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com

Nota técnica

pubs.acs.org/ac

Imagem de ressonância de plasma de superfície por mapeamento holográfico

aprimorado
B. Mandracchia, *, †, ‡ V. Pagliarulo,† M. Paturzo,† e P. Ferraro†
†CNR-Istituto di Cibernetica “E. Caianiello ”, Via Campi Flegrei 34, 80078, Pozzuoli, Napoli, Itália
Dipartimento di Ingegneria Chimica, dei Materiali e della Produzione Industriale, Universitàd̀i Napoli Federico II, Piazzale Tecchio
‡

80, 80100, Napoli, Itália

*C Recurso Web-Enhanced *S Informações de Apoio

RESUMO: Nós projetamos, construímos e testamos um microscópio de

Baixado via INST FED EDU CIENCIA TEC DA PARAIBA em 27 de setembro de 2021 às 19:21:50 (UTC).

ressonância de plasmon de superfície holográfica (HoloSPR) baseado em

Consulte https://pubs.acs.org/sharingguidelines para obter opções sobre como compartilhar legitimamente artigos publicados.

objetiva para imagem de ressonância de plasmon de superfície (SPRi)

simultânea de contraste de amplitude e contraste de fase. SPRi é uma
ferramenta amplamente difundida para detecção sem rótulo de alterações no
índice de refração e concentração, bem como mapeamento de filmes finos.
Atualmente, a maioria dos sensores SPR dependem da detecção de mudanças
de amplitude ou fase da luz. Apesar das altas sensibilidades alcançadas até
agora, cada técnica sozinha tem uma faixa de detecção limitada com
sensibilidade ideal. Aqui usamos uma objetiva de alta abertura numérica que
evita todas as limitações devido ao uso de uma configuração baseada em
prisma, produzindo imagens altamente ampliadas e sem distorção.
Reconstruções holográficas de imagens SPR e medidas cinéticas em tempo
real são
apresentado para mostrar a capacidade do HoloSPR de fornecer um método de imagem versátil para detecção de SPR de alto
rendimento complementar às técnicas convencionais de SPR.

S Os polaritons do plasmão da urface são uma onda de superfície

eletromagnética ligada na região entre dois dielétricos e uma
camada metálica ou condutora. Quando a energia luminosa externa
induz ressonantemente os elétrons livres do metal a oscilar na interface,
a energia radiante é absorvida e o metal exibe um mínimo de
refletividade. Este fenômeno, denominado ressonância plasmônica de
superfície (SPR), ocorre em um determinado ângulo de incidência
dependendo do índice de refração do meio dielétrico em contato com a
superfície metálica. A detecção de alterações no índice de refração
permite monitorar as interações biomoleculares, bem como obter
imagens bidimensionais, que são chamadas de imagens de ressonância
de plasmon de superfície (SPRi). Desde sua invenção em 1988,1 O SPRi se
tornou uma ferramenta poderosa para criar imagens de
características interfaciais sutis por meio do contraste de índice de
refração. A alta sensibilidade do SPRi o tornou uma boa ferramenta para
a caracterização de filmes finos ou para ler eventos de ligação
biomolecular em, por exemplo, DNA ou microarranjos de proteínas, de
forma livre de marcadores.2-4 Muitos tipos de sistemas de imagem SPR
foram desenvolvidos para obter instrumentos para análises de alto
rendimento com baixos limites de detecção. A maioria dos métodos SPRi
atuais podem ser divididos em dois grupos, com base na amplitude e no
sensibilidade e uma resposta diferente para a mesma amostra
dependendo das condições experimentais e, em geral, uma é
mais eficaz onde a outra não. Recentemente, a fim de explorar
esta natureza complementar dos métodos de contraste de
amplitude e fase, a possibilidade de medições simultâneas de
imagens SPR de amplitude e contraste de fase usando
holografia digital (DH) foi demonstrada.13
DH na configuração do microscópio já é usado para imagens de
microestruturas e sistemas biológicos devido à sua excelente
abordagem na obtenção de intensidade e informações quantitativas de
fase em uma onda de luz,14 a 19 e configurações baseadas em prisma
foram usadas para combinar facilmente DH com reflexão interna total
(TIR) e SPRi.20-22 Infelizmente, a restrição física do prisma limita a
abertura numérica (NA) e a ampliação de um sistema de imagem.
Conseqüentemente, ele produz uma resolução espacial pobre em
comparação com a que pode ser obtida com a microscopia óptica. Além
disso, a resolução em imagens baseadas em prisma é governada
principalmente por aberrações geométricas, que distorcem as imagens
SPR.23 Finalmente, o prisma também limita a compatibilidade com
microscópios convencionais e faz com que as imagens se movam

contraste de fase, respectivamente.5 Os métodos de imagem de quando o ângulo de incidência é alterado, limitando assim o uso de

contraste de amplitude detectam a distribuição de intensidade do feixe técnicas de varredura angular.

de luz refletido diretamente,1,6−8 enquanto os métodos de imagem de
contraste de fase detectam o padrão de interferência entre o feixe Recebido: 8 de janeiro de 2015
refletido e um feixe de referência.9 a 12 Cada técnica tem uma gama Aceitaram: 27 de março de 2015
diferente de Publicados: 27 de março de 2015

© 2015 American Chemical Society 4124 DOI: 10.1021 / acs.analchem.5b00095

Anal. Chem.2015, 87, 4124−4128
Química Analítica
Uma configuração alternativa evita esses problemas usando uma
objetiva de microscópio de alto NA para lançar o SPR, como a
configuração através da objetiva em microscopia de fluorescência
de reflexão interna total (TIRF).24 Uma abertura numérica alta (NA) e
um sistema de imagem de alta ampliação garantem que a
resolução lateral de SPRi na direção perpendicular ao plano de luz
incidente seja limitada por difração. Por outro lado, na direção
paralela ao plano incidente, o comprimento de propagação dos
plasmons de superfície limita a resolução longitudinal (por
exemplo, 3 μm para ouro no ar). Diferentes grupos, no entanto,
têm abordado a questão da resolução longitudinal pobre e
soluções propostas que levam a resoluções quase limitadas por
difração.25 a 28
Neste trabalho, apresentamos uma configuração holográfica
para imagens SPR de amplitude e fase simultâneas sem distorção
(Holo-SPRi). Construímos um microscópio SPR invertido com um
interferômetro Mach − Zehnder colocado no braço de detecção do
caminho óptico. Podemos adotar essa configuração porque a
excitação SPR ocorre apenas quando a luz iluminante é p-
polarizada, portanto, podemos usar o componente s-polarizado da
luz como um feixe de referência. Desta forma, realizamos um
arranjo compacto que pode ser facilmente implementado usando
microscópios convencionais e que, minimizando a diferença de
caminho óptico entre os dois feixes, suprime o ruído de vibração
■
durante a detecção da imagem.29
SECÇÃO EXPERIMENTAL
Configurar. Projetamos o microscópio HoloSPRi como um
microscópio invertido, consulte a Figura 1. Um laser He-Ne de 633 nm é
Figura 1. Configuração de imagem HoloSPR: BS, cubo divisor de feixe; PBS, cubo
divisor de feixe de polarização; λ / 2, placa de meia onda.
acoplado a uma fibra óptica monomodo (tamanho do núcleo c
= 4 μm). A saída da fibra é colimada com um colimador de fibra
(ótica OZ,fc = 18 mm) e depois expandido usando duas lentes
plano-convexas (f1 = 100 mm e f 2 = 200 mm). O ângulo de
divergência estimado é DA = {(c / fc) (f1/ f 2)} = 0,11 mrad. A luz é
convertida em p-polarização por um polarizador linear. A viga
4125
Nota técnica
passa por uma placa λ / 2, onde a polarização pode ser girada e, em
seguida, é focada por uma lente acromática (feu = 200 mm) para o
plano focal posterior de uma objetiva de alta abertura numérica
(Nikon Plan Apo 60× NA 1.49) e finalmente emerge da objetiva
como um feixe paralelo. O raio do ponto focal é estimado Δd
= {(DA / 2)f eu} = 11 μm.
No braço de detecção, um cubo de polarização é colocado para
dividir lateralmente os componentes de polarização s e p da luz
refletida. O feixe polarizado S, sem informações, atua como o braço
de referência do interferômetro. Ele passa por outra placa λ / 2, que
gira sua polarização em 90 graus, convertendo-a em um feixe p-
polarizado, permitindo, dessa forma, a interferência com o feixe do
objeto e, assim, a formação das imagens holográficas. O padrão de
interferência dos dois feixes é registrado em uma câmera CCD
(UI-1550SE, 1,92 MPix; tamanho do pixel, 2,8 μm) e analisado por
processamento numérico. O ângulo de saída θ do feixe de laser da
objetiva é alterado usando um estágio de translação linear e
calculado pela condição senoidal de um sistema óptico aplanático:d
= fob sin (θ), onde d
é o deslocamento lateral do palco e f a distância focal objetiva.
O erro em θ devido ao tamanho do ponto focal finito no plano
focal posterior da objetiva é dado por Δθ = {1 / (1 - sin2 θ)}1/2
(Δd / fob) Em nossa configuração em 45°, o erro esperado é Δθ = 4,8 mrad.
Holografia digital. A holografia digital na geometria fora do
eixo é baseada no princípio clássico da holografia, com a
diferença de que o registro do holograma é realizado por uma
câmera digital e transmitido para um computador e a
subsequente reconstrução da imagem holográfica é realizada
numericamente.
A intensidade registrada euH(xH,yH) no plano do holograma é o
módulo quadrado da superposição de amplitude do objeto e das
ondas de referência. É dado por
euH(xH, H ) |2 + |R |02 + O* 0 (x H, y )HR0
y ) = |O0(xH, y H
+ O0(xH, y H)R0 *
Os dois primeiros termos representam as intensidades das ondas de
referência e de objeto, respectivamente. Eles não fornecem informações
espaciais sobre o campo óptico do objeto e formam o termo de ordem
zero. Os dois últimos termos fornecem frequência espacial do
holograma gravado e são responsáveis pelas imagens virtuais e reais,
respectivamente. Nós reconstruímos hologramas propagando
numericamente o campo óptico ao longo doz direção usando o método
de espectro angular, que tem uma vantagem significativa por não ter
um requisito de distância mínima de reconstrução. SeE (x, y;0) é a frente
de onda no plano z = 0, o espectro angular
A (ξ, η;0) = F {E (x, y;0)} neste plano é obtido tomando a
transformada de Fourier, onde F {} denota a transformada de
Fourier; ξ e η são as frequências espaciais correspondentes dex e y
direções, respectivamente; ez é a direção de propagação da onda
do objeto. O novo espectro angular A no planoz = d é calculado a
partir de A (ξ, η;0) como
UMA(ξ, η; d) = UMA(ξ, η; 0) exp{ j
2πd
λ
[1 - (λξ)2 - (λη)2]2 }
A complexa frente de onda reconstruída no plano z = d é encontrada
tomando a transformada inversa de Fourier como
E(x , y; d) = F-1{UMA(ξ, η; d)}
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Química Analítica
Onde F-1{} denota a transformação inversa de Fourier. A
imagem de intensidadeI (x, y; d) e imagem de fase φ (x, y; d)
são obtidos simultaneamente a partir de um único holograma
digital, calculando o módulo quadrado da amplitude e o
argumento da frente de onda complexa reconstruída:
eu(x , y; d) = |E(x , y; d) |2
⎛ Eu estou[E(x , y; d)] ⎞
ϕ(x , y; d) = arctan⎜ ⎟
⎝ Ré[E(x , y; d)] ⎠
A resolução das imagens reconstruídas do método do
espectro angular é a mesma que no plano do holograma.30
Podemos assumir que a refletividade é 1 quando a amplitude da
onda do objeto é máxima, então a refletividade da amplitude r
pode ser definida como a normalização de I (x, y: d).13
Preparação de amostra. 10 mm padrão × Substratos de vidro de 10
mm foram limpos em acetona e 5 minutos em banho de ultrassom.
Depois disso, eles foram revestidos com ouro de 50 nm de espessura
por meio de pulverização catódica de magnetron e, em seguida, um
fotorresiste positivo (Microresist mp-1210) foi revestido por rotação na
superfície do ouro. Finalmente, a litografia de máscara convencional foi
sed para padronizar linhas e cúpulas de 10 μm de largura.
■RESULTADOS E DISCUSSÃO
você
A configuração usa uma objetiva de imersão em óleo com NA de 1,49.
Usando esta objetiva, quando a luz incidente é deslocada para a borda
da abertura traseira da objetiva, ela alcançará a amostra em um ângulo
maior do que o ângulo crítico até um ângulo nominal máximo de 79,6°.
A cobertura de grande ângulo permite ajustar as condições de excitação
do SPR para obter o contraste e a sensibilidade da imagem que melhor
se adaptam a uma ampla gama de amostras.
Comparação com o SPRi padrão através do objetivo. A fim de
avaliar a confiabilidade das imagens de contraste de amplitude
obtidas por reconstrução numérica, nós as comparamos com
imagens SPR de contraste de amplitude convencionais
(gravadas desligando o feixe de referência) usando padrões
fotorresistentes na superfície de ouro como uma amostra,
Figura 2a, b. O ângulo de incidência foi fixado próximo ao
ângulo mínimo SPR da interface aérea. A comparação dos
perfis de intensidade em correspondência com o fotorresiste
não mostra diferenças significativas entre as duas imagens
comprovando, assim, a confiabilidade da reconstrução
numérica, Figura 2c. Além disso, a redução do ruído coerente no
Figura 2. A reconstrução da amplitude corresponde com precisão à imagem
original: (a) imagem SPR convencional do padrão fotoresiste, (b) reconstrução
da amplitude e (c) comparação entre os perfis de intensidade das duas
imagens em correspondência com a linha tracejada. Barra de escala de 10 μm.
4126
Nota técnica
a reconstrução retorna um aumento de 20% na relação sinal-ruído
para o HoloSPRi e uma melhoria no índice de manchas de 39%,
consulte as informações de apoio.
Imagem Simultânea de Amplitude e Contraste de Fase SPR de
Padrões Poliméricos. A imagem SPR pode ser útil quando se trata
de medir a espessura de um filme em uma superfície. Ele tem, de
fato, uma resolução na direção axial de alguns nanômetros, o que é
útil para revelar pequenas características, como irregularidades em
superfícies planas ou imperfeições em um padrão específico.
Usamos o HoloSPRi para obter imagens simultâneas de amplitude e
contraste de fase de dois padrões poliméricos. O primeiro padrão
foi feito por cúpulas de 10 μm de diâmetro, enquanto o segundo foi
feito por uma série de linhas com espaçamento de 10 μm, Figura 3a
− d.
Figura 3. A holografia digital permite a recuperação simultânea de imagens de
contraste de amplitude e fase. Padrão de cúpulas fotorresistentes: imagem de
contraste de amplitude (a) e imagem de contraste de fase (b). Padrão de linhas
fotorresistentes: imagem de contraste de amplitude (c) e imagem de contraste de
fase (d). Barra de escala de 10 μm.
Os padrões foram realizados pelo processo de litografia de
interferência de um polímero fotoresiste fiado em um substrato de
ouro. Condições não ideais no processo fotolitográfico podem
ocasionar irregularidades no padrão e a presença de defeitos locais
no filme polimérico. Aproveitamos isso para mostrar como tais
irregularidades podem ser claramente observadas com imagens
SPR e como as imagens de amplitude e contraste de fase destacam
diferentes características da mesma amostra. Na Figura 3a, b, por
exemplo, o mapa de amplitude mostra com bom contraste um
resíduo fotoresiste, entre duas cúpulas no centro da imagem,
enquanto o mapa de fase enfatiza as imperfeições no topo das
cúpulas. É importante notar, além disso, que embora o mapa de
fase na Figura 3d pareça mais organizado em comparação com o
mapa de amplitude na Figura 3c, ele também mostra três linhas
nítidas, enquanto no último não há sinal. Isso se deve a uma
ambigüidade na resposta do SPR, que pode ser superada, em
grande parte, com uma escolha acertada das condições
experimentais, pela coleta simultânea de imagens de amplitude e
fase obtidas com o HoloSPRi.
A complementaridade da informação dada pela amplitude e fase
na imagem SPR não se limita apenas a determinar ambigüidades
na interpretação da imagem, mas se estende ainda mais à
sensibilidade. Em princípio, então, é possível aproveitar esse
recurso e mesclar as informações de amplitude e fase para
construir um mapa 3D sintético com sensibilidade aprimorada.
Relatamos na Figura 4 o mapa sintético do mesmo padrão
mostrado anteriormente na Figura 3a, b. O mapa foi obtido
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Química Analítica
Figura 4. (a) Mapa sintético 3D de linhas fotorresistentes obtido mesclando as
imagens de amplitude e contraste de fase na Figura 3a, b. (b) Gráfico do perfil
no centro do mapa (ver linha tracejada vermelha).
levando em consideração as imagens de amplitude e fase, consulte
as Informações de Apoio.
Um perfil obtido por medições de perfilometria (Dektak XT 2011) das
linhas fotorresistentes foi comparado com um perfil de um contraste de
amplitude, contraste de fase e mapa sintético, respectivamente,
consulte a Figura S-2 nas Informações de Apoio. A análise de correlação
e a análise do erro quadrado estão resumidas na Tabela 1. Elas mostram
um bom ajuste entre os dois perfis e, a propósito, uma melhor
concordância em relação aos perfis calculados usando apenas dados de
amplitude ou fase.
Tabela 1. Estimativa da Verossimilhança de Três Perfis de
Linhas Fotoresistentes obtidas pelas Figuras 3a, be 4uma
erro quadrado
perfil coeficiente de correlação quer dizer modo max
0,83 0,19
amplitude 2,53 × 10-9
Estágio 0,47 0,47 9,06 × 10-7 10
sintético 0,94 0,03 1,70 × 10-7
umaCada um deles é comparado com o mesmo perfil medido por
perfilometria.
Medições cinéticas de evaporação de gotículas. A aquisição
simultânea de imagens de amplitude e contraste de fase pode ser
útil também em medições cinéticas. Monitoramos, então, a
evaporação de uma gota de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle
Medium) em tempo real. A gota foi depositada na superfície de uma
lamela revestida de ouro iluminada em um ângulo de incidência de
cerca de 60 graus e uma série de hologramas da gota de
evaporação foram tirados a cada 0,42 s. As imagens SPR de
contraste de amplitude reconstruídas são mostradas no filme, e a
Figura 5a-d mostra as reconstruções de amplitude e fase no início e
no final das medições. O índice de refração de uma solução mostra
aproximadamente um comportamento linear com a concentração.
Enquanto a evaporação ocorre, a concentração do soluto aumenta,
produzindo um aumento no índice de refração. Este aumento pode
ser detectado por imagens SPR
Nota técnica
Figura 5. Evaporação de uma gota DMEM. Reconstruções das
imagens SPR de amplitude e contraste de fase emT = 0 s, partes a e
c, respectivamente, e T = 20 s, partes b e d, respectivamente. (e) A
refletividade e a fase foram calculadas no centro da gota.
para obter um comportamento qualitativo de concentração no tempo, consulte
■
igure 5e.
F CONCLUSÕES
A técnica HoloSPRi baseada em objetivos oferece a possibilidade de
detecção simultânea de refletividade e mudanças de fase em imagens
SPR. Ele estende, portanto, a faixa de amostras detectáveis e produz
uma capacidade de processamento mais alta com relação aos métodos
de imagem de contraste de fase e contraste de amplitude. Em
comparação com as técnicas de imagens holográficas SPR anteriores,
evita aberrações geométricas e limitações devido ao uso de um prisma.
Por fim, o emprego de uma configuração semelhante à amplamente
utilizada TIR tipo objetiva e o design modular o mantém compatível com
os microscópios convencionais, abrindo caminho para uma fácil
implementação com outras técnicas ópticas,
1,6
■
da microscopia de campo claro padrão para a fluorescência.
0,1
f CONTEÚDO ASSOCIADO
*S Informações de Apoio
Informações adicionais conforme observado no texto. Este material está
disponível gratuitamente na Internet em http://pubs.acs.org.
*C Recurso Web-Enhanced
Um filme de imagens SPR de contraste de amplitude reconstruídas é
■
Disponível na versão online do jornal.
umaINFORMAÇÃO SOBRE O AUTOR
Autor correspondente
* E-mail: b.mandracchia@cib.na.cnr.it.
Notas
■
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
T AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi apoiado por Progetto “Smart Cities” -
■
quaSystem: Grant PON04a2.
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