Anti-HCV
• Resultados falso positivos: mulheres grávidas, pessoas vacinadas recentemente
MÉTODO:
ELISA Sandwich de Duplo Antígeno
FINALIDADE:
O vírus da Hepatite C (HCV) é conhecido como o agente causador da maioria das
hepatites não-A e não-B. Estudos mostram que o HCV é transmitido por contato
sexual, por exposição a sangue contaminado ou por produtos derivados de sangue.
O uso de diferentes antígenos (recombinantes) tem mostrado uma maior efetividade
na identificação das hepatites agudas e crônicas não-A e não-B do que testes com
antígeno único.
O teste Anti-HCV tem a finalidade de identificar amostras potencialmente infectantes
e prevenir seu uso.
Somente para diagnóstico de uso in vitro.
PRINCÍPIO:
Detecção direta de anticorpo.
O anti-HCV ELISA Human é um teste de ELISA sandwich de duplo antígeno para a
detecção direta de anticorpos anti-HCV. O teste utiliza antígenos recombinantes
específicos (rAg: core, NS3, NS5) que recobrem as cavidades de microtitulação. Os
anticorpos de presentes nas amostras ou controles ligam-se aos antígenos de HCV
imobilizados (Etapa 1). Após um período de incubação, componentes da amostra
não ligados são removidos por meio de lavagem. Para um segundo período de
incubação, o conjugado (HCV-rAg marcado com peroxidase) é adicionado e se ligará
especificamente aos anticorpos anti-HCV humanos imobilizados formando complexos
de duplo antígeno-anticorpo. Após uma segunda etapa de lavagem para remover o
excesso de conjugado, adiciona-se substrato/TMB (etapa 3). Ocorre o
desenvolvimento de uma coloração azul que muda para amarela após a adição da
solução Stop. A intensidade da cor é proporcional à concentração de HCV-Ac na
amostra.
A absorbância dos controles e das amostras é obtida pelo uso de leitoras de ELISA
ou sistemas automatizados de ELISA. Os resultados para as amostras de pacientes
são obtidos pela comparação com o valor do Cut-off que se baseia no controle
negativo.
IDENTIFICAÇÃO E ARMAZENAMENTO:
Conservar entre 2 a 8ºC.
Reagentes:
MIC- 12 Tiras de microtitulação (em um suporte de tiras)
Tiras descartáveis com 8 cavidades cobertas com antígenos recombinantes de HCV
(E. coli).
NC- 4,5 mL Controle negativo (tampa amarela)
Soro humano não reativo para anti-HCV. Pronto para uso.
PC- 3,5 mL Controle Positivo (tampa vermelha)
Soro humano reativo para anti-HCV.
CON- 1,8 mL Conjugado anti-HCV (tampa preta)
De cor vermelha escura. Antígenos recombinantes de HCV conjugados com
peroxidase, salina fosfato tamponada.
C-DIL- 24 mL Diluente de Conjugado (tampa branca)
pH 6,5 ± 0,1. Tampão Tris 0,02 M; Tween 20 0,2%.
WS- 110 mL Solução de lavagem (20x concentrada) (tampa branca)
pH 6,5 ± 0,1. Concentrada para 2000 mL; salina fosfato tamponada 1 mol/L, Tween
20 0,2%.
SA- 12 mL Reagente Substrato A
Peróxido de hidrogênio 0,03%; Tampão citrato 0,06 mol/L.
SB- 12 mL Reagente Substrato B
3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina 0,6 mg/mL; DMSO 0,7 mol/L.
STOP- 12 mL Solução Stop
Ácido sulfúrico 1,0 mol/L.
3 tiras adesivas
ESTABILIDADE:
• Os reagentes são estáveis até o vencimento da data de validade impressa nos
rótulos, quando armazenados entre 2 e 8ºC.
• Depois de abertos, os reagentes devem ser armazenados entre 2 e 8ºC e usados
dentro de 30 dias.
• O fabricante garante a qualidade do produto, se este for armazenado como
descrito acima e em sua embalagem original.
TRANSPORTE:
O transporte do kit deve ser feito pela rota mais direta evitando-se as chegadas nos
finais de semana e feriados no local de destino. O kit não é afetado pelo transporte
desde que seja entregue ao destinatário no período máximo de 07 dias e em uma
temperatura de até 37ºC.
PRECAUÇÕES:
• Cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação sos
reagentes. STOP, NC, SA, SB podem irritar olhos, pele e membranas mucosas. Em
contato, enxaguar abundantemente com água e consultar um médico.
NC, PC contém azida sódica. Não ingerir ou aspirar. Evitar contato com a pele e
mucosa.
• Todas as amostras e controles do kit devem ser manuseados como capazes de
transmitir infecção. Recomenda-se seguir as normas de biossegurança.
• O controle positivo foi inativado pelo calor mas deve ser manuseado como
potencialmente infectante. Os controles positivo e negativo foram checados para
HBsAg e anticorpos anti-HIV 1/2, encontrando-se negativos.
• Todo o material contaminado com amostra de paciente e controles deve ser
inativado por autoclavação (60 min a 121ºC) ou por imersão em solução de
hipoclorito de sódio a 10% por no mínimo 60 min.
• Para descarte seguro dos reagentes e materiais biológicos, sugerimos utilizar as
regulamentações normativas locais, estaduais ou federais para a preservação
ambiental.
LIMITAÇÕES:
para influenza, portadores de hipergamaglobulinemia, presença de fator reumatóide
e anticorpos anti-nucleares podem fornecer resultados falso-positivos.
• Resultados falso-negativos: Resultados falso-negativos em pacientes HIV
positivos são observados em um número razoável de pacientes. A co-infecção
HIV/HCV pode ser encontrada em até 30% dos pacientes HIV positivos.
• O resultado isolado do Hexagon HCV não pode ser usado para um diagnóstico
definitivo. Como todos os testes diagnósticos, os resultados obtidos com o Hexagon
HIV devem ser interpretados levando-se em consideração outros achados
laboratoriais e o status clínico do paciente. Um resultado negativo não exclui a
possibilidade de exposição ou infecção com o HIV.
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS:
• Leitora de Elisa.
• Lavadora automática.
• Pipetas automáticas.
• Ponteiras descartáveis.
PREPARO DOS REAGENTES:
Trazer todos os reagentes para a temperatura ambiente (15-25ºC) antes do uso.
Os reagentes não devem ser usados na temperatura de 2 a 8ºC.
Tiras de microtitulação MIC:
São seladas em uma bolsa aluminizada contendo com um dessecante.
A bolsa deve atingir a temperatura ambiente antes de ser aberta. As tiras que não
forem utilizadas devem retornar para a bolsa e devem ser armazenadas entre 2 e
8ºC. Não tocar na borda superior ou no fundo das cavidades com os dedos.
Solução Conjugado de Uso WCON
-Diluir CON 1 + 20 com C-DIL. Ex.: 50 L de CON + 1000 L de C-DIL para 8
cavidades. (são necessários 100 L para cada cavidade).
-Fazer o preparo para cada bateria de testes.
-Estabilidade: 6 horas em temperatura ambiente (evitar contaminação).
Solução de Lavagem de Uso WASH
-Cristais no WS devem ser dissolvidos por aquecimento entre 35 e 37ºC.
-Diluir WS 1 + 19 com água deionizada recentemente colhida, ex, 50 mL WS + 950
mL de água = 1000 mL.
-São necessários aproximadamente 2,5 mL de WASH necessário para cada
cavidade.
-Preparar somente a quantidade necessária para a bateria de testes que vai ser
realizada.
-Estabilidade: 1 semana a 2 e 8ºC ou 2 dias em temperatura ambiente (15 a
25°C).
Solução Substrato de Uso SUB (Ver também Procedimento Alternativo):
-Preparar o volume necessário misturando partes iguais de SA e SB em um
recipiente de plástico limpo, enxaguado com água deionizada antes do uso.
-O SB deve ser incolor a ligeiramente azulado, se diferente, deve ser descartado.
-Manusear o SUB cuidadosamente e evitar contaminação! Não usá-lo se
apresentar na cor azul.
-Armazenar protegido da luz forte.
-Estabilidade: 6 minutos em temperatura ambiente (15 e 25º).
AMOSTRAS, CONTROLES
Soro e plasma com os anticoagulantes citrato, heparina ou EDTA.
Não usar amostras fortemente lipêmicas, hemolisadas ou ictéricas.
Amostras podem ser armazenadas por 12 horas em temperatura ambiente (15 a
25ºC), por 24 horas entre 2 e 8ºC, ou por um ano a –20ºC. Congelar e
descongelar somente uma vez. Amostras descongeladas devem ser
cuidadosamente homogeneizadas. Eliminar material particulado por centrifugação ou
filtração.
PROCEDIMENTO DO TESTE:
Seguir os procedimentos exatamente como descritos.
P1: Não trocar as tampas dos frascos (risco de contaminação). Não usar os
reagentes após a data de validade.
P2: Não usar reagentes que possam estar contaminados, ter a aparência ou cheiro
diferente do usual.
P3: Identificar as amostras e controles cuidadosamente folha fornecida com o kit
P4: MIC – Selecionar o número de tiras ou cavidades necessárias.
P5: Realizar duplicata ou triplicata dos controles positivo e negativo. Pipetá-los
no fundo das cavidades.
P6. Adicionar sempre os reagentes na mesma ordem, cronometrando para
minimizar a diferença do tempo de reação entre as cavidades. Isto é
importante para a reprodutibilidade dos resultados. A pipetagem das amostras
não deve exceder 5 minutos. Se o tempo for superior a 5 minutos, pipetar os
calibradores nas posições indicadas na metade do tempo da pipetagem das
amostras. Se mais de 1 placa for utilizada, realizar uma curva para cada placa.
P7. Evitar/remover bolhas de ar antes das incubações e leitura.
P8. SUB – incubar no escuro. O SUB inicia a reação cinética, que é finalizada com a
adição do STOP.
PROCEDIMENTO DE LAVAGEM:
O Procedimento de lavagem é crítico. Lavagem insuficiente resulta em pouca
precisão ou absorbâncias falsamente elevadas.
L1: Remover as tiras adesivas, aspirar o conteúdo das cavidades, adicionar WASH a
cada cavidade, aspirar novamente o conteúdo das cavidades após 30 segundos de
tempo de espera. Repetir a lavagem 7 vezes.
L2: No caso de lavadoras automáticas, realizar um prime com a WASH e lavar as
tiras 8 vezes. Verificar se a lavadora encheu todas as cavidades completamente e
aspirar após 30 segundos eficientemente (líquido remanescente deve ser < 15 L).
L3: Após a lavagem, remover o líquido remanescente batendo a placa invertida
em um papel absorvente.
REV. 01/12
Esquema de Pipetagem: HCV, nível 2 28 1,909 5,43
Seguir os procedimentos exatamente como descritos. Particular atenção no
procedimento de lavagem! Corrida 3 N°. amostras Média (DO) CV (%)
Os reagentes e amostras devem estar na temperatura ambiente antes do uso. HCV, nível 1 26 2,439 6,28
Etapa 1 Cavidade ( L) HCV, nível 2 28 1,831 7,95
A1 B1/C1 D1/F1 G1…
Branco NC PC Amostra REPETIBILIDADE:
NC em triplicata --- 100 --- --- N°. amostras Média (DO) CV (%)
PC em duplicata --- --- 100 --- HCV, nível 1 78 2,439 6,28
Amostras --- --- --- 100 HCV, nível 2 84 1,831 7,95
Misturar cuidadosamente (15 segundos)
Cobrir MIC com as tiras adesivas APRESENTAÇÃO DO KIT:
Incubar 60 min. a 37ºC Cat. Nº Nº Teste
Lavar 8 vezes como descrito (L1 – L3) 51275 96
WASH 350 350 350 350
BIBLIOGRAFIA:
Etapa 2
1. Uyttendaele S. et al., Vox Sang 66, 122-129 (1994)
WCON --- 100 100 100
2. Mc Farlane I. G. et al., Lancet 335, 754-757 (1990)
Cobrir MIC com as tiras adesivas 3. Tsutsumt M. et al., Hepatology 19, 265-272 (1994)
Incubar 30 min. a 37ºC 4. Claeys H. et al., J. Med. Virol. 36, 259-264 (1992)
Lavar 8 vezes como descrito (L1 – L3) 5. Kuog G. et al., Science 244, 362-364 (1989)
WASH 350 350 350 350
Etapa 3 DEPARTAMENTO DE SERVIÇOS ASSOCIADOS:
SUB 100 100 100 100 Para esclarecimentos de dúvidas do consumidor quanto ao produto:
Telefax (31) 3067-6400 E-mail: invitroms@invitro.com.br
Incubar 15 min. a 37ºC (Ver P8)
N.º DO LOTE, DATA DE FABRICAÇÃO, DATA DE VALIDADE VIDE RÓTULO DO
STOP 100 100 100 100 PRODUTO.
Misturar cuidadosamente
Medir a absorbância em 450 nm o mais rápido possível ou no máximo dentro de
15 minutos após o término da reação, utilizando como comprimento de onda de Produzido por Human GmbH Max-Planck-Ring 21, D 65205, Wiesbaden, Alemanha
620 nm (se disponível). e Distribuído por In Vitro Diagnóstica Ltda
Rua Cromita, 278, Distrito Industrial – Itabira/MG. CEP: 35903-053
Procedimento alternativo para uso em analisadores automáticos de ELISA Telefone: 31-3067-6400 – Fax: 31-3067-6401
e-mail: invitroms@invitro.com.br
Etapa 3: -dispensar primeiro 50 L de SA e em seguida 50 L de SB em Resp. Téc.: Patrícia C. C. Vilela – CRF 4463
cada cavidade incluindo A1; misturar bem e proceder como descrito. Reg. M.S. 10303460222

CÁLCULO DOS VALORES DOS CONTROLES, CUTT-OFF E ÍNDICE DO CUTT- SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS UTILIZADOS NOS RÓTULOS DO PRODUTO
OFF: O conteúdo é suficiente para <n> testes
Média da absorbância dos valores de NC nas cavidades B1, C1 e D1 (MNC) e PC nas
cavidades E1 e F1 (MPC) são calculadas de acordo com: Data limite de utilização
MNC = A450 (B1) + A450 (C1) + A450(D1)/ 3 MPC = A450 (E1) + A450 (F1)/ 2
Limite de temperatura (conservar a)
Valor de cut-off COV = MCN + 0,100
Número do Catálogo
Índex do cut-off S/Co = Aamostra/COV
Consultar Instrução de Uso

VALIDAÇÃO DO TESTE:
Número do lote
O teste pode ser considerado válido desde que os seguintes critérios sejam
encontrados:
1. Abs da cavidade branco < 0,100 (incolor ou ligeiramente amarelado), Produto Diagnóstico In Vitro
caso contrário o teste deverá ser repetido.
2. MNC 0,100 A450 Data de Fabricação
3. MPC 0,600 A450
4. MPC – MNC 0,500 A450

O Guia de Problemas e Soluções da Linha ELISA Human encontra-se disponível

na internet, em Publicações: www.invitro.com.br

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

Resultados
A450 (amostra) < COV
A450 (amostra) COV
Novo teste em duplicata:
Ambos os resultados: S/Co >1,5
Ambos os resultados: S/Co < 1,0
Ambos os resultados: 1,0 < S/Co <
1,5
Resultado 1: S/Co < 1,0
Resultado 2: S/Co > 1,5
Interpretação
Anticorpo anti-HCV não reativo
Anticorpo anti-HCV inicialmente
reativo: testar novamente
Anticorpo anti-HCV
Reativo: Fazer teste confirmatório
Não reativo
Duvidoso: Monitoramento de amostra
subsequente; Fazer teste confirmatório.
Inválido, (erro de procedimento):
testar novamente

SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE:
Foram testadas 421 amostras positivas e 5169 amostras não selecionadas contra
testes de ELISA comercialmente disponíveis. A sensibilidade encontrada foi de 100%
e a especificidade foi de 99,75%.
A sensibilidade de soroconversão foi avaliada usando-se 38 painéis de
soroconversão. Os resultados foram comparados com testes com a marcação CE
resultando em sensibilidade de soroconversão equivalente.

INTERFERENTES:
Nenhuma interferência foi observada com as substâncias abaixo até a concentração
indicada.
Substância Concentração
Bilirrubina Até 0,2 mg/mL
Hemoglobina Até 5 mg/mL
Triglicérides Até 5 mg/mL
FR Até 500 mg/mL

REPRODUTIBILIDADE:
Corrida 1 N°. amostras Média (DO) CV (%)
HCV, nível 1 26 2,282 4,89
HCV, nível 2 28 1,698 6,42

Corrida 2 N°. amostras Média (DO) CV (%)

HCV, nível 1 26 2,549 3,66
REV. 01/12