A.

prepare os tubos como segue:

B. Prepare, separadamente, um branco para cada amostra.

C. Pipete a solução-padrão e a solução da amostra para os respectivos tubos
(no caso do branco do padrão ou do branco da amostra, adicione água).
D. Adicione todas as soluções subsequentes num só tubo e faça a leitura da cor
antes de passar para o outro tubo, começando com o branco padrão e a
solução padrão.
E. Agite o tubo no vórtex para homogeneizar o líquido, adicione ácido sulfanílico
e agite novamente.
F. Imediatamente adicione 0,5 mL de ácido clorídrico diluído e misture. Coloque
no espectrofotômetro e, com o branco, ajuste o zero de absorção do
aparelho, usando o comprimento de onda 450 nm, dentro de
aproximadamente 30 segundos após a adição da solução de ácido sulfanílico.
G. Leia imediatamente a absorbância da solução padrão no comprimento de
onda de 450 nm (a cor alcança o máximo de intensidade em um minuto e,
após a adição do ácido sulfanílico, permanece no máximo por dois minutos).
H. A seguir, leia a absorbância de cada amostra com o respectivo branco,
usando este para fixar o zero de absorção do aparelho.
I. A concentração de ácido nicotínico é proporcional à absorção, se o padrão e
a solução da amostra tiverem aproximadamente a mesma concentração.

1
 Procedimento analítico para cereais

A. Selecione um tubo adicional para o branco do padrão, para cada série de

determinações, mas não adicione bromocianogênio. Prepare os tubos da
seguinte maneira:

B. Com o comprimento de onda a 470 nm, fixe a 100% de transmitância, com o

branco dos padrões e leia a transmitância dos outros tubos, de 12 a 15
minutos após a adição do ácido sulfanílico.
C. Faça um gráfico com a absorção dos padrões, menos a do branco dos
reagentes, contra a concentração do ácido nicotínico, em μg/mL.
D. Neste gráfico, determine a concentração correspondente à absorbância da
amostra, tendo esta leitura sido feita após a fixação dos 100% de
transmitância do aparelho com o branco da amostra.

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 ANEXO G - ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DE PIGMENTOS NATURAIS

1. Identificação de antocianinas

 Identificação de antocianinas de cascas de uva

Material
Vidraria: béqueres de 25 mL; proveta graduada de 50 mL; balão volumétrico de 100
mL, filtro.
Reagente: hidróxido de sódio.
Equipamento: balança analítica.

Preparo de solução
 Solução de hidróxido de sódio (NaOH) – Pese 4,3 g de NaOH, transfira para
um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água.

Procedimento
A. Pese 0,1 g de amostra, adicione 50 mL de água e agite.
B. Filtre, se necessário, e adicione solução de hidróxido de sódio. A cor
vermelha torna-se azul ou verde-escura.

 Determinação da intensidade de cor em enocianinas por

espectrofotometria

Material
Vidraria: béqueres de 100 mL; provetas graduadas de 50 e 100 mL.
Reagente: ácido cítrico; fosfato de sódio dibásico.
Equipamento: balança analítica; pHmetro; espectrofotômetro UV/VIS.

3
Preparo de solução
 Solução de ácido cítrico 0,1 M, contém 21,01 g/L de ácido cítrico di-hidratado
C 6H8O7.2H2O.
 Solução de fosfato de sódio dibásico 0,2 M, contém 28,40 g/L de Na 2HPO4 ou
35,6 g/L de Na2HPO4.2H2O.
 Solução-tampão de ácido cítrico/fosfato de sódio dibásico, pH 3 – Misture
79,45 mL de ácido cítrico 0,1 M e 20,55 mL de fosfato de sódio dibásico 0,2 M
e ajuste o pH a 3 com uma ou outra solução.

Procedimento
A. Pese, com precisão, cerca de 0,1 g de amostra e adicione a solução-tampão
pH 3 até completar 100 mL.
B. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância a 525 nm,
utilizando a solução-tampão como branco e cubetas de 1 cm.
C. Meça a absorbância (A) da amostra a 525 nm. Caso a absorbância não esteja
entre 0,2 e 0,7, reajuste a massa inicial.

Cálculo:

A = absorbância a 525 nm
P= massa da amostra em gramas (g)

2. Identificação de carmim de cochonilha

Material
Vidraria: béquer; cápsula de porcelana; dessecador; conta gota; funil de separação.

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Reagente: hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio; cristais de ditionito de sódio;
ácido sulfúrico; ácido clorídrico; álcool amílico; éter de petróleo; acetato de uranila.
Equipamento: banho-maria.

Preparo de solução
 Solução aquosa de hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio a 10%
 Solução aquosa de ácido clorídrico (HCl) a 10% v/v – Dilua 266 mL de HCl
com água em um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume.
 Solução aquosa de acetato de uranila a 5% m/v – Pese 5 g de acetato de
uranila, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume
com água.

Procedimento
A. Alcalinize levemente uma dispersão aquosa da amostra pela adição de uma
gota de solução de hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio a 10%.
Forma-se uma coloração violeta.
B. A adição de pequena quantidade de cristais de ditionito de sódio as soluções
da amostra, em meio ácido, neutro ou alcalino, não descora a solução.
C. Leve a secura, em banho-maria, uma pequena quantidade da amostra em
cápsula de porcelana. Esfrie totalmente e trate o resíduo seco com uma ou
duas gotas de ácido sulfúrico concentrado. Não se observa alteração da cor.
D. Transfira uma dispersão aquosa da amostra para um funil de separação, cuja
capacidade seja três vezes o volume da dispersão.
E. Adicione 1/3 do volume (correspondente ao da dispersão) de solução de
ácido clorídrico a 10% v/v e agite.
F. Adicione álcool amílico de maneira a dobrar o volume do conteúdo do funil de
separação e agite. Deixe separar e despreze a fase aquosa (inferior).
G. Lave a fase amílica de duas a quatro vezes com água para eliminar resíduos
de ácido clorídrico. Dilua a fase amílica com igual volume de éter de petróleo
e agite.
H. Adicione uma pequena quantidade de água (cerca de 1/6 do volume total).
Adicione gota a gota solução de acetato de uranila a 5%, agitando após cada

5
 adição. Forma-se uma coloração verde esmeralda característica, na fase
inferior.

3. Identificação de urucum

 Identificação de urucum lipossolúvel (bixina)

Material
Vidraria: coluna de vidro de 1 cm de diâmetro e 8 a 10 cm de altura; béquer; proveta;
pipeta graduada de 1, 5 e 10 mL.
Reagente: ciclo-hexano; clorofórmio, desidratado com carbonato de potássio anidro;
alumina para coluna cromatográfica; tricloreto de antimônio; sulfato de sódio anidro;
dicromato de potássio.
Equipamento: espectrofotômetro UV/VIS.

Preparo de solução
 Solução de dicromato de potássio 0,1%
 Reativo de Carr-Price – Pese 25 g de tricloreto de antimônio, transfira para
um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com clorofórmio. Deixe
em repouso por um dia, em frasco bem fechado e em geladeira. O frasco não
deve ser aberto enquanto a solução estiver gelada.

Procedimento
A. Dissolva uma quantidade da amostra em ciclo-hexano de modo a se obter
uma coloração semelhante à de uma solução de dicromato de potássio a
0,1%.
B. Prepare uma coluna de 1 cm de diâmetro e 8 a 10 cm de altura com emulsão
de alumina em ciclo-hexano e tampão de lã de vidro na extremidade afilada
da coluna de vidro.
C. Escoe lentamente o solvente. Passe pela coluna a solução da amostra obtida
anteriormente. Lave três vezes com 10 mL de ciclo-hexano sem deixar secar
a coluna.

6
 D. A bixina é fortemente adsorvida pela alumina na parte superior da coluna e
forma uma zona vermelho-alaranjada brilhante. A faixa de cor amarelo-pálida
migra através da coluna e será eliminada na lavagem com ciclo-hexano.
E. Elua a coluna três vezes com 5 mL de clorofórmio. A faixa da bixina adsorvida
não é eluida em ciclo-hexano, éter de petróleo, clorofórmio, acetona, álcool e
metanol (com os dois últimos solventes, a cor passa a laranja). Quando a
última porção for eluida, adicione 1 mL do reativo de Carr-Price. A bixina
adsorvida torna-se imediatamente azul-esverdeada.

Notas

 O extrato de urucum lipossolúvel é insolúvel em água e pouco solúvel em

álcool.
 Os extratos de urucum reagem em ácido sulfúrico dando coloração azulada
em razão da bixina. O extrato de urucum lipossolúvel diluído com clorofórmio
apresenta absorbância máxima a 439, 470 e 501 nm.

 Determinação do teor de bixina

Material
Vidraria: béquer de 25 mL; balões volumétricos de 100 mL; pipeta volumétrica de 10
mL.
Reagente: clorofórmio.
Equipamento: balança analítica; espectrofotômetro UV/VIS.

Procedimento
A. Pese, com precisão, a quantidade de mg da amostra que pode ser
encontrada pela fórmula: m = 0,153, dividida pela porcentagem de bixina
esperada.
B. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL com clorofórmio e complete o
volume. Transfira 10 mL desta solução para outro balão volumétrico de 100
mL e complete o volume com clorofórmio.

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 C. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância, a 470 nm,
utilizando clorofórmio como branco e cubetas de 1 cm. Meça a absorbância
da amostra a 470 nm.
D. Calcule o teor de carotenoides totais expresso em bixina usando o valor de
absortividade igual a 2826.

 Identificação do urucum hidrossolúvel (norbixina)

Material
Vidraria: coluna de vidro de 1 cm de diâmetro e 8 a 10 cm de altura, béquer; proveta
de 100 mL; pipeta graduada de 2, 5 e 10 mL; funil de separação; balão volumétrico
de 1000 mL.
Reagente: ácido sulfúrico; ciclo-hexano; clorofórmio, desidratado com carbonato de
potássio anidro; alumina para coluna cromatográfica; tricloreto de antimônio; sulfato
de sódio anidro.
Equipamento: balança analítica; espectrofotômetro UV/VIS; centrífuga.

Preparo de solução
 Solução de ácido sulfúrico 1 M.
 Reativo de Carr-Price – Pese 25 g de tricloreto de antimônio, transfira para
um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com clorofórmio. Deixe
em repouso por um dia, em frasco bem fechado e em geladeira. O frasco não
deve ser aberto enquanto a solução estiver gelada.

Procedimento
A. Transfira 2 mL ou 2 g da amostra para um funil de separação de 250 mL.
B. Adicione ácido sulfúrico 1 M suficiente para se obter uma reação fortemente
ácida (a norbixina é separada como precipitado vermelho).
C. Adicione 50 mL de ciclo-hexano e agite fortemente.
D. Após a separação das fases, descarte a fase aquosa e lave a fase ciclo-
hexânica com água até eliminação do ácido.
E. Centrifugue a emulsão que se forma, por 10 min., a 2500 rpm. Decante a
solução límpida de norbixina e seque sobre sulfato de sódio anidro.

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 F. Prepare uma coluna de 1 cm de diâmetro e 8 a 10 cm de altura com emulsão
de alumina em ciclo-hexano e tampão de lã de vidro na extremidade afilada
da coluna de vidro.
G. Escoe lentamente o solvente. Adicione 3 a 5 mL da solução obtida
anteriormente no topo da coluna de alumina.
H. Lave 3 vezes com 10 mL de ciclo-hexano sem deixar secar a coluna.
I. Elua a coluna três vezes com 5 mL de clorofórmio. Quando a última porção
for eluida, adicione 1 mL do reativo de Carr-Price.
J. A norbixina forma uma zona vermelho-alaranjada na superfície da coluna e
tem a mesma reação com reativo de Carr-Price da bixina, torna-se
imediatamente azul-esverdeada.

Notas

 O extrato de urucum hidrossolúvel é pouco solúvel em álcool.

 Os extratos de urucum reagem com ácido sulfúrico dando coloração azul-
esverdeada em razão da norbixina.
 O extrato de urucum hidrossolúvel diluído com água apresenta absorbância
máxima a 453 e 483 nm.

 Determinação do teor de norbixina

Material
Vidraria: béquer; balão volumétrico de 100 e 500 mL; pipeta volumétrica de 1 mL.
Reagente: hidróxido de potássio.
Equipamento: balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS.

Preparo de solução
 Solução aquosa de hidróxido de potássio a 0,5% – Pese 5 g de hidróxido de
potássio e transfira para um balão volumétrico de 1000 mL.

Procedimento

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 A. Pese, com precisão, cerca de 0,1 g do corante em pó, transfira para um balão
volumétrico de 500 mL com hidróxido de potássio 0,5% e complete o volume.
B. Pipete 1 mL desta solução para um balão volumétrico de 100 mL e complete
o volume com hidróxido de potássio 0,5%.
C. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância a 453 nm,
utilizando a solução de hidróxido de potássio 0,5% como branco e cubetas de
1 cm. Leia em espectrofotômetro a 453 nm.

Cálculo:

Calcule o teor de carotenoides totais expresso em norbixina usando o valor de

absortividade igual a 3473.

Nota: para expressar o resultado em bixina, deve-se multiplicar o teor de norbixina

encontrado pelo fator 1,037.

4. Identificação de betacaroteno

Material
Vidraria: béquer.
Reagente: éter de petróleo; álcool.
Equipamento: espectrofotômetro UV/VIS, aparelho medidor de ponto de fusão.

Procedimentos
A. O espectro de absorção da solução da amostra, em éter de petróleo,
apresenta picos de absorção máximo em 475, 448 e 450 nm. Em
álcool, apresenta absorções em 475, 449 e 427 nm.
B. O intervalo de fusão da amostra varia entre 178 a 184C, com
decomposição.

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  Determinação do teor de betacaroteno – Carotenoides lipossolúveis
(preparações a 30% )

Material
Vidraria: béquer de 25 mL; balão volumétrico de 100 mL; pipeta volumétrica de 20
mL.
Reagente: éter de petróleo.
Equipamento: balança analítica; espectrofotômetro UV/VIS.

Procedimento
A. Pese, com precisão, cerca de 50 mg da amostra, dissolva em éter de
petróleo, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume
com o mesmo solvente.
B. Transfira uma alíquota de 20 mL para outro balão volumétrico de 100 mL e
complete o volume.
C. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância, a 448 nm,
utilizando éter de petróleo como branco e cubetas de 1 cm.
D. Meça a absorbância da amostra a 448 nm.

Nota: Os ensaios devem ser feitos com a maior rapidez possível, evitando exposição
demasiada ao ar e a luz.

Cálculo:

Calcule a porcentagem de betacaroteno usando o valor de absortividade igual a

2592.

 Determinação do teor de betacaroteno – Carotenoides hidromiscíveis

(preparações com 10% )

Material
Vidraria: béquer; funil de separação de 250 mL; pipeta volumétrica de 20 mL; balão
volumétrico de 100 e 500 mL; proveta de 100 mL; erlenmeyer de 250 mL.

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Reagente: éter de petróleo; acetona; sulfato de sódio anidro.
Equipamento: balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS.

Procedimento
A. Pese, com precisão, cerca de 70 mg de amostra, transfira para um balão
volumétrico de 500 mL com auxílio de água e complete o volume.
B. Transfira uma alíquota de 20 mL para um funil de separação, adicione 80 mL
de acetona e agite por cinco minutos.
C. Adicione 60 mL de éter de petróleo, seguido de água para auxiliar a
transferência do pigmento para a fase de éter.
D. Após a separação das fases, descarte a fase inferior.
E. Lave três vezes com aproximadamente 150 mL de água. Recolha em
erlenmeyer contendo sulfato de sódio anidro para retirar gotas de água.
F. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com éter
de petróleo.
G. Ajuste o zero do espectrofotômetro em unidades de absorbância a 448 nm,
utilizando éter de petróleo como branco.
H. Meça a absorbância da amostra em cubeta de 1 cm, a 448 nm.

Cálculo:

Calcule a porcentagem de betacaroteno usando o valor de absortividade igual a

2592.

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