de DNA, logo, a purificação de DNA deve ser feita de
modo a diminuir perdas.
Primeira atividade laboratorial
Extração genómica
↪ DNA Genómico = DNA total
Os processos de purificação de DNA variam de acordo
com o tipo de organismos ou o tipo de amostra.
Há 4 passos essenciais na extração de DNA:
• Lise celular – usa-se o calor, a quebra mecânica
por rutura com micropérolas de vidro, sonicação,
pressões elevadas (French Press) e a hidrólise
com enzimas (lisozima, mutanolisina, lisostafina)
que reconhecem ligações específicas do
peptidoglicano;
• Desproteinização – podem ser eliminadas
através da utilização de detergentes (SDS,
sarcosil), agentes desnaturantes (ticianato de
guanidina), adição de EDTA e/ou degradação de
K.;
• Precipitação do DNA – pode ser feita através
da adição CTAB (detergente) em presença de
SDS e de sais e pode-se recorrer a um pré-
tratamento com metanol e mercaptoetanol
quando se estamos perante um organismo com
grandes quantidades de substâncias fenólicas.
• Eliminação do RNA – é feita pela adição da RNase
durante o processo de purificação
⚠ É necessário usar luvas, após a lise, para evitar a
degradação do DNA por ação das nucleases (presentes
na pele humana)! Recorre-se ao uso de agentes quelantes
(ex. EDTA).
Há amostras mistas, em que existem simultaneamente
bactérias, fungos e organismos do domínio Archea , que
devido à sua peculiar constituição da parede celular
(presença de pseudomureína ⇨ polímero não mureínico,
estrutura semelhante ao peptidoglicano) têm de ter um
processo de lise específico (a lisozima não funciona ⇨
não reconhece as ligações glicosídicas β (1-3) ). É
necessário recorrer a lise física e/ou mecânica.
O número reduzido de células alvo presente nas
amostras, reduz a eficácia e o rendimento da extração
O método mais usado para a desproteinização consiste
no tratamento do lisado com fenol saturado ou com a
mistura fenol : clorofórmio : álcool isoamílico (extração
fenólica). Estes precipitam as proteínas (coágulo branco
na interfase entre as fases aquosa e orgânica) mas
deixam os ácidos nucleicos em solução. Em alguns casos,
quando o extrato contém uma grande quantidade de
proteínas a extração pode se efetuar 2 ou mais vezes.
⚠ Muitas extrações podem resultar na quebra ou perda
de algum DNA ⇨ tratamento com uma protease
(proteinase K).
Algumas moléculas de RNA ( ex. mRNA) são removidas
por extração fenólica (só o fenol por norma), porém a
grande maioria continua na fase aquosa.
↪ Forma mais eficiente de remover o RNA: tratamento
com uma ribonuclease (RNase) ⇨ degrada as moléculas
de RNA a nucleótidos.
Há ainda compostos que inibem as reações enzimáticas
subsequentes, originando falsos resultados negativos,
estes incluem:
• Ácidos húmicos e metais (ex. amostras
ambientais)
• Polissacaridos complexos (ex. amostras de fezes)
• Proteínas, hemina e bilirrubina (derivados da
degradação da hemoglobina)
• Sais biliares, heparina e EDTA (ex.
anticoagulantes em amostras de sangue)
São necessários processos de remoção dos
compostos inibidores através da adição de
compostos químicos capazes de neutralizar ou
remover substâncias indesejáveis.
Material
Meios de cultura:
• Meio LB (Luria-Bertani): triptona
• Extrato de levedura
• Cloreto de Sódio
4 estirpes bacterianas
Soluções Stock :
 • GES (Guanidina Tiocianato, EDTA e Sarcosil)
⚠ Guanidina Tiocianato – desnatura a proteína
⚠ Sarcosil – detergente
• NH4Ac, NaAc pH 5,2
• TE a pH 8 (Tris HCl EDTA) – solução tampão
• Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico
• Isopropanol e etanol absoluto
• Etanol a 70%
• RNase e lisozima
Procedimento experimental
1) Crescer as células durante a noite em meio LB (fonte
de C e N) a 37ºC, com agitação orbital (condições
ótimas) ;
2) Colher as células bacterianas (2 mL) por
centrifugação a 8000 rpm, durante 10 mins,
desprezar o sobrenadante e solubilizar o pellet com
1 mL de TE (epp 2ml) ;
↪ epp = eppendorf (Tem este nome pois foi a 1ª marca
a comercializá-los)
3) Centrifugar novamente a 8000 rpm, durante 10
mins, solubilizar o pellet com 1 mL de TE (lavagem das
células- 1ª posição da micropipeta). O sedimento tem
de ficar todo ressuspendido;
4) Repetir
centrifugação e desprezar o sobrenadante;
5) Ressuspender em 250 μL de TE com lisozima (faz
“buracos” na parede celular) (10mg /mL). Incubar em
banho a 37ºC durante 1 a 2 horas – começa a lise
celular;
6) Adicionar 500 μL de reagente GES, agitar por
inversão e colocar no gelo (tem a função de parar a
atividade das enzimas) durante 5 a 10 mins
(confirmar lise ⇨ solução transparente ⇨ já NÃO
há células);
7) Adicionar 250 μL de 10 M NH4Ac frio e colocar no
gelo 10 mins; adicionar 1 mL da mistura 25:24:1 de
fenol (precipita as proteínas e deixa os ácidos
nucleicos em solução)/clorofórmio (ajuda na
precipitação e elimina o fenol)/álcool isoamílico e
misturar por inversão;
8) Centrifugar à velocidade máxima, durante 10 mins, e
recuperar o sobrenadante para um novo tubo (epp
2mL). Atenção para NÃO arrastar a interfase
(branco);
9) Adicionar igual volume isopropanol ou álcool absoluto
frio por inversão (deve-se observar a formação de
um novelo);
10) Enrolar os novelos com de ác. nucleicos com uma ansa
(se não se observar novelos centrifugar mais uma
vez ⇨ v. máx, 10 min) e lavar o novelo ou o pellet
com 1 mL de 70% etanol;
11) Após 5-10 min de secagem, solubilizar ao ác. nucleicos
com 500 μL de TE com RNase (50 μL/mL). Incubar
em banho a 37ºC, durante 30 min (para remover o
RNA)
12) Adicionar 500 μL de fenol/clorofórmio/álcool
isoamílico, misturar por inversão e centrifugar à v.
máx, 10 min (para desnaturar a RNase);
13) Retirar o sobrenadante para um novo tubo (epp 2
mL) e adicionar 1/10 do volume de 3 M NaAc frio
(adicionar um sal ⇨ aumenta a força iónica ⇨
desnaturação das proteínas é mais fácil). Misturar
por inversão;
14) Adicionar 2,5 volumes de etanol absoluto frio (-20ºC)
e misturar por inversão;
15) Centrifugar (v. máx, 10 min) ou enrolar o novelo com
a ansa. Lavar o novelo ou o pellet com 1 mL de etanol
a a 70%.
16) Após 5 a 10 min de secagem solubilizar em 100 μL
de TE ou água pura.
17) Observar uma alíquota de 5 μL em gel agarose
(avaliar o DNA)
⚠ Para guardar o DNA a 4ºC (curto prazo) ou a -20ºC
/-80ºC (longo prazo).