Manual Analises Microbiologicas

MANUAL DE MÉTODOS DE
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
DE ALIMENTOS E ÁGUA
5ª edição
NEUSELY DA SILVA
VALÉRIA CHRISTINA AMSTALDEN JUNQUEIRA
NELIANE FERRAZ DE ARRUDA SILVEIRA
MARTA HIROMI TANIWAKI
RENATO ABEILAR ROMEIRO GOMES
MARGARETE MIDORI OKAZAKI
Manual de métodos de
análise microbiológica
de alimentos e água
00 iniciais MICROBIOL_PROD.indd 1 08/06/2017 20:39:47

Neusely da Silva
Valéria Christina Amstalden Junqueira
Neliane Ferraz de Arruda Silveira
Marta Hiromi Taniwaki
Renato Abeilar Romeiro Gomes
Margarete Midori Okazaki
Manual de métodos de
análise microbiológica
de alimentos e água
5ª edição

Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
© 2017 Neusely da Silva, Valéria Christina Amstalden Junqueira, Neliane Ferraz de Arruda Silveira, Marta Hiromi Taniwaki,
Renato Abeilar Romeiro Gomes, Margarete Midori Okazaki
1ª edição digital – 2018
Editora Edgard Blücher Ltda.
Imagem da capa: iStockphoto
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Angélica Ilacqua CRB-8/7057
Rua Pedroso Alvarenga, 1245, 4º andar Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos
04531-934 – São Paulo – SP – Brasil e água [livro eletrônico] / Neusely da Silva...[et al]. – 5. ed. –
Tel.: 55 11 3078-5366 São Paulo : Blucher, 2017.
contato@blucher.com.br 560 p. ; PDF.
www.blucher.com.br
Bibliografia
Segundo o Novo Acordo Ortográfico, conforme 5. ed. ISBN 978-85-212-1226-3 (e-book)

do Vocabulário Ortográfico da Língua Portuguesa,
Academia Brasileira de Letras, março de 2009.
1. Microbiologia 2. Água – Análise 3. Alimentos –
Microbiologia 4. Alimentos - Análise I. Título
É proibida a reprodução total ou parcial por quaisquer

meios sem autorização escrita da editora. 17-0850 CDD 628.161
Todos os direitos reservados pela Editora Edgard Blücher Ltda.

Índices para catálogo sistemático:
1. Água – Análise microbiológica
2. Alimentos – Análise microbiológica
p.iv_Silva.indd 4 07/03/2018 17:54:27

Apresentação da 5ª edição
Desde sua primeira edição, em 1997, este livro térias lácticas, bolores e leveduras, Pseudomonas
foi preparado para fornecer um manual de méto- spp, clostrídios sulfito redutores); indicadores de
dos de análise microbiológica de alimentos em higiene e condições sanitárias (coliformes, E. coli,
português, com metodologia aceita pela Agência enterococos); esporos de bactérias (mesófilas e
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). São termófilas, aeróbias e anaeróbias, acidúricas como
métodos padronizados e publicados por organiza- Bacillus coagulans e Clostridium butyricum ou
ções internacionais renomadas, como a American acidófilas, como Alicyclobacillus); fungos dete-
Public Health Association (APHA), a Interna- riorantes (bolores termorresistentes, leveduras
tional Organization for Standardization (ISO), a osmofílicas, leveduras resistentes aos conservan-
Food and Drug Administration (FDA), o United tes) e bactérias patogênicas (Salmonella, Listeria
States Department of Agriculture (USDA) e a monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus
AOAC International. cereus, Clostridium perfringens, Campylobacter,
O principal objetivo do livro é oferecer um Cronobacter, E. coli O157:H7, Vibrio cholerae,
manual ilustrado de técnicas de laboratório, com Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yer-
uma visão geral dos métodos disponíveis atual- sinia enterocolitica) e, também, o teste de este-
mente. O texto foi preparado para atender tanto rilidade comercial/causa da deterioração para ali-
a profissionais com formação acadêmica quanto mentos enlatados.
a técnicos de laboratório e estudantes sem forma- Na quarta edição o escopo do livro foi amplia-
ção de nível superior. A configuração didática e do, passando a abordar também a análise micro-
a visualização dos procedimentos em esquemas biológica de água de consumo humano. Foram
passo-a-passo permitem entender e executar rapi- incluídos vários métodos da American Public He-
damente o procedimento pretendido. Cada capí- alth Association (APHA)/American Water Works
tulo fornece vários métodos para um determinado Association (AWWA)/Water Environment Fede-
exame e, também, as alternativas simples ou rápi- ration (WEF) e da ISO para bactérias heterotró-
das (kits) disponíveis. ficas totais, coliformes totais/termotolerantes/E.
Na introdução de cada capítulo é feita uma re- coli, enterococos, clostrídios sulfito redutores/
visão extensiva da literatura, apresentando o que Clostridium perfringens e Pseudomonas aerugi-
há de mais recente sobre o assunto tratado no ca- nosa.
pítulo. O livro também contempla as mudanças Nesta 5ª edição vários métodos foram revisa-
de nomenclatura das bactérias relevantes em ali- dos de acordo com as novas edições das referên-
mentos, ocorridas até dezembro de 2016. Dessa cias usadas, incluindo: a 5ª edição (2015) do Com-
forma, o manual oferece um material de conteúdo pendium of Methods for the Microbiological Exa-
profundo, moderno e atualizado, que se constitui mination of Foods, da APHA; a 22ª edição (2012)
em base teórica sólida para a compreensão da me- do Standard Methods for the Examination of Wa-
todologia e interpretação dos resultados. ter & Wastewater, da APHA/AWWA/WEF; a 20ª
Foram incluídos métodos para a enumeração edição (2016) do Official Methods of Analysis of
de microrganismos indicadores de contaminação AOAC International, da AOAC International e as
geral (contagem total de aeróbios mesófilos, bac- versões correntes em abril de 2017 do Bacteriolo-

VI □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
gical Analytical Manual [BAM Online], da FDA, esporos de C. perfringens em água. Esse mé-
do Microbiology Laboratory Guidebook [MLG todo é uma modificação do método ISO 6461-
Online], do USDA e das normas ISO. No índice 1:1986 para clostrídios sulfito redutores, ao
estão discriminados os itens que sofreram altera- qual foi incorporada uma etapa de confirmação
ções nesta 5ª edição e os detalhes das alterações para C. perfringens. Atualmente já se dispõe
estão descritos no início de cada capítulo. de métodos mais modernos e mais seletivos
Vários métodos que não constavam da 4ª edi- para C. perfringens em água.
ção foram adicionados nesta 5ª encontrando-se 18.4. (4ª ed. 2010) Método APHA:2001 de pla-
destacados no índice. queamento direto para Listeria monocytoge-
Da mesma forma, alguns métodos que consta- nes em alimentos. É um método pouco usado e
vam da 4ª edição foram suprimidos desta 5ª: pouco avaliado, em comparação com os méto-
12.4. (4ª ed. 2010) Método ANVISA:2001 de dos de plaqueamento ISO 11290-2 (item 18.4
contagem em placas para clostrídios sulfito re- da 5ª ed.) e BAM FDA (item 18.2. da 5ª ed.).
dutores a 46 ºC em alimentos. Esse método é 22.7. (4ª ed. 2010) Métodos APHA:2001 para
uma modificação mínima do método da APHA detecção ou contagem de Alicyclobacillus. É
para Clostridium perfringens e foi incorporado um método pouco usado e pouco avaliado, em
como nota no item 12.2.2.c. da 5ª edição. comparação com o método IFU 12:2007 (item
12.6. (4ª ed. 2010) Método CETESB:1993 para 22.7 da 5ª ed.).

Autores
Neusely da Silva
Engenheira de Alimentos, com Doutorado em Ciências de Alimentos pela
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). É pesquisadora da Uni-
dade Laboratorial de Referência em Microbiologia do Instituto de Tecnolo-
gia de Alimentos de Campinas (ITAL), órgão de pesquisa da Secretaria de
Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo. Exerce atividades de
pesquisa, desenvolvimento e inovação (P&D&I) para o setor de alimentos,
com vários livros e artigos científicos publicado no Brasil e no exterior. Sua
área de concentração é o desenvolvimento, adequação, avaliação e validação
de novos métodos de análise microbiológica de água e alimentos.
Endereço eletrônico: neusely@ital.sp.gov.br e neusely.da.silva@gmail.com.
Valéria Christina Amstalden Junqueira

Bióloga, com Doutorado em Tecnologia de Alimentos pela Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP). Foi pesquisadora do Laboratório de
Microbiologia do ITAL, onde concentrava suas atividades no estudo da de-
terioração de alimentos termo-processados e no estudo de bactérias anaeró-
bias patogênicas de importância em água e alimentos, incluindo Clostridium
perfringens e Clostridium botulinum. Possui uma ampla experiência de con-
sultoria a indústrias privadas processadoras de alimentos, principalmente em
produtos contaminados por microrganismos anaeróbios patogênicos e dete-
riorantes.
Endereço eletrônico: valeriacaj@gmail.com.
Neliane Ferraz de Arruda Silveira

Bióloga com Doutorado em Tecnologia de Alimentos pela Universidade Es-
tadual de Campinas (UNICAMP), na área de higiene e legislação de alimen-
tos. Pesquisadora da Unidade Laboratorial de Referência em Microbiologia
do ITAL, concentra suas atividades no controle da qualidade microbiológica
de alimentos, com ênfase em pescado de água salgada e doce; frutas e horta-
liças minimamente processadas, alimentos servidos em refeições coletivas e
produtos cárneos.
Endereço eletrônico: neliane@ital.sp.gov.br.
Marta Hiromi Taniwaki

Bióloga, com Doutorado na Universidade de New South Wales, em Syd-
ney-Australia. É pesquisadora da Unidade Laboratorial de Referência em
Microbiologia do ITAL, onde exerce atividades de pesquisa, desenvolvi-

VIII □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
mento e inovação (P&D&I). Expert em micologia de alimentos, membro

da International Commission on Food Mycology (ICFM) e da International
Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). Presta
consultoria a empresas públicas e privadas, para o controle de fungos e mi-
cotoxinas em alimentos.
Endereço eletrônico: marta@ital.sp.gov.br.
Renato Abeilar Romeiro Gomes
Engenheiro Agrícola, com mestrado em Engenharia Agrícola pela Universi-
dade Federal de Viçosa. Foi diretor do Centro de Informação em Tecnologia
de Alimentos (CIAL) do ITAL, concentrando suas atividades na divulgação
de informações tecnológicas para o setor de alimentos. Atualmente é pesqui-
sador no Centro de Tecnologia de Laticínios (TECNOLAT) do ITAL.
Endereço eletrônico: rarg@ital.sp.gov.br.
Margarete Midori Okazaki

Engenheira de Alimentos, com Mestrado em Tecnologia de Alimentos pela
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), na área de higiene e legis-
lação de alimentos. É pesquisadora da Unidade Laboratorial de Referência
em Microbiologia do ITAL, onde atualmente é vice diretora. Sua área de
concentração é o controle de qualidade de água e alimentos. Atua também
em áreas de capacitação técnica com foco em métodos de análises microbio-
lógicas de alimentos e água, boas práticas em laboratório e em serviço de
alimentação coletiva.
Endereço eletrônico: okazaki@ital.sp.gov.br.

Conteúdo
Capítulo 1. 2.3.1. Procedimento para a homogeneização

Coleta, transporte e estocagem de e retirada da unidade analítica de produtos
amostras para análise líquidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2.3.2. Procedimento para a homogeneização
Lote. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 e retirada da unidade analítica de produtos
Amostra de lote e unidade de amostra . . . . . . 1 sólidos ou líquidos concentrados. . . . . . . . . . . 14
Planos de amostragem de lotes. . . . . . . . . . . . 2 2.3.3. Procedimento para a retirada da
Unidade analítica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 unidade analítica pela técnica do esfregaço
1.2. Material necessário . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 de superfície . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3. Coleta de amostras para análise. . . . . . . . . . . 3 2.3.3.1. (revisado) Amostragem com
1.3.1. (revisado) Seleção e preparação de “swabs”. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
frascos para coleta de alimentos acondicionados 2.3.3.2. Amostragem com esponjas . . . . . . . . . . . 17
em embalagens não individuais. . . . . . . . . . . . 3 2.3.4. Procedimento para a retirada da unidade
1.3.2. Procedimentos para a coleta de alimentos analítica pela técnica da lavagem superficial . 17
acondicionados em embalagens não individuais. 4 2.3.4.1. Procedimento para a lavagem de
1.3.3. Coleta de alimentos envolvidos em casos carcaças de aves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
de doenças de origem alimentar (DTAs). . . . . . 5 2.3.4.2. Procedimento para a lavagem de
1.3.4. (revisado) Coleta de amostras de água. . . . 5 outros alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.4. Transporte e estocagem de amostras até o 2.3.4.3. Procedimento para a lavagem de
momento da análise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 embalagens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.4.1. Transporte e estocagem de alimentos 2.3.5. Guarda de contra-amostras. . . . . . . . . . . . . 18
com baixa atividade de água. . . . . . . . . . . . . . 6 2.4. (revisado) Preparo da 1ª diluição da unidade
1.4.2. Transporte e estocagem de alimentos analítica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
congelados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Diluentes para os ensaios de
1.4.3. (revisado) Transporte e estocagem de presença/ausência. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
alimentos refrigerados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Diluentes para os ensaios que requeiram
1.4.4. Transporte e estocagem de alimentos tratamento diferenciado da amostra . . . . . . . 19
comercialmente estéreis em embalagens Diluentes para os ensaios gerais de
herméticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 quantificação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.4.5. (revisado) Transporte e estocagem de Como obter uma diluição inicial de 1:10 (10-1). . 19
amostras de água. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 Como obter uma diluição inicial
1.5. Recepção de amostras para análise . . . . . . . . 8 diferente de 1:10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.6. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Procedimento para o preparo da primeira
diluição de amostras líquidas . . . . . . . . . . . . 19
Capítulo 2. Procedimento para o preparo da primeira
diluição de amostras sólidas ou líquidos
Preparação de amostras para análise
concentrados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Procedimento para o preparo da primeira
2.2. Material necessário . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
diluição de amostras obtidas por esfregaço de
2.3. Homogeneização da amostra e retirada da
superfície ou por lavagem superficial. . . . . . 20
unidade analítica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

X □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
2.5. (revisado) Diluição decimal seriada da o) Produtos lácteos fermentados. . . . . . . . . . . 27

amostra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 p) Caseína e caseinatos. . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Como obter a segunda diluição (10-2). . . . . . . 21 q) Paracaseína com problemas de solubilidade. 28
Como obter as diluições subsequentes . . . . . . 21 r) Moluscos (bivalves e gastrópodes) e
2.6. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 ouriços do mar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Anexo 2.1. (revisado) Procedimentos para s) Pepinos do mar (Holothuroidea) e
homogeneização do conteúdo e retirada da tunicados ou ascídias (Ascidiacea). . . . . . . . 28
unidade analítica de amostra de diferentes
tipos de alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Capítulo 3.
a) Produtos em pó. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Técnicas básicas de contagem de
b) Produtos pastosos ou moídos . . . . . . . . . . . 23 microrganismos em placas
c) Iogurtes com pedaços de frutas. . . . . . . . . . 23 3.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
d) Queijos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 3.2. Plaqueamento em profundidade (pour plate). 30
e) Produtos muito duros . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 3.2.1. Material requerido nas análises. . . . . . . . . . 30
f) Peças de alimentos sólidos . . . . . . . . . . . . . 23 3.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
g) Ovos em casca. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 3.3. Plaqueamento em superfície (spread plate). . 32
h) Cortes de carne para análise de contaminação 3.3.1. Material requerido nas análises. . . . . . . . . . 32
não superficial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.3.2. (revisado) Procedimento . . . . . . . . . . . . . . 32
i) Moluscos bivalves (ostra, mexilhão, lingueirão, 3.4. Plaqueamento em gotas (drop plate). . . . . . . 33
berbigão, conquilha, ameijoa). . . . . . . . . . . . . 24 3.4.1. Material requerido nas análises. . . . . . . . . . 33
j) Moluscos gastrópodes (caracol, caramujo, 3.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
búzio, lapa, apa, lesma). . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.5. Filtração em membrana. . . . . . . . . . . . . . . . . 34
k) Moluscos cefalópodes (polvo, lula) . . . . . . 24 3.5.1. Material requerido nas análises. . . . . . . . . . 34
l) Caranguejos e lagostas. . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
m) Ouriços do mar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.6. Contagem das colônias e cálculo dos
Anexo 2.2. (revisado) Casos especiais em que há resultados segundo a APHA. . . . . . . . . . . . . . 36
variações na unidade analítica e/ou diluição e/ou 3.6.1. Plaqueamento em profundidade. . . . . . . . . 36
diluentes recomendados para a preparação 3.6.1.1. Cálculo dos resultados na situação
da primeira diluição de amostras de diferentes padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
tipos de alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.6.1.2. (revisado) Regras para o cálculo em
a) Líquidos com baixa contaminação. . . . . . . 25 situações não usuais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
b) Alimentos gordurosos. . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.6.1.3. Cálculo dos resultados
c) Pós de baixa solubilidade com tendência à para amostras preparadas pela técnica
formação de grumos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 do esfregaço de superfície
d) Espessantes ou produtos com antimicrobianos (“swabs” ou esponjas). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
naturais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.6.1.4. Cálculo dos resultados para
e) Gelatina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 amostras preparadas pela técnica da
f) Produtos ácidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 lavagem superficial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
g) Farinhas, cereais, ração animal. . . . . . . . . . 26 3.6.2. Plaqueamento em superfície. . . . . . . . . . . . 41
h) Cacau e chocolate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.6.3. Plaqueamento em gotas. . . . . . . . . . . . . . . . 42
i) Clara de ovo líquida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.6.4. Filtração em membrana. . . . . . . . . . . . . . . . 42
j) Produtos fermentados contendo 3.7. (revisado) Contagem das colônias e
microrganismos vivos destinados à cálculo dos resultados segundo a ISO. . . . . . . 42
quantificação da microbiota contaminante 3.7.1. Exigências gerais para o cálculo
(exceto probióticos). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
k) Produtos lácteos em pó 3.7.2. Regras gerais para o cálculo dos
(leite, soro de leite, creme de leite, lactose) . 27 resultados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
l) Manteiga . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.7.3. Regras para o cálculo em situações
m) Produtos lácteos congelados . . . . . . . . . . . 27 não usuais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
n) Queijos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.8. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Conteúdo □ XI
Anexo 3.1. (novo) Limite de concordância Teste de malonato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

aceitável entre as contagens de colônias obtidas Teste de oxidação/fermentação (O/F). . . . . . . 66
em placas de duas diluições subsequentes Teste de oxidase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
(ISO 14461-2:2005) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 Teste de redução do nitrato. . . . . . . . . . . . . . . 67
Anexo 3.2. (novo) Limite de concordância Teste de urease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
aceitável entre as contagens de colônias obtidas Teste de vermelho de metila (VM). . . . . . . . . 68
em um par de placas de uma duplicata Teste de Voges-Proskauer (VP). . . . . . . . . . . . 68
(ISO 14461-2:2005) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 5.2. Material requerido nas análises. . . . . . . . . . . 68
5.3. Procedimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
a) Pré-enriquecimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
Capítulo 4. Composição de amostras a seco. . . . . . . . . . 68
Técnicas básicas de contagem b) Enriquecimento seletivo. . . . . . . . . . . . . . . 69
de microrganismos pelo Composição úmida de amostras em ensaios
número mais provável (NMP) com duas etapas de enriquecimento. . . . . . . 69
4.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Composição úmida em ensaios com uma
4.2. Teste de diluição múltipla . . . . . . . . . . . . . . . 52 única etapa de enriquecimento. . . . . . . . . . . 69
4.2.1. Material requerido nas análises. . . . . . . . . . 53 c) Plaqueamento diferencial . . . . . . . . . . . . . . 69
4.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 c.1) Técnica de inoculação por estrias de
4.3. Teste de diluição única. . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 esgotamento para obter culturas puras . . . . . 69
4.3.1. Material requerido nas análises. . . . . . . . . . 54 d) Seleção de colônias e repique de culturas
4.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 para confirmação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.4. Cálculo dos resultados. . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 d.1) Técnica de repique de culturas puras
4.4.1. Cálculo dos resultados do teste de a partir de colônias isoladas em placas. . . . . 70
diluição múltipla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 e) Testes de confirmação. . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.4.1.1. Cálculo usando as tabelas de NMP e.1) (corrigido) Coloração de Gram
(para diluições decimais) . . . . . . . . . . . . . . . . 55 (método de Hucker) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.4.1.2. Cálculo usando a fórmula de Thomas e.2) (novo) Teste do KOH para confirmação
(para diluições não decimais). . . . . . . . . . . . . 57 da coloração de Gram duvidosa
4.4.1.3. Cálculo dos resultados para amostras (Gregersen, 1978). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
preparadas pela técnica do esfregaço de e.3) Coloração de esporos
superfície ou da lavagem superficial. . . . . . . . 57 (método de Schaeffer-Fulton). . . . . . . . . . . 71
4.4.2. Cálculo dos resultados do teste de diluição única. 57 e.4) (corrigido) Coloração de esporos
4.5. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 (método de Ashby). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Anexo 4.1. Tabelas de NMP. . . . . . . . . . . . . . . . . 59 e.5) Montagens úmidas para observação
microscópica a fresco. . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Capítulo 5. 5.4. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Técnicas básicas de detecção
da presença/ausência de Capítulo 6.
microrganismos Contagem total de microrganismos
5.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 aeróbios mesófilos e psicrotróficos
Enriquecimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 em placas
Isolamento em meios sólidos 6.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
(plaqueamento diferencial). . . . . . . . . . . . . . . 64 6.1.1. (revisado) Significado da contagem
Confirmação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 total de aeróbios mesófilos . . . . . . . . . . . . . . . 73
Teste de catalase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 6.1.2. (revisado) Definição de psicrotróficos. . . . 74
Teste de citrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 6.1.3. (revisado) Comentários sobre os
Testes de descarboxilação de aminoácidos. . . 65 métodos de análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Teste de fenilalanina deaminase . . . . . . . . . . . 65 6.2. (revisado) Método de plaqueamento
Testes de fermentação de carboidratos. . . . . . 66 APHA 08:2015 para contagem total de
Teste de indol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 aeróbios mesófilos em alimentos. . . . . . . . . . . 77

XII □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
6.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 77 7.2.b. (novo) Métodos de plaqueamento

6.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 ISO 21527-1:2008 e ISO 21527-2:2008
6.2.2.1. Plaqueamento em profundidade. . . . . . . . 77 para contagem de bolores e leveduras
6.2.2.2. Plaqueamento em superfície . . . . . . . . . . 79 em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
6.2.2.3. Filtração em membrana. . . . . . . . . . . . . . 79 7.2.b.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 95
6.3. (revisado) Métodos de plaqueamento em 7.2.b.2. Procedimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Petrifilm™ AOAC 986.33/989.10/990.12 7.3. (revisado) Método de plaqueamento
para contagem total de aeróbios mesófilos APHA 13:2015 para contagem de fungos
em alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 psicrotróficos em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . 98
6.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 80 7.4. (revisado) Método de plaqueamento
6.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 APHA 22.4:2015 para contagem de bolores
6.4. (revisado) Método de plaqueamento termorresistentes em alimentos. . . . . . . . . . . . 98
APHA 13.61:2015 para contagem de bactérias 7.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 98
aeróbias psicrotróficas em alimentos. . . . . . . . 81 7.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
6.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 81 7.5. Métodos de Pitt & Hocking:2009 para
6.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 plaqueamento ou presença/ausência de
6.5. (novo) Métodos de plaqueamento leveduras resistentes aos conservantes
ISO 4833-1:2013 e ISO 4833-2:2013/Corr.1:2014 em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
para contagem total de aeróbios mesófilos 7.5.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 102
em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 7.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
6.5.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 83 7.5.2.1. Método qualitativo de detecção
6.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 com enriquecimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
6.6. (novo) Métodos de plaqueamento 7.5.2.2. Método de contagem direta em
ISO 6222:1999 para contagem total placas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
de aeróbios mesófilos em água. . . . . . . . . . . . 85 7.6. (revisado) Método de plaqueamento ou
6.6.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 85 filtração em membrana APHA 17.3:2015
6.6.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 para contagem de leveduras osmofílicas
6.7. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
7.6.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 105
7.6.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
Capítulo 7. 7.6.2.1. Método de filtração em membrana . . . . . 105
Contagem de bolores e leveduras 7.6.2.2. Método de plaqueamento em
profundidade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
7.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
7.7. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
7.1.1. (revisado) Comentários sobre os métodos de
análise de bolores e leveduras totais. . . . . . . . 88
7.1.2. Fungos psicrotróficos . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 Capítulo 8.
7.1.3. (revisado) Bolores termorresistentes. . . . . 89 Contagem de enterobactérias
7.1.4. Leveduras resistentes a conservantes. . . . . 90 8.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Zigosaccharomyces bailii. . . . . . . . . . . . . . . . 90 8.1.1. Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Zygosaccharomyces bisporus. . . . . . . . . . . . . 91 8.1.2. Comentários sobre os métodos de
Schizosaccharomyces pombe . . . . . . . . . . . . . 91 análise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
Candida krusei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 8.2. (revisado) Método de plaqueamento
Pichia membranaefaciens. . . . . . . . . . . . . . . . 91 APHA 9.62:2015 para contagem de
7.1.5. Leveduras osmofílicas . . . . . . . . . . . . . . . . 92 enterobactérias em alimentos . . . . . . . . . . . . . 108
Zygosaccharomyces rouxii . . . . . . . . . . . . . . . 92 8.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 108
7.2.a. (revisado) Método de plaqueamento 8.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
APHA 21:2015 para contagem de bolores e 8.3. (revisado) Método do NMP
leveduras em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 APHA 9.61:2015 para contagem
7.2.a.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 93 de enterobactérias em alimentos. . . . . . . . . . . 110
7.2.a.2. Procedimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 8.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 110

Conteúdo □ XIII
8.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 9.6.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

8.4. (revisado) Método do Petrifilm™ 9.7. (revisado) Método do NMP
AOAC 2003.1:2016 para contagem de AOAC 991.15:2016 (substrato
enterobactérias em alimentos . . . . . . . . . . . . . 112 cromogênico Colilert®) para contagem
8.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 112 de coliformes totais e E. coli em água. . . . . . . 134
8.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 9.7.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 134
8.5. (novo) Método de plaqueamento 9.7.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
ISO 21528-2:2004 para contagem de 9.8 (novo) Método de filtração ISO 9308-1:2014
enterobactérias em alimentos . . . . . . . . . . . . . 113 para contagem de coliformes totais e
8.5.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 113 E. coli em água . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
8.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 9.8.1. Material requerido para a análise . . . . . . . . 135
8.6. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 9.8.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
9.9. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Capítulo 9.
Contagem de coliformes totais, Capítulo 10.
coliformes termotolerantes e Staphylococcus aureus
Escherichia coli 10.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
9.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 10.1.1 Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
9.1.1. Definição de coliformes totais . . . . . . . . . . 117 10.1.1.1. (revisado) O gênero
9.1.2. Definição de coliformes Staphylococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
termotolerantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 10.1.1.2. (revisado) Os estafilococos
9.1.3. E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 coagulase positivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
9.1.4. Aplicação como indicadores . . . . . . . . . . . 118 10.1.1.3. Os estafilococos produtores de
9.1.5. (revisado) Comentários sobre os enterotoxinas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
métodos de análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 10.1.1.4. Staphylococcus aureus. . . . . . . . . . . . . . 140
9.2. (revisado) Métodos do NMP APHA 9:2015 e 10.1.2. Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
APHA/AWWA/WEF 9221:2012 10.1.2.1. As enterotoxinas de S. aureus (SEs) . . . 142
para contagem de coliformes totais/coliformes 10.1.2.2. A doença de origem alimentar. . . . . . . . 143
termotolerantes/E. coli em água e alimentos. . 121 10.1.3. Comentários sobre os métodos de
9.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 121 análise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
9.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 10.2. (revisado) Método de plaqueamento
9.3. (revisado) Método de plaqueamento APHA 39.63:2015 para contagem de
APHA:2015 para contagem de coliformes Staphylococcus aureus em alimentos. . . . . . . 145
totais em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 10.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 145
9.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 127 10.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
9.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 10.3. (revisado) Método do NMP
9.4. (revisado) Método do NMP AOAC 992.30 APHA 39.62:2015 para Staphylococcus
(ColiComplete™) para contagem de aureus em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
coliformes totais e E. coli em alimentos. . . . . 129 10.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 149
9.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 10.4. (revisado) Método de presença/ausência
9.5 (revisado) Método do Petrifilm™ (AOAC) APHA 39.61:2015 para Staphylococcus
para contagem de coliformes totais e aureus em alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
E. coli em alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 10.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 151
9.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 10.5. (novo) Método de plaqueamento
9.6. Método do NMP ISO 7251:2005 para ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003 para
contagem de coliformes termotolerantes e contagem de estafilococos coagulase
E. coli presuntiva em alimentos . . . . . . . . . . . 132 positivos em alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
9.6.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 132 10.5.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 153

XIV □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
10.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 12.1.3. (revisado) Comentários sobre os

10.6. (novo) Método do NMP métodos de análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
APHA/AWWA/WEF:2012 para 12.2. (revisado) Método de plaqueamento
Staphylococcus aureus em água. . . . . . . . . . . 156 APHA 33.72:2015 para contagem de
10.6.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 156 clostrídios sulfito redutores e Clostridium
10.6.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 perfringens em alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . 179
10.7. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 12.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 179
12.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
12.3. (revisado) Método de presença/ausência
Capítulo 11. APHA 33.71:2015 para Clostridium
Bacillus cereus perfringens em alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . 183
11.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 12.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 183
11.1.1. (revisado) Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . 159 12.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
11.1.1.1. O grupo Bacillus cereus. . . . . . . . . . . . . 159 12.4. Método do NMP ISO 6461-1:1986 para
Bacillus anthracis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 esporos de clostrídios sulfito redutores em água. 183
Bacillus thuringiensis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 12.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 183
Bacillus mycoides. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 12.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
Bacillus pseudomycoides. . . . . . . . . . . . . . . . . 160 12.5. (novo) Método de filtração em membrana
Bacillus weihenstephanensis. . . . . . . . . . . . . . 160 ISO 14189:2013 para contagem de
Bacillus cytotoxicus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 Clostridium perfringens em água. . . . . . . . . . 186
11.1.1.2. A espécie Bacillus cereus. . . . . . . . . . . . 160 12.5.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 186
11.1.2. (revisado) Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . 162 12.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
11.1.3. Comentários sobre os métodos de 12.6. (novo) Método de plaqueamento
análise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 ISO 7937:2004 para contagem de
11.2. (revisado) Método de plaqueamento Clostridium perfringens em alimentos. . . . . . 188
APHA 31.61:2015 para contagem de 12.6.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 189
Bacillus cereus em alimentos . . . . . . . . . . . . . 163 12.6.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
11.2.1. Material requerido para a análise . . . . . . . 164 12.7. (novo) Método de filtração
11.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 ISO 6461-2:1986 para contagem de
11.3. (revisado) Método do NMP esporos de clostrídios sulfito redutores
APHA 31.62:2015 para contagem de em água. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
Bacillus cereus em alimentos . . . . . . . . . . . . . 169 12.7.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 192
11.3.1. Material requerido para a análise . . . . . . . 169 12.7.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
11.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 12.8. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
11.4. (novo) Método de plaqueamento
ISO 7932:2004 para contagem presuntiva Capítulo 13.
de Bacillus cereus em alimentos. . . . . . . . . . . 169 Contagem de enterococos
11.4.1. Material requerido para a análise . . . . . . . 171 13.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
11.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 13.1.1. (revisado) Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . 195
11.5. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 13.1.1.1. Streptococcus fecais. . . . . . . . . . . . . . . . 195
13.1.1.2. Enterococcus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
13.1.1.3. Diferenciação entre Enterococcus
Capítulo 12. e Streptococcus fecais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
Clostrídios sulfito redutores e 13.1.2. (revisado) Comentários sobre os
Clostridium perfringens métodos de análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
12.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 13.2. (revisado) Método de plaqueamento
12.1.1. (revisado) Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . 175 APHA 10.5:2015 para contagem de
Clostridium perfringens . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 enterococos em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . 199
Clostrídios sulfito redutores a 46 ºC. . . . . . . . 176 13.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 200
12.1.2. (revisado) Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . 176 13.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200

Conteúdo □ XV
13.3. (revisado) Método do NMP APHA 10.2:2015 14.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225

para contagem de enterococos em alimentos . 201 14.5. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227
13.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 201
13.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
13.4. (revisado) Método de filtração em membrana Capítulo 15.
APHA/AWWA/WEF 9230C.3c:2012 para Campylobacter
contagem de enterococos em água . . . . . . . . . 202 15.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
13.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 203 15.1.1. (revisado) Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . 229
13.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 15.1.1.1. Campylobacter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
13.5. (novo) Método de filtração em membrana 15.1.1.2. Campylobacter termotolerantes. . . . . . . 230
ISO 7899-2:2000 para contagem de 15.1.2. (revisado) Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . 230
enterococos em água. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 15.1.3. (revisado) Comentários sobre os
13.5.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 205 métodos de análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232
13.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 15.2. Método presença/ausência
13.6. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 ISO 10272-1:2006. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234
Capítulo 14. 15.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235
Contagem de bactérias lácticas 15.3. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
14.1. (revisado) Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Carnobacterium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Enterococcus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 Capítulo 16.
Fructobacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 Cronobacter
Lactobacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 16.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
Lactococcus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 16.1.1. Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
Leuconostoc. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 Cronobacter Iversen et al. 2008, gen. nov.. . . 241
Oenococcus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 Características nutricionais e de crescimento. 241
Pediococcus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214 16.1.2. (revisado) Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . 243
Streptococcus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214 16.1.3. (revisado) Ecologia . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
Tetragenococcus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215 16.1.4. Métodos de análise. . . . . . . . . . . . . . . . . . 247
Vagococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215 16.2. Método de presença/ausência
Weissella. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 ISO 22964:2006 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247
Comentários sobre os métodos de análise. . . . 216 16.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 247
14.2. (revisado) Métodos de plaqueamento 16.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
APHA 19.52:2015 para contagem de 16.3. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
bactérias lácticas em alimentos. . . . . . . . . . . . 219
14.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220 Capítulo 17.
14.3. (revisado) Métodos de NMP Escherichia coli O157:H7
APHA 19.526:2015 e APHA 19.524:2015 17.1. (revisado) Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . 253
para contagem de bactérias lácticas 17.1.1. Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253
em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 17.1.2. Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
14.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 221 17.1.3. Comentários sobre os métodos
14.3.2. Procedimento APHA 19.526:2015 de análise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
utilizando o Caldo MRS. . . . . . . . . . . . . . . . . 222 17.2. (revisado) Método BAM/FDA:2016
14.3.3. Procedimento APHA 19.524:2015 para presença/ausência de E. coli O157:H7
utilizando o Caldo Rogosa SL. . . . . . . . . . . . . 222 em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258
14.4. (novo) Método de plaqueamento 17.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 258
ISO 15214:1998 para contagem de 17.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259
bactérias lácticas em alimentos. . . . . . . . . . . . 225 17.3. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262

XVI □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
Capítulo 18. Os sorotipos mais comuns. . . . . . . . . . . . . . . . 295

Listeria monocytogenes 19.1.3. Características bioquímicas de
18.1. (revisado) Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . 265 Salmonella. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296
18.1.1. Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265 19.1.4. (revisado) Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . 296
18.1.2. Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268 19.1.5. Comentários sobre os métodos
18.1.3. Comentários sobre os métodos tradicionais de análise de Salmonella. . . . . . . 298
de análise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 19.1.6. Comentários sobre os métodos
18.1.3.1 Os métodos de detecção alternativos de análise de Salmonella. . . . . . . 300
(presença/ausência). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 19.1.7. Composição de amostras para
18.1.3.2. Os métodos de contagem. . . . . . . . . . . . 271 a análise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
18.1.3.3. Os “kits” analíticos . . . . . . . . . . . . . . . . 271 Composição a seco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
18.1.3.4. Cuidados especiais na realização Composição úmida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
das análises. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271 19.2. (corrigido) Método ISO 6579 para presença/
18.2. (revisado) Método FDA/BAM.10:2016 ausência de Salmonella em alimentos. . . . . . . 301
para detecção ou contagem de Listeria 19.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 301
monocytogenes em alimentos . . . . . . . . . . . . . 273 19.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
18.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 273 19.3. (revisado) Método BAM/FDA:2016
18.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 para presença/ausência de Salmonella
18.3. (revisado) Método USDA/MLG 8.10:2017 para em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
detecção ou contagem (NMP) de 19.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 307
Listeria monocytogenes em 19.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
carnes/aves/ovos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279 19.4. (revisado) Método MLG/FSIS/USDA:2017
18.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 279 para presença/ausência ou NMP de
18.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280 Salmonella em alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . 317
18.4. (corrigido) Método de plaqueamento 19.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 317
ISO 11290-2:1998/Amendment 1:2004 19.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
para contagem de L. monocytogenes 19.5. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
em alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
18.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 283 Capítulo 20.
18.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283 Vibrios patogênicos
18.5. Método ISO 11290-1:1996/ 20.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325
Amendment 1:2004 para presença ou 20.1.1. Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325
ausência de L. monocytogenes em alimentos . 287 20.1.2. (revisado) Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . 329
18.5.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 287 20.1.2.1. V. cholerae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
18.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 20.1.2.2. V. parahaemolyticus. . . . . . . . . . . . . . . . 329
18.6. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 20.1.2.3. V. vulnificus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330
20.1.3. (revisado) Comentários sobre
os métodos de análise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330
Capítulo 19. 20.2. (revisado) Método APHA 40.61:2015
Salmonella para presença/ausência ou NMP de Vibrio
19.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 cholerae em alimentos e água. . . . . . . . . . . . . 331
19.1.1. (revisado) Classificação taxonômica 20.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 332
de Salmonella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 20.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332
19.1.2. Classificação sorológica de 20.3. (revisado) Métodos APHA 40.62/40.63:2015
Salmonella. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 para presença/ausência ou NMP de
Os antígenos somáticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 V. parahaemolyticus e V. vulnificus . . . . . . . . 336
Os antígenos capsulares . . . . . . . . . . . . . . . . . 294 20.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 336
Os antígenos flagelares “H” . . . . . . . . . . . . . . 294 20.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 336
O esquema de White-Kauffmann-Le Minor. . 295 20.4. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339
A nomenclatura dos sorotipos. . . . . . . . . . . . . 295

Conteúdo □ XVII
Capítulo 21. Brevibacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 366

Yersinia enterocolitica Clostridium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 366
Clostridium botulinum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 366
21.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341
Clostrídios proteolíticos . . . . . . . . . . . . . . . . . 368
21.1.1. (revisado) Taxonomia. . . . . . . . . . . . . . . . 341
Clostrídios sacarolíticos . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
21.1.2. (revisado) Epidemiologia. . . . . . . . . . . . . 344
Clostrídios psicrófilos ou psicrotróficos
21.1.3. Comentários sobre os métodos de análise . . 344
deteriorantes de carnes embaladas à
21.2. (revisado) Método APHA 41:2015 para
vácuo refrigeradas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
presença/ausência de Yersinia enterocolitica
Cohnella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370
em alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345
Desulfotomaculum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370
21.2.1 Material requerido para a análise. . . . . . . . 345
Desulfotomaculum nigrificans. . . . . . . . . . . . . 370
21.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345
Geobacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371
21.3. (novo) Método ISO 10273:2003 para
Geobacillus stearothermophilus. . . . . . . . . . . 371
presença/ausência de Yersinia enterocolitica
Lysinibacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372
patogênica presuntiva em alimentos. . . . . . . . 349
Moorella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
21.3.1 Material requerido para a análise. . . . . . . . 349
Paenibacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
21.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351
Sporolactobacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
21.4. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355
Thermoanaerobacter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
Thermoanaerobacterium. . . . . . . . . . . . . . . . . 374
Capítulo 22. T. thermosaccharolyticum. . . . . . . . . . . . . . . . 375
Contagem de esporos de bactérias Virgibacillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375
22.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357 22.2. (revisado) Métodos APHA 25:2015 e
22.1.1. (novo) O esporo bacteriano . . . . . . . . . . . 357 APHA 26:2015 para contagem de esporos
Sequência de formação do esporo. . . . . . . . . . 357 de termófilos aeróbios totais e “flat-sour” . . . 376
Estrutura do esporo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358 22.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 376
Mecanismos de resistência do esporo. . . . . . . 358 22.2.2. Procedimento para a análise de
Germinação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358 açúcar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377
Resistência térmica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 22.2.3. Procedimento para a análise de
22.1.2. (revisado) Taxonomia das bactérias esporogê- amido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377
nicas importantes em alimentos . . . . . . . . . . . 359 22.2.4. Procedimento para a análise de
Aeribacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 tomates inteiros, polpa de tomate,
Alicyclobacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 360 purê de tomate e leite concentrado. . . . . . . . . 378
Alicyclobacillus acidiphilus . . . . . . . . . . . . . . 360 22.2.5. Procedimento para a análise de
Alicyclobacillus acidoterrestris. . . . . . . . . . . . 361 leite em pó desnatado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378
Alicyclobacillus acidocaldarius . . . . . . . . . . . 361 22.2.6. Procedimento para a análise de
Alicyclobacillus contaminans. . . . . . . . . . . . . 361 creme de leite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 379
Alicyclobacillus dauci. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361 22.2.7 Procedimento para a análise de
Alicyclobacillus fastidiosus. . . . . . . . . . . . . . . 361 outros alimentos (geral) . . . . . . . . . . . . . . . . . 379
Alicyclobacillus herbarius. . . . . . . . . . . . . . . . 362
Alicyclobacillus pomorum. . . . . . . . . . . . . . . . 362 22.3. (revisado) Métodos APHA 27:2015 para
Alicyclobacillus sacchari . . . . . . . . . . . . . . . . 362 detecção de esporos de termófilos anaeróbios
Aneurinibacillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362 não produtores de H2S (Thermoanaerobacterium
Aneurinibacillus thermoaerophilus. . . . . . . . . 362 thermosaccharolyticum) . . . . . . . . . . . . . . . . . 381
Anoxybacillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363 22.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 381
Anoxybacillus contaminans. . . . . . . . . . . . . . . 363 22.3.2. Procedimento para a análise
Anoxybacillus tepidamans. . . . . . . . . . . . . . . . 363 de açúcar e leite em pó . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381
Bacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363 22.3.3. Procedimento para a análise
Bacillus coagulans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364 de amido e farinhas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382
Bacillus smithii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365 22.3.4. Procedimento para a análise
Bacillus sporothermodurans. . . . . . . . . . . . . . 365 de cereais e massas alimentícias. . . . . . . . . . . 382

XVIII □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
22.3.5. Procedimento para a análise Capítulo 23.

de cogumelos frescos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382 Esterilidade comercial ou
22.3.6. Procedimento para a análise causa da deterioração
de produtos na linha de processamento. . . . . . 383 23.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
22.4. (revisado) Métodos APHA 28:2015 Definição de esterilidade comercial . . . . . . . . 401
para contagem de esporos de termófilos Classificação dos alimentos comercialmente
anaeróbios produtores de H2S estéreis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
(Desulfotomaculum nigrificans) . . . . . . . . . . . 383 Alimentos de baixa acidez. . . . . . . . . . . . . . . . 402
22.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 383 Alimentos ácidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402
22.4.2. Procedimento para a análise 23.1.1. Parâmetros de avaliação da resistência
de açúcar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383 térmica dos microrganismos. . . . . . . . . . . . . . 402
22.4.3. Procedimento para a análise Curva de sobrevivência e tempo de redução
de amido e farinhas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384 decimal (valor D) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402
22.4.4. Procedimento para a análise de Número de reduções decimais. . . . . . . . . . . . . 403
leite em pó desnatado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384 Curva de destruição térmica e coeficiente
22.4.5. Procedimento para a análise de de temperatura (valor z) . . . . . . . . . . . . . . . . 404
isolados proteicos de soja. . . . . . . . . . . . . . . . 384 23.1.2. (atualizado) Valores D e z
22.5. (revisado) Métodos APHA 23:2015 para de microrganismos de importância em
contagem de esporos de mesófilos aeróbios. . 384 alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405
22.5.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 385 Células vegetativas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405
22.5.2. Procedimento para alimentos Esporos de bolores termorresistentes . . . . . . . 405
em geral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385 Esporos de bactérias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
22.5.3. Procedimento para a análise de leite Bactérias esporogênicas aeróbias
e produtos lácteos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387 termófilas estritas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
22.5.4. Procedimento para a análise de água . . . . 387 Bactérias esporogênicas anaeróbias
22.6. (revisado) Método APHA 24:2015 para termófilas estritas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
contagem de esporos de mesófilos anaeróbios. 387 Bactérias esporogênicas aeróbias
22.6.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 388 termófilas facultativas. . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
22.6.2. Procedimento para a análise de açúcar. . . 388 Bactérias esporogênicas aeróbias
22.6.3. Procedimento para a análise de amido, mesófilas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
farinhas e outros produtos de cereais . . . . . . . 388 Bactérias esporogênicas mesófilas
22.6.4. Procedimento para a análise de anaeróbias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
vegetais desidratados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389 23.1.3. Dimensionamento de processos
22.6.5. Procedimento para a análise de térmicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
condimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389 Definição da intensidade do processo
22.6.6. Procedimento para a análise de térmico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407
ovo em pó, leite em pó e outros 23.1.4. Deterioração microbiana de
produtos lácteos em pó. . . . . . . . . . . . . . . . . . 390 alimentos enlatados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408
22.6.7. Procedimento para a análise de Subprocessamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408
leite fluido e queijos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390 Contaminação pós-processamento
22.6.8. Outros procedimentos. . . . . . . . . . . . . . . . 391 (vazamento) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408
22.7. Método IFU 12:2007 para detecção Deterioração por termófilos estritos . . . . . . . . 409
e contagem de Alicyclobacillus. . . . . . . . . . . . 391 Multiplicação microbiana antes do
22.7.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 392 tratamento térmico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409
22.7.2. Procedimento para a análise de Causas não microbianas de deterioração. . . . . 409
matéria-prima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392 23.2. (revisado) Método APHA:2015 para teste de
22.7.3. Procedimento para a análise esterilidade comercial e determinação da causa
de produto final. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394 da deterioração de alimentos de baixa acidez. 410
22.7.4. Interpretação e cálculo dos resultados . . . 394 23.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 410
22.8. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 395 23.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410

Conteúdo □ XIX
23.2.3. Interpretação dos resultados. . . . . . . . . . . 415 Capítulo 25.

23.3. (revisado) Método APHA:2015 para teste Preparação de material de laboratório
de esterilidade comercial e determinação da para análises microbiológicas
causa da deterioração de alimentos ácidos . . . 418 25.1. (revisado) Descontaminação e descarte
23.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 418 de resíduos contaminados. . . . . . . . . . . . . . . . 445
23.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419 25.2. Lavagem. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445
23.3.3. Interpretação dos resultados. . . . . . . . . . . 423 25.3. Acondicionamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446
23.4. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426 25.4. (revisado) Esterilização. . . . . . . . . . . . . . . . 447
25.5. Preparo de vidraria nova . . . . . . . . . . . . . . . 448
Capitulo 24. 25.6. Controle de qualidade do material. . . . . . . . 448
Pseudomonas spp 25.6.1. (revisado) Verificação da limpeza . . . . . . 448
24.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427 25.6.2. (revisado) Verificação da
Pseudomonas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429 esterilização. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448
Pseudomonas em água tratada para 25.6.3. Verificação da presença de
consumo humano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 430 resíduos tóxicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448
Pseudomonas em água mineral e 25.7. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 449
água natural. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 430
Pseudomonas em alimentos . . . . . . . . . . . . . . 430 Capítulo 26.
Shewanella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431 Cuidados na preparação de
Shewanella putrefaciens meios de cultura e reagentes
(sinônimo Pseudomonas putrefaciens) . . . . 431 para análises microbiológicas
Janthinobacterium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432 26.1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451
Janthinobacterium lividum 26.1.1. Ingredientes utilizados na
(sinônimo Pseudomonas mephitica) . . . . . . 432 formulação de meios de cultura . . . . . . . . . . . 451
Stenotrophomonas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433 26.1.1.1. (revisado) Água para o preparo
Stenotrophomonas maltophilia de meios e reagentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451
(sinônimo Pseudomonas maltophilia) . . . . . 433 26.1.1.2. Fontes de nutrientes em meios
Comentários sobre os métodos de análise. . . . 433 de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452
24.2. Método do NMP APHA/AWWA/ 26.1.1.3. Agentes seletivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . 454
WEF 9213:2012 para contagem de 26.1.1.4. Agentes diferenciais. . . . . . . . . . . . . . . . 455
Pseudomonas aeruginosa em água. . . . . . . . . 434 26.1.1.5. Agentes redutores. . . . . . . . . . . . . . . . . . 455
24.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 434 26.1.1.6. Agentes tamponantes. . . . . . . . . . . . . . . 456
24.2.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 436 26.1.1.7. Substratos cromogênicos e
24.3. (novo) Método de filtração em membrana fluorogênicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 456
ISO 16266:2006 para contagem de 26.1.1.8. Ágar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 456
Pseudomonas aeruginosa em água. . . . . . . . . 436 26.1.2. (revisado) Classificação dos meios
24.3.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 436 de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 456
24.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 436 26.1.2.1. Classificação pela composição. . . . . . . . 456
24.4. (revisado) Método de plaqueamento 26.1.2.2. Classificação pela consistência . . . . . . . 457
ISO 13720:2010 para contagem presuntiva de 26.1.2.3. Classificação pela forma de
Pseudomonas spp em carne e preparação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 457
produtos cárneos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439 26.1.2.4. Classificação pela função. . . . . . . . . . . . 457
24.4.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 439 26.2. Procedimento para preparação de
24.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439 meios de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 458
24.5. Método de plaqueamento ISO 11059:2009 26.2.1. Armazenamento dos insumos para
para contagem de Pseudomonas spp preparo de meios de cultura . . . . . . . . . . . . . . 458
em leite e produtos lácteos . . . . . . . . . . . . . . . 441 26.2.2. Pesagem e reidratação. . . . . . . . . . . . . . . . 459
24.5.1. Material requerido para a análise. . . . . . . 441 26.2.3. Dissolução e dispersão. . . . . . . . . . . . . . . 459
24.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441 26.2.4. Verificação e ajuste do pH antes
24.6. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444 da esterilização . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459

XX □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
26.2.5. Distribuição. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459 Ágar Coliformes Cromogênico (CCA) . . . . . . . . 473

26.2.6. Esterilização pelo calor úmido. . . . . . . . . 460 Ágar Columbia Sangue (CBA) . . . . . . . . . . . . . . 474
26.2.7. Esterilização por filtração. . . . . . . . . . . . . 461 Ágar (Caldo) Dextrose Triptona (DTA/DTB) . . . 474
26.2.8. Verificação depois da esterilização. . . . . . 461 Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG18) . . . . . . . . . . . 474
26.2.9. Preparação dos suplementos Ágar Dicloran Rosa de Bengala
para meios de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462 Cloranfenicol (DRBC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 475
26.2.10. (revisado) Estocagem dos meios Ágar (Caldo) Elliker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 475
esterilizados até o momento do uso. . . . . . . . . 462 Ágar Entérico de Hecktoen (HE). . . . . . . . . . . . . 475
26.2.10.1. Recomendações da Ágar Extrato de Levedura (YEA) . . . . . . . . . . . . 476
ISO 11133:2014. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462 Ágar (Caldo) Extrato de Levedura Amido
26.2.10.2. Recomendações do Standard Glicose (YSG) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 476
Methods for the Examination of Water Ágar Extrato de Levedura Glicose
and Wastewater (Hunt, 2012). . . . . . . . . . . . . 462 Cloranfenicol (YEGC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 476
26.2.11. Preparação dos meios no momento
Ágar Extrato de Malte com
do uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463
Antibióticos (MEA ANT). . . . . . . . . . . . . . . . 476
26.3. Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463
Ágar Extrato de Malte 0,5% Ácido
Acético (MAA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477
Ágar Extrato de Malte Extrato de Levedura
Anexo 1.
40% Glicose (MY40G) . . . . . . . . . . . . . . . . . 477
Preparo de meios e reagentes
Ágar Fenilalanina Deaminase . . . . . . . . . . . . . . . 477
para as análises
Ágar Fígado de Vitela (LVA) . . . . . . . . . . . . . . . . 477
Ágar/Caldo Acetamida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465 Ágar Gema de Ovo Anaeróbico (AEY) . . . . . . . . 478
Ágar/Caldo APT (All Purpose Tween) . . . . . . . . 465 Ágar Gentamicina Tálio Carbonato
Ágar APT Acidificado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 466 Fluorogênico (FGTC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 478
Ágar APT BCP 2% Sacarose . . . . . . . . . . . . . . . . 466 Ágar Glicose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 478
Ágar APT 1,5% Glicose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 466 Ágar (Caldo) Infusão Cérebro
Ágar Azul de Toluidina DNA . . . . . . . . . . . . . . . . 466 Coração (BHIA/BHI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 479
Ágar/Caldo Bacillus acidoterrestris (BAT) . . . . . 467 Ágar de Isolamento de Enterobacter
Ágar Baird-Parker (BP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467 sakazakii (ESIA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 479
Ágar Batata Dextrose Acidificado (PDA-AC). . . 468 Ágar K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 479
Ágar Batata Dextrose com
Ágar KF Streptococcus (KF) . . . . . . . . . . . . . . . . 479
Antibióticos (PDA-ANT). . . . . . . . . . . . . . . . 468
Ágar Kim-Goepfert (KG). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 480
Ágar Bile Esculina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
Ágar Kligler Ferro (KIA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 480
Ágar Bile Esculina Azida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
Ágar Leveduras Resistentes aos
Ágar Bismuto Sulfito (BS). . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
Conservantes (PRY) (Preservative
Ágar Cefalotina Fusidato Cetrimida (CFC). . . . . 470
Resistant Yeasts Medium) . . . . . . . . . . . . . . . 481
Ágar Cefsulodina Irgasan Novobiocina (CIN). . . 470
Ágar Levine Eosina Azul de Metileno (L-EMB). 481
Ágar Celobiose Colistina (CC). . . . . . . . . . . . . . . 471
Ágar Celobiose Polimixina Colistina Ágar Lipovitelenina Sal Manitol (LSM) . . . . . . . 481
Modificado (m-CPC). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 471 Ágar Lisina Arginina Ferro (LAIA) . . . . . . . . . . . 481
Ágar Charcoal Cefoperazona Desoxicolato Ágar Lisina Ferro (LIA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 482
Modificado (m-CCDA) (também chamado Ágar Lisina Ferro Duplamente
de Ágar Campylobacter Charcoal Modificado (DM-LIA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 482
Diferencial Modificado) . . . . . . . . . . . . . . . . . 472 Ágar Listeria Ottaviani & Agosti (ALOA) . . . . . 482
Ágar Chromagar Listeria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 472 Ágar MacConkey . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 483
Ágar Chromagar Vibrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 472 Ágar MacConkey Sorbitol Telurito
Ágar Citrato Azida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 472 Cefixima (TC-SMAC). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 484
Ágar Citrato de Simmons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473 Ágar Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP). . 484
Ágar Cloreto de Lítio Feniletanol Moxalactan Ágar m-Enterococos
(LPM) Suplementado com Esculina e Fe3+ . . 473 (Slanetz & Bartley Medium) . . . . . . . . . . . . . 485

Conteúdo □ XXI
Ágar m-HPC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 485 Ágar Tripticase de Soja (TSA) com Magnésio e

Ágar Motilidade para Bacillus cereus . . . . . . . . . 485 Oxalato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 497
Ágar/Caldo MRS Ágar Triptona Glicose Extrato de Carne (TGE). . 497
(De Man Rogosa & Sharpe) . . . . . . . . . . . . . . 485 Ágar (Caldo) Triptona Glicose Extrato de Levedura
Ágar MRS Acidificado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 486 0,5% Ácido Acético (TGYA – TGYB). . . . . . 497
Ágar MRS Acidificado Frutose 1% . . . . . . . . . . . 486 Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) . . . . . . . 497
Ágar MRS Ácido Sórbico 0,1% . . . . . . . . . . . . . . 486 Ágar Tween Esterase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 498
Ágar MRS Ácido Sórbico Cisteína . . . . . . . . . . . 486 Ágar Ureia de Christensen . . . . . . . . . . . . . . . . . 498
Ágar MRS Frutose 0,5% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 487 Ágar Verde Brilhante (BG). . . . . . . . . . . . . . . . . . 499
Ágar MRS Modificado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 487 Ágar Verde Brilhante Sulfa (BGS) . . . . . . . . . . . . 499
Ágar Mueller Hinton 5% Sangue . . . . . . . . . . . . . 487 Ágar Vermelho Violeta Bile (VRB) . . . . . . . . . . . 499
Ágar Nitrato Motilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 487 Ágar Vermelho Violeta Bile com
Ágar/Caldo Nutriente (NA/NB). . . . . . . . . . . . . . 487 Glicose (VRBG) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 499
Ágar Nutriente Azul de Tripano . . . . . . . . . . . . . . 488 Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) . . . . . . . 500
Ágar Nutriente Manganês (ANMn) . . . . . . . . . . . 488 Ágar Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4) . . . . . . . . . 500
Ágar NWRI (HPCA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 488 Água Peptonada 0,1% (H2Op) . . . . . . . . . . . . . . . 500
Ágar Oxford (OXA) Ágar Oxford Água Peptonada Alcalina (APA) . . . . . . . . . . . . . 501
Modificado (MOX) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 488 Água Peptonada Tamponada (BPW) . . . . . . . . . . 501
Ágar Oxoid Listeria Cromogênico (OCLA). . . . . 489 Água Peptonada Tamponada com Cristal Violeta . 501
Ágar Padrão para Contagem (PCA) Água Peptonada Tamponada Modificada
Standard Methods Agar (SMA) com Piruvato (mBPWp) . . . . . . . . . . . . . . . . . 501
Tryptone Glucose Yeast Extract Agar . . . . . . 489 Água Salina Peptonada (H2Osp) . . . . . . . . . . . . . 501
Ágar Padrão para Contagem (PCA) Suplementado Água Verde Brilhante (H2Ovb) . . . . . . . . . . . . . . 502
com Amido Solúvel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489 Álcool 70% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502
Ágar Padrão para Contagem (PCA) Suplementado Álcool Iodado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502
com Cloranfenicol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489 Álcool Iodado 3:1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502
Ágar Palcam . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 490 Caldo Acetamida = vide Ágar/Caldo Acetamida
Ágar Penicilina Pimaricina (PPA). . . . . . . . . . . . . 490 Caldo Acetamida ISO 16266 . . . . . . . . . . . . . . . . 502
Ágar Pirazinamidase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 490 Caldo Ácido (CA) = vide Caldo Thermoacidurans
Ágar Pseudomonas CN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491 (mesma formulação)
Ágar R2A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491 Caldo Ali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503
Ágar Rainbow O157 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492 Caldo APT = vide Ágar/Caldo All Purpose Tween
Ágar Rapid’L.mono. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492 Caldo Asparagina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503
Ágar R&F O157 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492 Caldo Bacillus acidoterrestris (BAT)
Ágar/Caldo Rogosa SL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492 = vide Ágar/Caldo Bacillus acidoterrestris
Ágar Salmonella Shigella Desoxicolato (SSDC). 492 Caldo Bolton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503
Ágar Sangue Nº 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 493 Caldo Brucella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504
Ágar Sangue de Cavalo em Sobrecamada (HL). . 493 Caldo Cianeto de Potássio (KCN)
Ágar Selo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 493 (cuidado, veneno) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504
Ágar Selo Tioglicolato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 493 Caldo Citrato de Koser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505
Ágar (Caldo) Soro de Laranja (OSA/OSB) . . . . . 494 Caldo Descarboxilase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505
Ágar Sulfeto Indol Motilidade (SIM) . . . . . . . . . 494 Caldo Descarboxilase de Falkow . . . . . . . . . . . . . 505
Ágar Sulfito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494 Caldo Dextrose Púrpura de Bromocresol (BCP) . 505
Ágar Sulfito Ferro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494 Caldo Dextrose Triptona (DTB)
Ágar (Caldo) T1N0 - T1N1 - T1N3 . . . . . . . . . . . . . 495 = vide Ágar (Caldo) Dextrose Triptona
Ágar/Caldo Thermoacidurans (TAA/TAB). . . . . . 495 Caldo Diferencial Reforçado para
Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS). . 495 Clostrídios (DRCM). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506
Ágar Tirosina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 495 Caldo E. coli (EC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506
Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI). . . . . . . . . . . . . 496 Caldo E. coli com 4-metilumbeliferil-β-D-
Ágar Tripticase de Soja (TSA). . . . . . . . . . . . . . . 496 -glicuronídeo (EC-MUG). . . . . . . . . . . . . . . . 506

XXII □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
Caldo de Enriquecimento de Caldo Tripticase de Soja (TSB) . . . . . . . . . . . . . . 516

Enterobacteriaceae (EEB) . . . . . . . . . . . . . . . 507 Caldo Triptona 1% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 517
Caldo de Enriquecimento para Listeria Caldo Triptona Glicose Extrato de
Tamponado (BLEB) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 507 Levedura 0,5% Ácido Acético (TGYB)
Caldo de Enriquecimento de Listeria = vide Ágar/Caldo Triptona Glicose
Tamponado com Ácido Extrato de Levedura 0,5% Ácido Acético
Morfolinopropanosulfônico (MOPS-BLEB) . 507 Caldo Universidade de Vermont
Caldo Extrato de Levedura Amido Glicose (YSG) Modificado (UVM). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 517
= vide Ágar/Caldo Extrato de Levedura Amido Caldo Ureia Rápido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 518
Glicose Caldo Ureia de Rustigian & Stuart . . . . . . . . . . . 518
Caldo Extrato de Malte (EM). . . . . . . . . . . . . . . . 508 Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB). . . . . . . . . . 518
Caldo Fraser – Half-Fraser – Half-Fraser Base . . 508 Caldo Vermelho de Fenol-Carboidratos . . . . . . . . 518
Caldo de Fígado (CF). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509 Caldo VM VP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 519
Caldo Half-Fraser = vide Caldo Fraser – Caldo VP Modificado para Bacillus . . . . . . . . . . . 519
Caldo Half-Fraser – Caldo Fraser Base Discos de Indoxil Acetato . . . . . . . . . . . . . . . . . . 519
Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI) Escala de McFarland . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 519
= vide Ágar/Caldo Infusão Cérebro Coração Etanol 70% = vide Álcool 70%
Caldo Infusão de Vitela (VIB) . . . . . . . . . . . . . . . 509 Formalina
Caldo Irgasan Ticarcilina Clorato (ITC). . . . . . . . 509 = vide Solução Salina Formalinizada
Caldo KF Streptococcus (KFB) . . . . . . . . . . . . . . 510 Leite em Pó Desnatado Reconstituído . . . . . . . . . 520
Caldo Lactosado (CL). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 510 Leite Tornassolado (Litmus Milk) . . . . . . . . . . . . 520
Caldo Lactose Sulfito (LS). . . . . . . . . . . . . . . . . . 511 Meio de Carne Cozida (CMM). . . . . . . . . . . . . . . 520
Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST). . . . . . . . . . . 511 Meio de Fermentação de Carboidratos para
Caldo Lauril Sulfato Triptose Modificado Clostridium perfringens . . . . . . . . . . . . . . . . . 521
Vancomicina (m-LST-V). . . . . . . . . . . . . . . . . 511 Meio de King B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 521
Caldo Malonato Modificado . . . . . . . . . . . . . . . . 512 Meio de Lactose Gelatina (MLG). . . . . . . . . . . . . 521
Caldo MRS (De Man, Rogosa & Sharpe) Meio PE-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522
= vide Ágar/Caldo MRS Meio Reforçado para Clostrídios (RCM). . . . . . . 522
Caldo M-Staphylococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512 Meio Reforçado para Clostrídios com
Caldo Nitrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512 Lactato (RCML). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522
Caldo Nutriente (NB) = vide Ágar/Caldo Nutriente Meio Teste de Motilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522
Caldo Nutriente Lisozima . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512 Meio Teste de Motilidade ISO . . . . . . . . . . . . . . . 523
Caldo Peptona Sorbitol Bile (PSBB) . . . . . . . . . . 513 Meio de Tioglicolato (TGM) . . . . . . . . . . . . . . . . 523
Caldo de Pré-Enriquecimento Universal . . . . . . . 513 Reagente de Beta-Galactosidase (orto-nitrofenil-
Caldo Púrpura Base Carboidratos . . . . . . . . . . . . 513 -β-d-galactopiranosídeo – ONPG) . . . . . . . . . 523
Caldo Rappaport-Vassiliadis Reagente de Beta-Glicosidase . . . . . . . . . . . . . . . 523
Modificado (RV = R10) Caldo Rappaport- Reagente de Catalase
-Vassiliadis Soja (RVS). . . . . . . . . . . . . . . . . . 513 (Peróxido de Hidrogênio 3%) . . . . . . . . . . . . 524
Caldo Rogosa SL = vide Ágar/Caldo Rogosa SL Reagentes para Coloração de Esporos (Ashby) . . 524
Caldo Selenito Cistina (SC) . . . . . . . . . . . . . . . . . 514 Reagentes para Coloração de Gram (Hucker) . . . 524
Caldo Soro de Laranja (OSB) Reagente de Fosfatase Ácida . . . . . . . . . . . . . . . . 524
= vide Ágar/Caldo Soro de Laranja Reagente de Kovacs para Teste de Indol
Caldo T1N0 e T1N3 (Solução alcoólica 5%
= vide Ágar/Caldo T1N0 - T1N1 - T1N3 p-dimetilaminobenzaldeído) . . . . . . . . . . . . . . 525
Caldo Tetrationato (TT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 515 Reagente de Kovacs para Teste de Oxidase
Caldo Tetrationato Hajna (TTH). . . . . . . . . . . . . . 515 (Solução 1% de cloridrato de N,N,N,N-
Caldo Tetrationato Muller Kauffmann -tetrametil-p-fenilenodiamina) . . . . . . . . . . . . 525
Novobiocina (MKTTn) . . . . . . . . . . . . . . . . . 515 Reagente de Nessler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 525
Caldo Thermoacidurans (TAB) Reagentes de Nitrato (Solução 0,8% ácido
= vide Ágar/Caldo Thermoacidurans sulfanílico e solução 0,5% alfa-naftol) . . . . . . 526

Conteúdo □ XXIII
Reagente de Nitrato ISO 7937 (Mistura da solução Solução de Hipurato de Sódio . . . . . . . . . . . . . . . 530
de ácido 5-amino-2-naftalenossulfônico com Solução Iodo Desinfetante . . . . . . . . . . . . . . . . . . 530
solução de ácido sulfanílico) . . . . . . . . . . . . . 526 Solução de Ninidrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 530
Reagente de VM para Teste de Vermelho Solução de Ringer ¼ de Concentração . . . . . . . . 530
de Metila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 526 Solução de Safranina 0,5% . . . . . . . . . . . . . . . . . 530
Reagentes de VP para Teste de Voges Proskauer Solução Salina 0,85% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 530
(Solução 40% de hidróxido de potássio ou Solução Salina Formalinizada (Formalina) . . . . . 531
sódio e solução 5% de alfa-naftol) . . . . . . . . . 526 Solução de Sudan Black 0,3% . . . . . . . . . . . . . . . 531
Reagentes de VP ISO para Teste Voges-Proskauer Solução de Sulfato Ferroso Amoniacal 1% . . . . . 531
(Solução 1-naftol, solução aquosa Solução Tamponada Glicerol Sal . . . . . . . . . . . . . 531
40% hidróxido de potássio, solução Solução Tiossulfato de Sódio 3% ou 10% . . . . . . 531
de creatina) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 527 Solução de Tripolifosfato 2% . . . . . . . . . . . . . . . . 532
Soluções de Ácido Clorídrico (HCl) . . . . . . . . . . 527 Solução de Verde Malaquita (Aquosa 5%)
Solução de Azul Brilhante de Coomassie . . . . . . 527 = vide Reagentes para Coloração de Esporos
Solução de Azul de Bromotimol 0,04% . . . . . . . . 527 Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
Solução de Citrato de Sódio 2% . . . . . . . . . . . . . 528 (Tampão Butterfield = Água de
Solução de Cloreto Férrico 10% . . . . . . . . . . . . . 528 Diluição Fosfato) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532
Soluções de Corantes e Indicadores de pH para Tampão Fosfato Conforme ISO 6887-4:2003 . . . 532
Adição em Meios de Cultura . . . . . . . . . . . . . 528 Tampão Fosfato Conforme ISO 6887-5:2010 . . . 532
Solução de Desoxicolato de Sódio 0,5% . . . . . . . 528 Tampão Fosfato com Cloreto de
Solução de Fosfato de Potássio (K2HPO4) 2% . . . 529 Magnésio (PB-MgCl2). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533
Solução de Fosfato de Potássio (K2HPO4) 2% Tampão Fosfato Salina (PBS). . . . . . . . . . . . . . . . 533
com Antiespumante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529 Tampão Fosfato Salina 0,02M para Teste de
Solução de Hidróxido de Potássio Salina 0,5% . . 529 Lisostafina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533
Soluções de Hidróxido de Sódio . . . . . . . . . . . . . 529 Vaspar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533
Solução Hipoclorito de Sódio 100 ou 200 mg/l
(100 ou 200ppm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529 Referências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 534

1 Coleta, transporte e estocagem
de amostras para análise
Revisões da 5ª edição
Item 1.3.1 (revisado) A esterilização de frascos e utensílios para coleta de amostras em autoclave deve ser feita
a 121±3 ºC por 15 minutos no mínimo. Em estufas deve ser feita a 170±10 ºC por 1 hora no mínimo (ISO
7218:2007/Amd.1:2013).
Item 1.3.4 (revisado) Nas orientações da 21ª edição do Standard Methods for the Examination of Water and Was-
tewater para a coleta de amostras de água havia a recomendação de adicionar EDTA às amostras com teor alto
de metais. Essa recomendação foi suprimida na 22ª edição e também nesta 5ª edição do Manual.
Item 1.4.3 (revisado) A temperatura de estocagem de amostras sob refrigeração recomendada pela 5ª edição do
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods passa de 0 a 4,4 ºC para 0 a 4,0 ºC. O
tempo máximo de seis horas para estocagem de amostras de moluscos e crustáceos foi suprimida na 5ª edição
do Compendium e também deste Manual.
Item 1.4.5 (revisado) A temperatura de estocagem de amostras de água sob refrigeração recomendada pela 22ª
edição do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt, 2012) passa de 10 ºC para
8 ºC, enfatizando-se a recomendação de que essas amostras não devem ser congeladas.
to de mesma composição e características físicas,

1.1. Introdução
químicas e sensoriais, produzida e manuseada
As recomendações contidas nesse capítulo são numa mesma batelada, sob as mesmas condições.
da American Public Health Association (APHA), Na prática, lote geralmente é a quantidade de ali-
descritas na 5ª edição do Compendium of Methods mento produzida dentro de um intervalo de tempo
for the Microbiological Examination of Foods de funcionamento de uma linha de produção, sem
(Salfinger & Tortorello, 2015), na 22ª edição do interrupção.
Standard Methods for the Examination of Water
and Wastewater (Hunt, 2012) (específicas para Amostra de lote e unidade de
a análise de água), na 17ª edição do Standard amostra
Methods for the Examination of Dairy Products
Amostra de lote é uma fração do total produzi-
(Wehr & Frank, 2004) (específicas para a análi-
do, retirada ao acaso, para avaliar as condições
se de produtos lácteos) e em diversas normas da
do lote. No caso de alimentos acondicionados em
International Organization for Standardization
embalagens individuais, é composta de n embala-
(recomendadas para ensaios realizados com me-
gens individuais. No caso de grandes massas de
todologia ISO).
alimentos, não acondicionados em embalagens
Alguns termos utilizados ao longo do texto são
individuais, é composta de n alíquotas do produto.
oriundos da terminologia relacionada com a
As embalagens ou alíquotas individuais são cha-
amostragem de lotes e devem ter seu significado
madas de unidades de amostra e, para a avaliação
corretamente compreendido:
do lote, são analisadas separadamente. A partir do
conjunto de resultados da análise das n unidades
Lote de amostra, é possível inferir as características de
Lote é definido como uma quantidade de alimen- todo o lote, mas o resultado da análise de uma úni-
01anMICROBIOL_PROD.indd 1 08/06/2017 20:40:34

2 □ Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água
ca unidade de amostra não pode ser tomado como das e obedecidas as orientações dos capítulos rela-
representativo do lote. cionados aos ensaios específicos em questão.
Nas análises de Salmonella, cujo padrão em ali- m: é o padrão microbiológico estabelecido para
mentos é ausência em qualquer das unidades de um dado microrganismo, num dado alimento. Em
amostra, é comum a prática de compor (misturar) as um plano de três classes esse valor separa um lote
unidades de amostra, para realizar um único ensaio. aceitável de um lote com qualidade intermediária
A presença na amostra composta é inaceitável, in- aceitável.
dependente de quantas ou quais unidades de amos- M: é um limite tolerável, acima do padrão, que
tra estejam contaminadas. Maiores detalhes são pode ser atingido por algumas (c) unidades de
apresentados no capítulo específico de Salmonella. amostra, mas não pode ser ultrapassado por ne-
nhuma. Em um plano de duas classes, M separa o
Planos de amostragem de lotes lote aceitável do inaceitável. Em um plano de três
Sempre que se tratar da avaliação de lotes ou par- classes, separa o lote com qualidade intermediária
tidas, a tomada das n unidades de amostra deverá aceitável do lote inaceitável.
seguir um plano de amostragem estatístico ade- c: dentre as n unidades de amostra que constituem
quado. Os mais utilizados são os planos de duas a amostra representativa do lote, c é o número má-
ou três classes estabelecidos pela International ximo de unidades que podem ser aceitas com con-
Commission on Microbiological Specifications tagens acima do padrão m, desde que não acima
for Foods (ICMSF, 2002), adotados pela Agência do limite M. Nos casos em que o padrão micro-
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). biológico é ausência, c é igual a zero e aplica-se o
O plano de duas classes classifica os lotes em plano de duas classes.
duas categorias, aceitável ou inaceitável, depen-
dendo dos resultados da análise das n unidades de Unidade analítica
amostra. É o mais aplicado no caso de ensaios de A unidade de amostra geralmente contém uma
presença/ausência, como Salmonella, por exem- quantidade de produto maior do que a necessária
plo, em que a ausência é aceitável e a presença para a análise, porque, ao se coletar uma unida-
em qualquer das n unidades de amostra é inacei- de de amostra, há sempre o cuidado de se tomar
tável. quantidades suficientes para estocagem de con-
O plano de três classes classifica os lotes em três tra-amostras e prevenção de perdas por aciden-
categorias, aceitável, qualidade intermediária mas te. Unidade analítica é a quantidade de alimento
aceitável e inaceitável. São recomendados para efetivamente utilizada na realização de um ou
ensaios quantitativos, para os quais o padrão não mais ensaios da unidade de amostra. O número
é ausência, mas sim, valores dentro de uma fai- de unidades analíticas necessárias para a análise
xa entre m e M. Os parâmetros utilizados nesses depende do número e tipos de ensaios que serão
planos, para a tomada de decisões a respeito dos realizados na mesma unidade de amostra, sen-
lotes são: do uma para os ensaios gerais de quantificação
n: é o número de unidades de amostras a serem (contagem total de aeróbios mesófilos, contagem
colhidas aleatoriamente de um mesmo lote, para de bolores e leveduras, contagem de coliformes
serem analisadas individualmente. As n unidades totais/termotolerantes/E. coli, contagem de S.
de amostra constituem a amostra representativa do aureus, contagem de B. cereus, contagem de C.
lote. Para ensaios de presença/ausência, não quan- perfringens), uma para cada ensaio de presença/
titativos (Salmonella ou Listeria monocytogenes, ausência (Salmonella, Listeria monocytogenes e
por exemplo) as unidades de amostra poderão ser todos os outros que requeiram enriquecimento em
compostas e realizada uma única análise, porém, caldo específico) e uma para cada outro ensaio
na composição das amostras devem ser consulta- que requeira tratamento diferenciado da amostra

Coleta, transporte e estocagem de amostras para análise □ 3
(contagem de esporos de bactérias, contagem de análises e guarda de contra amostras, deve-se co-
bolores termorresistentes e outros). letar várias embalagens unitárias, como parte de
uma mesma unidade de amostra. No momento da
análise, deve-se juntar o conteúdo dessas diversas
1.2. Material necessário embalagens em um único frasco estéril, misturan-
do-se bem e retirar a unidade analítica da mistura.
Frascos e utensílios para coleta Se o produto não permitir mistura, deve-se tomar,
□ Frascos ou bolsas plásticas estéreis de capaci- de cada uma das embalagens unitárias, porções de
dade variada peso aproximadamente igual, para compor a uni-
□ Espátulas dade analítica daquela unidade de amostra.
□ Facas
No caso de alimentos contidos em tanques ou
□ Colheres
grandes embalagens, impossíveis de serem trans-
□ Tesouras
portadas ao laboratório, deve-se transferir porções
□ Pinças
representativas da massa total para frascos ou bol-
□ Caladores
sas de coleta estéreis, sob condições assépticas.
□ Amostradores verticais de tubo duplo
□ Amostradores tipo “corer”
1.3.1. Seleção e preparação de
□ Furadeira elétrica e brocas esterilizadas
□ Caixas de isopor com gelo seco ou sachês de
frascos para coleta de alimentos
gelo reutilizável em gel acondicionados em embalagens
Reagentes e diluentes
não individuais
□ Etanol 70% Utilizar frascos ou bolsas com tampas à prova
□ Solução de hipoclorito de sódio a 100 mg/l de vazamentos, de material não tóxico, aprovado
(100ppm) para contato com alimentos e, de preferência, au-
□ Solução de tiossulfato de sódio (Na2S2O3) 3% toclaváveis ou pré-esterilizados. Não é recomen-
ou 10% dável o uso de frascos de vidro, devido ao risco de
□ Solução Tamponada Glicerol Sal quebra, contaminação do ambiente de coleta com
Equipamentos cacos de vidro e perda do conteúdo
□ Freezer com temperatura abaixo de 20 ºC ne- Escolher frascos com tamanho adequado para a
gativos quantidade de alimento que será coletada. Para de-
□ Refrigerador com temperatura entre 0 e 4 ºC finir a quantidade de amostra a ser coletada, consi-
derar que cada unidade de amostra deve conter, no
mínimo, duas vezes o número de unidades analíti-
1.3. Coleta de amostras cas que serão utilizadas nos ensaios, de preferên-
para análise cia, três a quatro vezes esse valor, para a separação
da contra-amostra e prevenção de possíveis perdas.
O capítulo 2 do Compendium (Taylor et al., 2015) Levar em conta, ainda, o fato de que os frascos de
recomenda que amostras de alimentos acondicio- coleta não devem ser completamente preenchidos
nados em embalagens individuais sejam coletadas pelo alimento, sendo recomendável utilizar, no má-
e encaminhadas ao laboratório na sua embalagem ximo, três quartos de sua capacidade, para facilitar
comercial original, fechada e intacta. Cada emba- a posterior homogeneização da amostra, antes da
lagem unitária do produto constitui uma unidade retirada da(s) unidade(s) analítica(s).
de amostra e devem ser coletadas tantas unidades Os frascos e utensílios não pré-esterilizados que
de amostra quantas forem requeridas pelo plano serão utilizados na coleta (espátulas, colheres,
de amostragem. Se a embalagem unitária contiver tesouras, pinças, caladores etc.) devem, de prefe-
uma quantidade de alimento insuficiente para as rência, ser esterilizados individualmente em auto-

clave (121±3 ºC pelo menos por 15 minutos) ou em grandes peças sólidas, deve-se usar fa-
em estufa de esterilização (170±10 ºC pelo me- cas, pinças e fórceps estéreis para cortar pe-
nos por uma hora) (ISO 7218:2007/Amd.1:2013). daços menores do alimento.
Alguns outros métodos que podem ser utilizados b3) No caso de grandes blocos de alimentos
como alternativa são a flambagem em chama, a congelados, como blocos de pescados e
imersão em etanol e combustão do álcool (pode frutos do mar, blocos de ovo líquido etc., o
não eliminar esporos) e o tratamento com solu- mais adequado é utilizar uma furadeira elé-
ções desinfetantes. Nesse último caso devem ser trica (com a broca previamente esterilizada)
usados desinfetantes aprovados para superfícies combinada com um funil estéril. A broca é
de contato com alimentos, aplicados conforme a inserida no funil (cujo diâmetro de abertura
orientação dos fabricantes e seguidos de 12 enxá- inferior deve ser apenas ligeiramente maior
gues com água purificada estéril, para a remoção que o diâmetro da broca) e encostada no
dos resíduos. Frascos ou bolsas não estéreis que ponto do bloco que se deseja amostrar. Li-
apresentem, num teste de lavagem da superfície ga-se a furadeira e as raspas congeladas do
interna, contagem de microrganismos viáveis me- alimento vão-se dirigindo para a superfície,
nor do que 1 UFC/ ml de capacidade, podem ser sendo coletadas no funil, de onde podem ser
utilizados sem esterilização prévia. transferidas para um frasco de coleta ade-
quado.
1.3.2. Procedimentos para a coleta b4) Quando a coleta for feita através de tor-
de alimentos acondicionados neiras ou tubulações, limpar a parte externa
em embalagens não individuais da saída com etanol 70%, flambar, se o ma-
a) Antes de iniciar a coleta da unidade de amos- terial for resistente ao fogo, e deixar escoar
tra, promover uma mistura de toda a massa uma certa quantidade do produto, antes de
de alimento, para garantir que a distribuição iniciar a coleta. Isso vai promover uma la-
dos microrganismos seja homogênea. Retirar vagem da tubulação e remover os resíduos
então, com utensílios ou instrumentos adequa- acumulados.
dos, a quantidade de produto necessária para b5) Para a amostragem de margarina e produ-
compor a unidade de amostra. tos similares (“spreads”) a ISO 6887-4:2017
b) Se não for possível promover a mistura da mas- recomenda remover a camada externa (3 a
sa de alimentos antes do início da amostragem, 5mm) e retirar as unidades de amostra com
retirar porções de diferentes partes do conteú- um amostrador tipo “corer”, previamente es-
do, até obter a quantidade de produto adequada terilizado. Introduzir o instrumento na diago-
para compor a unidade de amostra. Evitar a renal, sem atingir o fundo, rodar num círculo
tirada de porções das regiões próximas à super- completo e retirar, trazendo uma porção cô-
fície ou abertura do tanque ou volume. nica do produto.
b1) Para coletar amostras de pó, em diferentes c) Lembrar que a superfície externa dos frascos
partes de tanques ou grandes embalagens, e bolsas de coleta não é estéril. Assim, não se-
podem ser utilizados caladores ou amos- gurar os frascos ou bolsas diretamente acima
tradores verticais de tubo duplo, com com- da massa de alimento, pois podem cair ou in-
primento suficiente para atingir o centro da troduzir contaminantes no produto. Da mesma
massa de alimento. Usar um amostrador es- forma, nunca introduzir um frasco de coleta
téril diferente para cada unidade de amostra diretamente no produto, mas sim, utilizar um
coletada, ou desinfetar o instrumento entre utensílio adequado para retirar as unidades de
uma amostragem e outra. amostra.
b2) Para compor uma unidade de amostra com d) Ao retirar o instrumento de coleta cheio com
porções de diferentes pontos de alimentos o produto coletado, não manuseá-lo sobre os

outros instrumentos pré-esterilizados, pois res- mogeneizar todo o conteúdo, invertendo a emba-
pingos do alimento podem contaminar os que lagem várias vezes, desinfetar o bocal com etanol
serão utilizados posteriormente. 70% e, em condições assépticas, abrir o lacre com
e) Abrir os frascos ou bolsas de coleta apenas o uma faca ou tesoura estéril ou flambada. Despre-
necessário para introduzir o produto e fechar zar o volume inicial e coletar a amostra em um
imediatamente. frasco estéril adequado.
f) Não tocar a superfície interna dos frascos ou Para a coleta de outros tipos de água, a parte
bolsas de coleta e suas tampas. 9060A da 22a edição do Standard Methods for
g) Alimentos contaminados podem conter micror- the Examination of Water and Wastewater (Hunt,
ganismos perigosos para a saúde. Essas amos- 2012) traz as seguintes orientações:
tras devem ser coletadas por pessoal bem trei-
a) Para coletar amostras de torneiras e tubula-
nado na manipulação de microrganismos, cien-
ções, limpar a área externa da saída com uma
te dos cuidados necessários para sua própria
solução de hipoclorito de sódio a 100 mg/l ou
proteção. Na dúvida, tratar cada amostra como
com etanol 70%, flambando, se o material for
se estivesse contaminada.
resistente ao fogo. Abrir totalmente a torneira e
deixar a água fluir por 2 a 3 minutos, para lim-
1.3.3. Coleta de alimentos par a tubulação. Reduzir o fluxo para coletar a
envolvidos em casos de amostra sem respingos para fora do frasco de
doenças de origem alimentar coleta.
(DTAs) b) Para coletar amostras de água de poço ou cis-
O capítulo 2 do Compendium (Taylor et al., 2015) terna com bomba, bombear a água por cinco a
recomenda coletar e analisar amostras de todos os 10min, para estabilizar a temperatura da água
alimentos suspeitos, o mais cedo possível. Entre- antes da coleta. Se não houver uma bomba,
tanto, não adianta coletar amostras de alimentos preparar os frascos de coleta com um peso na
que tenham sofrido abuso de temperatura ou que base e introduzir o frasco diretamente no poço.
já se encontrem em estado de parcial deterioração. É necessário cuidado para não contaminar a
Os resultados dessas análises serão de pouca ou amostra com material acumulado na superfície
nenhuma utilidade para as conclusões da investi- da água.
gação. Se não houver sobras das refeições suspei- c) Para coletar amostras de água de rios, lagos ou
tas, pode-se tentar uma das seguintes alternativas: reservatórios, segurar o frasco de coleta pela
coletar amostras de refeições similares, prepara- base e mergulhar abaixo da superfície da água,
das posteriormente sob as mesmas condições, co- com a boca para baixo. Direcionar a boca do
letar amostras dos ingredientes e matéria-prima frasco para a corrente de água e elevar ligei-
utilizados na preparação das refeições suspeitas e ramente, para que a água fique retida. Se não
coletar os vasilhames onde as refeições suspeitas houver corrente de água, empurrar o frasco
se encontravam acondicionadas para frente horizontalmente, no sentido con-
trário ao da mão.
1.3.4. Coleta de amostras de água d) Amostras de água clorada devem ter o cloro
O capítulo 60 do Compendium (Robin & Feng, residual neutralizado imediatamente após a co-
2015) trata da coleta de água engarrafada, consi- leta, para impedir a continuação do seu efeito
derada pelo Codex Alimentarius como alimento. bactericida sobre a microbiota presente. Para
Essas amostras devem ser coletadas na embala- tanto, adicionar aos frascos de coleta, antes da
gem original, lacrada. Em havendo interesse ou esterilização, 0,1 ml de uma solução 3% de
necessidade de coletar volumes menores, a partir tiossulfato de sódio (Na2S2O3), para cada 100
de embalagens de maior capacidade, deve-se ho- ml de amostra que se pretende coletar. Essa

quantidade é suficiente para neutralizar 5 mg de estocagem dessas amostras não seja superior a
de cloro residual por litro de amostra. Nas situ- 20 ºC negativos. A ISO 7218:2007/Amd.1:2013
ações em que a concentração de cloro residual recomenda temperatura de 15 ºC negativos, de
seja superior a 5 mg/l, utilizar 0,1 ml de uma preferência 18 ºC negativos.
solução 10% de tiossulfato de sódio, para cada O transporte deve ser feito em caixas de isopor
100 ml de amostra que se pretende coletar. com gelo seco, porém, certos cuidados devem ser
Essa quantidade é suficiente para neutralizar observados. O produto não deve entrar em contato
15 mg de cloro residual por litro de amostra. com o gelo seco porque a absorção do CO2 pode
Podem também ser utilizadas bolsas plásticas alterar o pH. Se a tampa da embalagem não vedar
ou frascos estéreis, disponíveis comercial- a entrada de gases e/ou se embalagem for permeá-
mente já contendo o tiossulfato de sódio. Se a vel aos gases e/ou se tornar quebradiça com o frio,
amostra for coletada e enviada ao laboratório deve-se usar uma embalagem secundária. Geral-
pelo próprio interessado, sem a prévia neutra- mente um embrulho em papel grosso é suficiente
lização do cloro, adicionar a solução de tios- para prevenir esse problema.
sulfato de sódio estéril imediatamente após a Rótulos e etiquetas usados na identificação das
chegada da amostra, sob condições assépticas. amostras devem ser à prova d’água, para prevenir
a perda dos dados.
1.4. Transporte e estocagem
1.4.3. Transporte e estocagem de
de amostras até o
alimentos refrigerados
momento da análise
Amostras de alimentos comercializados na forma
Como regra geral, deve-se transportar e estocar refrigerada devem ser transportados e mantidos
amostras de alimentos da mesma forma como o sob refrigeração desde a coleta até o momento da
produto é normalmente transportado e estocado análise. O capítulo 2 do Compendium (Taylor et
na sua comercialização. As orientações abaixo al., 2015) recomenda, como regra geral, transpor-
devem ser observadas para garantir a integridade te e estocagem entre 0 e 4 ºC e intervalo máxi-
do produto até o momento das análises: mo de 36 horas entre a coleta e a análise. A ISO
7218:2007/Amd.1:2013 recomenda transporte
1.4.1. Transporte e estocagem de entre 1 ºC e 8 ºC, estocagem a 3±2 ºC e interva-
alimentos com baixa atividade lo máximo de 36h entre a coleta e a análise (24h
de água no caso de amostras altamente perecíveis). Na
impossibilidade de se proceder à análise no inter-
Alimentos desidratados, secos ou concentrados são valo de tempo preconizado, as amostras devem
estáveis microbiologicamente, podendo ser trans- ser congeladas e mantidas nas mesmas condições
portados e estocados à temperatura ambiente. De- descritas para amostras congeladas (item 1.4.2),
vem, entretanto, ser protegidos contra a umidade. desde que o congelamento não interfira na recu-
peração do(s) microrganismo(s) alvo (vide item
1.4.2. Transporte e estocagem de 1.4.3.1. exceções abaixo).
alimentos congelados O capítulo 2 do Compendium (Taylor et al., 2015)
Amostras de alimentos comercializados na forma recomenda que o transporte seja feito em caixas
congelada devem ser transportadas e mantidas de isopor com gelo, sendo recomendável o uso de
congeladas até o momento da análise, não poden- sachês de gelo reutilizável em gel, para evitar o
do sofrer descongelamento total ou parcial du- acúmulo de líquido nas caixas. Na indisponibili-
rante o transporte. O capítulo 2 do Compendium dade de gelo em gel, pode ser utilizado gelo co-
(Taylor et al., 2015) recomenda que a temperatura mum, desde que acondicionado em bolsas plásti-

cas. Caixas bem fechadas, com espaço amplo para d) No capítulo específico para Campylobacter a
gelo, suficiente para envolver todos os frascos de ISO 10272-1:2006 destaca a sensibilidade de
amostra, podem manter temperaturas de refrige- Campylobacter ao congelamento e à secagem,
ração adequadas por até 48 horas, na maioria das recomendando que as amostras não sejam con-
situações. Como regra geral, essas amostras não geladas e que sejam protegidas contra a perda
devem ser congeladas, por isso, não é recomen- de umidade. Indica estocagem à 3±2 ºC e aná-
dável o uso de gelo seco nas caixas de isopor. lise o mais rápido possível. O Bacteriological
Se o tempo de trânsito for prolongado e houver Analytical Manual (Hunt et al., 2001) destaca
necessidade de usar gelo seco, as embalagens de que Campylobacter é sensível ao ar, secagem,
amostras não devem entrar em contato direto com baixo pH, aquecimento, congelamento e es-
as embalagens de gelo seco, para evitar o congela- tocagem prolongada, podendo sofrer injúrias
mento. Rótulos e etiquetas usados na identificação que dificultam a detecção. Células velhas ou
das amostras devem ser a prova d’água, para pre- estressadas gradualmente adquirem forma
venir a perda dos dados. cocoide e se tornam mais difíceis de cultivar.
1.4.3.1. Exceções. Para certos produtos ou micror- Para estocagem prolongada, C. jejuni subsp
ganismos as recomendações são diferenciadas: jejuni pode sobreviver duas a quatro semanas
sob refrigeração (4 ºC), se for garantida bai-
a) No capítulo específico para bactérias lácticas
xa tensão de oxigênio e proteção contra perda
o congelamento não é recomendado, devido
de umidade (exceto no caso de leite cru). Nas
à grande susceptibilidade desses microrganis-
mesmas condições, também pode sobreviver
mos às injúrias pelo congelamento.
dois a cinco meses a 20 ºC negativos. Outras
b) No capítulo específico para vibrios patogênicos espécies, nas mesmas condições, podem so-
recomenda-se que as amostras sejam estocadas breviver (mas não se multiplicar) uma a três
sob resfriamento moderado (7-10 ºC) e anali- semanas a 4 ºC (exceto no caso de leite cru). A
sadas entre 24 e 48h após a coleta. O contato população diminui dois ciclos logarítmicos a
direto com gelo deve ser evitado, porque as 20 ºC negativos, mas os sobreviventes podem
células podem ser injuriadas se o resfriamen- ser recuperados após mais de cinco meses.
to for rápido. O congelamento das amostras é Uma vez abertos os frascos ou embalagens, a
desaconselhado e, em caso de absoluta neces- análise deve ser feita o mais rápido possível,
sidade, deve ser feito a 80 ºC negativos. porque a introdução de oxigênio é particular-
c) No caso de C. perfringens devem ser analisadas, mente deletéria para as células, já debilitadas
se possível, imediatamente, pois a estocagem pela estocagem prolongada.
por poucos dias sob refrigeração ou congela- e) No capítulo específico para contagem de aeró-
mento pode levar a uma redução de três a cin- bios psicrotróficos, recomenda-se que as amos-
co ciclos logarítmicos na contagem em placas. tras sejam analisadas no intervalo de seis ho-
Na impossibilidade de se proceder à análise ras, a partir da coleta. A estocagem refrigerada
imediata, o capítulo 33 do Compendium (La- permite a multiplicação dos psicrotróficos e o
bbe, 2015) recomenda que sejam refrigeradas tempo de geração de vários desses microrganis-
pelo menor tempo possível, não devendo ser mos encontra-se dentro desse intervalo. O con-
congeladas ou mantidas sob refrigeração pro- gelamento não é indicado para essas amostras,
longada. Havendo necessidade de estocagem porque pode provocar injúria ou morte de vários
por mais de 48 horas, tratar as amostras com microrganismos. Se o congelamento for indis-
Solução Tamponada Glicerol Sal (na quantida- pensável considerar na avaliação dos resultados
de requerida para atingir a concentração final que parte da microbiota pode ter sido perdida.
de 10% na amostra) e estocar entre 55 e 60 ºC f) Segundo o capítulo 46 do Compendium (Ricke
negativos. et al., 2015), amostras de ovo líquido refrige-

rado devem ser analisadas, se possível, dentro gem sob refrigeração e intervalo entre coleta e
de quatro horas após a coleta, não devendo ser análise preferencialmente de 8h, não devendo
congeladas. ultrapassar 24h.
g) Segundo o capítulo 51 do Compendium (Pé- Para outros tipos de água, a parte 9060B da 22a
rez-Diaz et al., 2015), amostras de produtos edição do Standard Methods for the Examination
vegetais fermentados ou acidificados não co- of Water and Wastewater (Hunt, 2012) traz a se-
mercialmente estéreis devem ser estocadas sob guinte orientação:
refrigeração por não mais do que 24 horas. c) Como regra geral, transporte e estocagem sob
refrigeração (menor que 8 ºC sem congelar) e
1.4.4. Transporte e estocagem intervalo entre coleta e análise não superior a
de alimentos comercialmente 24h.
estéreis em embalagens d) Para avaliação da conformidade de água po-
herméticas tável, transporte e estocagem sob refrigeração
(menor que 8 ºC sem congelar) e intervalo
Alimentos comercialmente estéreis com embala- entre coleta e análise não superior a 30h, para
gens em condições normais, podem ser transpor- quantificação de coliformes, ou 8h, para a
tados e estocados à temperatura ambiente, deven- quantificação de heterotróficos (contagem to-
do ser protegidos contra exposição a temperaturas tal de aeróbios mesófilos em placas).
superiores a 40 ºC (ISO 7218:2007/Amd.1:2013). e) Para a avaliação da conformidade de água não
Refrigerantes engarrafados, comercializados à potável, transporte e estocagem sob refrigera-
temperatura ambiente, também podem ser trans- ção (menor que 8 ºC sem congelar) e intervalo
portados e estocados nessas condições. entre coleta e análise não superior a 6h.
Segundo o capítulo 51 do Compendium (Parkin-
son & Francis, 2015), embalagens estufadas de-
vem ser acondicionadas em bolsas plásticas de-
1.5. Recepção de amostras
vido ao perigo de vazamento de material de alto para análise
risco microbiológico. O transporte e a estocagem
podem ser feitos sob refrigeração, para prevenir Na recepção de amostras para análise no laborató-
explosão, mas se houver suspeita de deterioração rio, devem ser observadas as condições da emba-
por bactérias termófilas, lembrar que a refrigera- lagem e as condições em que foi feito o transpor-
ção pode destruir as células vegetativas. te, antes da aceitação do pedido de análise. Deve
ser recusada qualquer amostra com embalagem
rasgada, furada, violada, com corpos estranhos ou
1.4.5. Transporte e estocagem de
qualquer outro tipo de defeito, bem como amos-
amostras de água
tras transportadas sob condições inadequadas. Se
O Capítulo 60 do Compendium (Robin & Feng, o interessado estiver encaminhando amostra com
2015) recomenda: embalagem já aberta ou com selo violado (comum
a) Para água engarrafada na embalagem original, no caso de amostras encaminhadas para responder
lacrada, transporte e estocagem à temperatu- à reclamações de consumidores, por exemplo),
ra ambiente, sem necessidade de refrigeração. pode-se proceder à análise, dependendo do tipo
Não há exigências quanto ao intervalo de tem- de embalagem, tipo de produto e microrganismos
po entre a coleta e a análise. investigados, porém, as condições em que a amos-
b) Para embalagens abertas ou amostras transfe- tra foi recebida devem constar da identificação da
ridas para outros frascos, transporte e estoca- amostra e do laudo final de análise.

1.6. Referências
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In: U S Food and Drug Administration (FDA), Bac- – tests for cause of spoilage. In: SALFINGER, Y. &
teriological Analytical Manual. [Online], disponível TORTORELLO, M.L. (eds.), Compendium of Me-
no site: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceRese- thods for the Microbiological Examination of Foods,
arch/LaboratoryMethods/ucm072616.htm [acesso em 5th ed. American Public Health Association, Washing-
15/09/16]. Chapter 7, revised March 2001. ton, D. C. Chapter 62, pp.805-821.
HUNT, M.E., 2012. Microbiological examination. In: RICE, PÉREZ-DIAZ, I.M., BREIDT, F. JR., BUESCHER, R.W.
E.W., BAIRD, R.B., EATON, A.D. & CLESCERI, et al., 2015. Fermented and acidified vegetables. In:
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of Water & Wastewater, 22nd Ed. Washington, D.C.: Compendium of Methods for the Microbiological Exa-
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RICKE, S.C., JONES, D.R. & GAST, R.K., 2015. Egg and
ICMSF (International Commission on Microbiological egg products. In: SALFINGER, Y. & TORTORELLO,
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Foods 7. Microbiological Testing in Food Safety Ma- biological Examination of Foods, 5th ed. American
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5th ed. American Public Health Association, Washing- the Examination of Dairy Products, 17 th ed. American
ton, D. C., 2015. Chapter 33, pp.403-409. Public Health Association, Washington, 2004.

2 Preparação de amostras
para análise
Figuras 2.1 e 2.2 (revisadas) As figuras da ISO 17604:2003 foram substituídas pelas da ISO 17604:2015.
Item 2.4 (revisado) Para a análise de leite e produtos lácteos foram corrigidos os diluentes recomendados pelo
Standard Methods for the Examination of Dairy Products e incluídos os diluentes recomendados pela ISO
6887-5:2010.
Item 2.5 (revisado) No procedimento geral descrito na 5ª edição do Compendium para diluição decimal seriada, a
duração do procedimento completo passou de 15 para 20 minutos. As recomendações para manter alimentos
de umidade intermediária de molho no diluente não foi mantida na análise de bolores e leveduras e de ente-
rococos.
Anexo 2.1.e (revisado) de acordo com a ISO 6887-5:2010 e ISO 6887-4:2017 para a homogeneização de produtos
muito duros.
Anexo 2.l.g (revisado) de acordo com a 5ª edição do Compendium e ISO 6887-4:2017 para a desinfecção da casca
de ovos.
Anexo 2.2.b (revisado) de acordo com a ISO 6887-4:2017 para preparação de alimentos gordurosos.
Anexo 2.2.c (nediovo) Incluído procedimento da 5ª edição do Compendium para preparação de amostras de pós
de baixa solubilidade com tendência à formação de grumos.
Anexo 2.2.d (revisado) de acordo com a ISO 6887-4:2017 para preparação de espessantes ou produtos com anti-
microbianos naturais.
Anexo 2.2.e (novo) Incluído procedimento da ISO 6887-4:2017 para preparação de amostras de gelatina.
Anexo 2.2.f (revisado) acrescentando recomendações da ISO 6887-4:2017 para preparação de produtos ácidos.
Anexo 2.2.g (revisado) de acordo com a ISO 6887-4:2017 para preparação de farinhas, cereais e ração animal.
Anexo 2.2.h (revisado) de acordo com a ISO 6887-4:2017 para preparação de cacau e chocolate.
Anexo 2.2.j (revisado) de acordo com a ISO 6887-4:2017 para preparação de produtos fermentados contendo
microrganismos vivos.
Anexo 2.2.l (revisado) Substituído o procedimento da ISO 8261:2001 (revogada) pelo da ISO 6887-5:2010 para
preparação de amostras de manteiga.
Anexo 2.2.m (revisado) Substituído o procedimento da ISO 8261:2001 (revogada) pelo da ISO 6887-5:2010 para
preparação de amostras de produtos lácteos congelados.
Anexo 2.2.p (revisado) Substituído o procedimento da ISO 8261:2001 (revogada) pelo da ISO 6887-5:2010 para
preparação de amostras de caseína e caseinatos.
2.1. Introdução and Wastewater (Rice et al., 2012) (específicas

para a análise de água), na 17ª edição do Stan-
As orientações contidas nesse capítulo são da dard Methods for the Examination of Dairy Pro-
American Public Health Association (APHA), ducts (Wehr & Frank, 2004) (específicas para a
descritas na 5ª edição do Compendium of Me- análise de produtos lácteos) e de várias normas
thods for Microbiological Examination of Foods da International Organization for Standardization
(Salfinger & Tortorello, 2015), na 22ª edição do (ISO 6887-1:1999, ISO 6887-2:2003, ISO 6887-
Standard Methods for the Examination of Water 3:2003, ISO 6887-4:2017, ISO 6887-5:2010 e

ISO 7218:2007/Amd.1:2013 (recomendadas para utensílios em bandejas de descarte, não direta-

ensaios realizados com metodologia ISO). mente sobre as bancadas.
A preparação das amostras para a análise envolve ▪ Todos os instrumentos e utensílios utilizados na
três etapas, que são a homogeneização do conteú- abertura das embalagens e retirada das unida-
do e retirada da unidade analítica, a preparação da des analíticas (tesouras, pinças, facas, espátu-
primeira diluição da unidade analítica e a prepara- las etc.) devem ser previamente esterilizados
ção de diluições decimais seriadas, para inocula- (em autoclave ou estufa de esterilização) ou
ção nos meios de cultura. mergulhados em etanol 70% e flambados no
Antes de iniciar os procedimentos, recomenda- momento do uso.
se que sejam observados alguns cuidados, para ▪ Antes de abrir as embalagens, desinfetar a área
garantir que as atividades sejam conduzidas sob externa com etanol 70%, mantendo o contato
condições assépticas: até a evaporação do álcool. No caso de emba-
▪ Assegurar-se de que a área de trabalho esteja lagens flexíveis, cortar com uma tesoura esté-
limpa e as portas e janelas fechadas, para evi- ril. No caso de embalagens rígidas com tampa
tar correntes de ar. rosqueável, desrosquear e remover a tampa
▪ Desinfetar todas as superfícies de trabalho com assepticamente. No caso de latas com sistema
um desinfetante adequado (etanol 70%, clo- de abertura tipo “easy open”, abrir asseptica-
reto de benzalcônio a 500ppm, hipoclorito de mente e remover a tampa. No caso de latas sem
sódio ou outro composto de cloro a 200ppm sistema “easy open”, usar um abridor de latas
são adequados). estéril. No caso de latas, vidros, caixinhas e
▪ Assegurar-se de que todo o material necessário outras embalagens destinados ao teste de este-
esteja disponível nas bancadas. rilidade comercial, devem ser seguidos proce-
▪ Lavar as mãos e desinfetar com um desinfetante dimentos diferenciados, descritos no Capítulo
adequado ao contato com a pele. Se requeri- específico. Esses procedimentos objetivam ga-
do, colocar luvas, verificando a necessidade rantir a integridade da selagem, para análises
ou não de luvas nos capítulos específicos de posteriores da embalagem, se necessárias.
ensaios com patógenos. ▪ Observar e anotar qualquer anormalidade nas
▪ Trabalhar preferencialmente no interior de ca- embalagens ou no conteúdo interno, como es-
pelas de fluxo laminar vertical, para prevenir tufamento, vazamento, odor e/ou aparência es-
a contaminação da amostra pelo ambiente e do tranha, presença de corpos estranhos etc.
ambiente e do analista pela amostra. Na indis-
ponibilidade de uma capela de fluxo laminar,
2.2. Material necessário
trabalhar na região próxima à chama de um
bico de Bunsen que, em bom funcionamento, Reagentes e diluentes
deve ter a chama azulada. Na manipulação de □ Etanol 70% (álcool 70)
amostras em pó não é recomendável trabalhar □ Álcool iodado 3:1
na chama de bico de Bunsen. A ISO 7218:2007 □ Solução de iodo desinfetante
estabelece o uso de uma área separada ou de □ Cloreto de benzalcônio a 500ppm, hipoclorito
uma capela de fluxo laminar. de sódio ou outro composto de cloro a 200ppm
▪ Evitar a formação de aerossóis ao abrir tubos, □ Água Peptonada 0,1% (H2Op)
frascos ou placas depois de agitar, ao liberar □ Água Salina Peptonada (H2Osp)
o conteúdo de pipetas ou ao flambar alças de □ Água Peptonada Tamponada (BPW)
inoculação. □ Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
▪ Nunca pipetar com a boca, mas sim, usando pi- □ Tampão Fosfato segundo ISO 6887-5
petadores. (PB-ISO 6887-5)
▪ Depois de usados, acomodar as pipetas e outros □ Solução de Ringer ¼ de concentração

Preparação de amostras para análise □ 13
□ Tampão Fosfato Cloreto de Magnésio □ Bandejas de descarte

□ Solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2%
com pH ajustado em 7,5±0,2
□ Solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% 2.3. Homogeneização
com pH ajustado em 8,4±0,2 da amostra e retirada da
□ Solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% unidade analítica
com anti espumante e pH ajustado em 7,5±0,2
□ Solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% Unidade analítica é a quantidade de material re-
com anti espumante e pH ajustado em 8,4±0,2 tirado da amostra para ser utilizado na realização
□ Solução de citrato de sódio (Na3C6H5O7.2H2O) 2% de um ou mais ensaios. O número de unidades
□ Leite em pó desnatado dissolvido em Tampão analíticas que devem ser retiradas e a quantidade
Fosfato (0,1g/100 ml) de material em cada unidade analítica dependem
□ Solução de tripolifosfato (Na3O10P3) 2% do número e tipos de ensaios que serão realiza-
□ Tergitol-7 Aniônico ou Tween 80 dos na mesma amostra. De maneira geral são ne-
□ Sulfito de potássio (K2SO3) cessárias:
□ Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1N es- a) Uma unidade analítica para cada ensaio de pre-
téril sença/ausência com enriquecimento em caldo
□ Solução de ácido clorídrico (HCl) 1N estéril específico. Esses ensaios geralmente são Ali-
□ Solução de púrpura de bromocresol 0,04% al- cyclobacillus, Salmonella, Listeria monocyto-
coólica genes, Yersinia enterocolitica, Campylobacter,
Equipamentos Escherichia coli O157:H7, Cronobacter, Vi-
□ Capela de fluxo laminar vertical brio cholerae, Vibrio parahaemolyticus e Vi-
□ Bico de Bunsen brio vulnificus). A quantidade de material em
□ “Shaker” cada uma dessas unidades analíticas é definida
□ Refrigerador com temperatura abaixo de 4 ºC nos capítulos específicos para esses ensaios.
□ Banho maria com temperatura regulável na b) Uma unidade analítica para cada ensaio com
faixa de 30 a 45 ºC tratamento diferenciado da amostra. Esses en-
□ Furadeira elétrica e brocas esterilizadas saios geralmente são esterilidade comercial,
□ Balança calibrada contagem de esporos de bactérias e contagem
□ Agitador magnético com barras magnéticas es- de bolores termorresistentes. A quantidade de
terilizadas material em cada uma dessas unidades analíti-
□ Liquidificador cas também é definida nos capítulos específi-
□ Homogeneizador peristáltico (“stomacher”) cos para esses ensaios.
□ Agitadores tipo “vortex” c) Uma unidade analítica para os ensaios gerais de
Instrumentos e utensílios quantificação. Os ensaios gerais de quantifica-
□ Tesouras ção compreendem a contagem total de aeróbios
□ Pinças mesófilos ou psicrotróficos, a contagem de bo-
□ Facas lores e leveduras, a contagem de bactérias lác-
□ Martelos ticas, a contagem de enterococos, a contagem
□ Espátulas de enterobactérias, a contagem de coliformes
□ Baguetas de vidro totais/termotolerantes/E. coli, a contagem de S.
□ Pipetas de capacidade variada aureus, a contagem de B. cereus, a contagem de
□ Funis estéreis de capacidade variada C. perfringens e a contagem de Pseudomonas.
□ “Swabs” e esponjas para amostragem de su- Esses ensaios são feitos com a mesma unida-
perfícies de analítica que, no Brasil, geralmente é de 25
□ Moldes para amostragem de superfícies gramas ou mililitros da amostra. A ISO 6887-1

(1999) recomenda que seja de, no mínimo, 10g Retirar a unidade analítica com uma pipeta, inserida
para sólidos ou 10 ml para líquidos. O Capítulo numa profundidade não maior do que 2,5cm abaixo
2 do Compendium (Taylor et al., 2015), reco- da superfície do líquido. A medida deve ser volu-
menda que seja de 50g para alimentos sólidos métrica e o intervalo entre a homogeneização da
e 10, 11 ou 50 ml para produtos líquidos. En- amostra e a retirada da unidade analítica não deve
tretanto, nos capítulos específicos, a quantida- ultrapassar 3min. O capítulo 2 do Compendium
de recomendada na maioria dos casos é de 25g (Taylor et al., 2015) não estabelece limite para a in-
ou menor. Assim, unidades analíticas de 25g certeza da medição do volume que, segundo a ISO
atendem às exigências da ISO 6887-1 (1999) 6887-1 (1999), não deve ser maior que 5%.
e, também, às do Compendium, para a maioria
dos ensaios. Há casos diferenciados em que a 2.3.2. Procedimento para a
unidade analítica deve ser maior ou menor do homogeneização e retirada
que o especificado aqui, devendo ser consulta- da unidade analítica de
do o Anexo 2.2, para verificar essas exceções. produtos sólidos ou líquidos
Antes da retirada da(s) unidade(s) analítica(s), o concentrados
conteúdo da amostra deve ser bem homogeneiza-
do, para garantir que a porção removida seja re- No caso de amostras sólidas ou líquidos concen-
presentativa de todo o material. Os procedimentos trados, seguir as orientações do Anexo 2.1, que
para se conseguir uma boa homogeneização são define os procedimentos mais adequados de ho-
diferentes para produtos líquidos, produtos sóli- mogeneização e retirada da unidade analítica de
dos e produtos com contaminação predominante- diferentes tipos de alimentos. O capítulo 2 do
mente superficial, conforme apresentado abaixo. Compendium (Taylor et al., 2015) recomenda que
a incerteza da medição da massa não seja maior
2.3.1. Procedimento para a do que 0,1g. A ISO 6887-1 (1999) recomenda que
não exceda 5%. O intervalo entre a homogenei-
homogeneização e retirada da
zação e a retirada da unidade analítica não deve
unidade analítica de produtos
ultrapassar 15 minutos.
líquidos
Se a amostra estiver congelada, o capítulo 2 do
No caso de amostras líquidas (viscosidade não Compendium (Taylor et al., 2015) recomenda
maior que a do leite) acondicionadas em frascos descongelar sob refrigeração (<4,4 ºC) por não
com espaço suficiente para a agitação, inverter a mais de 18 horas, na embalagem original. Alter-
embalagem 25 vezes. Se o frasco apresentar mais nativamente, podem ser usadas temperaturas mais
de 2/3 do espaço preenchido, inverter 25 vezes altas, mas não superiores a 40 ºC e por não mais
num arco de 30cm, em sete segundos. Se não hou- do que 15 minutos. Nesse caso, é requerida a agi-
ver espaço livre para agitação, utilizar um segundo tação frequente da amostra, para facilitar o des-
frasco, estéril e transferir a amostra de um frasco congelamento. O uso de um banho com tempe-
para o outro, por três vezes. Se houver formação ratura controlada e agitação é recomendável. No
de espuma, aguardar que a espuma disperse. Se caso de grandes blocos de alimentos congelados,
a amostra for gaseificada (refrigerantes produtos que não podem ser descongelados nas condições
similares), transferir o conteúdo para um frasco preconizadas acima, pode ser seguido o procedi-
estéril de boca larga e, com a tampa ligeiramente mento recomendado pela ISO 6887-2 (2003) para
aberta, agitar em “shaker” até a completa expul- grandes peças de carne. Utilizar uma furadeira
são dos gases (essa etapa pode ser dispensada se a elétrica (com a broca previamente esterilizada)
unidade analítica for transferida diretamente para combinada com um funil estéril. Inserir a broca
o frasco de filtração, nos ensaios pelo método da no funil (cujo diâmetro de abertura inferior deve
filtração em membrana). ser apenas ligeiramente maior que o diâmetro da

broca) e posicionar a broca no ponto do bloco que mento por 3mm de diâmetro e a parte absorvente
se deseja amostrar. Ligando-se a furadeira, as ras- em algodão com aproximadamente 2cm de com-
pas congeladas vão-se acumulando no funil, de primento por 5mm de diâmetro.
onde pode(m) ser retirada(s) a(s) unidade(s) ana-
2.3.3.1. Amostragem com “swabs”
lítica(s) necessária(s) para os ensaios.
Se a amostra for heterogênea, composta por di- Preparar tubos ou frascos com 10 ml de um diluen-
ferentes camadas de composições distintas (bo- te adequado, sendo recomendados pelo capítulo
los recheados, tortas, sobremesas e outros pratos 2 do Compendium (Taylor et al., 2015) a Água
prontos para consumo, por exemplo), a ISO 6887- Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH
4:2017 recomenda compor a unidade analítica 7,2 (PB) e pela ISO 6887-1 (1999) a Água Salina
com porções das diferentes camadas, levando em Peptonada (H2Osp) ou a Água Peptonada Tampo-
conta a proporção presente no produto. Alternati- nada (BPW). Retirar o “swab” de sua embalagem
vamente, homogeneizar todo o conteúdo da amos- estéril, segurando a haste na extremidade oposta
tra e retirar a unidade analítica do macerado. à do algodão. Umedecer o algodão no diluente,
Se a quantidade de amostra encaminhada para a comprimindo-o contra as paredes do frasco para
análise for menor do que a(s) unidade(s) analíti- remover o excesso de líquido.
ca(s) requerida(s), o capítulo 2 do Compendium Usando um molde estéril de 50cm2, delimitar a
(Taylor et al., 2015) recomenda submeter metade área a ser amostrada, segurando o molde firme-
à análise, reservando a outra metade como con- mente contra a superfície. Aplicar o “swab” com
tra-amostra. Se a homogeneização da amostra for pressão, descrevendo movimentos da esquerda
feita em liquidificador, a quantidade de amostra para a direita e depois de baixo para cima. Rodar o
mais diluente (primeira diluição 10-1) no copo do “swab” continuamente, para que toda a superfície
liquidificador deve ser suficiente para cobrir as do algodão entre em contato com a amostra. Após a
facas do aparelho. Para produtos cárneos, a ISO aplicação, transferir o “swab” para o tubo ou frasco
6887-3 (2003) recomenda usar todo o material de diluente, quebrando a parte manuseada da haste
nos ensaios. na borda interna do tubo ou frasco, antes de mer-
gulhar o restante do “swab” no diluente. Repetir
2.3.3. Procedimento para a esse procedimento mais uma vez, sobre a mesma
retirada da unidade analítica área, usando um “swab” seco. Recolher o segundo
“swab” no mesmo frasco ou tubo de diluente.
pela técnica do esfregaço de
O líquido de coleta dos “swabs” pode ser utilizado
superfície
tanto nos ensaios gerais de quantificação como nos
A técnica do esfregaço de superfície aplica-se ensaios de presença/ausência, que requerem en-
aos alimentos cuja contaminação é predominan- riquecimento em caldo diferenciado (no segundo
temente superficial, como carcaças de bovinos, caso, seguir as orientações dos capítulos específi-
suínos, aves e peixes. Aplica-se também à análise cos). Considerar que esse procedimento amostra
de superfícies de equipamentos, mesas, utensílios uma área de 50cm2 e cada mililitro de diluente,
e embalagens. depois de recolhidos os “swabs”, corresponde a
O esfregaço pode ser feito com “swabs” estéreis 5cm2 de superfície. Tanto a área amostrada quanto
ou, se a área amostrada for grande, com esponjas o volume de diluente podem variar, de acordo com
estéreis. Esse material pode ser adquirido em em- a necessidade ou com as características da amostra.
balagens individuais, estéreis. As esponjas podem Para fazer o esfregaço de meias carcaças de bo-
ser substituídas por tampões de algodão estéreis, vinos e suínos usando o mesmo procedimento,
preparados no laboratório. Os “swabs” também a ISO 17604:2015 recomenda amostrar os pon-
podem ser preparados no laboratório, com hastes tos apresentados nas Figuras 2.1 e 2.2. Usar um
de madeira de aproximadamente 15cm de compri- “swab” para cada ponto e, entre um ponto e ou-

Figura 2.1. Pontos recomendados pela ISO 17604:2015 para a amostragem de carcaças de bovinos com “swabs”.
Figura 2.2. Pontos recomendados pela ISO 17604:2015 para a amostragem de carcaças de suínos com “swabs”.

tro, mergulhar o molde em etanol 70% e flambar. 2.3.4. Procedimento para a retirada
Os “swabs” podem ser recolhidos em um mesmo da unidade analítica pela
frasco, com um volume total de diluente corres- técnica da lavagem superficial
pondente a 10 ml para cada par de “swabs”.
A técnica da lavagem superficial aplica-se a ali-
2.3.3.2. Amostragem com esponjas mentos de contaminação predominantemente su-
perficial, como carcaças de aves inteiras, cortes
Preparar tubos ou frascos com 25 ml de um dos
de aves, peixes, cascas de ovos, grãos, sementes,
diluente recomendados para os “swabs”. Abrir a
castanhas, amendoins, que podem ser mergulha-
bolsa plástica contendo a esponja (ou tampão de
dos em um diluente adequado, contido em uma
algodão) estéril e adicionar uma quantidade de
bolsa estéril. Aplica-se também à análise de em-
diluente suficiente para molhar a esponja, sem
balagens que possam ser fechadas e agitadas com
excesso de fluído visível. Segurando a bolsa pelo
um diluente em seu interior, para lavagem e coleta
lado de fora, massagear a esponja para umedecer
da contaminação.
uniformemente. Lavar bem as mãos, colocar um
par de luvas estéreis e retirar a esponja da bolsa. 2.3.4.1. Procedimento para a lavagem de
Usando um molde vazado estéril, de 10x10cm, carcaças de aves
delimitar a área a ser amostrada, segurando o
Procedimento recomendado pelo USDA/FSIS
molde firmemente contra a superfície. Aplicar a
(2017) e pela ISO 17604:2015, que pode ser uti-
esponja com pressão, descrevendo 10 movimen-
lizado para a análise simultânea de Salmonella e
tos da esquerda para a direita e 10 movimentos
outros microrganismos.
de baixo para cima. Após a aplicação, colocar a
esponja de volta na bolsa e adicionar o restante do Drenar o excesso de líquido das embalagens,
diluente, completando os 25 ml. transferir a carcaça para uma bolsa estéril e pe-
sar. Adicionar à bolsa e na cavidade da carcaça,
O líquido de coleta das esponjas pode ser utiliza-
400 ml de um dos diluentes recomendados para
do tanto nos ensaios gerais de quantificação como
“swabs”. Segurando a carcaça com uma mão e
nos ensaios de presença/ausência que requerem
fechando a abertura da bolsa com a outra, agitar
enriquecimento em caldo diferenciado (no se-
rodando o líquido na bolsa, de forma a lavar toda
gundo caso, seguir as orientações dos capítulos
a superfície interna e externa da carcaça.
específicos). Considerar que esse procedimento
amostra uma área de 100cm2 e cada mililitro de O líquido obtido na lavagem pode ser utilizado
diluente, depois de recolhida a esponja, corres- tanto nos ensaios gerais de quantificação como
ponde a 4cm2 de superfície. Tanto a área amostra- nos ensaios de presença/ausência que requerem
da quanto o volume de diluente podem variar, de enriquecimento em caldo diferenciado (no se-
acordo com a necessidade ou com as característi- gundo caso, seguir as orientações dos capítulos
cas da amostra. específicos). Considerar que, nesse procedimento,
cada mililitro do lavado corresponde ao peso da
Para fazer o esfregaço de meias carcaças de bo-
carcaça dividido por 400. Por exemplo, se o peso
vinos e suínos, usar o mesmo procedimento para
da carcaça for de 1600g, cada mililitro do lavado
cada um dos pontos recomendados pela ISO
corresponde a 4g da amostra. Para os ensaios de
17604:2015, apresentados nas Figuras 2.1 e 2.2.
presença/ausência em 25g podem ser adicionados
Usar uma esponja para cada ponto e, entre um
6,25 ml do lavado a 56,25 ml de cada caldo de
ponto e outro, mergulhar o molde em etanol 70%
enriquecimento que inicia o respectivo ensaio (di-
e flambar. As esponjas podem ser recolhidas em
luição 1:10, vide item 2.4).
uma mesma bolsa, adicionando à essa bolsa todas
as porções restantes do volume de 25 ml corres-
pondente a cada esponja.

2.3.4.2. Procedimento para a lavagem de gundo caso, seguir as orientações dos capítulos
outros alimentos específicos). Considerar que, nesse procedimento,
Transferir a amostra para uma bolsa estéril e pesar. cada mililitro do lavado corresponde à capacidade
Usando os mesmos diluentes recomendados para da embalagem dividido pelo volume de diluente.
“swabs”, adicionar à bolsa o volume de diluente Por exemplo, se a capacidade da embalagem for
requerido para diluição inicial 1:1 (1 ml de diluen- de 500 ml e o volume de diluente igual a 100 ml,
te por grama de amostra). Fechando a abertura da cada mililitro do lavado corresponde a 5cm3.
bolsa com uma mão, agitar a amostra e massagear
as peças com a outra mão, por fora das bolsas, 2.3.5. Guarda de contra-amostras
com os devidos cuidados para que pontas ou ou-
tras protuberâncias não venham a furar a emba- A ISO 7218:2007/Amd.1:2013 recomenda que,
lagem. No caso de grãos, sementes, castanhas e depois da retirada da(s) unidade(s) analítica(s), o
produtos similares, a amostra pode ser colocada material remanescente seja estocado nas mesmas
em um frasco com o diluente e agitada por 10min condições utilizadas antes da análise. As amos-
em “shaker”. tras perecíveis precisam ser congeladas, porém
O líquido obtido na lavagem pode ser utilizado é destacado o fato de que o descongelamento da
tanto nos ensaios gerais de quantificação como nos contra-amostra para repetição do(s) ensaio(s) não
ensaios de presença/ausência que requerem en- é uma prática aceitável, devido à possível morte
riquecimento em caldo diferenciado (no segundo de parte da população presente. No caso de pro-
caso, seguir as orientações dos capítulos especí- dutos congelados, esse problema pode ser solu-
ficos). Considerar que, nesse procedimento, cada cionado descongelando-se para a análise apenas
mililitro do lavado corresponde a 1g de amostra. a porção requerida no(s) ensaio(s). A quantidade
remanescente, que não sofreu descongelamento,
O volume de diluente pode variar, de acordo com a
pode ser mantida congelada como conta-amos-
necessidade ou com as características da amostra.
tra, para uma posterior repetição do(s) ensaio(s),
2.3.4.3. Procedimento para a lavagem de se necessária. No caso de produtos refrigerados,
embalagens não há forma aceitável de manter contra-amostras
Esse procedimento é recomendado para embala- sem congelamento. No caso de repetição do(s)
gens com tampa à prova de vazamento. No caso ensaio(s), a interpretação do(s) resultado(s) deve
de embalagens sem a tampa ou com tampas que levar em consideração o fato de que a população
não sejam à prova de vazamento, recorrer ao mé- do(s) microrganismo(s) alvo pode ter diminuído
todo do “swab”. em razão do congelamento.
Usando os mesmos diluentes recomendados para No caso de amostras cuja coleta da unidade ana-
“swabs”, adicionar à embalagem uma quantidade lítica tenha sido feita pela técnica do esfregaço
de diluente suficiente para lavar toda a superfície de superfície ou da lavagem superficial, congelar
interna, por agitação (1/5 da capacidade da em- como contra-amostra a parte não utilizada do di-
balagem, por exemplo). Fechar e, com as mãos, luente em que foram recolhidos os contaminantes.
agitar vigorosamente a embalagem, para remover Também nesse caso, levar em consideração o fato
os microrganismos aderidos às paredes internas. de que a população do(s) microrganismo(s) alvo
Procurar atingir todos os pontos da superfície in- pode diminuir em razão do congelamento.
terna, de forma a garantir uma completa remoção O tempo mínimo de guarda das contra-amostras
dos contaminantes presentes. é o requerido para a obtenção dos resultados dos
O líquido obtido na lavagem pode ser utilizado ensaios, devendo, entretanto, ser definido a crité-
tanto nos ensaios gerais de quantificação como rio do laboratório. O descarte final das amostras
nos ensaios de presença/ausência que requerem pode ser feito no lixo, porém, aquelas deteriora-
enriquecimento em caldo diferenciado (no se- das ou suspeitas de conter microrganismos noci-

vos à saúde devem ser descontaminadas em au- ▪ A ISO 6887-5:2010 recomenda, a Água Pepto-
toclave (121 ºC/30min) antes do descarte (ISO nada 0,1% (H2Op), a Água Peptonada Tampo-
7218:2007/Amd.1:2013). nada (BPW), a Água Salina Peptonada 0,1%
(H2Osp), a Solução de Ringer ¼ de concentra-
ção ou o Tampão Fosfato segundo ISO 6887-5
2.4. Preparo da 1ª diluição (PB-ISO 6887-5) para a análise de leite e pro-
da unidade analítica dutos lácteos.
▪ O Standard Methods for the Examination of
No prosseguimento da análise, a unidade analítica Water & Wastewater (Hunt, 2012) recomenda,
deve ser diluída e homogeneizada com um diluen- para a análise de água, a Água Peptonada 0,1%
te adequado, para permitir a inoculação nos meios (H2Op) ou o Tampão Fosfato Cloreto de Mag-
de cultura. Os diluentes e a diluição inicial reco- nésio, chamado de Água de Diluição.
mendados variam em função do tipo de amostra
Há casos especiais em que o diluente recomenda-
e do tipo de ensaio que será realizado, conforme
do é diferente, devendo ser consultado o Anexo
descrito abaixo:
2.2 para verificar essas exceções.
► Diluentes para os ensaios de
► Como obter uma diluição inicial de
presença/ausência
1:10 (10-1)
Esses ensaios, definidos no item 2.3, são feitos A diluição inicial recomendada para a maioria das
com diluição e homogeneização diretamente no amostras é de 1:10 (10-1), adicionando-se m gra-
caldo de enriquecimento, especificados nos capí- mas ou mililitros da amostra para 9 x m mililitros
tulos específicos. do diluente. Por exemplo, para 25g de amostra,
► Diluentes para os ensaios que adicionar 9x25 ml de diluente (225 ml). A ISO
requeiram tratamento diferenciado da 6887-1 (1999) recomenda que, para evitar injúrias
amostra aos microrganismos por choque térmico, a tempe-
ratura do diluente seja a mesma do ambiente. Há
Para esses ensaios, definidos no item 2.3, também
situações em que o diluente e a diluição inicial
devem ser consultados os capítulos específicos.
são diferentes, devendo ser consultado o Anexo
► Diluentes para os ensaios gerais de 2.2 para verificar essas exceções.
quantificação
► Como obter uma diluição inicial
Para esses ensaios, definidos no item 2.3, são fei- diferente de 1:10
tas as seguintes recomendações: Há casos especiais em que a primeira diluição é
▪ O capítulo 2 do Compendium (Taylor et al., diferente de 1:10. Para definir o volume de diluen-
2015) recomenda a Água Peptonada 0,1% te necessário para obter uma determinada dilui-
(H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) para ção 1:k da amostra, usar a relação v = [(k.m)–m].
alimentos em geral. Por exemplo, para obter a diluição 1:50 de uma
▪ A ISO 6887-1 (1999) recomenda a Água Sa- unidade analítica de 10g, adicionar [(50x10)-10]
lina Peptonada (H2Osp) e a Água Peptonada mililitros do diluente (490 ml). Para obter a mes-
Tamponada (BPW) para alimentos em geral. ma diluição com uma unidade analítica de 20g,
▪ O capítulo 4 do Standard Methods for the Exa- adicionar [(50x20)-20] mililitros do diluente (980
mination of Dairy Products (Davis & Hickey, ml).
2004) recomenda o Tampão Fosfato pH 7,2
(PB) (chamado de Água de Diluição Fosfa- ► Procedimento para o preparo da
to) ou o Tampão Fosfato Cloreto de Magnésio primeira diluição de amostras líquidas
(chamado de Água de Diluição Fosfato Mag- No caso de alimentos líquidos, transferir a unida-
nésio) para a análise de produtos lácteos. de analítica diretamente para os tubos ou frascos

contendo a quantidade de diluente necessária para coletada com “swabs”, esponjas ou lavagem su-
a diluição 1:10. Há casos especiais em que a dilui- perficial já é a primeira diluição da amostra. O tra-
ção inicial é diferente, devendo ser consultado o tamento subsequente de diluição decimal seriada
Anexo 2.2 para verificar essas exceções. é feito a partir dessa suspensão. Como a diluição
Homogeneizar amostra com o diluente por agita- inicial não é padrão de 1:10, considerar essa di-
ção, invertendo a embalagem 25 vezes. Para per- ferença no cálculo final dos resultados, conforme
mitir a homogeneização, utilizar tubos ou frascos descrito nos Capítulos 3 e 4.
com tampa de rosca. O tamanho deve ser suficien-
te para que não mais do que 2/3 da capacidade
2.5. Diluição decimal seriada
seja preenchida pela unidade analítica + diluente.
da amostra
► Procedimento para o preparo da
primeira diluição de amostras sólidas ou A preparação e inoculação de diluições seriadas
líquidos concentrados da amostra é requerida nos ensaios quantitativos,
No caso de alimentos sólidos ou líquidos concen- para reduzir o número de microrganismos por
trados, transferir a unidade analítica para frascos unidade de volume, permitindo a contagem. Essa
ou bolsas de homogeneização estéreis, previa- série de diluições geralmente é decimal, para faci-
mente tarados. Adicionar à amostra a quantidade litar o posterior cálculo dos resultados.
de diluente necessária para a diluição 1:10. Há ca- O número de diluições necessárias depende do ní-
sos especiais em que a diluição inicial é diferente, vel de contaminação esperado e deve ser tal que
devendo ser consultado o Anexo 2.2 para verificar permita, na contagem em placas, a obtenção de
essas exceções. placas com número de colônias adequado (vide
Capítulo 3). Na contagem pelo método do Núme-
Homogeneizar a unidade analítica com o diluente,
ro Mais Provável (NMP) deve ser tal que permita
o que pode ser feito por agitação com as mãos, in-
a obtenção de tubos positivos nas menores dilui-
vertendo o frasco em arco de 30cm em 7s (líquidos
ções e negativos nas maiores (vide Capítulo 4).
concentrados, pós solúveis), em homogeneizador
peristáltico (“stomacher”) por 1 a 2min (alimentos No procedimento geral descrito pelo capítulo 6 do
moles, pastosos, moídos, pós pouco solúveis) ou Compendium (Petran et al., 2015), a segunda di-
em liquidificador (alimentos duros). Na homoge- luição é iniciada logo após o término da primeira
neização em liquidificador o capítulo 2 do Com- e a duração do procedimento completo, desde a
pendium (Taylor et al., 2015) recomenda usar alta preparação da primeira diluição até que todos os
rotação nos primeiros segundos e baixa (8000rpm) meios de cultura estejam inoculados, não deve ex-
no tempo restante, que não deve ultrapassar 2min. ceder 20 minutos (exceto quando especificado nos
Se for necessário uma homogeneização mais pro- capítulos específicos).
longada, é importante prevenir o excessivo aqueci- No procedimento geral descrito pela ISO 6887-1
mento do material. Para isso, o capítulo 2 do Com- (1999), a duração do procedimento completo não
pendium (Taylor et al., 2015) recomenda resfriar o deve exceder 45 minutos e o intervalo entre o fim
diluente em banho de gelo, antes de usar, enquanto do preparo da primeira diluição e o início da se-
a ISO 6887-4:2017 recomenda não homogeneizar gunda e subsequentes não deve exceder 30 minu-
por mais do 2,5min de cada vez. tos (exceto quando especificado em procedimen-
tos específicos).
► Procedimento para o preparo da Em todas as transferências de volumes, a incerte-
primeira diluição de amostras obtidas za da medição não deve exceder 5% (ISO 6887-1,
por esfregaço de superfície ou por 1999). Utilizar pipetas com capacidade no máxi-
lavagem superficial
mo 10 vezes superior ao volume que vai ser co-
O diluente no qual foi recolhida a contaminação letado, uma pipeta diferente para cada diluição.

Caso a ponta venha a tocar qualquer superfície são, o material pode ser agitado antes de transferir
não estéril, descartar e substituir por outra. Não o volume da primeira para a segunda diluição.
flambar as pipetas. Encher completamente a pi- Se houver partículas em suspensão a ISO 6887-1
peta e descarregar o volume a partir da marca su- (1999) recomenda não agitar e aguardar que se-
perior, com a ponta encostada na parede interna dimentem no fundo do frasco, antes de transfe-
do tubo ou frasco, de forma que o líquido escorra rir o volume. No caso de amostras viscosas, que
pela parede. aderem à parede interna da pipeta, a ISO 6887-
5:2010 recomenda descarregar o volume e depois
► Como obter a segunda diluição (10-2)
lavar a pipeta com o diluente, aspirando e liberan-
Transferir assepticamente 1 ml da primeira dilui- do o líquido várias vezes, para garantir que todo o
ção (10-1) para 9 ml de diluente. Os diluentes são os material seja transferido para a segunda diluição.
mesmos recomendados no item 2.4 para a primeira
► Como obter as diluições subsequentes
diluição. Na segunda diluição não há casos espe-
ciais em que o diluente recomendado seja diferente. Proceder de maneira similar, transferindo-se 1 ml
Não mergulhar a pipeta numa profundidade supe- da diluição anterior para 9 ml de diluente. Antes
rior a 1cm ao pipetar o volume da primeira para de retirar o volume a ser transferido, agitar vigo-
a segunda diluição (ISO 6887-1, 1999). Se a pri- rosamente o tubo, invertendo 25 vezes em arco
meira diluição não contiver partículas em suspen- de 30cm (em 7s) ou com o auxílio de um agitador
tipo “vortex” (15s).
2.6. Referências
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Anexo 2.1.
Procedimentos para homogeneização do conteúdo e
retirada da unidade analítica de amostra de
diferentes tipos de alimentos
a) Produtos em pó tos lácteos, recomenda acondicionar a amostra em

Homogeneizar a amostra agitando e invertendo duas bolsas estéreis quando for ho mgeneizar em
a embalagem com as mãos, até misturar bem, ou stomacher. Quando for usado o liquidificador, não
revolver o conteúdo com uma espátula ou bague- ultrapassar 2,5min de cada vez.
ta estéril. Se a embalagem não tiver espaço livre f) Peças de alimentos sólidos
para homogeneização, transferir todo o conteúdo O capítulo 2 do Compendium (Taylor et al., 2015)
para um frasco maior e proceder da mesma forma recomenda usar um instrumento adequado (faca,
(ISO 6887-5, 2010). Retirar a unidade analítica tesoura estéril) para quebrar ou cortar pedaços
com uma espátula estéril. menores (de diversos pontos da peça), até obter a
b) Produtos pastosos ou moídos quantidade requerida para a análise.
O capítulo 2 do Compendium (Taylor et al., 2015) g) Ovos em casca
recomenda revolver o conteúdo com uma espátula
Para a análise do conteúdo interno o capítulo 46
ou bagueta estéril, para homogeneizar. Retirar a
do Compendium (Ricke et al., 2015) recomenda
unidade analítica com uma espátula estéril.
remover o material aderido à casca com uma es-
c) Iogurtes com pedaços de frutas cova, mergulhar em etanol 70% por 10 segundos e
Para iogurte com pedaços de frutas, o capítulo flambar ou mergulhar em álcool iodado 3:1 por 10
9 do Standard Methods for the Examination of segundos e deixar secar. Com luvas estéreis, abrir
Dairy Products (Duncan et al., 2004) recomen- os ovos assepticamente e colocar o conteúdo inter-
da homogeneizar todo o conteúdo da unidade de no num frasco ou bolsa estéril, separando a clara da
amostra em liquidificador, por 1min, antes de reti- gema, se a análise assim o exigir. Misturar bem e
rar a unidade analítica. retirar a unidade analítica da mistura.
d) Queijos A ISO 6887-4:2017 recomenda três procedimen-
O capítulo 9 do Standard Methods for the Exa- tos, dependendo da finalidade do ensaio:
mination of Dairy Products (Duncan et al., 2004) ▪ Para analisar apenas a contaminação externa,
recomenda macerar todo o conteúdo da unidade pode ser usado o procedimento da lavagem
de amostra (com uma espátula estéril) e retirar a superficial. Alternativamente, quebrar os ovos,
unidade analítica da mistura. desprezar o conteúdo interno, colocar as cas-
e) Produtos muito duros cas em uma bolsa estéril, quebrar as cascas,
A ISO 6887-4:2017 recomenda moer ou triturar a misturar bem e retirar a unidade analítica da
amostra até obter uma mistura homogênea. Para mistura.
evitar calor excessivo neste processo, não ho- ▪ Para analisar a contaminação externa e inter-
mogeneizar por mais de um minuto de cada vez. na, quebrar os ovos, colocar as cascas e o con-
Também pode-se colocar a amostra em duas bol- teúdo interno em um frasco ou bolsa estéril,
sas plásticas estéreis e fragmentar em pequenas misturar bem e retirar a unidade analítica da
partes com um martelo estéril. Após a adição do mistura.
diluente, manter a amostra homogeneizada em re- ▪ Para analisar apenas o conteúdo interno, lim-
pouso por uma hora entre 18 e 27 ºC, para a recu- par a casca com gaze molhada, secar com
peração de células estressadas. papel absorvente, mergulhar em solução de
A ISO 6887-5:2010, que é específica para produ- etanol 70% e, com luvas estéreis, remover

assepticamente os ovos da solução, deixando nos seis) e o líquido que escorre do interior das
secar. Com luvas, abrir os ovos assepticamen- conchas em um frasco ou bolsa plástica estéril.
te e colocar o conteúdo interno num frasco ou Lavar e desinfetar bem as mãos antes de iniciar o
bolsa estéril, separando a clara da gema, se a procedimento.
análise assim o exigir. Misturar bem e retirar a j) Moluscos gastrópodes (caracol, caramujo, bú-
unidade analítica da mistura. zio, lapa, apa, lesma)
h) Cortes de carne para análise de contamina- A ISO 6887-3 (2003) recomenda esfregar as con-
ção não superficial chas com uma escova abrasiva estéril, sob água cor-
Para a análise de contaminação profunda de car- rente (potável). Desinfetar com álcool 70%, colocar
caças ou cortes de carne, a ISO 6887-2 (2003) sobre uma superfície estéril e cobrir com papel ab-
recomenda expor uma área de aproximadamente sorvente estéril. Quebrar a concha com um martelo
5x5cm, usando uma faca ou tesoura estéril para estéril e retirar a carne assepticamente, recolhendo
remover a pele (se presente) e uma camada su- em uma bolsa ou frasco estéril. Lavar e desinfetar
perficial de aproximadamente 2mm. Cauterizar a bem as mãos antes de iniciar o procedimento.
superfície exposta com fogo e, com outra faca ou k) Moluscos cefalópodes (polvo, lula)
tesoura estéril, remover uma segunda camada de A ISO 6887-3 (2003) recomenda remover a pele
aproximadamente 1mm de profundidade e 4x4cm e retirar a unidade analítica dos músculos dorsais
de área. A partir dessa região exposta, retirar a(s) e dos tentáculos.
unidade(s) analítica(s) requerida(s) para os ensaios. l) Caranguejos e lagostas
i) Moluscos bivalves (ostra, mexilhão, linguei- A ISO 6887-3 (2003) recomenda quebrar a casca
rão, berbigão, conquilha, ameijoa) com um martelo estéril e remover o máximo da
A ISO 6887-3 (2003) recomenda esfregar as con- carne na retirada da unidade analítica.
chas com uma escova abrasiva estéril, sob água m) Ouriços do mar
corrente (potável). Drenar o excesso de água, co- A ISO 6887-3 (2003) recomenda lavar os orga-
locar sobre uma superfície estéril e cobrir com nismos em água corrente (potável), abrir o lado
papel absorvente estéril. Abrir assepticamente as ventral e retirar toda a carne e fluído internos com
conchas e então recolher os organismos (pelo me- uma espátula.

Anexo 2.2.
Casos especiais em que há variações na unidade analítica e/ou
diluição e/ou diluentes recomendados para a preparação da
primeira diluição de amostras de diferentes tipos de alimentos
a) Líquidos com baixa contaminação a diluição 10-1 adicionando, para cada m mililitros
Nos ensaios quantitativos de amostras líquidas de fase aquosa, 9m mililitros de diluente. Observa-
com baixa contagem microbiana, é comum ino- ção: No caso de ensaios de presença ausência po-
cular uma alíquota da amostra diretamente nos de-se usar uma unidade analítica de toda a amostra
meios de cultura, sem diluição. Nesse caso, a e não apenas a fase aquosa.
primeira diluição pode ser feita inoculando-se 1 O capítulo 6 do Standard Methods for the Exa-
ml da amostra em 9 ml do diluente. Também são mination of Dairy Products (Laird et al., 2004)
comuns os ensaios usando a técnica de filtração recomenda, para margarina e “spreads”, o mesmo
em membrana, inoculando-se um volume maior procedimento descrito para manteiga.
da amostra, sem qualquer diluição. c) Pós de baixa solubilidade com tendência à
b) Alimentos gordurosos formação de grumos
Para esses alimentos o capítulo 2 do Compendium Para esses alimentos o capítulo 2 do Compendium
(Taylor et al., 2015) recomenda suplementar o di- (Taylor et al., 2015) recomenda suplementar o di-
luente com 1% (P/V) de Tergitol-7 Aniônico ou luente com 1% (P/V) de Tergitol-7 Aniônico ou
equivalentes (Tween 80, por exemplo) e homoge- equivalentes (Tween 80, por exemplo) e homoge-
neizar em liquidificador por 2min, em baixa rota- neizar em liquidificador por 2min, em baixa rota-
ção (8000rpm). ção (8000rpm).
A ISO 6887-4:2017 e a ISO 6887-5:2010 reco- d) Espessantes ou produtos com antimicrobia-
mendam suplementar o diluente com 1 a 10g/l de nos naturais
Tween 80, dependendo do teor de gordura. Para Para espessantes e outros produtos que aumentam
produtos com 40% de gordura, por exemplo, su- de viscosidade em água (gomas, pectina, celu-
plementar com 4g/l de Tween 80. Esse procedi- lose, condimento desidratados em folhas, como
mento não se aplica a margarina e “spreads”. orégano) o capítulo 52 do Compendium (Hayman
Para margarina e “spreads” a ISO 6887-4:2017 et al., 2015) e a ISO 6887-1 (1999) recomendam
recomenda unidade analítica de 50g e o seguinte trabalhar com diluição inicial maior do que 1:10,
procedimento: adicionar à unidade analítica um podendo ser 1/20, 1/50, 1/100 ou outra adequada à
volume de diluente (sem suplementos) proporcio- viscosidade do material. A unidade analítica pode
nal ao teor de gordura da margarina. Por exem- ser de 10g e a diluição inicial utilizada deve ser
plo, para margarinas com 84% de gordura e uni- levada em conta no cálculo dos resultados. Se as
dade analítica de 50g, adicionar 50 x 0,84 = 42 contagens esperadas são baixas, deve-se manter,
ml de diluente. Colocar o frasco em banho maria se possível, a inoculação de 0,1g nos meios de
com temperatura controlada entre 44 e 47 ºC, até cultura (usando-se várias placas para distribuir o
a fusão do material. Esse período não deve exce- volume necessário da primeira diluição).
der 20min. Homogeneizar em stomacher até for- Para evitar diluição muito alta dessas amostras, a
mar uma emulsão homogênea. Deixar descansar ISO 6887-4:2017 sugere aumentar sua solubilidade,
à temperatura ambiente até a completa separação adicionando enzimas à Água Peptonada Tamponada
das fases aquosa (inferior) e gordurosa (superior). (BPW) usada como diluente. Para amido e cereais
Continuar a análise com a fase aquosa, na qual 1 pode-se adicionar 1% de alfa amilase à BPW. Para
ml corresponde a 1g de margarina. Preparar então carboximetil celulose, alfarroba ou goma de alfarro-

ba, goma guar e goma acácia, pode-se adicionar 1% g) Farinhas, cereais, ração animal
de celulase. Para gelatina, 2% de papaína. A ISO 6887-4:2017 recomenda Água Salina
Para produtos que contém compostos antimicro- Peptonada como diluente (para evitar choque os-
bianos naturais, como condimentos (alho, cebola, mótico) e repouso por 20-30min à temperatura
cravo, canela, orégano, pimenta) e certos chás e ambiente (18-27 ºC), antes de homogeneizar. Se
café também recomenda-se que a primeira dilui- a viscosidade da suspensão aumentar muito, difi-
ção seja maior do que 1:10. A ISO 6887-4:2017 cultando a homogeneização e a transferência de
sugere 1:100 para canela e orégano e 1:1000 para volumes, adicionar uma quantidade adicional de
cravo ou, alternativamente, a adição de 0,5% de diluente, até diluição 1:20. Considerar essa alte-
sulfito de potássio (K2SO3) ao diluente e trabalhar ração da diluição inicial no cálculo dos resultados.
com a diluição inicial normal. Para amostras de cereais, usar uma unidade analí-
O sal (NaCl) também pode inibir o crescimento tica de 50g.
dos microrganismos e amostras com mais de 10% h) Cacau e chocolate
em sua composição devem ser submetidas a uma A ISO 6887-4:2017 recomenda preaquecer o di-
diluição inicial maior, de forma que a concentra- luente a 37-40 ºC, adicionar à unidade analítica e
ção de sal na diluição 10-1 não ultrapasse 1% (ISO misturar por agitação manual. Manter em repouso
6887-4:2017). por 20-30min à temperatura ambiente (18-27 ºC),
e) Gelatina até a fusão do material, homogeneizando então
A ISO 6887-4:2017 recomenda unidade analítica em “stomacher”. Se for necessário fundir a amos-
de 20g em 180 ml de Tampão Fosfato. Misturar e tra para retirar a unidade analítica (antes da adição
deixar em repouso por 60min à temperatura am- do diluente), manter entre 42 e 47 ºC pelo tempo
biente (18 a 27 ºC), para absorção do diluente. necessário.
Transferir para um banho entre 44 e 47 ºC por no i) Clara de ovo líquida
máximo 30min, para fundir a gelatina. A ISO 6887-4:2017 recomenda que a primeira di-
f) Produtos ácidos luição seja 1:40, em Água Peptonada Tamponada
Para o preparo de produtos lácteos a ISO 6887- (BPW), para reduzir a inibição causada pela liso-
5:2010 recomendam que o pH da primeira diluição zima natural sobre os microrganismos. A diluição
seja neutralizado com NaOH estéril. Para facilitar inicial utilizada deve ser levada em conta no cál-
essa etapa, pode-se adicionar 0,1 ml/l de uma so- culo dos resultados.
lução de púrpura de bromocresol 0,04% alcoólica j) Produtos fermentados contendo microrga-
ao diluente. Na adição do NaOH, a elevação do pH nismos vivos destinados à quantificação da mi-
pode ser acompanhada pela alteração de cor do meio crobiota contaminante (exceto probióticos)
que, muda de amarelo para roxo em pH 6,8 (neu- A ISO 6887-4:2017, para a determinação de ou-
tro). A concentração do NaOH (0,1M ou 1M, por tros microrganismos que não os responsáveis
exemplo) a ser usada depende da acidez da amostra pela fermentação (os contaminantes), recomenda
e deve ser tal que a quantidade adicionada não altere usar como diluente a Água Peptonada Tampona-
significativamente a proporção 1 + 9 entre amos- da (BPW) suplementada com agentes inibidores
tra e diluente. Uma segunda opção é usar diluen- adequados para evitar a multiplicação do fermen-
tes tamponados mas, mesmo assim, a adição de to. Se os microrganismos responsáveis pela fer-
NaOH frequentemente é necessária, para aumen- mentação forem leveduras, adicionar ao meio de
tar a capacidade tamponante do meio. cultura onde será feita a contagem um agente an-
Para o preparo de outros alimentos a ISO 6887- tifúngico como a cicloeximida (50 mg/Kg), a nis-
4:2017 recomenda, quando necessária a neutrali- tatina (50 mg/Kg) ou a anfotericina (10 mg/Kg).
zação da amostra, usar como diluente a Água Pep- Para outros microrganismos responsáveis pela
tonada Tamponada (BPW) em concentração dupla. fermentação, adicionar um outro antibiótico, que

seja adequado para inibir essa microbiota. recomenda, para sorvetes e outras sobremesas
k) Produtos lácteos em pó (leite, soro de leite, lácteas congeladas, pesar uma unidade analítica
creme de leite, lactose) de 11g em um frasco estéril, adicionar 99 ml de
Para pós com baixa solubilidade o capítulo 6 do Tampão Fosfato pH 7,2 (PB), transferir para um
Standard Methods for the Examination of Dairy banho-maria regulado a 40 ºC, aguardar a fusão
Products (Laird et al., 2004) recomenda solução da amostra (não mais do que 15min) e homoge-
de citrato de sódio 2% com pH ajustado abaixo neizar por agitação ou em “stomacher.
de 8,0. n) Queijos
A ISO 6887-5 (2010) recomenda unidade analíti- A ISO 6887-5:2010 recomenda unidade analíti-
ca de 10g e que o pó seja adicionado ao diluente, ca de 10g e, como diluente, 90 ml de solução de
não o diluente ao pó (para facilitar a hidratação). fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajusta-
Para soro de leite ácido em pó usar 90 ml de solu- do em 7,5±0,2 ou de solução de citrato de sódio
ção de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH (Na3C6H5O7.2H2O) 2%, preaquecidos 45 ºC.
ajustado em 8,4±0,2. O capítulo 6 do Standard Methods for the Exa-
Para leite em pó (secagem em rolo) – 90 ml de mination of Dairy Products (Laird et al., 2004)
solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com recomenda unidade analítica de 11g e, como di-
pH ajustado em 7,5±0,2 ou solução de citrato de luente, 99 ml de solução de citrato de sódio 2%,
sódio (Na3C6H5O7.2H2O) 2%. preaquecida a 40-45 ºC.
l) Manteiga o) Produtos lácteos fermentados
A ISO 6887-5:2010 recomenda pesar uma unida- A ISO 6887-5:2010 recomenda unidade analítica
de analítica de 10g em um frasco estéril, transferir de 10g e, como diluente, 90 ml de água peptonada
para um banho-maria regulado a 45 ºC, aguardar tamponada (BPW) ou solução de fosfato de po-
a fusão da amostra, adicionar 90 ml de Água Pep- tássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7,5±0,2.
tonada Tamponada (BPW) ou Água Salina Pepto- Homogeneizar em “stomacher”.
nada 0,1% (H2Osp) e homogeneizar em “stoma- Para produtos destinados à contagem de bactérias
cher”. lácticas, o capítulo 19 do Compendium (Njongme-
O capítulo 6 do Standard Methods for the Exami- ta et al., 2015) e o capítulo 8 do Standard Methods
nation of Dairy Products (Laird et al., 2004) reco- for the Examination of Dairy Products (Frank &
menda fundir a amostra em banho a 40±1 ºC, por Yousef, 2004) destacam que não deve ser utiliza-
não mais de 15min. Preaquecer o diluente a 40-45 do Tampão Fosfato na preparação das amostras,
ºC e pipetar o diluente várias vezes, retornando porque pode causar injúrias às células. O diluente
ao frasco, para aquecer a pipeta. Pipetar então 11 recomendado, de maneira geral, é a Água Pepto-
ml da amostra fundida (evitar a separação das fa- nada 0,1%.
ses aquosa e gordurosa), transferir para 99 ml do Para leites e creme fermentados, em particular, o
diluente aquecido e agitar, invertendo o frasco em Capítulo 9 do Standard Methods for the Examina-
arco de 30cm, 25 vezes em sete segundos. Prepa- tion of Dairy Products (Duncan et al., 2004) reco-
rar e inocular as diluições seriadas imediatamente, menda unidade analítica de 11g e, como diluente,
com os tubos de diluente também aquecidos. 99 ml de água destilada estéril ou solução de citra-
m) Produtos lácteos congelados to de sódio (Na3C6H5O7.2H2O) 2%, preaquecidas
a 40-45 ºC. Para iogurte e outros produtos fermen-
A ISO 6887-5:2010 recomenda unidade analítica
tados ou acidificados (exceto leite e creme), reco-
de 10g em 90 ml de Água Peptonada Tamponada
menda unidade analítica de 10g e, como diluen-
(BPW) ou Água Salina Peptonada 0,1% (H2Osp)
te, 90 ml de leite em pó desnatado dissolvido em
e homogeneização em “stomacher”.
Tampão Fosfato (0,1g/100 ml).
O capítulo 9 do Standard Methods for the Exa-
mination of Dairy Products (Duncan et al., 2004)

p) Caseína e caseinatos tripolifosfato (Na3O10P3) 2% preaquecida a 37 ºC.

A ISO 6887-5:2010 recomenda unidade analítica Agitar em “shaker” por 15min, transferir para um
de 10g e 90 ml dos seguintes diluentes: banho-maria regulado a 37 ºC e manter no banho
▪ Caseinatos – solução 2% de fosfato de po- por mais 15min, agitando periodicamente para fa-
tássio (K2HPO4) com pH ajustado em 7,5±0,2 cilitar a homogeneização.
ou solução 2% citrato de sódio ou água salina r) Moluscos (bivalves e gastrópodes) e ouriços
peptonada (H2Osp). do mar
Para moluscos bivalves (ostra, mexilhão, lin-
▪ Caseína láctica ou ácida – solução solução
gueirão, berbigão, conquilha, ameijoa) e molus-
de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH
cos gastrópodes (caracol, caramujo, búzio, lapa,
ajustado em 8,4±0,2 e suplementado com anti
apa, lesma) e ouriços do mar (Echinoidae), a ISO
espumante.
6887-3 (2003) recomenda unidade analítica de
▪ Paracaseína (obtida por coagulação com reni- seis organismos inteiros e diluição inicial de 1:2,
na) – solução de fosfato de potássio (K2HPO4) adicionado uma parte da amostra para 2 partes de
2% com pH ajustado em 7,5±0,2 e suplemen- diluente. Homogeneizar em liquidificador por 30s
tado com anti espumante. Adicionar o diluente a 2min e completar a diluição até 1:10 com o mes-
à amostra, misturar bem, deixar descansar por mo diluente.
15min à temperatura ambiente e homogeneizar s) Pepinos do mar (Holothuroidea) e tunicados
em “stomacher” por 2min. Deixar descansar ou ascídias (Ascidiacea)
por mais 5min antes de preparar as diluições A ISO 6887-3 (2003) recomenda cortar os or-
subsequentes. ganismos em pequenos pedaços, preparar uma
q) Paracaseína com problemas de solubilidade diluição inicial de 1:2, adicionado uma parte da
A ISO 6887-5:2010 recomenda moer aproxima- amostra para 2 partes de diluente, homogeneizar
damente 20g da amostra, retirar uma unidade em liquidificador por 30s a 2min e completar a
analítica de 5g, transferir para um frasco com diluição até 1:10 com o mesmo diluente.
pérolas de vidro e adicionar 95 ml de solução de

3 Técnicas básicas de contagem
de microrganismos em placas
Item 3.3.2.b (revisado) Secagem das placas em estufa = 50 ºC/1,5-2h ou 25-35 ºC/18-24h.
Item 3.6.1.2 Regra 9.b e Regra 11 (complementadas) Placas descartáveis de plástico tem área total de aproxi-
madamente 56cm2.
Item 3.7 (revisado) revisão segundo a ISO 7218:2007/Amd.1:2013 e na ISO 14461-2:2005.
Anexo 3.1 (novo) Limite de concordância aceitável entre as contagens de colônias obtidas em placas de duas di-
luições subsequentes (ISO 14461-2:2005).
Anexo 3.2 (novo) Limite de concordância aceitável entre as contagens de colônias obtidas em um par de placas
de uma duplicata (ISO 14461-2:2005).
3.1. Introdução pítulo 5), a contagem do Número Mais Provável

(NMP) (Capítulo 4) e a contagem padrão em pla-
As orientações contidas nesse capítulo são da cas, descrita nesse capítulo.
American Public Health Association (APHA), A contagem padrão em placas é utilizada tanto
descritas na 5ª edição do Compendium of Methods para a quantificação de grandes grupos microbia-
for Microbiological Examination of Foods (Pe- nos, como os aeróbios mesófilos, os aeróbios psi-
tran et al., 2015) e das normas ISO 6887-1 (1999) crotróficos, os bolores e leveduras, os clostrídios
e ISO 7218:2007/Amendment 1:2013, recomen- sulfito redutores, os enterococos e as bactérias lác-
dadas para ensaios realizados com metodologia ticas, como também para gêneros e espécies em
da International Organization for Standardization. particular, como Staphylococcus aureus, Bacillus
A análise microbiológica de alimentos é predomi- cereus e Clostridium perfringens. O procedimento
nantemente cultural, objetivando a detecção ou a básico é a inoculação da amostra homogeneizada
enumeração de microrganismos vivos. Em função (e suas diluições) em um meio sólido (com ágar),
da multiplicidade de grupos, gêneros e espécies contido em placas de Petri, seguida da incubação
que podem estar presentes, um grande número das placas até crescimento visível. A versatilidade
de ensaios são utilizados, que podem ser de dois da técnica é decorrente do princípio envolvido na
tipos: ensaios qualitativos, que verificam a pre- contagem, baseado na premissa de que, quando
sença ou ausência do(s) microrganismo(s) alvo fixada em um meio de cultura sólido adequado,
em uma dada quantidade da amostra, sem quan- cada célula microbiana presente na amostra irá
tificar, e ensaios quantitativos, que determinam a formar uma colônia isolada. Variando-se o tipo de
quantidade do(s) microrganismo(s) alvo na amos- meio de cultura (meio de enriquecimento, meio
tra, geralmente por unidade de massa ou volume. seletivo, meio seletivo-diferencial) e as condições
Cada um desses ensaios segue procedimentos de incubação (temperatura e atmosfera), é possí-
diferenciados, que dependem do(s) microrganis- vel selecionar o grupo, gênero ou espécie que se
mo(s) alvo, mas a maioria deles utiliza as mesmas deseja contar. Como as células microbianas muitas
técnicas culturais básicas de microbiologia. Essas vezes ocorrem em agrupamentos (pares, tétrades,
técnicas são a detecção da presença/ausência (Ca- cachos, cadeias etc.), não é possível estabelecer

uma relação direta entre o número de colônias e 3.2.2. Procedimento

o número de células. Essa correlação é feita entre
o número de colônias e o número de “Unidades Antes de iniciar o procedimento, observar os cui-
Formadoras de Colônias” (UFC), que podem ser dados descritos no Capítulo 2, para garantir que
tanto células individuais como agrupamentos ca- as atividades sejam conduzidas sob condições as-
racterísticos de certos microrganismos. sépticas. Identificar todos os tubos e placas que
Para a homogeneização da amostra e preparo das serão inoculados, com o código da amostra, a di-
diluições, são utilizados os procedimentos descritos luição e a sigla do meio de cultura contido. Fundir
no Capítulo 2. Para a inoculação no meio de cultu- os meios de cultura em banho com água fervente,
ra, chamada de plaqueamento, podem ser utilizados mantendo a fervura apenas o tempo necessário
quatro procedimentos básicos: a) o plaqueamento para a fusão do ágar. Resfriar imediatamente em
em profundidade (pour plate), b) o plaqueamento água fria e manter à temperatura de 44 a 46 ºC
em superfície (spread plate), c) o plaqueamento em até o momento do uso (em banho ou estufa com
gotas (drop plate) ou d) a filtração em membrana. temperatura controlada).
a) Preparação das amostras e diluições seria-
das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-
3.2. Plaqueamento em pítulo 2.
profundidade (pour plate) b) Inoculação. Geralmente a inoculação é fei-
ta para vários ensaios simultaneamente. Para
O procedimento padrão de plaqueamento em pro-
cada ensaio que estiver sendo conduzido, se-
fundidade, descrito abaixo, tem limite de detecção
lecionar três diluições adequadas da amostra
de 10 UFC/g para produtos sólidos ou 1 UFC/ ml
(vide notas abaixo) e inocular 1 ml de cada
para produtos líquidos. Esse procedimento pode
diluição em placas de Petri separadas, estéreis
ser adaptado, se necessário, para limite de detec-
e vazias, abrindo as placas apenas o suficiente
ção de 1 UFC/g para produtos sólidos. Suas prin-
para inserir a pipeta. Trabalhar em uma capela
cipais aplicações são os ensaios de contagem total
de fluxo laminar ou próximo à chama de um
de aeróbios mesófilos, contagem de clostrídios
bico de Bunsen. Depositar o inóculo fora do
sulfito redutores, contagem de enterobactérias,
centro da placa, pois isto facilitará a posterior
contagem de enterococos e contagem de bactérias
mistura com o meio de cultura. Posicionar a
lácticas. Apresenta algumas limitações, a princi-
pipeta em ângulo de aproximadamente 45º e
pal delas sendo a necessidade de fusão do meio
tocando o fundo da placa. Utilizar uma pipeta
de cultura antes do uso. Alguns meios, suplemen-
diferente para cada diluição, com capacidade
tados com componentes sensíveis ao calor depois
de, no máximo, 10 ml. A incerteza da medição
da esterilização, não podem ser reaquecidos para
dos volumes não deve exceder 5% (ISO 6887-
fusão do ágar antes do uso.
1, 1999). Observar criteriosamente se a placa
3.2.1. Material requerido nas utilizada corresponde à amostra e à diluição
que estão sendo inoculadas. Mudar as placas de
análises
posição, à medida que sejam inoculadas, para
□ Material para preparação da amostra e dilui- não inocular a mesma placa mais de uma vez
ções seriadas, descritos no Capítulo 2 ou deixar alguma placa sem inocular.
□ Meio de cultura recomendado para o ensaio a
ser realizado, descrito nos capítulos específicos Nota b.1) Selecionar as diluições em função do nível de
□ Placas de Petri de 20 x 100mm estéreis vazias contaminação estimado da amostra, de forma a obter
placas com 25 a 250 colônias (10 a 300 no caso dos
□ Estufa incubadora regulada na temperatura es- métodos da ISO). Se o nível de inóculo esperado es-
pecificada pelo ensaio a ser realizado, descrito tiver na faixa de 2.500 a 25.000 UFC/g ou ml, por
nos capítulos específicos exemplo, as diluições recomendadas são a 10-1, 10-2

Técnicas básicas de contagem de microrganismos em placas □ 31
e 10-3, que correspondem a 0,1 - 0,01 e 0,001g ou balho, utilizar preferencialmente placas altas
ml da amostra. Se a contaminação esperada estiver (20x100mm). As placas podem ser empilhadas
acima dessa faixa, deve-se inocular diluições mais
altas. Se estiver abaixo, no caso de produtos líquidos
durante a adição do meio e a homogeneização
é possível inocular 1 ml da amostra sem diluição e 1 com o inóculo, mas, em seguida, devem ser
ml das duas diluições subsequentes. No caso de pro- distribuídas numa bancada fria, para acelerar o
dutos sólidos não é possível inocular a amostra sem resfriamento e a solidificação do meio.
diluição, mas pode-se inocular até 2 ml da diluição
inicial em uma mesma placa, ou um volume maior, Nota c.1) Quando vários ensaios estiverem sendo condu-
distribuído em várias placas (2 ml/placa). Caso não zidos simultaneamente, as atividades e o trabalho em
seja possível estimar previamente o nível de conta- equipe devem ser programados de forma a obedecer
minação da amostra, recomenda-se inocular mais do as seguintes condições, estabelecidas pelo Compen-
que três diluições, partindo-se da diluição inicial. dium (Petran et al., 2015): o tempo decorrido entre o
depósito do inóculo em uma placa e a adição do meio
Nota b.2) Na análise de alguns alimentos, a diluição ini-
de cultura não deve ultrapassar 10 minutos, para evi-
cial recomendada é maior do que 1:10 (vide Capítulo
tar o ressecamento e aderência do inóculo às placas.
2). Se as contagens esperadas nesses produtos são
A mistura do meio de cultura com o inóculo deve ser
baixas, deve-se aumentar o volume inoculado da di-
feita imediatamente após a adição do meio, para não
luição inicial, da mesma forma descrita na Nota b.1.
haver risco de solidificação do ágar. Além disso, na
Utilizando essa técnica, deve-se manter, se possível,
recomendação do Compendium a duração do proce-
a inoculação de 0,1g de produtos sólidos ou 1 ml de
dimento completo, desde a preparação da primeira
produtos líquidos.
diluição até que todos os meios de cultura estejam
Nota b.3) Para aumentar a precisão das contagens reco- inoculados, não deve exceder 20 minutos. Na reco-
menda-se não utilizar pipetas com capacidade maior mendação da ISO 6887-1 (1999), a duração do pro-
do que 2 ml para liberar os volumes de 1 ml. Pode-se cedimento completo não deve exceder 45 minutos.
também inocular duas placas por diluição (duplicata).
Nota c.2) Alguns alimentos contendo partículas (fari-
Nota b.4) A ISO 7218:2007/Amd.1:2013 não exige a nhas, por exemplo) podem dificultar a visualização
inoculação de três diluições da amostra, nem duas das colônias na primeira diluição, confundidas com
placas por diluição. Estabelece duas diluições suces- as partículas. Para evitar esse problema, pode-se
sivas, sem duplicata, ou duplicata se for usada apenas adicionar TTC (2,3,5 cloreto de trifeniltetrazólio) ao
uma diluição. Entretanto, a forma de cálculo dos re- meio de cultura, pois a maioria das bactérias forma
sultados é um pouco diferente (vide item 3.7). colônias vermelhas na presença do TTC. Para cada
100 ml de meio, adicionar 1 ml da solução aquosa
c) Adição do meio de cultura. Para cada ensaio
0,5% de TTC, previamente esterilizada por filtração.
que estiver sendo conduzido, retirar o meio de
cultura do banho ou estufa a 44-46 ºC e, se o d) Incubação. Aguardar a completa solidificação
frasco estiver molhado, secar com papel toa- do meio de cultura, inverter as placas (exceto
lha, para evitar respingos nas placas, no mo- quando houver recomendação em contrário nos
mento do plaqueamento. Evitar agitação e mo- capítulos específicos) e incubar nas condições
vimentos bruscos do frasco, para não formar de temperatura, tempo e atmosfera especifica-
bolhas. Verter 12 a 15 ml do meio nas placas das para cada ensaio. O meio de cultura deve
inoculadas, observando criteriosamente se a atingir a temperatura de incubação no intervalo
identificação das placas corresponde ao meio máximo de duas horas. Evitar o empilhamento
de cultura utilizado. Misturar o meio com o excessivo das placas e não encher demasiada-
inóculo, movimentando suavemente as plamente as estufas incubadoras, para garantir a
cas, numa superfície plana, em movimentos na distribuição homogênea da temperatura. Num
forma de oito ou em movimentos circulares, intervalo de 48h de incubação, as placas não
oito a dez vezes no sentido horário e oito a dez podem perder mais do que 15% do seu peso por
vezes no sentido anti-horário. A movimenta- ressecamento. Umidade excessiva também é
ção das placas deve ser feita cuidadosamente, indesejável, porque aumenta o risco de espalha-
para evitar respingos de meio nas bordas ou mento. Dependendo da temperatura, o controle
nas tampas. Para facilitar esta etapa do trada umidade nas estufas pode ser necessário.

e) Contagem das colônias e cálculo dos resulta- 3.3.2. Procedimento

dos. Seguir as orientações do item 3.6.1.
Assim como recomendado no plaqueamento em
profundidade, observar os cuidados descritos no
3.3. Plaqueamento em Capítulo 2, antes de iniciar o procedimento, para
superfície (spread plate) garantir que as atividades sejam conduzidas sob
condições assépticas. Identificar todos os tubos
A principal diferença do plaqueamento em super- e placas que serão inoculados, com o código da
fície, em relação ao plaqueamento em profundi- amostra, a diluição e a sigla do meio de cultura
dade, é que a amostra e/ou suas diluições são ino- contido.
culadas diretamente na superfície do meio sólido, a) Preparação das amostras e diluições seria-
já distribuído em placas. A inoculação superficial das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-
é considerada vantajosa sob alguns aspectos, pois pítulo 2.
não expõe os microrganismos ao calor do meio b) Inoculação. Preparar previamente as placas e
fundido, permite a visualização de características secar em capela de fluxo laminar (30-60min,
morfológicas e diferenciais de colônias, facilita com as tampas parcialmente abertas) ou em
a transferência de colônias, permite a utilização estufa (50 ºC/1,5-2h ou 25-35 ºC/18-24h). Ge-
de meios que não podem ser fundidos depois de ralmente a inoculação é feita para vários en-
prontos e não exige que os meios sejam trans- saios simultaneamente. Para cada ensaio que
lúcidos. Sua principal desvantagem é que o vo- estiver sendo conduzido, selecionar três dilui-
lume inoculado é limitado à capacidade de ab- ções adequadas da amostra para a inoculação
sorção de líquido pelo meio de cultura, que não (vide nota b.1 abaixo). Com uma pipeta de no
permite a inoculação de mais do que 0,5 ml por máximo 1 ml (divisões de 0,1 em 0,1 ml), ino-
placa. O procedimento padrão é a inoculação de cular 0,1 ml de cada diluição na superfície das
0,1 ml/placa de cada diluição, com limite de de- placas previamente preparadas. Observar cri-
tecção de 100 UFC/g para produtos sólidos ou 10 teriosamente se a placa utilizada corresponde à
UFC/ ml para produtos líquidos. Esse procedi- amostra e à diluição que estão sendo inocula-
mento pode ser adaptado, se necessário, para limi- das e se contém o meio de cultura correto. Mu-
te de detecção de 10 UFC/g para produtos sólidos dar as placas de posição, à medida que sejam
ou 1 UFC/ ml para produtos líquidos. Suas prin- inoculadas, para não inocular a mesma placa
cipais aplicações são os ensaios de contagem total mais de uma vez ou deixar alguma sem inocu-
de aeróbios psicrotróficos, contagem de bolores e lar. Trabalhar em uma capela de fluxo laminar
leveduras, contagem de S. aureus e contagem de ou próximo à chama de um bico de Bunsen.
B. cereus. O mais rápido possível, espalhar o inóculo
por toda a superfície do meio, com uma alça
3.3.1. Material requerido nas de Drigalski, até que o excesso de líquido seja
análises absorvido. Usar uma alça para cada placa ou
fazer o espalhamento da placa de maior para a
□ Material para preparação da amostra e dilui-
placa de menor diluição, flambando a alça com
ções seriadas, descritos no Capítulo 2
etanol 70%, entre uma placa e outra. Resfriar
□ Placas de Petri contendo o meio recomendado
a alça na parte interna da tampa da placa antes
para o ensaio, descrito nos capítulos específicos
de colocá-la em contato com o inóculo.
□ Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mer-
Nota b.1) Assim como no plaqueamento em profundi-
gulhada em etanol 70%
dade, selecionar as diluições em função do nível de
□ Estufa incubadora regulada na temperatura es- contaminação estimado da amostra, de forma a obter
pecificada pelo ensaio a ser realizado, descrito placas com 25 a 250 colônias (10 a 300 no caso dos
nos capítulos específicos métodos da ISO). Considerar, entretanto, que o volu-

me inoculado é dez vezes menor. Para amostras com é que o inóculo não é espalhado, mas sim, depo-
nível baixo de contaminação pode-se inocular um sitado no meio de cultura, em gotas de 0,01 ml.
volume maior da primeira diluição, distribuindo esse
volume por várias placas. A distribuição mais comu-
Como as gotas ocupam um espaço mínimo, é pos-
mente utilizada é três placas com 0,3 ml e uma placa sível inocular, numa mesma placa, três diluições
com 0,1 ml. No espalhamento das placas com 0,3 em triplicata, três gotas por diluição. Isso torna a
ml, o tempo requerido para a absorção do líquido é técnica extremamente econômica, com limite de
maior, exigindo cuidados para que não permaneçam
detecção de 1.000 UFC/g de produtos sólidos ou
filmes de umidade na superfície, com a consequente
formação de zonas de espalhamento. 100 UFC/ ml de produtos líquido. Não é uma técni-
Nota b.2) Na análise de alguns alimentos, a diluição ini- ca rotineiramente utilizada na análise de alimentos,
cial recomendada é maior do que 1:10 (vide Capítulo mas pode ser muito útil em situações que exijam a
2). Se as contagens esperadas nesses produtos são inoculação de um número grande de diluições.
baixas, deve-se aumentar o volume inoculado da di-
luição inicial, da mesma forma descrita na Nota b.1.
3.4.1. Material requerido nas
Utilizando essa técnica, deve-se manter, se possível,
a inoculação de 0,01g de produtos sólidos ou 0,1 ml análises
de produtos líquidos.
Nota b.3) Quando vários ensaios estiverem sendo condu-
zidos simultaneamente, as atividades e o trabalho em
equipe devem ser programados de forma a obedecer □ Pipetas graduadas de 0,1 ml estéreis ou pipeta-
as seguintes condições, estabelecidas pelo Compen- dores de ponteiras descartáveis, para liberação
dium (Petran et al., 2015): a duração do procedimen- das gotas
to completo, desde a preparação da primeira diluição □ Placas de Petri contendo o meio recomendado
até que todos os meios de cultura estejam inoculados,
não deve exceder 20 minutos e o espalhamento do
inóculo na superfície do meio deve ser iniciado ime- □ Estufa incubadora regulada na temperatura es-
diatamente após a inoculação das três diluições da pecificada pelo ensaio a ser realizado, descrito
amostra. Na recomendação da ISO 6887-1 (1999), a nos capítulos específicos
duração do procedimento completo não deve exceder
45 minutos.
3.4.2. Procedimento
Nota b.4) Para aumentar a precisão das contagens reco-
menda-se não utilizar pipetas com capacidade maior Assim como recomendado no plaqueamento em
do que 1 ml para liberar os volumes de 0,1 ml. profundidade, observar os cuidados descritos no
Nota b.5) A ISO 7218:2007/Amd.1:2013 não exige a Capítulo 2, antes de iniciar o procedimento, para ga-
inoculação de três diluições da amostra, estabelece
rantir que as atividades sejam conduzidas sob con-
duas diluições sucessivas, sem duplicata, ou dupli-
cata se for usada apenas uma diluição. Entretanto, a dições assépticas. Identificar todos os tubos e placas
forma de cálculo dos resultados é um pouco diferente que serão inoculados, com o código da amostra, a
(vide item 3.7) diluição e a sigla do meio de cultura contido. Prepa-
c) Incubação. Seguir as mesmas orientações des- rar previamente as placas com os meios de cultura e
critas para o plaqueamento em profundidade. secar em estufa por 24 horas a 25-30 ºC.
d) Contagem das colônias e cálculo dos resulta- a) Preparação das amostras e diluições seria-
dos. Seguir as orientações do item 3.6.2. das. Seguir os procedimentos descritos no Capí-
tulo 2, porém, preparar o diluente suplementado
com 0,1% de ágar, para facilitar a posterior fixa-
3.4. Plaqueamento em gotas ção das gotas na superfície do meio de cultura.
(drop plate) b) Inoculação. Dividir a placa em 9 setores, mar-
cando o fundo com caneta vidrográfica (três
O plaqueamento em gotas é uma técnica de inocu- linhas horizontais e três linhas verticais). Para
lação em superfície, com as mesmas vantagens do cada ensaio que estiver sendo conduzido, se-
plaqueamento em superfície. A principal diferença lecionar três diluições adequadas da amostra

para a inoculação (vide nota b.1 abaixo). Antes membrana os microrganismos presentes na quan-
de coletar o volume de cada diluição, para a tidade inoculada. O limite de detecção é de 1 UFC
inoculação nas placas, não esquecer de agitar por volume inoculado, sendo indicado para amos-
vigorosamente os tubos de diluição, invertendo tras com contagens abaixo do limite de detecção
25 vezes em arco de 30cm, ou com o auxílio de dos outros procedimentos. Suas principais aplica-
um agitador tipo “vortex”. Utilizando pipetas ções são os ensaios de contagem total de aeróbios
graduadas de 0,1 ml (divisões de 0,01 em 0,01 mesófilos, contagem de bolores e leveduras, conta-
ml) ou pipetadores de ponteiras descartáveis, gem de bactérias lácticas, contagem de enterococos
depositar três gotas de 0,01 ml de cada dilui- e contagem de coliformes totais/fecais/E. coli em
ção em três quadrados adjacentes da placa (tri- água, refrigerantes, outros produtos líquidos e pro-
plicata). Esse procedimento deve ser feito com dutos sólidos que possam ser transformados numa
cuidado, para que as gotas não escorram para solução límpida, como sal e açúcar, por exemplo.
fora dos respectivos quadrados. Não espalhar
as gotas. Mantendo as placas numa superfície 3.5.1. Material requerido nas
plana, aguardar que o líquido seja absorvido análises
pelo meio de cultura, o que requer aproxima-
damente 30 minutos.
Nota b.1) Selecionar as diluições em função do nível de
contaminação estimado da amostra, de forma a obter
□ Proveta de 100 ou 200 ml estéril, para medição
gotas com 30 colônias, no máximo. Considerar, ende volumes de amostra
tretanto, que o plaqueamento em gotas não se aplica a □ Conjunto de filtração previamente esterilizado
amostras com nível de contaminação abaixo de 1.000 □ Bomba de vácuo
UFC/g ou 100 UFC/ ml. A primeira razão desta limi-
□ Membranas de 47mm de diâmetro, porosidade
tação é o pequeno volume inoculado e a segunda é a
capacidade da pipeta, que não permite a transferência de 0,45mm, brancas e quadriculadas
de líquidos viscosos ou com sólidos em suspensão, □ Pinças para transferência das membranas,
comum nas duas primeiras diluições de alimentos mergulhadas em etanol
sólidos. Pode, entretanto, ser utilizado para amostras □ Placas de Petri contendo o meio recomendado
com nível mais baixo de contaminação, se a finalida-
de do ensaio não for quantificar, mas sim, comprovar
que a contagem encontra-se abaixo desse limite. □ Placas estéreis vazias e almofadas estéreis
(“pads”) opcionais para uso dos meios na for-
c) Incubação. Aguardar a completa absorção do ma de caldo
líquido das gotas pelo meio de cultura e incu- □ Estufa incubadora regulada na temperatura es-
bar nas mesmas condições recomendadas para pecificada pelo ensaio a ser realizado, descrito
o plaqueamento em profundidade. nos capítulos específicos
d) Contagem das colônias e cálculo dos resulta-
dos. Seguir as orientações do item 3.6.3. 3.5.2. Procedimento
Assim como recomendado no plaqueamento em
profundidade, observar os cuidados descritos no
3.5. Filtração em membrana Capítulo 2, antes de iniciar o procedimento, para ga-
rantir que as atividades sejam conduzidas sob con-
O procedimento de filtração em membrana é limi- dições assépticas. Identificar todos os tubos e placas
tado à analise de amostras líquidas límpidas, sem que serão inoculados, com o código da amostra, a
sólidos em suspensão, que possam ser filtradas diluição e a sigla do meio de cultura contido.
através de uma membrana de poro 0,45μm. Sua a) Preparação do conjunto de filtração. O con-
principal vantagem é que permite a inoculação junto de filtração é composto de um porta fil-
de maiores volumes da amostra, concentrando na tro, um kitasato e um copo de filtração. O por-

ta filtro é um tipo de funil cuja parte superior de 5 ml do meio de cultura. Também é comum
é plana, para acomodar o filtro membrana e, a prática de se utilizar o meio na forma de cal-
sobre essa, o copo de filtração, preso por uma do, situação em que não é necessária a prepa-
presilha. A parte inferior do porta filtro é aco- ração prévia das placas. No momento da aná-
plada ao kitasato que, conectado à uma bomba lise, deve-se colocar uma almofada absorvente
de vácuo, recolhe o líquido filtrado. Antes do (“pad”) estéril no interior das placas também
início das análises o porta filtro deve ser aco- estéreis e embeber a almofada com porções de
plado ao kitasato, embrulhado em papel kraft e 2 ml do mesmo meio, na forma líquida.
esterilizado em autoclave (121 ºC/30min). Os c) Homogeneização da amostra e retirada da
copos de filtração devem ser embrulhados se- unidade analítica. Homogeneizar a amostra
paradamente em papel kraft e também esterili- seguindo os procedimentos descritos no Capí-
zados em autoclave (121 ºC/30min). Alterna- tulo 2. Medir 100 ml numa proveta estéril e
tivamente podem ser utilizados copos descar- verter cuidadosamente no copo do conjunto
táveis estéreis, muito úteis quando o número de filtração, evitando respingos. Se o copo do
de amostras para filtrar é alto. No momento do conjunto de filtração for graduado e a escala
uso as duas partes devem ser desembrulha- contiver a marcação de volume requerida, o
das em uma câmara de fluxo laminar ou, na volume da amostra pode ser medido direta-
indisponibilidade desta, próximo à chama de mente, sem a utilização da proveta.
um bico de Bunsen. O conjunto é preparado d) Diluição seriada da amostra. Como o méto-
ajustando-se a membrana estéril no porta filtro do de filtração é uma técnica de concentração
(com a face quadriculada para cima) e o copo dos microrganismos em amostras com baixas
de filtração sobre a membrana. Conecta-se en- contagens, geralmente não são feitas diluições
tão o kitasato à bomba de vácuo, para proceder seriadas da amostra. O procedimento usual é
à filtração. Podem também ser utilizados “ma- a filtração de 100 ml, que podem ser fraciona-
nifolds”, que têm vários porta filtros e permi- dos em duas porções de 50 ml, 4 porções de
tem filtrar várias amostras simultaneamente. 25 ml ou 3 porções de 70, 25 e 5 ml, respec-
Nota a1) Entre uma amostra e outra, antes de posicionar tivamente. A seleção do volume a ser filtrado,
uma nova membrana, o porta filtro deve ser flambado entretanto, depende da contaminação estimada
com álcool e o copo de filtração deve ser substituído.
na amostra, de forma a resultar em placas com
A cada 10 amostras recomenda-se filtrar no conjunto
100 ml de um dos diluentes recomendados no Capí- contagens na faixa de 20 a 200 colônias. Se
tulo 2, estéril, incubando essa membrana para verifi- for necessário o preparo de diluições, utilizar
car possível contaminação cruzada entre as amostras. o mesmo procedimento descrito no Capítulo 2.
Após a filtração de 30 amostras o conjunto deve ser e) Filtração. Ligar a bomba de vácuo e proceder
novamente esterilizado em autoclave, reiniciando
uma nova série de filtrações. Se o intervalo entre uma
à filtração. Após a passagem da amostra, ain-
filtração e outra for maior do que 30min e o conjunto da com a bomba ligada, enxaguar as paredes
estiver sendo utilizado fora da capela de fluxo lami- do copo com 20 a 30 ml de um dos diluentes
nar, então recomenda-se autoclavar todo o conjunto recomendados no Capítulo 2, para recolher
novamente, mesmo que não tenha sido atingido o li-
eventuais contaminantes aderidos. Repetir
mite de 30 amostras.
esse procedimento mais uma vez. Desligar a
b) Preparação das placas. Na contagem pelo mé- bomba de vácuo antes que a membrana seque
todo de filtração em membrana, as placas mais excessivamente. Quando o volume a ser filtra-
comumente utilizadas são as de 50mm de diâ- do for menor do que 20 ml, adicionar ao copo
metro e 9mm de altura. Se for utilizado meio do conjunto de filtração cerca de 20-30 ml de
sólido, devem ser preparadas previamente, da diluente, antes da adição da amostra. Não é ne-
mesma forma recomendada para o plaquea- cessária uma medida exata do volume de di-
mento em superfície, distribuindo-se porções luente, cuja função é aumentar o volume a ser

filtrado, facilitando uma melhor distribuição Esse é o caso da contagem de bactérias lácticas,
dos microrganismos na membrana. clostrídios sulfito redutores, C. perfringens, S. au-
f) Transferência e incubação da membrana. reus e B. cereus, que também seguem as orienta-
Retirar o copo e, com uma pinça flambada e ções dos capítulos específicos.
resfriada, transferir a membrana para a placa
com o meio de cultura, com a face quadricula- 3.6.1. Plaqueamento em
da para cima. Ao colocar a membrana no meio profundidade
de cultura é importante que toda a superfície
Para a contagem, selecionar as placas sem espalha-
fique completamente aderida ao meio, para
mento, com número de colônias entre 25 e 250 (10
que haja contato dos microrganismos com os
a 150 no caso da contagem de bolores e leveduras).
nutrientes. Se houver formação de bolhas, de-
Contar as colônias com o auxílio da lupa de um
ve-se levantar a borda da membrana mais pró-
contador de colônias, para facilitar a visualização.
xima da(s) bolha(s) e recolocá-la de forma a
Utilizar um contador de colônias que tenha o fundo
eliminar a(s) bolha(s). Incubar as placas nas
quadriculado em cm2, como guia para a contagem.
condições recomendadas pelo ensaio (descrita
Se não houver placas nessas condições ideais, seguir
nos capítulos específicos), invertidas e, pre-
as orientações das regras 5 a 12, para a contagem.
ferencialmente, acondicionadas em sacos ou
Para calcular os resultados, há duas situações
bandejas com papel toalha ou papel de filtro
a considerar. A primeira é situação padrão, em
úmido, para evitar desidratação.
que unidade analítica é uma massa ou volume da
g) Contagem das colônias e cálculo dos resulta-
amostra, homogeneizada com o diluente. A se-
dos. Seguir as orientações do item 3.6.4.
gunda é a situação em que as amostras foram pre-
paradas pelas técnicas do esfregaço de superfície
3.6. Contagem das colônias ou da lavagem superficial.
e cálculo dos resultados Em todas as situações, usar notação exponencial
na apresentação dos resultados, com apenas uma
segundo a APHA casa decimal depois da vírgula e aproximando
para cima quando a segunda casa decimal for
As instruções apresentadas nesse item são para
igual a cinco ou maior. A aproximação deve ser
ensaios realizados com métodos da American Pu-
feita no número final obtido, depois de efetuados
blic Health Association (APHA) e estão descri-
todos os cálculos.
tas na 5ª edição do Compendium of Methods for
Microbiological Examination of Foods (Petran et
3.6.1.1. Cálculo dos resultados na
al., 2015). Aplicam-se aos ensaios em que todas
situação padrão
as colônias desenvolvidas nas placas, após o pe-
ríodo de incubação, são contadas e consideradas A situação padrão é aquela em que unidade ana-
no cálculo. No caso de ensaios que utilizam meios lítica é uma massa ou volume da amostra, homo-
diferenciais, para distinguir o(s) microrganis- geneizada com o diluente. A regra geral para o
mo(s) alvo da microbiota acompanhante (outros cálculo dos resultados é: UFC/g ou ml = c/d.v,
microrganismos que podem crescer nas mesmas sendo c o número de colônias na placa contada, d
condições), apenas as colônias típicas são conta- a diluição da placa contada e v o volume inocula-
das e consideradas no cálculo. Esse é o caso da do dessa diluição. Regras mais detalhadas para o
contagem de enterococos e enterobactérias, que cálculo dos resultados seguem abaixo.
seguem as orientações dos capítulos específicos. Nota. A regra geral para o cálculo dos resultados nos mé-
todos ISO é diferente (vide item 3.7).
Da mesma forma, no caso dos ensaios que exigem
a confirmação das colônias, apenas a porcentagem Regra 1 – Se a contagem foi feita numa pla-
de colônias confirmadas é considerada no cálculo. ca inoculada com a amostra sem diluição, sem

duplicata, o número de unidades formadoras de luição inoculada. O inverso da diluição 10-1 é 101, o
colônias (UFC) é igual ao número de colônias inverso da 10-2 é 102 e assim por diante (Exemplos 5
(Exemplos 1 e 2). Se foi feita duplicata, o núme- e 6). Se foi feita duplicata, considerar como número
ro de UFC é igual à média aritmética da conta- de colônias a média aritmética da contagem obtida
gem obtida em cada uma das placas da duplicata em cada uma das placas da duplicata e multiplicar
(Exemplos 3 e 4). pelo inverso da diluição (Exemplos 7 e 8).
Regra 2 – Se a contagem foi feita numa placa Regra 3 – Se o volume inoculado da primeira
inoculada com a diluição 10-1 ou maior, sem du- diluição (ou da amostra sem diluição) foi di-
plicata, calcular o número de UFC/g ou ml multi- ferente de 1 ml e a contagem foi feita na placa
plicando o número de colônias pelo inverso da di- inoculada com esse volume, valem as regras ante-
No colônias na(s) placa(s) da diluição

Exemplo 1 Contagem UFC/ ml
sem diluição (100) 10-1 10-2
Sem duplicata
1 199* 8 0 199 = 2,0 x 102
2 245* 22 2 245 = 2,5 x 102
Com duplicata
3 62* - 57* 6-5 0-0 (62 + 57)/2 = 59,5 = 6,0 x 101
4 123*- 136* 12 - 10 0-0 (123 + 136)/2 = 129,5 = 1,3 x 102
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado.

Exemplo 2 Contagem UFC/g ou ml
10-1 10-2 10-3
Sem duplicata
5 199* 18 2 199 x 101 = 2,0 x 103
6 Inc 245* 22 245 x 102 = 2,5 x 104
Com duplicata
7 Inc - Inc 62* - 57* 6-5 [(62 + 57)/2] x 102 = 59,5 x 102 = 6,0 x 103
8 Inc - Inc Inc - Inc 239*- 242* [(239 + 242/2] x 103 = 240,5x 103 = 2,4 x 105
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Inc = Incontável

Exemplo 3 (volume inoculado) Contagem UFC/g ou ml
10-1 (2 ml) 10-2 (1 ml) 10-3 (1 ml)
Sem duplicata
9 199* 18 2 (199/2) x 101 = 1,0 x 103
10 123* 2 0 (123/2) x 101 = 6,2 x 102
Com duplicata
11 62* - 57* 6-5 0-0 [(62 + 57)/2)]/2 x 101 = 29,75 x 101 = 3,0 x 102
12 27* - 35* 3-3 0-0 [(27 + 35)/2)]/2 x 101 = 15,5 x 101 = 1,6 x 102
Exemplo Unidade Volume No colônias na(s) placa(s) da diluição

Diluição inicial UFC/g ou ml amostra
4 analítica diluente Inicial 1o decimal 2o decimal
Sem duplicata
13 10g 490 ml 10/500 = 1/50 199* 18 2 199 x 50 = 1,0x104
14 25g 350 ml 25/375 = 1/15 280 30* 2 30x15x101 = 4,5x103
15 25g 975 ml 25/1.000 = 1/40 Inc Inc 133* 133x40x102 = 5,3x105
Com duplicata
16 25g 475 ml 25/500 = 1/20 237*-229* 21 - 20 2-1 [(237+229)/2] x 20 = 4,7x103
17 10g 490 ml 10/500 = 1/50 Inc - Inc 62* - 57* 6-5 [(62+57)/2] x 50x101 = 3,0x104
18 10g 290 ml 10/300 = 1/30 Inc - Inc Inc - Inc 239*- 242* [(239+242)/2] x 30x102 = 7,2x105
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Inc = Incontável

riores mas o número de colônias deve ser dividido 6.a. Se um dos resultados for maior do que o dobro do
pelo volume inoculado, para calcular o resultado outro, considerar apenas o menor (Exemplos 19 e 31
do Quadro 3.1)
(Exemplos 9, 10, 11 e 12).
6.b. Se um dos resultados não ultrapassar o dobro do ou-
Regra 4 – Se a diluição inicial não foi decimal tro, então considerar ambos os resultados, apresen-
(1:20, 1:50, 1:200 etc.), valem as regras 2 e 3 mas tando a média como resultado final (Exemplos 20 e
é necessário inserir nos cálculos a diluição inicial 32 do Quadro 3.1).
aplicada. Considerando uma unidade analítica de Regra 7 – Nenhuma placa atingiu 25 colônias.
m gramas ou mililitros, diluída em v mililitros de Contar as colônias nas placas com número mais
diluente, a diluição inicial é igual a m/(m+v), ou próximo de 25, calcular o número de UFC (Exem-
seja, unidade analítica dividida pelo volume total plos 21 e 33 do Quadro 3.1) e apresentar o resulta-
(diluente + unidade analítica). As diluições deci- do como contagem estimada (est).
mais subsequentes são a inicial multiplicada por
10-1 (1º decimal), a inicial multiplicada por 10-2 Regra 8 – Nenhuma placa com crescimento.
(2º decimal) e assim por diante. Por exemplo, para Considerar o número de colônias na 1ª diluição
uma unidade analítica de 50g preparada com 950 inoculada como sendo 1 e calcular o resultado de
ml de diluente, a diluição inicial é de 50/(50+950) acordo com as regras 1, 2, 3 ou 4 (Exemplos 22 e
= 50/1.000 = 1/20 (1:20). A 1º decimal é 10-1/20, 34 do Quadro 3.1). Relatar o resultado final como
a 2º decimal é 10-2/20 e assim por diante. O cálcu- menor do que o valor obtido no cálculo, valor es-
lo dos resultados ainda é feito multiplicando-se o timado. Se nenhuma placa houvesse apresentado
número de colônias pelo inverso da diluição mas, crescimento nos exemplos 1 a 4 da Regra 1, o re-
nesse caso, o inverso da diluição é a fração inver- sultado final seria <1/ ml (est). Nos exemplos 5 a 8
tida: inverso da diluição 1/20 = 20/1, inverso da da regra 2 seria <10/g ou ml (est). Nos exemplos 9
10-1/20 = 20x101, inverso da 10-2/20 = 20x102 e a 12 da regra 3 seria <5/g ou ml (est). Nos exem-
assim por diante (Exemplos 13, 14, 15, 16, 17 e plos 13 a 18 da regra 4 seria: <50, <15, <40, <20,
18). <50 e <30 UFC/g ou ml, respectivamente.
3.6.1.2. Regras para o cálculo em Regra 9 – Todas as placas com mais de 250 co-
situações não usuais lônias. Nestes casos há quatro alternativas para
Os exemplos acima são de cálculos em condições estimar o número de UFC/g ou ml. Em todos os
ideais, com número de colônias na faixa de 25 a casos, o resultado deve ser apresentado como con-
250, em placas da mesma diluição, sem espalha- tagem estimada (est).
mento. Mas são bastante frequentes as situações em 9.a. Se for possível contar todas as colônias da
que as placas não se apresentam em condições tão placa, contar e calcular o número de UFC a
ideais, sendo aplicadas algumas regras básicas para partir da contagem obtida (Exemplos 23 e 35
o cálculo dos resultados. Essas regras são apresen- do Quadro 3.1).
tadas a seguir, com exemplos no Quadro 3.1. 9.b. Se não for possível contar todas as colônias
da placa, mas o número de colônias/cm2 es-
Regra 5 – Uma placa da duplicata com conta-
tiver abaixo de 10, contar as colônias em 12
gem acima ou abaixo da faixa de 25-250 colô-
quadrados de 1cm2, 6 quadrados consecutivos
nias. Se a outra placa apresenta contagem na faixa
na horizontal e 6 quadrados consecutivos na
de 25 a 250, considerar o número de colônias de
vertical, utilizando os quadrados demarcados
ambas as placas no cálculo do resultado (Exemplo
no contador de colônias como guia. Calcular
30 do Quadro 3.1)
o número médio de colônias/cm2 e, a partir da
Regra 6 – Duas diluições consecutivas com 25- média, determinar o número total de colônias
250 colônias. Calcular o número de UFC de cada na placa, multiplicando a média pela área total
diluição e comparar os resultados. da placa. Lembrar que a área total da placa é

igual a πd2/4, onde d é o diâmetro interno. Por rio” e repetir o ensaio. Se o laboratório observar
exemplo, placas de vidro de 100mm tem diâ- ocorrência de espalhamento do segundo tipo, com
metro interno por volta de 9cm e área total de tamanho superior a 25%, em mais de 5% das pla-
aproximadamente 65cm2. Placas descartáveis cas preparadas num período de trabalho, devem
de plástico tem área total de aproximadamente ser tomadas medidas preventivas para minimizar
56cm2. Utilizar este número total de colônias esse problema. Para contar placas com zonas de
para calcular o número de UFC (Exemplo 24 espalhamento do primeiro tipo, cada zona deve
do Quadro 3.1). ser contada como uma única UFC, não contando
9.c. Se o número de colônias/cm2 for maior do que as colônias individualmente dentro dessas zonas.
10, contar as colônias em quatro quadrados re- Para contar placas com zonas de espalhamento
presentativos da distribuição das colônias nas do segundo tipo, selecionar uma região da placa,
placas e calcular o número de UFC da mes- livre de espalhamento e contar as colônias em di-
ma forma utilizada no caso de 12 quadrados versos quadrados de 1cm2. Calcular a média de
(Exemplo 25 do Quadro 3.1). colônias/cm2, multiplicar pela área total da placa
(65cm2 no caso de placas de vidro com diâmetro
9.d. Se o número de colônias/cm2 for maior do
externo de 100mm ou 56cm2 no caso de placas
que 100, apresentar o resultado como maior do
descartáveis de plástico) e utilizar este valor esti-
que área total da placa x inverso da diluição
mado para calcular o número de UFC. Apresentar
(Exemplo 26 do Quadro 3.1).
o resultado como contagem estimada (est) (Exem-
Regra 10 – Número de colônias acima de 250 plos 28 e 37 do Quadro 3.1).
numa diluição e abaixo de 25 na seguinte. Se
Regra 12 – Placas em que o crescimento é pro-
numa diluição o número de colônias ficou acima
porcionalmente maior nas maiores diluições.
de 250 e na seguinte ficou abaixo, selecionar as
Esta situação pode ser decorrente da contamina-
placas com contagem mais próxima de 250 e cal-
ção acidental da amostra durante o plaqueamento,
cular o número de UFC a partir da contagem obti-
de erro na identificação da diluição nas placas ou
da (Exemplos 27 e 36 do Quadro 3.1).
da presença de substâncias inibidoras na amostra.
Regra 11 – Placas com espalhamento. Há dois Considerar o resultado como “acidente de labora-
tipos distintos de espalhamento. O primeiro é re- tório” e repetir o ensaio. Se a suspeita de presença
sultante da desintegração de agrupamentos de cé- de substâncias inibidoras na amostra for alta, utili-
lulas, durante a mistura do inóculo com o meio zar na repetição um procedimento adequado para
de cultura. O segundo é resultante da inadequada suprimir ou reduzir a influência desses componen-
mistura do inóculo com o meio, levando à forma- tes no resultado (vide Anexo 2.2. do Capítulo 2)
ção de filmes de umidade na superfície do meio (Exemplo 29 do Quadro 3.1).
ou entre o meio e o fundo da placa. A distinção
entre os dois tipos é facilmente visualizada, por-
que no espalhamento do primeiro tipo sempre se 3.6.1.3. Cálculo dos resultados para
pode observar crescimento de colônias individu- amostras preparadas pela técnica
do esfregaço de superfície
ais, enquanto no outro, a massa de crescimento
(“swabs” ou esponjas)
é contínua, não há ocorrência de colônias indivi-
duais. As placas com espalhamento poderão ser Os resultados devem ser expressos em UFC por
contadas nas seguintes condições: se nenhuma cm2 de amostra. Inicialmente, deve-se calcular o
das zonas de espalhamento individuais tiver ta- número de UFC por mililitro do diluente onde fo-
manho superior a 25% da área da placa e, ainda, ram recolhidos os “swabs”. Para tanto, considerar
se a área total coberta por zonas de espalhamento essa suspensão como se fosse uma amostra sem
não ultrapassar 50% da placa. Em caso contrário, diluição e, em função das diluições inoculadas
reportar o resultado como “acidente de laborató- dessa suspensão, calcular o resultado, da mes-

Quadro 3.1. Exemplos do cálculo dos resultados do plaqueamento em profundidade em condições não
ideais.
Regras Nº colônias na(s) placa(s) da diluição
Exemplo Contagem UFC/g ou ml
usadas 10-1 10-2 10-3
Sem duplicata
19 6.a Inc 140* 32 140x102 = 1,4 x 104
20 6.b Inc 243* 34* [(243x102)+(34x103)]/2 = 2,9 x 104
21 7 18* 2 0 18x101 = 1,8 x 102 est
22 8 0 0 0 < 1x101 = <10 est
23 9a Inc Inc 370* 370x103 = 3,7 x 105 est
24 9b Inc Inc 8/cm2* 8x65x103 = 520x103 = 5,2 x 105 est
2
25 9c Inc Inc 21/cm * 21x65x103 = 1.365x103 = 1,4 x 106 est
2
26 9d Inc Inc >100/cm * > 100x65x103 = > 6,5 x 106 est
27 10 Inc 325* 20 325x102 = 3,3 x104 est
28 11 Inc 243* Esp Esp 243x102 = 2,4 x104
29 12 27 215 20 Acidente de Laboratório
Com duplicata
30 5 Inc - Inc Inc - Inc 239*- 328* [(239+328)/2]x103 = 283,5x103 = 2,8 x105
31 6a 138*- 162* 42 - 30 1-2 [(138+162)/2]x101 = 150x101 = 1,5 x103
32 6b 228*- 240* 28*- 26* 2-2 {[(228+240)/2]x101 + [(28+26)/2]x102}/2 = 2.520 = 2,5 x 103
33 7 18*- 16* 2-0 0-0 [(18+16)/2]x101 = 17x101 = 1,7 x 102
34 8 0-0 0-0 0-0 <10 est
35 9a Inc - Inc Inc - Inc 320*- 295* [(320+295)/2]x103 = 307,5x103 = 3,1 x 105
36 10 287*- 263* 23 - 19 2-2 [(287+263)/2]x101 = 275x101 = 2,8 x 103
37 11 Inc - Inc 224*- 180* 28*-Esp [(224+180)/2]x102 + 28x103 = 24.100 = 2,4 x 104
*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Inc = Incontável, Esp = Espalhamento, Est = Estimada.
ma forma descrita para o plaqueamento utilizado áreas amostradas, para facilitar os cálculos. No
(profundidade, superfície, gotas ou filtração em caso acima, a contagem em UFC/cm2 será igual
membrana). ao valor obtido por ml de suspensão, dividido
Em seguida, deve-se converter a contagem de por cinco. No procedimento descrito no Capítu-
UFC/ ml da suspensão para UFC/cm2 da amostra. lo 2 para amostragem com esponjas, que amostra
Para tanto, calcular a quantos cm2 corresponde 100cm2 e recolhe as esponjas em 25 ml de diluen-
cada mililitro da suspensão. No procedimento pa- te, cada mililitro de diluente corresponde a 4cm2
drão descrito no Capítulo 2 para amostragem com de superfície. Nesse caso, a contagem em UFC/
“swabs, que amostra uma área de 50cm2 e recolhe cm2 será igual ao valor obtido por ml de suspen-
os “swabs”em 10 ml de diluente, cada mililitro de são, dividido por quatro. Numa outra situação, em
diluente corresponde a 5cm2 de superfície. Essa que um esfregaço de 100cm2 de área fosse sus-
relação, entretanto, pode ser alterada a critério do pendido em 10 ml de diluente, por exemplo, cada
laboratório, dependendo do tipo de amostra e ob- ml de suspensão corresponderia a 10cm2 de área e
jetivo da amostragem. É recomendável trabalhar o número de UFC/cm2 seria igual ao valor obtido
sempre com volumes de diluente múltiplos das por ml de suspensão, dividido por dez.
Área amostrada
UFC/cm2 = UFC/ ml da suspensão x
Volume de diluente de coleta

3.6.1.4. Cálculo dos resultados para ml da suspensão de lavagem para UFC/g de amos-
amostras preparadas pela técnica da tra, em função da diluição inicial utilizada na lava-
lavagem superficial gem (peso de amostra: volume de diluente). Se a
No caso de alimentos, os resultados devem ser diluição foi 1:1, cada ml de lavado corresponderá
expressos em UFC/g de amostra. Inicialmente, de- a 1g de amostra e o número de UFC/g será igual ao
ve-se calcular o número de UFC por mililitro do valor obtido por ml. Se a diluição for diferente de
diluente de lavagem. Para tanto, considerar essa 1:1, deve-se primeiro calcular a quantos gramas de
suspensão de lavagem como se fosse uma amostra amostra corresponde 1 ml de lavado, que é igual ao
sem diluição e, em função das diluições inocula- peso da amostra lavada dividido pelo volume de di-
das dessa suspensão, calcular o resultado da mes- luente usado. Por exemplo, se uma carcaça de fran-
ma forma descrita para o plaqueamento utilizado go de 1,6kg for lavada com 400 ml de diluente, cada
(profundidade, superfície, gotas ou filtração em ml de lavado corresponderá a 4g de amostra. Neste
membrana). caso, o número de UFC/g de amostra será igual ao
Em seguida, deve-se converter o número de UFC/ número de UFC/ml de lavado, dividido por quatro.
Volume de diluente usado na lavagem

UFC/g = UFC/ ml da suspensão x
Peso da amostra lavada
No caso de embalagens, os resultados podem isso, deve-se primeiro calcular a quantos cm3 da
ser expressos em UFC/cm3 da embalagem ou em embalagem corresponde 1 ml de lavado. Esse va-
UFC por embalagem. Inicialmente, deve-se cal- lor é igual à capacidade da embalagem dividida
cular o número de UFC por mililitro de água de pelo volume de diluente usado, ou seja se uma
lavagem, da mesma forma indicada para a análise embalagem de 500 ml foi lavada com 100 ml de
de alimentos. diluente, cada mililitro de lavado corresponderá
Em seguida, deve-se converter o número de UFC/ a 5cm3. Neste caso, o número de UFC/cm3 será
ml de água de lavagem para UFC/cm3, em função igual ao número de UFC/ ml de lavado dividido
do volume de diluente usado na lavagem. Para por cinco.
Volume de diluente usado na lavagem

UFC/cm3 = UFC/ ml da suspensão x
Capacidade da embalagem
Para determinar o número de UFC por embala-

gem, basta multiplicar o número de UFC/cm3 pela
capacidade da embalagem.
UFC/embalagem = UFC/cm3 x Capacidade da embalagem
3.6.2. Plaqueamento em superfície

Assim como no plaqueamento em profundidade, plaqueamento em profundidade, seguindo as mes-
as recomendações apresentadas nesse item são mas regras. Entretanto, o resultado final deve ser
aplicáveis aos ensaios em que todas as colônias multiplicado por 10 (dez), para levar em conta o
desenvolvidas nas placas, após o período de in- volume 10 vezes menor inoculado. Se foi feita a
cubação, são contadas e consideradas no cálculo. distribuição de 1 ml da primeira diluição em vá-
A contagem das colônias e o cálculo dos resul- rias placas, o número de colônias dessa diluição é
tados são feitos da mesma forma descrita para o a soma de todas as placas. Se o cálculo do resulta-

do for feito com a contagem dessa diluição, então Regra 3 – Se o número de colônias por quadrícula
não é necessário multiplicar por 10. for maior do que 20, expressar o resultado como
maior do que 2000 dividido pelo volume filtrado.
3.6.3. Plaqueamento em gotas
Regra 4 – Se foi feita a filtração de uma solução
Assim como no plaqueamento em profundidade, obtida de amostra sólida (sal ou açúcar, por exem-
as recomendações apresentadas nesse item são plo), valem as regras 1, 2 e 3 mas o valor deve ser
aplicáveis aos ensaios em que todas as colônias convertido para UFC/g em função quantidade de
desenvolvidas nas placas, após o período de in- amostra na solução. Exemplo: Dissolvidas 25g de
cubação, são contadas e consideradas no cálculo. açúcar em 225 ml de água peptonada 0,1% (dilui-
Contar as colônias das gotas com no máximo 30 ção 1:10), filtrados 100 ml da solução e contadas
colônias. Para calcular o número de UFC/g ou ml, 120 colônias na membrana. Cada mililitro da so-
tirar a média do número de colônias nas três gotas lução equivale a 0,1g de amostras, portanto, em
da diluição inoculada, multiplicar pelo inverso da 100 ml foi filtrada uma quantidade equivalente a
diluição e em seguida por 100, para considerar o 10g da amostra sólida. Então:
volume inoculado (UFC/g ou ml = Nº Colônias UFC/100 ml de solução
X 100/diluição). = UFC/10g de amostra = 120
⇒ UFC/g = 120/10 = 12
3.6.4. Filtração em membrana

3.7. Contagem das colônias
Assim como no plaqueamento em profundidade,
as recomendações apresentadas nesse item são e cálculo dos resultados
aplicáveis aos ensaios em que todas as colônias segundo a ISO
desenvolvidas nas placas, após o período de in-
cubação, são contadas e consideradas no cálculo. As instruções apresentadas nesse item são para
ensaios realizados com métodos International Or-
Proceder à contagem das colônias com o auxílio
ganization for Standardization (ISO) e estão des-
de um microscópio estereoscópico, com aumento
critas na ISO 7218:2007/Amd.1:2013 e na ISO
de 10 a 15 vezes e, para facilitar a visualização
14461-2:2005.
posicionar as placas de forma a obter uma ilumi-
nação perpendicular ao plano da membrana. Se-
3.7.1. Exigências gerais para o
lecionar para contagem placas com 20 a 200 co-
cálculo dos resultados
lônias. Seguir as regras abaixo para contagem e
cálculo do número de UFC/ ml: a) Inoculação ou não de duplicata. A ISO
7218:2007/Amd.1:2013 estabelece que pelo
Regra 1 – Se o número de colônias por quadrícula
menos duas placas sejam inoculadas para cada
da membrana for menor ou igual a 2, contar todas
contagem, podendo ser uma placa de duas di-
as colônias presentes e dividir pelo volume filtra-
luições subsequentes ou duas placas da mes-
do, para obter o número de UFC/ ml.
ma diluição (duplicata). Nada impede que seja
Regra 2 – Se o número de colônias por quadrícula feita duplicata no plaqueamento de diluições,
estiver na faixa de 3 a 10, contar 10 quadrículas mas não é obrigatório (exceto no caso de labo-
e tirar a média por quadrícula. Multiplicar esse ratórios que não trabalhem com um sistema de
valor por 100 e dividir pelo volume filtrado, para qualidade assegurada).
obter o número de UFC/ ml. Se o número de co- b) Número máximo e mínimo de colônias nas
lônias por quadrícula estiver na faixa de 10 a 20, placas para contagem. A ISO 7218:2007/
contar apenas 5 quadrículas para tirar a média e Amd.1:2013 manda selecionar para a contagem
calcular o número de UFC/ ml da mesma forma. as placas em que o número total de colônias não

ultrapasse 300 (placas de 90mm). Para placas seja obedecido um limite superior e inferior
com diâmetro diferente de 90mm, o número aceitáveis para a diferença entre as placas. O
máximo aceitável de colônias é proporcional Anexo 3.2 traz uma tabela com o limite de
à área da placa. No caso de placas de 55mm concordância aceitável entre essas contagens,
de diâmetro o número máximo de colônias é de estabelecido pela ISO 14461-2:2005.
110 e, no caso de placas de 140mm é de 730 e) Apresentação do resultado. A ISO 7218:2007/
colônias. Nos ensaios que utilizam meios dife- Amd.1:2013 estabelece que, em todas as situa-
renciais e apenas as colônias típicas são conta- ções, seja usada notação exponencial na apre-
das, selecionar para a contagem as placas em sentação dos resultados, com apenas uma casa
que a soma das colônias típicas + atípicas não decimal depois da vírgula e aproximando para
ultrapasse 300 (placas de 90mm) e o número de cima quando a segunda casa decimal for igual
colônias típicas não ultrapasse 150. Em todos a cinco ou maior. A aproximação deve ser fei-
os casos o número mínimo de colônias na placa ta no número final obtido, depois de efetuados
selecionadas deve ser de 10 (típicas, atípicas ou todos os cálculos.
soma delas). Intervalo de confiança. Há situ-
ações em que a ISO 7218:2007/Amd.1:2013
permite o uso de placas com número de colô- 3.7.2. Regras gerais para o cálculo
nias superior ou inferior ao estabelecido, desde dos resultados
que dentro do intervalo de confiança apresen- Para o cálculo segundo a ISO 7218:2007/Amd.
tado abaixo. 1:2013 há três situações a serem consideradas: 1)
Nº aceitável
Sem duplicata Com duplicata
ensaios em que todas as colônias ou todas as colô-
de colônias nias típicas desenvolvidas nas placas, após o perí-
máximo 300 limite superior 332 limite superior 323 odo de incubação, são contadas e consideradas no
máximo 150 limite superior 173 limite superior 166
máximo 100 limite superior 119 limite superior 113
cálculo, sem necessidade de confirmação (conta-
mínimo 30 limite inferior 20 limite inferior 23 gem total de aeróbios mesófilos, por exemplo, ou
mínimo 15 limite inferior 7 limite inferior 10 colônias pretas na contagem de clostrídios sulfito
mínimo 10 limite inferior 4 limite inferior 6 redutores, por exemplo), 2) métodos em que colô-
nias típicas são contadas como presuntivas e, após
c) Diluição decimal do número de colônias. A
uma etapa de confirmação, apenas a porcentagem
ISO 7218:2007/Amd.1:2013 estabelece que,
confirmada é considerada nos cálculos (Bacillus
se foram plaqueadas duas diluições, a conta-
cereus, por exemplo) e 3) métodos em que, além
gem em uma diluição seja de aproximadamen-
das colônias típicas, colônias atípicas também po-
te 10% da diluição anterior, com limite supe-
dem ser contadas como presuntivas e, após uma
rior de 15,6% e inferior de 5,2% (definidos na
etapa de confirmação, consideradas nos cálculos
ISO 14461-2:2005). Exemplo: Se numa dilui-
(estafilococos coagulase positivos, por exemplo).
ção observou-se o desenvolvimento de 250
colônias, a contagem na diluição subsequente Regra 1 – Geral para ensaios em que todas as
não deve ser inferior a 13 (5,2%) ou superior a colônias (ou todas as colônias típicas) são consi-
39 (15,6%). O Anexo 3.1 traz uma tabela com deradas nos cálculos (sem confirmação)
a contagem aceitável na segunda diluição con-
siderada, para cada contagem de colônias ob- 1.1) A regra geral para o cálculo dos resultados é:
servada na diluição anterior.
UFC/g ou ml = ∑C / v x [n1 + (0,1 x n2)] x d
d) Variação aceitável entre as contagens do
par de placas de uma duplicata. A ISO onde:
7218:2007/Amd.1:2013 estabelece que, se foi ∑C = número total de colônias (ou de colônias típicas) pre-
plaqueada duplicata de uma mesma diluição, sentes em cada placa selecionada para contagem.

v = volume inoculado em cada placa (geralmente 0,1 ml no que produzem colônias típicas muito grandes, tra-
plaqueamento em superfície ou 1 ml no plaqueamento em tados separadamente nos capítulos específicos).
profundidade).
n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele- Pelo menos uma das placa selecionadas deve con-
cionada (geralmente uma se não foi feita replicata ou duas ter um mínimo de 10 colônias no total (típicas,
quando foi feita duplicata). atípicas ou soma delas).
n2 = número de placas contadas da segunda diluição sele-
cionada. 2.1) A regra geral para o cálculo dos resultados
d = primeira diluição retida para contagem nesses métodos é:
(100=1, 10-1= 0,1, 10-2= 0,01 e assim por diante).
UFC/g ou ml =∑a / v x [n1 + (0,1 x n2)] x d
1.2) A equação acima é válida tanto para a inocu-
lação com duplicata como sem duplicata. Entre- onde:
tanto, quando não é feita a inoculação de duplicata a = (b x C/A) sendo C = número de colônias típicas presen-
tes em cada placa selecionada para contagem, A = número
temos n1 = n2 = 1, então, a equação pode ser sim- de colônias típicas submetidas à confirmação (geralmente
plificada para: cinco) e b = número de colônias típicas confirmadas, den-
tre as que foram submetidas à confirmação (o valor obtido
UFC/g ou ml = ∑C / v x 1,1 x d
deve ser arredondado para o número inteiro mais próximo
do calculado).
Exemplo 1) Inoculados 1 ml das diluições 10-1, v = volume inoculado em cada placa.
10-2 e 10-3, uma placa por diluição (sem dupli- n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele-
cata, n1 = n2 = 1). Os resultados obtidos foram: cionada
Diluição 10-2 Diluição 10-3
cionada
Número de colônias presentes
150 17 d = primeira diluição retida para contagem (100=1, 10-1=
em cada placa
Volume inoculado em cada placa (v) 1 ml 1 ml
0,1, 10-2= 0,01 e assim por diante).
Primeira diluição -2
10 = 0,01
retida para contagem (d) 2.2) A equação acima é válida tanto para a inocu-
Somatória das colônias nas placas
150 + 17 = 167 lação com duplicata como sem duplicata. Entre-
(∑C)
167 / 1 x 1,1 x 0,01
tanto, quando não é feita a inoculação de duplicata
UFC/g ou ml = ∑C / v x 1,1 x d
= 167/0,011 = 1,5 x 104 temos n1 = n2 = 1, então, a equação pode ser sim-
plificada para:
Exemplo 2) Inoculados 0,1 ml da diluição 10-1,
em duplicata (n1 = 2 , n2 = 0). Os resultados UFC/g ou ml =∑a / v x 1,1 x d
obtidos foram:
10-1 - Placa 1 10-1 - Placa 2 Exemplo 3) Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1e
18 20 10-2, uma placa por diluição (n1 = 1 e n2 = 1).
em cada placa
Os resultados obtidos foram:
Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml
Primeira diluição retida -1 Diluição 10-1 Diluição 10-2
10 = 0,1
para contagem (d) Colônias típicas na placa (C) 150 17
Somatória das colônias nas placas Colônias típicas submetidas
18+20 = 38 5 5
(∑C) à confirmação (A)
UFC/g ou ml = 38 / 0,1 x [2+(0,1 x 0) x 0,1] Colônias típicas confirmadas dentre
∑C / v x [n1 + (0,1 x n2)] x d = 38/0,02 = 1,9 x 103 4 3
as submetidas à confirmação (b)
Número de colônias consideradas
(4x150/5) (3x17/5)
Regra 2 – Geral para ensaios em que apenas confirmadas nas placas
= 120 = 10
[a = (b x C/A)]
colônias típicas confirmadas são consideradas
nos cálculos Primeira diluição retida para -1
10 = 0,1
Selecionar para a contagem as placas em que o contagem (d)
Somatória das colônias consideradas
número total de colônias não ultrapasse 300 (pla- confirmadas nas placas (∑a)
120+10 = 130
cas de 90mm) e o número de colônias típicas não 130 / 0,1 x 1,1 x 0,1
UFC/g ou ml =∑a / v x 1,1 x d
ultrapasse 150 (exceto no caso de microrganismos = 130/0,011 = 1,2x104

Exemplo 4) Inoculados 0,1 ml da diluição 10-1, Exemplo 5) Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1e
em duplicata (n1 = 2, n2 = 0). Os resultados 10-2, uma placa por diluição (n1 = 1 e n2 = 1).
obtidos foram: Os resultados obtidos foram:
10-1 - Placa 1 10-1 - Placa 2 Diluição 10-1 Diluição 10-2
Colônias típicas na placa (C) 18 20 Colônias típicas na placa (Ct) 150 17
Colônias típicas submetidas Colônias atípicas na placa (Ca) 12 2
5 5 Colônias típicas submetidas
à confirmação (A) 5 5
à confirmação (At)
Colônias típicas confirmadas dentre
4 5 Colônias atípicas submetidas
as submetidas à confirmação (b) 5 2
à confirmação (Aa)
confirmadas nas placas (4x18/5) = 14 (5x20/5) = 20 4 3
as submetidas à confirmação (bt)
[a = (b x C/A)]
Colônias atípicas confirmadas dentre
Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml 0 0
as submetidas à confirmação (ba)
Primeira diluição retida para Número de colônias consideradas (4x150/5) + (3x17/5) +
10-1 = 0,1
contagem (d) confirmadas nas placas (0x12/5) (0x2/2)
Somatória das colônias consideradas [a = (bt x Ct/At) + (ba x Ca/Aa)] = 120 = 10
14+20 = 34
confirmadas nas placas (∑a) Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml
UFC/g ou ml = 34 / 0,1 x [(2 + 0,1x0) x 0,1] Primeira diluição retida
10-1 = 0,1
∑a / v x [n1 + (0,1 x n2)] x d = 34/0,02 = 1,7x103 para contagem (d)
120+10 = 130
confirmadas nas placas (∑a)
Regra 3 – Geral para ensaios em que, além das 130 / 0,1 x 1,1 x 0,1
colônias típicas, colônias atípicas confirmadas = 130/0,011 = 1,2x104
também são consideradas nos cálculos
Exemplo 6) Inoculados 0,1 ml da diluição 10-1,
3.1) A regra geral para o cálculo dos resultados em duplicata (n1 = 2, n2 = 0). Os resultados
nesses métodos é: obtidos foram:
10-1 - Placa 1 10-1 - Placa 2
UFC/g ou ml =∑a / v x [n1 + (0,1 x n2)] x d Colônias típicas na placa (Ct) 18 20
onde: Colônias atípicas na placa (Ca) 2 3
Colônias típicas submetidas
a = (bt x Ct/At) + (ba x Ca/Aa) sendo C = número de colô- 5 5
nias típicas (Ct) ou atípicas (Ca) presentes em cada placa Colônias atípicas submetidas
selecionada para contagem, A = número de colônias 2 3
típicas (At) ou atípicas (Aa) submetidas à confirmação Colônias típicas confirmadas dentre
4 5
(geralmente cinco) e b = número de colônias típicas (bt) as submetidas à confirmação (bt)
ou atípicas (ba) confirmadas, dentre as que foram submeti- Colônias atípicas confirmadas dentre
0 1
das à confirmação. as submetidas à confirmação (ba)
v = volume inoculado em cada placa. Número de colônias consideradas (4x18/5) + (5x20/5) +
n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele- confirmadas nas placas (0x2/2) (1x3/3)
cionada [a = (bt x Ct/At) + (ba x Ca/Aa)] = 14 = 21
Primeira diluição retida
cionada 10-1 = 0,1
para contagem (d)
d = primeira diluição retida para contagem
(100=1, 10-1= 0,1, 10-2= 0,01 e assim por diante). 14+21 = 35
UFC/g ou ml = 35 / 0,1 x [(2 + 0,1x0) x 0,1]
3.2) A equação acima é válida tanto para a inocu- ∑a / v x [n1 + (0,1 x n2)] x d = 35/0,02 = 1,8x103
lação com duplicata como sem duplicata. Entre-
tanto, quando não é feita a inoculação de duplicata
3.7.3. Regras para o cálculo em
temos n1 = n2 = 1, então, a equação pode ser sim-
situações não usuais
plificada para:
Os exemplos acima são de cálculos em condi-
ções ideais, com número de colônias na faixa de

10 a 300, sem espalhamento. Mas são bastante Exemplo 9 – Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1
frequentes as situações em que as placas não se e 10-2, uma placa por diluição (n = 1). Os resul-
apresentam em condições tão ideais, sendo apli- tados obtidos foram:
cadas algumas regras básicas para o cálculo dos Diluição 10-1 Diluição 10-2
resultados. Essas regras são apresentadas a seguir. Número de colônias presentes
0 0
em cada placa
Regra 4 – Nenhuma placa atingiu 10 colônias Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml
ou nenhuma colônia nas placas -1
10 = 0,1
para contagem (d)
Se houver menos de 10, mas pelo menos quatro Somatória das colônias nas placas (∑C) Considerar como 1
colônias estiverem presentes, usar a fórmula abai- 1 / 0,1 x 1 x 0,1
UFC/g ou ml = ∑C / v x n x d
= 1/0,01 → <100
xo para os cálculos e relatar o resultado como es-
timado (exemplo 7). Se houver menos de quatro Regra 5 – Placas com mais de 300 colônias
colônias, calcular para quatro e relatar o resulta-
5a) Mais de 300 em uma diluição e menos de 10
dos como menor do que o valor obtido (exemplo
na seguinte. Se numa diluição o número de colô-
8). Se não houver colônias, calcular para uma e
nias ficou acima de 300 e na seguinte ficou abai-
relatar o resultados como menor do que o valor
xo de 10, o resultado é inaceitável porque 10 está
obtido (exemplo 9).
abaixo do limite inferior permitido na diluição
UFC/g ou ml = ∑C / v x n x d subsequente (vide Anexo 3.1). Por exemplo, se
houver 301 colônias na 1ª diluição retida, a menor
onde: contagem aceitável na diluição seguinte é de 17
∑C = número total de colônias (ou de colônias típicas) pre- colônias.
sentes em cada placa selecionada para contagem.
v = volume inoculado em cada placa. 5b) Mais de 150 colônias nos ensaios em que o
n = número de placas contadas da primeira diluição selecio- número máximo de colônias aceitável nas placas
nada. é de 150 (contagem de bolores e leveduras, por
Exemplo 7) Inoculados 0,1 ml da diluição 10-1, em exemplo). Se numa diluição o número de colônias
duplicata (n = 2). Os resultados obtidos foram: ficou acima de 150 e na seguinte ficou abaixo de
10 o resultado é aceitável se não ultrapassar 173
10-1 - Placa 1 10-1 - Placa 2
(sem duplicata) ou 166 (com duplicata) na 1ª di-
6 8
em cada placa luição retida e se, na subsequente, obedecer ao li-
Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml mite inferior definido no Anexo 3.1 (exemplo 10).
Primeira diluição retida -1
10 = 0,1
para contagem (d) Exemplo 10) Inoculados 1 ml das diluições 10-1e
Somatória das colônias nas placas
6 + 8=14 10-2, duas placas por diluição (n = 2). Os resul-
(∑C)
14 / 0,1 x 2 x 0,1 tados obtidos foram:
= 14/0,02 = 7x102 (est)a Diluição 10-1 Diluição 10-2
a = Resultado estimado. Número de colônias presentes
151 e 160a 08 e 09b
em cada placa
Exemplo 8) Inoculados 1 ml das diluições 10-1e Volume inoculado em cada placa (v) 1 ml 1 ml
10-2, uma placa por diluição (n = 1). Os resul- para contagem (d)
-1
10 = 0,1
tados obtidos foram: Somatória das colônias nas placas (∑C) 151 +160 + 08 + 9 = 328
Diluição 10 -1
Diluição 10 -2 328/1 x 2 x 0,1
Número de colônias presentes em = 328/0,2 = 1,6x103
3 0 a Não ultrapassou o limite superior de 166.
cada placa
Volume inoculado em cada placa (v) 1 ml 1 ml b Ficou acima do limite inferior de 06 e 07 definido no Anexo 3.1.

10-1 = 0,1
para contagem (d) 5c) Nos ensaios com confirmação em que só se
Somatória das colônias nas placas (∑C) Considerar como 4
4 / 1 x 1 x 0,1
observa colônias típicas ou confirmadas em placas
UFC/g ou ml = ∑C / v x n x d com mais de 300 colônias e não na diluição sub-
= 4/0,1 → <40

sequente. Se num ensaio as colônias típicas ou as Exemplo 12) Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1
colônias confirmadas são observadas apenas em e 10-2 (d1 = 0,1 e d2 = 0,01), uma placa por di-
placas com mais de 300 colônias e não na diluição luição. Os resultados obtidos foram:
subsequente, calcular o resultado (Exemplo 11): Diluição 10-1 Diluição 10-2
UFC/g ou ml = menor que 1/V2.d2 e maior que 1/ mais de 300 33
em cada placa
V1.d1 Colônias típicas e/ou
ausentes ausentes
confirmadas na placa
onde Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml
d1 e d2 são os fatores de diluição correspondentes às dilui- UFC/g ou ml = menor que 1/V2.d2 > 1/0,1 x 0,01 → >103
ções inoculadas,
V1 é o volume inoculado da diluição d1 e
5d) Número aceitável de colônias em apenas uma
V2 é o volume inoculado da diluição d2.
das diluições inoculadas. Nas contagens sem du-
Se não for observada a presença de colônias tí- plicata, se na primeira diluição inoculada o núme-
picas ou confirmadas na placas com mais de 300 ro de colônias é maior que 332 (limite superior
colônias e nem na placa da diluição subsequente, do intervalo de confiança, Quadro 3.2) mas na di-
calcular o resultado (Exemplo 12): luição seguinte a contagem atende às exigências
UFC/g ou ml = menor que 1/V2.d2 do Anexo 3.1, usar essa contagem nos cálculos e
relatar como resultado estimado (Exemplo 13).
Exemplo 11) Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1 Exemplo 13) Inoculados 1 ml das diluições 10-1
e 10-2 (d1 = 0,1 e d2 = 0,01), uma placa por di- e 10-2 (d1 = 0,1 e d2 = 0,01), uma placa por
luição. Os resultados obtidos foram: diluição (n = 1). Os resultados obtidos foram:
mais de 300 33 Número de colônias presentes em
em cada placa 334a 31b
cada placa
Colônias típicas e/ou
presentes ausentes Volume inoculado em cada placa (v) 1 ml 1 ml
confirmadas na placa
Primeira diluição retida para conta-
Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml d2 = 10-2 = 0,01
gem (d)
UFC/g ou ml = menor que 1/V2.d2 e < 1/0,1 x 0,01 e > 1/0,1 x 0,1
Somatória das colônias nas placas considerar apenas as da
maior que 1/V1.d1 → <103 e > 102
(∑C) diluição 10-2 = 31
31/1 x 1 x 0,01 = 31/0,01
= 3,1x103 (estimada)
a Acima do limite superior de 332 do Quadro 3.2.
b Ficou dentro do intervalo aceitável de 20 a 50 colônias definido no Anexo
3.1.
3.8. Referências
ISO 6887-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs microbiological laboratories – Part 2: Determination
– Preparation of test samples, initial suspension and of the reliability of colony counts of parallel plates and
decimal dilutions for microbiological examination – subsequent dilution steps. 1st edition, 2005. The Inter-
Part 1: General rules for the preparation of the initial national Organization for Standardization.
suspension and decimal dilutions. 1st ed., 1999. The PETRAN, R.L., GRIEME, L.E., FOONG-CUNNINGHAM,
International Organization for Standardization. S., 2015. Culture methods for enumeration of micro-
ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs – organisms. In: SALFINGER, Y. & TORTORELLO,
General requirements and guidance for microbiological M.L. (eds.), Compendium of Methods for the Micro-
examination. 3rd edition, 2007/Amendment 1, 2013. The biological Examination of Foods, 5th ed. Washington:
International Organization for Standardization. American Public Health Association (APHA). Chapter
ISO 14461-2. Milk and milk products – Quality control in 6, pp.75-87.

Anexo 3.1.
Limite de concordância aceitável entre as contagens de
colônias obtidas em placas de duas diluições subsequentes
(ISO 14461-2:2005)
10-x = Número de colônias observado na placa da 1ª diluição considerada (ou soma das colônias das duas
placas da duplicata, se foi inoculada duplicata de cada diluição).
10-(x+1) = Número de colônias aceitável na placa da 2ª diluição considerada (ou soma das colônias das
duas placas da duplicata, se foi inoculada duplicata de cada diluição).
10-x 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
mínimo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10-(x+1)
máximo 4 5 5 5 5 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7
10-x 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
mínimo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1
10-(x+1)
máximo 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 10 10 10
10-x 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
mínimo 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
10-(x+1)
máximo 10 10 11 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12
10-x 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69
mínimo 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2
10-(x+1)
máximo 13 13 13 13 13 13 14 14 14 14 14 14 14 15 15
10-x 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84
mínimo 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
10-(x+1)
máximo 15 15 15 15 16 16 16 16 16 16 16 17 17 17 17
10-x 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99
mínimo 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
10-(x+1)
máximo 17 17 17 18 18 18 18 18 18 18 19 19 19 19 19
10-x 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114
mínimo 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
10-(x+1)
máximo 19 19 20 20 20 20 20 20 20 21 21 21 21 21 21
10-x 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129
-(x+1)
mínimo 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
10
máximo 21 22 22 22 22 22 22 22 23 23 23 23 23 23 23
10-x 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144
mínimo 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6
10-(x+1)
máximo 24 24 24 24 24 24 24 24 25 25 25 25 25 25 25
10-x 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159
-(x+1)
mínimo 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7
10
máximo 26 26 26 26 26 26 26 27 27 27 27 27 27 27 27

10-x 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174
mínimo 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8 8
10-(x+1)
máximo 28 28 28 28 28 28 28 29 29 29 29 29 29 29 29
10-x 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189
mínimo 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9
10-(x+1)
máximo 30 30 30 30 30 30 30 31 31 31 31 31 31 31 31
10-x 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204
mínimo 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10
10-(x+1)
máximo 32 32 32 32 32 32 32 32 33 33 33 33 33 33 33
10-x 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219
mínimo 10 10 10 10 10 10 11 11 11 11 11 11 11 11 11
10-(x+1)
máximo 34 34 34 34 34 34 34 34 35 35 35 35 35 35 35
10-x 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234
mínimo 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
10-(x+1)
máximo 35 36 36 36 36 36 36 36 36 37 37 37 37 37 37
10-x 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249
mínimo 12 12 12 12 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13
10-(x+1)
máximo 37 38 38 38 38 38 38 38 38 39 39 39 39 39 39
-x
10 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264
-(x+1)
mínimo 13 13 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14
10
máximo 39 39 40 40 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41
10-x 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279
mínimo 14 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 16
10-(x+1)
máximo 41 41 41 42 42 42 42 42 42 42 42 43 43 43 43
10-x 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294
mínimo 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 17 17
10-(x+1)
máximo 43 43 43 43 44 44 44 44 44 44 44 44 45 45 45
10-x 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309
mínimo 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 18 18 18 18
10-(x+1)
máximo 45 45 45 45 45 46 46 46 46 46 46 46 46 47 47
10-x 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324
mínimo 18 18 18 18 18 18 18 18 18 19 19 19 19 19 19
10-(x+1)
máximo 47 47 47 47 47 47 48 48 48 48 48 48 48 48 49
10-x 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334
mínimo 19 19 19 19 19 19 19 20 20 20
10-(x+1)
máximo 49 49 49 49 49 49 49 50 50 50

Anexo 3.2.
Limite de concordância aceitável entre as contagens de
colônias obtidas em um par de placas de uma duplicata
(ISO 14461-2:2005)
Maior = Contagem na placa que apresentou o maior número de colônias no par.

Menor = Contagem aceitável na outra placa do par.
Maior 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Menor 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 9 9 10
Maior 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Menor 11 11 12 12 13 14 14 15 16 16 17 18 19 19 20
Maior 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
Menor 21 21 22 23 24 24 25 26 27 27 28 29 29 30 31
Maior 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69
Menor 32 32 33 34 35 36 36 37 38 39 39 40 41 42 43
Maior 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84
Menor 43 44 45 46 46 47 48 49 50 50 51 52 53 54 54
Maior 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99
Menor 55 56 57 58 58 59 60 61 62 62 63 64 65 66 67
Maior 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114
Menor 67 68 69 70 71 71 72 73 74 75 76 76 77 78 79
Maior 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129
Menor 80 81 81 82 83 84 85 86 86 87 88 89 90 91 91
Maior 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144
Menor 92 93 94 95 96 96 97 98 99 100 101 102 102 103 104
Maior 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159
Menor 105 106 107 107 108 109 110 111 112 113 113 114 115 116 117
Maior 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174
Menor 118 119 119 120 121 122 123 124 125 125 126 127 128 129 130
Maior 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189
Menor 131 131 132 133 134 135 136 137 138 138 139 140 141 142 143
Maior 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204
Menor 144 144 145 146 147 148 149 150 151 151 152 153 154 155 156
Maior 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219
Menor 157 158 158 159 160 161 162 163 164 165 165 166 167 168 169
Maior 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234
Menor 170 171 172 172 173 174 175 176 177 178 179 179 180 181 182
Maior 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249
Menor 183 184 185 186 186 187 188 189 190 191 192 193 194 194 195
Maior 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264
Menor 196 197 198 199 200 201 202 202 203 204 205 206 207 208 209
Maior 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279
Menor 210 210 211 212 213 214 215 216 217 218 218 219 220 221 222
Maior 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294
Menor 223 224 225 226 226 227 228 229 230 231 232 233 234 234 235
Maior 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309
Menor 236 237 238 239 240 241 242 243 243 244 245 246 247 248 249
Maior 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323
Menor 250 251 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 260 261

o 4 Técnicas básicas de contagem
de microrganismos pelo
número mais provável (NMP)
Sem alterações.
4.1. Introdução dessa diluição. Há situações em que as alíquotas

da amostra sólida são inoculadas diretamente no
As orientações contidas nesse capítulo são da caldo de cultura. A inoculação direta das amostras
American Public Health Association (APHA), des- sólidas, entretanto, é menos comum e depende do
critas na 5ª edição do Compendium of Methods for tipo de amostra.
Microbiological Examination of Foods (Salfinger Como a inoculação é feita em meios líquidos, a
& Tortorello, 2015) e da Food and Drug Adminis- técnica do NMP apresenta algumas vantagens em
tration (FDA), descritas no Bacteriological Analy- relação à contagem padrão em placas. Uma delas
tical Manual (Blodgett, 2010). é a possibilidade de inocular quantidades maiores
A técnica do número mais provável é um método da amostra, aumentando-se proporcionalmente o
de análise quantitativo que permite determinar o volume de meio de cultura. Isso confere à técnica
número mais provável (NMP) do(s) microrganis- uma sensibilidade maior do que a da contagem em
mo(s) alvo na amostra, através da inoculação de placas e uma grande flexibilidade no estabeleci-
alíquotas dessa amostra em uma série de tubos, mento do limite de detecção. Outra vantagem é
contendo um meio de cultura líquido adequado que permite a introdução de etapas de recuperação
ao seu crescimento. A determinação do número de injúrias, utilizando um meio não seletivo para
de microrganismos é baseada no princípio de que, a inoculação inicial, mais favorável aos microrga-
subdividindo a amostra em alíquotas, algumas alí- nismos injuriados, e depois transferindo a cultura
quotas vão conter microrganismos e outras não, para meios seletivos.
dependendo da quantidade dos microrganismos A técnica do NMP é bastante versátil, permitindo
na amostra. O número de alíquotas com microrga- a enumeração de diferentes grupos ou espécies de
nismos (tubos com crescimento positivo após a in- microrganismos, variando-se o meio de cultura e as
cubação) e alíquotas sem microrganismos (tubos condições de incubação. Suas principais aplicações
com crescimento negativo após a incubação) per- são a contagem de coliformes totais, coliformes ter-
mite estimar, por cálculo de probabilidade, a den- motolerantes e E. coli em água e alimentos. Pode
sidade original dos microrganismos na amostra. também ser utilizada em outros ensaios quantitati-
Essa aplicação da teoria da probabilidade depen- vos, quando a contaminação esperada na amostra
de de que os microrganismos estejam distribuídos está abaixo do limite de detecção do plaqueamen-
ao acaso e homogeneamente por toda a amostra. to ou quando partículas do alimento interferem na
No caso de amostras líquidas, essa condição pode contagem em placas. Uma outra aplicação é a adap-
ser atingida sem dificuldade, através da cuidadosa tação de métodos qualitativos para quantitativos,
agitação do material. No caso de amostras sólidas, como a contagem de Salmonella, Listeria monocy-
pode ser atingida no preparo e homogeneização da togenes e outros microrganismos tradicionalmente
primeira diluição, tomando-se as alíquotas a partir analisados por métodos de presença/ausência.

Para a homogeneização da amostra e preparo das diluições (menores alíquotas da amostra). Para
diluições, são utilizados os procedimentos des- orientação, as diluições recomendadas para amos-
critos no Capítulo 2. Para a inoculação, a técnica tras com contaminação na faixa de 3 a 1.000/g
do NMP apresenta dois formatos, dependendo de ou ml, são a 10-1, 10-2 e 10-3. Se a contaminação
como as alíquotas são distribuídas. Um é o forma- esperada estiver acima dessa faixa, deve-se ino-
to do teste de diluição múltipla, no qual três, cinco cular diluições mais altas. Caso não seja possível
ou dez alíquotas de uma diluição são inoculadas estimar previamente o nível de contaminação da
numa série de três, cinco ou dez tubos e, depois, amostra, deve-se inocular mais do que três dilui-
uma nova série de três, cinco ou dez alíquotas, ções (pelo menos cinco), partindo-se da diluição
da diluição subsequente, são inoculadas em outra inicial. Se a contaminação estimada estiver abai-
série de tubos e assim por diante. Quanto maior xo dessa faixa, pode-se inocular volumes maiores
o número de diluições e de tubos por diluição, da amostra sem diluição (no caso de líquidos) ou
maior a precisão da contagem. Para a maioria das da primeira diluição (no caso de sólidos), aumen-
situações encontradas na análise de alimentos, tando proporcionalmente o volume de meio de
três diluições com três tubos por diluição são sufi- cultura. A proporção entre o volume inoculado e
cientes para uma boa estimativa do NMP. O outro o volume de meio de cultura recomendado pelo
formato é o do teste de diluição única, no qual Compendium (Petran et al., 2015) é: uma parte
todas as alíquotas inoculadas (geralmente cinco a da amostra ou diluição adicionada a dez partes do
dez) são de uma mesma diluição, com igual quan- caldo. Uma prática bastante comum, que mantém
tidade da amostra. essa proporção, é a inoculação de 10 ml das amos-
tras líquidas, sem diluição, em 10 ml do meio de
cultura em concentração dupla. Essa prática tam-
4.2. Teste de diluição múltipla bém é muito utilizada na inoculação da primeira
diluição de amostras sólidas. Para orientação na
O teste de diluição múltipla é o mais versátil dos
seleção das diluições pode ser consultado o Qua-
formatos da técnica do NMP, porque permite
dro 4.1, que apresenta a quantidade de amostra
abranger uma faixa ampla de concentrações dos
presente nas alíquotas de várias combinações de
microrganismos na amostra, variando-se as di-
diluições, com o limite de detecção da técnica em
luições inoculadas. O procedimento padrão é a
cada combinação. Outras combinações são possí-
inoculação de três diluições decimais sequenciais
veis, particularmente no caso de amostras líqui-
da amostra, três alíquotas por diluição ou, mais
das, que podem ser adicionadas diretamente no
raramente, cinco alíquotas por diluição e/ou cinco
caldo, como a combinação decimal 100 – 10 – 1
diluições. A técnica, entretanto, permite procedi-
ml ou a não decimal 500 – 50 –5, por exemplo. No
mentos não tão comuns, como a inoculação de um
caso de amostras sólidas as opções são mais res-
número maior de diluições decimais, um número
tritas, porque, como já mencionado anteriormen-
maior de alíquotas por diluição ou, mesmo, dilui-
te, nem todos os produtos apresentam distribuição
ções não decimais. Nesses casos o procedimento
de microrganismos homogênea para inoculação
analítico é o mesmo, mas varia a forma de cálculo
direta. Nos casos em que isso ocorre, podem ser
dos resultados. O procedimento padrão traz a van-
utilizadas as mesmas combinações dos produtos
tagem de ter os resultados apresentados em Tabe-
líquidos.
las de NMP, enquanto os não padrão requerem o
uso de fórmulas para o cálculo. A seleção do meio de cultura mais adequado
para a inoculação das alíquotas varia para cada
A seleção das diluições depende da contamina-
ensaio, em função do(s) microrganismo(s) alvo,
ção estimada da amostra, de forma a obter tubos
sendo descrita nos capítulos específicos.
positivos nas menores diluições (maiores alíquo-
tas da amostra) e tubos negativos nas maiores A verificação da presença do(s) microrganis-

Técnicas básicas de contagem de microrganismos pelo número mais provável (NMP) □ 53
mo(s) alvo nas alíquotas inoculadas após a pítulos específicos

incubação, para cálculo do NMP, também varia
4.2.2. Procedimento
para cada ensaio, sendo descrita nos capítulos es-
pecíficos. Na maioria dos ensaios essa verificação Antes de iniciar o procedimento, observar os cui-
inclui não só a ocorrência de crescimento, mas dados descritos no Capítulo 2, para garantir que as
também o desenvolvimento ou não de caracterís- atividades sejam conduzidas sob condições assép-
ticas típicas do(s) microrganismo(s) alvo no meio ticas. Identificar todos os tubos que serão inocula-
utilizado. Além disso, a maioria dos ensaios exige dos, com o código da amostra, a diluição e a sigla
ainda uma ou mais etapas de confirmação, que é do meio de cultura contido.
feita transferindo-se a cultura obtida no primeiro a) Preparação das amostras e diluições. Seguir
meio inoculado, para outros meios de confirma- os procedimentos descritos no Capítulo 2.
ção. Por exemplo, em um dos métodos de ensaio b) Inoculação. Seguindo as orientações apresen-
de coliformes totais, as alíquotas são inoculadas tadas acima, selecionar três ou mais diluições
em Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), incuba- decimais sequenciais da amostra para a inocula-
das a 35 ºC/24h e verificada a ocorrência ou não ção. Inocular três alíquotas de cada diluição em
de crescimento com produção de gás. As culturas tubos do caldo de cultura, selecionando o caldo
obtidas nos tubos positivos para essas duas ca- de acordo com o ensaio a ser realizado (nos capí-
racterísticas são transferidas para o caldo Verde tulos específicos). Em alguns ensaios recomen-
Brilhante Bile 2% (VB), que é um meio seleti- da-se utilizar uma série de cinco alíquotas por di-
vo para coliformes totais. Após a incubação a 35 luição, sendo essa recomendação também men-
ºC/24h, é novamente verificada a ocorrência ou cionada nos capítulos específicos.Utilizar uma
não de crescimento com produção de gás. Apenas pipeta diferente para cada diluição. A incerteza
as culturas positivas para essas duas característi- da medição dos volumes não deve exceder 5%
cas, em VB, são confirmadas como coliformes to- (ISO 6887-1, 1999). Observar criteriosamente
tais. O caldo LST permite o crescimento de uma se os tubos utilizados correspondem à amostra
série de outros microrganismos produtores de gás e à diluição que estão sendo inoculadas. Mudar
que, no Caldo VB, são inibidos ou diferenciados os tubos de posição, à medida que sejam inocu-
dos coliformes totais. A inoculação não é feita di- ladas, para não inocular o mesmo tubo mais de
retamente em VB porque a presença de agentes uma vez ou deixar algum tubo sem inocular.
seletivos pode inibir os coliformes injuriados. A c) Incubação. Incubar os tubos nas condições es-
etapa inicial no LST garante a recuperação das pecificadas para o ensaio, nos capítulos espe-
injúrias, permitindo o crescimento posterior em cíficos.
condições seletivas. d) Verificação da presença do(s) microrganis-
mo(s) alvo nos tubos. A definição das caracte-
4.2.1. Material requerido nas rísticas a serem consideradas como indicação
da presença do(s) microrganismo(s) alvo nos
análises
tubos são definidas nos capítulos específicos.
□ Material para preparação da amostra e dilui- Essas características podem ser:
ções seriadas, descritos no Capítulo 2 d.1) Crescimento. O crescimento é verificado
□ Meios de cultura recomendados para o ensaio pela turvação do meio de cultura, desde que
a ser realizado, descritos nos capítulos especí- não provocada pela própria amostra. Nesse
ficos segundo caso, pode ser necessário um pro-
cedimento alternativo para confirmar o cres-
□ Estufa(s) incubadora ou banho(s) maria regu-
cimento. Um dos mais usados é transferir
lado(s) na(s) temperatura(s) especificada(s)
uma alçada do caldo suspeito para um novo
pelo ensaio a ser realizado, descrita(s) nos ca-

tubo do mesmo meio e verificar a turvação, preparação de diluições. Uma de suas principais
confirmativa do crescimento no primeiro. aplicações são a contagem de coliformes em água
d.2) Produção de gás. A produção de gás pode tratada e em sucos e refrigerantes.
ser verificada pela formação de bolhas em O procedimento padrão é a inoculação de cinco
tubos invertidos (tubos de Durham), colo- ou dez alíquotas de 10 ml das amostras líquidas
cados nos tubos de caldo antes da esterili- em 10 ml do caldo de cultura em concentração
zação. Na utilização dessa técnica é impor- dupla (50 a 100 ml no total), ou cinco ou dez alí-
tante verificar, previamente, se não houve quotas de 10 ml da primeira diluição das amostras
formação de pequenas bolhas nos tubos de sólidas, em 10 ml do caldo em concentração dupla
Durham, durante a estocagem do meio em (5 a 10g no total). Essas quantidades podem variar
geladeira. Essas bolhas são provocadas pelo dependendo da contaminação esperada na amos-
ar dissolvido no líquido e, se presentes, o tra, podendo ser inoculadas cinco ou dez porções
tubo deve ser descartado e substituído por de 100 ml em 100 ml de caldo em concentração
outro. Outra alternativa utilizada para veri- dupla, para amostras com nível mais baixo de
ficar a produção de gás é cobrir a superfície contaminação, ou cinco ou dez porções de 1 ml
do caldo com vaspar ou ágar selo, depois da em 10 ml de caldo em concentração simples, para
inoculação, verificando seu deslocamento amostras com nível mais alto de contaminação. A
para cima, quando há formação de gás. inoculação de cinco ou dez alíquotas com quanti-
d.3) Produção de ácido ou base. A produção de dades múltiplas de dez apresenta a vantagem de
ácido ou base pode ser verificada pela vira- ter os resultados tabelados em Tabelas de NMP.
gem de um indicador de pH adicionado ao Pode, entretanto, ser inoculado qualquer número
caldo de cultura (púrpura de bromocresol, de alíquotas, de qualquer quantidade, desde que
vermelho de fenol e outros). Outra alternati- todas sejam iguais e que a diluição seja de uma
va usada é medir o pH ou a acidez titulável parte da amostra adicionada em dez partes de cal-
do meio depois da incubação. do. Nesses casos, o cálculo dos resultados utiliza
d.4) Alteração do potencial redox. A alteração fórmulas, em vez das tabelas.
do potencial de óxido redução é verificada Assim como no teste de diluição múltipla, a sele-
pela viragem de aceptores de elétrons como ção do meio de cultura e a forma de verificação da
a rezarzurina, o azul de metileno e o cloreto presença do(s) microrganismo(s) alvo nas alíquo-
de trifeniltetrazólio. tas inoculadas encontra-se descrita nos capítulos
e) Transferências. A maioria dos ensaios que uti- específicos. Dependendo da complexidade dos
lizam a técnica do NMP exige a transferência testes de confirmação subsequentes, o formato
da cultura obtida nos tubos inoculados, para de cinco alíquotas pode ser mais vantajoso para
confirmação da presença do(s) microrganis- amostras com baixa contaminação, do que o de
mo(s) alvo. Apenas os tubos contendo culturas dez alíquotas ou o teste de diluição múltipla.
confirmadas são considerados como positivos
no cálculo do NMP. As transferências requeri- 4.3.1. Material requerido nas
das em cada ensaio encontram-se descritas nos análises
capítulos específicos. □ Material para preparação da amostra, descritos
no Capítulo 2
4.3. Teste de diluição única □ Meios de cultura recomendados para o ensaio
a ser realizado, descritos nos capítulos especí-
O teste de diluição única é mais utilizado para ficos
amostras com baixo nível de contaminação, para □ Estufa(s) incubadora(s) ou banho(s) maria re-
as quais não há necessidade nem se justifica a gulado(s) na(s) temperatura(s) especificada(s)

pelo ensaio a ser realizado, descrita(s) nos ca- binações que ocorrem com menor frequência são
pítulos específicos omitidas na tabulação e, nesses casos, o cálculo
do resultado pode ser feito através das fórmulas,
4.3.2. Procedimento mas é recomendável repetir antes o ensaio, para
Antes de iniciar o procedimento, observar os cui- confirmar a ocorrência da combinação.
dados descritos no Capítulo 2, para garantir que as
4.4.1. Cálculo dos resultados do
atividades sejam conduzidas sob condições assép-
teste de diluição múltipla
ticas. Identificar todos os tubos que serão inocu-
lados, com o código da amostra e a sigla do meio 4.4.1.1. Cálculo usando as tabelas de
de cultura contido. NMP (para diluições decimais)
a) Preparação das amostras. Seguir os procedi- A Tabela NMP-1 do Anexo 4.1 apresenta os resul-
mentos descritos no Capítulo 2. tados de uma série de três tubos inoculados com
b) Inoculação. Seguindo as orientações apresen- alíquotas de 0,1 – 0,01 e 0,001g ou ml da amos-
tadas acima, selecionar as quantidades mais tra. A Tabela NMP-2 do Anexo 4.1 apresenta os
adequadas da amostra para a inoculação. Ino- resultados de uma série de cinco tubos inocula-
cular cinco ou dez alíquotas da amostra em dos com as mesmas alíquotas. Para outras alíquo-
cinco a dez tubos ou frascos do caldo de cultu- tas, são usadas as mesmas tabelas, com um fator
ra, adicionando uma parte da alíquota para dez de conversão para multiplicar ou dividir o valor
partes do caldo. Selecionar o caldo de acordo lido, em função do tamanho das alíquotas inocu-
com o ensaio a ser realizado (nos capítulos es- ladas. Observar que as diluições são decimais e
pecíficos). A incerteza da medição dos volu- que as tabelas utilizam a quantidade da amostra
mes não deve exceder 5% (ISO 6887-1, 1999). nas alíquotas, não a diluição inoculada. Assim,
Mudar os tubos ou frascos de posição, à medi- para facilitar o uso, o Quadro 4.1 abaixo apresen-
da que sejam inoculadas, para não inocular o ta a correspondência entre diluições inoculadas e
mesmo tubo/frasco mais de uma vez ou deixar quantidade de amostra nas alíquotas, bem como o
algum tubo/frasco sem inocular. fator de conversão do resultado quando as alíquo-
c) Incubação. Incubar os tubos nas condições estas são diferentes das tabeladas. Além da estima-
pecificadas para o ensaio, descritas nos capítu- tiva do NMP/g ou ml da amostra, as tabelas de
los específicos. NMP também apresentam, para cada combinação
d) Verificação da presença do(s) microrga- de tubos positivos e negativos, o limite superior e
nismo(s) alvo nos tubos. Seguir as mesmas o limite inferior da estimativa do NMP, ao nível
orientações do teste de diluição múltipla. de 95% de confiança. Esse é intervalo em que se
e) Transferências. Seguir as mesmas orientações encontra a contagem verdadeira (mas desconheci-
do teste de diluição múltipla. da) dos microrganismos na amostra, em 95% das
vezes.
As regras para o cálculo dos resultados, com
4.4. Cálculo dos resultados exemplos no Quadro 4.2 são:
A combinação de tubos positivos e negativos na Regra 1 – Se as três diluições inoculadas cor-
técnica do NMP permite estimar, por cálculo de respondem às alíquotas tabeladas, o resultado
probabilidade, a densidade do(s) microrganis- é lido diretamente na linha correspondente à
mo(s) alvo na amostra. Os cálculos podem ser fei- combinação de tubos positivos obtida (Exem-
tos usando várias fórmulas, mas, para as para as plos 1 e 8 do Quadro 4.2).
combinações de tubos positivos e negativos que Regra 2 – Se as três diluições inoculadas não cor-
ocorrem com maior frequência, os valores já fo- respondem às alíquotas tabeladas, o resultado
ram calculados e tabulados em tabelas de NMP, lido na linha correspondente à combinação de
não sendo necessário o uso de fórmulas. As com-

Quadro 4.1. Orientação para o uso das tabelas de NMP, em função da quantidade de amostra presente
nas alíquotas e das diluições inoculadas, com o limite de detecção da contagem e a regra para con-
versão do resultado.
Quantidade de amostra Limite de detecção Fator de conversão do
Combinação de diluições*
nas alíquotas (g ou ml) (por g ou ml da amostra) resultado na Tabela
1 S/D (100 ml) - S/D (10 ml) - SD (1 ml) 100 – 10 – 1 0,003 dividir por 1.000
2 S/D (10 ml) - S/D (1 ml) - 10-1 (1 ml) 10 – 1 – 0,1 0,03 dividir por 100
-1 -2
3 S/D (1 ml) - 10 (1 ml) - 10 (1 ml) 1 – 0,1 – 0,01 0,3 dividir por 10
4 10-1 (10 ml) – 10-1 (1 ml) – 10-2 (1 ml) 1 – 0,1 – 0,01 0,3 dividir por 10
5 10-1 (1 ml) – 10-2 (1 ml) – 10-3 (1 ml) 0,1 – 0,01 – 0,001 3 direto
6 10-2 (1 ml) – 10-3 (1 ml) - 10-4 (1 ml) 0,01 – 0,001 – 0,0001 30 multiplicar por 10
7 10-3 (1 ml) - 10-4 (1 ml) - 10-5 (1 ml) 0,001 – 0,0001 - 0,00001 300 multiplicar por 100
*Entre parênteses o volume inoculado da diluição, onde SD = sem diluição (combinação restrita à amostras líquidas).
tubos positivos deve ser convertido segundo o consecutivas que tenham os tubos positivos na
fator de conversão do Quadro 4.1 (Exemplos 2 do meio (Exemplos 5 e 12 do Quadro 4.2).
e 9 do Quadro 4.2). 3.c. Se uma diluição apresentar número de tubos
Regra 3 – Se mais de três diluições foram inocu- positivos maior ou igual ao da diluição ante-
ladas, valem as regras um e dois, mas apenas rior, somar esse número ao da diluição anterior,
três diluições consecutivas são consideradas. desconsiderando a posterior (Exemplos 6 e 13
3.a. Se mais de uma diluição apresentar todos do Quadro 4.2).
os tubos positivos, a combinação considerada 3.d. Se todas as diluições apresentarem todos os
deve conter a maior diluição (menor alíquota) tubos positivos, considerar as três últimas dilui-
com todos os tubos positivos e as duas conse- ções consecutivas (maiores diluições, menores
cutivas (Exemplos 3, 4, 10 e 11 do Quadro 4.2). alíquotas) (Exemplos 7 e 14 do Quadro 4.2).
3.b. Se nenhuma das diluições apresentou todos
os tubos positivos, considerar as três primeiras
Quadro 4.2. Exemplos de cálculo dos resultados usando as tabelas de NMP.
Regra Número de tubos positivos nas alíquotas (g ou ml) Combinação

Exemplo Resultado
utilizada 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 considerada
Série de três tubos (Tabela NMP-1)
1 1 3 2 0 NI* NI* 3-2-0 93 = 9,3x101
2 2 NI* 3 2 0 NI* 3-2-0 93x10 = 9,3x102
3 3a, 2 3 3 2 0 0 3-2-0 93x10 = 9,3x102
4 3a, 2 3 3 3 2 0 3-2-0 93x100 = 9,3x103
5 3b, 2 0 0 1 0 0 0-1-0 3x10 = 3,0x101
6 3c, 2 3 3 2 1 1 3-2-2 210x10 = 2,1x103
7 3d, 2 3 3 3 3 3 3-3-3 >1.100x100 = >1,1x105
Série de cinco tubos (Tabela NMP-2)
8 1 5 2 0 NI* NI* 5-2-0 49 = 4,9x101
9 2 NI* 5 2 0 NI* 5-2-0 49 x 10 = 4,9x102
10 3a, 2 5 5 2 0 0 5-2-0 49 x 10 = 4,9x102
11 3a, 2 5 5 5 2 0 5-2-0 49 x 100 = 4,9x103
12 3b, 2 0 0 1 0 0 0-1-0 1,8 x10 =1,8x101
13 3c, 2 5 5 3 1 1 5-3-2 140x10 = 1,4x103
14 3d, 2 5 5 5 5 5 5-5-5 >1.600x100 = >1,6x105
*NI = Não inoculado.

4.4.1.2. Cálculo usando a fórmula de Alíquota 8g 4g 2g 1g 0,5g 0,25g

Thomas (para diluições não decimais) Nº de tubos
5 4 2 0 1 0
positivos em 5
Thomas (1942) publicou uma fórmula simplifi- P = 5 + 4 + 2 + 1 = 12
cada de cálculo do NMP, que pode ser utilizada N = (1 x 4) + (3 x 2) + (5 x 1) + (4 x 0,5) + (5 x 0,25) =
para calcular os resultados de amostras inocula- 18,25g
das em diluições não decimais. Pode ser também T = (5 x 8) + (5 x 4) + (5 x 2) (5 x 1) + (5 x 0,5) (5 x 0,25)
= 78,75g
utilizada para amostras inoculadas com diluições
NMP/g = 12 /√ (18,25) x (7875) = 0,32
decimais, porém, cujos resultados foram omitidos
das tabelas de NMP. O cálculo pela fórmula per- 4.4.1.3. Cálculo dos resultados para
mite considerar todas as diluições inoculadas, não amostras preparadas pela técnica
apenas três. Os resultados podem não concordar do esfregaço de superfície ou da
exatamente com os da fórmula de Halvorson & lavagem superficial
Ziegler (1933), mais usada na construção de ta-
É feito da mesma forma descrita para a contagem
belas de NMP, mas a diferença é pequena e sem
em placas, porém, onde se lê UFC deve-se subs-
consequências práticas. A fórmula é a seguinte:
tituir por NMP e, onde se lê contagem em placas
NMP/g ou ml = P / √ NT substituir por contagem pela técnica do NMP.
onde 4.4.2. Cálculo dos resultados do

P = Número de tubos positivos
N = Soma da quantidade de amostra inoculada em todos os teste de diluição única
tubos negativos
T = Soma da quantidade de amostra inoculada em todos os Para a distribuição de dez alíquotas de 10g ou ml
tubos da amostra, pode ser utilizada a Tabela NMP-3 do
Anexo. Para a distribuição de cinco alíquotas de
Exemplo 1. Considere as alíquotas e a combina- 20g ou ml da amostra, pode ser utilizada a Tabela
ção de tubos positivos e negativos na série de NMP-4 e para cinco alíquotas de 10g ou ml, a
três tubos abaixo: Tabela NMP-5. Considerando que o teste de dilui-
Alíquota 0,1g 0,01g 0,001g ção única é aplicável principalmente para amos-
Nº de tubos positivos em 3 0 2 0
tras líquidas com baixa contaminação, as tabelas
P=2 apresentam o resultado em NMP/100 ml da amos-
N = (3 x 0,1) + (1 x 0,01) + (3 x 0,001) = 0,313g
tra. Não há, entretanto, restrição ao seu uso para
T = (3 x 0,1) + (3 x 0,01) + (3 x 0,001) = 0,333g
NMP/g = 2 / √ (0,313) x (0,333) = 6,2 amostras sólidas, se foram inoculadas as mesmas
alíquotas, por exemplo, 10 x 100 ml da diluição
Exemplo 2. Considere as alíquotas e a combina- 10-1 em 100 ml de caldo concentração dupla ou
ção de tubos positivos e negativos na série de inoculação direta de 10 x 10g da amostra no caldo
cinco tubos abaixo: (se aplicável).
Alíquota 0,1g 0,01g 0,001g Para outras distribuições pode ser utilizada a fór-
Nº de tubos positivos em 5 0 2 0
mula abaixo, retirada do Bacteriological Analyti-
P=2 cal Manual (Blodgett, 2010).
N = (5 x 0,1) + (3 x 0,01) + (5 x 0,001) = 0,535g
T = (5 x 0,1) + (5 x 0,01) + (5 x 0,001) = 0,555g
NMP/g ou ml = (1/z) x 2,303 x Log10 (t/n)
NMP/g = 2 / √ (0,353) x (0,555) = 3,7
Exemplo 3. Considere as alíquotas de diluições onde

z = peso ou volume de amostra por alíquota
1:2 e a combinação de tubos positivos e nega- t = número total de alíquotas inoculadas
tivos na série de cinco tubos abaixo: n = número de alíquotas negativas.

► Regras para o cálculo usando a Tabela Regra 3 – Para converter o resultado de NMP/100
NMP-3 ml ou g para NMP/ ml ou g, basta dividir o valor
Regra 1 – Para determinar o NMP/100 ml ou g, por 100.
na inoculação de 10 x 10 ml ou g, basta ler o valor Exemplo 5. Inoculados 10 x 1 ml da amostra e
na linha correspondente ao número de tubos posi- obtidos nove tubos positivos - NMP/100 ml
tivos obtido. = 23x10 = 2,3x102 e NMP/ ml = 2,3
Exemplo 1. Inoculados 10 x 10 ml da amostra e
obtidos cinco tubos positivos - NMP/100 ml = ► Cálculo pela fórmula
6,9 O cálculo é muito simples, conforme exemplo
Exemplo 2. Inoculadas 10 x 10g da amostra e ob- abaixo:
tidos três tubos positivos - NMP/100g = 3,6 Exemplo 6. Inoculadas cinco alíquotas de 25g e
obtidos dois frascos positivos
Regra 2 – Para determinar o resultado da inocu-
lação de dez alíquotas com quantidade diferente z = 25, t = 5, n = 3 – NMP/g = (1/25) x 2,303 x
de 10g ou ml, mas ainda múltiplas de dez, basta Log10(5/3) = 0,02 ou NMP/100g = 2
multiplicar (se a quantidade for menor que dez)
ou dividir (se a quantidade for maior que dez) o ► Cálculo para amostras preparadas
valor lido na Tabela NMP-3. pela técnica do esfregaço de superfície
Exemplo 3. Inoculadas 10 x 1g da amostra e obti- ou da lavagem superficial
dos nove tubos positivos - NMP/100g = 23x10 Para calcular os resultados de amostras prepara-
= 2,3x102 das pela técnica do esfregaço de superfície ou da
Exemplo 4. Inoculadas 10 x 100g da amostra e lavagem superficial, seguir a mesma orientação
obtidos nove frascos positivos - NMP/100g = do teste de diluição múltipla.
23/10 = 2,3
4.5. Referências
BLODGETT, R., 2010. Appendix 2 - Most Probable Number Part 1: General rules for the preparation of the initial
from Serial Dilutions. In: US FOOD AND DRUG AD- suspension and decimal dilutions, 1 st ed. The Interna-
MINISTRATION (FDA), Bacteriological Analytical tional Organization for Standardization, 1999.
Manual. Revision February 2006. [Online] Disponível PETRAN, R.L., GRIEME, L.E., FOONG-CUNNINGHAM,
no site: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceRese- S., 2015. Culture methods for enumeration of micro-
arch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm [acesso em organisms. In: SALFINGER, Y. & TORTORELLO,
17/03/2017]. M.L. (eds.), Compendium of Methods for the Micro-
GREENBERG A. E., TRUSSEL R. R., CLESCERI L.S. biological Examination of Foods, 5 th ed. Washington:
(Eds.). Standard Methods for the Examination of Wa- American Public Health Association (APHA). Chapter
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Works Association (AWWA), Water Pollution Control L.S. (Eds). Standard Methods for the Examination of
Federation (WPCF), 1985. Water & Wastewater, 22 nd Ed. Washington, D.C.: Ame-
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Bacteriology 25:101-121. ment Federation (WEF), 2012.
ISO 6887-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs THOMAS, H.A., 1942. Bacterial densities from fermenta-
– Preparation of test samples, initial suspension and tion tube tests. Journal of The American Water Works
decimal dilutions for microbiological examination – Association 34:572-576.

Anexo 4.1.
Tabelas de NMP
Tabela NMP-1. Número Mais Provável (NMP) e intervalo de confiança a nível de 95% de probabili-
dade, para diversas combinações de tubos positivos em série de três tubos. Quantidade inoculada da
amostra: 0,1 - 0,01 e 0,001g ou ml.
Combinação de Intervalo de confiança (95%) Combinação de Intervalo de confiança (95%)
NMP/g ou ml NMP/g ou ml
tubos + Mínimo Máximo tubos + Mínimo Máximo
0-0-0 <3,0 - 9,5 2-2-0 21 4,5 42
0-0-1 3,0 0,15 9,6 2-2-1 28 8,7 94
0-1-0 3,0 0,15 11 2-2-2 35 8,7 94
0-1-1 6,1 1,2 18 2-3-0 29 8,7 94
0-2-0 6,2 1,2 18 2-3-1 36 8,7 94
0-3-0 9,4 3,6 38 3-0-0 23 4,6 94
1-0-0 3,6 0,17 18 3-0-1 38 8,7 110
1-0-1 7,2 1,3 18 3-0-2 64 17 180
1-0-2 11 3,6 38 3-1-0 43 9 180
1-1-0 7,4 1,3 20 3-1-1 75 17 200
1-1-1 11 3,6 38 3-1-2 120 37 420
1-2-0 11 3,6 42 3-1-3 160 40 420
1-2-1 15 4,5 42 3-2-0 93 18 420
1-3-0 16 4,5 42 3-2-1 150 37 420
2-0-0 9,2 1,4 38 3-2-2 210 40 430
2-0-1 14 3,6 42 3-2-3 290 90 1.000
2-0-2 20 4,5 42 3-3-0 240 42 1.000
2-1-0 15 3,7 42 3-3-1 460 90 2.000
2-1-1 20 4,5 42 3-3-2 1.100 180 4.100
2-1-2 27 8,7 94 3-3-3 >1.100 420 -
Fonte: Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2010).

Tabela NMP-2. Número Mais Provável (NMP) e intervalo de confiança a nível de 95% de probabilida-
de, para diversas combinações de tubos positivos em série de cinco tubos. Quantidade inoculada da
amostra: 0,1 - 0,01 e 0,001g ou ml.
Combinação Intervalo de confiança (95%) Combinação Intervalo de confiança (95%)
NMP/g ou ml NMP/g ou ml
de tubos + Mínimo Máximo de tubos + Mínimo Máximo
0-0-0 <1,8 - 6,8 4-0-3 25 9,8 70
0-0-1 1,8 0,09 6,8 4-1-0 17 6 40
0-1-0 1,8 0,09 6,9 4-1-1 21 6,8 42
0-1-1 3,6 0,7 10 4-1-2 26 9,8 70
0-2-0 3,7 0,7 10 4-1-3 31 10 70
0-2-1 5,5 1,8 15 4-2-0 22 6,8 50
0-3-0 5,6 1,8 15 4-2-1 26 9,8 70
1-0-0 2 0,1 10 4-2-2 32 10 70
1-0-1 4 0,7 10 4-2-3 38 14 100
1-0-2 6 1,8 15 4-3-0 27 9,9 70
1-1-0 4 0,7 12 4-3-1 33 10 70
1-1-1 6,1 1,8 15 4-3-2 39 14 100
1-1-2 8,1 3,4 22 4-4-0 34 14 100
1-2-0 6,1 1,8 15 4-4-1 40 14 100
1-2-1 8,2 3,4 22 4-4-2 47 15 120
1-3-0 8,3 3,4 22 4-5-0 41 14 100
1-3-1 10 3,5 22 4-5-1 48 15 120
1-4-0 11 3,5 22 5-0-0 23 6,8 70
2-0-0 4,5 0,79 15 5-0-1 31 10 70
2-0-1 6,8 1,8 15 5-0-2 43 14 100
2-0-2 9,1 3,4 22 5-0-3 58 22 150
2-1-0 6,8 1,8 17 5-1-0 33 10 100
2-1-1 9,2 3,4 22 5-1-1 46 14 120
2-1-2 12 4,1 26 5-1-2 63 22 150
2-2-0 9,3 3,4 22 5-1-3 84 34 220
2-2-1 12 4,1 26 5-2-0 49 15 150
2-2-2 14 5,9 36 5-2-1 70 22 170
2-3-0 12 4,1 26 5-2-2 94 34 230
2-3-1 14 5,9 36 5-2-3 120 36 250
2-4-0 15 5,9 36 5-2-4 150 58 400
3-0-0 7,8 2,1 22 5-3-0 79 22 220
3-0-1 11 3,5 23 5-3-1 110 34 250
3-0-2 13 5,6 35 5-3-2 140 52 400
3-1-0 11 3,5 26 5-3-3 180 70 400
3-1-1 14 5,6 36 5-3-4 210 70 400
3-1-2 17 6 36 5-4-0 130 36 400
3-2-0 14 5,7 36 5-4-1 170 58 400
3-2-1 17 6,8 40 5-4-2 220 70 440
3-2-2 20 6,8 40 5-4-3 280 100 710
3-3-0 17 6,8 40 5-4-4 350 100 710
3-3-1 21 6,8 40 5-4-5 430 150 1.100
3-3-2 24 9,8 70 5-5-0 240 70 710
3-4-0 21 6,8 40 5-5-1 350 100 1.100
3-4-1 24 9,8 70 5-5-2 540 150 1.700
3-5-0 25 9,8 70 5-5-3 920 220 2.600
4-0-0 13 4,1 35 5-5-4 1.600 400 4.600
4-0-1 17 5,9 36 5-5-5 >1.600 700 -
4-0-2 21 6,8 40
Fonte: Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2010).

Tabela NMP-3. Número Mais Provável (NMP) e intervalo de confiança a nível de 95% de probabilida-
de, para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 10 alíquotas de 10g
ou ml da amostra por tubo.
Intervalo de confiança (95%)

Número de tubos positivos NMP/100 ml
Mínimo Máximo
0 <1,1 - 3,3
1 1,1 0,05 5,9
2 2,2 0,37 8,1
3 3,6 0,91 9,7
4 5,1 1,6 13
5 6,9 2,5 15
6 9,2 3,3 19
7 12 4,8 24
8 16 5,9 33
9 23 8,1 53
10 >23 12 -
Fonte: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 22nd ed. (Rice et al., 2012).
dade, para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de cinco alíquotas de
20g ou ml da amostra por tubo.

Mínimo Máximo
0 <1,1 - 3,5
1 1,1 0,051 5,4
2 2,6 0,40 8,4
3 4,6 1,0 13
4 8,0 2,1 23
5 >8,0 3,4 -
Fonte: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 22nd ed. (Rice et al., 2012).
dade, para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de cinco alíquotas de
10g ou ml da amostra por tubo.

Mínimo Máximo
0 <2,2 0 6,0
1 2,2 0,1 12,6
2 5,1 0,5 19,2
3 9,2 1,6 29,4
4 16,0 3,3 52,9
5 >16,0 8,0 -
Fonte: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 16th ed. (Greenberg et al., 1985).

5 Técnicas básicas de detecção
da presença/ausência de
microrganismos
Item 5.3.e.1 (corrigido) – pequenas correções no procedimento de coloração de Gram.
Item 5.3.e.2 (novo) – inserido teste do KOH para confirmação da coloração de Gram duvidosa.
Item 5.3.e.4 (corrigido) – pequenas correções no método de Ashby para coloração de esporos.
5.1. Introdução de presença/ausência, por três razões. A primeira

é que a população dos patógenos nas amostras é
As orientações contidas nesse capítulo são da normalmente baixa (muito abaixo do limite de de-
American Public Health Association (APHA), tecção da contagem em placas), sendo necessário
descritas nos Capítulos 4 e 5 da 5ª edição do Com- elevar o número de células a quantidades detec-
pendium of Methods for Microbiological Exami- táveis. Não é incomum produtos com população
nation of Foods (Brehm-Stecher & Tortorello, menor do que uma célula por 100g e há casos de
2015, Sperber et al., 2015). detecção de quantidades tão baixas como uma cé-
Vários ensaios utilizados na análise de alimentos lula por 500g do produto. A segunda razão é que,
são qualitativos (presença/ausência), incluindo os na maioria dos alimentos industrializados, as cé-
de Salmonella, Listeria monocytogenes, Yersinia lulas do microrganismo alvo estão injuriadas pelo
enterocolitica, Campylobacter, Escherichia coli processamento, sendo necessária a reparação das
O157:H7, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemoly- injúrias. Células injuriadas exigem um período de
ticus e Vibrio vulnificus. Todos utilizam as mes- tempo em condições ótimas de crescimento, para
mas técnicas microbiológicas básicas, que são o reativação das vias metabólicas responsáveis pela
enriquecimento em um ou mais caldos específi- multiplicação. A terceira razão é que, normal-
cos e o posterior isolamento em meios sólidos. mente, a microbiota competidora nas amostras se
A principal razão para que esses ensaios sejam encontra em número muito maior do que o mi-
qualitativos é a etapa de enriquecimento, que di- crorganismo alvo, sendo necessário inibir o cres-
ficulta a quantificação, embora seja possível, se cimento dessa população, para que o alvo tenha
indispensável, utilizar a técnica do NMP nesses oportunidade de se multiplicar.
casos. Para tanto, é necessário repetir o mesmo O enriquecimento pode incluir uma ou mais eta-
ensaio de presença/ausência para várias alíquotas pas, dependendo do microrganismo alvo. Nos
da mesma amostra, sendo pelo menos nove, num ensaios de Salmonella e Listeria monocytogenes,
teste de diluição múltipla ou cinco, num teste de por exemplo, é feito em duas etapas. Nos ensaios
diluição única. Em função disso, a quantificação de Vibrio cholerae e Yersinia enterocolitica é feito
se torna excessivamente trabalhosa e dispendiosa, em apenas uma. Quando há duas etapas é comum
não sendo necessária e nem justificável, na maio- chamar a primeira de pré-enriquecimento ou en-
ria das situações. riquecimento primário e a segunda de enriqueci-
mento seletivo.
Enriquecimento ► O pré-enriquecimento tem por objetivo a
O enriquecimento é uma etapa crítica nos ensaios reparação de células injuriadas, oferecendo con-

dições para a sua recuperação, porém, sem favo- quecimento seletivo. Esse é o caso, por exemplo,
recer demasiadamente a microbiota competidora. do ensaio para Salmonella, que utiliza dois caldos.
De maneira geral, células injuriadas não crescem
em condições altamente seletivas, por isso, os cal- Isolamento em meios sólidos
dos de pré-enriquecimento normalmente são não (plaqueamento diferencial)
seletivos ou moderadamente seletivos. O pH do
meio deve estar na faixa ótima de crescimento do Uma vez conseguida a multiplicação no(s) cal-
alvo e, após a inoculação de produtos ácidos, deve do(s) de enriquecimento, é necessário diferenciar
ser ajustado para retornar ao ótimo, se houver al- e separar o microrganismo alvo da microbiota
teração. Para microrganismos que têm pH ótimo competidora. Isso é feito na etapa de isolamento
fora da faixa neutra (Vibrio cholerae, por exem- em meios sólidos, que permite também a obten-
plo, com ótimo na faixa alcalina), o pH do caldo ção de culturas puras, para utilização em testes de
pode oferecer uma vantagem competitiva em rela- confirmação da identidade. De maneira geral, os
ção à microbiota acompanhante. A temperatura de meios de isolamento são seletivos e diferenciais,
incubação também deve estar na faixa ótima, mas para suprimir parte da microbiota competidora e
o tempo de incubação deve ser apenas o suficiente distinguir o alvo da remanescente.
para a reparação das injúrias. Durante a fase de Os agentes seletivos usados em meios sólidos são
reparação, a multiplicação das células injuriadas os mesmos usados nos meios líquidos de enrique-
é mínima e, se a incubação for prolongada além cimento, selecionados em função do ensaio. Os
do necessário, a população competidora pode au- agentes diferenciais mais usados são os indicado-
mentar demasiadamente, dificultando ou impe- res de pH, para diferenciar os microrganismos que
dindo a posterior detecção do alvo. produzem dos que não produzem ácido ou base
► O enriquecimento seletivo objetiva inibir a durante o crescimento. Os indicadores de pH mu-
microbiota competidora presente nas amostras, dam de cor em determinadas faixas de pH e os
favorecendo a multiplicação do microrganismo mais utilizados em meios de cultura são o verme-
alvo. Isso é conseguido através da utilização de lho de fenol e o púrpura de bromocresol. Os indi-
agentes seletivos e/ou condições restritivas para a cadores de sulfeto de hidrogênio (H2S) também
microbiota competidora, que podem ser: o pH do são bastante usados, para diferenciar os micror-
meio de cultura, a temperatura e/ou atmosfera de ganismos que produzem dos que não produzem
incubação, a adição de antibióticos (polimixina B, esse composto no metabolismo de aminoácido
ampicilina, moxalactam, novobiocina, D-ciclose- sulfurados. Os indicadores de H2S são compostos
rina, oxitetraciclina, vancomicina, trimetoprima, de ferro como o citrato férrico, o citrato férrico
cicloeximida) e a adição de compostos químicos amoniacal ou o sulfato férrico amoniacal. Ao rea-
(verde brilhante, selenito de sódio, sais biliares, gir com o H2S, é produzindo sulfeto de ferro, um
telurito de potássio, lauril sulfato de sódio). A composto preto e solúvel que se difunde e pro-
composição nutricional do meio deve ser ótima voca o escurecimento do meio de cultura. Outros
e, se possível, conter nutrientes utilizados prefe- agentes diferenciais são a gema de ovo, para dife-
rencialmente pelo alvo, como fontes de carbono renciar os microrganismos que produzem dos que
não comuns (D-manose, sorbitol, citrato de sódio, não produzem enzimas lipolíticas, a esculina, para
por exemplo). Nem sempre os caldos de enrique- diferenciar os microrganismos que hidrolizam dos
cimento seletivo conseguem um balanceamento que não hidrolizam esse composto e o sangue,
ideal entre a necessidade de inibir os competido- para diferenciar os microrganismos que produzem
res sem inibir o microrganismo alvo. Eventual- dos que não produzem hemólise.
mente, algumas cepas do alvo podem ser sensíveis Assim como no enriquecimento seletivo, algumas
às condições seletivas presentes e, nesses casos, é cepas do alvo podem ser sensíveis às condições
comum a utilização de mais de um meio de enri- seletivas dos meios de plaqueamento. Nesses ca-

Técnicas básicas de detecção da presença/ausência de microrganismos □ 65
sos, é comum a utilização de mais de um meio, carbono para crescimento. No teste, a única fonte
como é o caso do ensaio de Salmonella, por exem- de carbono disponível no meio de cultura é o ci-
plo, que utiliza dois ou três. trato. Se a bactéria dispõe do aparato metabólico
necessário à assimilação do citrato, ocorrerá mul-
Confirmação tiplicação. O crescimento pode ser observado vi-
sualmente, pelo acúmulo de massa celular ou por
Essa etapa objetiva confirmar a identidade da cul-
viragem de indicador de pH. Em caso negativo,
tura isolada, através de testes que verificam ca-
não haverá crescimento.
racterísticas típicas do(s) microrganismo(s) alvo.
Testes de descarboxilação de aminoácidos.
As características mais usadas na confirmação são
Objetivam verificar se a bactéria é capaz de des-
as morfológicas, as bioquímicas e as sorológicas.
carboxilar aminoácidos formando aminas, com a
As características morfológicas incluem princi- consequente alcalinização do meio de cultura. A
palmente a forma das células (cocos, bastonetes descarboxilação é dependente da disponibilidade
retos, bastonetes curvos, helicoidais), o arranjo de enzimas de descarboxilação, específicas para
das células (isoladas, em pares, em tétrades, em cada aminoácido. Apenas os aminoácidos que
cadeias, em cachos, em filamentos) a coloração de apresentam pelo menos um grupo químico ativo,
Gram, a motilidade e a formação de esporos. As além dos grupos amina e carboxila, são passíveis
características sorológicas incluem principalmen- de descarboxilação A disponibilidade de uma ou
te a verificação da presença dos antígenos somáti- mais descarboxilases varia entre as espécies e re-
cos “O” da parede celular e dos antígenos flagela- presenta uma característica útil na diferenciação.
res “H”. As características bioquímicas dependem As descarboxilases mais utilizadas em testes de
do microrganismo alvo e são apresentadas nos ca- identificação são a arginina, lisina e ornitina des-
pítulos específicos. Os testes mais utilizados são carboxilases, enzimas indutíveis produzidas pelas
os descritos abaixo (Silva, 1996): bactérias apenas na presença dos respectivos ami-
Teste de catalase. Objetiva verificar se a bactéria noácidos e em condições ácidas. O metabolismo
é capaz de produzir a enzima catalase, responsá- de descarboxilação é um processo anaeróbio que
vel pela decomposição do peróxido de hidrogênio resulta em cadaverina e CO2 a partir da lisina e pu-
(H2O2). O peróxido de hidrogênio (água oxigena- trescina e CO2 a partir da ornitina. O metabolismo
da) é um metabólito formado durante a utilização da arginina é mais complexo e envolve duas vias
aeróbica dos carboidratos. É tóxico e pode pro- metabólicas que podem operar simultânea ou se-
vocar a morte das células se não for rapidamen- paradamente: a via da arginina descarboxilase e a
te decomposto. A decomposição desse material via da arginina dehidrolase. Na via da descarboxi-
ocorre através da ação das enzimas classificadas lase, a arginina é inicialmente degradada a agma-
como hidroperoxidases, que incluem a peroxidase tina que, por sua vez, será posteriormente degra-
e a catalase (peróxido de hidrogênio redutase). A dada a putrescina e uréia, pela enzima agmatinase.
maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias facul- Nas bactérias urease positivas, a uréia ainda será
tativas que contêm citocromo também apresen- degradada a duas moléculas de amônia. Na via da
tam catalase. A maioria das bactérias anaeróbias, dehidrolase, a arginina é inicialmente degradada a
como Clostridium sp, por exemplo, possuem pero- L-citrulina que, por sua vez, será posteriormente
xidase em lugar da catalase. As bactérias que não degradada a L-ornitina, CO2 e NH3, pela enzima
apresentam catalase ou peroxidase não são capazes citrulina ureidase. Independente de qual via seja
de decompor o peróxido de hidrogênio, tendo seu utilizada pela bactéria no metabolismo da argini-
crescimento inibido pelo acúmulo desse produto na, os produtos finais do processo serão alcalinos
do seu próprio metabolismo. e produzirão o mesmo resultado no teste.
Teste de citrato. Objetiva verificar se a bactéria Teste de fenilalanina deaminase. Objetiva veri-
é capaz de utilizar o citrato como única fonte de ficar se a bactéria é capaz de desaminar o amino-

ácido fenilalanina. A desaminação ocorre na pre- triptofanase, que desamina o triptofano resultan-
sença de oxigênio, sob a ação de uma aminoácido do em indol, ácido pirúvico, amônia e energia.
oxidase, flavoproteína que catalisa a conversão de O indol liberado para o meio de cultura pode ser
uma molécula de fenilalanina em uma molécula detectado por uma reação química com o aldeído
de ácido fenilpirúvico e uma molécula de amônia. presente no reagente de Kovacs para teste de in-
O ácido fenilpirúvico pode ser detectado no meio dol (p-dimetilamino benzaldeído), que resulta em
de cultura através da adição do cloreto férrico, produtos de condensação coloridos. Esses com-
que reage com o ácido fenilpirúvico formando um postos, de cor vermelho-violeta, ficam concentra-
produto colorido, a fenilhidrazona. dos na fase alcoólica do reagente, formando um
Testes de fermentação de carboidratos. Obje- anel na superfície do meio de cultura líquido.
tivam verificar se a bactéria é capaz de fermentar Teste de malonato. Objetiva verificar se a bacté-
determinados carboidratos, produzindo ácido com ria é capaz de utilizar o malonato de sódio como
ou sem gás. Vias metabólicas de fermentação de fonte de carbono para crescimento, com resultante
diferentes carboidratos são características das es- alcalinização do meio de cultura. O malonato é um
pécies, sendo um dos caracteres de fenótipo mais composto que apresenta a característica de inibir a
utilizados na identificação de bactérias. Os pro- atividade da enzima succinato desidrogenase, es-
cessos fermentativos são sequências de reações sencial à atividade metabólica das bactérias para
de óxido-redução que transformam a glucose em a produção de energia. Dependendo da concentra-
um ou mais compostos de carbono, gerando ener- ção do malonato presente, a multiplicação dos mi-
gia no final. O tipo(s) de produto(s) final(ais) da crorganismos pode ser parcial ou completamente
oxidação da glucose, ou seja, o tipo de fermen- inibida, a menos que as células sejam capazes de
tação, varia de espécie para espécie bacteriana, utilizar o próprio malonato como fonte de car-
incluindo ácidos, álcoois, CO2 e H2. A entrada de bono e energia. Quando uma bactéria é capaz de
um carboidrato diferente da glucose nos proces- utilizar o malonato, também é capaz de utilizar o
sos fermentativos depende da capacidade de cada sulfato de amônia como única fonte de nitrogê-
espécie para introduzir o carboidrato na célula, nio, gerando como produto final de metabolismo
convertê-lo em glucose e então realizar a fermen- o hidróxido de sódio. Assim, adicionando-se sul-
tação. O termo carboidratos, de maneira geral, in- fato de amônia ao meio de cultura, as bactérias
clui os compostos abaixo, além do inositol, que é malonato-positivas provocarão uma elevação do
um composto não-derivado de carboidratos, po- pH do meio, pelo acúmulo de hidróxido de sódio.
rém, também testado nos ensaios de fermentação: Essa alcalinização pode ser detectada pelo azul de
bromotimol, um indicador de pH com ponto de
▪ Monossacarídeos: Eritritose (tetrose), Ribose,
viragem em 7,6.
Xilose, Arabinose (pentoses), Glucose, Fruto-
Teste de oxidação/fermentação (O/F). Objetiva
se, Galactose (hexoses)
verificar o tipo de metabolismo de carboidratos
▪ Dissacarídeos: Maltose (glucose + glucose),
utilizado pela bactéria ou a não utilização de car-
Sacarose (glucose + frutose), Lactose (glucose
boidratos. A utilização de carboidratos para pro-
+ galactose)
dução de energia nas bactérias pode ocorrer por
▪ Trissacarídeos: Rafinose
dois processos, o oxidativo (respiração celular)
▪ Polissacarídeos: Amido, Inulina e o fermentativo. O metabolismo oxidativo é um
▪ Açúcares-álcool: Adonitol, Dulcitol, Manitol, processo aeróbio para a maioria das bactérias, isto
Sorbitol é, só ocorre na presença do oxigênio como aceptor
Teste de indol. Objetiva verificar se a bactéria é final de elétrons, embora algumas espécies sejam
capaz de desaminar o aminoácido triptofano. A capazes de crescer substituindo o oxigênio por
desaminação do triptofano depende da disponi- compostos inorgânicos como o nitrato e o sulfato
bilidade pelas bactérias do complexo enzimático (respiração anaeróbia). O metabolismo fermenta-

tivo, ao contrário, é um processo anaeróbio e não se encontra presente em todas as bactérias capazes
depende da disponibilidade de oxigênio. As bacté- de utilizar o metabolismo respiratório. No teste,
rias que utilizam apenas o metabolismo oxidativo o reagente utilizado é sempre um agente redutor
dependente do oxigênio são chamadas de aeróbias artificial que atua como aceptor final dos elétrons
estritas, uma vez que seu crescimento só ocorre na transferidos pela citocromo oxidase C. Esses re-
presença de O2. As bactérias que utilizam tanto o agentes apresentam a característica de mudar de
metabolismo oxidativo quanto o fermentativo são cor ao passar do estado reduzido para o oxidado,
chamadas de anaeróbias facultativas, porque pode forma que, ao receber os elétrons, oxidam-se,
dem crescer tanto na presença quanto na ausência provocando uma reação colorida visível
de O2. O carboidrato normalmente adicionado aos Teste de redução do nitrato. Objetiva verificar
meios teste de oxidação fermentação é a glucose, se a bactéria é capaz de reduzir o nitrato a nitri-
porque é utilizado pela maioria das bactérias. Se o to ou a gás nitrogênio livre. A redução do nitrato
metabolismo da glicose for estritamente oxidativo (NO3-) é um processo usualmente anaeróbio e o
ou oxidativo e fermentativo, o dos demais tam- produto final da redução varia em função da es-
bém será, não havendo necessidade de testar um pécie bacteriana, podendo incluir o nitrito (NO2-),
a um. Por outro lado, algumas bactérias são inca- a amônia (NH3), o gás nitrogênio (N2), o óxido
pazes de utilizar a glicose, embora possam utilizar nítrico (NO), o óxido nitroso (N2O) e a hidroxila-
outros carboidratos. Também há bactérias que são mina (R-NH-OH). Os mais comuns são o nitrito
incapazes de utilizar qualquer tipo de carboidrato, e, no caso das bactérias também capazes de re-
como o Campylobacter, por exemplo, que deriva duzir o nitrito, o gás nitrogênio resultante dessa
sua energia de aminoácidos ou de ácidos interme- redução. A redução completa do nitrato a gás ni-
diários do ciclo do ácido tricarboxílico. trogênio (via nitrito ou óxido nitroso) é chamada
Teste de oxidase. Objetiva verificar a presença denitrificação. Os produtos da redução podem ser
da enzima citocromo C, uma das oxidases que utilizados ou não no metabolismo das bactérias,
participam do processo oxidativo de respiração dependendo das condições ambientais. Quando
celular. O metabolismo de respiração celular nas não utilizados são excretados para o meio de cul-
bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas apre- tura, onde podem ser detectados. O nitrito pode
senta, como etapa final do processo, o sistema de ser detectado através de uma reação colorida com
transporte de elétrons. Esse sistema é uma sequ- os reagentes para teste de nitrato, uma mistura de
ência de reações de óxido redução, em que elé- α-naftilamina e ácido sulfanílico, que reagem com
trons são transferidos de um substrato para outro, o nitrito formando um composto diazônico colo-
com a produção de energia. No final da cadeia, o rido. Alternativamente, se o meio estiver isento
aceptor final de elétrons, que se oxida para manter de produtos da redução do nitrato, a ocorrência
o sistema funcionando, é o oxigênio, que recebe do processo pode ser comprovada pela ausência
os elétrons transportados pelos substratos ante- do nitrato originalmente acrescentado ao meio de
riores. Para que a transferência de elétrons para o cultura. Essa verificação é feita com zinco, capaz
oxigênio possa ocorrer é necessária a participação de provocar uma reação colorida com qualquer ni-
de um grupo especial de enzimas de transporte de trato presente no meio, indicativa de não redução.
elétrons, as citocromo oxidases, presentes em to- Não ocorrendo reação, pode-se concluir que o ni-
das as bactérias que utilizam o metabolismo respi- trato foi reduzido.
ratório. O tipo e o número de citocromo oxidases Teste de urease. Objetiva verificar se a bactéria
presentes na cadeia de transporte de elétrons de produz a enzima urease, responsável pela decom-
diferentes bactérias é uma característica das es- posição da uréia em amônia. A urease é uma enzi-
pécies, utilizada como caráter de identificação. ma do grupo das amidases, que catalisam a hidró-
O teste de oxidase detecta especificamente uma lise de amidas como a uréia, uma diamida do ácido
dessas oxidases, a citocromo C oxidase, que não carbônico ou carbamida. A hidrólise de cada molé-

cula de uréia resulta em duas moléculas de amônia, □ Meios de cultura recomendados para o ensaio a
que elevam o pH do meio de cultura e podem ser ser realizado, descritos nos capítulos específicos
detectadas pelo vermelho de fenol, um indicador □ Estufa(s) incubadora ou banho(s) maria regu-
de pH com ponto de viragem em pH 8,4. lado(s) na(s) temperatura(s) especificada(s)
Teste de vermelho de metila (VM). Objetiva pelo ensaio a ser realizado, descrita(s) nos ca-
verificar se o metabolismo fermentativo da bac- pítulos específicos
téria é do tipo ácido misto. A fermentação da gli-
cose pelas bactérias pode resultar em diferentes 5.3. Procedimento
produtos finais de fermentação, sendo o tipo de
Antes de iniciar o procedimento, observar os cui-
metabolismo fermentativo uma característica das
dados descritos no Capítulo 2, para garantir que as
espécies. Na fermentação ácido mista, o produto
atividades sejam conduzidas sob condições assép-
final é uma mistura de ácidos (2 glicose + 1 H2O
ticas. Identificar todos os frascos, tubos e placas
⇒ 2 ácido lático + 1 ácido acético + 2 ácido fór-
que serão inoculados, com o código da amostra e
mico + 1 etanol) que reduzem o pH do meio para
a sigla do meio de cultura contido.
menos de 4,5. Essa redução acentuada do pH, que
supera a capacidade tamponante do tampão fosfa- a) Pré-enriquecimento
to presente, pode ser detectada adicionando-se à
Nos ensaios que utilizam uma única etapa de en-
cultura algumas gotas de solução de vermelho de
riquecimento, essa etapa não é de pré-enriqueci-
metila, um indicador de pH com ponto de viragem
mento, mas sim, de enriquecimento seletivo.
abaixo de 4,5.
Para a inoculação da amostra, seguir as orienta-
Teste de Voges-Proskauer (VP). Objetiva veri- ções dos capítulos específicos para cada ensaio. A
ficar se a bactéria produz butilenoglicol (butano- maioria deles utiliza os mesmos procedimentos de
diol) como produto final de fermentação da gli- preparação de amostras descritos no Capítulo 2,
cose. Na fermentação butilenoglicólica, o produto substituindo o diluente pelo caldo de pré-enrique-
final é precedido por um precursor intermediário, cimento. A diluição padrão da amostra no caldo é
a acetoína (acetilmetilcarbinol), convertida em de 1:10 (uma parte da amostra para nove partes de
butilenoglicol pela ação da diacetil redutase. A caldo). Para a incubação do(s) caldo(s), seguir as
acetoína pode ser detectada no teste de VP, através orientações dos capítulos específicos.
da adição dos reagentes Barrit para teste de VP.
Primeiramente é adicionada uma solução alcoóli- Composição de amostras a seco. Na análise de
ca 5% de α-naftol, que atua como catalisador para diversas unidades de amostra de lotes, é comum a
a reação com o reagente seguinte, uma solução prática de compor as amostras, coletando-se uma
concentrada de hidróxido de potássio ou sódio. O unidade analítica de cada e juntando todas numa
segundo atua como agente oxidante para a oxida- única amostra composta. A essa amostra compos-
ção da acetoína a diacetil. O diacetil reage com os ta adiciona-se o caldo de pré-enriquecimento, na
núcleos guanidina da peptona do meio, formando quantidade necessária para diluição 1:10. Como
um produto de condensação avermelhado que, à esse volume normalmente é grande, recomen-
medida em que é formado, combina-se com o α- da-se que a temperatura do caldo, no momento
naftol, acelerando a reação e intensificando a cor. da inoculação, seja a mesma da incubação. Esse
cuidado evita que a amostra inoculada permane-
ça por muito tempo nas estufas antes de atingir a
5.2. Material requerido nas
temperatura de incubação. Para alimentos que não
análises
permitam a obtenção de uma amostra composta
□ Material para preparação da amostra, descritos homogênea, pode-se fazer a composição úmida,
nos capítulos específicos descrita no item b a seguir.

b) Enriquecimento seletivo uma alíquota de 1 ml de cada caldo enriquecido

para um mesmo tubo estéril vazio, homogeneizar
Esse item aplica-se apenas aos ensaios que utili-
bem em um agitador tipo “vortex” e utilizar essa
zam duas etapas de enriquecimento.
amostra composta na etapa de plaqueamento dife-
Agitar cuidadosamente o frasco de pré-enrique- rencial subsequente.
cimento e transferir uma alíquota para o caldo
de enriquecimento seletivo. A proporção entre c) Plaqueamento diferencial
o volume da alíquota e o volume do caldo é de Nos ensaios de duas etapas de enriquecimento, o
uma parte para dez, na maioria dos ensaios, mas plaqueamento diferencial é feito a partir do(s) cal-
há exceções, devendo ser consultados os capítu- do(s) de enriquecimento seletivo. Nos ensaios de
los específicos. Se mais de um caldo for utilizado uma única etapa, é feita a partir do único caldo de
no ensaio, transferir uma alíquota para o segundo enriquecimento.
caldo de maneira similar. Para a incubação do(s)
A partir de cada tubo ou frasco de caldo enrique-
caldo(s) de enriquecimento seletivo, seguir as
cido, estriar uma alçada na superfície do meio de
orientações dos capítulos específicos.
cultura seletivo diferencial recomendado para o
Se foi feita a composição a seco de várias amos- ensaio, nos capítulos específicos. Se mais de um
tras no pré-enriquecimento, o volume da alíquota meio de plaqueamento for recomendado para o
de caldo de pré-enriquecimento a ser transferi- ensaio, repetir esse procedimento em cada meio
da para o(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo utilizado. A inoculação deve ser feita por estrias
deve ser multiplicada pelo número de unidades de de esgotamento, conforme descrito abaixo, para
amostra compostas. O volume do(s) caldo(s) de obter culturas puras em colônias isoladas. A incu-
enriquecimento seletivo também deve ser multi- bação das placas deve ser feita da forma recomen-
plicado pelo número de unidades de amostra com- dada para o ensaio, nos capítulos específicos.
postas, para manter a proporção. c.1) Técnica de inoculação por estrias de esgota-
Composição úmida de amostras em ensaios mento para obter culturas puras. As estrias são
com duas etapas de enriquecimento. Se não foi feitas da seguinte forma: com uma alça de ino-
feita a composição a seco, nessa etapa pode ser culação, transferir uma alçada da cultura para
feita a composição úmida de várias amostras pré- um ponto da superfície do meio, bem próximo
-enriquecidas, compondo os caldos de pré-enri- à parede da placa. A partir desse ponto, puxar a
quecimento obtidos. Para tanto, uma alíquota de alça em movimentos de vai-e-vem, fazendo li-
cada caldo de pré-enriquecimento é transferida nhas bem próximas umas das outras, em meta-
para um mesmo frasco de caldo de enriqueci- de da placa, conforme mostrado na Figura 5.1.
mento seletivo. Nesse caso, o volume do caldo de As linhas não devem encostar umas nas outras,
enriquecimento seletivo deve ser suficiente para sendo mantido um pequeno ângulo entre uma
manter a proporção recomendada de pré-enrique- e outra. Atingida a metade da placa, flambar
cimento a ser transferido. Para a prática de trans- a alça, aguardar resfriar e tocar em um ponto
ferir 1 ml do caldo de pré-enriquecimento para da metade inoculada, próximo à parede da pla-
10 ml do caldo de enriquecimento seletivo, por ca. A partir desse ponto, puxar o inóculo para
exemplo, são necessários 100 ml do caldo de enri- fora da metade inoculada e descrever novas li-
quecimento seletivo para compor 10 amostras. Se, nhas, ocupando um quarto da placa. As novas
no caso de presença, for importante determinar linhas não devem tocar as primeiras. Flambar
qual unidade de amostra está contaminada, é pos- novamente a alça, aguardar esfriar e, a partir
sível preservar cada unidade pré-enriquecida sob da segunda série de estrias, puxar novamente o
refrigeração e analisar individualmente depois. inóculo para o último quarto não inoculado da
Composição úmida em ensaios com uma única placa, descrevendo novas linhas em toda a área
etapa de enriquecimento. Nesse caso, transferir restante. Não tocar nenhuma das estrias feitas

Figura 5.1. Técnica de inoculação por estrias de esgotamento.
anteriormente. A cada série de estrias o inóculo repicar a cultura das colônias nos meios de isola-
é menor, porque foi sendo esgotado na série mento, de forma a transferir culturas puras.
anterior. Assim, no último quadrante inocula- d.1) Técnica de repique de culturas puras a par-
do, é provável a obtenção de colônias isoladas. tir de colônias isoladas em placas. As placas
normalmente contém colônias típicas e, tam-
d) Seleção de colônias e repique de
bém, colônias atípicas de vários tipos, que são
culturas para confirmação
da microbiota competidora. Para garantir que
A confirmação é feita a partir das colônias com a cultura tomada de uma colônia típica esteja
características típicas do microrganismo alvo, pura, a retirada do inóculo deve ser feita com
descritas nos capítulos específicos. Na ausência de agulhas, nunca com alças de inoculação. Com
colônias típicas, o ensaio é dado como concluído a ponta da agulha, tocar levemente o centro da
e o resultado como ausência, mesmo que outros colônia, em sua parte mais alta, de forma a re-
tipos de colônias estejam presentes. Há exceções tirar uma quantidade mínima da massa de célu-
em que se recomenda utilizar colônias atípicas, na las. Não tocar qualquer outra região da colônia
ausência das típicas. Essas exceções são apresen- ou do meio de cultura em redor, porque isso
tadas nos capítulos específicos. aumenta o risco de carregar os contaminantes.
Havendo colônias típicas, deve ser feito o isola- Nunca remover toda a colônia. Uma quanti-
mento da cultura, transferindo-se uma pequena dade mínima de inóculo, mesmo que não pos-
parte da massa de células para um ou mais meios sa ser vista, é suficiente para inocular vários
de isolamento. O número de colônias que devem meios de isolamento. Os meios normalmente
ser isoladas para a confirmação varia com o en- estão contidos em tubos, podendo ser sólidos
saio, assim como os meios de isolamento, devendo (inclinados ou não), semissólidos ou líquidos.
ser seguidas as orientações dos capítulos específi- Os meios semissólidos e os sólidos não incli-
cos. De maneira geral, pelo menos duas colônias nados são inoculados por picada, sem atingir o
típicas de cada meio de plaqueamento diferencial fundo do tubo. Os meios sólidos inclinados são
são submetidas à confirmação, para aumentar a inoculados fazendo-se uma picada, sem atingir
chance de isolar uma que seja do microrganismos o fundo e, depois, estrias na rampa. Os meios
alvo. Para o isolamento, a placa deve conter colô- líquidos são inoculados introduzindo-se a agu-
nias isoladas, pelo menos no último quarto inocu- lha até uma profundidade próxima do fundo e
lado. Se isso não ocorrer, uma alçada da cultura agitando levemente (há exceções, apresenta-
na placa deve ser novamente inoculada por estrias das nos capítulos específicos). Na inoculação
de esgotamento, em outra placa do mesmo meio. de vários tubos, não flambar a agulha nem to-
Esse procedimento deve ser repetido tantas vezes mar um novo inóculo entre um tubo e outro.
quantas necessárias, até obter placas com colônias Incubar os tubos nas condições descritas para
isoladas. Utilizar a técnica descrita abaixo para a o ensaio, nos capítulos específicos.

e) Testes de confirmação algumas situações a coloração de Gram pode

deixar dúvidas quanto ao resultado. Nesse
Os testes requeridos na confirmação são definidos
caso pode ser usado o teste do KOH, também
nos capítulos específicos. Os capítulos também
chamado de teste do fio, para confirmação
apresentam o procedimento para a realização dos
do resultado. Procedimento: Colocar uma a
testes, exceto os procedimentos básicos de colora-
duas gotas de solução de hidróxido de potás-
ção de Gram, coloração de esporos e preparação
sio (KOH) 3% em uma lâmina de vidro limpa
de montagens úmidas, apresentados abaixo.
e seca. Transferir uma alçada da cultura para
e.1) Coloração de Gram (método de Hucker).
a gota de KOH e emulsionar bem. Em apro-
Preparar um esfregaço da cultura da seguinte
ximadamente cinco a dez segundos as cepas
forma: Se a cultura estiver em meio sólido, co-
Gram negativas formam uma massa de mate-
locar uma gota de solução salina (NaCl 0,85%)
rial viscoso, que se estica quando puxado para
sobre uma lâmina de vidro limpa e seca e
cima com a alça, formando um fio que pode
emulsionar uma alçada da cultura com a solu-
atingir 2-3cm de comprimento, antes de rom-
ção salina. Se a cultura estiver em caldo, agitar
per-se (lise das células e liberação do DNA).
o caldo e colocar uma alçada sobre a lâmina
de vidro. Aguardar que o líquido seque natu- Nota e.2.1) Algumas espécies de bactérias Gram posi-
ralmente e, então, fixar o esfregaço pelo calor, tivas podem dar resultados duvidosos ou errôneos,
parecendo KOH positivas, como cepas de Bacillus
passando rapidamente a lâmina pela chama do macerans (Gregersen, 1978), Bacillus cereus (Car-
bico de Bunsen, por três vezes. Corar da se- lone et al., 1983), Bacillus megaterium e Thermo-
guinte forma: anaerobacter (Wiegel & Quandt 1982). Da mesma
▪ Cobrir o esfregaço com Solução de Cristal forma, algumas bactérias Gram negativas podem dar
resultado negativo no teste do KOH, como cepas de
Violeta de Hucker e manter em contato por
Xanthobacter (provavelmente devido à presença de
um minuto. cápsula) (Wiegel & Quandt 1982) e cepas de Mo-
▪ Lavar em água corrente (fluxo de água bem raxella (Carlone et al., 1983). Falsos positivos com
leve). bactérias Gram positivas também podem ocorrer de-
▪ Cobrir com Solução de Iodo (Lugol) por um vido ao uso de inóculo excessivo ou quando se testa
cepas produtoras de goma.
minuto.
▪ Lavar em água corrente e secar com lenço e.3) Coloração de esporos (método de Schaeffer-
de papel, tocando levemente, sem esfregar. -Fulton). Preparar um esfregaço da cultura,
▪ Descolorir lavando com etanol 95% por 30 da mesma forma indicada para a coloração de
segundos. Gram. Corar da seguinte forma:
▪ Lavar em água corrente e secar com lenço ▪ Cobrir o esfregaço com Solução de Verde
de papel, tocando levemente, sem esfregar. Malaquita 5% aquosa e corar a quente duran-
▪ Cobrir com Solução de Safranina por 10 sete cinco minutos. Para aquecer a solução de
gundos. verde de malaquita, segurar a lâmina sobre
▪ Lavar em água corrente e secar com lenço um banho ou frasco com água sob fervura.
de papel, tocando levemente, sem esfregar. ▪ Após o tempo de contato recomendado, la-
Observar ao microscópio óptico com ob- var em água corrente e cobrir com Solução
jetiva de imersão. As células das bactérias de Safranina 0,5% aquosa por 30 segundos.
Gram positivas vão ficar coradas de roxo e
▪ Lavar em água corrente e secar com lenço de
as das Gram negativas de vermelho, poden-
papel ou papel de filtro (sem esfregar, apenas
do também ser observadas a morfologia e o
tocando o esfregaço com o papel). Observar
arranjo das células.
ao microscópio óptico com objetiva de imer-
e.2) Teste do KOH para confirmação da colora- são. Os esporos vão ficar corados de verde e
ção de Gram duvidosa (Gregersen, 1978). Em as células vegetativas de vermelho.

e.4) Coloração de esporos (método de Ashby). de imersão. Os esporos vão ficar corados de
Preparar um esfregaço da cultura e fixar com verde e as células vegetativas de vermelho.
o mínimo de calor. Corar da seguinte forma: e.5) Montagens úmidas para observação micros-
▪ Segurar a lâmina sobre um banho ou frasco cópica a fresco. Se a cultura estiver em meio
com água sob fervura, até observar gotas sólido, colocar uma gota de solução salina so-
de água condensada na parte de baixo da bre uma lâmina de vidro limpa e seca e emul-
lâmina. sionar uma alçada da cultura com a solução
▪ Mantendo a lâmina sobre banho ou frasco salina. Se a cultura estiver em caldo, agitar o
com água sob fervura, cobrir o esfregaço caldo e colocar uma alçada sobre a lâmina de
com Solução de Verde Malaquita 5% aquo- vidro. Cobrir o líquido com uma lamínula e
sa e corar durante um a dois minutos. observar imediatamente ao microscópio, antes
▪ Lavar em água corrente e cobrir com Solu- que o material seque. A melhor visualização é
ção de Safranina 0,5% aquosa por 20 a 30 obtida em microscópio de contraste de fase,
segundos. mas, na falta deste, também pode ser feita em
▪ Lavar em água corrente e esperar secar com- microscópio óptico, com objetiva de imersão.
pletamente (sem usar lenço de papel). Ob- A observação a fresco permite verificar a moti-
servar ao microscópio óptico com objetiva lidade, a forma e o arranjo das células.
5.4. Referências
BREHM-STECHER, B & TORTORELLO, M.L., 2015. Mi- Bactérias em Alimentos. Campinas: Instituto de Tec-
croscopic methods. In: SALFINGER, Y. & TORTO- nologia de Alimentos.
RELLO, M.L. (eds.), Compendium of Methods for the SPERBER, W.A., MOORMAN, M.A. & FREIER, T.A.,
Microbiological Examination of Foods, 5 th ed. Ame- 2015 Cultural methods for the enrichment and isola-
rican Public Health Association, Washington, D. C. tion of microorganisms. In: SALFINGER, Y. & TOR-
Chapter 4, pp.45-65 TORELLO, M.L. (eds.), Compendium of Methods for
CARLONE, G.M., VALADEZ, M.J. & PICKETT, M.J., the Microbiological Examination of Foods, 5 th ed.
1983. Methods for Distinguishing Gram-Positive from American Public Health Association, Washington, D.
Gram Negative Bacteria. Journal of Clinical Micro- C. Chapter 5, pp.67-73.
biology, 16(6): 1157-1159. WIEGEL, T & QUANDT, L., 1982. Determination of the
GREGERSEN, T., 1978. Rapid Method for Distinction of Gram Type Using the Reaction Between Polymyxin
Gram-Negative from Gram-Positive Bacteria. Euro- B and Lippolysaccharides of the Outer Cell Wall of
pean J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 5. 123-127. Whole Bacteria. Journal of General Microbiology,
SILVA, N., 1996. Testes Bioqúimicos para Identificação de 128:2261-2270.

6 Contagem total de microrganismos
aeróbios mesófilos e psicrotróficos
em placas
Tabela 6.1 (revisada) A tabela da 4ª edição do Compendium foi substituída pela da 5ª edição (Ryser & Schuman,
2015).
Tabela 6.4 (revisada) Incluídos métodos AOAC 2008.10 e 2015.13.
Itens 6.1.2.c, e, f, g (revisados) Atualizado de acordo com 5ª edição do Compendium (Vasavada & Critzer, 2015).
Item 6.2 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, com uma
alteração no método:
Item 6.2.2.1.a Inserida a Nota a.1.
Item 6.3 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) do Compendium pela 20ª edição (2016) do AOAC
Official Methods of Analysis, sem alterações no método.
Item 6.4 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem alte-
rações no método.
Item 6.5 (novo) Incluído método ISO 4833-1/2:2013 para contagem total de aeróbios mesófilos em alimentos.
Item 6.6 (novo) Incluído método ISO 6222:1999 para contagem total de aeróbios mesófilos água.
6.1. Introdução de bactéria, sendo utilizada para se obter infor-

mações gerais sobre a qualidade de produtos, prá-
As orientações desse capítulo são da American ticas de manufatura, matérias primas utilizadas,
Public Health Association (APHA), descritas na condições de processamento, manipulação e vida
5ª edição do Compendium of Methods for the Mi- de prateleira.
crobiological Examination of Foods (Salfinger & Não é um indicador de segurança, pois não está
Tortorello, 2015). Quando diferentes ou comple- diretamente relacionado à presença de patógenos
mentares às do Compendium, foram também in- ou toxinas. Dependendo da situação, pode ser útil
cluídas recomendações da 17ª edição do Standard na avaliação da qualidade, porque populações al-
Methods for the Examination of Dairy Products tas de bactérias podem indicar deficiências na sa-
(Wehr & Frank, 2004) e da 22ª edição do Stan- nitização ou falha no controle do processo ou dos
dard Methods for the Examination of Water & ingredientes. Os produtos fermentados, ao contrá-
Wastewater (Hunt, 2012). rio, apresentam populações naturalmente altas de
mesófilos, sem qualquer relação com a qualidade.
6.1.1. Significado da contagem
A utilização da contagem total de aeróbios mesó-
total de aeróbios mesófilos filos como indicador de qualidade deve ser crite-
A contagem Total de Aeróbios Mesófilos em pla- riosa. Por exemplo, aplicada à ingredientes, deve
cas, (Aerobic Plate Count), também denominada levar em conta a diluição e o efeito no produto
Contagem Padrão em Placas, é o método mais final. Aplicada a alimentos desidratados, pode in-
utilizado como indicador geral de populações dicar se o controle da umidade está sendo correta-
bacterianas em alimentos. Não diferencia tipos mente aplicado ao processo de secagem.

Na Tabela 6.1 são apresentadas as contagens típi- ter, Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas e
cas de alguns produtos disponíveis no mercado. Yersinia causam amolecimento e deterioração
Na Tabela 6.2 as especificações da FAO/WHO em vegetais refrigerados.
(Food and Agriculture Organization/World Health d) Brochothrix, Lactobacillus, Leuconostoc e
Organization) para a contagem total de aeróbios membros da família Enterobacteriaceae são
mesófilos em alguns alimentos. Na Tabela 6.3 as deteriorantes de alimentos embalados sob
especificações apresentadas pelo Standard Me- vácuo ou atmosferas modificadas, bem como
thods for the Examination of Dairy Products da Carnobacterium e Weissella viridescens, em
APHA (Lewis et al., 2004) para a contagem total menor extensão.
de aeróbios mesófilos em produtos lácteos. e) Nas carnes embaladas à vácuo ou em atmosfe-
ra modificada são comuns as cepas psicrotró-
6.1.2. Definição de psicrotróficos ficas de Carnobacterium, Enterobacteriaceae
Microrganismos que crescem em alimentos sob e Brochothrix thermosphacta. Também podem
refrigeração (0-7 ºC) mas apresentam temperatura ser encontrados Lactobacillus, Leuconostoc,
ótima acima de 20 ºC são chamados de psicrotrófi- Pediococcus, Aeromonas e Yersinia enteroco-
cos ou psicrotrófilos. São definidos como micror- litica.
ganismos capazes de produzir crescimento visível f) Pseudomonas é o psicrotrófico deteriorante
a 7 ºC no prazo de 7 a 10 dias, independente de mais comum em carnes refrigeradas. Em fran-
sua temperatura ótima. Na classificação tradicio- gos os mais comuns são Acinetobacter, Pseu-
nal dos microrganismos em função da temperatu- domonas e Psychrobacter.
ra – termófilos, mesófilos e psicrófilos – os psi- g) Pseudomonas e Acinetobacter são os psicro-
crotróficos são um subgrupo dos mesófilos, não tróficos deteriorantes mais frequentes em pro-
dos psicrófilos, porque esses últimos geralmente dutos lácteos refrigerados (não fermentados).
morrem à temperatura ambiente. Os psicrotrófi- Bactérias esporogênicas como Paenibacillus
cos, ao contrário, se multiplicam em alimentos re- e Bacillus também tem sido associadas à al-
frigerados mas crescem melhor nas temperaturas terações em leite pasteurizado, decorrentes de
da faixa mesófila. atividade proteolítica.
a) As principais bactérias psicrotróficas estão dis- h) Algumas bactérias patogênicas também são
tribuídas em vários gêneros, incluindo, cocos psicrotróficas, incluindo Listeria monocyto-
e bastonetes, esporogênicos e não esporogê- genes, Yersinia enterocolitica, Aeromonas
nicos, aeróbios e anaeróbios. As mais comuns hydrophila, Vibrio cholerae, algumas cepas
em alimentos (produtos lácteos, cárneos, aves, de E. coli enteropatogênica, algumas cepas de
peixes e frutos do mar) são espécies dos gê- Bacillus cereus, algumas cepas de Clostridium
neros Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, botulinum tipo E, bem como cepas não proteo-
Arthrobacter, Bacillus, Brochothrix, Carno- líticas dos tipos B e F.
bacterium, Chromobacterium, Citrobacter,
Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, 6.1.3. Comentários sobre os
Escherichia, Flavobacterium, Klebsiella, Lac- métodos de análise
tobacillus, Leuconostoc, Listeria, Microbacte- O método clássico de contagem total de aeróbios
rium, Micrococcus, Moraxella, Pseudomonas, mesófilos em alimentos, descrito no Capítulo 8 do
Psychrobacter, Serratia, Shewanella, Strepto- Compendium (Ryser & Schuman, 2015) é a conta-
coccus e Weissella. gem padrão em placas (plaqueamento em profun-
b) Espécies de Alteromonas, Photobacterium e Vi- didade, superfície ou filtração em membrana). O
brio são importantes deteriorantes de pescados. meio de cultivo recomendado para a maioria dos
c) Espécies de Bacillus, Clostridium, Enterobac- produtos é o Ágar Padrão para Contagem (PCA),

Contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos em placas □ 75
Tabela 6.1. Contagem total de aeróbios mesófilos típica em alguns alimentos (Ryser & Schuman, 2015).
Produto Contagem total de aeróbios mesófilos em PCA (UFC/g)
Carne moída crua 1,0x104 a 1,0x107
Carne cozida fatiada 1,0x102 a 1,0x103
Carne de frango crua 1,0x103 a 1,0x104
Ovo líquido pasteurizado 1,0x103
Ovo em pó 1,0x104
Leite pasteurizado 1,0x102 a 1,0x104
Leite em pó 1,0x103 a 1,0x104
Peixes e camarões crus 1,0x104 a 1,0x106
Frutas e vegetais congelados 1,0x102 a 1,0x107
Frutas e vegetais desidratados 1,0x102 a 1,0x105
Gomas (guar, carragena, alfarroba) 1,0x104 a 1,0x105
Condimentos 1,0x104 a 1,0x105
Adoçantes e amido 1,0x102 a 1,0x104
Grãos de cereais não processados 1,0x104 a 1,0x105
Cereais matinais 1,0x102 a 1,0x103
Confeitos (chocolate e marshmallows) 1,0x103 a 1,0x104
Nozes (frescas na casca) 1,0x104
Nozes, sementes e pastas de legumes 1,0x103 a 1,0x104
Água engarrafada (tratada com bactericida ou osmose reversa) 1,0x102 (máximo)
Água mineral engarrafada (sem tratamento bactericida) 1,0x104 a 1,0x105
UFC = Unidades Formadoras de Colônias.
Tabela 6.2. Especificações da FAO/WHO para contagem total de aeróbios mesófilos em alimentos (Ry-
ser & Schuman, 2015).
Contagem total de aeróbios mesófilos máxima
Produto
(UFC/g)
Ovo integral em pó ou congelado 5,0x104
Produtos instantâneos em pó 1,0x103
Produtos desidratados consumidos após adição de líquido
1,0x104
com emprego de calor
Camarão congelado pré-cozido 1,0x105
Misturas geladas 2,5x104
Gelo comestível 5,0x104
Leite em pó 5,0x104
Caseínas 3,0x104
UFC = Unidades Formadoras de Colônias.
FAO = Food and Agriculture Organization (Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura),
WHO = World Health Organization (Organização Mundial da Saúde - OMS).
Tabela 6.3. Especificações apresentadas pelo Standard Methods for the Examination of Dairy Products
da APHA para a contagem total de aeróbios mesófilos em produtos lácteos (Lewis et al., 2004).
Contagem total de aeróbios mesófilos máxima
Produto
(UFC/g ou ml)
Leite e produtos lácteos pasteurizados 2,0x104
Leite condensado 3,0x104
Leite desnatado em pó tipo A e tipo Instantâneo 3,0x104
Leite desnatado em pó tipo Extra 4,0x104
Leite desnatado em pó tipo Padrão 7,5x104
Leite integral em pó tipo Extra 3,0x104
Leite integral em pó tipo Padrão 5,0x104
UFC = Unidades Formadoras de Colônias,
APHA = American Public Health Association.

incubado a 35±1 ºC/48±2h, com as seguintes ex- 35±0,5 ºC/48±2h. Esses meios podem ser usa-
ceções: dos no plaqueamento em profundidade, superfí-
▪ Na análise de leite e produtos lácteos, o Ca- cie e filtração em membrana. Recomenda ainda,
pítulo 6 do Standard Methods for the Exami- exclusivamente para a técnica de filtração em
nation of Dairy Products (Laird et al., 2004) membrana, o Ágar m-HPC, incubado a 35±0,5
recomenda incubar o PCA a 32±1 ºC/48±2h, ºC/48±2h. Em água o PCA resulta em conta-
prolongando a incubação até 72±3h no caso de gens menores do que o R2A ou o NWRI, mas
produtos lácteos desidratados. foi mantido na 22ª edição do Standard Methods
▪ Na análise de sucos de frutas, o Capítulo 58 do para estudos comparativos com outros meios e,
Compendium (Parish et al., 2015) recomenda também, para laboratórios que necessitam man-
substituir o PCA pelo Ágar Soro de Laranja ter a continuidade de registros antigos.
(OSA), incubado a 30 ºC/48h. O OSA é um ▪ Na análise de alimentos e ração animal a ISO
meio nutricionalmente mais rico que o PCA, 4833-1:2013 e a ISO 4833-2:2013 recomen-
permitindo recuperar as bactérias lácticas nor- dam o PCA com plaqueamento em profundi-
malmente presentes nesses produtos. dade ou superfície, respectivamente, incubado
▪ Na análise de água, a Seção 9215 do Standard a 30±1 ºC/72±3h.
Methods for the Examination of Water and ▪ Outros métodos que já foram oficializados
Wastewater (Hunt, 2012) recomenda substituir pela AOAC International são os “kits” analíti-
o PCA pelo Ágar R2A ou NWRI, incubados a cos descritos na Tabela 6.4.
Tabela 6.4. “Kits” analíticos adotados pela AOAC International para contagem total de aeróbios em
alimentos (Latimer, 2016, AOAC International, 2016).
Método Nome do kit e fabricante Princípio do método Alimentos

Petrifilm™ Aerobic Count Plate,
986.33 Petrifilm™ Coliform Count Plate, Cultural, contagem em placa de filme reidratável Leite.
3M Microbiology Products.
989.10 Petrifilm™ Coliform Count Plate, Cultural, contagem em placa de filme reidratável Produtos lácteos.

990.12 Cultural, contagem em placa de filme reidratável Alimentos.
Leite, chocolate, misturas para bolos, pi-

menta em pó, castanhas, produtos lácteos,
SimPlate Total Plate Count – Cultural (NMP), amostra distribuída em uma
carnes vermelhas, carne de frango, frutos
2002.07 Color Indicator (TPC-CI), placa com múltiplos pocinhos contendo um
do mar, tortas congeladas, cereais, massas,
BioControl Systems Inc. indicador colorimétrico de crescimento.
produtos de ovos, farinha, batata marron,
legumes, frutas e suco de frutas.
Cultural (NMP), amostra distribuída automati-
TEMPO Total Viable Count camente em um cartão com múltiplos pocinhos Carne bovina e de aves, pescados, leite,
2008.10
(TVC), BioMérieux, Inc. contendo um indicador fluorescente de cresci- alface.
mento, lido automaticamente pelo aparelho
Pescados, frutas e produtos de frutas, lei-
Petrifilm Rapid Aerobic Count
2015.13 Cultural, contagem em placa de filme reidratável te, sorvetes, carne bovina, suína e de aves,
Plate
temperos e condimentos, massas.
NMP = Número Mais Provável.

6.2. Método de plaqueamento □ Ágar Padrão para Contagem (PCA)

□ Ágar Soro de Laranja (OSA) (para sucos de
APHA 08:2015 para contagem frutas)
total de aeróbios mesófilos □ Ágar R2A ou NWRI (preferenciais para amos-
em alimentos tras de água)
Inoculação por plaqueamento em superfície
Método da American Public Health Association
□ Placas com Ágar Padrão para Contagem (PCA)
(APHA) para a análise de alimentos e água en-
□ Placas com Ágar Soro de Laranja (OSA) (para
garrafada, descrito no Capítulo 8 da 5ª edição do
sucos de frutas)
Compendium of Methods for the Microbiological
□ Placas com Ágar R2A ou NWRI (para amos-
Examination of Foods (Ryser & Schuman, 2015).
tras de água)
Incluídas também as recomendações específicas
□ Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mer-
do Capítulo 58 do Compendium (Parish et al.,
gulhada em etanol 70%
2015), para a análise de sucos de frutas, as do Ca-
Inoculação por filtração em membrana
pítulo 6 do Standard Methods for the Examina-
□ Placas com Ágar Padrão para Contagem (PCA)
tion of Dairy Products (Laird et al., 2004), para a
□ Placas com Ágar R2A, NWRI ou m-HPC (para
análise de produtos lácteos, e as da Seção 9215 do
amostras de água)
Standard Methods for the Examination of Water
and Wastewater (Hunt, 2012), para a análise de
de 0,45mm, brancas e quadriculadas
todos os tipos de água.
□ Conjunto de filtração previamente esterilizado
A contagem pode ser feita utilizando-se os métodos □ Bomba de vácuo
de plaqueamento em profundidade (pour plate), □ Pinças para transferência das membranas,
superfície (spread plate) e filtração em membra- mergulhadas em etanol
na. Antes de iniciar as atividades, ler atentamente □ Proveta de 100 ou 200 ml estéril, para medição
as orientações do Capítulo 3, que apresenta todos de volumes de amostra
os detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
Incubação
microrganismos em placas, da seleção das dilui-
□ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC (para
ções ao cálculo dos resultados. O procedimento
alimentos em geral)
descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres-
supondo que sejam conhecidos pelo analista.
sucos de frutas)
6.2.1. Material requerido para a leite e produtos lácteos)
análise
Preparação da amostra e diluições seriadas 6.2.2. Procedimento
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou O esquema geral de análise para contagem total
Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) de aeróbios mesófilos em alimentos usando o mé-
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada todo de plaqueamento APHA 08:2015 encontra-se
0,1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) descrito na Figura 6.1.
□ Pipetas de 1 ou 2 ml
6.2.2.1. Plaqueamento em profundidade
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
tulo 2 para verificar casos especiais em que o a) Preparação das amostras e diluições seria-
tipo ou volume de diluente variam em função das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-
da amostra analisada. pítulo 2.
Nota a.1) Se a primeira diluição da amostra apresentar
Inoculação por plaqueamento em profundidade pH fora da faixa entre 5,5 e 7,6 é recomendado ajus-
□ Placas de Petri de 20x100mm estéreis vazias tar o pH em 7.

Figura 6.1. Esquema geral de análise para contagem total de aeróbios mesófilos em alimentos usando o método de
plaqueamento APHA 08:2015 (Ryser & Schuman, 2015).
b) Inoculação. Selecionar três diluições adequa- d) Incubação. Inverter e incubar as placas nas se-
das da amostra e inocular 1 ml de cada diluição guintes condições:
em placas de Petri separadas, estéreis e vazias. PCA - 35±1 ºC/48±2h para alimentos em geral
PCA - 32±1 ºC/48±2h para produtos lácteos
c) Adição do meio de cultura. Verter nas placas PCA - 32±1 ºC/72±3h para produtos lácteos desidratados
inoculadas, 12 a 15 ml de Ágar Padrão para OSA - 30±1 ºC/48±2h para sucos de frutas
Contagem (PCA), previamente fundido e res- R2A ou NWRI ou PCA - 35±0,5 ºC/48±2h para água
friado a 44-46 ºC. Para amostras de sucos de e) Contagem das colônias e cálculo dos resulta-
frutas, substituir o PCA pelo Ágar Soro de La- dos. Selecionar as placas com 25 a 250 colô-
ranja (OSA). Para amostras de água, preferen- nias e contar as colônias com o auxílio de uma
cialmente, substituir o PCA pelo Ágar R2A ou lupa, em um contador de colônias. Calcular o
Ágar NWRI. Misturar o inóculo com o meio número de unidades formadoras de colônias
de cultura movimentando suavemente as pla- (UFC) por grama ou mililitro da amostra multi-
cas, numa superfície plana, em movimentos na plicando o número de colônias pelo inverso da
forma de oito ou em movimentos circulares, diluição inoculada. Caso tenham sido utilizadas
oito a dez vezes no sentido horário e oito a duas placas por diluição (duplicata), considerar
dez vezes no sentido anti-horário. Distribuir as como número de colônias a média aritmética
placas numa bancada fria, sem empilhar, para da contagem obtida em cada uma das placas da
solidificação do meio. Para amostras em que duplicata. Usar notação exponencial e apenas
seja comum a ocorrência de colônias grandes e uma casa decimal depois da vírgula, na apre-
espalhadas (leite em pó, por exemplo), aguar- sentação dos resultados. Para a contagem de
dar a completa solidificação do ágar e adicio- colônias e cálculo dos resultados em situações
nar uma sobrecamada do mesmo meio. não usuais, seguir as orientações do Capítulo 3.

Limite de detecção do procedimento padrão (1 cálculo dos resultados em situações não usuais,
ml/diluição): 1 UFC/ ml de amostras líquidas seguir as orientações do Capítulo 3.
ou 10 UFC/g de amostras sólidas. Limite de detecção do procedimento padrão
(0,1 ml/diluição): 10 UFC/ ml de amostras lí-
6.2.2.2. Plaqueamento em superfície quidas ou 100 UFC/g de amostras sólidas.
a) Preparação das amostras e diluições seriadas.
Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2. 6.2.2.3. Filtração em membrana
b) Preparação das placas. Preparar previamente O método de filtração em membrana aplica-se a
placas de Ágar Padrão para Contagem (PCA) e, líquidos límpidos, sem sólidos em suspensão. É
antes do uso, secar em capela de fluxo laminar recomendado para amostras com contagens abai-
(30 a 60 minutos, com as tampas parcialmente xo do limite de detecção dos outros métodos, sen-
abertas) ou em estufa (50 ºC/1,5-2h ou 25-30 ºC/ do bastante utilizado na análise de refrigerantes
18-24h). Para amostras de sucos de frutas, subs- (não contendo sucos naturais) e água para consu-
tituir o PCA pelo Ágar Soro de Laranja (OSA). mo humano. Pode também ser utilizado na análise
Para amostras de água, preferencialmente, subs- de produtos sólidos convertidos em soluções lím-
tituir o PCA pelo Ágar R2A ou NWRI. pidas, como sal e açúcar, por exemplo.
c) Inoculação. Selecionar três diluições adequa- a) Preparação do conjunto de filtração. Seguir
das da amostra e inocular 0,1 ml de cada dias orientações do Capítulo 3.
luição na superfície das placas previamente b) Preparação das placas. Preparar previamente,
preparadas. Usando uma alça de Drigalski, es- da mesma forma recomendada para o plaquea-
palhar o inóculo por toda a superfície do meio, mento em superfície. Para amostras de água, pre-
até que o excesso de líquido seja absorvido. Se ferencialmente, substituir o PCA pelo Ágar R2A,
o nível de contaminação esperado da amostra NWRI ou m-HPC. Podem também ser utilizadas
for baixo, inocular um volume maior (1 ml) placas de 50mm de diâmetro (com 5 ml de meio
da primeira diluição, distribuindo esse volu- de cultura) ou almofadas absorventes (“pads”)
me por quatro placas (três placas com 0,3 ml e estéreis, colocadas no interior de placas (também
uma placa com 0,1 ml). estéreis) e embebidas com porções de 2 ml dos
d) Incubação. Aguardar que as placas sequem mesmos meios, na forma líquida.
(mínimo 15min), inverter e incubar nas se- c) Preparação da amostra. Homogeneizar a
guintes condições: amostra seguindo as orientações do Capítulo
PCA - 35±1 ºC/48±2h para alimentos em geral 2. Medir 100 ml numa proveta estéril e verter
PCA - 32±1 ºC/48±2h para produtos lácteos cuidadosamente no copo do conjunto de filtra-
PCA - 32±1 ºC/72±3h para produtos lácteos desidratados
ção, evitando respingos. Se o copo do conjunto
OSA - 30±1 ºC/48±2h para sucos de frutas
R2A ou NWRI ou PCA - 35±0,5 ºC/48±2h para água de filtração for graduado e a escala contiver a
marcação de volume requerida, o volume da
e) Contagem das colônias e cálculo dos resul-
amostra pode ser medido diretamente, sem a
tados. Seguir as mesmas orientações descritas
utilização da proveta.
para o plaqueamento em profundidade, porém,
Nota c.1) Como o método de filtração é uma técnica de
multiplicar o resultado por dez, para levar em
concentração dos microrganismos em amostras com
conta o volume dez vezes menor inoculado. Se baixas contagens, o procedimento usual é a filtração
foi feita a distribuição de 1 ml da primeira di- de 100 ml da amostra, que podem ser fracionados em
luição em quatro placas, o número de colônias duas porções de 50 ml, quatro porções de 25 ml ou
dessa diluição é a soma das quatro placas. Se o três porções de 70, 25 e 5 ml, respectivamente. A se-
leção do volume a ser filtrado, entretanto, depende
cálculo do resultado for feito com a contagem da contaminação estimada na amostra, de forma a
dessa diluição, então não é necessário multi- resultar em placas com contagens na faixa de 20 a
plicar por dez. Para a contagem de colônias e 200 colônias.

Nota c.2) Quando o volume a ser filtrado for menor do todas as colônias presentes e dividir pelo volu-
que 20 ml, adicionar ao copo do conjunto de filtra- me filtrado, para obter o número de UFC/ ml.
ção cerca de 20-30 ml de diluente, antes da adição
da amostra. Não é necessária uma medida exata de
Se o número de colônias por quadrícula estiver
diluente, cuja função é aumentar o volume a ser fil- na faixa de três a dez, contar dez quadrículas e
trado, facilitando uma melhor distribuição dos mi- tirar a média por quadrícula. Multiplicar esse va-
crorganismos na membrana. lor por 100 e dividir pelo volume filtrado, para
d) Filtração. Ligar a bomba de vácuo e proceder obter o número de UFC/ ml. Se o número de
à filtração. Após a passagem da amostra, ainda colônias por quadrícula estiver na faixa de dez
com a bomba ligada, enxaguar as paredes do a vinte, contar apenas cinco quadrículas para ti-
copo com 20 a 30 ml de diluente, para reco- rar a média e calcular o número de UFC/ ml da
lher eventuais contaminantes aderidos. Repetir mesma forma.
esse procedimento mais uma vez. Desligar a Se o número de colônias por quadrícula for
bomba de vácuo antes que a membrana seque maior do que vinte, expressar o resultado como
excessivamente. maior do que 2,0x103 dividido pelo volume fil-
e) Transferência e incubação da membrana. trado.
Retirar o copo e, com uma pinça flambada e Limite de detecção do procedimento padrão
resfriada, transferir a membrana para a placa (filtração de 100 ml): 1 UFC/100 ml.
com o meio de cultura, com a face quadricula-
da para cima. Ao colocar a membrana na placa 6.3. Métodos de
é importante que toda a superfície fique com-
plaqueamento em Petrifilm™
pletamente aderida ao meio, para que haja con-
tato dos microrganismos com os nutrientes. Se AOAC 986.33/989.10/990.12
houver formação de bolhas, deve-se levantar para contagem total de
a borda da membrana mais próxima da(s) bo- aeróbios mesófilos em
lha(s) e recolocá-la de forma a eliminar a(s)
alimentos
bolha(s).
f) Incubação. Incubar as placas nas condições Método oficial da AOAC International (Latimer,
abaixo, invertidas e, preferencialmente, acon- 2016), aplica-se à análise de todos os alimentos.
dicionadas em sacos ou bandejas com papel Petrifilm™ é uma modificação da contagem de cé-
toalha ou papel de filtro úmido, para evitar de- lulas viáveis em placas. É composto por dois filmes
sidratação. estéreis, reidratáveis, impregnados por substâncias
PCA - 35±1 ºC/48±2h para alimentos em geral
geleificantes solúveis em água fria, pelo meio de
R2A, NWRI, PCA ou m-HPC - 35±0,5 ºC/48±2h para
água cultura (similar ao Ágar Padrão para Contagem -
PCA) e por um indicador de tetrazólio (torna as
g) Contagem das colônias e cálculo dos resul-
colônias vermelhas, facilitando a contagem).
tados. Proceder à contagem das colônias com
o auxílio de um microscópio estereoscópico,
6.3.1. Material requerido para a
com aumento de 10 a 15 vezes e, para facilitar
a visualização posicionar as placas de forma a
análise
obter uma iluminação perpendicular ao plano Preparação da amostra e diluições seriadas
da membrana. Selecionar para contagem pla- □ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou
cas com 20 a 200 colônias. Seguir as orienta- Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
ções abaixo para contagem e cálculo do núme- □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada
ro de UFC/ ml: 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
Se o número de colônias por quadrícula da □ Pipetas de 1 ou 2 ml
membrana for menor ou igual a dois, contar Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-

tulo 2 para verificar casos especiais em que o com mais 250, contar as colônias em um ou
tipo ou volume de diluente variam em função mais quadrados de 1cm2, calcular a média por
da amostra analisada. cm2 e multiplicar por 20.
Inoculação Limite de detecção: 1 UFC/ ml de amostras lí-
□ Placas de Petrifilm™AC para Contagem Total quidas ou 10 UFC/g de amostras sólidas.
(3M Company)
□ Espalhador
6.4. Método de plaqueamento
Incubação
□ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC APHA 13.61:2015 para
□ Estufa incubadora regulada a 32±1 ºC (para leite contagem de bactérias
e produtos lácteos) aeróbias psicrotróficas em
alimentos
6.3.2. Procedimento
Observação. O procedimento abaixo é orienta- Método da American Public Health Association
tivo, devendo sempre ser verificadas e obede- (APHA), descrito no Capítulo 13 da 5ª edição do
cidas as instruções do fabricante. Compendium of Methods for the Microbiologi-
a) Preparação das amostras e diluições seria- cal Examination of Foods (Vasavada & Critzer,
das. Seguir os procedimentos descritos no Ca- 2015) e no Capítulo 8 da 17ª edição do Standard
pítulo 2. Methods for the Examination of Dairy Products
(Frank & Yousef, 2004). Aplica-se à análise de to-
b) Inoculação. Posicionar os petrifilms em uma
dos os alimentos.
superfície plana. Selecionar três diluições ade-
O Compendium recomenda que as amostras desti-
quadas da amostra para a inoculação. Inocular
nadas à contagem de aeróbios psicrotróficos sejam
1 ml de cada diluição em placas de Petrifil-
analisadas no intervalo de seis horas, a partir da
m™AC para Contagem Total (3M Company)
coleta. A estocagem refrigerada permite sua multi-
separadas, levantando o filme superior e depo-
plicação e o tempo de geração de vários desses mi-
sitando o inóculo no centro da área circular do
crorganismos encontra-se dentro desse intervalo. O
filme inferior. Baixar o filme superior sobre o
congelamento não é indicado para essas amostras,
inóculo, posicionar o espalhador (que acompa-
porque pode provocar injúria ou morte de vários
nha o kit de petrifilms) e, seguindo as instru-
microrganismos. Se o congelamento for indispen-
ções do fabricante, aplicar uma leve pressão,
sável, considerar na avaliação dos resultados que
para espalhar o inóculo.
parte da microbiota pode ter sido perdida.
c) Incubação: Aguardar um minuto para o gel so-
lidificar e incubar 35±1 ºC/48±2h, em pilhas de
não mais de 20 filmes, sem inverter. No caso de
produtos lácteos, incubar a 32±1 ºC/48±3h análise
d) Contagem das colônias e cálculo dos resul- Preparação da amostra e diluições seriadas
tados. A área circular de crescimento do pe- □ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou
trifilm tem aproximadamente 20cm2 e a conta- Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
gem deve ser feita nos petrifilms com 25 a 250 □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada
colônias. Contar todas as colônias vermelhas, 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
independente do tamanho ou intensidade da □ Pipetas de 1 ml
cor. Calcular o número de UFC por grama ou Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
mililitro da amostra multiplicando o número tulo 2 para verificar casos especiais em que o
de colônias pelo inverso da diluição. Para de- tipo ou volume de diluente variam em função
terminar o número de colônias em petrifilms da amostra analisada.

Inoculação por plaqueamento em superfície de aeróbios mesófilos, alterando a condição de in-

□ Meio de cultura: placas com Ágar Padrão para cubação.
Contagem (PCA), que pode ser substituído O Capítulo 13 do Compendium (Vasavada & Crit-
pelo Ágar Tripticase de Soja (TSA) ou pelo zer, 2015) recomenda plaqueamento em Petrifilm
Petrifilm Contagem Total (3M Company) ou plaqueamento em superfície, usando Ágar Pa-
□ Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mer- drão para Contagem (PCA) ou Ágar Tripticase
gulhada em etanol 70% de Soja (TSA) como meios de cultivo. Se possí-
□ Estufa incubadora regulada a 7±1 ºC vel, recomenda-se não utilizar o plaqueamento em
□ Estufa incubadora regulada a 17±1 ºC profundidade porque as bactérias são sensíveis ao
(opcional) calor e podem ser afetadas pelo meio de cultura
quente. A incubação pode ser feita a 7±1 ºC por 10
6.4.2. Procedimento dias ou 17±1 ºC por 16 horas, seguido de mais três
dias a 7±1 ºC.
O esquema geral de análise para contagem total O Standard Methods for the Examination of Dairy
de microrganismos aeróbios psicrotróficos em ali- Products (Frank & Yousef, 2004) recomenda, para
mentos usando o método de plaqueamento APHA leite e produtos lácteos, plaqueamento em profundi-
13.61:2015 encontra-se descrito na Figura 6.2. dade, usando PCA resfriado a 45±1 ºC, antes da adi-
Segue o mesmo procedimento da contagem total ção sobre o inóculo. Incubação a 7±1 ºC por 10 dias.
Figura 6.2. Esquema geral de análise para contagem total de microrganismos aeróbios psicrotróficos em alimentos usando o
método de plaqueamento APHA 13.61:2015 (Vasavada & Critzer, 2015).

6.5. Métodos de plaqueamento □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Salina

Peptonada (H2Osp) ou Água Peptonada Tam-
ISO 4833-1:2013 e ponada (BPW)
ISO 4833-2:2013/Corr.1:2014 □ Pipetas de 1 ou 2 ml
para contagem total de aeróbios Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
mesófilos em alimentos tulo 2 para verificar casos especiais em que o
tipo ou volume de diluente variam em função
Métodos da International Organization for Stan- da amostra analisada.
dardization, aplicam-se a alimentos destinados ao Inoculação
consumo humano, à rações animais e à amostras □ Placas de Petri estéreis vazias (para plaquea-
do ambiente de fabricação destes produtos. Para al- mento em profundidade) ou já contendo o meio
gumas matrizes o plaqueamento em profundidade de cultura (para plaqueamento em superfície)
(ISO 4833-1) pode dar resultados diferentes dos ob- □ Ágar Padrão para Contagem (PCA)
tidos com o plaqueamento em superfície (ISO 4833- □ Ágar Padrão para Contagem (PCA) suplemen-
2). Para a análise de produtos fermentados pode ser tado com 1g/l de leite em pó desnatado (para a
mais apropriado o uso de outros meios e/ou condi- análise de produtos lácteos)
ções de incubação. O método pode até ser aplicado Incubação
a esses produtos, mas os microrganismos predomi- □ Estufa incubadora regulada a 30±1 ºC
nantes podem não ser detectados de forma eficaz.
A ISO 4833-1 recomenda o plaqueamento em 6.5.2. Procedimento
profundidade nas seguintes situações:
O esquema geral de análise para contagem to-
▪ análise de produtos com contagens baixas
tal de microrganismos aeróbios mesófilos em
(menor do 102/ ml no caso de de líquidos ou
alimentos usando os métodos de plaqueamento
menor do que 103/g no caso de sólidos),
ISO 4833-1:2013 e ISO 4833-2:2013/Corr.1:2014
▪ análise de produtos que costumam resultar em
encontra-se descrito na Figura 6.3.
colônias espalhadas, como leite e derivados,
por exemplo, que contém cepas de Bacillus. a) Preparação das amostras e diluições seria-
das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-
A ISO 4833-2 recomenda o plaqueamento em su-
pítulo 2.
perfície nas seguintes situações:
▪ análise de produtos cuja flora predominante seja b) Inoculação por plaqueamento em profundi-
sensível ao calor (psicrotróficos, por exemplo), dade (ISO 4833-1:2013). Selecionar pelo me-
▪ análise de produtos cuja flora predominante seja nos duas diluições adequadas da amostra e ino-
aeróbia estrita (Pseudomonas, por exemplo), cular 1 ml de cada diluição em placas de Petri
▪ análise de produtos com partículas que possam separadas, estéreis e vazias. Se não for neces-
ser confundidas com colônias, sária a inoculação de diluições, plaquear duas
▪ análise de produtos fortemente coloridos, cuja alíquotas de 1 ml da amostra ou sua primeira
cor possa interferir na visualização das colônias, diluição em duas placas (duplicata). Verter nas
▪ produtos nos quais seja importante a verifica- placas inoculadas, 12 a 15 ml de Ágar Padrão
ção das características das colônias. para Contagem (PCA), previamente fundido e
resfriado a 44-47 ºC. Para amostras de produ-
tos lácteos suplementar o PCA com 1g/l de lei-
te em pó desnatado. Misturar o inóculo com o
análise
meio de cultura movimentando suavemente as
Preparação da amostra e diluições seriadas placas numa superfície plana, em movimentos
□ Diluente: Água Salina Peptonada (H2Osp) ou circulares. Distribuir as placas numa bancada
Água Peptonada Tamponada (BPW) fria, sem empilhar, para solidificação do meio.

Figura 6.3. Esquema Geral de Análise para contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos em alimentos usando
o método de plaqueamento ISO 4833-1: 2003 e ISO 4833-2: 2003.
Para amostras em que seja comum a ocorrên- e) Contagem das colônias e cálculo dos resul-
cia de colônias grandes e espalhadas (leite em tados. Selecionar as placas com 10 a 300 co-
pó, por exemplo), aguardar a completa solidi- lônias e contar as colônias com o auxílio de
ficação do ágar e adicionar uma sobrecamada uma lupa, em um contador de colônias. A regra
de ágar 1,5% estéril. geral para calcular o resultado é:
c) Inoculação por plaqueamento em superfí-
UFC/g ou ml = ∑c / V x 1,1 x d
cie (ISO 4833-2:2013/Cor 1:2014). Selecio-
nar pelo menos duas diluições adequadas da onde:
amostra e inocular 0,1 ml de cada diluição em ∑c é a soma das colônias contadas em duas placas de
placas de PCA previamente preparadas. Para duas diluições consecutivas,
V é o volume de cada diluição colocado nas placas (em ml)
amostras de produtos lácteos suplementar o
d é a primeira diluição cuja placa foi contada.
PCA com 1g/l de leite em pó desnatado. Se
não for necessária a inoculação de diluições, Exemplo (plaqueamento em superfície, 0,1 ml por
plaquear duas alíquotas de 0,1 ml da amostra diluição):
ou sua primeira diluição em duas placas (du- Nº de colônias nas placas
Contagem (UFC/g ou UFC/ ml)
plicata). Espalhar o inóculo pela superfície do 10-1 10-2 10-3
meio com uma alça de Drigalski. 245* 22* 2
(245+22)/0,1x1,1x10-1
= 24.272,72 = 2,4x104
d) Incubação. Incubar as placas a 30±1 ºC/72±3h,
invertidas. Para amostras em que seja comum
a ocorrência de colônias grandes e espalhadas Para a contagem de colônias e cálculo dos resulta-
(leite em pó, por exemplo), fazer uma contados em situações não usuais, seguir as orientações
gem prévia com 24 ou 48h, marcando as colô- do Capítulo 3.
nias observadas.

6.6. Métodos de plaqueamento usando o método de plaqueamento ISO 6222:1999

encontra-se descrito na Figura 6.4.
ISO 6222:1999 para contagem
total de aeróbios mesófilos das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-
em água pítulo 2.
b) Inoculação. Selecionar pelo menos duas di-
Método da International Organization for Stan-
luições adequadas da amostra e inocular dois
dardization, aplica-se a todo tipo de água.
conjuntos de placas de Petri estéreis vazias
com 1 ml de cada diluição. Verter nas placas
inoculadas, 15 a 20 ml de Ágar Extrato de Le-
análise vedura (YEA), previamente fundido e resfria-
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) do. Misturar o inóculo com o meio de cultura
□ Ágar Extrato de Levedura (YEA) movimentando suavemente as placas numa
□ Estufa incubadora regulada a 36±2 ºC superfície plana, em movimentos circulares.
□ Estufa incubadora regulada a 22±2 ºC Distribuir as placas numa bancada fria, sem
empilhar, para solidificação do meio.
6.6.2. Procedimento c) Incubação. Incubar um conjunto de as placas a
O esquema geral de análise para contagem total 36±2 ºC/44±4h, invertidas. Incubar o outro con-
de microrganismos aeróbios mesófilos em água junto de as placas a 22±2 ºC/68±4h, invertidas.
Figura 6.4. Esquema geral de análise para contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos em água usando
o método de plaqueamento ISO 6222:1999.

d) Contagem das colônias e cálculo dos resul- Exemplo:

tados. Selecionar as placas com 10 a 300 co- Nº de colônias nas placas
lônias e contar as colônias com o auxílio de sem
Contagem (UFC/g ou UFC/ ml)
uma lupa, em um contador de colônias. Rejei- diluição 10-1 10-2
100
tar placas com crescimento confluente. A regra (245+22)/1x1,1x100
geral para calcular o resultado é: 245* 22* 2
= 242,72 = 2,4x102
UFC/g ou ml = ∑c / V x 1,1 x d
onde: Para a contagem de colônias e cálculo dos resulta-

dos em situações não usuais, seguir as orientações
∑c é a soma das colônias contadas em duas placas de duas
diluições consecutivas,
do Capítulo 3.
V é o volume de cada diluição colocado nas placas (1 ml) e
d é a primeira diluição cuja placa foi contada.
6.7. Referências
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AOAC International (OMA) Online. Disponível no site: of AOAC International, 20 th edition. Gaithersburg,
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7 Contagem de
bolores e leveduras
Tabela 7.1 (revisada) Incluído método AOAC 2014.05.
Item 7.1.3 (revisado) Revisão bibliográfica sobre bolores termorresistentes atualizada.
Item 7.2.A (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem
alterações no método.
Item 7.2.B (novo) Incluídos métodos de plaqueamento ISO 21527-1:2008 e ISO 21527-2:2008 para contagem de
bolores e leveduras em alimentos.
rações no método de fungos psicrotróficos.
Item 7.4 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, com alte-
ração em todos os itens do método de bolores termorresistentes.
Item 7.6 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, com a
seguintes alterações no método de leveduras osmofílicas:
Item 7.6.2.1 O filtro membrana de poro 0,80μm foi substituído pelo de poro 0,45μm.
Item 7.6.2.2 Foram introduzidas mais opções de diluentes para a análise.
7.1. Introdução amônia e o nitrogênio orgânico. Entretanto, se for

necessário utilizar proteínas ou aminoácidos como
As informações e orientações contidas nesse ca- fonte de nitrogênio ou de carbono, várias espécies
pítulo são da American Public Health Association vão apresentar um crescimento limitado. As le-
(APHA), descritas na 5ª edição do Compendium veduras, de maneira geral, são mais exigentes do
of Methods for the Microbiological Examination que os bolores. Muitas são incapazes de assimilar
of Foods (Salfinger & Tortorello, 2015) e da 3ª nitrato e carboidratos complexos, algumas exigem
edição do livro Fungi and Food Spoilage (Pitt & vitaminas e outras, como Zygosaccharomyces bai-
Hocking, 2009). Quando diferentes ou comple- lii, por exemplo, não conseguem utilizar a sacaro-
mentares às do Compendium, foram também in- se como única fonte de carbono. Esses fatores, de
cluídas recomendações da 17ª edição do Standard uma certa forma, limitam a gama de alimentos sus-
Methods for the Examination of Dairy Products ceptíveis à deterioração por leveduras.
(Wehr & Frank, 2004), específicas para a análise Os bolores e leveduras são também bastante resis-
de produtos lácteos. tentes à condições adversas, como pH ácido e ativi-
Os bolores e leveduras constituem um grande gru- dade de água baixa. Com relação ao pH, os fungos
po de microrganismos, a maioria originária do solo são muito pouco afetados pela variação na faixa de
ou do ar. Os bolores são extremamente versáteis, a 3,0 a 8,0. Vários bolores crescem abaixo de 2,0 e
maioria das espécies capaz de assimilar qualquer diversas leveduras abaixo de 1,5. Entretanto, quan-
fonte de carbono derivada de alimentos. A maio- do o pH afasta-se do ótimo (geralmente próximo
ria também é indiferente com relação às fontes de de 5,0) a velocidade de crescimento diminui e, se
nitrogênio, podendo utilizar o nitrato, os íons de houver outros fatores de inibição (atividade de água,

temperatura etc.), seu efeito restritivo sobre a velo- Os fungos infecciosos raramente são associados
cidade de crescimento torna-se mais acentuado. aos alimentos, porém, certas leveduras de origem
A temperatura ótima de crescimento da maioria alimentar podem desencadear reações alérgicas
dos fungos encontra-se na faixa de 25 a 28 ºC, não e alguns bolores podem provocar infecções em
crescendo bem nas temperaturas mesófilas (35-37 indivíduos imunodeprimidos. Vários bolores pro-
ºC) e raramente nas temperaturas de bactérias ter- duzem micotoxinas, que são metabólitos tóxicos
motolerantes (45 ºC). Seu crescimento não é inco- formados durante o crescimento. Os gêneros de
mum sob condições de refrigeração (5 ºC), porém, bolores toxigênicos mais importantes são Asper-
abaixo de 10 ºC negativos os alimentos podem ser gillus, Penicillium e Fusarium.
considerados microbiologicamente estáveis.
Os bolores deteriorantes de alimentos, como quase 7.1.1. Comentários sobre os
todos os outros fungos filamentosos, exigem oxi- métodos de análise de bolores e
gênio para crescimento, podendo ser considera- leveduras totais
dos aeróbios estritos. No entanto, várias espécies
são eficientes em utilizar pequenas quantidades de A quantificação de bolores e leveduras em alimen-
oxigênio, de forma que o efeito do O2 é depen- tos é feita pelo método de contagem padrão em
dente da quantidade absoluta dissolvida no subs- placas, determinando-se o número de unidades
trato, e não da concentração presente na atmos- formadoras de colônias (UFC). O método mais
fera. Ao contrário dos bolores, muitas espécies recomendado é o plaqueamento em superfície,
de leveduras são capazes de crescer na completa para aumentar a exposição ao oxigênio e evitar
ausência de O2 e em diferentes concentrações de o “stress” causado pelo meio de cultura quente.
CO2. Isso as torna os deteriorantes mais comuns Vários meios podem ser utilizados:
de alimentos líquidos engarrafados, nos quais o O Capítulo 21 do Compendium (Ryu & Wolf-Hall,
crescimento dos bolores é limitado pela dispo- 2015) recomenda o Ágar Dicloran Rosa de Ben-
nibilidade de oxigênio. Eventualmente, algumas gala Cloranfenicol (DRBC), para alimentos com
espécies de bolores dos gêneros Mucor, Rhizopus, atividade de água superior a 0,95 e o Ágar Di-
Byssochlamys e Fusarium podem crescer nesses cloran Glicerol 18 (DG18), para alimentos de ati-
produtos, provocando deterioração. vidade de água menor ou igual a 0,95. O DRBC
A consistência do alimento, assim como a atmos- contém cloranfenicol, para inibir bactérias, além
fera de armazenamento, exerce uma considerável de dicloran e rosa de bengala, para restringir o es-
influência sobre os tipos de fungos que irão pro- palhamento da colônia. O DG18, além de cloran-
vocar a deterioração do produto. Em linhas gerais, fenicol e dicloran, contém também glicerol, que
as leveduras predominam em alimentos líquidos, reduz a atividade de água do meio.
porque são unicelulares e se dispersam mais facil- O Capítulo 8 do Standard Methods for the Exami-
mente em líquidos. Além disso, substratos líqui- nation of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004)
dos oferecem maior oportunidade para desenvol- recomenda o DRBC para produtos lácteos em geral
vimento de condições anaeróbias, ideais para as e o Ágar Extrato de Levedura Glicose Cloranfeni-
leveduras fermentativas. Os bolores, ao contrário, col (YEGC) para amostras com predomínio de le-
são favorecidos por substratos sólidos firmes, em veduras ou com leveduras injuriadas pelo processa-
cuja superfície há fácil acesso ao oxigênio. Por mento. Nesses produtos o DRBC recupera menos
outro lado, essa afirmação não deve ser entendi- leveduras do que o YEGC. Para produtos não sub-
da como absoluta, sugerindo que leveduras não metidos a tratamento térmico, acidificação ou outro
possam deteriorar alimentos sólidos ou bolores tratamento que possa provocar injúrias às células,
alimentos líquidos. Simplesmente, as leveduras pode também ser utilizado Ágar Batata Dextrose
são mais competitivas em líquidos, provocando Acidificado (PDA-AC), porém, algumas bactérias
alterações percebidas mais fácil ou rapidamente. podem crescer neste meio (Taniwaki et al., 1999).

Contagem de bolores e leveduras □ 89
Tabela 7.1. “Kits” analíticos oficializados pela AOAC International para a contagem bolores e leveduras
em alimentos (Latimer, 2016, AOAC International, 2016).
AOAC Official Method Fabricante Nome do “kit Aplicação
Petrifilm Yeast and Mold Count
997.02 3M Microbiology Products Alimentos
Plate
SimPlate Yeast and Mold Color Alimentos, ingredientes e amos-
2002.11 BioControl Systems Inc.
Indicator (YM-CI) tras ambientais
Iogurte, massa de pão congelada,
salame fermentado, creme de
3M™ Petrifilm™ Rapid Yeast leite, torta pronta para consumo,
2014.05 3M Microbiology Products
and Mold Count Plate carne moída congelada, sanduí-
ches, maçã fatiada, amêndoas e
sopa desidratada
Outros métodos já oficializados pela AOAC In- 7.1.3. Bolores termorresistentes

ternational são os “kits” analíticos descritos na Os fungos, de maneira geral, apresentam baixa re-
Tabela 7.1. sistência ao calor, sendo destruídos com relativa
facilidade por tratamentos térmicos brandos. Há,
7.1.2. Fungos psicrotróficos entretanto, exceções, pois certos fungos filamen-
tosos produzem ascosporos ou outras estruturas
Os bolores e leveduras também apresentam cepas
de resistência capazes de sobreviver aos tratamen-
psicrotróficas, embora sejam menos estudadas
tos térmicos. Os mais comuns são dos gêneros
do que as bactérias. Os fungos predominam em
Byssochlamys, Neosartoria e Talaromyces, mas
alimentos refrigerados, com baixa atividade de
também podem ocorrer nos gêneros Penicillium,
água, alta acidez ou condições de embalagem que
Hamigera e Monascus.
inibam bactérias, incluindo, frutas, geléias e pro-
dutos fermentados (iogurte, queijos, embutidos A resistência térmica de algumas espécies de bo-
etc.). Os gêneros de leveduras mais encontrados lores termorresistentes isolados de alimentos en-
são Candida, Cryptococcus, Debaromyces, Han- contram-se descritas na Tabela 7.2.
senula, Kluveromyces, Pichia, Saccharomyces, Os bolores termorresistentes são mais comumen-
Rhodotorula, Torulopsis e Trichosporon. Os bolo- te associados com a deterioração de frutas e seus
res são Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Clados- derivados, processados termicamente. Sua sobre-
porium, Colletotrichum, Fusarium, Geotrichum, vivência ao tratamento térmico pode resultar em
Monascus, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sporo- crescimento com formação de micélios e, no caso
trichum, Thamnidium e Trichothecium. de produção de pectinases, na completa alteração
O método tradicional de quantificação de psicro- da textura.
tróficos em alimentos é contagem padrão em pla- Os bolores termorresistentes são amplamente
cas, determinando-se o número de unidades for- distribuídos no solo, porém, o número de espo-
madoras de colônias (UFC) de aeróbios por grama ros em frutas geralmente é baixo, não exceden-
ou mililitro. Os meios utilizados são o Ágar Di- do 1-10/100g ou ml dos produtos processados.
cloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC), Por essa razão, o sucesso da detecção depende da
para alimentos em geral (pode ser substituído pelo coleta de amostras significativamente maiores do
PCA suplementado com 100 mg/l de cloranfeni- que as normalmente requeridas nas demais análi-
col) e o Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG18), para ses de alimentos. Essas amostras podem ser con-
alimentos com atividade de água menor que 0,95. geladas antes da análise, porque os esporos não
A temperatura de incubação é de 7±1 ºC por 10 são afetados pelo congelamento.
dias ou 17±1 ºC por 16 horas, seguido de mais três A detecção é baseada no tratamento térmico das
dias a 7±1 ºC. amostras, para eliminação das células vegetativas

Tabela 7.2. Resistência térmica de alguns bolores termorresistentes isolados de alimentos e bebidas
(Rico-Munoz et al., 2015).
Espécie e estrutura de resistência Temperatura Resistência
Byssochlamys fulva (ascosporos) 90 ºC em suco de tomate D90 ºC = 8,1min
Byssochlamys nivea (ascosporos) 90 ºC em suco de tomate D90 ºC = 1,5min
Byssochlamys nivea (ascosporos) 85 ºC em tampão pH 3,5 D85 ºC = 1,3 a 4,5min
Byssochlamys spectabilis (ascosporos) 85 ºC em tampão ACES D85 ºC = 45 a 75min
Penicillium lapidosum (ascosporos) 81 ºC em suco de mirtilo 10min sobrevive, 15min não sobrevive
Penicillium lapidosum (cleistotecio) 93,3 em suco de mirtilo 9min sobrevive, 10min não sobrevive
Monascus ruber (ascosporos) 80 ºC em tampão citrato pH 4,0 D80 ºC = 2,1min
Neosartorya glabra (ascosporos) 90 ºC em água 60min sobrevive
Neosartoria fischeri (ascosporos) 90 ºC em suco de tomate D90 ºC = 4,4 a 4,6min
Neosartoria fischeri (ascosporos) 87,8 ºC em suco de maçã D87,8 ºC = 1,4min, z = 5,6 ºC
Neosartoria fischeri (ascosporos) 85 ºC em suco de uva D85 ºC = 10,1min
Talaromyces macrosporus (ascosporos) 90,6 ºC em suco de maçã D90,6 ºC = 2,2min, z = 5,2 ºC
Talaromyces macrosporus (ascosporos) 85 ºC em tampão ACES pH 6,8 D85 ºC = 30 a 100min
ACES = ácido N-(2-acetamida)-2-aminoetanosulfonico.
de bolores, leveduras e bactérias, seguido do pla- servantes, podendo adquirir, após a primeira expo-
queamento em um meio adequado ao crescimento sição, resistência a quantidades cada vez mais altas.
de bolores, como o Ágar Batata Dextrose (PDA) Em quarto lugar, é xerofílica (cresce em atividades
ou o Ágar Extrato de Malte (MEA). de água da ordem de 0,80 a 25 ºC e 0,86 a 30 ºC)
e mesofílica (apresenta temperatura de crescimento
7.1.4. Leveduras resistentes a na faixa de 5 a 40 ºC). Afortunadamente, apresen-
conservantes ta baixa resistência térmica (D50 ºC = 0,1 a 0,3min
para as células vegetativas e D60 ºC = 8 a 14min para
Algumas espécies de leveduras conhecidas como
os ascosporos), além de não utilizar a sacarose que,
PRY (preservative resistant yeasts) são capazes de
adicionada em lugar da glicose, pode prevenir a dete-
crescer na presença de conservantes, como o dióxi-
rioração. O pH mínimo de crescimento é de 2,2-2,5.
do de enxofre e os ácidos sórbico, benzóico, propi-
ônico e acético. A mais importante dentre essas es- Os produtos susceptíveis de deterioração fermen-
pécies é Zygosaccharomyces bailii, mas Zygosac- tativa ou explosiva por Z. bailii incluem molhos
charomyces bisporus, Schizosacharomyces pombe, de tomate, mostarda, azeitonas, maionese e outros
Cândida krusei e Pichia membranaefaciens tam- molhos para saladas, refrescos e refrigerantes (car-
bém podem crescer (Pitt & Hocking, 2009). bonatados ou não), sucos de frutas (concentrados
ou não), xaropes de frutas e outras coberturas, ci-
Zigosaccharomyces bailii dra, vinhos e vinagre balsâmico. A prevenção deve
(Lindner) Guilliermond 1912 ser baseada na completa exclusão das células de Z.
Dados levantados por Pitt & Hocking (2009) des- bailii do produto, porque a experiência mostra que
tacam Zigosaccharomyces bailii como a levedura a distribuição de apenas cinco células adaptadas
mais conhecida e temida na indústria de alimen- por embalagem é suficiente para resultar na dete-
tos ácidos. Em primeiro lugar, fermenta a gli- rioração de uma alta porcentagem da produção. A
cose vigorosamente com produção de CO2, não alternativa mais segura é a pasteurização do produ-
sendo inibida por pressões da ordem de 80 psig to na embalagem final, garantindo-se a manuten-
(560 kPa). Em segundo lugar, é resistente à maio- ção de temperaturas de 65-68 ºC no centro da em-
ria dos conservantes utilizados na prevenção de balagem por vários segundos. Se a pasteurização
fungos, crescendo na presença de 400 a 800 mg/kg for feita antes da distribuição do produto na em-
ou mais de ácido benzóico ou sórbico. Em terceiro balagem, então é necessária a manutenção de um
lugar, apresenta mecanismos de adaptação aos con- rigoroso programa de limpeza e sanificação das li-

nhas de processamento, para prevenir a presença de em pH extremamente baixo (1,3 a 1,9, dependendo
focos de contaminação. A filtração em membrana do ácido presente), numa ampla faixa de tempera-
antes da distribuição nas embalagens também pode tura (8 a 47 ºC), com excelente desenvolvimento
ser uma alternativa eficiente, na impossibilidade da a 37 ºC. Apresenta resistência aos conservantes,
pasteurização. Sempre que possível, recomenda-se crescendo em 335ppm de ácido sórbico, 360ppm
substituir a glicose pela sacarose e, nos produtos de ácido benzóico e 30ppm de SO2 livre. Para cé-
sintéticos, evitar a adição de sucos de frutas natu- lulas adaptadas ao ácido benzóico a concentração
rais e de fontes utilizáveis de carbono e nitrogênio. inibitória mínima (MIC) encontrada é de 13,5g/l de
ácido acético, 8g/l de ácido propiônico, 440 mg/l de
Zygosaccharomyces bisporus
ácido benzóico e 1g/l de metil paraben. Apresenta
(Naganishi) Lodder & Kreger 1952
resistência térmica relativamente alta (sobrevive
Segundo Pitt & Hocking (2009), Z. bisporus apre-
80min a 56 ºC), embora seja inativada com 2min
senta características fisiológicas semelhantes às de
a 65 ºC. O tipo de deterioração mais comumente
Z. bailii, porém, é mais xerofílica (cresce em ativi-
provocado em alimentos é a formação de filmes su-
dade de água de 0,70 em xarope de glicose/glice-
perficiais e tem sido isolada de sementes de cacau,
rol). Os ascosporos sobrevivem a 60 ºC por 10min,
figos, molhos de tomate, produtos cítricos, suco de
mas não por 20min. Há poucos relatos sobre essa
laranja concentrado e outros produtos de frutas, re-
espécie na literatura e sua presença é menos co-
frescos, refrigerantes, azeitonas, queijos, iogurte e
mum em produtos deteriorados, embora apresente
outros produtos fermentados de leite
o mesmo potencial de deterioração de Z. bailii.
Schizosaccharomyces pombe Pichia membranaefaciens
Lindner 1893 Hansen 1904
S. pombe apresenta duas caracteríticas que a dis- Pitt & Hocking (2009) destacam as seguintes carac-
tinguem da maioria das demais leveduras deterio- terísticas de P. membranaefaciens: produz ascos-
rantes de alimentos (Pitt & Hocking, 2009). Em poros em forma de chapéu, cresce na faixa de 5 a
primeiro lugar, a reprodução vegetativa não se dá 37 ºC e é halofílica, podendo crescer em até 15,2%
por brotamento, mas sim por fissão lateral, e em de NaCl (aw 0,90), dependendo do pH. Resistente
segundo lugar, cresce melhor e mais rapidamente a conservantes, seu crescimento já foi relatado em
a 37 do que a 25 ºC, o que a torna um deteriorante concentrações de benzoato de sódio que, dependen-
potencial em países tropicais. É osmofílica (cres- do do pH, variaram de 250 mg/kg (pH 3,0) a 3000
ce em atividade de água de 0,81 em meios a base mg/kg (pH 4,5). Em pH 5,0 o crescimento já foi
de glicose), resistente aos conservantes (resiste observado em 250 mg/kg de sorbato, mas não em
a 120 mg/kg de SO2 livre e a 600 mg/l de ácido pH 3,0. O pH mínimo de crescimento varia de 1,9 a
benzóico) e apresenta resistência térmica depen- 2,2, dependendo do ácido presente. É muito sensí-
dente da atividade de água e do soluto presente, vel ao calor, resistindo por 30min a 56 ºC ou 10min
sendo maior na presença de sacarose (aw 0,95/D65 a 55 ºC, mas não por 20min a 55 ou 10 minutos a
ºC = 1,48min) do que na presença de glicose (aw 60 ºC. Tem sido isolada da salmoura de azeitonas,
0,95/D65 ºC = 0,41min), frutose (aw 0,95/D65 ºC = onde provoca “stuck fermentation” (reduz a quan-
0,27min) ou glicerol (aw 0,95/D65 ºC = 0,21min). É tidade de carboidrato sem a consequente produção
relativamente incomum como deteriorante, tendo de ácido lático), de diversos produtos conservados
sido isolada de xaropes de açúcar e licor de fram- em ácido acético (cebolas, pepinos, picles e chu-
boesa conservados com SO2. crute), de molhos de tomate, de maionese e outros
Candida krusei molhos para saladas, onde responde pela formação
(Castellani) Berkhout 1923 de filmes, de suco de laranja concentrado e outros
Pitt & Hocking (2009) destacam, como principais produtos cítricos, de mosto de uva e de linhas de
características de C. krusei: a capacidade de crescer processamento de refrescos e refrigerantes.

A detecção de leveduras resistentes aos conservan- (em 10% de glicose peso/peso) a cerca de 33 ºC
tes é baseada na inoculação em meios de cultura (em 60% de glicose peso/peso, atividade de água
contendo ácido acético. Pitt & Hocking (2009) reco- de 0,87). Dependendo da concentração de glicose,
medam o Ágar Extrato de Malte com 0,5% de ácido a temperatura mínima varia de 4 ºC (em 10% de
acético (MAA) ou o Ágar (Caldo) Triptona Glicose glicose) a 7 ºC (em 60% de glicose) e a máxima
Extrato de Levedura com 0,5% de Ácido Acético varia de 37 ºC (em 10% de glicose) a 42 ºC (em
(TGYA-TGYB). A inoculação no MAA ou TGYA 60% de glicose). Na presença de 46% de glicose,
é feita em superfície e as placas são incubadas a 30 a faixa de pH de crescimento é de 1,8 a 8,0.
ºC por dois a três dias. O caldo TGYB é usado para A resistência térmica de Z.rouxii varia com o subs-
enriquecimento prévio das amostras, quando a po- trato, sendo maior na presença de sacarose (aw
pulações é muito baixa, aumentando a probabilida- 0,95/D65 ºC = 1,9min) do que na presença de glico-
de de recuperação das cepas em MAA ou TGYA. O se, frutose ou glicerol (aw 0,95/D65 ºC = 0,2-0,6min).
Capítulo 59 do Compendium (Lawlor & Leighton, A atividade de água exerce uma grande influência
2015) recomenda o Agar Leveduras Resistentes aos sobre a capacidade de sobrevivência ao calor, que
Conservantes (Preservative Resistant Yeast Medium aumenta com a redução do teor de água livre:
– PRY), que contém 1% de ácido acético. O Capí- aw D55 ºC D60 ºC D65,5 ºC Z
tulo 21 (Ryu & Wolf-Hall, 2015), entretanto, reco- 0,995 a 0,998 < 0,1 min < 0,1 min
menda os mesmos meios de Pitt & Hocking (2009). 0,94 0,6 min <0,1 min < 0,1 min
0,90 7 min < 0,1 min 8 ºC
7.1.5. Leveduras osmofílicas 0,85 55 min 10 min 0,4 min 8 ºC
De maneira geral as leveduras apresentam ativi- A combinação entre capacidade de crescer em ati-
dade de água mínima de crescimento na faixa de vidades de água extremamente baixas e fermentar
0,88 e a maioria dos bolores na faixa de 0,80. Os hexoses vigorosamente torna Z. rouxii a segunda
bolores capazes de crescer em atividades de água levedura mais frequentemente associada à de-
abaixo do limite normal de 0,80 são chamados de terioração de alimentos processados, perdendo
xerófilicos (ou xerófilos), enquanto as leveduras apenas para Z. bailii. Dentre os produtos de risco
que crescem abaixo do limite de 0,88 são comu- incluem-se caldo de cana, extrato de malte, sucos
mente conhecidas como osmófilas ou osmofílicas de frutas concentrados, coberturas e caldas cara-
(aquelas que crescem em altas concentrações de meladas, bombons com centro mole, frutas secas
açúcar) ou halófilas (aquelas que crescem em altas e xaropes de açúcar. A conservação não pode ser
concentrações de sal). Segundo Pitt & Hocking baseada exclusivamente na redução da atividade de
(2009), a maioria das leveduras osmofílicas são água porque os produtos não podem ser concentra-
do gênero Zygosaccharomyces, incluindo Z. rou- dos a valores abaixo do seu mínimo de crescimen-
xi, Z. bailii e Z. bisporus. to. Dessa forma, assim como ocorre com Z. bailii,
Zygosaccharomyces rouxii a prevenção exige a completa exclusão de suas
(Boutroux) Yarrow células do produto, sendo a pasteurização antes
Pitt & Hocking (2009) destacam as seguintes cada concentração considerada a alternativa mais
racterísticas de Z. rouxii: É extremamente resis- segura, além da refrigeração por volta dos 0 ºC.
tente às baixas atividades de água, sendo consi- Os conservantes são eficientes no controle do seu
derada o 2º organismo mais xerofílico conhecido crescimento, mas raramente são permitidos em
na natureza (o primeiro é outro fungo, o bolor Xe- produtos concentrados. É essencial a manutenção
romyces bisporus). A atividade de água mínima de um rigoroso programa de limpeza e sanifica-
relatada é 0,62 em xarope de frutose e 0,65 em xa- ção das linhas de processamento, porque Z. rouxii
rope de glicose/glicerol, podendo crescer e produ- pode crescer continuamente nos equipamentos e
zir ascosporos em ameixas secas com aw 0,70. A sua presença no produto só será detectada depois
temperatura ótima de crescimento varia de 24 ºC de um período considerável de tempo.

A detecção de leveduras osmofílicas é baseada na atividade de água maior que 0,95 e produtos
inoculação em meios de cultura com alta concen- lácteos em geral)
tração de glicose. A inoculação pode ser feita por □ Placas de Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18)
plaqueamento em superfície ou filtração em mem- (para alimentos com atividade de água menor
brana e as placas são incubadas a 30 ºC por cinco ou igual a 0,95, exceto produtos lácteos)
a sete dias. □ Placas de Ágar Extrato de Levedura Glicose
Cloranfenicol (YEGC) opcional para produtos
lácteos com predomínio de leveduras ou com
7.2.a. Método de leveduras injuriadas)
plaqueamento APHA 21:2015 □ Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mer-
para contagem de bolores e gulhada em etanol 70%
□ Estufa incubadora regulada a 25 ºC
leveduras em alimentos
Método da American Public Health Association 7.2.a.2. Procedimento
(APHA), descrito no Capítulo 21 da 5ª edição do O esquema geral de análise para contagem de bo-
Compendium of Methods for the Microbiological lores e leveduras em alimentos pelo método de
Examination of Foods (Ryu & Wolf-Hall, 2015). plaqueamento APHA 21:2015 encontra-se descri-
Incluídas também as recomendações específi- to na Figura 7.1.a.
cas do Capítulo 8 do Standard Methods for the a) Preparação das amostras e diluições seria-
Examination of Dairy Products (Frank & Yousef, das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-
2004), para a análise de produtos lácteos. pítulo 2.
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as b) Inoculação. Selecionar três diluições adequa-
orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os das da amostra e inocular (plaqueamento em
detalhes e cuidados envolvidos na contagem de superfície) 0,1 ml de cada diluição em placas
microrganismos em placas, da seleção das dilui- previamente preparadas e secadas, de um dos
ções ao cálculo dos resultados. O procedimento seguintes meios de cultura:
descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- ▪ Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol
supondo que sejam conhecidos pelo analista. (DRBC), para alimentos com atividade de água
maior que 0,95 e produtos lácteos em geral.
7.2.a.1. Material requerido para a ▪ Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18), para ali-
análise mentos com atividade de água menor ou igual
Preparação da amostra e diluições seriadas a 0,95, exceto produtos lácteos.
▪ Ágar Extrato de Levedura Glicose Cloranfe-
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou
nicol (YEGC), opcional para produtos lácteos
Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
com predomínio de leveduras ou com levedu-
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada
ras injuriadas.
0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
▪ Ágar Batata Dextrose Acidificado, opcional
para produtos lácteos não submetidos ao ca-
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- lor, acidificação ou outro tratamento que possa
tulo 2 para verificar casos especiais em que o provocar injúrias às células
tipo ou volume de diluente variam em função ▪ Espalhar o inóculo com uma alça de Drigalski,
da amostra analisada. das placas de maior para as placas de menor
Contagem por plaqueamento em superfície diluição, até que todo o excesso de líquido
□ Placas de Ágar Dicloran Rosa de Bengala seja absorvido. Se as contagens estimadas na
Cloranfenicol (DRBC) (para alimentos com amostra forem menores do que 100/g ou ml,

Figura 7.1.a. Esquema geral de análise para contagem de bolores e leveduras em alimentos pelo
método de plaqueamento APHA 21:2015 (Ryu & Wolf-Hall, 2015).

inocular 1 ml da primeira diluição, distribuin- de bolores por dez e pelo inverso da diluição.
do o volume por quatro placas, três com 0,3 ml Para calcular o número de UFC/g ou ml de
e uma com 0,1 ml. leveduras, multiplicar o número de colônias
Nota b.1) Antes do uso, estocar as placas de DRBC ou confirmadas como leveduras por dez e pelo
DG-18 em geladeira, protegidas contra a luz, para inverso da diluição. Para calcular o número
evitar a fotodegradação do rosa de bengala, com total de bolores e leveduras, somar o número
formação de compostos inibidores para os bolores e
de colônias de bolores e o número de colônias
leveduras.
confirmadas como leveduras e multiplicar por
c) Incubação. Aguardar que as placas sequem (mí- dez e pelo inverso da diluição.
nimo 15 minutos) e incubar a 25 ºC por cinco Exemplo
dias, sem inverter, no escuro. Recomenda-se não Diluição 10-2 (inoculados 0,1 ml)
contar as colônias antes de cinco dias, porque a Total de colônias típicas de bolores na placa = 30
movimentação das placas pode resultar em cres- Colônias presuntivas de leveduras na placa = 40, cinco
submetidas à confirmação, quatro confirmadas (80%)
cimento secundário (devido ao deslocamento de
Total de colônias de leveduras na placa = 40x0,8 = 32
esporos), invalidando a contagem final. UFC/g ou ml de bolores = 30x102x10 = 3,0x104.
d) Contagem das colônias e cálculo dos resulta- UFC/g ou ml de leveduras = 32x102x10 = 3,2x104.
dos. Para a contagem de colônias e cálculo dos UFC/g ou ml de bolores e leveduras = (30+32)x102x10
= 6,2x104.
resultados, selecionar as placas com 10 a 150
colônias e contar as colônias com o auxílio de
uma lupa, em um contador de colônias. 7.2.b. Métodos de
Na placa selecionada, contar separadamente
as colônias com aspecto filamentoso, cotono-
plaqueamento
so ou pulverulento, características de bolores, ISO 21527-1:2008 e
anotando o resultado. ISO 21527-2:2008 para
Na mesma placa, contar as demais colônias, contagem de bolores e
que podem ser de leveduras ou de bactérias,
eventualmente capazes de crescer. Selecionar
leveduras em alimentos
pelo menos cinco dessas colônias e verificar a Métodos da International Organization for Standar-
morfologia das células ao microscópio, obser- dization, aplicam-se a alimentos destinados ao con-
vando se a cultura é de leveduras, bactérias ou sumo humano, à rações animais. A ISO 21527-1
mistura de ambas. Para isso, pode ser feita uma destina-se a alimentos com atividade de água maior
montagem úmida ou uma coloração de Gram, do que 0,95 e a ISO 21527-2 a alimentos com ativi-
conforme procedimento descrito no Capítulo dade de água menor ou igual a 0,95.
5. Considerar como confirmadas todas as co-
lônias que apresentarem leveduras ou mistura
7.2.b.1. Material requerido para a
de leveduras e bactérias. Determinar o número
análise
de colônias de leveduras na placa em função
da porcentagem confirmada. Por exemplo, de Preparação da amostra e diluições seriadas
30 colônias contadas, cinco foram submetidas □ Água Peptonada (H2Op) (diluente para amos-
à confirmação e três foram confirmadas como tras com atividade de água maior que 0,95)
leveduras (60%). Então, o número de colônias □ Água Peptonada (H2Op) com 20 a 35% de dex-
de leveduras na placa é de 30x0,6=18. trose ou glicerol (diluente para amostras com
O cálculo dos resultados deve ser feito de atividade de água menor ou igual a 0,95)
acordo com as orientações do Capítulo 3. Para □ Pipetas de 1 ml
calcular o número de UFC/g ou ml de bolo- Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
res, multiplicar o número de colônias típicas tulo 2 para verificar casos especiais em que o

tipo ou volume de diluente variam em função Nota b.1) No caso de alimentos sólidos particulados
da amostra analisada. como grãos, nozes e castanhas, é recomendado o pla-
queamento direto. Desinfetar a superfície do produ-
Contagem por plaqueamento em superfície to com uma solução de hipoclorito de sódio 0,35%
□ Placas de Ágar Dicloran Rosa de Bengala Clo- (1.000μg/g) por dois minutos, enxaguar com água
ranfenicol (DRBC) (para alimentos com ativi- purificada, secar em papel estéril e colocar direta-
dade de água maior que 0,95) mente sobre o meio de cultura.
Nota b.2) Estocar as placas de DRBC ou DG-18 em
□ Placas de Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18)
geladeira, protegidas contra a luz, para evitar a fo-
(para alimentos com atividade de água menor todegradação do rosa de bengala, com formação de
ou igual a 0,95) compostos inibidores para os bolores e leveduras.
□ Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mer- Nota b.3) O método recomenda a inoculação em duplica-
gulhada em etanol 70% ta, mas a ISO 7218:2007/Amd.1:2013 já não exige du-
□ Estufa incubadora regulada a 25±1 ºC plicata se forem inoculadas pelo menos duas diluições.
Nota b.4) Na análise de produtos em que possa ocorrer
crescimento excessivo de bactérias (carnes frescas, por
7.2.b.2. Procedimento exemplo), suplementar o DRBC com 50 mg/l de clori-
O esquema geral de análise para contagem de bo- drato de clorotetraciclina. Para tanto, preparar uma so-
lores e leveduras em alimentos pelos métodos de lução 0,1% da clorotetraciclina, esterilizar por filtração
e adicionar 5 ml da solução a cada 100 ml de DRBC,
plaqueamento ISO 21527-1:2008 e ISO 21527- imediatamente antes de distribuir o meio em placas.
2:2008 encontra-se descrito na Figura 7.1.b. Nota b.5) Para que os bolores possam exibir a morfo-
a) Preparação das amostras e diluições seriadas logia completa, particularmente os pigmentos que
Seguir os procedimentos descritos no Capítulo produzem, são necessários elementos traço que não
2. Devido à rápida sedimentação dos esporos de estão presentes no DRBC. Se a observação dessas
características for necessária, preparar uma solução
bolores nas pipetas, recomenda-se que, uma vez
com 1g de ZnSO4 e 0,5g de CuSO4 em 100 ml de
cheias com as amostras e/ou suas diluições, as água purificada e adicionar 1 ml dessa solução a cada
pipetas sejam mantidas em posição horizontal litro de DRBC, antes da esterilização.
(não vertical) enquanto manuseadas. Nota b.6) Para evitar o crescimento excessivo de Mu-
Nota a.1) No caso de alimentos com baixa atividade de coraceae, suplementar o DRBC com tergitol 7, na
agua é recomendado suplementar o diluente com 20 concentração de 1 ml por litro de meio.
a 35% de dextrose ou glicerol, para evitar choque os-
c) Incubação. Aguardar que as placas sequem e
mótico a bolores xerofílicos e leveduras osmofílicas.
incubar o DRBC a 25±1 ºC/5 dias e o DG18
b) Inoculação. Selecionar pelo menos duas dilui-
25±1 ºC/5-7dias, sem inverter. No caso da pre-
ções adequadas da amostra e inocular (plaque-
sença de bolores de crescimento rápido, contar
amento em superfície) 0,1 ml de cada diluição
as colônias com dois dias de incubação e, no-
em placas previamente preparadas e secadas,
vamente, após cinco dias (DRBC) ou 5-7 dias
de um dos seguintes meios de cultura:
(DG18). Se necessário, manter as placas em re-
▪ Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfeni-
pouso sob luz diurna difusa por um a dois dias.
col (DRBC), para alimentos com atividade de
Os esporos de bolores se dispersam no ar com
água maior que 0,95.
grande facilidade, por isso, a manipulação das
▪ Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18), para alimen-
placas deve ser feita com cuidado, para evitar
tos com atividade de água menor ou igual a 0,95.
o desenvolvimento de colônias satélites (supe-
Espalhar o inóculo com uma alça de Drigalski,
restimar a população).
das placas de maior para as placas de menor dilui-
ção, até que todo o excesso de líquido seja absor- Nota c.1) Pode ser usado o plaqueamento em profundi-
dade, mas neste caso a equivalência entre os resulta-
vido. Se as contagens estimadas na amostra forem
dos deve ser validada e não é admitida a diferencia-
menores do que 100/g ou ml, inocular 1 ml da ção entre leveduras e bolores.
primeira diluição, distribuindo o volume por qua- Nota c.2) Recomenda-se que as placas sejam acondicio-
tro placas, três com 0,3 ml e uma com 0,1 ml. nadas em um saco plástico (aberto), para prevenir a

Figura 7.1.b. Esquema geral de análise para contagem de bolores e leveduras em alimentos pelos
métodos de plaqueamento ISO 21527-1:2008 e ISO 21527-2:2008.

contaminação da incubadora numa eventual dissemi- Segue o mesmo procedimento da contagem total
nação de bolores para fora das placas. de bolores e leveduras (método APHA 21:2015),
d) Contagem das colônias e cálculo dos resulta- alterando a condição de incubação, que pode ser
dos. Para a contagem de colônias e cálculo dos 7±1 ºC por 10 dias ou 17±1 ºC por 16 horas, segui-
resultados, selecionar as placas com 10 a 150 do de mais 3 dias a 7±1 ºC.
colônias e contar as colônias com o auxílio Na preparação das amostras, a homogeneização
de uma lupa, em um contador de colônias. Se em “stomacher” é mais indicada do que em liqui-
houver predomínio de bolores, selecionar as dificador, que pode favorecer a fragmentação dos
placas com número de colônias na faixa mais micélios, alterando a contagem. Se for necessário
baixa de contagem. Se houver predomínio de usar liquidificador, não ultrapassar dois minutos
leveduras, selecionar as placas com número de de homogeneização.
colônias na faixa mais alta de contagem. Os meios recomendados são o Ágar Dicloran
Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC), para ali-
Nota d.1) A contagem pode ser imprecisa porque, no
caso dos bolores, consiste em uma mistura de mi-
mentos em geral (pode ser substituído pelo PCA
célios e esporos. O número de colônias depende do suplementado com 100 mg/l de cloranfenicol) e o
grau de fragmentação dos micélios e da proporção de Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18), para alimen-
esporos capazes de crescer no meio de cultura. A não tos com atividade de água menor ou igual a 0,95.
linearidade na redução decimal no número de colô-
nias entre uma diluição e outra pode ocorrer.
Se necessário, contar separadamente as colô- 7.4. Método de plaqueamento

nias de bolores (aspecto filamentoso, cotonoso APHA 22.4:2015 para contagem
ou pulverulento) e de leveduras. de bolores termorresistentes
Se houver dúvida quanto à identidade das cul-
turas nas colônias de leveduras, selecionar pelo
em alimentos
menos cinco colônias e verificar a morfologia Método da American Public Health Association
das células ao microscópio (montagem úmida, (APHA), descrito no Capítulo 22 da 5ª edição do
coloração simples ou coloração de Gram), para Compendium of Methods for the Microbiological
diferenciar de bactérias eventualmente presentes. Examination of Foods (Rico-Munoz et al., 2015).
Calcular os resultados de acordo com as orien-
tações do Capítulo 3. 7.4.1. Material requerido para a
análise
7.3. Método de plaqueamento □ Água destilada estéril
□ Ágar Batata Dextrose (PDA) com Antibióticos
APHA 13:2015 para contagem
ou Ágar Extrato de Malte (MEA) com Antibió-
de fungos psicrotróficos em ticos, em concentração dupla
alimentos □ Banho-maria regulado a 75-80 ºC
(APHA), descrito no Capítulo 13 da 5ª edição do 7.4.2. Procedimento
Examination of Foods (Vasavada & Critzer, 2015). O esquema geral de análise para contagem de bo-
O esquema geral de análise para contagem de fun- lores termorresistentes em alimentos pelo método
gos psicrotróficos em alimentos pelo método de APHA 22.4:2015 encontra-se descrito na Figura 7.3.
plaqueamento APHA 13:2015 encontra-se descri- ATENÇÃO. Recomenda-se que todas as etapas
to na Figura 7.2. da análise para detecção de bolores termorresis-

Figura 7.2. Esquema geral de análise para contagem de fungos psicrotróficos em alimentos pelo
método de plaqueamento APHA 13:2015 (Vasavada & Critzer, 2015).

Figura 7.3. Esquema geral de análise para contagem de bolores termorresistentes em alimentos pelo método APHA
22.4:2015 (Rico-Munoz et al., 2015).

tentes sejam desenvolvidas em capela de fluxo (dividir em alíquotas de 50 ml e usar uma

laminar, para evitar a contaminação acidental da membrana para cada alíquota). Lavar bem cada
amostra por bolores do ambiente. membrana após a filtração da amostra, filtrando
duas ou três porções de 20-30 ml do diluente
a) Choque térmico
estéril. Transferir as membranas para uma pe-
a.1) Para a análise de sucos de frutas concentra- quena bolsa plástica estéril e adicionar 10 ml
dos (Brix > 35º) e frutas ou polpas contendo de diluente à bolsa, mantendo as membranas
pedaços de frutas: pesar 100g da amostra em imersas no diluente. Transferir a bolsa para um
uma bolsa plástica estéril, adicionar 150 ml banho-maria com a temperatura controlada en-
de água purificada estéril e homogeneizar em tre 75 e 80 ºC. Manter no banho por 30min, ga-
“stomacher”, por 2-4min. Após a homogenei- rantindo que a superfície do líquido permaneça
zação, fechar a bolsa plástica e transferir para abaixo da superfície da água do banho.
um banho-maria com a temperatura controlada
b) Inoculação e incubação
entre 75 e 80 ºC. Manter no banho por 30min,
garantindo que a superfície do produto perma- Após o choque térmico, misturar a amostra com
neça abaixo da superfície da água do banho. igual volume de Ágar Extrato de Malte (MEA),
em dupla concentração, homogeneizando bem.
Nota a1) No caso de pectinas e outros espessantes pesar
12,5g da amostras e homogeneizar com 250 ml de Nota b.1) No caso das amostras filtradas, descartar as
água. No caso de outros produtos, diluir de acordo membranas e usar apenas o diluente, após agitar bem
com a solubilidade da amostra. para remover os microrganismos das membranas.
Nota b.2) Ao transferir a amostra para o frasco com o
a.2) Para a análise de sucos de frutas não con- meio de cultura é importante evitar que o material
centrados e produtos similares: transferir aderido na parte superior da bolsa plástica seja car-
250 ml da amostra para uma bolsa plástica es- regado, porque este material não ficou submerso na
téril, fechar a bolsa plástica e transferir para água do banho e pode conter fungos viáveis não re-
sistentes ao calor.
um banho-maria com a temperatura controlada
entre 75 e 80 ºC. Manter no banho por 30min, Distribuir o meio de cultura inoculado em placas
garantindo que a superfície do produto perma- de Petri estéreis, vazias, aguardando a completa
neça abaixo da superfície da água do banho. solidificação do ágar. Incubar as placas a 30 ºC
por 14 dias, acondicionadas em um saco plásti-
Nota a2) No caso de amostras muito ácidas (pH menor
que 2,0), ajustar o pH em 3,5-4,0. co, para prevenir a perda de umidade. Observar
a cada sete dias. A maioria dos esporos viáveis
a.3) Para a análise por filtração: no caso de normalmente germinará e formará colônias visí-
amostras líquidas sem sólidos em suspensão veis em 7-10 dias, porém, esporos injuriados pelo
(água e refrigerantes, por exemplo), filtrar duas calor poderão requerer um período adicional para
porções de 50 ml em filtros membrana de poro desenvolver colônias.
0,45µm. No caso de amostras sólidas que pos-
sam ser convertidas em líquidos límpidos (açú- c) Cálculo dos resultados
car e adoçantes, por exemplo), pesar duas por- Contar e somar as colônias desenvolvidas em to-
ções de 50g e dissolver cada porção em 100 ml das as placas e calcular o resultado como número
de água peptonada 0,1% (H2Op). Filtrar cada de esporos por quantidade de amostra inoculada
porção em filtros membrana de poro 0,45µm ou número de esporos por grama ou mililitro.

7.5. Métodos de O esquema geral de análise de leveduras resisten-

tes aos conservantes em alimentos pelo método
Pitt & Hocking:2009
de Pitt & Hocking (2009) encontra-se descrito nas
para plaqueamento ou Figuras 7.4.a e 7.4.b.
presença/ausência de
leveduras resistentes aos 7.5.1. Material requerido para a
análise
conservantes em alimentos
Método qualitativo de detecção com enrique-
Métodos descritos no Capítulo 4 da 3ª edição do cimento
Fungi and Food Spoilage (Pitt & Hocking, 2009) □ Tubos com 20 ml de Caldo Triptona Glicose Ex-
e no Capítulo 21 da 5ª edição do Compendium of trato de Levedura 0,5% de Ácido Acético (TGYB)
Methods for the Microbiological Examination of □ Placas de Ágar Triptona Glicose Extrato de
Foods (Ryu & Wolf-Hall, 2015). Levedura 0,5% de Ácido Acético (TGYA)
Figura 7.4.a. Esquema geral de análise de leveduras resistentes aos conservantes em alimentos pelo método qualitativo de
detecção com enriquecimento de Pitt & Hocking (2009).

Figura 7.4.b. Esquema geral de análise de leveduras resistentes aos conservantes em alimentos pelo
método de plaqueamento de Pitt & Hocking (2009).
□ Pipetas de 1 ou 2 ml 7.5.2.1. Método qualitativo de detecção

□ Estufa incubadora regulada a 30 ºC com enriquecimento
Método de contagem direta em placas
Descrito no Capítulo 4 da 3ª edição do Fungi and
Food Spoilage (Pitt & Hocking, 2009), esse méto-
do é o mais indicado para amostras em que a po-
pulação de leveduras resistentes aos conservantes
pode ser muito baixa, mas ainda assim potencial-
□ Pipetas de 1 ou 2 ml mente capaz de provocar a deterioração.
□ Placas de Ágar Triptona Glicose Extrato de Le-
vedura 0,5% de Ácido Acético (TGYA) ou Agar Procedimento. Inocular três alíquotas de 1g ou
Extrato de Malte 0,5% Ácido Acético (MAA) 1 ml da amostra em três tubos com 20 ml de Cal-
do Triptona Glicose Extrato de Levedura 0,5%
de Ácido Acético (TGYB). Incubar os tubos a
30 ºC/48-72h. Após a incubação, inocular 0,1 ml
7.5.2. Procedimento
de cada tubo em uma placa separada de Ágar Trip-
Pitt & Hocking (2009) descrevem dois procedi- tona Glicose Extrato de Levedura 0,5% de Ácido
mentos para leveduras resistentes aos conser- Acético (TGYA) (plaqueamento em superfície).
vantes, um qualitativo (presença/ausência) com Incubar as placas a 30 ºC/48-72h e observar se há
enriquecimento prévio das amostras e o outro de desenvolvimento de colônias. Apenas leveduras
contagem direta em placas, que é o mesmo do resistentes aos conservantes vão se desenvolver
Compendium. nesse método.

Nota a.1) O Agar Extrato de Malte 0,5% Ácido Acético Extrato de Malte 0,5% Ácido Acético (MAA) (pla-
(MAA) pode ser usado em lugar do TGYA, mas, se- queamento em superfície). Incubar as placas a 30
gundo os autores, a recuperação é melhor no TGYA,
porque seu pH (3,8) é um pouco mais alto do que o
ºC por três a cinco dias e observar se há desenvol-
do MAA (3,2) e a concentração de glicose também é vimento de colônias. Contar todas as colônias, por-
maior (10%) do que no MAA (2%). que apenas leveduras resistentes aos conservantes
vão se desenvolver nesses meios. Calcular os resul-
7.5.2.2. Método de contagem direta em
tados de acordo com as orientações do capítulo 3.
placas
Descrito no Capítulo 4 da 3ª edição do Fungi and
Food Spoilage (Pitt & Hocking, 2009) e no Capí- 7.6. Método de plaqueamento
tulo 21 da 5ª edição do Compendium of Methods ou filtração em membrana
for the Microbiological Examination of Foods
APHA 17.3:2015 para
(Ryu & Wolf-Hall, 2015). Esse método é o mais
indicado para amostras com população alta de le- contagem de leveduras
veduras resistentes aos conservantes, porque per- osmofílicas em alimentos
mite a inoculação de diluições.
Procedimento. Homogeneizar 25g da amostra com Método da American Public Health Association
225 ml de Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tam- (APHA), descrito no Capítulo 17 da 5ª edição do
pão Fosfato pH 7,2 (PB), seguindo os procedimen- Compendium of Methods for the Microbiological
tos descritos no capítulo 2. Selecionar três diluições Examination of Foods (Kim et al., 2015).
adequadas e inocular 0,1 ml de cada diluição em O esquema geral de análise de leveduras osmofí-
placas de Ágar Triptona Glicose Extrato de Le- licas em alimentos pelo método APHA 17.3:2015
vedura 0,5% de Ácido Acético (TGYA) ou Agar encontra-se descrito na Figura 7.5.
Figura 7.5. Esquema geral de análise de leveduras osmofílicas em alimentos pelo

método APHA 17.3:2015 (Kim et al., 2015).

7.6.1. Material requerido para a água de enxágue das linhas de processamento não
análise há necessidade de diluir). Filtrar em filtro-mem-
brana de poro 0,45µm , com a face quadriculada
Método de filtração em membrana
voltada para cima. Antes que a membrana seque,
□ Água destilada estéril
lavar as paredes do copo do sistema de filtração
□ Conjunto de filtração à vácuo
com 100 ml de água destilada estéril, filtrando
□ Filtros-membrana de poro 0,45µm
todo o volume de água para lavar a membrana.
□ Proveta graduada estéril
Desligar a bomba de vácuo antes que a membra-
□ Placas de Ágar Extrato de Malte Extrato de
na seque excessivamente. Transferir a membrana
Levedura 40% Glicose (MY40G)
para uma placa de Ágar Extrato de Malte Extrato
de Levedura 40% Glicose (MY40G), colocando-a
Método de plaqueamento em profundidade sobre a superfície do meio, com a face quadricula-
□ Diluentes: Tampão Fosfato pH 7,2 ou Água da voltada para cima. Incubar a placa a 30 ºC por
Peptonada 0,1% suplementados com 40% de cinco a sete dias.
glicose ou 30% de glicerol
□ Tubos de diluição com 9 ml de Tampão Fosfa- Nota a.1) Recomenda-se que a filtração de amostras de
açúcar líquido seja feita, preferencialmente, em porta
to pH 7,2 ou Água Peptonada 0,1% suplemen- filtros de metal, porque os porta filtros porosos são
tados com 40% de glicose ou 30% de glicerol de difícil limpeza e sanitização após a filtração desse
□ Placas de Petri estéreis tipo de produto.
□ Ágar Extrato de Malte Extrato de Levedura
40% Glicose (MY40G) 7.6.2.2. Método de plaqueamento em
□ Estufa incubadora regulada a 30 ºC profundidade
Esse método é recomendado para amostras que
7.6.2. Procedimento não permitem filtração, como sucos concentrados e
O Compendium apresenta dois procedimentos xaropes de frutas. Também é o mais indicado para
para a contagem de leveduras osmofílicas, um amostras com população alta de leveduras osmo-
usando a técnica de filtração em membrana e ou- fílicas, porque permite a inoculação de diluições.
tro usando a técnica de plaqueamento direto. Procedimento. Pesar 25g da amostra e adicionar
225 ml de Tampão Fosfato pH 7,2 ou Água Pepto-
7.6.2.1. Método de filtração em membrana
nada 0,1% suplementados com 40% de glicose ou
Esse método é recomendado para amostras líqui- 30% de glicerol (diluição 10-1). No caso da análise
das não deterioradas, sem sólidos em suspensão, de açúcar, preparar o diluente sem adição de glico-
como açúcar (líquido ou não, diluído) ou água se e adicionar 40% da própria amostra (ou o peso
de enxágue das linhas, nas quais a população de equivalente, no caso do açúcar líquido) ao diluen-
leveduras osmofílicas pode ser muito baixa, mas te, considerando essa diluição como a amostra
ainda assim potencialmente capaz de provocar a sem diluição. Preparar as diluições subsequentes,
deterioração. É importante considerar que a dilui- utilizando o mesmo diluente. Inocular 1 ml da 10-
ção da amostra com água destilada estéril, embora 1
, 1 ml da 10-2 e 1 ml da 10-3 (ou começando da
seja necessária para permitir a filtração, pode pro- amostra sem diluição no caso de açúcar) em pla-
vocar choque osmótico sobre as leveduras osmo- cas de Petri estéreis e adicionar aproximadamente
fílicas presentes. A possível redução no número 20 ml de Ágar Extrato de Malte Extrato de Leve-
de UFC obtido deve sempre ser levado em consi- dura 40% Glicose (MY40G). Selecionar diluições
deração na interpretação dos resultados. mais altas no caso de amostras deterioradas, em
Procedimento. Pesar 25g da amostra concentrada que as contagens esperadas sejam maiores. Incu-
e adicionar 25 a 50 ml de água destilada estéril, bar as placas a 30 ºC por cinco a sete dias e contar
homogeneizando bem (no caso de amostras de as colônias com o auxílio da lupa de um contador

de colônias. Somente as leveduras osmofílicas se- de incubação, porque a velocidade de crescimento

rão capazes de se desenvolver no Ágar MY40G e desses microrganismos é baixa, nas condições de
suas colônias serão diminutas após esse período atividade de água do meio.
7.7. Referências
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gical Examination of Foods, 5 th Ed. American Public Public Health Association, Washington, D. C., 2004.

8 Contagem de enterobactérias
rações no método.
Item 8.3 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, com a
seguintes alterações no método:
Item 8.3.2.c, d A temperatura de incubação do Caldo EEB e do Ágar VRBG passou a ser 35 ou 37 ºC.
Item 8.4 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) do Compendium pela 20ª edição (2016) do AOAC
Official Methods of Analysis, com a seguintes alterações no método:
Item 8.4.2.c (corrigido) A temperatura de incubação do Petrifilm Enterobacteriaceae foi corrigida de 35±1 ºC
para 37±1 ºC.
Item 8.5 (novo) método de plaqueamento ISO 21528-2:2004 para contagem de enterobactérias em alimentos.
8.1. Introdução tros carboidratos. Não são halofílicas, produzem

catalase (exceto Xenorhabdus e algumas cepas de
As orientações contidas nesse capítulo são da Shigella dysenteriae) e reduzem nitrato a nitrito
American Public Health Association (APHA), (exceto Saccharobacter fermentatus e algumas
descritas na 5ª edição do Compendium of Me- cepas de Erwinia e Yersinia).
thods for the Microbiological Examination of Escherichia é o gênero tipo da família, que inclui
Foods (Salfinger & Tortorello, 2015). Quando di- diversos outros gêneros de importância em ali-
ferentes ou complementares às do Compendium, mentos, como Citrobacter, Edwardsiella, Entero-
foram também incluídas recomendações da 17ª bacter, Erwinia, Hafnia, Klebsiella, Morganella,
edição do Standard Methods for the Examination Pantoea, Pectobacterium, Proteus, Salmonella,
of Dairy Products (Wehr & Frank, 2004), especí- Serratia, Shigella e Yersinia. Na família também
ficas para a análise de produtos lácteos. se encontram as bactérias dos grupos coliformes
totais e coliformes termotolerantes (coliformes fe-
8.1.1. Taxonomia cais), discutidos no capítulo específico. O número
As informações abaixo são da 2ª edição do Ber- de gêneros e espécies da família tem aumentado
gey’s Manual of Systematic Bacteriology (Bren- continuamente, sendo 12 gêneros e 36 espécies
ner & Farmer III, 2005). em 1974, 20 gêneros e 76 espécies 1984, 30 gê-
Enterobactérias é como vulgarmente se chamam neros e 107 espécies em 1994 e 44 gêneros e 176
os membros da família Enterobacteriaceae, que espécies em 2005, nessa 2a edição do Bergey’s
inclui as bactérias Gram negativas na forma de Manual of Systematic Bacteriology.
bastonetes retos, não esporogênicas, anaeróbias As enterobactérias são amplamente distribuídas
facultativas e oxidase negativas (exceto o gênero na natureza, sendo encontradas no solo, água,
Plesiomonas, recentemente transferido para essa plantas, frutas, vegetais, carnes, ovos, grãos, ani-
família). São quimiorganotróficas com metabolis- mais, insetos e no homem. Várias espécies são
mo respiratório e fermentativo, a maioria produ- patogênicas para plantas e animais, respondendo
zindo ácidos e gás na fermentação da glicose e ou- por perdas econômicas expressivas na agricultu-

ra e na indústria de alimentos. Erwinia e Pecto- com duas etapas: A primeira é o enriquecimento

bacterium, por exemplo, provocam alterações em seletivo em Caldo de Enriquecimento para Ente-
milho, batatas, maçãs, cana de açúcar, abacaxis e robacteriaceae (EEB) e a segunda é o isolamento
outros produtos vegetais. Yersinia ruckeri e várias de colônias típicas no Ágar VRBG. No EEB, a
espécies de Edwardsiella provocam doenças em presença de bile e verde brilhante inibe grande
peixes tropicais, afetando diretamente o setor pes- parte da microbiota acompanhante. Além disso,
queiro. Klebsiella e Citrobacter freundii são cau- a alta capacidade tamponante do meio previne o
sadores de mastite em bovinos. efeito deletério da redução do pH sobre as ente-
Várias enterobactérias são também patogênicas robactérias. Esse procedimento também pode ser
para o homem, representando risco para a saúde aplicado como um simples teste de presença/au-
pública em todo o mundo. Salmonella é a mais sência, se a quantificação não for necesária.
importante, sendo as aves, os ovos, os ovinos e Outro método recomendado no Capítulo 9 do
os suínos os principais veículos de salmoneloses Compendium of Methods for the Microbiological
para humanos. Outros gêneros e espécies patogê- Examination of Foods (Kornacki et al., 2015) e
nicas veiculadas por alimentos são Shigella, Yer- no Capítulo 7 do Standard Methods for the Exa-
sinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, mination of Dairy Products (Davidson et al.,
Cronobacter e cepas de E. coli enteropatogênicas, 2004) é o Petrifilm Enterobacteriaceae da 3M
incluindo as enterohemorrágicas (EHEC) como Company (AOAC Official Method 2003.1), que
E. coli O157:H7. segue o mesmo princípio da contagem em placas
As enterobactérias são utilizadas como indicado- de VRBG.
res das condições de higiene dos processos de fa-
bricação, porque são facilmente inativadas pelos
sanitizantes e capazes de colonizar vários nichos 8.2. Método de plaqueamento
das plantas de processamento, quando a sanitiza- APHA 9.62:2015
ção é falha. para contagem de
São mesófilas mas cepas psicrotróficas não são enterobactérias em alimentos
incomuns, principalmente dentro dos gêneros
Yersinia, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Método da American Public Health Association
Klebsiella, Serratia e Hafnia. (APHA), descrito no Capítulo 9 da 5ª edição do
8.1.2. Comentários sobre os Examination of Foods (Kornacki et al., 2015).
métodos de análise Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
A quantificação de enterobactérias pode ser fei- orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os
ta pelo método de contagem padrão em placas, detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
utilizando o Ágar Vermelho Violeta Bile Glicose microrganismos em placas, da seleção das dilui-
(VRBG) como meio de cultivo. O VRBG é um ções ao cálculo dos resultados. O procedimento
meio seletivo diferencial contendo cristal violeta descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres-
e sais biliares, que inibem bactérias Gram positi- supondo que sejam conhecidos pelo analista.
vas. A fermentação da glicose resulta em ácidos,
detectados pelo indicador de pH vermelho neutro 8.2.1. Material requerido para a
(viragem para vermelho) e pela formação de uma análise
zona de precipitação de sais biliares em torno das Preparação da amostra e diluições seriadas
colônias. □ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou
Para produtos com baixas contagens, é recomen- Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
dada a técnica do Número Mais Provável (NMP), □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada

Contagem de enterobactérias □ 109
0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) b) Inoculação. Selecionar três diluições adequa-
□ Pipetas de 1 ou 2 ml das da amostra e inocular em Ágar Vermelho
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- Violeta Bile com Glicose (VRBG) para ente-
tulo 2 para verificar casos especiais em que o robactérias. Utilizar a técnica de plaqueamento
tipo ou volume de diluente variam em função em profundidade e, após a completa solidifica-
da amostra analisada. ção do meio, cobrir com uma sobrecamada de
Contagem por plaqueamento em profundidade 5-8 ml do mesmo meio.
□ Placas de Petri de 20 x 100mm estéreis vazias c) Incubação. Incubar as placas na posição inver-
□ Meio de cultura: Ágar Vermelho Violeta Bile tida, a 35 ºC/18-24h.
com Glicose (VRBG)
□ Estufa incubadora regulada a 35 ºC d) Contagem das colônias e cálculo dos resul-
tados. Selecionar placas com 15-150 colônias
e contar apenas as colônias típicas de entero-
8.2.2. Procedimento
bactérias no VRBG: vermelho púrpura, com
O esquema geral de contagem de enterobac- 0,5mm ou mais em diâmetro, rodeadas por
térias em alimentos pelo método de plaquea- um halo avermelhado de precipitação de sais
mento APHA 9.62:2015 encontra-se descrito na biliares. Em placas muito cheias as colônias
Figura 8.1. são menores, não atingindo 0,5mm. Determi-
a) Preparação das amostras e diluições seria- nar o número de UFC/g ou ml multiplicando
das. Seguir os procedimentos descritos no Ca- o número de colônias típicas pelo inverso da
pítulo 2. diluição.
Figura 8.1. Esquema de contagem de enterobactérias em alimentos pelo método de plaqueamento APHA 9.62:2015
(Kornacki et al., 2015).

8.3. Método do NMP □ Estufa incubadora regulada a 35 ou 37 ºC

APHA 9.61:2015
8.3.2. Procedimento
para contagem de
O esquema de contagem de enterobactérias em
enterobactérias em alimentos
alimentos pelo método do Número Mais Prová-
Método da American Public Health Association vel APHA 9.61:2015 encontra-se descrito na Fi-
(APHA), descrito no Capítulo 9 da 5ª edição do gura 8.2.
Compendium of Methods for the Microbiological a) Preparação das amostras e diluições seria-
Examination of Foods (Kornacki et al., 2015). das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-
A contagem de enterobactérias pelo NMP é indi- pítulo 2.
cada para amostras com baixas contagens, abaixo
Nota a.1) Se não houver necessidade de quantificar, bas-
do limite de detecção do plaqueamento. Antes de tando determinar a presença/ausência de enterobac-
iniciar as atividades, ler atentamente as orienta- térias na amostra, a preparação pode ser feita direta-
ções do Capítulo 4, que apresenta todos os deta- mente no Caldo de enriquecimento, passando ao item
incubação.
lhes e cuidados envolvidos na contagem de mi-
crorganismos pelo NMP, da seleção das diluições b) Inoculação (teste presuntivo). Inocular três
ao cálculo dos resultados. O procedimento descri- alíquotas de 10 ml da primeira diluição (10-1)
to abaixo não apresenta esses detalhes, pressupon- em três tubos com 10 ml de Caldo de Enri-
do que sejam conhecidos pelo analista. quecimento de Enterobacteriaceae (EEB) em
Este procedimento pode ser usado para detecção concentração dupla, três alíquotas de 1 ml da
da presença ou ausência de enterobactérias em 10-1 em três tubos com 10 ml de EEB concen-
uma quantidade definida de amostra (em 10g ou tração simples e três alíquotas de 1 ml da 10-2
em 25g, por exemplo). Para tanto, homogeneizar em três tubos com 10 ml de Caldo de EEB con-
a quantidade requerida de amostra com o caldo de centração simples.
enriquecimento na diluição 1:10 e dar prossegui- c) Incubação. Incubar os tubos de EEB a 35 ou
mento ao ensaio com essa única porção da amostra. 37 ºC/20-24h e observar se há crescimento. Em
caso positivo, passar aos itens subsequentes.
análise Nota c.1) Se houver interesse em contar apenas as ente-
robactérias mesófilas, sem incluir as cepas psicrotró-
Preparação da amostra e diluições seriadas ficas, incubar o caldo EEB a 43 ºC/18h.
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou d) Confirmação de enterobactérias. A partir de
Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) cada tubo com crescimento em EEB, estriar (es-
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada trias de esgotamento) uma alçada da cultura em
0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) Ágar Vermelho Violeta Bile Glicose (VRBG).
□ Pipetas de 1 ou 2 ml Incubar as placas a 35 ou 37 ºC/20-24h. Obser-
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- var se há desenvolvimento de colônias típicas de
tulo 2 para verificar casos especiais em que o enterobactérias, vermelho púrpura, com 0,5mm
tipo ou volume de diluente variam em função ou mais em diâmetro, rodeadas por um halo
da amostra analisada. avermelhado de precipitação de sais biliares.
Enriquecimento e plaqueamento e) Cálculo dos resultados. Anotar o número de
□ Caldo de Enriquecimento de Enterobacteria- tubos confirmados e determinar o NMP/g ou
ceae (EEB) ml conforme a orientação do Capítulo 4, usan-
□ Placas de Ágar Vermelho Violeta Bile com do uma das tabelas de NMP.
Glicose (VRBG)

Figura 8.2. Esquema de contagem de enterobactérias em alimentos pelo método do NMP APHA 9.61:2015
(Kornacki et al., 2015).

8.4. Método do Petrifilm™ 8.4.2. Procedimento

AOAC 2003.1:2016 para a) Preparação das amostras e diluições seria-
contagem de enterobactérias das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-
em alimentos pítulo 2, porém, não usar diluentes contendo
citrato, bissulfito ou tiossulfato, porque podem
Método oficial da AOAC International, descrito inibir o crescimento nos petrifilms. Nos casos
no Capítulo 17 da 20ª edição do Official Methods em que esses diluentes sejam recomendados
of AOAC International (Latimer, 2016). Também no Capítulo 2, substituir por Tampão Fosfato
incluído no Capítulo 9 da 5ª edição do Compen- (PB). Após a homogeneização, retirar uma alí-
dium of Methods for the Microbiological Exami- quota de volume conhecido e verificar o pH.
nation of Foods (Kornacki et al., 2015) e no Capí- Se necessário, acertar o pH da alíquota na fai-
tulo 7 do Standard Methods for the Examination xa de 6,5 a 7,5 com NaOH ou HCl 1N, verifi-
of Dairy Products (Davidson et al., 2004). cando o volume de ácido ou base consumido
Petrifilm™ (3M Company) é uma modificação da na correção. Adicionar à amostra um volume
contagem de Unidades Formadoras de Colônias proporcional da solução estéril.
(UFC) em placas, composto por dois filmes esté-
b) Inoculação. Selecionar três diluições adequa-
reis reidratáveis, impregnados pelo meio de cul-
das da amostra e, de cada diluição, inocular 1
tura e por substâncias geleificantes solúveis em
ml em uma placa de Petrifilm Enterobacteria-
água fria. A inoculação é feita no filme inferior
ceae. Para tanto, seguir as orientações do fa-
que, depois de inoculado, é coberto com o filme
bricante, apresentadas a seguir: Colocar a pla-
superior. O inóculo é espalhado com um difusor
ca em uma superfície plana, levantar o filme
de plástico, por leve pressão manual e, depois da
superior e posicionar a ponta da pipeta perpen-
solidificação do gel, as placas são incubadas para
dicular ao centro do filme inferior. Depositar o
desenvolvimento de colônias. O meio de cultura é
volume de 1 ml e baixar o filme superior sobre
o Vermelho Violeta Bile Glicose (VRBG) suple-
o líquido, evitando a formação de bolhas. Posi-
mentado com cloreto de trifeniltetrazolium (indi-
cionar o difusor plástico sobre centro do filme
cador que, ao sofrer redução, confere coloração
superior, com o lado liso para baixo. Com leve
vermelha às colônias) e com um indicador de pH
pressão, espalhar o líquido sobre todo o filme
(para detectar a fermentação com produção de
inferior. Não arrastar o difusor sobre a placa,
ácido, com ou sem produção de gás). As colônias
apenas pressionar levemente. Remover o difu-
típicas são vermelhas, com um halo amarelo e as-
sor e aguardar pelo menos um minuto, para a
sociadas ou não com bolhas de gás.
total solidificação do gel.
8.4.1. Material requerido para a Nota b.1) Para a seleção das diluições, seguir as orienta-
ções do Capítulo 3, porque o Petrifilm segue o mes-
análise
mo princípio da contagem em placas.
Preparação da amostra e diluições seriadas Nota b.2) Alguns alimentos podem interferir na visualiza-
□ Diluente: Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) ção das colônias na primeira diluição, como é o caso
□ Tubos de diluição com 9 ml de Tampão Fosfa- de café, chocolate ou ervas secas (muito escuros).
to pH 7,2 (PB) c) Incubação. Incubar as placas a 37±1 ºC/24±2h,
□ Pipetas de 1 ou 2 ml com o lado transparente para cima, em pilhas
Inoculação e incubação com não mais de 20 placas.
□ Placas de Petrifilm Enterobacteriaceae (3M
Nota c.1) Pode ser necessário umidificar a incubadora,
Company) para que não ocorra desidratação das placas. A perda
□ Difusor plástico de umidade, indicada pela perda de peso, não deve
□ Estufa incubadora regulada a 37±1 ºC ser superior a 15%, após a incubação.

d) Contagem das colônias e cálculo dos resulta- ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
dos. Selecionar para contagem as placas com 15 □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Pepto-
a 100 colônias. Contar apenas as colônias típicas, nada Tamponada (BPW) ou o Tampão Fosfato
que podem ser de três tipos: vermelhas com bo- pH 7,2 (PB)
lhas de gás e sem halo amarelo, vermelhas com □ Pipetas de 1 ou 2 ml
halo amarelo e sem bolhas de gás ou vermelhas Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
com halo amarelo e bolhas de gás. Determinar tulo 2 para verificar casos especiais em que o
o número de UFC/g ou ml multiplicando o nú- tipo ou volume de diluente variam em função
mero de colônias típicas pelo inverso da diluição da amostra analisada.
(UFC/g ou ml = Nº colônias/diluição). Contagem por plaqueamento em profundidade
Nota d.1) Não contar as colônias presentes na espuma □ Placas de Petri de 20 x 100mm estéreis vazias
da borda do filme, pois essas não se encontram sob a □ Ágar Vermelho Violeta Bile com Glicose
ação dos agentes seletivos. Não enumerar bolhas de (VRBG)
ar artificiais.
□ Placas de Ágar Nutriente
Nota d.2) A área de crescimento circular das placas de
□ Tubos de Ágar Glicose (não inclinados)
petrifilm é de aproximadamente 20cm2. Em placas
com mais de 150 colônias, a contagem pode ser es- □ Reagente de Kovacs para teste de oxidase
timada contando-se o número de colônias em um ou □ Estufa incubadora regulada a 37±1 ºC
mais quadrados representativos e calculando-se a
média por quadrado. Multiplicar então por 20, para
determinar o número total de colônias por placa.
8.5.2. Procedimento
Nota d.3) Uma vez completado o tempo de incubação, O esquema geral de contagem de enterobactérias
as placas podem ser armazenadas sob congelamento em alimentos pelo método de plaqueamento ISO
(15 ºC negativos ou menor), para contagem posterior.
21528-2:2004 encontra-se descrito na Figura 8.3.
8.5. Método de plaqueamento das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-
ISO 21528-2:2004 para pítulo 2.
b) Inoculação. Selecionar pelo menos duas dilui-
contagem de enterobactérias
ções adequadas da amostra e inocular em Ágar
em alimentos Vermelho Violeta Bile com Glicose (VRBG)
Método da International Organization for Stan- para enterobactérias. Utilizar a técnica de pla-
dardization, aplica-se a alimentos destinados ao queamento em profundidade com 10 ml de meio.
consumo humano, à rações animais e à amostras Após a completa solidificação do ágar, cobrir
do ambiente de fabricação desses produtos. com uma sobrecamada de 15 ml do mesmo meio.
Nota b.1) O método recomenda a inoculação em dupli-
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
cata, mas a ISO 7218:2007/Amd.1:2013 já não exige
orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os duplicata se forem inoculadas pelo menos duas di-
detalhes e cuidados envolvidos na contagem de luições.
microrganismos em placas, da seleção das dilui- c) Incubação. Incubar as placas na posição inver-
ções ao cálculo dos resultados. O procedimento tida, a 37±1 ºC/24±2h.
descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- Nota c.1) A temperatura de 37 ºC geralmente é usada nas
supondo que sejam conhecidos pelo analista. análises com finalidade de avaliar a contagem de en-
terobactérias como indicador de higiene. Alternativa-
8.5.1. Material requerido para a mente pode ser feita a incubação a 30±1 ºC, quando a
contagem é feita com finalidade tecnológica e inclui
análise enterobactérias psicrotróficas.
Preparação da amostra e diluições seriadas d) Confirmação das colônias. Selecionar placas
□ Diluente: Água Peptonada Tamponada (BPW) com até 150 colônias e, de cada placa, esco-

Figura 8.3. Esquema de contagem de enterobactérias em alimentos pelo método de plaqueamento ISO 21528-2:2004.

lher cinco colônias típicas para a confirmação afrouxadas, para manter condições aeróbi-
(se houver menos de cinco em alguma placa, cas. Crescimento com viragem para amarelo
selecionar todas). As colônias típicas de ente- (viragem ácida do indicador) indica fermen-
robactérias no VRBG: vermelho púrpura, com tação da glicose. Crescimento sem altera-
0,5mm ou mais em diâmetro, rodeadas por um ção da cor do meio para amarelo indica não
halo avermelhado de precipitação de sais bi- fermentação da glicose. As enterobactérias
liares. Em placas muito cheias as colônias são fermentam a glicose.
menores, não atingindo 0,5mm. Algumas ente- e) Cálculo dos resultados. Considerar como con-
robactérias provocam descoloração das colô- firmadas todas as culturas oxidase positivas
nias ou do meio de cultura. Portanto, se não for que fermentam a glicose. Seguir as orientações
observada a presença de colônias vermelhas, abaixo para o cálculo dos resultados.
essas colônias esbranquiçadas devem ser sele- Segundo a ISO 7218:2007/Amd 1:2013, cal-
cionadas para confirmação. cular usando a fórmula:
A partir de cada colônia selecionada, inocular
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1n2) . d]
uma alçada da cultura (estrias de esgotamento)
em uma placa de Agar Nutriente (NA) e incu- onde:
bar as placas a 37±1oC/24±2h. Selecionar uma a = (b.C/A) sendo, C = número total de colônias presentes
colônia bem isolada para os testes de confir- em cada placa selecionada para contagem, A = número de
mação descritos abaixo. colônias submetidas à confirmação (geralmente cinco) e
b = número de colônias confirmadas, dentre as que foram
d.1) Teste de oxidase. Colocar um disco ou submetidas à confirmação.
fita de papel de filtro no interior de uma v = volume inoculado em cada placa.
placa de Petri e embeber o centro do pa- n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele-
cionada
pel com o reagente de Kovacs para teste de
oxidase (solução aquosa 1% de cloridrato cionada
de N,N,N,N-tetrametil-p-fenilenodiamina). d = primeira diluição retida para contagem
Com uma alça de platina ou palitos estéreis (100=1, 10-1= 0,1, 10-2= 0,01 e assim por diante).
(não utilizar alça de níquel-cromo), remo-
ver uma pequena quantidade da colônia e Exemplo 1) Inoculados 1 ml das diluições 10-1 e
espalhar sobre o reagente no papel, obser- 10-2, uma placa por diluição (n1= 1 e n2 = 1).
vando se ocorre o desenvolvimento de uma Os resultados obtidos foram:
cor azul intensa, em aproximadamente dez Diluição 10-1 Diluição 10-2
Total de colônias na placa (C) 150 17
segundos (teste positivo). O não-desenvol-
Colônias submetidas à confirmação (A) 5 5
vimento da cor azul no intervalo de dez se- Colônias confirmadas dentre as
4 3
gundos indica teste negativo. As enterobac- submetidas à confirmação (b)
térias são oxidase negativas. Número de colônias consideradas 4x150/5
3x17/5 = 10
confirmadas na placa (a) = 120
d.2) Teste de fermentação da glicose. Com Volume inoculado em cada placa (v) 1 ml 1 ml
uma agulha de inoculação, inocular cada Primeira diluição retida
10-1 = 0,1
para contagem (d)
cultura em um tubo de Ágar Glicose (não Somatória das colônias consideradas
inclinado), por picada. Incubar os tubos a 120+10 = 130
37±1 ºC/24±2h, com as tampas ligeiramente UFC/g = ∑a / [v x (n1 + 0,1n2) x d]
130 / [1 x (1+0,1 x 1) x 0,1]
= 130/0,11 = 1,2x103

8.6. Referências
BRENNER, D.J. & FARMER III, J.J. Family I. Entero- thod, 1 st ed. The International Organization for Stan-
bacteriaceae. In: BRENNER, D.J., KRIEG, N.R. & dardization, 2004.
STALEY, J.T. (Eds), Bergey’s Manual of Systematic KORNACKI, J.L. GURTLER, J.B. & STAWICK, B.A. En-
Bacteriology, 2 nd Ed. Volume 2. New York: Springer terobacteriaceae, coliforms, and Escherichia coli as
Science+Business Media Inc., 2005. pp.587-607. quality and safety indicators. In: SALFINGER, Y. &
DAVIDSON, P.M., ROTH, L.A., GAMBREL-LENARZ, TORTORELLO, M.L. (eds.), Compendium of Me-
S.A. Coliform and other indicator bacteria. In: WEHR, thods for the Microbiological Examination of Foods,
H.M. & FRANK, J.F (Eds.), Standard Methods for 5 th ed. American Public Health Association, Washing-
the Examination of Dairy Products, 17 th ed. American ton, D. C., 2015. Chapter 9, pp.103-120.
Public Health Association, Washington, D. C., 2004. LATIMER JR., G.W. (ed.). Official Methods of Analysis
Chapter 7, pp.187-226. of AOAC International, 20 th edition. Gaithersburg,
ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs Maryland: AOAC International, 2016.
– General requirements and guidance for microbio- SALFINGER, Y. & TORTORELLO, M.L. (eds.). Compen-
logical examination. 3 rd edition, 2007/Amendment 1, dium of Methods for the Microbiological Examination
2013. The International Organization for Standardi- of Foods, 5 th ed. Washington: American Public Health
zation. Association (APHA), 2015.
ISO 21528-2. Microbiology of food and animal feeding stuffs WEHR, H.M. & FRANK, J.F (Eds.). Standard Methods for
– Horizontal methods for the detection and enumera- the Examination of Dairy Products, 17 th ed. American
tion of Enterobacteriaceae - Part 2: Colony-count me- Public Health Association, Washington, D. C., 2004.

9 Contagem de coliformes totais,
coliformes termotolerantes e
Escherichia coli
Quadro 9.1 (revisado) Inserido método 2009.02.
Item 9.2.2.e (revisado) A possibilidade de usar um único banho a 45 ºC para incubação de amostras de água e
diferentes tipos de alimentos não foi mantida na 5ª edição do Compendium.
Item 9.3.2.b (revisado) Nota b.1. complementada com o tempo de incubação em TSA (2±0,5h) antes da adição da
sobrecamada de VRB para recuperação de injúrias.
Item 9.3.2.c (revisado) A temperatura e o tempo de incubação do VRB passam a ser 35 ºC/18-24h.
Item 9.5.2.c (revisado) O tempo de incubação do Petrifilm Coliformes Totais Rápido passa para 8-24h.
Item 9.8 (novo) Incluído método de filtração ISO 9308-1:2014 para contagem de coliformes totais e E. coli em
água.
9.1. Introdução dentre as quais encontrando-se tanto bactérias ori-

ginárias do trato gastrintestinal de humanos e ou-
As informações e orientações contidas nesse ca- tros animais de sangue quente (Escherichia coli),
pítulo são da American Public Health Association como também bactérias não entéricas (espécies de
(APHA), descritas na 5ª edição do Compendium Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella e Serratia,
of Methods for the Microbiological Examination dentre outras).
of Foods (Salfinger & Tortorello, 2015). Quando A capacidade de fermentar a lactose pode ser
diferentes ou complementares às do Compendium, verificada pela formação de gás e/ou ácido, nos
foram também incluídas recomendações da 22ª meios de cultivo contendo lactose. Essas caracte-
edição do Standard Methods for the Examination rísticas são utilizadas nos métodos tradicionais de
of Water and Wastewater (Rice et al., 2012), espe- contagem de coliformes totais. Os métodos mais
cíficas para a análise de água, e da 17ª edição do modernos, entretanto, detectam diretamente a ati-
Standard Methods for the Examination of Dairy vidade da enzima β-galactosidase, envolvida no
Products (Wehr & Frank, 2004), específicas para a metabolismo fermentativo da lactose, incorporan-
análise de produtos lácteos. do substratos para a enzima nos meios de cultivo.
Um desses substratos é o ONPG (orto-nitrofenil-
9.1.1. Definição de coliformes -β-D-galactopiranosídeo) que, quando degrada-
totais do pela β-galactosidase, resulta num produto de
O grupo dos coliformes totais é um subgrupo reação amarelo. Outros são o X-GAL (5-bromo-
da família Enterobacteriaceae que, na 2ª edição 4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiraniosídeo), que
do Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology resulta num produto de reação intensamente azul
(Brenner & Farmer III, 2005), inclui 44 gêneros e o Salmon-Gal (6-cloro-3-indolil-β-D-galactopi-
e 176 espécies. No grupo dos coliformes totais ranosídeo), cujo produto de degradação é salmão
estão apenas as enterobactérias capazes de fer- a vermelho.
mentar a lactose com produção de gás a 35 ºC. O Compendium ressalta, entretanto, que os mé-
Mais de 20 espécies se encaixam nessa definição, todos que detectam diretamente a atividade da

β-galactosidase sem verificar se o microrganis- dado pela β-glicuronidase, resulta em 4-metilum-

mo produz gás ou não, podem detectar entero- beliferona, fluorescente sob luz UV. Outro é o
bactérias que fermentam a lactose sem produção BCIG (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glicuroní-
de gás, fugindo um pouco da definição clássica deo), também chamado de X-β-D-Glicuronídeo,
de coliformes totais. Por outro lado, no caso dos que quando é degradado pela enzima, forma um
métodos baseados atividade da β-galactosidase já produto de reação azul.
oficializados pela AOAC (Quadro 9.1), a compa-
ração com a técnica clássica (fermentação da lac- 9.1.4. Aplicação como indicadores
tose com produção de gás) não mostrou diferença
Segundo Kornacki et al. (2015), E. coli foi ini-
significativa entre os resultados.
cialmente introduzida como indicador em 1892
na Austrália e em 1895 nos Estados Unidos. Foi
9.1.2. Definição de coliformes
usada para indicar a contaminação da água por
termotolerantes matéria fecal e, consequentemente, alertar para a
O grupo dos coliformes termotolerantes, comu- presença potencial de patógenos entéricos (Sal-
mente chamados de coliformes fecais, é um sub- monella, por exemplo). O padrão foi mudado para
grupo dos coliformes totais, restrito aos membros coliformes totais em 1915, pelo U.S. Public Health
capazes de fermentar a lactose a 44,5-45,5 ºC Service, baseado na premissa (considerada ques-
com produção de gás. Essa definição objetivou, tionável pelos autores) de que todos os coliformes
em princípio, selecionar apenas as enterobactérias apresentavam igual valor como indicadores de
originários do trato gastrintestinal (E. coli), po- contaminação fecal. Da água foram estendidos
rém, atualmente sabe-se que o grupo inclui mem- aos alimentos, ainda segundo os autores, sem
bros de origem não fecal (várias cepas Klebsiella uma avaliação muito criteriosa da validade dessa
pneumoniae, Pantoea agglomerans, Enterobacter aplicação em diferentes produtos. Atualmente, a
cloacae e Citrobacter freundii). Em função disso, premissa de que altos números de E. coli, colifor-
o termo coliformes fecais tem sido, gradativamen- mes termotolerantes, coliformes totais ou entero-
te, substituído por coliformes termotolerantes. bactérias em alimentos estão correlacionados com
contaminação fecal já não é válida, por uma série
9.1.3. E. coli de razões:
1) E. coli, coliformes termotolerantes, coliformes
E. coli está incluída tanto no grupo dos colifor-
totais ou enterobactérias não são habitantes
mes totais quanto no dos coliformes termotole-
obrigatórios do trato intestinal de animais de
rantes. Seu habitat natural é o trato intestinal de
sangue quente, podendo ser encontrados em
animais de sangue quente, embora também possa
reservatórios ambientais.
ser introduzida nos alimentos a partir de fontes
2) Esses organismos são comuns nos ambientes
não fecais. É tradicionalmente distinguida dos
de manufatura de alimentos, podendo se tornar
demais coliformes termotolerantes pelas caracte-
parte da microbiota residente (principalmente
rísticas de crescimento no Ágar L-EMB (Levine
se as condições de limpeza são inadequadas).
Eosina Azul de Metileno) e pelo perfil dos testes
3) Várias cepas de E. coli, coliformes ou entero-
de indol, vermelho de metila, Voges Proskauer e
bactérias podem crescer em alimentos refrige-
citrato (IMViC). Os métodos mais modernos dife-
rados.
renciam E. coli através da verificação da atividade
da enzima β-glicuronidase, produzida por 96% Com base nesses fatos, a FAO (Food and Agri-
das cepas, incluindo as anaerogênicas (Feng & culture Organization) e a OMS (Organização
Hartman, 1982). Um dos substratos para verificar Mundial da Saúde) concluíram que não é possível
a atividade β-glicuronidase é o MUG (4-metilum- avaliar a segurança (inocuidade) de alimentos em
beliferil-β-D-glicuronídeo), que quando é degra- função dos níveis de E. coli, coliformes termoto-

Contagem de coliformes totais, coliformes termotolerantes e Escherichia coli □ 119
lerantes, coliformes totais ou enterobactérias. Um a 35 ºC, é considerada confirmativa da pre-

alto índice desses microrganismos pode estar, em sença de coliformes totais. Crescimento com
certas circunstâncias, relacionado com uma maior produção de gás nos tubos de EC, após 24h de
probabilidade de presença de patógenos entéri- incubação a 45,5 ºC (ou 44,5 ºC, no caso de
cos, porém, frequentemente não está. Da mesma água), é considerada confirmativa da presença
forma, sua ausência nem sempre significa que os de coliformes termotolerantes.
produtos estejam livres de bactérias entéricas pa- 3º) Os tubos de EC positivos para coliformes ter-
togênicas. As principais aplicações desses micror- motolerantes são suspeitos da presença de E.
ganismos como indicadores, na verdade são: coli. Para a confirmação, uma alçada de cada
a) Enterobactérias e coliformes – indicadores tubo é estriada em Ágar Levine Eosina Azul de
das condições de higiene dos processos de fa- Metileno (L-EMB), meio seletivo diferencial
bricação, porque são facilmente inativados pe- para distinguir E. coli dos demais coliformes
los sanitizantes e capazes de colonizar vários termotolerantes. Se houver desenvolvimento
nichos das plantas de processamento, quando de colônias típicas de E. coli no L-EMB, duas
a sanitização é falha. dessas colônias são isoladas para as provas bio-
b) Coliformes – indicadores de falha de processo químicas de indol, VM, VP e citrato (IMViC).
ou de contaminação pós processo em alimen- São consideradas confirmadas as culturas com
tos pasteurizados, porque são facilmente des- os perfis: + + - - (biotipo 1) ou - + - - (bio-
truídos pelo calor e não devem sobreviver ao tipo 2).
tratamento térmico. No método clássico do NMP a última etapa do
c) E. coli – indicador de contaminação fecal em teste é opcional e muitos laboratórios terminam a
alimentos “in natura” (mas não em alimentos análise na confirmação de coliformes termotole-
processados). rantes. Quando é feita a confirmação de E. coli, o
ensaio é chamado de teste completo.
9.1.5. Comentários sobre os Na análise de água a 22ª edição do Standard Me-
métodos de análise thods for the Examination of Water and Wastewa-
Método do NMP. O método clássico de conta- ter (Rice et al., 2012) recomenda procedimentos
gem de coliformes totais, termotolerantes e E. coli diferentes desse para a confirmação de E. coli.
em água e alimentos é o do Número Mais Prová- Um deles é a transferência das culturas suspei-
vel (NMP), que inclui as seguintes etapas: tas obtidas no LST para tubos de Caldo EC com
1º) Teste presuntivo, em que três alíquotas de três MUG. Após incubação a 44,5 ºC/24h, as culturas
diluições da amostra são inoculadas em uma que apresentarem fluorescência azul sob luz UV
série de três tubos de Caldo Lauril Sulfato são consideradas confirmadas. Outro procedimen-
Triptose (LST) por diluição. O LST contém to é a transferência do LST para Caldo Triptona
lactose e a observação de crescimento com 1%, incubação a 44,5 ºC/24h e teste de indol. As
produção de gás a partir da lactose, após 24- culturas positivas no teste de indol são considera-
48h de incubação a 35 ºC, é considerada sus- das confirmadas.
peita (presuntiva) da presença de coliformes. No método do NMP da ISO (7251:2005) para co-
2º) Para a confirmação dos coliformes totais e liformes termotolerantes em alimentos, a incuba-
termotolerantes, uma alçada de cada tubo sus- ção do Caldo EC é feita a 44±1 ºC e a confirmação
peito é transferida para tubos de Caldo Verde presuntiva de E. coli também utiliza o teste de in-
Brilhante Bile 2% (VB) e Caldo E. coli (EC), dol, após crescimento em Caldo Triptona a 44±1
meios seletivos que contém lactose. A obser- ºC. A principal vantagem desse método é que a
vação de crescimento com produção de gás variação aceitável na temperatura é de ±1 ºC, que
nos tubos de VB, após 24-48h de incubação pode ser obtida em estufas incubadoras. No Com-

pendium a variação máxima aceitável é de ±0,2 zado em ampolas, na quantidade necessária para
ºC, o que exige um banho-maria para a incubação. 100 ml de amostra). b) Número mais provável
O grande problema é que os banhos com essa es- (NMP) em 100 ml, fracionando-se os 100 ml em
tabilidade são bastante dispendiosos, bem como 10 alíquotas de 10 ml.
termômetros capazes de detectar essa variação. Método de contagem em placas. Para a contagem
Método do substrato cromogênico. Para a de- de coliformes totais em alimentos, o Compendium
terminação de coliformes totais e Escherichia coli (Kornacki et al., 2015) e o Standard Methods for
em água, um método extremamente simples e prá- the Examination of Dairy Products (Davidson et
tico é o do substrato cromogênico e fluorogênico al., 2004) também recomendam o método de con-
(COLILERT®) AOAC 991.15. É uma técnica cul- tagem direta em placas de Ágar Vermelho Violeta
tural baseada na adição de um meio de cultura de- Bile (VRB). Esse método segue o mesmo princí-
finido e diferencial à amostra, em que o exato ba- pio da contagem de enterobactérias, descrito no
lanceamento entre todos os componentes garante capítulo específico, mas utiliza lactose em lugar
a especificidade do resultado. O meio contém de glicose, no VRB. No caso de produtos proces-
dois substratos para enzimas: a) orto-nitrofenil-β- sados em que se espera uma maior incidência de
-D-galactopiranosídeo (ONPG), substrato para a células injuriadas, pode ser feita a inoculação em
enzima β-galactosidase dos coliformes, cujo pro- Ágar Tripticase de Soja, mantido à temperatura
duto de reação é amarelo. b) 4-metilumbeliferil-β- ambiente por duas horas, para reparação das in-
-D-glicuronídeo (MUG), substrato para a enzima júrias. Em seguida é feita uma sobrecamada com
β-glicuronidase de E. coli, cujo produto de reação o VRB e a incubação normal para contagem dos
é fluorescente sob luz UV. O ensaio pode ser fei- coliformes.
to de duas formas: a) Presença/ausência em 100 Outros métodos. Outros métodos oficializados
ml, adicionado-se o meio de cultura à 100 ml da pela AOAC International são os “kits” analíticos
amostra (o meio desidratado estéril é comerciali- descritos no Quadro 9.1.
Quadro 9.1. “Kits” analíticos oficializados pela AOAC International para a contagem de coliformes
totais e/ou E. coli em alimentos (Latimer, 2016, AOAC International, 2016).
AOAC
Official Analito Fabricante Nome do “kit” Aplicação
Method
966.24 Coliformes totais e E. coli BioControl Systems, Inc. Colitrak Todos os alimentos
986.33,
Carnes, aves, pescados e
989.10 Coliformes totais 3M Microbiology Products Petrifilm Coliform Count Plate
produtos de pesca, alimentos
e 991.14
988.19 Coliformes totais e E. coli BioControl Systems, Inc. ColiTrak Plus Todos os alimentos
Redigel Violet Red Bile
989.11 Coliformes totais 3M Microbiology Products Produtos lácteos
Medium for Coliform
991.14 Alimentos, carnes, aves,
Coliformes totais e E. coli 3M Microbiology Products Petrifilm E. coli Count Plate
e 998.08 pescados e produtos de pesca
991.15 Coliformes totais e E. coli Idexx Laboratories Inc. Colilert Água
992.30 Coliformes totais e E. coli BioControl Systems, Inc. ColiComplete Todos os alimentos
Petrifilm High Sensitivity
996.02 Coliformes totais 3M Microbiology Products Produtos lácteos
Coliform Count Plate
Petrifilm Rapid Coliform
2000.15 Coliformes totais 3M Microbiology Products Alimentos
Count Plate
SimPlate Coliform and E. coli
2005.03 Coliformes totais e E. coli BioControl Systems, Inc. Alimentos
Color Indicator (CEc-CI)
Automated Enumeration Carne bovina, carne de frango
2009.02 E. coli BioMérieux Inc. of E. coli in Food, TEMPO® (cozida), carne de caranguejo, alface,
EC Method leite, feijão (verde congelado)

9.2. Métodos do NMP □ Tubos de Caldo E. coli (EC) com tubos de

Durham
APHA 9:2015 e □ Cepa padrão positiva (cultura de E. coli com
APHA/AWWA/WEF 24 horas)
9221:2012 para contagem de □ Cepa padrão negativa (cultura de E. aerogenes
coliformes totais/coliformes com 24 horas)
termotolerantes/E. coli Contagem de E. coli (método tradicional para
alimentos) (opcional)
em água e alimentos □ Placas de Ágar Levine Eosina Azul de Metile-
Métodos da American Public Health Association no (L-EMB)
(APHA), descritos no Capítulo 9 da 5ª edição do □ Tubos de Ágar Padrão para Contagem (PCA)
Compendium of Methods for the Microbiological inclinados
Examination of Foods (Kornacki et al., 2015) e na □ Tubos de Caldo Citrato de Koser ou Ágar Ci-
Seção 9221 do Standard Methods for the Exami- trato de Simonns
nation of Water and Wastewater (Hunt, 2012). In- □ Tubos de Caldo Triptona 1%
cluídas também as recomendações específicas do □ Tubos de Caldo VM-VP
Capítulo 7 do Standard Methods for the Exami- □ Reagente de Kovacs para teste de indol
nation of Dairy Products (Davidson et al., 2004), □ Reagente de VM para teste de Vermelho de
para a análise de produtos lácteos. Aplicação: aná- Metila
lise de água e de todos os alimentos. □ Reagentes de VP para teste de Voges Proskauer
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as (solução de alfa-naftol 5%, solução de KOH
orientações do Capítulo 4, que apresenta todos os 40%, creatina em cristal)
detalhes e cuidados envolvidos na contagem de Contagem de E. coli (método EC-MUG para
microrganismos pelo NMP, da seleção das dilui- água) (opcional)
ções ao cálculo dos resultados. O procedimento □ Tubos de Caldo E. coli com 4-metilumbeliferil-
descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- -β-D-glicuronídeo (EC-MUG)
supondo que sejam conhecidos pelo analista. Contagem de E. coli (método do indol para
água) (opcional)
9.2.1. Material requerido para a □ Tubos de Caldo Triptona 1%
análise □ Reagente de Kovacs para teste de indol
Preparação da amostra e diluições seriadas Incubação
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou □ Estufa incubadora regulada a 35±0,5 ºC
Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) □ Banho-maria de temperatura controlada a
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada 45,5±0,2 ºC (para alimentos em geral)
0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) □ Banho-maria de temperatura controlada a
□ Pipetas de 1 ou 2 ml 44,5±0,2 ºC (para água, pescados e moluscos)
tulo 2 para verificar casos especiais em que o 9.2.2. Procedimento
Os esquemas de análise de coliformes totais, ter-
da amostra analisada.
motolerantes e E. coli pelo método do Número
Contagem de coliformes totais e termotolerantes
Mais Provável encontram-se descritos nas Figuras
□ Tubos de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)
9.1 (análise de alimentos) e 9.2 (análise de água).
com tubos de Durham
□ Tubos de Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB) a) Preparação das amostras e diluições seriadas.
com tubos de Durham Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2.

Figura 9.1. Esquema de análise de coliformes totais, termotolerantes e E. coli em alimentos pelo
método do NMP APHA 9:2015 (Kornacki et al., 2015). (continua)

Figura 9.1. Continuação do esquema de análise de coliformes totais, termotolerantes e E. coli em alimentos pelo
método do NMP APHA 9:2015 (Kornacki et al., 2015). (continuação)

Figura 9.2. Esquema de análise de coliformes totais, termotolerantes e E. coli em água pelo
método do NMP APHA/AWWA/WEF 9221:2012 (Hunt, 2012).

b) Inoculação (teste presuntivo) Nota c.1) A variação de temperatura estabelecida pelo

Selecionar três diluições adequadas da amos- Standard Methods for the Examination of Dairy Pro-
ducts na incubação é de ±1 ºC. No Compendium é
tra e inocular uma série de três tubos de Cal- de ±0,5 ºC, para harmonizar com Standard Methods
do Lauril Sulfato Triptose (LST) por diluição, for the Examination of Water and Wastewater (Hunt,
adicionando 1 ml da diluição por tubo com 10 2012), se o método for usado para a análise de água.
ml de LST.
Nota b.1) No caso de amostras em que se espera uma d) Contagem de coliformes totais
contagem baixa, pode-se inocular 3x10 ml da 10-1 em A partir dos tubos de LST com crescimento e
3x10 ml de LST dupla concentração, 3x1 ml da 10-1 produção de gás, transferir uma alçada bem
em 3x10 ml de LST concentração normal e 3x1 ml da
10-2 em 3x10 ml de LST concentração normal.
carregada de cada cultura para tubos de Caldo
Nota b.2) Na análise de água para consumo humano, Verde Brilhante Bile 2% (VB). Se for obser-
normalmente é feito o teste de diluição única: Inocu- vada a presença de película na superfície dos
lar dez alíquotas de 10 ml da amostra em dez tubos tubos positivos de LST, evitar que esta pelí-
com 10 ml de LST em concentração dupla ou cinco cula seja transferida para os tubos de VB (os
alíquotas de 20 ml em cinco tubos com 10 ml de LST
em concentração tripla.
coliformes não formam película). Incubar os
Nota b.3) Na análise de sucos, refrescos e refrigerantes tubos de VB a 35±0,5 ºC/24±2h e observar se
também é mais comum o teste de diluição única, há crescimento com produção de gás. Em caso
inoculando-se seis alíquotas de 10 ml da amostra em negativo (sem crescimento ou crescimento
seis tubos com 10 ml de Caldo Lauril Sulfato Trip- sem produção de gás), reincubar até completar
tose (LST), em concentração dupla. A um dos tubos
é adicionada solução de hidróxido de sódio (NaOH
48±2h e repetir a leitura.
1N ou 0,6%) até que o pH atinja 6,0. O volume de Anotar o número de tubos de VB com cres-
NaOH consumido é anotado, o tubo é descartado e, cimento e produção de gás, confirmativos da
aos outros cinco é adicionado, em condições assépti- presença de coliformes totais. Determinar o
cas, idêntica quantidade de NaOH estéril.
Número Mais Provável (NMP)/g ou ml con-
Nota b.4) No exame de moluscos e crustáceos (ostras,
mexilhões e mariscos, camarão etc.), o Compendium forme a orientação do Capítulo 4, usando uma
recomenda utilizar uma série de cinco tubos. das tabelas de NMP.
Nota b.5) Na análise de amostras ácidas, como maio-
e) Contagem de coliformes termotolerantes
nese e outras coberturas para saladas, por exemplo,
recomenda-se neutralizar a acidez da amostra antes A partir dos tubos de LST com crescimento e
da inoculação nos tubos de LST. Para isso, homoge- produção de gás, transferir uma alçada bem car-
neizar bem a primeira diluição, retirar uma alíquota regada de cada cultura para tubos de Caldo E.
de volume conhecido e verificar o pH. Ajustar em 6,0
coli (EC). Incubar por 24±2 horas em banho-
com NaOH 1N, verificando o volume de base con-
sumido na correção da alíquota. Adicionar à amostra -maria a 45,5±0,2 ºC (maioria dos alimentos) ou
um volume proporcional da solução de NaOH estéril. 44,5±0,2 ºC (água, crustáceos e moluscos) e ob-
Alternativamente, utilizar o tampão fosfato pH 7,2 servar se há crescimento com produção de gás.
como diluente, o que pode eliminar a necessidade de
neutralização, porém, recomenda-se verificar antes Nota e.1) A incubação dos tubos de EC deve ser sempre
da inoculação dos tubos de LST. acompanhada de um tubo inoculado com a cepa pa-
drão positiva (E. coli) e um tubo inoculado com a cepa
c) Incubação Incubar os tubos de LST a 35±0,5 padrão negativa (Enterobacter aerogenes). Todos os
ºC/24±2h e observar se há crescimento com tubos devem permanecer mergulhados na água, até
produção de gás. Em caso positivo (cresci- uma altura superior à superfície do meio de cultura.
O intervalo entre a inoculação e a transferência para o
mento e produção de gás), passar aos itens
banho de incubação não deve ultrapassar 30min.
subsequentes. Em caso negativo (sem cresci-
Nota e.2) Se a análise for continuar até a confirmação
mento ou crescimento sem produção de gás),
e contagem de E. coli pelo método tradicional (item
reincubar até completar 48±2h e repetir a lei- f), deve-se reincubar os tubos de EC por 24 horas
tura, passando para os itens subsequentes em adicionais, submetendo à confirmação os tubos po-
caso de crescimento com produção de gás. sitivos em 48±2h.

Anotar o número de tubos de EC com produ- f.2) Teste de indol (caldo triptona 1%). Inocu-
ção de gás, confirmativo da presença de coli- lar uma alçada com inóculo leve da cultura
formes termotolerantes. Determinar o Número e incubar a 35 ºC/24±2h. Adicionar cinco
Mais Provável (NMP)/g ou ml conforme a gotas do reagente de Kovacs a cada 4 ml
orientação do Capítulo 4, usando uma das tade cultura e agitar levemente. Observar se
belas de NMP. há desenvolvimento de um anel vermelho-
f) Contagem de E. coli em alimentos (opcional) -violeta na superfície do meio de cultura
(teste positivo) ou se o anel permanece na
Procedimento do Compendium e do Standard
cor amarela do reagente (teste negativo) As
Methods for the Examination of Dairy Products.
cepas de E. coli podem ser indol positivas
De cada tubo de EC com produção de gás em
ou negativas.
48±2h, estriar (estrias de esgotamento) uma al-
f.3) Teste de vermelho de metila e Voges
çada da cultura em placas de Ágar Levine Eosi-
Proskauer (caldo VM-VP). Inocular uma al-
na Azul de Metileno (L-EMB). Incubar as pla-
çada com inóculo leve da cultura e incubar
cas a 35 ºC/18-24h e observar se há desenvolvi-
a 35 ºC/48±2h. Para o teste de VP, transfe-
mento de colônias típicas de E. coli (nucleadas
rir assepticamente 1 ml da cultura para um
com centro preto, com ou sem brilho metálico).
tubo de ensaio e adicionar os Reagentes de
Havendo colônias típicas, transferir duas colô- VP, na seguinte ordem: 0,6 ml de solução
nias bem isoladas de cada placa, para tubos de de α-naftol 5% e agitar. Adicionar em segui-
Ágar Padrão para Contagem (PCA) inclinados da 0,2 ml de solução de KOH 40%, agitar
e incubar os tubos a 35 ºC/18-24h. e adicionar uma pitada leve de cristais de
A partir das culturas puras em PCA, fazer creatina, para acelerar a reação. Deixar des-
coloração de Gram e inocular os meios teste cansar e observar periodicamente, por até
abaixo, para realização de provas bioquímicas uma hora, o desenvolvimento de uma cor
de indol, VM, VP e citrato (IMViC). Todos os vermelha ou rósea no meio de cultura (teste
meios podem ser inoculados a partir de uma positivo). A permanência do meio na cor do
única alçada de cultura, porém, o Caldo Citra- reagente (amarelada ou ligeiramente esver-
to de Koser (ou o Ágar Citrato de Simmons) deada) indica teste negativo. As cepas de E.
deve ser inoculado em primeiro lugar, para coli são VP negativas. Reincubar a cultura
evitar a introdução de compostos de carbono remanescente no caldo VM-VP por 48 ho-
originários dos demais meios teste. ras adicionais e realizar o teste de VM com
f.1) Teste de citrato (caldo citrato de Koser). 96 horas de incubação. Para a realização do
Inocular uma alçada com inóculo leve da teste, adicionar a cada 2,5 ml da cultura, cin-
cultura, incubar a 35 ºC/96h e observar se co gotas do Reagente de VM, observando
há crescimento (teste positivo) ou não (teste imediatamente se o meio adquire uma colo-
negativo). As cepas de E. coli são citrato-ne- ração vermelha (teste positivo) ou amarela
gativas. Alternativamente, pode-se utilizar o (teste negativo). As cepas de E. coli são VM
Ágar Citrato de Simmons para o teste de ci- positivas.
trato. Transferir um inóculo leve da cultura Considerar como E. coli todas as culturas com as
para a rampa dos tubos de Ágar Citrato de seguintes características: bastonetes Gram nega-
Simmons e incubar a 35 ºC/96h. O cresci- tivos, indol (+) ou (-), VM (+), VP (-) e citrato
mento com viragem alcalina, alterando a (-). Anotar em quantos tubos de caldo EC foi con-
cor do meio de verde para azul, é indicati- firmada a presença de E. coli e determinar o Nú-
vo de teste positivo. O não crescimento e a mero Mais Provável (NMP)/g ou ml conforme a
não alteração da cor do meio indicam teste orientação do Capítulo 4, usando uma das tabelas
negativo. de NMP.

g) Contagem de E. coli em água (opcional) microrganismos em placas, da seleção das dilui-

Pode ser usado um dos procedimentos abaixo, ções ao cálculo dos resultados. O procedimento
descritos no Standard Methods for the Exami- descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres-
nation of Water and Wastewater. supondo que sejam conhecidos pelo analista.
g.1) Método do EC-MUG. De cada tubo de
LST com crescimento e produção de gás, 9.3.1. Material requerido para a
inocular uma alçada em tubos de EC-MUG análise
(Caldo E. coli suplementado com 0,05g/l de
Preparação da amostra e diluições seriadas
4-metilumbeliferil-b-D-glicuronídeo). In-
cubar os tubos a 44,5±0,2 ºC/24±2h e obser-
var os tubos com crescimento sob lâmpada
de luz ultravioleta (6w), ondas longas (365 a
366nm). O desenvolvimento de fluorescên-
cia azul indica a presença de E. coli.
g.2) Método do indol. De cada tubo de LST
tulo 2 para verificar casos especiais em que o
com crescimento e produção de gás, inocu-
lar uma alçada em tubos de Caldo Triptona
1% para teste de indol. Incubar os tubos a
44,5±0,2 ºC/24±2h e adicionar a cada tubo Contagem de coliformes totais
(com 3-5 ml de cultura) 0,2 a 0,3 ml de Re- □ Placas de Petri de 20 x 100mm estéreis vazias
agente de Kovacs para teste de indol. O de- □ Meio de cultura: Ágar Vermelho Violeta Bile
senvolvimento de um anel vermelho violeta (VRB)
na superfície do meio de cultura indica a □ Tubos de Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB)
presença de E. coli. com tubos de Durham
Anotar em quantos tubos de caldo LST foi □ Estufa incubadora regulada a 35 ºC (32±1 ºC
confirmada a presença de E. coli e determi- para leite e produtos lácteos)
nar o Número Mais Provável (NMP)/g ou
ml conforme a orientação do Capítulo 4, 9.3.2. Procedimento
usando uma das tabelas de NMP. O esquema de análise de coliformes totais pelo
método de por plaqueamento APHA:2015 encon-
9.3. Método de plaqueamento tra-se descrito na Figura 9.3.
APHA:2015 para contagem a) Preparação das amostras e diluições seriadas.

Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2.
de coliformes totais em
alimentos das da amostra e inocular em Ágar Vermelho
Método da American Public Health Association Violeta Bile (VRB). Utilizar a técnica de pla-
(APHA), descrito no Capítulo 9 da 5ª edição do queamento em profundidade e, após a comple-
Compendium of Methods for the Microbiological ta solidificação do meio, cobrir com uma so-
Examination of Foods (Kornacki et al., 2015) e no brecamada de 5-8 ml do mesmo meio.
Capítulo 7 do Standard Methods for the Exami- Nota b.1) Na contagem de coliformes totais em amos-
nation of Dairy Products (Davidson et al., 2004). tras processadas com suspeita de injúria sub letal, o
Aplicação: análise de todos os alimentos. Compendium recomenda fazer o plaqueamento em
Agar Tripticase de Soja (TSA), manter 2±0,5h à tem-
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as peratura ambiente (para reparação de injúrias) e, em
orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os seguida, fazer uma sobrecamada com VRB ou VRB
detalhes e cuidados envolvidos na contagem de fortificado (com dupla concentração de sais biliares,

Figura 9.3. Esquema de análise de coliformes totais pelo método de plaqueamento APHA:2015 (Kornacki et al., 2015).
vermelho neutro e cristal violeta) e incubar. O Stan- leite e derivados). Selecionar placas com 15
dard Methods for the Examination of Dairy Products a 150 colônias e contar apenas as colônias tí-
recomenda fazer o plaqueamento em TSA, manter as
placas a 32±1 ºC/2±0,5h e, em seguida, cobrir com
picas de coliformes totais (vermelho púrpura,
uma sobrecamada de VRB fortificado e incubar. com 0,5mm ou mais em diâmetro, rodeadas
Nota b.2) Para a contagem de coliformes totais e também por um halo avermelhado de precipitação de
E. coli, o Standard Methods for the Examination of sais biliares). Determinar o número de UFC/g
Dairy Products recomenda o seguinte procedimento, ou ml multiplicando o número de colônias tí-
para a análise de leite, derivados de leite, sobremesas
picas pelo inverso da diluição.
lácteas, queijos manteiga e produtos lácteos desidra-
tados: Suplementar o VRB com 100 mg/l de MUG e d) Confirmação de colônias com aspecto du-
proceder da maneira usual, para a contagem de coli- vidoso em VRB. A confirmação é recomen-
formes totais. Para a contagem de E. coli, observar as dada quando as colônias apresentam aspecto
placas sob lâmpada de luz ultravioleta (6w), ondas
longas (365 a 366nm). As colônias com desenvolvi-
duvidoso (comum em placas muito cheias) ou
mento de fluorescência azul são contadas como E. quando as placas foram inoculadas com amos-
coli. A orientação da nota b.1 também se aplica nesse tras contendo quantidades significativas de
caso, suplementando o TSA e o VRB (fortificado) outros carboidratos que não a lactose (açúcar,
com a mesma concentração de MUG.
por exemplo). Para a confirmação, transferir
c) Incubação/contagem das colônias e cálculo uma alçada de cada colônia suspeita para tu-
dos resultados. Incubar as placas na posição bos de Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB)
invertida, a 35 ºC/18-24h (32±1 ºC no caso de e incubar a 35 ºC/24-48h (32±1 ºC no caso de

leite e derivados). Considerar como coliforme □ Pipetas de 1 ou 2 ml

total (colônia confirmada) todos os tubos com Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
crescimento e produção de gás, sem película tulo 2 para verificar casos especiais em que o
superficial. Havendo gás e película superficial, tipo ou volume de diluente variam em função
submeter a cultura à coloração de Gram e tes- da amostra analisada.
te de oxidase, considerando como coliformes Contagem de coliformes totais e E. coli
totais todas as culturas de bastonetes Gram ne- □ Meio de cultura: tubos com 10 ml de Caldo
gativos oxidase negativos. Lauril Sulfato Triptose (LST)
□ Substratos: discos de Coli Complete™ (Bio-
Control Systems, Inc.)
9.4. Método do NMP
AOAC 992.30 (ColiComplete™) □ Lâmpada de luz ultravioleta (6w), ondas lon-
para contagem de coliformes gas (365 a 366nm)
totais e E. coli em alimentos
9.4.2. Procedimento
Método oficial da AOAC International, descrito
Observação. O procedimento abaixo é orienta-
no Capítulo 17 da 20ª edição do Official Methods
tivo, devendo sempre ser verificadas e obede-
of AOAC International (Latimer, 2016). Também
cidas as instruções do fabricante.
incluído no Capítulo 9 da 5ª edição do Compen-
dium of Methods for the Microbiological Exami- a) Preparação da amostra, diluições seriadas
nation of Foods (Kornacki et al., 2015). Aplica- e inoculação. Seguir o mesmo procedimento
ção: análise de todos os alimentos. descrito no método do NMP (item 9.2), porém,
os tubos de LST não precisam conter o tubo de
O método do Coli Complete™ é uma modifica-
Durham. Após a inoculação da amostra, adicio-
ção do método do número mais provável clássico,
nar a cada tubo de LST inoculado, um disco do
que incorpora ao Caldo LST um disco impregna-
Coli Complete™ (BioControl Systems, Inc.).
do com dois substratos: o 5-bromo-4-cloro-3-in-
dolil-b-D-galactopiraniosídeo (X-GAL), para a Nota a.1) Alguns vidros utilizados na manufatura de tu-
enzima b-galactosidase dos coliformes, e o 4-me- bos de ensaio podem apresentar uma fluorescência
natural sob luz UV. Por essa razão, deve-se verificar
tilumbeliferil-b-D-glicuronídeo (MUG), para a a ausência de fluorescência em todos os tubos desti-
enzima b-glicuronidase de E. coli. nados ao teste com Coli Complete.
b) Incubação. Incubar os tubos de LST a 35
orientações do Capítulo 4, que apresenta todos os
ºC/30±2h e observar se há crescimento com
detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
produção de um precipitado azul insolúvel, in-
microrganismos pelo NMP, da seleção das dilui-
dicativo da presença de coliformes totais. Ob-
servar também a ocorrência de fluorescência
azul sob lâmpada de luz ultravioleta (6W, ondas
longas de 365 a 366nm), indicativa da presen-
ça de E. coli. Não sendo observada a formação
9.4.1. Material requerido para a do precipitado azul, reincubar as amostras a 35
análise ºC até completar 48h e verificar novamente a
Preparação da amostra e diluições seriadas presença de coliformes totais (mas não repetir
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou a leitura para E. coli com 48h).
Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) Nota b.1) A incubação dos tubos de LST com os discos
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada deve ser sempre acompanhada de um tubo inoculado
0,1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) com a cepa padrão glicuronidase positiva (E. coli) e

um tubo inoculado com a cepa padrão glicuronidase (AOAC Official Methods 991.14 e 998.08), para
negativa (Enterobacter aerogenes). coliformes totais + E. coli em alimentos. Em todos
c) Cálculo dos resultados. Para coliformes totais, eles o meio de cultura base é o Vermelho Violeta
contar todos os tubos de LST com precipitado Bile (VRB), seletivo para enterobactérias, suple-
azul insolúvel (após 30 ou 48h). Para E. coli, mentado com cloreto de trifeniltetrazolium (TTC),
contar todos os tubos de LST com fluorescên- indicador que, ao sofrer redução, confere coloração
cia azul sob luz UV (após 30h). Determinar o vermelha às colônias, facilitando sua visualização.
Número Mais Provável (NMP)/g ou ml con- O meio contém lactose que, fermentada pelos co-
forme a orientação do Capítulo 4, usando uma liformes ou E. coli, produz bolhas de gás em tor-
das tabelas de NMP. no das colônias. As colônias típicas são vermelhas
com bolhas de gás. No Petrifilm para Coliformes
+ E. coli, o meio contém ainda BCIG, substrato
9.5. Método do Petrifilm™ cromogênico para a b-glicuronidase, que permite
(AOAC) para contagem diferenciar E. coli pela formação de um precipitado
de coliformes totais e azul em torno das colônias. O Petrifilm de alta sen-
sibilidade (High-Sensitivity Coliform Count Plate)
E. coli em alimentos
permite a inoculação de volumes de 5 ml e o Petri-
Método oficial da AOAC International, descrito film para contagem rápida (Rapid Coliform Count
no Capítulo 17 da 20ª edição do Official Methods Plate) permite a obtenção do resultado em 8 a 14h.
of AOAC International (Latimer, 2016). Também
incluído no Capítulo 9 da 5ª edição do Compen- 9.5.1. Material requerido para a
dium of Methods for the Microbiological Exami- análise
nation of Foods (Kornacki et al., 2015) e no Capí-
tulo 7 do Standard Methods for the Examination
□ Diluente: Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
of Dairy Products (Davidson et al., 2004).
□ Tubos de diluição com 9 ml de Tampão Fosfa-
Petrifilm™ (3M Company) é uma modificação da
to pH 7,2 (PB)
contagem de Unidades Formadoras de Colônias
(UFC) em placas, composto por dois filmes esté-
reis reidratáveis, impregnados pelo meio de cul-
tura e por substâncias geleificantes solúveis em
água fria. A inoculação é feita no filme inferior
que, depois de inoculado, é coberto com o filme
superior. O inóculo é espalhado com um difusor Contagem de coliformes totais e E. coli
de plástico, por leve pressão manual e, depois da □ Placas de Petrifilm adequada à contagem que
solidificação do gel, as placas são incubadas para se deseja efetuar
desenvolvimento de colônias. □ Difusor plástico
A AOAC validou vários tipos de Petrifilm para co- □ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC
liformes totais e E. coli, com diferentes escopos de □ Estufa incubadora regulada a 32±1 ºC (para
aplicação: Petrifilm Coliform Count Plate (AOAC produtos lácteos)
Official Methods 991.14, 986.33 e 989.10), para
coliformes totais em alimentos, Petrifilm High 9.5.2. Procedimento
Sensitivity Coliform Count Plate (AOAC Official Observação: O procedimento abaixo é orienta-
Method 996.02), para coliformes totais em produ- tivo, devendo sempre ser verificadas e obede-
tos lácteos, Petrifilm Rapid Coliform Count Plate cidas as instruções do fabricante.
(AOAC Official Method 2000.15), para coliformes a) Preparação das amostras e diluições seria-
totais em alimentos e Petrifilm E. coli Count Plate das. Seguir os procedimentos descritos no Ca-

pítulo 2, porém, não usar diluentes contendo ▪ Petrifilm Coliformes Totais e Petrifilm Co-
citrato, bissulfito ou tiossulfato, porque podem liformes Totais Alta Sensibilidade. Incubar
inibir o crescimento nos petrifilms. Nos casos a 35±1 ºC/24±2h (32±1 ºC para produtos
em que esses diluentes sejam recomendados lácteos) e selecionar para contagem as pla-
no Capítulo 2, substituir por Tampão Fosfato cas com 15 a 150 colônias. Contar apenas as
(PB). Após a homogeneização, retirar uma alí- colônias típicas, vermelhas com bolhas de
quota de volume conhecido e verificar o pH. gás.
Se necessário, acertar na faixa de 6,5 a 7,5 ▪ Petrifilm Coliformes Totais Rápido. Incubar
com NaOH ou HCl 1N, verificando o volume a 35±1 ºC/8-24h (inclusive produtos lácte-
de ácido ou base consumido na correção da os) e fazer a contagem de todas as zonas
alíquota. Adicionar à amostra um volume pro- amarelas presentes, indicativas de produção
porcional da solução estéril. de gás e presuntivas de coliformes totais.
b) Inoculação. Selecionar três diluições adequadas Fazer a contagem definitiva com 24 horas,
da amostra e, de cada diluição, inocular 1 ml (5 da mesma forma indicada para o Petrifilm
ml no caso do Petrifilm de alta sensibilidade) coliformes totais.
em uma placa de Petrifilm adequada à conta- ▪ Petrifilm E. coli/Coliformes. Incubar a 35±1
gem que se deseja efetuar. Para tanto, seguir as ºC/24±2h (32±1 ºC para produtos lácteos) e
orientações do fabricante, apresentadas a se- selecionar para contagem as placas com 15
guir: colocar a placa em uma superfície plana, a 150 colônias. Contar apenas as colônias tí-
levantar o filme superior e posicionar a ponta picas, com as seguintes características: Co-
da pipeta perpendicular ao centro do filme in- liformes totais, todas as colônias vermelhas,
ferior. Depositar o volume de 1 ml (ou 5 ml) e azuis ou vermelho azuladas, com bolhas de
baixar o filme superior sobre o líquido, evitando gás. E. coli, apenas as colônias azuis ou ver-
a formação de bolhas. Posicionar o difusor plás- melho azuladas com bolhas de gás. Não ha-
tico sobre centro do filme superior, com o lado vendo desenvolvimento de colônias típicas
liso para baixo. Com leve pressão, espalhar o de E. coli em 24 horas, reincubar as placas e
líquido sobre todo o filme inferior. Não arrastar repetir a contagem com 48±2 horas.
o difusor sobre a placa, apenas pressionar le- Nota c.1) Pode ser necessário umidificar a incubadora,
vemente. Remover o difusor e aguardar dois a para que não ocorra desidratação das placas. A perda
cinco minutos, para a total solidificação do gel. de umidade, indicada pela perda de peso, não deve
ser superior a 15%, após a incubação.
Nota b.1) Para a seleção das diluições, seguir as orienta-
ções do Capítulo 3, porque o Petrifilm segue o mes- Nota c.2) Não contar as colônias presentes na espuma
mo princípio da contagem em placas. da borda do filme, pois essas não se encontram sob a
ação dos agentes seletivos. Não enumerar bolhas de
Nota b.2) O tecido de ostras, mexilhões e mariscos apre- ar artificiais.
senta atividade natural de b-glicuronidase, que pode
provocar falsos resultados positivos na contagem de Nota c.3) A área de crescimento circular das placas de
E. coli. Para essas amostras não é recomendável a Petrifilm é de aproximadamente 20cm2. Em placas
utilização do Petrifilm coliformes/E. coli. com mais de 150 colônias, a contagem pode ser es-
timada contando-se o número de colônias em um ou
Nota b.3) Alguns alimentos podem interferir na visualiza-
mais quadrados representativos e calculando-se a
ção das colônias na primeira diluição, como é o caso
média por quadrado. Multiplicar então por 20, para
de café, chocolate ou ervas secas (muito escuros).
determinar o número total de colônias por placa. Nas
placas de alta sensibilidade (inoculação de 5 ml) a
c) Incubação e contagem das colônias. Incubar área de crescimento é de aproximadamente 60cm2.
as placas com o lado transparente para cima, Multiplicar então por 60, para determinar o número
em pilhas com não mais de 20 placas (10 pla- total de colônias por placa.
cas no caso do Petrifilm de alta sensibilidade), Nota c.4) Uma vez completado o tempo de incubação,
nas seguintes condições: as placas podem ser congeladas (temperatura menor

ou igual a -15 ºC) para armazenamento de até uma □ Estufa incubadora regulada a 37±1 ºC
semana, para contagem posterior. □ Estufa incubadora regulada a 44±1 ºC
d) Cálculo dos resultados. Determinar o núme- Contagem de presuntiva E. coli
ro de UFC/g ou ml multiplicando o número □ Tubos de Caldo Triptona 1%
de colônias típicas pelo inverso da diluição □ Reagente de Kovacs para teste de indol
(UFC/g ou ml = Nº colônias/diluição). Nas □ Estufa incubadora regulada a 44±1 ºC
placas de alta sensibilidade considerar o volu-
me de 5 ml inoculado, no cálculo do resultado 9.6.2. Procedimento
(UFC/g ou ml = Nº colônias/5 x diluição).
O esquema de análise de coliformes termotoleran-
tes e E. coli presuntiva em alimentos pelo método
9.6. Método do NMP de NMP ISO 7251:2005 encontra-se descrito na
ISO 7251:2005 para contagem Figura 9.4.
de coliformes termotolerantes orientações do Capítulo 4, que apresenta todos os
e E. coli presuntiva em detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
alimentos microrganismos pelo NMP, da seleção das dilui-
Método da International Organization for Stan- descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres-
dardization, aplica-se a todos os alimentos desti- supondo que sejam conhecidos pelo analista.
nados ao consumo humano, às rações animais e à
a) Preparação das amostras e diluições seriadas.
amostras do ambiente de fabricação ou manipula-
Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2.
ção de alimentos.
b) Teste presuntivo. Selecionar três diluições ade-
quadas da amostra e inocular uma série de três
tubos de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)
análise por diluição, adicionando 1 ml da diluição por
Preparação da amostra e diluições seriadas tubo com 9 ml de LST. Incubar os tubos de
□ Diluente: Água Peptonada Tamponada (BPW) LST a 37±1 ºC/24±2h e observar se há cres-
ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) cimento com produção de gás. Em caso posi-
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Pepto- tivo (crescimento e produção de gás), passar
nada Tamponada (BPW) ou o Tampão Fosfato aos itens subsequentes. Em caso negativo (sem
pH 7,2 (PB) crescimento ou crescimento sem produção de
□ Pipetas de 1 ou 2 ml gás), reincubar até completar 48±2h e repetir
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- a leitura, passando para os itens subsequentes
tulo 2 para verificar casos especiais em que o em caso de crescimento com produção de gás.
tipo ou volume de diluente variam em função Nota b.1) No exame de moluscos e crustáceos (ostras, me-
da amostra analisada. xilhões e mariscos, camarão, etc), utilizar uma série de
Contagem de coliformes termotolerantes cinco tubos e incubar por 48±2h, sem leitura com 24h.
□ Tubos de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) Nota b.2) Algumas amostras de produtos lácteos (ex. case-
com tubos de Durham ína), podem provocar aderência dos tubos de Durham
□ Tubos de Caldo E. coli (EC) com tubos de no fundo do tubo de ensaio. Nesses casos, havendo
crescimento após 48±2h, passar aos itens subsequen-
Durham tes, mesmo que não seja observada produção de gás.
□ Cepa padrão positiva (cultura de E. coli com
24 horas) c) Contagem de coliformes termotolerantes. A
□ Cepa padrão negativa (cultura de E. aerogenes partir dos tubos de LST com produção de gás,
com 24 horas) transferir uma alçada bem carregada de cada cul-

Figura 9.4. Esquema de análise de coliformes termotolerantes e E. coli presuntiva em alimentos

pelo método de NMP ISO 7251:2005.

tura para tubos de Caldo E. coli (EC). Incubar 9.7.1. Material requerido para a
por 24±2h em banho-maria ou estufa incubado- análise
ra a 44±1 ºC e observar se há crescimento com
produção de gás. Em caso negativo (sem cres- □ Substrato cromogênico Colilert® (Idexx La-
cimento ou crescimento sem produção de gás), bratories Inc.) ou equivalente
reincubar até completar 48±2h e repetir a leitura. □ Proveta estéril para medida de volume de 100
ml da amostra de água
Nota c.1) No exame de moluscos e crustáceos (ostras, □ Pipetas estéreis de 10 ou 20 ml para transfe-
mexilhões e mariscos, camarão etc.), incubar por
apenas 24±2h.
rência de volumes de 10 ml da amostra com
Nota c.2) A incubação dos tubos de EC deve ser sempre
substrato
acompanhada de um tubo inoculado com a cepa pa- □ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC
drão positiva (Escherichia coli) e um tubo inoculado
com a cepa padrão negativa (Enterobacter aeroge-
nes). Todos os tubos devem permanecer mergulhados
9.7.2. Procedimento
na água, até uma altura superior à superfície do meio
Observação. O procedimento abaixo é orienta-
de cultura (caso o banho maria seja utilizado).
tivo, devendo sempre ser verificadas e obede-
d) Contagem presuntiva de E. coli. De cada tubo de cidas as instruções do fabricante do substrato
EC com crescimento e produção de gás, inocular cromogênico.
uma alçada em tubos com 5 ml de Caldo Triptona Teste de presença/ausência em 100 ml. Trans-
1%, para teste de indol. Pré-aquecer os tubos a 44 ferir 100 ml da amostra para um frasco ou bolsa
ºC antes da inoculação. Incubar os tubos a 44±1 estéril. Para amostras de água clorada, enviadas
ºC/48±2h e, após a incubação, adicionar 0,5 ml ao laboratório sem a prévia neutralização do clo-
de Reagente de Kovacs para teste de indol a cada ro, utilizar frascos ou bolsas estéreis contendo
tubo. O desenvolvimento de um anel vermelho tabletes de tiossulfato de sódio, para a neutrali-
violeta na superfície do meio de cultura, após um zação. Abrir o envelope ou ampola contendo a
minuto, indica a presença presuntiva de E. coli. quantidade pré-distribuída do substrato de cul-
Caso haja interesse na confirmação definitiva de tura, disponível comercialmente já esterilizado.
E. coli, podem ser usados os procedimentos des- Assepticamente, adicionar o substrato aos 100 ml
critos no item 9.2.2.f (IMViC). de amostra de água. Algumas partículas podem
e) Cálculo e expressão dos resultados. Para a con- permanecer indissolúveis, mas isso não afetará o
tagem presuntiva de E. coli, anotar o número de desempenho do teste. Incubar a 35±1 ºC/24h e ob-
tubos de Caldo Triptona 1% com teste de indol servar o desenvolvimento de cor amarela, confir-
positivo e determinar o Número Mais Provável mativa da presença de coliformes totais. Observar
(NMP)/g ou ml conforme a orientação do Capí- também, sob lâmpada de luz ultravioleta (4 a 6w),
tulo 4, usando uma das tabelas de NMP. ondas longas (365 a 366nm), a ocorrência de flu-
orescência azulada, confirmativa da presença de
E. coli.
9.7. Método do NMP
Quantificação pela técnica dos tubos múltiplos
AOAC 991.15:2016 (substrato (NMP). Se houver interesse na determinação do
cromogênico Colilert®) para Número Mais Provável (NMP) de coliformes to-
contagem de coliformes totais tais ou E. coli na amostra, dividir o volume de
e E. coli em água 100 ml (já contendo o substrato de cultura) em
10 alíquotas de 10 ml, transferidos para 10 tubos
Método oficial da AOAC International, descrito de ensaio estéreis vazios. Homogeneizar bem a
no Capítulo 17 da 20ª edição do Official Methods amostra, por agitação, antes da tomada das alíquo-
of AOAC International (Latimer, 2016). tas. Incubar os tubos a 35±1 ºC/24h e proceder

à leitura dos resultados da mesma forma descrita a) Preparação da amostra, filtração e incuba-
para o teste de presença/ausência. ção. Seguindo os procedimentos descritos no
Nota) Alguns vidros utilizados na manufatura de tubos Capítulo 3, filtrar 100 ml ou outro volume
de ensaio podem apresentar uma fluorescência natu- adequado da amostra em filtro membrana de
ral sob luz UV. Por essa razão, deve-se verificar a au- 0,45mm. Transferir a membrana para uma pla-
sência de fluorescência em todos os tubos destinados
ca de Ágar Coliformes Cromogênico (CCA) e
ao ensaio quantitativo.
incubar a placa, invertida, a 36±2 ºC/21-24h.
Nota a.1) A filtração de 100 ml da amostra é o procedi-
9.8. Método de filtração mento padrão para análise de água mineral, na qual
se espera ausência, sendo esse o volume mínimo exi-
ISO 9308-1:2014 para gido pela legislação brasileira.
contagem de coliformes totais b) Contagem e confirmação das colônias.
e E. coli em água Considerar como presuntivas de coliformes as
colônias róseas a vermelhas (atividade de β-D-
-galactosidase positiva). Para confirmação,
dardization, aplica-se a amostras de água com bai-
submeter preferencialmente todas ou pelo me-
xa contagem bacteriana, como água potável, água
nos 10 colônias ao teste de oxidase. Considerar
mineral e, também para água de piscinas submeti-
como E. coli as colônias azul escuras ou roxas
da a tratamentos bactericidas, que não contenham
(atividade de β-D-glicuronidase positivas). Es-
material em suspensão.
sas não requerem confirmação.
orientações do Capítulo 3, que apresenta todos b.1) Teste de oxidase. Colocar um disco ou fita
os detalhes e cuidados envolvidos na contagem de papel de filtro no interior de uma placa de
de microrganismos pela técnica da filtração em Petri e embeber o centro do papel com o rea-
membrana. O procedimento descrito abaixo não gente de Kovacs para teste de oxidase (solu-
apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam ção aquosa 1% de cloridrato de N,N,N,N-te-
conhecidos pelo analista. trametil-p-fenilenodiamina). Com uma alça
de platina ou palitos estéreis (não utilizar
alça de níquel-cromo), espalhar uma peque-
9.8.1. Material requerido para a na quantidade da cultura sobre o reagente no
análise papel, observando se ocorre o desenvolvi-
□ Conjunto de filtração previamente esterilizado mento de uma cor azul intensa, em aproxi-
□ Pinças para transferência das membranas, madamente dez segundos (teste positivo). O
mergulhadas em etanol não-desenvolvimento da cor azul no inter-
□ Membranas de porosidade de 0,45mm valo de um minuto indica teste negativo. Os
□ Placas de Ágar Coliformes Cromogênico coliformes são oxidase negativos.
(CCA) c) Cálculo dos resultados. Para coliformes totais,
□ Reagente de Kovacs para teste de Oxidase somar todas as colônias róseas a vermelhas
□ Estufa incubadora regulada a 36±2 ºC oxidase negativas com todas as colônias azul
escuras ou roxas e relatar a soma como UFC
9.8.2. Procedimento de coliformes totais pelo volume inoculado.
O esquema de análise de coliformes totais e E. coli Para E. coli, contar todas as colônias azul es-
em água pelo método de filtração ISO 9308-1:2014 curas ou roxas e relatar a soma como UFC de
encontra-se descrito na Figura 9.5. E. coli pelo volume inoculado.

Figura 9.5. Esquema de análise de coliformes totais e E. coli em água pelo método de filtração ISO 9308-1:2014.

9.9. Referências
AOAC International, 2016. Official Methods of Analysis of Standardization, 2005.
AOAC International (OMA) Online. Disponível no site: ISO 9308-1. Water quality — Enumeration of Escherichia
http://www.eoma.aoac.org [acesso em 12/04/2016]. coli and coliform bacteria — Part 1: Membrane filtra-
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STALEY, J.T. (Eds), Bergey’s Manual of Systematic dardization, 2014.
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Chapter 7, pp.187-226. LATIMER JR., G.W. (ed.). Official Methods of Analysis
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& Wastewater, 22 nd Ed. Washington, D.C.: American Water Works Association (AWWA) & Water Environ-
Public Health Association (APHA), American Water ment Federation (WEF), 2012.
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presumptive Escherichia coli – Most probable number the Examination of Dairy Products, 17 th ed. American
technique. 3 rd ed. The International Organization for Public Health Association, Washington, D. C., 2004.

10 Staphylococcus aureus
Item 10.1.1 (revisado) Taxonomia atualizada.
Item 10.1.2 (revisado) Epidemiologia atualizada.
Quadro 10.3 (revisado) Acrescentado método AOAC 2003.11.
Item 10.4.2.c (revisado) O tempo de incubação do BP passa a ser 46±2h.
Item 10.5 (novo). Adicionado método de plaqueamento ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003 para contagem estafiloco-
cos coagulase positiva em alimentos.
Item 10.6 (novo). Adicionado método do NMP APHA/AWWA/WEF:2012 para Staphylococcus aureus em água.
10.1. Introdução diferentes phyla indica uma grande distância fi-

logenética entre esses dois gêneros. Entretanto,
Staphylococcus aureus é uma bactéria patogêni- Micrococcus e Staphylococcus têm várias carac-
ca, cuja doença transmitida por alimentos (DTA) terísticas fenotípicas em comum, tanto que faziam
é classificada pela International Commission parte da mesma família na 1ª edição do Bergey’s
on Microbiological Specifications for Foods Manual of Systematic Bacteriology (Sneath et al.,
(ICMSF, 2002) no grupo de risco III, que inclui 1986).
as doenças “de perigo moderado, usualmente de O phylum Firmicutes inclui as bactérias Gram
curta duração e sem ameaça de morte ou sequelas, positivas com baixo teor de G+C no DNA (<50)
com sintomas auto limitados mas que causam se- (Schleifer, 2009). O gênero Staphylococcus é
vero desconforto”. membro da família Staphylococcaceae, que inclui
ainda os gêneros Jeotgalicoccus, Macrococcus e
10.1.1 Taxonomia Salinicocus (Schleifer & Bell, 2009a).
Na 9ª edição do Bergey’s Manual of Determinati-
ve Bacteriology (Holt et al., 1994) o gênero Sta- 10.1.1.1. O gênero Staphylococcus
phylococcus fazia parte do Grupo 17, que incluía De acordo com a descrição de Schleifer & Bell
todos os cocos Gram positivos. Na 2ª edição do (2009b) as células dos estafilococos são esféricas
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology os e caracteristicamente se dividem em mais de um
membros do Grupo 17 foram divididos em três plano, formando arranjos que lembram cachos de
phyla: o gênero Deinococcus foi transferido para uvas. Gram positivos, imóveis, não esporogêni-
o phylum Deinococcus-Thermus, os gêneros Mi- cos. Catalase usualmente positiva e oxidase usu-
crococcus e Stomatococcus foram transferidos almente negativa. Quimioorganotróficos, apre-
para o phylum Actinobacteria e os demais gêne- sentam metabolismo de carboidratos respiratório
ros de cocos Gram positivos, incluindo Staphylo- e fermentativo. São susceptíveis à lise por lisosta-
coccus, foram transferidos para o phylum Firmi- fina e resistentes à lise por lisozima. Predominan-
cutes (Garrity & Holt, 2001). temente associados à pele, glândulas e mucosas
A afiliação de Micrococcus e Staphylococcus em de animais de sangue quente.

Com base no teste de coagulase e na resistência coágulo sem participação do CRF e não é inibido
à novobiocina a 2ª edição do Bergey’s Manual of pelos anticorpos da coagulase livre. A detecção é
Systematic Bacteriology (Schleifer & Bell, 2009b) feita pelo teste de coagulase em lâmina.
divide as espécies de Staphylococcus em grupos. As principais características dos estafilococos
Os grupos mais importantes são: coagulase positivos encontram-se no Quadro
▪ Grupo S. epidermidis (incluindo S. epider- 10.1. De acordo com Schleifer & Bell (2009b),
midis, S. capitis, S. caprae, S. haemolyticus, S. aureus subsp. aureus é o patógeno mais co-
S. hominis, S. saccharolyticus, S. warneri) e mum, entre os estafilococos coagulase positivos
Grupo S. simulans (incluindo S. simulans, S. e várias cepas produzem enterotoxinas. S. aureus
carnosos), que são coagulase negativos e sus- subsp. anaerobius é encontrado em abscessos de
ceptíveis à novobiocina. carneiros e também é patogênico para caprinos.
▪ Grupo S. saprophyticus (incluindo S. sapro- Essa subspécie produz coagulase mas não produz
phyticus, S. cohnii, S. xylosus) e Grupo S. enterotoxinas. S. intermedius é patógeno oportu-
sciuri (incluindo S. sciuri, S. lentus, S. vitu- nista para cães. S. hyicus é associado à infecções
linus), que são coagulase negativos e resisten- em suínos, lesões de pele em bovinos e equinos,
tes à novobiocina. osteomielite em aves e bovinos e, ocasionalmen-
te, mastite em bovinos. S. delphini é associado à
▪ Grupo S. intermedius (incluindo S. interme-
lesões de pele em golfinhos. S. schleiferi subsp.
dius, S. delphini) e Grupo S. aureus (incluin-
coagulans é associado à otite em cães.
do S. aureus subsp. aureus, S. aureus subsp.
anaerobius), que são coagulase positivos e Dentre os estafilococos coagulase positivos S. au-
susceptíveis à novobiocina. reus, S. hyicus e S. intermedius são as espécies
associadas com intoxicações alimentares (Bennett
10.1.1.2. Os estafilococos coagulase & Hait, 2011).
positivos 10.1.1.3. Os estafilococos produtores de
Os estafilococos coagulase positivos são S. au- enterotoxinas
reus, S. intermedius, S. delphini e S. schleiferi Várias espécies de estafilococos produzem enteroto-
subsp. coagulans. S. hyicus é coagulase variável. xinas, incluindo coagulase positivos e negativos. As
Essas espécies são consideradas patógenos poten- principais características que diferenciam estas es-
cialmente sérios (Schleifer & Bell, 2009b) e, por pécies encontram-se apresentadas no Quadro 10.2.
essa razão, a produção de coagulase é considerada
uma indicação de patogenicidade entre as espé- 10.1.1.4. Staphylococcus aureus
cies de Staphylococcus. A espécie S. aureus é subdividida em duas subs-
De acordo com MacFaddin (2000), coagulase é pécies, S. aureus subsp. aureus e S. aureus subsp.
uma enzima que converte fibrinogênio em fibrina, anaerobius. As características que diferenciam es-
formando um coágulo visível. A enzima pode ser sas duas subspécies encontram-se no Quadro 10.1.
encontrada em duas formas, a coagulase ligada ou S. aureus subsp. anaerobius cresce em condições
“clumping factor” e a coagulase livre ou “clotting microaeróbicas e anaeróbicas, mas o crescimento
factor”. A coagulase livre é extracelular e reage em condições aeróbicas é fraco. Diferencia-se de
com uma substância do plasma chamada de “coa- S. aureus subsp. aureus em três características:
gulase-reacting factor” (CRF), formando um com- não produz pigmento e “clumping factor”, não
plexo coagulase-CRF. Esse complexo converte fi- fermenta o manitol em condições anaeróbicas e
brinogênio em fibrina indiretamente, produzindo não cresce a 45 ºC. A temperatura ótima de cresci-
o coágulo. A detecção é feita através do teste de mento varia entre 30 e 40 ºC, não cresce a 20 nem
coagulase em tubo. O “clumping factor”, que está a 45 ºC. Todas as cepas toleram 10% de NaCl,
localizado na superfície da parede celular, forma o a maioria não tolera 15%. O primeiro isolamento

Staphylococcus aureus □ 141
Quadro 10.1. Características bioquímicas e de crescimento das espécies e subspécies de estafilococos

coagulase positivos (Schleifer & Bell, 2009b).
S. aureus S. aureus subsp. S. schleiferi
Característica S. hyicus S. intermedius S. delphini
subsp. aureus anaerobius subsp. coagulans
Catalase + - + + + +
Oxidase - - - - - -
Pigmento +w - - - - -
Crescimento aeróbico + - + + + +
Crescimento anaeróbico (meio de tioglicolato) + + + (+) + +
Crescimento em 10% NaCl (p/v) + + + + + ND
Crescimento em 15% NaCl (p/v) w d -w d + ND
Crescimento a 15 ºC + ND + + ND ND
Crescimento a 45 ºC + - -w + + ND
Fosfatase alcalina + + + + + +
Redução do telurito + + ND - ND ND
Coagulase + + d + + +
Clumping factor + - - d - -
Proteina A + - ND - ND -
Nuclease termo resistente + + + + - +
Hemólise + + - d + +
Acido a partir de manitol + - - (d) + d
+, 90% ou mais cepas positivas; d, 11-89% ou mais cepas positivas; w, reação fraca; -w, reação fraca a negativa;
-, 90% ou mais cepas negativas; ( ), reação lenta; +w, reação positiva a fraca; ND, não determinado.
Quadro 10.2. Principais características que diferenciam as espécies de estafilococos produtores de en-
terotoxinas (Bennett et al., 2015).
Espécie Coagulase Hemólise Nuclease Manitol
S. aureus + (+) Termorresistente (+)
S. intermedius + + Termorresistente (+)
S. hyicus (+) - Termorresistente -
S. caprae - (+) Termosensível -
S. chromogens - - -w V
S. cohnii - - - V
S. epidermidis - V - -
S. haemolyticus - + Termosensível V
S. lentus - - +
S. saprophyticus - - - +
S. sciuri - - +
S. warneri - -w Termosensível +
S. xylosus - + - V
+ = positivo, - = negativo, -w = negativo a fracamente positivo, (+) = reação fraca, V = variável.

requer meios de cultura suplementados com soro noses tais como intoxicação alimentar, síndrome
sanguíneo, gema de ovo ou sangue (Schleifer & da pele escaldada e síndrome do choque tóxico,
Bell, 2009b). e iii) condições sistêmicas e com risco de vida,
S. aureus subsp. aureus é normalmente chama- como endocardite, osteomielite, pneumonia, abs-
do apenas de S. aureus na literatura, sem men- cesso cerebral, meningite e bacteremia.
ção à subspécie. De acordo com Schleifer & Bell Vários tipos de toxinas estão associadas às doen-
(2009b) é anaeróbio facultativo mas cresce me- ças provocadas por S. aureus. As toxinas alfa, beta,
lhor em condições aeróbicas. Produz proteína A, delta e gama, por exemplo, são leucocidinas en-
fosfatase alcalina, coagulase, “clumping factor”, volvidas na lise de células e na invasão de tecidos
nuclease termo estável (termonuclease), hemoli- (Ferry et al., 2005). As ETs (exfoliatives toxins),
sina e lipase. Produz ácido a partir de glicose e também conhecidas como toxinas epidermolíticas,
manitol em condição aeróbica. são responsáveis pela síndrome estafilocócica da
É mesófilo, crescendo na faixa de 7 a 47,8 ºC com pele escaldada, caracterizada pela perda de cama-
ótimo a 35 ºC (FDA, 2012). das superficiais da pele, desidratação e infecções
secundárias (Bukowski et al., 2010). A TSST-1
A faixa de pH de crescimento vai de 4,5 a 9,3,
(toxic shock syndrome toxin) é responsável pela
com ótimo entre 7,0 e 7,5 (FDA, 2012)
síndrome do choque tóxico, uma doença de início
S. aureus é tolerante ao sal e, de acordo com Schlei-
agudo, caracterizada por febre, erupções na pele e
fer & Bell (2009b) cresce bem em meios com 10%
hipotensão, podendo levar à insuficiência múltipla
de NaCl e pobremente em 15%. De acordo com a
de órgãos e choque letal (Ferry et al., 2005).
FDA (2012), sob condições ideais cresce em ativi-
dade de água de 0,83, com ótimo em 0,99. Sob esse 10.1.2.1. As enterotoxinas de S. aureus
aspecto é uma espécie atípica entre as bactérias pa- (SEs)
togênicas de origem alimentar, que normalmente As enterotoxinas de S. aureus (SEs) estão en-
não crescem em atividade de água baixa. volvidas na intoxicação alimentar estafilocócica,
S. aureus não é resistente ao calor, sendo facil- uma das doenças mais comuns transmitidas por
mente destruído na pasteurização ou na cocção de alimentos no mundo inteiro. São classificadas
alimentos. As toxinas, ao contrário, são altamente como superantígenos (SAGs), que têm a capaci-
resistentes, suportando tratamentos térmicos tão dade de desencadear uma resposta imune muito
severos como a esterilização de alimentos de bai- mais forte do que os antígenos normais (Pinchuk
xa acidez (ICMSF, 1996). et al., 2010).
Poucas destas enterotoxinas foram estudadas pro-
10.1.2. Epidemiologia fundamente. Elas são pirogênicas e apresentam
outras características em comum, como o fato de
S. aureus é um patógeno versátil e pode causar di- serem superantígenos, induzirem emese e gas-
versas infecções em humanos, associadas ou não troenterites (Pinchuk et al., 2010). Os sorotipos
aos alimentos. Entre 1950 e 1960 foi responsável das SEs são similares na composição e atividade
por considerável morbidade e mortalidade entre biológica, mas diferentes na atividade antigênica,
pacientes hospitalizados e em 1980 emergiram as sendo identificados sorologicamente como pro-
cepas resistentes à meticilina (methicillin resistant teínas distintas (Bennett & Hait, 2011). São re-
Staphylococcus aureus - MRSA), que se tornaram sistentes a ácido e estáveis numa ampla faixa de
um grande problema em hospitais (Schleifer & pH. Resistentes ao calor, não são completamente
Bell, 2009b). desnaturadas pelo cozimento. Também resistem
As doenças causadas por S. aureus são citadas por às proteases gastrointestinais e outras (pepsina,
Bien et al. (2011) em três categorias: i) lesões su- tripsina, quimotripsina, renina, papaína) (Smith,
perficiais tais como a infecção de feridas, ii) toxi- 2008, FDA, 2012).

Outras espécies de estafilococos também produ- for demonstrada posteriormente, a designação

zem enterotoxinas e causam gastroenterites em SEL pode ser alterado para SE.
humanos, incluindo cepas coagulase positivas Uma apresentação no IAFP 4 th European Sympo-
(S. intermedius, S. hyicus) e cepas coagulase ne- sium on Food Safety mostrou a seguinte situação
gativas (S. epidermidis). Entretanto, S. aureus é (Smith, 2008):
a espécie predominantemente associada com to- ▪ Enterotoxinas estafilocócicas clássicas:
xinfecções estafilocócicas (Bennett & Hait, 2011, SEA, SEB, SEC, SED e SEE.
FDA, 2012). ▪ Novas enterotoxinas: SEG, SEH, SEI, SER,
Em 1990 foi estabelecida uma designação padrão SES e SET.
para as enterotoxinas de S. aureus (Betley et al., ▪ Enterotoxinas-like: SElJ, SElK, SElL,
1990). Naquela época havia cinco variantes an- SElM, SElN, SElO, SElP, SElQ, SElU,
tigênicas, que foram designadas como “SEA”, SElV, SElW.
“SEB”, “SEC”, “SED” e “SEE” (Lina et al.,
2004). As enterotoxinas descobertas depois de 10.1.2.2. A doença de origem alimentar
1990 passaram a ser designadas por uma letra, na As informações abaixo são da 2ª edição do “Bad
ordem em que foram sendo descobertas. Bug Book”, Foodborne Pathogenic Microorga-
Em 2004 o International Nomenclature Com- nisms and Natural Toxins (FDA, 2012).
mittee for Staphylococcal Superantigens propôs A doença transmitida por S. aureus é chamada de
regras internacionais para designar as enterotoxi- intoxicação alimentar estafilocócica. É provocada
nas, levando em conta o fato de seu efeito emético pela ingestão de enterotoxinas formadas no ali-
haver sido comprovado ou não. As regras, descri- mento, quando ocorre a multiplicação das células.
tas por Lina et al. (2004) são as seguintes: A ingestão de uma dose menor que 1µg pode pro-
a) Genes de toxinas identificados mas cuja ex- vocar os sintomas da intoxicação e essa quanti-
pressão não tenha sido confirmada não devem dade é atingida quando a população de S. aureus
ser nomeados segundo a nomenclatura padrão alcança valores acima de 106 UFC/g de alimento.
internacional. Em indivíduos mais sensíveis, a ingestão de 100
b) Apenas as toxinas cujo efeito emético tenha a 200ng de enterotoxina pode causar sintomas. A
sido comprovado por administração oral em população de S. aureus no momento da análise
primatas podem ser chamadas de enterotoxinas. pode já não apresentar contagens tão altas (se o
c) A designação usando letras deve ser mantida alimento passou por algum tratamento destrutivo
para as SEs, onde S = S. aureus e E = entero- para as células), mas ainda assim conter a toxina
toxina. pré-formada. Isto deve ser levado em considera-
d) A abreviatura SE deve ser seguida de uma le- ção na interpretação dos resultados de contagem
tra atribuída sequencialmente, até a 25ª toxina de S. aureus em alimentos suspeitos, porque ainda
(SEZ). Depois disso, as toxinas recém-descri- que as células tenham sido destruídas, as toxinas
tas deverão ser numeradas sequencialmente permanecem biologicamente ativas.
começando com SE26. Os sintomas são evidenciados entre uma a sete
e) As toxinas que não mostrarem propriedades horas depois da ingestão, incluindo náusea, vômi-
eméticas (ou não forem testadas) devem ser tos, cólicas abdominais e diarreia. Em casos mais
designadas como “enterotoxina estafilocóci- graves pode ocorrer desidratação, dor de cabeça,
ca-like” (SEL), para indicar que o seu papel dores musculares e alterações transitórias da pres-
potencial na intoxicação alimentar não foi são arterial e da pulsação. A recuperação ocorre
confirmado. Para minimizar a confusão e mu- em torno de algumas horas a um dia e as compli-
dança de nome posterior, SELs devem seguir a cações ou morte são raras. A complicação mais
designação sequencial por letras, na ordem em comum é a desidratação, provocada pela diarreia
que forem descobertas. Se a atividade emética e vômito. O diagnóstico é fácil, especialmente

quando há predomínio de sintomas gastrointesti- verificar se o alimento é uma fonte potencial de

nais superiores, com intervalo curto entre a inges- S. aureus ou indicar contaminação pós-processo
tão e o início dos sintomas. A confirmação é ba- (que geralmente se deve ao contato com mani-
seada no isolamento da enterotoxina pré-formada puladores ou com superfícies inadequadamente
ou no isolamento de estafilococos enterotoxigêni- sanitizadas). Em cada um destes casos, o suces-
cos do alimento suspeito ou das fezes ou vômito so das análises depende da seleção de um méto-
do paciente. do adequado ao número de células presentes e
Os estafilococos são muito comuns no ambiente, às condições de injúria das células. De maneira
podendo ser encontrados no ar, poeira, esgoto e geral, alimentos envolvidos em surtos apresentam
água. O reservatório de S. aureus são os seres hu- uma grande população de S. aureus, não exigindo
manos e os animais de sangue quente, ocorrendo métodos particularmente sensíveis. É importante
nas vias nasais, garganta, pele e cabelos de 50% ressaltar, entretanto, que alimentos mantidos em
ou mais indivíduos humanos saudáveis. A con- condições favoráveis ao crescimento e, depois,
taminação pode ser introduzida nos alimentos submetidos a aquecimento, podem não apresen-
através da tosse ou espirros de indivíduos com tar células viáveis, mas, ainda assim, conter toxi-
infecções respiratórias, ou por trabalhadores com nas ativas (Bennett et al., 2015). Na enumeração
lesões nas mãos ou braços causadas por S. aureus. como indicador, o número de células geralmente
De maneira geral os manipuladores são a fonte é baixo, exigindo métodos mais sensíveis, princi-
mais frequente de contaminação, embora os equi- palmente se S. aureus não for a espécie predomi-
pamentos e superfícies do ambiente também pos- nante no alimento.
sam contaminar os alimentos. Há vários métodos disponíveis para a contagem
Alimentos já incriminados em surtos incluem de S. aureus, com sensibilidade variável tanto
carnes e produtos cárneos (principalmente pre- em função das características seletivas/diferen-
suntos), produtos lácteos e derivados (principal- ciais utilizadas na formulação dos meios, como
mente queijos), aves, ovos, saladas mistas com em função da técnica de contagem propriamente
vários ingredientes (ovos, atum, frango, batata), dita (direta em placas ou pelo Número Mais Pro-
macarrão, tortas de cremes, bombas de chocolate vável). Eventualmente, dependendo do objetivo
e sanduíches com recheios. São de maior risco os da análise e das condições de injúria impostas às
alimentos muito manipulados durante o preparo células, pode ser aconselhável a aplicação de um
e/ou os que permanecem à temperatura ambiente simples teste de presença/ausência, com uma eta-
depois da preparação. pa de pré-enriquecimento não seletivo, que garan-
Na prevenção é essencial evitar a permanência ta a reparação das injúrias.
dos alimentos de risco por muito tempo em tem- As principais características seletivas utilizadas
peraturas de abuso, que permitam a multiplica- no isolamento de S. aureus são a habilidade de
ção e a produção de enterotoxinas. Nos casos de crescer na presença de NaCl (5,5 a 10%), teluri-
intoxicação humana os alimentos normalmente to de potássio (0,0025 a 0,05%), cloreto de lítio
implicados não foram mantidos sob refrigeração (0,01 a 0,05%), glicina (0,12 a 1,26%) e poli-
(abaixo de 10 ºC) ou não foram mantidos suficien- mixina (40 mg/l). As características diferenciais
temente quentes (acima de 45 ºC). são a capacidade de reduzir o telurito de potás-
sio (produzindo colônias pretas em meios sóli-
dos), a capacidade de hidrolisar a gema de ovo,
10.1.3. Comentários sobre os
a capacidade de utilizar o manitol e de crescer a
métodos de análise
42-43 ºC em condições seletivas, a atividade de
A contagem de S. aureus em alimentos pode ser coagulase e a atividade de termonuclease. Há vá-
feita com três objetivos diferentes: confirmar o rios meios disponíveis para a contagem direta em
envolvimento em surtos de intoxicação alimentar, placas, combinando uma ou mais características

seletivas/diferenciais, como o Ágar Manitol Sal, 10.2. Método de plaqueamento

o Ágar Vogel-Johnson, o Ágar Azida Gema de
Ovo, o Ágar Fenolftaleína Fosfato de Polimixina,
APHA 39.63:2015 para
o Ágar Leite Sal, o Ágar Telurito Glicina, o Ágar contagem de Staphylococcus
Telurito Polimixina Gema de Ovo e o Ágar Sta- aureus em alimentos
phylococcus 110. De maneira geral, estes meios
não devem ser utilizados para alimentos em que Método da American Public Health Association
se espera a presença de células injuriadas, pois (APHA), descrito no Capítulo 39 da 5ª edição do
são considerados restritivos para a reparação das Compendium of Methods for the Microbiological
injúrias. Examination of Foods (Bennett et al., 2015) e no
Capítulo 5 da 17ª edição do Standard Methods for
O meio mais amplamente utilizado é o Ágar
the Examination of Dairy Products (Henning et al.,
Baird-Parker (BP), que combina o telurito de
2004). Recomendado para alimentos em que se es-
potássio (0,01%), a glicina (1,2%) e o cloreto de
pera contagens de S. aureus acima de 100 UFC/g.
lítio (0,5%), como agentes seletivos, e a redução
do telurito e a hidrólise da gema de ovo, como ca- Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
racterísticas diferenciais. Adicionalmente, o meio orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os
contém 1% de piruvato de sódio, considerado detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
excelente para a reparação de células injuriadas, microrganismos em placas, da seleção das dilui-
porque evita o acúmulo de peróxido de hidrogênio ções ao cálculo dos resultados. O procedimento
(tóxico para as células). Pode ser utilizado para o descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres-
plaqueamento direto de alimentos processados ou supondo que sejam conhecidos pelo analista.
“in natura”, tanto na enumeração com finalidades
10.2.1. Material requerido para a análise
indicativas como na enumeração com finalidades
de saúde pública. Por outro lado, o BP, bem como Preparação da amostra e diluições seriadas
todos os demais meios citados, não é capaz de □ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou
suprimir completamente o crescimento de com- Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
petidores de S. aureus. Outras espécies não pato- □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptona-
gênicas do gênero Staphylococcus podem crescer, da 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2
produzindo colônias semelhantes, havendo a ne- (PB)
cessidade de submeter as colônias típicas ao teste □ Pipetas de 1 ou 2 ml
de coagulase, para confirmação. Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
Outros métodos oficializados pela AOAC Inter- tulo 2 para verificar casos especiais em que o
national são os “kits” analíticos descritos no Qua- tipo ou volume de diluente variam em função
dro 10.3. da amostra analisada.
Quadro 10.3. “Kits” analíticos oficializados pela AOAC International para a contagem de S. aureus em
alimentos (Latimer, 2016, AOAC International, 2016).
Fabricante Nome do “kit Validação Aplicação
3M Microbiology Products Petrifilm™ Rapid S. aureus Count Plate AOAC Official Method 2001.05 Alimentos
Alimentos processados
3M Microbiology Products Petrifilm™ StaphExpress Count Plate AOAC Official Method 2003.07
e preparados
3M Microbiology Products Petrifilm™ StaphExpress Count Plate AOAC Official Method 2003.08 Produtos lácteos selecionados
3M Microbiology Products Petrifilm Staph Epress Count Plate AOAC Official Method 2003.11 Carne bovina, aves e pescados

Contagem direta em placas c) Incubação e contagem das colônias presunti-

□ Placas com Ágar Baird-Parker (BP) vas. Aguardar que as placas sequem completa-
□ Estufa incubadora regulada a 35-37 ºC mente e incubar, invertidas, a 35-37 ºC/45-48h.
Confirmação Nota c.1) Incubação a 35±1 ºC no Standard Methods for
□ Tubos com Caldo Infusão Cérebro Coração(BHI) the Examination of Dairy Products.
□ Tubos com Ágar Tripticase de Soja (TSA) in-
Selecionar para a contagem as placas com 20
clinados
a 200 colônias. Contar as colônias típicas de
□ Coagulase Plasma-EDTA ou “kit” de teste de
S. aureus, que são circulares, pretas ou cinza
aglutinação em látex
escuras, com 2-3mm de diâmetro (em placas
□ Placas ou lâminas com Ágar Azul de Toluidina
cheias são menores, com cerca de 1,5mm),
DNA
lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa
□ Reagente de Catalase
de células esbranquiçada nas bordas, rodeadas
(peróxido de hidrogênio 3%)
por uma zona opaca e, frequentemente, por um
□ Tampão Fosfato Salina 0,02M
halo transparente se estendendo para além da
□ Lisostafina
zona opaca.
□ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5% de
Outros tipos de colônias também podem vir a
glicose
ser observados nas placas. Por exemplo, cepas
□ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5% de
isoladas de alimentos congelados ou desidrata-
manitol
dos por longos períodos de tempo podem apre-
□ Óleo mineral estéril
sentar colônias menos escuras, com aparência
□ Reagentes para coloração de Gram
rugosa e seca. Eventualmente S. aureus também
□ Estufa incubadora regulada a 35-37 ºC
pode apresentar colônias atípicas, cinzentas,
sem um ou ambos os halos típicos. Nesses ca-
10.2.2. Procedimento sos, contar cada tipo de colônia separadamente
O esquema geral de análise de S. aureus pelo mé- e anotar o resultado obtido para cada tipo.
todo de plaqueamento APHA 39.63:2015 encon- Se as colônias típicas estiverem presentes ape-
tra-se descrito na Figura 10.1. nas em placas mais cheias (mais de 200 colô-
a) Preparação da amostra e diluições seriadas. nias) e não nas placas das diluições subsequen-
Seguir os procedimentos descritos no Capítulo tes, usar essas placas para a contagem, mas não
2. Para a análise de produtos lácteos o Stan- contar as colônias atípicas.
dard Methods for the Examination of Dairy d) Confirmação. Selecionar no mínimo cinco co-
Products recomenda unidade analítica de 50g. lônias típicas para o teste de coagulase e, haven-
b) Inoculação. Selecionar três diluições ade- do menos do que cinco, tomar todas. Se a pla-
quadas da amostra e inocular 0,1 ml de cada ca apresentar colônias suspeitas de mais de um
diluição na superfície de placas de Ágar tipo, selecionar pelo menos uma de cada tipo.
Baird-Parker (BP), previamente preparadas e Transferir cada colônia para tubos de Caldo
secadas. Espalhar o inóculo com uma alça de Infusão Cérebro Coração (BHI), emulsionar
Drigalski, das placas de maior para as placas bem a massa de células com o caldo e transfe-
de menor diluição, até que todo o excesso de rir uma alçada de cada tubo de BHI para tubos
líquido seja absorvido. Se as contagens esti- com Ágar Tripticase de Soja (TSA) inclinados.
madas de S. aureus na amostra forem menores Incubar todos os tubos a 35-37 ºC/18-24h. Re-
do que 100 UFC/g ou ml, inocular 1 ml da servar a cultura em TSA para testes adicionais,
amostra ou da primeira diluição, distribuindo se necessários.
o volume por quatro placas, três com 0,3 ml e d.1) Teste de coagulase. Transferir 0,2 ml de
uma com 0,1 ml. cada cultura obtida em BHI, para um tubo

Figura 10.1. Esquema de análise de S. aureus pelo método de plaqueamento APHA 39.63:2015 (Bennett et al., 2015).

estéril de 10x100mm. Adicionar aos 0,2 lhamento imediato (teste positivo) ou não
ml de cultura, 0,5 ml de Coagulase Plasma (teste negativo). As cepas de S. aureus são
EDTA (plasma de coelho com EDTA). Mis- catalase positivas.
turar com movimentos de rotação, sem agi- d.3) Teste de termonuclease. A partir do caldo
tar os tubos, para não interferir na coagula- BHI, transferir uma porção da cultura para
ção. Incubar a 35-37 ºC e observar periodi- um tubo de 10x100mm e ferver em banho
camente, durante seis horas, se há formação maria por 15 minutos. Inocular a cultura
de coágulo. Ao observar os tubos, não agitar fervida e resfriada nos orifícios previamente
para evitar rompimento do coágulo. Ao fi- preparados em lâminas de Ágar Azul de To-
nal das seis horas, a coagulação completa de luidina DNA. Utilizar uma das perfurações
todo o conteúdo do tubo, formando um coá- para uma cepa padrão termonuclease posi-
gulo firme que não se rompe quando o tubo tiva (S. aureus ATCC 12.600) e outra para
é virado para baixo, é considerada reação uma cepa padrão negativa (S. epidermidis
positiva de nível 4+ (Figura 10.1). A coagu- ATCC 14.990). Colocar as lâminas dentro
lação da maior parte do conteúdo do tubo, de placas de Petri recobertas com papel de
formando um coágulo grande e organizado, filtro umidificado (câmara úmida) e selar
é considerada reação positiva de nível 3+. A as placas com fita crepe. Incubar a 35-37
formação de um pequeno coágulo organiza- ºC/4h ou a 50 ºC/2h e observar, após a in-
do ou de pequenos coágulos desorganizados cubação, se há formação de um halo róseo,
caracterizam reações positivas de nível 2+ estendendo-se por cerca de 1mm em redor
ou 1+, respectivamente. As reações de nível das perfurações inoculadas (teste positivo),
3+ ou 4+ são confirmativas da presença de ou a ausência desse halo, indicativa de teste
S. aureus coagulase positivo. Culturas com negativo. As cepas de S. aureus produzem
reações positivas de nível 1+ ou 2+ devem termonuclease.
ser submetidas a testes adicionais (coloração d.4) Teste de sensibilidade à lisostafina. A par-
de Gram, catalase, termonuclease, sensibili- tir do caldo BHI, transferir 0,1 ml da cultura
dade à lisostafina e utilização anaeróbica da para um tubo estéril de 10x100mm com 0,1
glicose e do manitol), para confirmação. ml de solução de lisostafina (dissolvida em
Nota d.1.1) O Compendium considera a reação de ní- Tampão Fosfato Salina 0,02M com 2% de
vel 3+ confirmativa, mas o Standard Methods for NaCl) na concentração de 25 mg/ ml. Prepa-
the Examination of Dairy Products (Henning et al., rar um tubo com uma cepa padrão positiva
2004) e o Bacteriological Analytical Manual (Ben-
(S. aureus ATCC 12.600), um tubo com uma
nett & Lancette, 2016) só consideram a reação de
nível 4+. cepa padrão negativa (Kocuria varians ATCC
Nota d.1.2) O teste de coagulase pode ser substituído 15.306, anteriormente classificado como Mi-
pelo teste de aglutinação em latex, utlizando “kits” crococcus varians) e um tubo “branco” com
disponíveis comercialmente. Esse teste detecta o fa- 0,1 ml da cultura suspeita e 0,1 ml de Tampão
tor aglutinante (clumping factor) presente nas células
Fosfato 0,02M com 2% de NaCl (sem lisos-
de S. aureus, que liga-se ao fibrinogênio ou fibrina do
plasma humano ou de coelho, resultando na aglutina- tafina). Incubar os tubos a 37±1 ºC/2h e ob-
ção das células. Para a realização do teste, seguir o servar se a suspensão perde a turbidez (teste
procedimento recomendado pelos fabricantes. positivo) ou permanece turva (teste negativo).
As células de S. aureus geralmente são lisa-
d.2) Teste de catalase. A partir dos tubos de das pela lisostafina (sensíveis), apresentando
TSA inclinados, emulsionar uma alçada da resultado positivo nesse teste.
cultura em uma gota do Reagente de Cata- Nota d.4.1) Lisostafina dissolvida em Tampão Fosfato
lase (peróxido de hidrogênio 3%), em uma 0,02M com 1% de NaCl no Standard Methods for the
lâmina de vidro. Observar se ocorre borbu- Examination of Dairy Products.

d.5) Teste de utilização anaeróbica da glicose e 10.3. Método do NMP

do manitol. A partir do tubo de TSA, trans-
ferir uma alçada com inóculo pesado da cul-
APHA 39.62:2015 para
tura para um tubo de Caldo Púrpura Base Staphylococcus aureus
com 0,5% de glicose e um tubo de Caldo em alimentos
Púrpura Base com 0,5% de manitol, previa-
mente desaerados. Incluir um tubo inocu-
(APHA), descrito no Capítulo 39 da 5ª edição do
lado com uma cepa padrão positiva (S. au-
reus ATCC 12.600), um tubo com uma cepa
Examination of Foods (Bennett et al., 2015).
padrão negativa (Kocuria varians ATCC
Este método é recomendado para ingredientes e
15.306) e um tubo “branco” não inoculado.
alimentos não processados, com baixa contagem
Cobrir com uma camada de 2,5mm de óleo
de S. aureus e alta contagem de microrganismos
mineral estéril e incubar por cinco dias a 37
competidores. Antes de iniciar as atividades, ler
ºC. Observar a ocorrência de viragem ácida
atentamente as orientações do Capítulo 4, que apre-
para amarelo (teste positivo) ou não (teste
senta todos os detalhes e cuidados envolvidos na
negativo). S. aureus utiliza a glicose e, usu-
contagem de microrganismos pelo NMP, da seleção
almente, também o manitol anaerobicamen-
das diluições ao cálculo dos resultados. O procedi-
te. K. varians não.
mento descrito abaixo não apresenta esses detalhes,
e) Interpretação e cálculo dos resultados. Con- pressupondo que sejam conhecidos pelo analista.
siderar como S. aureus todas as culturas com
reação de coagulase de níveis 3 e 4, ou as cul- 10.3.1. Material requerido para a
turas com reação de coagulase de níveis 1 e
análise
2, Gram positivas em forma de cocos em ca-
chos, produtoras de termonuclease, sensíveis à Preparação da amostra e diluições seriadas
lisostafina e que utilizam a glicose e o manitol □ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou
anaerobicamente. Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
Calcular o número de UFC/g ou ml em fun-
ção do número de colônias típicas contadas,
diluição inoculada e percentagem de colônias
confirmadas.
Exemplo 1: Diluição 10-2, 30 colônias típicas, tipo ou volume de diluente variam em função
cinco submetidas à confirmação, três confir- da amostra analisada.
madas (60%). UFC/g ou ml = 30x102x10x0,6 Contagem
= 1,8x104. □ Tubos com 10 ml de Caldo Tripticase de Soja
Exemplo 2: Diluição 10-2, 30 colônias suspeitas (TSB) suplementado com 10% de NaCl e 1%
(20 de um tipo e 10 de outro tipo), 10 subme- de piruvato de sódio
tidas à confirmação (cinco do primeiro tipo e □ Placas de Ágar Baird Parker (BP)
cinco do segundo tipo), sete confirmadas (cin- □ Estufa incubadora regulada a 35-37 ºC
co do primeiro tipo = 100% e 2 do segundo Confirmação
tipo = 40%). UFC/g ou ml = (20x102x10x1) + □ Os mesmos itens requeridos no item 10.2.1.
(10x102x10x0,4) = 2,4x104.
10.3.2. Procedimento
O esquema geral de análise de S. aureus pelo mé-
todo do NMP APHA 39.62:2015 encontra-se des-
crito na Figura 10.2.

Figura 10.2. Esquema de análise de S. aureus pelo método do NMP APHA 39.62:2015(Bennett et al., 2015).

a) Preparação das amostras, inoculação e in- Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
cubação. Para a preparação das amostras e tulo 2 para verificar casos especiais em que o
diluições decimais seriadas, seguir os procedi- tipo ou volume de diluente variam em função
mentos descritos no Capítulo 2. Inocular três da amostra analisada.
porções de 1 ml das três primeiras diluições Teste de presença/ausência
da amostra, em uma série de três tubos com □ Frascos com 50 ml de Caldo Tripticase de Soja
10 ml de Caldo Tripticase de Soja (TSB), su- (TSB) em concentração dupla
plementado com 10% de NaCl e 1% piruvato □ Frascos com 100 ml de Caldo TSB (concentra-
de sódio. Incubar os tubos a 35-37 ºC/48±2h e ção normal) suplementado com 20% de NaCl
observar se ocorre crescimento. □ Placas de Ágar Baird Parker (BP)
b) Confirmação. A partir de cada tubo com cres- □ Estufa incubadora regulada a 35-37 ºC
cimento, estriar uma alçada da cultura em Confirmação
placas de Ágar Baird-Parker (BP), por estrias □ Os mesmos itens requeridos no item 10.2.1.
de esgotamento. Incubar as placas a 35-37
ºC/48±2h e observar a presença de colônias tí- 10.4.2. Procedimento
picas, do tipo descrito no item 10.2. Na ausên- O esquema geral do método de presença/ausência
cia de colônias típicas, considerar o tubo como de S. aureus APHA 39.61:2015 encontra-se des-
não confirmado. Na presença de colônias típi- crito na Figura 10.3.
cas, selecionar uma ou mais colônias de cada
a) Pré-enriquecimento. Para a preparação das
placa e submeter à confirmação, seguindo os
amostras, seguir os procedimentos descritos no
mesmos procedimentos descritos no item 10.2.
Capítulo 2. Para aumentar o limite de detecção
c) Cálculo dos resultados. Anotar o número de tu- do método, pode-se inocular diferentes quanti-
bos confirmados e determinar o Número Mais dades da amostra na primeira diluição (50g/450
Provável (NMP)/g ou ml conforme a orientação ml diluente ou 100g/900 ml diluente, etc.).
do Capítulo 4, usando uma das tabelas de NMP. Transferir 50 ml da primeira diluição para 50 ml
de Caldo Tripticase de Soja (TSB) em concen-
tração dupla e incubar a 35-37 ºC por 3 horas.
10.4. Método de presença/
b) Enriquecimento seletivo. Após a incubação
ausência APHA 39.61:2015 por três horas, adicionar ao Caldo TSB mais
para Staphylococcus aureus 100 ml de Caldo TSB (em concentração nor-
em alimentos mal) suplementado com 20% de NaCl. Incubar
a 35-37 ºC por 24±2 horas.
c) Confirmação da presença/ausência. Transfe-
rir duas porções de 0,1 ml do caldo de enri-
quecimento seletivo para a superfície de duas
Examination of Foods (Bennett et al., 2015).
placas de Ágar Baird-Parker (BP). Espalhar o
Este método objetiva verificar a presença de S.
inóculo com uma alça de Drigalski, aguardar
aureus em alimentos processados, com baixa con-
a completa absorção do líquido e incubar as
tagem e provável incidência de células injuriadas.
placas invertidas, a 35-37 ºC/46±2h. Observar
a presença de colônias típicas de S. aureus, do
10.4.1. Material requerido para a tipo descrito no item 10.2, e considerar a au-
análise sência de colônias típicas como indicação da
Preparação da amostra ausência de S. aureus na quantidade de amos-
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou tra inoculada. Havendo colônias típicas, se-
Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) lecionar duas ou mais colônias de cada placa

Figura 10.3. Esquema geral do método de presença/ausência de S. aureus APHA 39.61:2015 (Bennett et al., 2015).

e submeter à confirmação, de acordo com o a) Preparação da amostra, inoculação e incu-

procedimento descrito no item 10.2. Havendo bação. Para a preparação da amostra e dilui-
confirmação das colônias, apresentar o resulta- ções seriadas, seguir os procedimentos descri-
do como presença de S. aureus na quantidade tos no Capítulo 2.
de amostra inoculada. Selecionar pelo menos duas diluições adequa-
das da amostra e inocular 0,1 ml de cada dilui-
ção em placas de Ágar Baird-Parker (BP), pre-
10.5. Método de plaqueamento viamente preparadas e secadas (plaqueamento
ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003 em superfície). Se não houver necessidade de
diluições, inocular duas alíquotas de 0,1 ml
para contagem de
em duas placas de BP (duplicata). Havendo
estafilococos coagulase suspeita de contagens inferiores a 100 UFC/g,
positivos em alimentos inocular 2x1 ml da primeira diluição da amos-
tra, distribuindo cada alíquota de 1 ml em três
Método da International Organization for Stan- placas de BP. Espalhar o inóculo com alças de
dardization, aplica-se a todos os alimentos desti- Drigaslski, até que todo o líquido seja absorvi-
nados ao consumo humano e às rações animais. do pelo meio de cultura. Incubar invertidas, a
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as 35±1 ºC/48±2h ou a 37±1 ºC/48±2h.
Nota a.1) O método ISO 6888-1 especifica plaqueamen-
detalhes e cuidados envolvidos na contagem de to em duplicata mas a ISO 7218:2007/Amd 1:2013
microrganismos em placas, da seleção das dilui- dispensou a duplicata quando for feita a inoculação
ções ao cálculo dos resultados. O procedimento de pelo menos duas diluições.
descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- b) Contagem das colônias presuntivas. Após a
supondo que sejam conhecidos pelo analista. incubação, selecionar para a contagem as pla-
cas com 15 a 300 colônias típicas e/ou atípicas
10.5.1. Material requerido para a e contar separadamente as típicas e as atípicas
análise de diferentes tipos.
□ Diluente: Água Peptonada Tamponada (BPW) Colônias típicas. Pretas ou cinzas, brilhantes,
ou Água Salina Peptonada (H2Osp) convexas, com 1,5-2,5 mm de diâmetro, rode-
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptona- adas por um halo claro transparente em redor.
da Tamponada (BPW) ou Água Salina Pepto- Um anel opaco pode se formar na parte mais
nada (H2Osp) interna deste halo, na região imediatamente em
contato com a colônia.
□ Placas de Ágar Baird-Parker (BP)
Colônias atípicas. Podem ser de dois tipos: i)
□ Tubos de Caldo Infusão Cérebro Coração(BHI)
cinzentas sem o halo claro ou ii) pretas bri-
□ Coagulase Plasma-EDTA (plasma de coelho
lhantes, com ou sem uma estreita massa de
com EDTA)
células esbranquiçadas nas bordas, com halo
□ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC ou a
transparente pouco visível ou ausente e anel
37±1 ºC
opaco também pouco visível ou ausente.
Nota b1) Colônias que não se enquadrem nas caracterís-
10.5.2. Procedimento ticas típicas ou atípicas são consideradas como flora
acompanhante.
O esquema geral de análise de estafilococos coa-
gulase positiva pelo método de plaqueamento ISO c) Confirmação das colônias presuntivas. Sele-
6888-1:1999/Amd 1:2003 encontra-se descrito na cionar prioritariamente cinco colônias típicas e
Figura 10.4. na ausência parcial ou total de colônias típicas,

Figura 10.4. Esquema de análise para contagem de de estafilococos coagulase positiva pelo
método de plaqueamento ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003.

selecionar as colônias atípicas, se houver, tota- Exemplo 1) Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1e
lizando cinco colônias para o teste de coagula- 10-2, uma placa por diluição (n1 = 1 e n2 = 1).
se . Transferir cada colônia para tubos com 5 Os resultados obtidos foram:
ml de Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI) e Diluição 10-1 Diluição 10-2
incubar a 35±1 ºC ou 37±1 ºC por 24±2h. Colônias típicas na placa (Ct) 150 17
Colônias atípicas na placa (Ca) 0 0
Teste de coagulase: Transferir 0,1 ml de cada Colônias típicas submetidas
cultura obtida em BHI, para um tubo estéril de 5 5
10x100mm. Adicionar aos 0,1 ml de cultura, Colônias atípicas submetidas
0 0
0,3 ml de Coagulase Plasma-EDTA (plasma de
Colônias típicas confirmadas dentre as
coelho com EDTA). Misturar com movimen- 4 3
submetidas à confirmação (bt)
tos de rotação, sem agitar os tubos, para não Colônias atípicas confirmadas dentre as
0 0
submetidas à confirmação (ba)
interferir na coagulação. Incubar um contro-
le positivo (0,1 ml de cultura de Stapylococ- (4x150/5)+0 (3x17/5)+0
confirmadas nas placas
= 120 = 10
cus.aureus cultivada em caldo BHI e 0,3 ml [a = (bt .Ct /At) + (ba .Ca /Aa)]
de Coagulase Plasma-EDTA) em paralelo ao
Primeira diluição retida para contagem (d) 10-1 = 0,1
teste. Incubar a 35 ou 37 ºC e observar após Somatórias das colônias consideradas
120+10 = 130
4-6 horas a formação de coágulo. No caso de confirmadas nas placas (∑a)
teste negativo, completar a incubação para 24h 130 / [0,1 .(1+0,1.1).0,1]
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
= 130/0,011 = 1,2x104
e examinar os tubos novamente. Considerar
como coagulase positiva todos os tubos que Exemplo 2) Inoculados 0,1 ml da diluição 10-1,
apresentarem formação de coágulo ocupando em duplicata (n1 = 2 e n2 = 0) . Os resultados
mais da metade do volume original de líquido. obtidos foram:
Placa 1 Placa 2
d) Cálculo dos resultados. Segundo a ISO
Colônias típicas na placa (Ct) 18 20
7218:2007/Amd 1:2013, calcular usando a Colônias atípicas na placa (Ca) 0 0
fórmula: Colônias típicas submetidas
5 5
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d] Colônias atípicas submetidas
0 0
onde: Colônias típicas confirmadas dentre as
a = (bt .Ct /At) + (ba .Ca /Aa) sendo C = número de colônias 4 5
submetidas à confirmação (bt)
típicas (Ct) ou atípicas (Ca) presentes em cada placa sele- Colônias atípicas confirmadas dentre as
0 0
cionada para contagem, submetidas à confirmação (ba)
A = número de colônias típicas (At) ou atípicas (Aa) subme- Número de colônias consideradas
(4x18/5)+0 (5x20/5)+0
tidas à confirmação (geralmente cinco) e confirmadas nas placas
= 14 = 20
b = número de colônias típicas (bt) ou atípicas (ba) confirma- [a = (bt .Ct /At) + (ba .Ca /Aa)]
das, dentre as que foram submetidas à confirmação. Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml
Primeira diluição retida para contagem (d) 10-1 = 0,1
v = volume inoculado em cada placa.
n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele- 14+20 = 34
cionada
34 / [0,1x(2+0,1x0)x0,1]
n2 = número de placas contadas da segunda diluição sele- UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
= 34/0,02 = 1,7x103
cionada

10.6. Método do NMP de caldo Caldo M-Staphylococcus em concen-

tração dupla. Incubar os tubos a 35±1 ºC/24h.
APHA/AWWA/WEF:2012
Nota a.1) A filtração de 100 ml da amostra é adequada
para Staphylococcus aureus para análise de água de consumo humano, na qual se
em água espera ausência. No caso da análise de águas não des-
tinadas ao consumo humano, nas quais a população
Método da American Public Health Associa- possa atingir contagens superiores, preparar diluições,
selecionar três adequadas para o nível de contamina-
tion (APHA), American Water Works Associa- ção esperado inocular cinco alíquotas de 1 ml de cada
tion (AWWA) & Water Environment Federation diluição em cinco tubos de Caldo M-Staphylococcus.
(WEF), descrito na seção 9213.B.6.c da 22ª edi-
ção do Standard Methods for the Examination of b) Confirmação. A partir de cada tubo com cres-
Water & Wastewater (Hunt., 2012). cimento, estriar uma alçada da cultura em
placas de Ágar Lipovitelenina Sal Manitol
10.6.1. Material requerido para a (LSM), por estrias de esgotamento. Incubar as
análise placas a 35±1 ºC/24h e guardar os tubos até a
obtenção dos resultados. Após 24h de incuba-
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ção das placas, observar a presença de colônias
ou Tampão Fosfato Cloreto de Magnésio (PB com um halo opaco, característico da ativida-
mgCl2) de de lipovitelenina-lipase. Em caso positivo
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptona- reincubar as placas por 24h adicionais e obser-
da 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato Cloreto var com 48h se ocorre fermentação do manitol,
de Magnésio (PB mgCl2) caracterizada por um halo amarelo em redor
□ Tubos com 10 ml de Caldo M-Staphylococcus das colônias. A presença de colônias típicas
□ Placas de Ágar Lipovitelenina Sal Manitol com halo opaco (em 24h) e halo amarelo (em
(LSM) 48h) confirmam a presença de S. aureus nos
□ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC tubos originais.
Se necessário ou em caso de dúvida confir-
10.6.2. Procedimento mar as culturas através da morfologia e colo-
O esquema geral de análise de S. aureus em água ração de Gram (descritos no capítulo 5) e dos
pelo método APHA/AWWA/WEF:2012 de núme- testes de coagulase, catalase e fermentação
ro mais provável (NMP) encontra-se descrito na anaeróbia da glicose e do manitol (descritos
Figura 10.5. no item 10.2)
a) Preparação das amostras, inoculação e incu- c) Cálculo dos resultados. Anotar o número de
bação. Para a preparação das amostras e dilui- tubos confirmados e determinar o Número
ções decimais seriadas, seguir os procedimen- Mais Provável (NMP)/g ou ml conforme a
tos descritos no Capítulo 2. Inocular 5 porções orientação do Capítulo 4, usando uma das ta-
de 20 ml da amostra, em cinco tubos com 20 ml belas de NMP.
10.7. Referências
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Figura 10.5. Esquema de análise de S. aureus em água pelo método de NMP APHA/AWWA/WEF:2012
(Hunt, 2012, section 9213.B.6.c).

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11 Bacillus cereus
Item 11.4 (novo) Inserido método de plaqueamento ISO 7932:2004 para contagem presuntiva de Bacillus cereus
em alimentos.
11.1. Introdução muito semelhantes geneticamente e, do ponto de

vista prático, dificilmente diferenciadas umas das
Bacillus cereus é uma bactéria patogênica, cujas outras. Cada uma é diferenciada de Bacillus ce-
doenças transmitidas por alimentos (DTAs) são reus basicamente, por uma única característica e,
classificadas pela International Commission on nem sempre, nos ensaios, é possível diferenciar
Microbiological Specifications for Foods (ICMSF, B. cereus dos outros membros do grupo, cujas ca-
2002) no grupo de risco III, que inclui as doenças racterísticas estão sumariadas na Quadro 11.1.
“de perigo moderado, usualmente de curta du- Todos os membros do grupo são bastonetes gran-
ração e sem ameaça de morte ou sequelas, com des (>1μm), Gram positivos, esporogênicos e for-
sintomas auto limitados mas que provocam severo mam esporos facilmente, na maioria dos meios de
desconforto”. cultura.
As colônias em meios sólidos são facilmente re-
11.1.1. Taxonomia conhecíveis: grandes (2 a 7mm em diâmetro), pla-
De acordo com Logan & DeVos (2009), Bacillus nas, variando na forma de circulares a irregulares,
cereus é uma espécie do gênero Bacillus, que com bordas lisas ou onduladas. A textura geral-
pertence à família Bacillaceae. Esta família in- mente é granular, embora colônias lisas e úmidas
clui vários gêneros de bactérias, na sua maioria não sejam incomuns.
bastonetes com parede celular Gram positiva, es- Anaeróbios facultativos, utilizam a glicose e outros
porogênicos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, carboidratos aeróbia e anaerobicamente. Catala-
quimioorganotróficos. O gênero Bacillus compre- se positivos, oxidase negativos, Voges Proskauer
ende mais de 140 espécies, incluindo B. cereus (VP) positivos.
e algumas espécies estreitamente relacionadas à Produzem lecitinase, provocando uma reação tí-
B. cereus, denominadas de grupo B. cereus. pica em meios contendo gema de ovo, como o
Ágar Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP), o
11.1.1.1. O grupo Bacillus cereus
Ágar Kim-Goepfert (KG) ou o Ágar Bacillus ce-
As espécies do grupo B. cereus são Bacillus cereus segundo Mossel. Essa reação é caracterizada
reus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis, pela formação de um precipitado branco sob as
Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Ba- colônias, após a incubação. Não utilizam manitol
cillus weihenstephanensis e Bacillus cytotoxicus e essa característica pode ser observada no Ágar
(Guinebretière et al., 2013). Essas espécies são MYP e Mossel (que contém manitol e indicador

de pH), onde formam um halo de viragem alcalina B. mycoides, B. cereus não forma colônias rizói-
em redor das colônias. des e as cepas são móveis em sua maioria.
Bacillus anthracis. De acordo com Logan & Bacillus pseudomycoides. É uma espécie nova,
DeVos (2009), B. anthracis é patogênico e tem proposta por Nakamura (1998) para acomodar um
sido considerado um agente potencial para guer- grupo de cepas de B. mycoides com composição
ra biológica ou bioterrorismo. Provoca uma dode ácidos graxos distinta. As características mor-
ença conhecida como antraz ou carbúnculo, que fológicas, fisiológicas e de crescimento são indis-
atinge primariamente os herbívoros, mas pode tinguíveis de B. mycoides, incluindo o crescimen-
ser transmitida para humanos através do conta- to rizóide em meios sólidos.
to com os animais infectados. A transmissão se Bacillus weihenstephanensis. É uma espécie
dá por exposição cutânea (contaminação de fe- nova, proposta por Lechner et al. (1998) para aco-
ridas na pele), inalatória (inalação dos esporos) modar as cepas psicrotróficas de B. cereus, sepa-
ou gastrointestinal (consumo da carne de animais radas das cepas mesófilas, que continuam na espé-
que morreram de antraz). As principais caracte- cie cereus. Apresenta todas as características típi-
rísticas que o distinguem de B. cereus, segundo cas de B. cereus, do qual se diferencia apenas pela
Tallent et al. (2012), são as seguintes: B. anthra- capacidade de crescer entre 4 e 7 ºC e não crescer
cis não é móvel e usualmente não é hemolítico a 43 ºC. De acordo com Euzéby (2003) não há ca-
em 24h de incubação. Algumas poucas cepas de sos de intoxicações atribuídos à B. weihenstepha-
B. cereus também são imóveis, mas são forte- nensis, mas é provável que a patogenicidade dessa
mente hemolíticas e produzem uma zona de he- espécie seja comparável à de Bacillus cereus.
mólise com 2 a 4mm em redor das colônias em
Bacillus cytotoxicus. É uma espécie nova, pro-
24h de incubação.
posta por Guinebretière et al. (2013). Essa espécie
Bacillus thuringiensis. De acordo com Logan & foi isolada pela primeira vez em um surto de in-
DeVos (2009), B. thuringiensis é patogênico para toxicação alimentar ocorrido na França em 1998,
insetos, sendo utilizado como agente de controle com três mortes. Na França esse foi o surto diar-
biológico (bioinseticida) na agricultura. Durante reico mais grave atribuído a uma provável cepa do
o processo de esporulação, as células produzem grupo B. cereus e depois dela quatro novas cepas
inclusões cristalinas (cristais parasporais), com- foram isoladas, três também relacionadas a sur-
postas por um ou mais polipeptídios (delta-endo- tos de infecção alimentar na França e Alemanha.
toxinas), que são codificadas por genes designa- Os alimentos envolvidos foram purê de vegetais,
dos pelo prefixo “cry”. As toxinas são ativas par- purê de batatas e semolina. A principal caracte-
ticularmente contra as larvas de insetos das ordens rística que distingue essa espécie é a natureza
Lepidoptera, Coleoptera e Diptera, não afetando o termotolerante, crescendo na faixa de 20 a 50 ºC,
homem, os animais ou as plantas. Ao contrário de enquanto os demais membros do grupo B. cereus
B. thuringiensis, as cepas de B. cereus não produ- crescem entre 5-15 e 35-45 ºC.
zem cristais parasporais.
11.1.1.2. A espécie Bacillus cereus
Bacillus mycoides. De acordo com Logan &
DeVos (2009) B. mycoides é imóvel e apresenta Segundo Logan & DeVos (2009), B. cereus é
morfologia de colônias característica em meios patogênico para humanos e outros animais, pro-
sólidos, chamadas de colônias rizóides. A partir vocando intoxicações alimentares e infecções
do ponto de inoculação as colônias fortemen- oportunistas. Além das características típicas dos
te aderentes projetam-se radialmente, podendo membros do grupo B. cereus, apresenta morfolo-
facilmente cobrir toda a placa. A aparência é de gia de bastonetes, Gram positivos. Forma esporos
raízes (de onde deriva o termo rizóide), mas esta que podem ser elipsoidais ou cilíndricos, subter-
característica pode ser perdida. Ao contrário de minais ou paracentrais, sem dilatar o esporângio.

Bacillus cereus □ 161
As colônias apresentam aparência variável; são ca- 40 e 45 ºC e mínima entre 10 e 20 ºC, embora ce-
racteristicamente grandes (2-7mm em diâmetro), pas piscrotolerantes capazes de crescer a 6 ºC já
circulares ou irregulares, com bordas lisas ou on- tenham sido isoladas. A Food and Drug Adminis-
duladas. A massa celular nas colônias geralmente tration (FDA, 2012) relatam temperatura ótima en-
é branca, mas algumas cepas produzem pigmentos tre 28 e 35 ºC, máxima de 48 ºC e mínima de 4 ºC.
castanho rosados em Ágar Nutriente (NA) e outras De acordo com a ICMSF (1996) o pH ótimo
pigmento amarelo difusível ou pigmento fluores- para crescimento de B. cereus situa-se entre 6,0
cente amarelo esverdeado em vários meios. Não e 7,0, com um mínimo de 5,0 e um máximo de
há relato da produção de pigmentos pelos outros 8,8. A atividade de água mínima é de 0,93. A FDA
membros do grupo. Anaeróbio facultativo, catala- (2012) relata pH mínimo de 4,9, máximo de 9,3 e
se positivo, oxidase negativo. Produz reação com tolerância a 7,5% de sal (uma solução de NaCl a
gema de ovo. 7% apresenta atividade de água de 0,96).
A motilidade é variavel; Logan & DeVos (2009) Os esporos apresentam resistência térmica com-
relatam mais de 85% das cepas móveis, enquanto parável aos de outras bactérias mesófilas, com um
Tallent et al. (2012) relatam 50% móveis e Bennett valor D121 ºC entre 0,03 e 2,35min e um valor z en-
et al. (2015) relatam 50 a 90% das cepas positivas. tre 7,9 e 9,9 ºC (em tampão de fosfato de 0,067M).
Logan & DeVos (2009) relatam temperatura ótima Em caldo de arroz a 100 ºC, podem resistir por 4,2
de crescimento por volta de 37 ºC, máxima entre a 6,3 min (ICMSF, 1996).
Quadro 11.1. Características das espécies do grupo Bacillus cereus.
Dados de Guinebretière et al. (2013)

Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus
Característica
cereus cytotoxicus pseudomycoides thuringiensis weihenstephanensis mycoides anthracis
Gram + + + + + + +
Catalase + + + + + + +
Lecitinase em meio
+ + fraca + fraca + + + +
com gema de ovo
Ácido a partir de
- - - - - - -
D-manitol
Teste de VP + + fraco + + + + +
Glicose anaeróbica + + fraca + + + + +
Cristais parasporais - - - + - - -
Colônias rizóides - - + - - + -
Redução do nitrato + (81%) + + + + + +
Temperatura mínima
10 20 10 10 5 5 >10
de crescimento (ºC)
Temperatura máxima
45 50 40 45 37 37 <50
de crescimento (ºC)
Dados de Bennett et al., 2015
Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus
Característica
cereus cytotoxicus pseudomycoides thuringiensis weihenstephanensis mycoides anthracis
Motilidade v v - -
Hemólise + v v -
Decomposição da
+ + v v
tirosina
Resistência à lisozima + + + +
Símbolos usados por Guinebretière et al. (2013): + = positivo para 90% das cepas (exceto quando a porcentagem de cepas é apresentada entre parênteses),
- = negativo para 90% das cepas.
Símbolos usados por Bennett et al. (2015): + = positivo para 90 a 100% das cepas, - = negativo para 90 a 100% das cepas, v = positivo para 50 a 90% das cepas.

11.1.2. Epidemiologia B. cereus provoca dois tipos de doenças de ori-

gem alimentar. Uma é a síndrome diarreica, resul-
Segundo Logan & DeVos (2009) B. cereus produz
tante do consumo do alimento contaminado com
seis tipos de toxinas, incluindo uma citotoxina,
as células de B. cereus seguida da produção de
uma toxina emética e quatro enterotoxinas.
enterotoxina no intestino delgado. Seus sintomas
A citotoxina, chamada de citotoxina K (CytK), é característicos são diarreia aquosa e dores abdo-
similar à β-toxina de Clostridium perfringens e minais, que aparecem entre seis e 15 horas após
foi associada a um surto de enterite necrótica na o consumo do alimento contaminado e desapare-
França, com três mortes (Logan & DeVos, 2009). cem em cerca de 24 horas. Náusea pode acom-
A toxina emética, chamada de cereulide, é um panhar a diarreia, mas vômito (emese) raramente
polipeptídio não antigênico, resistente ao calor ocorre (FDA, 2012). A dose infectiva é de 104 a
(121 ºC/30min segundo FDA, 2012, 120 ºC/ 109 células de B. cereus por grama de alimento
60min segundo Logan & DeVos, 2009), ao pH (Logan & DeVos, 2009).
(2 a 11) e à proteólise. Estável ao frio (60 dias a
A outra é a síndrome emética, provocada pelo con-
4 ºC), também é produzida na incubação em baixa
sumo do alimento contaminado com a toxina emé-
temperatura. Sua formação ocorre sob condição
tica pré-formada. É caracterizada por um agudo
aeróbica ou microaeróbica, mas não em condição
ataque de náusea e vômito, que aparece entre 0,5
anaeróbica. A produção não parece estar conec-
e seis horas depois do consumo do alimento conta-
tada à esporulação. Também já foi detectada em
minado e desaparece em cerca de 24 horas (FDA,
B. weihenstephanensis e outros bacilos, indican-
2012). A formação de toxina emética no alimento,
do que o plasmídio responsável por sua formação
em quantidade suficiente para provocar os sinto-
pode sofrer transferência lateral (Logan & DeVos,
mas, ocorre quando B. cereus se multiplica e atinge
2009, FDA, 2012).
uma população na ordem de 105 a 108 células por
Segundo Logan & DeVos (2009), as quatro ente- grama de alimento (Logan & DeVos, 2009).
rotoxinas produzidas por B. cereus são: Segundo Bennett et al. (2015), a presença de
a) Hemolisina BL (Hbl), produzida por cerca de B. cereus em alimentos não representa risco à
60% das cepas testadas. Tem sido sugerido que saúde, a menos que possa se multiplicar e atingir
esta enterotoxina seja o principal fator de viru- populações maiores do que 105 células viáveis por
lência na diarreia provocada por B. cereus. grama. Os alimentos mais frequentemente impli-
b) Enterotoxina não hemolítica (Nhe), produzida cados em surtos são produtos cozidos ou contendo
pela maioria das cepas e cujos componentes ingredientes cozidos, particularmente os ricos em
apresentam certa semelhança com a Hbl. amido ou proteínas, como arroz, massas, vegetais,
c) e d) Enterotoxina T (BceT) e Enterotoxina FM sopas, saladas de vegetais, brotos de sementes,
(EntFM), cujas características e mecanismos pudins e carnes. Os esporos sobrevivem ao cozi-
de ação ainda são desconhecidos. Bennett et al. mento e, se a refrigeração não for adequada, esses
(2015) não distinguem as enterotoxinas produ- esporos podem germinar e as células vegetativas
zidas por B. cereus, relatando a existência de podem se multiplicar (Bennett et al., 2015).
uma enterotoxina proteica que consiste em um Na transmissão da síndrome diarreica vários tipos
complexo de multicomponentes. Segundo os de alimentos têm sido implicados, incluindo car-
autores essa toxina é sensível ao calor, sendo nes, leite, peixes e vegetais. Na síndrome emética
inativada a 56 ºC/5min. Antigênica, pode ser a causa mais frequente é arroz cozido ou pratos
detectada por ensaios imunológicos tipo RPLA contendo arroz cozido, mas massas, sopas, caldos,
(reverse passive latex agglutination) ou ELISA pudins, bolos e pratos contendo batatas também
(enzime-linked immunosorbent assay) dispo- têm sido envolvidos, bem como produtos de quei-
níveis comercialmente. jo (FDA, 2012).

11.1.3. Comentários sobre os al., 2015) recomenda o teste confirmatório rápi-

métodos de análise do de Holbrook & Anderson (1980), uma técnica
que combina a coloração de esporos de Ashby e a
A contagem de B. cereus em alimentos pode ser
coloração de gordura intracelular de Burdon. No
feita pelo método de plaqueamento direto, mais
método de Holbrook & Anderson, o isolamento
comum, ou pelo método do número mais prová-
de B. cereus é feito em PEMBA (Polymyxin Pyru-
vel, recomendado quando se esperam contagens
vate Egg-Yolk Bromothymol Blue Agar). Segun-
abaixo de 1000 UFC/g.
do os autores, apenas B. cereus, dentre as espécies
No plaqueamento direto, o meio mais utilizado é de Bacillus capazes de crescer em PEMBA, apre-
o Ágar Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP), sentam glóbulos de lipídios intracelulares. Devi-
que combina a polimixina como agente seletivo do à similaridade na composição e características
e a gema de ovo e o manitol, como agentes dife- diferenciais, o PEMBA pode ser substituído pelo
renciais. A produção de colônias com uma forte KG, no método descrito pelo Compendium.
reação de gema de ovo (atividade de lecitinase),
Colônias com características típicas no MYP ou
caracterizada por um grande halo de precipita-
KG também podem ser confirmadas no Grupo
ção, é típica dos bacilos do Grupo B. cereus. A
B. cereus através de provas bioquímicas. As carac-
não fermentação do manitol provoca a formação
terísticas mais típicas do grupo são determinadas,
de um halo de viragem alcalina de pH em volta
incluindo o teste de utilização anaeróbia da glu-
da colônia.
cose, o teste de decomposição da tirosina, o teste
Outro meio recomendado é o Ágar Kim-Goepfert
de VP, o teste de nitrato e o teste de resistência à
(KG), que apresenta a mesma sensibilidade e sele-
lisozima. Quando há necessidade ou interesse em
tividade do MYP, mas é bem menos utilizado. As
uma identificação mais rigorosa, para fins regu-
colônias são idênticas às do MYP, mas não apre-
latórios, por exemplo, o Compendium recomenda
sentam a coloração, porque o meio não contém
aplicar o teste de Holbrook & Anderson e as pro-
manitol. Formulado para estimular a formação de
vas bioquímicas. Quando não há necessidade de
esporos livres em 20-24h de incubação, permite
uma identificação mais rigorosa e as colônias são
a imediata confirmação das colônias (diretamen-
típicas no KG ou no MYP, as provas bioquímicas
te das placas de contagem), através da coloração
podem substituir o teste de Holbrook & Anderson.
de esporos e de glóbulos de lipídios intracelulares
Para diferenciar B. cereus dos demais bacilos do
(teste confirmatório rápido de Holbrook & Ander-
Grupo, os testes aplicados são a verificação da
son). Para aplicar esse teste às colônias obtidas
produção de cristais de toxinas intracelulares, a
em MYP, é necessário repicar a cultura em Ágar
verificação da motilidade, a verificação de cres-
Nutriente. Dessa forma, o KG é uma alternativa
cimento rizóide e a verificação de atividade he-
mais rápida na contagem de B. cereus. Outra van-
molítica.
tagem do KG é que outras espécies de Bacillus
que produzem lecitinase, como B. polymyxa, são
incapazes de formar lecitinase nesse meio, nutri-
cionalmente pobre.
A confirmação das colônias típicas inclui dois APHA 31.61:2015 para
grupos de testes, o primeiro para verificar se a contagem de Bacillus cereus
cultura isolada pertence ao Grupo B. cereus e o em alimentos
segundo para diferenciar B. cereus dos demais ba-
cilos do Grupo. Método da American Public Health Association
Para confirmar a cultura no grupo B. cereus, a 5a (APHA), descrito no Capítulo 31 da 5a edição do
edição do Compendium of Methods for the Mi- Compendium of Methods for the Microbiological
crobiological Examination of Foods (Bennett et Examination of Foods (Bennett et al., 2015).

Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as alcoólica 5% de alfa-naftol, solução aquosa de

orientações do Capítulo 3, que apresenta todos KOH 40%, creatina em cristais)
os detalhes e cuidados envolvidos na contagem □ Reagentes para Teste de Nitrato (solução 0,8%
de microrganismos em placas, da seleção das de ácido sulfanílico, solução 0,5% de alfa-naf-
diluições ao cálculo dos resultados. O procedi- tol em ácido acético, pó de zinco livre de nitra-
mento descrito abaixo não apresenta esses de- to ou nitrito)
talhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo □ Estufa incubadora regulada a 35 ºC
analista. Diferenciação dos membros do grupo B. cereus
□ Tubos de NA inclinados
11.2.1. Material requerido para a □ Ágar Motilidade para B. cereus
análise □ Placas de Ágar Nutriente (NA)
Preparação da amostra e diluições seriadas □ Ágar Tripticase de Soja suplementado com
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou sangue de carneiro (TSA-SANGUE)
Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) □ Solução de Azul Brilhante de Coomassie
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada □ Estufa incubadora regulada a 30 ºC
□ Pipetas de 1 ou 2 ml 11.2.2. Procedimento
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- O esquema geral de análise de B. cereus pelo mé-
tulo 2 para verificar casos especiais em que o todo de plaqueamento APHA 31.61:2015 encon-
tipo ou volume de diluente variam em função tra-se descrito na Figura 11.1.
da amostra analisada. a) Preparação da amostra, inoculação e incu-
Contagem presuntiva bação. Para a preparação da amostra e dilui-
□ Placas de Ágar Manitol Gema de Ovo Polimi- ções seriadas, seguir os procedimentos descri-
xina (MYP) ou Ágar Kim-Goepfert (KG) tos no Capítulo 2.
□ Alças de espalhamento (Drigalski) Selecionar três diluições adequadas da amostra
□ Estufa incubadora regulada a 30-32 ºC e inocular 0,1 ml de cada diluição em placas
Confirmação do grupo B. cereus pelo teste de de Ágar Manitol Gema de Ovo Polimixina
Holbrook & Anderson (MYP) ou Ágar Kim-Goepfert (KG), previa-
□ Solução de Verde Malaquita 5% mente preparadas e secadas (plaqueamento em
□ Solução de Sudan Black (0,3% peso/volume superfície). Espalhar o inóculo com alças de
em etanol 70%) Drigalski, até que todo o líquido seja absorvi-
□ Solução de Safranina 0,5% aquosa do pelo meio de cultura. Havendo suspeita de
□ Xileno (PA) contagens inferiores a 100 UFC/g, inocular 1
Confirmação do grupo B. cereus por provas ml da primeira diluição da amostra, distribuin-
bioquímicas (opcional) do o volume por quatro placas de MYP ou KG,
□ Placas de MYP (se o isolamento foi feito em KG) três com 0,3 ml e uma com 0,1 ml.
□ Tubos de Ágar Nutriente (NA) inclinados Havendo interesse em contar exclusivamente
□ Tubos de Caldo Vermelho de Fenol 1% Glucose os esporos, submeter a amostra a choque tér-
□ Tubos de Ágar Tirosina mico por 15 minutos a 70 ºC.
□ Tubos de Caldo VP modificado para Bacillus Aguardar que as placas sequem completamen-
□ Tubos de Caldo Nitrato te e incubar invertidas, a 30-32 ºC/20-24h.
□ Tubos de Caldo Nutriente Lisozima b) Contagem das colônias presuntivas. Sele-
□ Vaselina líquida ou óleo mineral estéril (ou sis- cionar para a contagem placas com 10 a 100
tema de geração de anaerobiose) colônias, contendo não mais do que 30 colô-
□ Reagentes de Barrit para teste de VP (solução nias típicas de B. cereus, pois estas colônias

Figura 11.1. Esquema de análise para contagem de B. cereus pelo método de plaqueamento APHA 31.61:2015
(Bennett et al., 2015).

são grandes e os halos característicos podem c.1) Teste confirmatório rápido de Holbrook &
confundir-se em placas muito cheias. Anderson (coloração de esporos e glóbulos
No KG as colônias típicas de B. cereus são es- de lípidios intracelulares). As colônias ob-
féricas, com bordas perfeitas, planas e secas, tidas no KG podem ser submetidas ao teste
translúcidas ou levemente creme, rodeadas por confirmatório rápido diretamente da placa
um grande halo de precipitação, devido à reação de contagem. As colônias obtidas no MYP
com a gema de ovo. Menos frequentemente, mas devem ser repicadas em tubos com Ágar
ainda consideradas típicas, as bordas são irregu- Nutriente (NA) inclinado e incubadas a
lares e, nesses casos, normalmente são brancas 30 ºC/24h, antes da realização do teste. Pro-
no centro e translúcidas em redor do centro. cedimento:
No MYP são idênticas às do KG, mas apre- ▪ Preparar um esfregaço da cultura, tomando
sentam ainda uma coloração rósea leitosa ao o inóculo no centro da colônia, se a cultura
redor das colônias, típica da não-fermentação estiver com 24h, ou na borda da colônia, se
do manitol. a cultura estiver com 48h. Deixar secar na-
Cuidado: O MYP e o KG podem permitir o cres- turalmente e fixar na chama com o mínimo
cimento de B. anthracis, patogênico, com colô- de calor.
nias indistinguíveis das colônias de B. cereus. ▪ Cobrir o esfregaço com Solução Aquosa 5%
Para prevenir riscos de contaminação do ana- de Verde Malaquita e corar a quente durante
lista e do laboratório, recomenda-se: 1) que o dois minutos. Para aquecer a solução de ver-
manuseio das placas seja feito sobre bandejas de de malaquita, há três opções: 1) colocar a
e não diretamente sobre as bancadas, 2) que ao lâmina sobre um suporte vazado e o supor-
trabalhar em capela de fluxo laminar se utili- te sobre um banho ou frasco com água sob
ze um modelo vertical, adequado ao manuseio fervura, para aquecer com o vapor de água.
de patógenos, 3) que se mantenha ao alcance 2) colocar sob a lâmina um “swab” com
das mãos um frasco de desinfetante como so- álcool em chamas, até observar a saída de
lução de cloro a 100ppm ou solução de álcool vapor (sem ferver). 3) passar a lâmina cui-
iodado, para descontaminar qualquer descarga dadosamente na chama de um bico de Bun-
inadvertida de material contaminado, 4) que o sen, até a emissão de vapor (sem ferver),
descarte seja precedido da descontaminação pelo menos duas vezes, com intervalo de
em autoclave a 121 ºC/30min, 5) que toda a um minuto.
área de trabalho seja prontamente descontami- ▪ Após o tempo de contato de dois minutos,
nada, uma vez concluídas as análises. lavar a lâmina em água corrente, secar com
c) Confirmação das colônias no Grupo B. ce- lenço de papel (apenas encostar a lâmina no
reus. Selecionar pelo menos cinco colônias tí- lenço de papel, sem esfregar) e cobrir com
picas bem isoladas para a confirmação. Se hou- Solução de Sudan Black (0,3% peso/volu-
ver menos de cinco colônias, selecionar todas. me em etanol 70%) por 20min.
Aplicar o teste confirmatório rápido de Hol- ▪ Descartar o excesso de corante, secar com
brook & Anderson (descrito no item c.1). Ha- lenço de papel e lavar a lâmina com xileno
vendo necessidade ou interesse em uma verifi- (PA), por cinco a dez segundos. Cuidado. O
cação mais rigorosa das características típicas xileno é inflamável e os vapores são irritan-
do grupo, aplicar também as provas bioquími- tes e depressores do sistema nervoso central,
cas (descritas nos itens c.2 a c.6). Se as colô- podendo provocar dor de cabeça, tontura,
nias obtidas no KG ou MYP forem bem típi- náusea, perda de consciência e outros sin-
cas, o teste confirmatório rápido de Holbrook tomas. Manusear com luvas, em capela de
& Anderson pode ser substituído pelas provas exaustão. Não descartar o excedente na pia,
bioquímicas. manter na capela de exaustão até evaporar.

Nota) O Manual da Oxoid (2000), na descrição do meio compõem a tirosina rapidamente, formando
Bacillus cereus Selective Agar Base (CM 617), re- uma zona de 3-4mm de profundidade. É
comenda substituir o xileno por Citroclear (H.D. Su-
pplies, 44 Rabans Close, Rabans Lane Industrial Esta-
também comum o escurecimento do meio
te, Aylesbury, Buckinghamshire, England, HP19 3RS). ao longo da região de crescimento, com de-
senvolvimento de uma coloração castanha.
▪ Secar imediatamente com com lenço de pa-
c.4) Teste de Voges-Proskauer (opcional). Ino-
pel e cobrir com Solução de Safranina 0,5%
cular uma alçada com inóculo leve da cultura
por 20 segundos.
em um tubo de Caldo VP Modificado para
▪ Lavar em água corrente, secar com lenço de
Bacillus e incubar a 35 ºC/48h. Adicionar,
papel e observar ao microscópio óptico com
para cada 1 ml de cultura, 0,6 ml de solução
objetiva de imersão. Os membros do gru-
de α-naftol 5%, 0,2 ml de solução de KOH
po B. cereus vão apresentar a) glóbulos de
40% e uma pitada de cristais de creatina, na
lipídios corados de azul escuro, dentro do
ordem indicada. Agitar vigorosamente, dei-
citoplasma das células, b) esporos centrais a
xar descansar e observar periodicamente, por
subterminais, sem dilatação do esporângio,
até uma hora, o desenvolvimento de uma cor
corados de verde pálido, c) células vegetati-
vermelha no meio de cultura (teste positivo).
vas, coradas de vermelho.
A permanência do meio na cor amarelada dos
c.2) Teste de utilização anaeróbia da glucose reagentes indica teste negativo. As cepas de
(opcional). Inocular uma alçada da cultura B. cereus são VP positivas.
em um tubo de Caldo Vermelho de Fenol 1% c.5) Teste de redução do nitrato (opcional).
glicose, previamente desaerado (fervura por Inocular uma alçada com inóculo pesado da
15 minutos em banho, com as tampas afrou- cultura em um tubo com 3-4 ml de Caldo
xadas, seguida do imediato resfriamento em Nitrato e incubar a 35 ºC/24h. Após a in-
banho de gelo). Cobrir a superfície do caldo cubação, adicionar aos tubos 0,25 ml de
com óleo mineral ou vaselina líquida estéril cada um dos reagentes para teste de nitrato
e incubar a 35 ºC/24h. Alternativamente, em (A = Solução 0,8% de ácido sulfanílico;
lugar de cobrir o meio com óleo ou vaseli- B = Solução 0,5% de a-naftol). Observar
na, pode-se incubar os tubos em atmosfera o desenvolvimento de uma cor rósea aver-
anaeróbia, obtida por um dos métodos rela- melhada em no máximo dez minutos (teste
cionados no Capítulo específico de Clostri- positivo). Em caso negativo, adicionar uma
dium perfringens. Observar se há ocorrência pitada de pó de zinco, deixar em repouso
de viragem ácida do indicador, alterando a por dez minutos e observar se o meio per-
cor do meio de vermelho para amarelo (teste manece com a cor inalterada (teste positivo)
positivo) ou se o meio permanece com a cor ou adquire uma coloração rósea avermelha-
inalterada (teste negativo). As cepas de B. ce- da (teste negativo). A maioria das cepas de
reus utilizam a glucose anaerobicamente. B. cereus reduz o nitrato, sendo poucas as
c.3) Teste de decomposição da tirosina (opcio- cepas negativas para essa característica.
nal). Estriar uma alçada da cultura na ram- c.6) Teste de resistência à lisozima (opcional).
pa de um tubo de Ágar Tirosina inclinado Inocular uma alçada da cultura em um tubo
e incubar a 35 ºC/48-72h. Observar se há de Caldo Nutriente Lisozima, inoculando
desenvolvimento de uma zona clara e trans- também um tubo de Caldo Nutriente sem li-
parente de decomposição e dissolução dos sozima (controle). Incubar a 35 ºC/48h e ob-
cristais de tirosina, na região abaixo da ram- servar se ocorre crescimento nos dois tubos
pa (teste positivo), ou não formação dessa (teste positivo) ou apenas no tubo controle
zona, mantendo o meio opaco inalterado (teste negativo). As cepas de B. cereus são
(teste negativo). As cepas de B. cereus de- resistentes à lisozima.

d) Diferenciação das espécies do Grupo B. ce- por picada, no centro do meio e até a profun-
reus. Esses testes aplicam-se às culturas confir- didade de 1cm do fundo do tubo. Incubar a
madas como pertencentes ao Grupo B. cereus, 30 ºC/18-24h e observar se ocorreu migração
para diferenciação das espécies dentro do Grupo. das células para as regiões fora da linha de
d.1) Coloração de cristais de toxinas intrace- inoculação (motilidade positiva) ou se o cres-
lulares (Método de Sharif & Alaeddinoglu, cimento restringiu-se à linha da picada (mo-
1988). Inocular uma alçada da cultura na tilidade negativa). Opcionalmente, a caracte-
rampa de um tubo de Ágar Nutriente (NA) rística de motilidade pode ser observada ao
inclinado e incubar a 30 ºC/24h. Manter o microscópio. Adicionar 0,2 ml de água desti-
tubo à temperatura ambiente por três dias, lada estéril à rampa de um tubo de NA incli-
para envelhecer a cultura, permitir a forma- nado e estriar uma alçada da cultura na rampa
ção de esporos e a lise dos esporângios. Pre- umidificada. Incubar a 30 ºC/6-8h e transferir
parar um esfregaço da cultura, fixando leve- uma alçada da cultura, coletada do líquido na
mente pelo calor. Cobrir o esfregaço por três base da rampa, para uma gota de água desti-
minutos com uma Solução de Azul Brilhan- lada estéril depositada numa lâmina de vidro.
te de Coomassie (0,25g de azul brilhante de Emulsionar o material, cobrir com uma lamí-
coomassie + 50 ml de etanol absoluto + 7 nula e observar ao microscópio. As cepas de
ml de ácido acético glacial + 43 ml de água B. cereus e B. thuringiensis geralmente são
destilada). Lavar a lâmina em água corrente, ativamente móveis, enquanto as cepas de
aguardar secar e observar em microscópio B. anthracis e B. mycoides são imóveis.
óptico, sob imersão. As cepas de B. thurin- d.3) Verificação de crescimento rizóide. Depo-
giensis vão apresentar esporos livres não sitar uma alçada da cultura no centro de uma
corados, células vegetativas (bastonetes) placa de Ágar Nutriente (NA), sem espa-
coradas de azul e cristais livres corados de lhar. Incubar a 30 ºC/24-48h e observar se a
azul intenso, tetragonais e bem menores do colônia desenvolvida apresenta crescimento
que as células vegetativas. No interior das rizóide (a massa de células se estende para
células vegetativas (coradas de azul) os es- fora do ponto de inoculação, como raízes),
poros e os cristais aparecem brancos. As ce- característico das cepas de B. mycoides.
pas de B. cereus não produzem cristais.
d.4) Verificação de atividade hemolítica. Ino-
Nota d.1) O procedimento descrito no Compendium cular até seis culturas em uma placa de Ágar
é diferente, bem mais trabalhoso e utiliza metanol,
tóxico, que deve ser manuseado com cuidado, evi-
Tripticase de Soja suplementado com sangue
tando-se inalação ou contato com a pele (trabalhar de carneiro (TSA-SANGUE), transferindo
com luvas e máscara protetora): Cultivar a cultura da o inóculo para um único ponto do meio, por
mesma forma descrita acima e preparar o esfregaço. simples contato. Incubar a 30-32 ºC/24h
Cobrir o esfregaço com metanol por 30 segundos,
e observar se há formação de um halo claro
descartar o excesso de álcool e flambar, para fixação
definitiva. Cobrir em seguida o esfregaço com uma de hemólise em redor das colônias (teste po-
solução aquosa 0,5% de fucsina básica, aquecer deli- sitivo). As cepas de B. cereus são fortemente
cadamente à chama, até a emissão de vapores, aguar- hemolíticas, produzindo halos grandes e bem
dar dois minutos e aquecer novamente até nova emis- nítidos, enquanto B. mycoides e B. thurin-
são de vapores. Aguardar 30 segundos, lavar a lâmi-
na em água corrente, secar e observar ao microscópio
giensis são fracamente hemolíticos, produ-
óptico, sob imersão. As cepas de B. thuringiensis vão zindo halos menores ou, eventualmente, zona
apresentar esporos livres e uma grande quantidade de de hemólise restrita à região sob a colônia. As
cristais tetragonais corados de vermelho. cepas de B. anthracis geralmente não são he-
d.2) Teste de motilidade. Inocular a cultura em molíticas.
um tubo de Ágar Motilidade para B. cereus,

e) Cálculo dos resultados. Calcular o número de plementado com polimixina

UFC/g ou ml em função do número de colô- □ Estufa incubadora regulada a 30 ºC
nias típicas, diluição inoculada e percentagem Confirmação
de colônias confirmadas. □ Os mesmos itens requeridos na contagem em
Exemplo: Diluição 10-1, plaqueamento em super- placas (item 11.2.1).
fície, seis colônias típicas, seis submetidas à
confirmação, três confirmadas (50%). 11.3.2. Procedimento
1 2
UFC/g ou ml = 6x10 x10x0,5 = 3,0x10
O esquema geral de análise de B. cereus pelo mé-
todo do NMP APHA 31.62:2015 encontra-se des-
11.3. Método do NMP crito na Figura 11.2.
APHA 31.62:2015 para Para a preparação da amostra e diluições seriadas,
seguir as orientações do Capítulo 2.
contagem de Bacillus cereus
Inocular três alíquotas de 1 ml das três primeiras
em alimentos diluições da amostra em uma série de três tubos
Método da American Public Health Association de Caldo Tripticase de Soja (TSB) suplementado
(APHA), descrito no Capítulo 31 da 5ª edição do com polimixina B, na mesma concentração utili-
Compendium of Methods for the Microbiological zada no Ágar Ágar Manitol Gema de Ovo Polimi-
Examination of Foods (Bennett et al., 2015). xina (MYP). Incubar os tubos a 30 ºC/48h.
O método do NMP é uma alternativa que pode ser Observar crescimento denso, típico de B. cereus e
utilizada quando as contagens esperadas encon- estriar uma alçada de cada tubo com crescimento
tram-se abaixo do limite de detecção do plaquea- em placas de MYP ou Ágar Kim-Goepfert (KG),
mento, que é de 100 UFC/g. Antes de iniciar as incubando as placas a 30-32 ºC/20-24h. Verificar
atividades, ler atentamente as orientações do Ca- a formação de colônias típicas de B. cereus, des-
pítulo 4, que apresenta todos os detalhes e cuida- critas no item 11.2 e selecionar uma ou mais colô-
dos envolvidos na contagem de microrganismos nias de cada placa para confirmação, que deve ser
pelo NMP, da seleção das diluições ao cálculo dos feita seguindo os mesmos procedimentos descri-
resultados. O procedimento descrito abaixo não tos no item 11.2.
apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam Anotar o número de tubos cujas culturas foram
conhecidos pelo analista. confirmadas e determinar o Número Mais Prová-
vel (NMP)/g conforme a orientação do Capítulo
11.3.1. Material requerido para a 4, usando uma das tabelas de NMP.
análise
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou ISO 7932:2004 para contagem
Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) presuntiva de Bacillus cereus
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada em alimentos
□ Pipetas de 1 ou 2 ml Método da International Organization for Stan-
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- dardization, aplica-se a todos os alimentos desti-
tulo 2 para verificar casos especiais em que o nados ao consumo humano, às rações animais e à
tipo ou volume de diluente variam em função amostras do ambiente de fabricação ou manipula-
da amostra analisada. ção de alimentos.
Contagem presuntiva Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
□ Tubos de Caldo Tripticase de Soja (TSB) su- orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os

Figura 11.2. Esquema de análise para contagem de B. cereus pelo método do NMP APHA 31.62:2015 (Bennett et al., 2015).

detalhes e cuidados envolvidos na contagem de ção da amostra, distribuindo cada alíquota de 1

microrganismos em placas, da seleção das dilui- ml em três placas de MYP. Havendo interesse
ções ao cálculo dos resultados. O procedimento em contar exclusivamente os esporos, subme-
descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- ter a amostra a choque térmico por 10 minutos
supondo que sejam conhecidos pelo analista. a 80 ºC.
Aguardar que as placas sequem completamen-
11.4.1. Material requerido para a te e incubar invertidas, a 30±1 ºC/18-24h. Se
análise as colônias não estiverem claramente visíveis
□ Diluente: Água Peptonada Tamponada (BPW) ao final de 24h de incubação, incubar por 24h
ou Água Salina Peptonada (H2Osp) adicionais.
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptona- b) Contagem e confirmação das colônias pre-
da Tamponada (BPW) ou Água Salina Pepto- suntivas. Selecionar para a contagem placas
nada (H2Osp) com 15 a 150 colônias. As colônias típicas de
□ Placas de Ágar Manitol Gema de Ovo Polimi- B. cereus são grandes, com halo de viragem
xina (MYP) alcalina pink (não fermentação do manitol) e,
□ Placas de Ágar Sangue Nº 2 geralmente, rodeadas por uma zona de precipi-
□ Estufa incubadora regulada a 30±1 ºC tação, devido à produção de lecitinase.
Nota b.1) Segundo a ISO 7932:2004, algumas cepas de
11.4.2. Procedimento B. cereus produzem pouca ou nenhuma lecitinase, for-
mando colônias sem zona de precipitação. Essas co-
O esquema geral de análise de B. cereus pelo mé- lônias também devem ser submetidas à confirmação.
todo de plaqueamento ISO 7932:2004 encontra-se
Selecionar cinco colônias típicas para a confir-
descrito na Figura 11.3.
mação e, se houver menos de cinco, selecionar
a) Preparação da amostra, inoculação e incu-
todas. Inocular em placas de Ágar Sangue Nº 2
bação. Para a preparação da amostra e dilui-
(estria ou picada) e incubar a 30±1 ºC/24±2h.
ções seriadas, seguir os procedimentos descri-
Observar a formação de halo transparente de
tos no Capítulo 2.
hemólise em redor da área inoculada.
Selecionar pelo menos duas diluições ade-
c) Cálculo dos resultados. Segundo a ISO
quadas da amostra e inocular 0,1 ml de cada
7218:2007/Amd 1:2013, calcular usando a
diluição em placas de Ágar Manitol Gema de
fórmula:
Ovo Polimixina (MYP), previamente prepara-
das e secadas (plaqueamento em superfície). UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ) . d ]
Espalhar o inóculo com alças de Drigalski, até
onde:
que todo o líquido seja absorvido pelo meio de a = (b.C /A) sendo C = número de colônias típicas presentes
cultura. em cada placa selecionada para contagem,
Nota a.1) O método ISO 7932:2004 especifica plaquea- A = número de colônias típicas submetidas à confirmação
mento em duplicata, mas a ISO 7218:2007/Amd (geralmente cinco) e
1:2013 dispensou a duplicata quando for feita a ino- b = número de colônias típicas confirmadas, dentre as que
culação de pelo menos duas diluições. foram submetidas à confirmação.
Se não houver necessidade de diluições, ino- n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele-
cular duas alíquotas de 0,1 ml em duas placas cionada
de MYP (duplicata). n2 = número de placas contadas da segunda diluição sele-
cionada
Havendo suspeita de contagens inferiores a d = primeira diluição retida para contagem
100 UFC/g, inocular 2x1 ml da primeira dilui- (100=1, 10-1 = 0,1, 10-2 = 0,01 e assim por diante).

Figura 11.3. Esquema de análise para contagem de B. cereus pelo método de plaqueamento ISO 7932:2004.

Exemplo 1) Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1e Exemplo 2) Inoculados 0,1 ml da diluição 10-
10-2, uma placa por diluição (n1 =1 e n2 = 1). Os 1
, em duplicata (n1 =2 e n2 = 0). Os resultados
resultados obtidos foram: obtidos foram:
Diluição 10-1 Diluição 10-2 Placa 1 Placa 2
Colônias típicas na placa (C) 150 17 Colônias típicas na placa (C) 18 20
Colônias típicas submetidas à Colônias típicas submetidas à
5 5 5 5
confirmação (A) confirmação (A)
Colônias típicas confirmadas dentre Colônias típicas confirmadas dentre
4 3 4 5
as submetidas à confirmação (b) as submetidas à confirmação (b)
Número de colônias consideradas (4x150/5) Número de colônias consideradas
(3x17/5) = 10 (4x18/5) = 14 (5x20/5) = 20
confirmadas nas placas [a = (b.C/A)] = 120 confirmadas nas placas [a = (b.C/A)]
Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml
Primeira diluição retida para -1 Primeira diluição retida para -1
10 = 0,1 10 = 0,1
contagem (d) contagem (d)
Somatória das colônias consideradas Somatória das colônias consideradas
120+10 = 130 14+20 = 34
confirmadas nas placas (∑a) confirmadas nas placas (∑a)
130 / [0,1 x (1+0,1 x 1) x 0,1] 34 / [0,1x(2+0,1x0)x0,1] =
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d] UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
= 130/0,011 = 1,2x104 34/0,02 = 1,7x103
11.5. Referências
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12 Clostrídios sulfito redutores
Clostridium perfringens
Método 12.4 (2010) (eliminado) O método de contagem de clostrídios sulfito redutores a 46 °C em alimentos da
ANVISA:2001 foi descontinuado.
Método 12.6 (2010) (eliminado) O método de contagem de esporos de Clostridium perfringens em água da
CETESB:1993 foi eliminado porque métodos mais modernos entraram em vigor.
Item 12.1.3 (revisado) Comentários sobre os métodos de análise atualizados.
Item 12.2.d, e, f (revisados) Inserida a contagem de clostrídios sulfito redutores.
Item 12.5 (novo) Inserido método de filtração em membrana ISO 14189:2013 para contagem de Clostridium
perfringens em água.
Item 12.6 (novo) Inserido método de plaqueamento ISO 7937:2004 para contagem de Clostridium perfringens
em alimentos.
Item 12.7 (novo) Inserido método de filtração em membrana ISO 6461-2:1986 para contagem de esporos de clos-
trídios sulfito redutores em água.
12.1. Introdução diaceae, composta predominantemente por bac-

térias anaeróbias estritas, esporogênicas, na for-
Clostridium perfringens é uma bactéria patogê- ma de bastonetes e parede celular Gram positiva
nica cujas doenças transmitidas por alimentos (Wiegel, 2009). Clostridium é o gênero típico da
(DTAs) são classificadas pela International Com- família, contendo mais de 200 espécies descritas,
mission on Microbiological Specifications for dentre elas Clostridium perfringens.
Foods (ICMSF, 2002) em dois grupos de risco.
A DTA provocada pelas cepas do tipo A, muito Clostridium perfringens
comum, é classificada no grupo de risco III, que Rainey et al. (2009) descrevem C. perfringens
inclui as doenças “de perigo moderado, usual- como bastonetes Gram positivos, imóveis e espo-
mente de curta duração e sem ameaça de morte rogênicos, embora a esporulação seja difícil “in vi-
ou sequelas, com sintomas auto limitados mas que tro”. Quando vistos os esporos são grandes, ovais,
provocam severo desconforto”. A DTA provocada centrais ou subterminais, provocando dilatação do
pelas cepas do tipo C (enterite necrótica), muito esporângio. A faixa de temperatura de crescimen-
mais rara, é classificada no grupo de risco IB, que to da maioria das cepas varia de 20 a 50 °C e a
inclui as doenças “de severo perigo para popula- ótima varia na faixa de 37 a 45 °C. Uma ou outra
ção restrita, representando ameaça de morte, se- cepa pode, eventualmente, crescer a 6 °C, mas essa
quelas crônicas ou longa duração”. característica geralmente desaparece após poucos
repiques em meio de cultura, porque não há cepas
12.1.1. Taxonomia verdadeiramente psicrotróficas nesta espécie. Cres-
O gênero Clostridium pertence à família Clostri- cem em pH variando de 5,5 a 8,0 e na presença de

20% de bile. Produzem H2S e a maioria apresenta perfringens cresce bem a 46 °C, essa temperatura é
atividade de lecitinase em meios contendo gema de utilizada para dar uma indicação mais precisa de C.
ovo. A atividade de catalase é negativa. perfringens, reduzindo o número de espécies que
De acordo com a ICMSF (1996), a esporulação podem crescer. Ainda assim, um número significa-
de C. perfringens em meios de cultura é rara, mas tivo de espécies sulfito redutoras crescem a 46 °C,
os esporos são facilmente produzidos no intestino. incluindo C. botulinum e C. sporogenes.
As características mais usadas para a identificação Sartory et al. (2006) avaliaram 31 espécies de
de C. perfringens na análise de alimentos são a re- Clostridium no Ágar Triptose Sulfito Cicloserina
dução do sulfito (positiva), a motilidade (negativa), (TSC), meio usado para a contagem de C. perfrin-
a fermentação da lactose (positiva), a hidrólise da gens (a 35-37 °C) e clostrídios sulfito redutores (a
gelatina (positiva) e a redução do nitrato (Labbe, 44 °C). Os resultados, sumariados na Tabela 12.1,
2015, Rhodehamel & Harmon, 2001). Rainey et al. mostraram que, além de C. perfringens, 16 das 31
(2009), entretanto, relatam que 11 a 39% das cepas espécies cresceram e reduziram o sulfito a 44 °C.
de C. perfringens não reduzem o nitrato. Apenas duas espécies tiveram a capacidade de re-
dução do sulfito inibida pela elevação da temperatu-
Uma das características mais marcantes de C. per-
ra (C. ghonii e C. sphenoides), crescendo nas duas
fringens é a de crescer ativamente em altas tempe-
temperaturas mas produzindo H2S apenas a 37 °C.
raturas, com tempo de geração de apenas 10min a
45 °C (Bates, 1997). A 45-46 °C também fermenta
o leite rapidamente, produzindo um tipo de coagu- Tabela 12.1. Espécies de clostrídios sulfito redu-
lação típica, chamada de coagulação tempestuosa. tores detectadas no Ágar Triptose Sulfito Ci-
Nesta reação a produção de ácido coagula o leite e closerina (TSC) incubado a 37 e a 44 °C (Sar-
a vigorosa produção de gás provoca o rompimento tory et al., 2006).
e deslocamento do coágulo. A reação pode ser ob- Redução do Redução do
servada em apenas cinco horas de incubação, par- Espécie de sulfito em TSC Espécie de sulfito em TSC
Clostridium a 37 a 44 Clostridium a 37 a 44
tindo-se de um inóculo pesado de culturas jovens e °C °C °C °C
ativas (Rhodehamel & Harmon, 2001). C. perfringens + + C. limosum + +
Em baixas temperaturas, ao contrário, as células C. absonum + + C. paraputrificum + +
vegetativas de C. perfringens são bastante sen- C. baratii + + C. sardiniense + +
síveis, podendo morrer rapidamente. A ICMSF C. bifermentans + + C. septicum + +
(1996) relata sobrevivência de apenas 6% das cé- C. botulinum + + C. sordellii +/-a +/-a
lulas em carne estocada a 23 °C negativos por 14 C. butyricum +/-a +/-a C. sphenoides + -
dias. Poucos dias sob refrigeração (entre zero e C. chauvoei +/-a +/-a C. sporogenes + +
10 °C) pode levar à uma redução de três a cinco C. cochlearium + + C. tertium + +
ciclos logarítmicos na contagem em placa. Tam- C. ghonii + - C. tetanomorphum +/-a +/-a
bém são relativamente sensíveis ao sal; crescem C. histolyticum +/-a +/-a
na presença de 2% de NaCl mas são inibidas em a = Resultado variável entre as cepas testadas.
6,5%. A atividade de água mínima é de 0,93.
Clostrídios sulfito redutores a 46 °C

12.1.2. Epidemiologia
Clostrídios sulfito redutores, como diz o nome, C. perfringens é capaz de produzir uma série de
são os clostrídios que reduzem o sulfito a sulfe- toxinas e, com base na capacidade de produzir
to de hidrogênio (H2S) a 46 °C. Sua aplicação na as quatro toxinas mais letais (alfa, beta, epsilon
análise de alimentos é oferecer uma indicação e iota), as cepas da espécie são classificadas em
simples e rápida da potencial presença de C. per- cinco tipos: A, B, C, D e E (Rainey et al., 2009),
fringens, que também é sulfito redutor. Como C. conforme mostrado na Tabela 12.2.

Clostrídios sulfito redutores Clostridium perfringens □ 177
A toxina alfa é comum a todos os tipos, embora o consumo do alimento contaminado com mais de
seja produzida em maior quantidade pelo tipo A. 106 células ou esporos/g. Dura entre 12 e 24 horas,
É uma fosfolipase que hidrolisa a lecitina (leciti- porém, em idosos e crianças pode durar até duas
nase), não associada com doenças transmitidas por semanas. Em surtos, o diagnóstico é confirmado
alimentos. Provoca gangrena gasosa (mionecrose), pela detecção da CPE em fezes de pacientes. A
uma infecção de feridas que atinge animais e hu- confirmação da presença de C. perfringens nos
manos (Rainey et al., 2009). A produção da toxina alimentos suspeitos ou nas fezes dos pacientes
alfa pode ser observada em meios contendo gema (contagem >106/g) também confirma o diagnós-
de ovo, nos quais as colônias apresentam um halo tico. É importante ressaltar, entretanto, que pode
turvo de precipitação, característico da atividade não ser detectado um número alto de células nos
de lecitinase. A inibição da atividade da toxina alfa alimentos, porque C. perfringens perde a viabili-
pela respectiva antitoxina, nos mesmos meios de dade se o produto for resfriado ou congelado por
cultura (reação de Nagler), é um teste diagnóstico período de tempo prolongado.
usado na confirmação de C. perfringens. Há, en- A enterite necrótica é uma doença muito mais
tretanto, cepas enterotoxigênicas que são lecitina- séria, embora bem mais rara, também provocada
se negativas e cepas que são fracamente positivas, pela ingestão de alimentos contaminados com alto
não sendo detectadas nesse teste (ICMSF, 1996). número de células ou esporos de C. perfringens
tipo C (>106/g). Os sintomas são resultantes da
Tabela 12.2. Classificação de C. perfringens em produção da beta toxina, incluindo dor e distensão
tipos com base na produção das toxinas alfa, abdominal, diarreia (às vezes com sangue), vômito
beta, epsilon e iota (Rainey et al., 2009). e necrose parcial do intestino delgado (FDA, 2012).
Tipo de C. perfringens Toxinas
Segundo Bates (1997), os primeiros casos ocorre-
Tipo A alfa
ram durante a Segunda Guerra Mundial, devidos
Tipo B alfa, beta, epsilon
ao consumo de carne enlatada. Em 1966-1967, no-
Tipo C alfa, beta
vos casos foram relatados na Nova Guiné, devidos
Tipo D alfa, epsilon
ao consumo de carne de porco contaminada, sen-
Tipo E alfa, iota
do chamada de síndrome “pigbel”. A toxina beta é
sensível à tripsina, mas, na Nova Guiné, a popula-
Nem todos os tipos de C. perfringens são asso- ção é mais vulnerável, devido ao alto consumo de
ciados com doenças transmitidas por alimentos. As batata doce. A batata doce contém um inibidor de
mais comuns são a gastroenterite provocada pelo tripsina que predispõe ao desenvolvimento da do-
tipo A e a enterite necrótica provocada pelo tipo C. ença, particularmente em crianças e adolescentes.
Segundo a FDA (2012), a gastroenterite provoca- A fome e a desnutrição também reduzem o nível
da pelo tipo A é resultante da ação de uma ente- de tripsina no trato gastrointestinal, aumentando a
rotoxina chamada CPE (C. perfringens enteroto- susceptibilidade à toxina beta. Esse, provavelmen-
xin), produzida no intestino do hospedeiro após te, foi um dos fatores associados aos casos de en-
a ingestão de alimentos com um número alto de terite necrótica durante a Segunda Guerra. Casos
células (>106/g). A produção da CPE é associada esporádicos têm sido relatados na Uganda, Malásia
com a formação de esporos “in vivo”, estimulada e Indonésia (Murrel, 1983).
pelas condições ácidas do estômago e pelos sais C. perfringens é amplamente distribuído no solo,
biliares no intestino. Durante o processo de es- poeira e vegetação. Também faz parte da micro-
porulação, as células produzem CPE, liberada no biota normal do trato intestinal do homem e dos
organismo junto com os esporos, quando ocorre a animais (FDA, 2012). A partir dessas fontes pode
lise do esporângio. A CPE provoca uma desordem atingir uma gama bastante variada de alimentos,
intestinal caracterizada por cólica abdominal e sendo comum a presença de esporos em carcaças
diarreia aquosa, que ocorre cerca de 16 horas após de bovinos e aves, em peixes, em vegetais, em

condimentos, em massas, em farinhas, em gela- racterística diferencial é a presença de ferro e sul-

tina, em leite e em pós para preparo de alimentos fito. Muitos clostrídios, incluindo C. perfringens,
doces ou salgados. reduzem sulfito a sulfeto, que reage com o ferro e
Produtos cozidos ou assados (principalmente car- precipita na forma de sulfeto de ferro, produzindo
nes), preparados em grandes quantidades e man- colônias pretas.
tidos de um dia para o outro até o momento de O Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) é o
servir, são os mais frequentemente associados a mais utilizado para a enumeração de C. perfrin-
surtos. Os esporos sobrevivem às temperaturas gens por plaqueamento direto, constituindo-se
normais de cozimento e, durante o resfriamento também numa excelente alternativa para a enu-
lento (normal na refrigeração de grandes porções meração de clostrídios sulfito-redutores em geral,
de alimentos) ou armazenamento em temperatura conseguindo suprimir o crescimento de pratica-
ambiente, podem germinar e se multiplicar. Em- mente todos os anaeróbios facultativos que acom-
bora seja uma bactéria anaeróbia, a sensibilidade panham os clostrídios em alimentos.
de C. perfringens ao oxigênio é menos acentuada Na enumeração de C. perfringens, o TSC pode ser
do que a de outros clostrídios, podendo crescer suplementado com gema de ovo, para verificar a
no interior da massa de alimentos. Mesmo que as produção da toxina alfa (lecitinase). A incorpo-
refeições sejam reaquecidas para o consumo, o ração da gema de ovo, entretanto, não apresenta
aquecimento inadequado permite a sobrevivência muita vantagem, porque alguns anaeróbios fa-
de um número suficiente de células para provo- cultativos podem produzir reação similar. Além
car a infecção. Alimentos como carne enrolada, disso, nem todas as cepas de C. perfringens pro-
panquecas, tortas ou bolos de carne também apre- duzem halo de reação de lecitinase, não sendo
sentam, em seu interior, condições favoráveis ao possível descartar as colônias sem halo. O halo
crescimento de C. perfringens, se mantidos em produzido por uma colônia também pode ser obs-
temperaturas abusivas. Da mesma forma, a práti- curecido pelos halos de outras colônias, dificul-
ca de manter carne assada (churrasco) quente em tando a visualização da reação.
caixas de isopor, até o momento de servir, oferece Todas as colônias pretas no Ágar TSC são pre-
condições para a multiplicação de C. perfringens. suntivas de clostrídios sulfito redutores e C. per-
Dependendo do tempo de permanência do produ- fringens. Para a confirmação de sulfito redutores
to nas caixas, a população pode atingir a dose in- a determinação da morfologia (bastonetes) e da
fectiva e provocar a doença. coloração de Gram (+) é suficiente.
Cepas não patogênicas de C. perfringens tam- Para a confirmação de C. perfringens os testes
bém são comum em água, onde a presença dos bioquímicos recomendadas são a motilidade (-),
esporos está constantemente associada a dejetos a fermentação da lactose (+), a hidrólise da ge-
humanos. Os esporos apresentam grande longe- latina (+) e a redução do nitrato a nitrito (+). A
vidade em água, em função da grande resistência ISO 7937:2004 também apresenta a alternativa de
às condições desfavoráveis do meio ambiente. Por confirmação no Caldo Lactose Sulfito (LS) a 46
esse motivo, são úteis na detecção de contamina- °C. Após 18 a 24h de incubação em LS, as cultu-
ção fecal remota, em situações nas quais outros ras com escurecimento do meio e com pelo menos
indicadores, como E. coli, já não se encontrariam um quarto do tubo de Durham preenchido pelo
presentes (Junqueira et al., 2012) gás são confirmadas como C. perfringens.
Na análise de água, ao contrário dos alimentos, é
12.1.3. Comentários sobre os mais comum é a enumeração dos esporos do que
das células vegetativas de clostrídios sulfito redu-
tores e C. perfringens. Os esporos de C. perfrin-
Há vários meios de cultura disponíveis para a enu- gens são excretados em grande quantidade nas fe-
meração de C. perfringens em alimentos, cuja ca- zes e apresentam grande longevidade no ambien-

te, servindo como indicadores de contaminação Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
fecal. orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os
A ISO 14189:2013 também usa o Ágar TSC para detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
a contagem de C. perfringens em água (filtração microrganismos em placas, da seleção das dilui-
em membrana), mas faz a confirmação através do ções ao cálculo dos resultados. O procedimento
teste de fosfatase ácida. As fosfatases são hidro- descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres-
lases que agem sobre compostos de fósforo e en- supondo que sejam conhecidos pelo analista.
contra-se em diversas formas moleculares, poden-
do ser classificadas em ácidas, neutras e alcalinas, 12.2.1. Material requerido para a
dependendo do pH necessário para o desenvolvi- análise
mento de sua atividade ótima.
Para a contagem de esporos de clostrídios sulfito □ Solução Glicerol Sal Tamponada (para estoca-
redutores o método ISO 6461-1:1986 (NMP) faz gem congelada de amostras)
a inoculação no Caldo DRCM (Differential Rein- □ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou
forced Clostridium Medium), que contém sulfito Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
de sódio e citrato férrico. A redução do sulfito re- □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada
sulta em sulfeto, que reage com o ferro forman- 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
do sulfeto de ferro, preto, com escurecimento do □ Pipetas de 1 ou 2 ml
meio. Para amostras em que se espera ausência Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
ou baixas contagens (menor do que 10/ ml), como tulo 2 para verificar casos especiais em que o
é o caso das águas minerais e naturais, engarra- tipo ou volume de diluente variam em função
fadas ou não, destinadas ao consumo humano, da amostra analisada.
recomenda-se distribuir 10 porções de 10 ml da
Contagem presuntiva
amostra em 10 tubos contendo 10 ml de DRCM
□ Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC)
em concentração dupla, totalizando 100 ml de
□ Sistema de geração de anaerobiose (Anaero-
amostra, como é requerido pela legislação brasi-
bac da Probac do Brasil, Anaerogen da Oxoid,
leira (ANVISA, 2005). Para amostras em que a
Anaerocult A da Merck, ou GasPak® da BD
concentração dos microrganismos seja maior, re-
Biosciences).
comenda-se trabalhar com diluições, inoculando-
□ Estufa incubadora regulada a 35-37 °C
-se uma série de cinco tubos para cada diluição. O
teste presuntivo é feito com a amostra previamen- Testes confirmativos
te submetida a choque térmico, para eliminação □ Tubos de Meio de Tioglicolato (TGM)
de células vegetativas. □ Tubos de Meio de Lactose Gelatina
□ Tubos de Ágar Nitrato Motilidade
□ Reagentes de Nitrato (Solução 0,8% de ácido
12.2. Método de plaqueamento sulfanílico, Solução 0,5% de alfa-naftol, Zinco
APHA 33.72:2015 para em pó livre de nitrato ou nitrito)
□ Tubos de Meio de Fermentação para C. per-
contagem de clostrídios fringens
sulfito redutores e Clostridium □ Solução 0,04% de Azul de Bromotimol
perfringens em alimentos
(APHA), descrito no Capítulo 33 da 5ª edição do O procedimento para contagem de C. perfringens
Compendium of Methods for the Microbiological em alimentos pelo método de plaqueamento APHA
Examination of Foods (Labbe, 2015). 33.72:2015 encontra-se descrito na Figura 12.1.

Figura 12.1. Esquema de análise para contagem de C. perfringens em alimentos pelo

método de plaqueamento APHA 33.72:2015 (Labbe, 2015).

a) Estocagem das amostras para a análise. O Nota c.1) No Brasil é comum a incubação do TSC a 46
Compendium recomenda que amostras desti- °C para a contagem de clostrídios sulfito redutores
indicadores de C. perfringens. Sendo observadas co-
nadas à enumeração de C. perfringens sejam lônias típicas (pretas), a confirmação é feitas através
analisadas, se possível, imediatamente. Na de uma simples coloração de Gram, sendo considera-
impossibilidade de se proceder à análise ime- das confirmadas as culturas Gram positivas.
diata, que sejam refrigeradas pelo menor tem-
d) Contagem das colônias presuntivas de clos-
po possível, não devendo ser congeladas ou
trídios sulfito redutores e C. perfringens. Se-
mantidas sob refrigeração prolongada. Haven-
lecionar placas com 20 a 200 colônias e contar
do necessidade de estocagem por mais de 48
as colônias típicas de clostrídios sulfito reduto-
horas, tratar as amostras com Solução Glicerol
res e C. perfringens, que são pretas. No caso do
Sal Tamponada (na quantidade requerida para
TSC com gema de ovo as colônias de C. per-
atingir a concentração final de 10% na amos-
fringens podem apresentar ou não um halo de
tra) e estocar entre 55 e 60 °C negativos.
precipitação, devido à reação de lecitinase com
b) Preparação das amostras e inoculação. Para a gema de ovo.
a preparação da amostra e diluições decimais Cuidado. O Ágar TSC permite crescimento e
seriadas, seguir as recomendações do Capítu- produção de toxina de C. botulinum, não ha-
lo 2. As amostras não devem ser submetidas vendo distinção entre suas colônias e as colô-
a choque térmico, para contagem de esporos nias de C. perfringens (Serrano & Junqueira,
(uma prática comum na análise de água e de fe- 1991). O manuseio e o descarte dessas placas,
zes), porque C. perfringens raramente esporula bem como de todo o material envolvido nas
em alimentos. etapas subsequentes da análise, devem ser fei-
Selecionar três diluições adequadas da amostra tos com o máximo cuidado, para evitar riscos
e inocular em Ágar Triptose Sulfito Cicloseri- de contaminação do analista e do laboratório.
na (TSC), plaqueamento em superfície ou em Trabalhar com luvas, colocar o material sobre
profundidade. Alternativamente, pode-se utili- bandejas, não diretamente sobre a bancada,
zar o Ágar TSC com gema de ovo, plaquea- nunca pipetar culturas com a boca, desinfetar
mento em superfície. Aguardar que as placas todas as superfícies com solução de NaOH 1N
sequem e cobrir a superfície com uma sobre- e esterilizar todo o material de descarte a 121
camada de TSC, sem gema de ovo. °C/30min.
c) Incubação. e) Confirmação das colônias típicas de clos-
Aguardar a completa solidificação da sobreca- trídios sulfito redutores e C. perfringens.
mada e incubar as placas a 35-37 °C/18-24h, Selecionar cinco colônias típicas (10 no caso
em atmosfera anaeróbia, sem inverter. de análises oficiais) e transferir para Meio de
Para obtenção da atmosfera anaeróbia, pode-se Tioglicolato (TGM). Incubar a 46 °C/4h (em
utilizar o processo de exaustão de ar e intro- banho) ou a 35-37 °C/18-20h. Inocular a cultu-
dução de 90% de gás nitrogênio e 10% de gás ra obtida nos meios abaixo, para realização das
carbônico, em incubadora anaeróbia ou jarro provas bioquímicas de confirmação.
tipo Baird & Taitlock. Através das válvula de Colônias não isoladas devem ser purificadas
admissão e de exaustão, proceder à exaustão e por estrias em Ágar TSC (a partir do TGM) e
introdução dos gases por três ou quatro vezes. novamente inoculadas no TGM, antes da reali-
Alternativamente, pode-se utilizar sistemas zação das provas bioquímicas.
geradores de anaerobiose, disponíveis comer- Para a confirmação de sulfito redutores, de-
cialmente (BD Biosciences GasPak® Anaero- terminar a morfologia (bastonetes) e a colora-
bic Systems, Anaerogen Oxoid, Anaerocult A ção de Gram (+), conforme procedimento de
Merck, Anaerobac Probac do Brasil). coloração de Gram descrito no Capítulo 5.

Para a confirmação de C. perfringens, sub- teste positivo. Se o meio adquirir cor ver-
meter as culturas aos testes de fermentação da melha, há nitrato presente, indicando teste
lactose (+), hidrólise da gelatina (+), redução negativo. C. perfringens é imóvel e reduz o
do nitrato a nitrito (+) e motilidade (-) descri- nitrato.
tos abaixo. e.3) Testes de fermentação da rafinose e salici-
e.1) Teste de fermentação da lactose e hidró- na. Esses testes são requeridos apenas para
lise da gelatina (meio de lactose gelatina). as culturas que exibirem alguma reação atí-
Inocular uma alçada da cultura em tubos pica nos testes anteriores. A partir de uma
de Meio de Lactose Gelatina (previamente cultura de 24 horas em Meio de Tioglicolato
desaerados) e incubar a 35-37 °C/24-44h. (TGM), inocular 0,1 ml em tubos de Meio
Observar se há formação de bolhas e vira- de Fermentação para C. perfringens com
gem ácida do indicador (vermelho de fenol), rafinose e 0,1 ml em tubos de Meio de Fer-
alterando a cor do meio de vermelha para mentação para C. perfringens com salicina.
amarela (fermentação da lactose positiva), Incubar a 35-37 °C/24h e, após a incuba-
ou se o meio permanece com a cor inaltera- ção, verificar se houve produção de ácido,
da (fermentação da lactose negativa). Trans- transferindo 1 ml da cultura para um tubo de
ferir os tubos para uma geladeira e manter ensaio e adicionando duas gotas de solução
sob refrigeração por duas horas, observando 0,04% de azul de bromotimol. O desenvol-
em seguida se o meio permanece líquido vimento de uma cor amarela no meio de cul-
(hidrólise da gelatina positiva) ou se adqui- tura indica teste positivo. Em caso negativo,
re uma consistência firme (hidrólise da ge- reincubar a cultura e verificar novamente
latina negativa). C. perfringens fermenta a com 48 e com 72 horas de incubação. As
lactose e hidrolisa a gelatina. cepas de C. perfringens usualmente fermen-
e.2) Teste de redução do nitrato e teste de mo- tam a rafinose e não fermentam a salicina.
tilidade (ágar nitrato motilidade). Com uma
f) Cálculo dos resultados. Considerar como clos-
agulha de inoculação, inocular a cultura por
trídios sulfito redutores todas as culturas de
picada, no centro do Ágar Nitrato Motili-
bastonetes Gram positivos.
dade previamente desaerado, até uma pro-
Considerar como C. perfringens todas as cul-
fundidade distante 1cm do fundo do tubo.
turas com as seguintes características: fermen-
Incubar a 35-37 °C/24h e fazer a leitura do
tação da lactose (+), hidrólise da gelatina (+),
teste de motilidade, observando se houve
redução do nitrato (+), motilidade (-). Caso
migração de células para regiões fora da li-
uma destas reações seja atípica, verificar adi-
nha de inoculação (motilidade positiva), ou
cionalmente a capacidade de fermentação da
se o crescimento restringiu-se à região da
rafinose (usualmente positiva) e da salicina
picada (motilidade negativa). Para a realiza-
(usualmente negativa).
ção do teste de redução do nitrato, adicio-
Calcular o número de UFC/g ou ml em função
nar aos tubos de cultura 0,1 ml de cada um
do número de colônias típicas, diluição inocu-
dos reagentes de nitrato (A = solução 0,8%
lada e percentagem de colônias confirmadas.
de ácido sulfanílico; B = solução 0,5% de
alfa-naftol). Observar imediatamente se há Exemplo. Plaqueamento em profundidade, di-
desenvolvimento de uma cor vermelha no luição 10-2, 25 colônias típicas, 10 submetidas
meio de cultura (teste positivo) e, em caso à confirmação, oito confirmadas (80%).
negativo, adicionar uma pitada de pó de zin-
UFC/g ou ml = 25x102x0,8 = 2,0x103.
co ao meio, observando se ocorre alteração
de cor. Se o meio continuar com a cor inal-
terada, não há nitrato presente, indicando

12.3. Método de presença/ c) Confirmação. A partir dos tubos com cresci-

mento e produção de gás, estriar as culturas
ausência APHA 33.71:2015 em placas de Ágar TSC com ou sem gema de
para Clostridium perfringens ovo. Incubar a 35-37 °C/18-24h e observar a
em alimentos presença de colônias típicas, descritas no item
12.2. Havendo colônias típicas, selecionar
Método da American Public Health Association pelo menos uma para a confirmação, feita da
(APHA), descrito no Capítulo 33 da 5ª edição do mesma forma descrita no método de plaquea-
Compendium of Methods for the Microbiological mento APHA 33.72:2015 (item 12.2).
Examination of Foods (Labbe, 2015).
Este método objetiva verificar a presença ou au-
sência de C. perfringens em amostras de alimen- 12.4. Método do NMP
tos com baixas contagens e provável incidência de ISO 6461-1:1986 para
células injuriadas.
esporos de clostrídios sulfito
Cuidado. Todas as etapas do teste de presença/
ausência permitem o crescimento e a produção redutores em água
de toxina de C. botulinum, não havendo distinção
segura entre as culturas. Por este motivo, reco- Método da International Standards Organization
menda-se a observação dos mesmos cuidados in- (ISO 6461-1:1986) para determinação do núme-
dicados no método de contagem direta em placas ro mais provável (NMP) de esporos de clostrídios
(item 12.2). sulfito redutores em água.
12.3.1. Material requerido para a 12.4.1. Material requerido para a

análise análise
Teste presuntivo □ Pipetas de 10 ml para transferência dos volumes
□ Tubos de Caldo de Fígado (CF) □ Tubos com 10 ml Caldo Diferencial Reforçado
□ Ágar Selo (Ágar 2% estéril) para Clostrídios (DRCM) em concentração du-
□ Estufa incubadora regulada a 35-37 °C pla para inoculação de 10 ml da amostra
Teste confirmativo □ Sistema de geração de anaerobiose (Anaero-
□ os mesmos itens requeridos na contagem em bac da Probac do Brasil, Anaerogen da Oxoid,
placas (item 12.2.1) Anaerocult A da Merck, ou GasPak® da BD
Biosciences).
12.3.2. Procedimento □ Banho-maria a 75±5 °C para choque térmico
O procedimento do método de presença/ausência □ Estufa incubadora regulada a 37±1 °C
APHA 33.71:2015 para C. perfringens em ali-
mentos encontra-se descrito na Figura 12.2.
a) Inoculação. Inocular porções de aproximada-
mente 2g da amostra em tubos com 15-20 ml O procedimento para contagem de C. perfringens
de Caldo de Fígado (CF), previamente desae- em água pelo método do NMP ISO 6461-1:1986
rados. Cobrir a superfície do meio inoculado encontra-se descrito na Figura 12.3.
com um selo de 2cm de Ágar 2%. Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
b) Incubação. Incubar os tubos a 35-37 °C por orientações do Capítulo 4, que apresenta todos os
20-24 horas e observar se ocorrem crescimen- detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
to e produção de gás, com deslocamento do microrganismos pelo NMP, da seleção das dilui-
selo de Ágar. ções ao cálculo dos resultados. O procedimento

Figura 12.2. Esquema de análise para o método de presença/ausência APHA 33.71:2015

para C. perfringens em alimentos (Labbe, 2015).

Figura 12.3. Esquema de análise para contagem de C. perfringens em água pelo método do NMP ISO 6461-1:1986.

descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- 12.5. Método de filtração em
membrana ISO 14189:2013
a) Preparação das amostras. Submeter as amos-
tras à choque térmico a 75±5 °C/15min, para
para contagem de Clostridium
destruição de células vegetativas e ativação perfringens em água
dos esporos.
Método da International Standards Organization
b) Inoculação e incubação. Com uma pipeta de
(ISO 14189:2013) para determinação do número
10 ou 25 ml, adicionar 10 porções de 10 ml
de UFC de Clostridium perfringens (esporos ou
da amostra em 10 tubos contendo 10 ml de
células vegetativas) em água.
Caldo Diferencial Reforçado para Clostrídios
(DRCM), em concentração dupla, previamen-
te desaerados. Não havendo necessidade de
quantificar, inocular 100 ml da amostra em
análise
100 ml de DRCM concentração dupla (teste □ Diluente (Tampão Fosfato com cloreto de
de presença ausência). Incubar os tubos ou os magnésio ou Água Peptonada 0,1% ou Tam-
frascos a 37±1 °C/44±4h em jarro com atmos- pão Fosfato pH 7,2 ou Solução Salina 0,85%)
fera anaeróbia e observar se há ocorrência de se for necessária a preparação de diluições.
crescimento com escurecimento do meio. □ Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC)
□ Ágar Columbia Sangue (CBA) ou Ágar Tripti-
Nota b.1) A inoculação de 100 ml da amostra é o pro-
cedimento padrão para análise de amostras de água
case de Soja Sangue (TSA-SANGUE)
destinadas ao consumo humano, nas quais se espera □ Reagente de Fosfatase Ácida
ausência em 100 ml. Para outras finalidades, pode-se □ Sistema de geração de anaerobiose (Anaero-
inocular 50 ml em 50 ml de DRCM concentração du- bac da Probac do Brasil, Anaerogen da Oxoid,
pla ou cinco porções de 10 ml em 10 ml de DRCM
concentração dupla, ou diluições para contagem em
amostras mais contaminadas (série de cinco tubos Biosciences).
por diluição). □ Sistema de filtração em membrana
Nota b.2) Observar os seguintes procedimentos na pre- □ Filtros membranas de poro 0,45μm
paração dos tubos de Caldo DRCM antes da inocula- □ Estufas incubadoras reguladas a 44±1 °C e a
ção: Desaerar os tubos fervendo por 10 minutos em 36±1 °C
banho-maria, com as tampas afrouxadas, e resfriando
imediatamente em banho de água fria. Suplementar
□ Banho maria com temperatura regulada a 60±2 °C
com a solução de citrato férrico e sulfito de sódio
para Caldo DRCM, adicionando 0,4 ml da solução 12.5.2. Procedimento
em 10 ml de DRCM concentração dupla e 0,2 ml da
solução em 10 ml de DRCM concentração simples. O procedimento para contagem de C. perfringens
em água pelo método de filtração em membrana ISO
c) Cálculo dos resultados. Considerar como 14189:2013 encontra-se descrito na Figura 12.4.
clostrídios sulfito redutores todas as culturas Transportar e manter as amostras sob refrigeração
que apresentarem escurecimento do DRCM. (5±3 °C). Iniciar as análises preferencialmente no
Determinar o Número Mais Provável (NMP) mesmo dia ou, se impossível, não ultrapassar 18h
em uma tabela de NMP apropriada às diluições da coleta no caso de contagem de células vegeta-
inoculadas. tivas ou 72h no caso de esporos.
orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os de-
talhes e cuidados envolvidos na contagem de micror-
ganismos por filtração em membrana.. O procedi-

Figura 12.4. Esquema de análise para contagem de C. perfringens em água pelo

método de filtração em membrana ISO 14189:2013.

mento descrito abaixo não apresenta esses detalhes, das. Estriar em placas de Ágar Columbia San-
pressupondo que sejam conhecidos pelo analista. gue (CBA) ou Ágar Tripticase de Soja Sangue
a) Choque térmico e filtração. Se for objetivada (TSA-SANGUE) e incubar a 36±1 °C/21±3h
a contagem de células vegetativas, o choque sob anaerobiose.
térmico deve ser suprimido. Para a contagem Nota c.1) Na indisponibilidade de sangue pode ser usada
de esporos, aplicar o choque térmico a 60±2 a base do meio de cultura sem sangue.
°C/15±1min, em banho com temperatura con- Para a realização do teste, estriar a cultura em
trolada. Garantir que o volume de água do ba- uma folha de papel de filtro e pingar duas gotas
nho seja suficiente para cobrir os frascos até a do Reagente de Fosfatase Ácida sobre a cultu-
altura da superfície da amostra. Iniciar a con- ra. O desenvolvimento de uma coloração arro-
tagem dos 15min a partir do momento em que xeada é considerado resultado positivo, típico
os frascos atingirem a temperatura de 60 °C, de C. perfringens.
usando um segundo frasco com o mesmo vo- d) Cálculo dos resultados. Calcular a contagem
lume de amostra para acompanhar a subida da de C. perfringens no volume inoculado usando
temperatura com um termômetro. O tempo de a fórmula:
subida não deve exceder 15mim.
Homogeneizar a amostra por agitação e fil- UFC/volume = b . C/A
trar em filtro membrana com porosidade de
onde:
0,45μm. O volume a ser filtrado normalmente b = número de colônias típicas confirmadas, dentre as que
é de 100 ml para amostras de água de consumo foram submetidas à confirmação,
humano (ou águas não poluídas). Para águas C = número de colônias típicas presentes na placa e
poluídas recomenda-se filtrar volumes meno- A = número de colônias típicas submetidas à confirmação
(10 e se houver menos de 10, todas).
res ou diluições.
É recomendável o uso de funis de metal para a Exemplo) Filtrados 100 ml da amostra e o resul-
análise de esporos, que possam ser flambados tados obtidos foram:
entre a filtração de uma amostra e outra.
b) Incubação e contagem das colônias. Trans- Colônias típicas na placa (C) 25
ferir cada membrana para uma placa de Ágar Colônias típicas submetidas à confirmação (A) 10
Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) e incubar as Colônias típicas confirmadas dentre as
8
submetidas à confirmação (b)
placas 44±1 °C/21±3h, invertidas, em condi-
UFC/100 ml = b.C/A 8x25/10 = 20
ções anaeróbias.
Nota b.1) Para intensificar o escurecimento das colônias
pode-se colocar a membrana sobre uma fina camada
prévia do meio de cultura na placa e, em seguida, co- 12.6. Método de plaqueamento
brir com uma segunda camada do mesmo meio.
ISO 7937:2004 para contagem
Contar todas as colônias pretas, cinza ou casta- de Clostridium perfringens
nho amareladas, consideradas típicas de clos-
em alimentos
trídios sulfito redutores. A coloração escura
tende a desaparecer cm o tempo, sendo assim Método da International Organization for Stan-
recomendável que as colônias sejam contadas dardization, aplica-se a todos os alimentos desti-
em no máximo 30min após a retirada da at- nados ao consumo humano, às rações animais e à
mosfera anaeróbia. amostras do ambiente de fabricação ou manipula-
c) Confirmação pelo teste de fosfatase ácida. ção de alimentos.
Selecionar dez colônias típicas para a confir- Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
mação e, se houver menos de 10, selecionar to- orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os

detalhes e cuidados envolvidos na contagem de em placas de Ágar Triptose Sulfito Cicloserina

microrganismos em placas, da seleção das dilui- (TSC), plaqueamento em profundidade.
Nota a.1) O método ISO 7932:2004 especifica plaquea-
descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- mento em duplicata, mas a ISO 7218:2007/Amd
supondo que sejam conhecidos pelo analista. 1:2013 dispensou a duplicata quando for feita a ino-
culação de pelo menos duas diluições.
12.6.1. Material requerido para a Se não houver necessidade de diluições, ino-
análise cular duas alíquotas de 1 ml em duas placas de
Preparação da amostra e diluições seriadas TSC (duplicata).
□ Diluente: Água Peptonada Tamponada (BPW) Após a solidificação do meio de cultura, cobrir
ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) com uma sobrecamada do mesmo meio.
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Pepto- Aguardar a solidificação da sobrecamada e in-
nada Tamponada (BPW) ou o Tampão Fosfato cubar as placas a 37±1 °C/20±2h, em atmosfe-
pH 7,2 (PB) ra anaeróbia.
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- Para obtenção da atmosfera anaeróbia, pode-se
tulo 2 para verificar casos especiais em que o utilizar o processo de exaustão de ar e intro-
tipo ou volume de diluente variam em função dução de 90% de gás nitrogênio e 10% de gás
da amostra analisada. carbônico, em incubadora anaeróbia ou jarro
Contagem presuntiva tipo Baird & Taitlock. Através das válvula de
□ Placas de Ágar Triptose Sulfito Cicloserina admissão e de exaustão, proceder à exaustão e
(TSC) introdução dos gases por três ou quatro vezes.
□ Sistema de geração de anaerobiose (Anaero- Alternativamente, pode-se utilizar sistemas
bac da Probac do Brasil, Anaerogen da Oxoid, geradores de anaerobiose, disponíveis comer-
Anaerocult A da Merck, ou GasPak® da BD cialmente (BD Biosciences GasPak® Anaero-
Biosciences). bic Systems, Anaerogen Oxoid, Anaerocult A
□ Estufa incubadora regulada a 37±1 °C Merck, Anaerobac Probac do Brasil).
Testes confirmativos
b) Contagem das colônias presuntivas. Sele-
□ Tubos de Meio de Tioglicolato (TGM)
cionar todas as placas com não mais de 150
□ Tubos de Caldo Lactose Sulfito (LS) com tu-
colônias e contar as colônias pretas, típicas de
bos de Durham
C. perfringens.
□ Tubos de Meio de Lactose Gelatina
Cuidado. O Ágar TSC permite crescimento e
□ Tubos de Ágar Nitrato Motilidade
produção de toxina de C. botulinum, não ha-
□ Reagente de Nitrato ISO 7937, Zinco em pó
vendo distinção entre suas colônias e as colô-
livre de nitrato ou nitrito)
nias de C. perfringens (Serrano & Junqueira,
1991). O manuseio e o descarte dessas placas,
bem como de todo o material envolvido nas
O esquema geral de análise de Clostridium per- etapas subsequentes da análise, devem ser fei-
fringens pelo método de plaqueamento ISO tos com o máximo cuidado, para evitar riscos
7937:2004 encontra-se descrito na Figura 12.5. de contaminação do analista e do laboratório.
a) Preparação da amostra, inoculação e incu- Trabalhar com luvas, colocar o material sobre
bação. Para a preparação da amostra e dilui- bandejas, não diretamente sobre a bancada,
ções seriadas, seguir os procedimentos descri- nunca pipetar culturas com a boca, desinfetar
tos no Capítulo 2. todas as superfícies com solução de NaOH 1N
Selecionar pelo menos duas diluições adequa- e esterilizar todo o material de descarte a 121
das da amostra e inocular 1 ml de cada diluição °C/30min.

Figura 12.5. Esquema de análise para contagem de Clostridium perfringens pelo método de plaqueamento ISO 7937:2004.

Para a confirmação, selecionar cinco colônias latina (previamente desaerados) e incubar a

típicas de cada placa com menos de 150 co- 37±1 °C/24h. Observar se há formação de
lônias e, se houver menos de cinco, selecio- bolhas e viragem ácida do indicador (ver-
nar todas. Inocular em Meio de Tioglicolato melho de fenol), alterando a cor do meio
(TGM) e incubar a 37±1 °C/18-24h, em condi- de vermelha para amarela (fermentação da
ções anaeróbias. lactose positiva), ou se o meio permanece
Há dois procedimentos recomendados para a com a cor inalterada (fermentação da lacto-
confirmação, o crescimento no Caldo Lactose se negativa). Transferir os tubos para uma
Sulfito (LS) a 46 °C (item c) ou os teste de fer- geladeira (5 °C) e manter sob refrigeração
mentação da lactose, hidrólise da gelatina, repor uma hora, observando em seguida se o
dução do nitrato e motilidade (item d), ficando meio permanece líquido (hidrólise da gelati-
a critério do laboratório optar pelo que melhor na positiva) ou se adquire uma consistência
atende às suas necessidades. No caso da con- firme (hidrólise da gelatina negativa). Em
firmação no Caldo LS, não é necessária a puri- caso negativo (o meio permanece firme),
ficação das culturas, porque o meio incubado a reincubar a 37±1 °C e repetir a leitura com
46 °C é muito específico para C. perfringens. 48h. C. perfringens fermenta a lactose e hi-
No caso dos teste de lactose/gelatina e nitrato/ drolisa a gelatina.
motilidade, colônias não isoladas devem ser pu- d.2) Teste de redução do nitrato e teste de mo-
rificadas (estrias de esgotamento em Ágar TSC) tilidade (ágar nitrato motilidade). Com uma
antes da realização das provas bioquímicas. agulha de inoculação, inocular a cultura por
c) Confirmação no Caldo Lactose Sulfito (LS) picada, no centro do Ágar Nitrato Motili-
a 46 °C. Inocular cinco gotas de cada cultura dade previamente desaerado, até uma pro-
obtida no TGM em um tubo de Caldo Lacto- fundidade distante 1cm do fundo do tubo.
se Sulfito (LS). Incubar os tubos a 46±0,5 °C/ Incubar a 37 °C/24h e fazer a leitura do teste
18-24h. Após a incubação, verificar se ocorre de motilidade, observando se houve migra-
escurecimento do meio (redução do sulfito) e ção de células para regiões fora da linha de
produção de gás no tubo de Durham. Conside- inoculação (motilidade positiva), ou se o
rar confirmadas como C. perfringens as culturas crescimento restringiu-se à região da pica-
com escurecimento do meio e com pelo menos da (motilidade negativa). Para a realização
um quarto do tubo de Durham preenchido pelo do teste de redução do nitrato, adicionar aos
gás. Nos casos em que a quantidade de gás seja tubos de cultura 0,2 a 0,5 ml do Reagente de
menor do que um quarto do tubo de Durham, Nitrato ISO 7937, em uma capela de exaus-
transferir cinco gotas da cultura obtida no Caldo tão. Observar se há desenvolvimento de uma
LS para um novo tubo de LS e repetir a leitura cor vermelha no meio de cultura (teste posi-
após 18-24h de incubação a 46±0,5 °C. tivo) e, em caso negativo após 15min, adi-
cionar uma pitada de pó de zinco ao meio,
d) Confirmação através dos testes de fermen-
observando se ocorre alteração de cor. Se o
tação da lactose, hidrólise da gelatina, re-
meio continuar com a cor inalterada, não há
dução do nitrato e motilidade. Inocular
nitrato presente, indicando teste positivo.
cada cultura obtida em TGE nos meios abai-
Se o meio adquirir cor vermelha, há nitrato
xo, para realização das provas bioquímicas de
presente, indicando teste negativo. C. per-
confirmação.
fringens é imóvel e reduz o nitrato.
d.1) Teste de fermentação da lactose e hidró-
lise da gelatina (meio de lactose gelatina). e) Cálculo dos resultados.
Inocular uma alçada com inóculo pesado da Segundo a ISO 7218:2007/Amd 1:2013, cal-
cultura em tubos de Meio de Lactose Ge- cular usando a fórmula:

UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d] 12.7. Método de filtração

onde: ISO 6461-2:1986 para
a = (b.C/A) sendo C = número de colônias típicas presentes contagem de esporos de
em cada placa selecionada para contagem,
A = número de colônias típicas submetidas à confirmação clostrídios sulfito redutores
(geralmente cinco) e em água
b = número de colônias típicas confirmadas, dentre as que
foram submetidas à confirmação.
n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele-
dardization (ISO 6461-2:1986), aplica-se a todos
cionada os tipos de água que não contenham material em
n2 = número de placas contadas da segunda diluição sele- suspensão.
cionada
análise
Exemplo 1) Inoculados 1 ml das diluições 10-1 e □ Ágar Sulfito Ferro ou Ágar Triptose Sulfito
10-2, uma placa por diluição (n1 =1 e n2 = 1). Cicloserina Base (TSC sem cicloserina e sem
Os resultados obtidos foram: gema de ovo)
Diluição 10-1 Diluição 10-2 □ Sistema de filtração em membrana
Colônias típicas na placa (C) 150 17
□ Filtros membranas de poro 0,2μm
Colônias típicas submetidas à
5 5 □ Sistema de geração de anaerobiose (Anaero-
confirmação (A)
4 3 bac da Probac do Brasil, Anaerogen da Oxoid,
Número de colônias consideradas (4x150/5) (3x17/5)
confirmadas nas placas [a = (b.C/A)] = 120 = 10 Biosciences).
Volume inoculado em cada placa (v) 1 ml 1 ml □ Estufa incubadora regulada a 37±1 °C
Primeira diluição retida para
10-1 = 0,1
contagem (d)
120+10 = 130
130 / [1 x (1+0,1 x 1) x 0,1] O procedimento para contagem de esporos de
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
= 130/0,11 = 1,2x103 clostrídios sulfito redutores em água pelo método
de filtração em membrana ISO 6461-2:1986 en-
Exemplo 2) Inoculados 1 ml da diluição 10-1, em
contra-se descrito na Figura 12.6.
duplicata (n1 = 2 e n2 = 0). Os resultados obti-
dos foram: Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
Placa 1 Placa 2
Colônias típicas submetidas à microrganismos por filtração em membrana. O
5 5
confirmação (A) procedimento descrito abaixo não apresenta esses
4 5 detalhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo
Número de colônias consideradas (4x18/5) (5x20/5) analista.
confirmadas nas placas [a = (b.C/A)] = 14 = 20
Volume inoculado em cada placa (v) 1 ml 1 ml
a) Choque térmico e filtração. Aplicar o choque
Primeira diluição retida para térmico a 75±5 °C/15min, em banho com tem-
10-1 = 0,1
contagem (d) peratura controlada. Garantir que o volume de
14+20 = 34 água do banho seja suficiente para cobrir os
34 / [1x(2+0,1x0)x0,1] frascos até a altura da superfície da amostra.
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
= 34/0,2 = 1,7x102 Iniciar a contagem dos 15min a partir do mo-
mento em que os frascos atingirem a tempera-

Figura 12.6. Esquema de análise para contagem de esporos clostrídios sulfito redutores em água pelo
método de filtração em membrana ISO 6461-2:1986.
tura de 75 °C, usando um segundo frasco com onde estão retidos os microrganismos para bai-
o mesmo volume de amostra para acompanhar xo) em uma placa estéril vazia. Adicionar 18
a subida da temperatura com um termômetro. ml de Ágar Triptose Sulfito Cicloserina Base
Homogeneizar a amostra por agitação e filtrar (TSC sem cicloserina e sem gema de ovo) ou
em filtro membrana com porosidade de 0,2μm. Ágar Sulfito Ferro e incubar as placas 37±1
O volume a ser filtrado normalmente é de 100 °C/20±4h e 44±4h, sob anaerobiose. Se a ge-
ml para amostras de água de consumo humano ração de atmosfera anaeróbia for feita em jarro
(ou águas não poluídas). Para águas poluídas ou em incubador anaeróbio, a membrana pode
recomenda-se filtrar volumes menores ou di- ser posicionada diretamente sobre a superfície
luições. do meio de cultura, sem inverter.
É recomendável o uso de funis de metal para a Nota b.1) Para intensificar o escurecimento das colônias
pode-se colocar a membrana invertida sobre uma fina
análise de esporos, que possam ser flambados
camada prévia do meio de cultura na placa e, em segui-
entre a filtração de uma amostra e outra. da, cobrir com uma segunda camada do mesmo meio.
b) Incubação e contagem das colônias. Trans- Após 20±4h de incubação, contar todas as co-
ferir cada membrana, invertida (com a face lônias pretas, consideradas típicas de clostrí-

dios sulfito redutores. Reincubar as placas por ou número excessivo de colônias), usar a con-
24 horas adicionais e recontar as colônias. tagem de 20 horas e reportar como estimada.
d) Cálculo dos resultados. A contagem com 44h O número de esporos de clostrídios sulfito re-
deve ser usada no cálculo dos resultados, mas, dutores no volume inoculado é igual ao núme-
caso não seja possível contar (espalhamento ro de colônias pretas presentes na placa.
12.8. Referências
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fringens - Method using membrane filtration, 1 st ed. Springer. pp. 736-738.

13 Contagem de enterococos
Item 13.4.2 (revisado) Inserida etapa de confirmação e orientações sobre o cálculo de resultados.
Item 13.5 (novo) Inserido Método de filtração em membrana ISO7899-2:2000 para contagem de enterococos em
água.
13.1. Introdução sinônimos, para descrever os Streptococcus asso-

ciados ao trato intestinal (Leclerc et al., 1996).
O termo enterococos usado neste capítulo refere- Em 1984, entretanto, as espécies do subgrupo
-se às espécies dos gêneros Enterococcus e Strep- “enterococos” foram separadas do gênero Strep-
tococcus associadas ao trato intestinal de humanos tococcus e transferidas para o novo gênero Ente-
e animais e que são tradicionalmente usados como rococcus (Enterococcus faecalis e Enterococcus
indicadores de contaminação fecal. Até 1984 to- faecium por Schleifer & Kilpper-Bälz, 1984 e
das as espécies que atendiam a essas caracterís- Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus,
ticas estavam afiliadas ao gênero Strepetococcus Enterococcus durans e Enterococcus gallinarum
(conhecidas como grupo dos Streptococcus fe- por Collins et al., 1984).
cais) e apresentavam o fator antigênico do grupo
Posteriormente, várias novas espécies foram in-
D de Lancefield. Neste grupo dos Streptococcus
corporadas ao gênero, nem sempre apresentando
fecais havia um subgrupo de espécies chamadas
todas as características do subgrupo original (ori-
de “enterococos”, que diferiam dos demais estrep-
gem intestinal, grupo D de Lancefield, capacidade
tococos fecais na capacidade de crescer na presen-
de crescer na presença de 0,4% de azida de sódio,
ça de 0,4% de azida de sódio e 6,5% de NaCl, bem
6,5% de NaCl, 10 e 45 ºC e pH 9,6). Como con-
como nas temperaturas de 10 e 45 ºC e em pH 9,6.
sequência, o termo enterococos atualmente repre-
A classificação sorológica de Lancefield (1933) senta todos os membros do gênero Enterococcus,
foi proposta para os Streptococcus b hemolíti- que compõem uma coleção de espécies não só de
cos, com base em antígenos presentes na parede origem intestinal, mas também presente no solo,
celular. Os antígenos foram reunidos em grupos na água e nas plantas.
específicos, designados por letras do alfabeto (Le-
clerc et al., 1966). O grupo D era característico 13.1.1.1. Streptococcus fecais
das espécies de Streptococcus fecais, incluindo as
As espécies de estreptococos fecais mantidas no
do subgrupo “enterococos”.
gênero Streptococcus após a criação do gênero
Enterococcus foram Streptococcus bovis e Strep-
13.1.1. Taxonomia tococcus equinus, ambas listadas na 1ª edição
Os termos “Streptococcus fecais”, “enterococos” do Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology
e “Streptococcus do grupo D de Lancefield” fo- (Hardie, 1986). Com o tempo, sucessivos estu-
ram por muito tempo usados mais ou menos como dos taxonômicos resultaram na gradual subdivi-

são das cepas dessas espécies em novas espécies, foram descritas: S. entericus (Vela et al., 2002),
designadas como “grupo bovis” ou “complexo S. henryi e S. cabali (Milinovich et al., 2008) e
S.bovis/S.equinus” ou ainda “grupo S.bovis/S. S. danieliae (Clavel et al., 2013). O antigeno do
equinus” (Whiley & Hardie, 2009). Com base em grupo D esta presente em S. entericus e S. henryi,
estudos de hibridização DNA-DNA as linhagens mas não em S. cabali e S. danieliae.
tipo de S. bovis e de S.equinus mostraram per- Assim, o termo Streptococcus fecais atualmente
tencer ao mesmo grupo de similaridade, de for- representa estas espécies associadas ao trato in-
ma que esses dois nomes são hoje reconhecidos testinal de humanos e outros animais, cuja origem
como sinônimos, sendo S. equinus o epíteto que e nomenclatura encontram-se descritas na Tabela
tem prioridade. 13.1.
Atualmente (2016) há quatro espécies no “com-
plexo S.bovis/S.equinus”: S. equinus, S. alactoly- Características bioquímicas dos Streptococ-
ticus, S. infantarius e S. gallolyticus (subdividida cus fecais (Svec & DeVriese, 2009): Todos os
em três subspécies, gallolyticus, macedonicus e estreptococos fecais são bactérias lácticas com
pasteurianus) (Whiley & Hardie, 2009, DSMZ, metabolismo de carboidratos homofermentativo,
2016, Euzéby, 2016). O antígeno do grupo D de produzindo ácido láctico como produto final da
Lancefield é encontrado nas quatro espécies (se fermentação, sem gás. A morfologia é de cocos,
não em todas as cepas, pelo menos em algumas Gram positivos, imóveis, arranjados em cadeias.
cepas de cada espécie). Além dessas, quatro ou- Não esporogênicos, não pigmentados. Catalase
tras espécies isoladas do intestino de animais já negativos, anaeróbios facultativos. A temperatura
Tabela 13.1. Espécies do gênero Streptococcus associadas ao trato intestinal de humanos e outros ani-
mais e origem relatada.
Sinônimos Grupo
Espécie Origem (referência)
(DSMZ, 2016, Euzéby, 2016) Lancefield
Streptococcus alactolyticus Farrow et al., Streptococcus intestinalis D
Intestino de suínos e fezes de galinhas (1).
1985 (grupo bovis) (heterotypic synonym) (ocasionalmente G)
Streptococcus equinus Andrews & Horder Streptococcus bovis Fezes humanas, suínas e de ruminantes
D
1906 (grupo bovis) (heterotypic synonym) (bovinos, equinos, ovinos e outros) (1).
Fezes de vários animais incluindo marsu-
S. gallolyticus subsp. gallolyticus
piais (koala, canguru, gambá) e mamíferos
(Osawa et al., 1996) Schlegel et al. 2003 - D
(bovinos, equinos, pequenos ruminantes)
emend. Beck et al., 2008 (grupo bovis)
e outros) (1).
Streptococcus waius
S. gallolyticus subsp. macedonicus
(heterotypic syn.), Produtos lácteos e
(Tsakalidou et al., 1998) F ou não reativo
Streptococcus macedonicus indústria de laticínios (1).
Schlegel et al., 2003 (grupo bovis)
(basonym)
A linhagem tipo foi isolada das fezes
de uma criança e as outras cepas foram
Streptococcus infantarius Schlegel et al.
S. lutetiensis D ou não reativo isoladas de alimentos (produtos lácteos,
2000 (grupo bovis)
ervilhas congeladas) e de espécimes clíni-
cos (sangue e um caso de endocardite) (1).
Isolado das fezes e do intestino de um
Streptococcus entericus Vela et al. 2002 Nova espécie D bezerro com enterite, mas o habitat é
desconhecido (1).
Streptococcus caballi Milinovich et al. Isolado do reto de cavalos com laminite
Nova espécie -
2008 equina induzida por oligofrutose (3).
Streptococcus henryi Milinovich et al. Isolado do reto de cavalos com laminite
Nova espécie D
2008 equina induzida por oligofrutose (3).
Streptococcus danieliae Clavel et al. 2013 Nova espécie Não reativo Isolado do intestino de ratos (2)
Referências: 1) Whiley & Hardie (2009), 2) Clavel et al. (2013), 3) Milinovich et al. (2008).

Contagem de enterococos □ 197
ótima de crescimento é 37 ºC. Quimiorganotrófi- para os coliformes ou E. coli, sua presença pode
cos, apresentam requerimentos nutricionais com- não ter qualquer relação com os patógenos enté-
plexos para crescimento. ricos. Por outro lado, essa maior resistência pode
ser útil para avaliar a eficácia de procedimentos de
13.1.1.2. Enterococcus
desinfecção no ambiente de indústrias de alimen-
Muitas espécies de Enterococcus fazem parte da tos, ou para verificar a qualidade higiênico-sanitá-
flora intestinal de mamíferos, aves e outros ani- ria de produtos ácidos ou congelados, em que os
mais. Também são encontrados nos alimentos, nas coliformes ou E. coli podem não sobreviver.
plantas, no solo e na água. Características bioquímicas do gênero Entero-
As espécies de origem intestinal são E. faecalis, coccus (Svec & DeVriese, 2009): Todos os En-
E. faecium, E. durans, E. cecorum, E. hirae, E. terococcus são bactérias lácticas, anaeróbios fa-
villorum, E. raffinosus, E. canintestini, E. canis cultativos, com metabolismo de carboidratos ho-
e E. avium, com predomínio de E. faecalis e E. mofermentativo, produzindo ácido láctico como
faecium (Silva et al., 2013). produto final da fermentação, sem gás. Quimior-
As espécies mais comuns no ambiente (plantas, ganotróficos, apresentam requerimentos nutricio-
solo e água) são E. casseliflavus, E. haemopero- nais complexos para crescimento. A morfologia é
xidus, E. moraviensis, E. mundtii e E. sulfureus, de cocos, Gram positivos, isolados, aos pares ou
embora E. faecalis e E. faecium também possam em cadeias. Normalmente imóvies (E. columbae,
ser encontradas (Silva et al., 2013). De acordo com E. casseliflavus e E. gallinarum podem apresentar
Svec & DeVriese (2009) os enterococos são con- cepas móveis). Normalmente não pigmentados
taminantes transitórios das plantas, provavelmente (E. gilvus, E. mundtii, E. pallens, E. sulfureus e
disseminados por insetos. Também não são habi- algumas cepas de E. casseliflavus e E. haemope-
tantes naturais do solo, onde a contaminação ad- roxidus são pigmentados de amarelo). Catalase
vém dos animais, das plantas, do vento e da chuva. negativos (algumas cepas podem apresentar pseu-
Na água sua presença é considerada uma indicação do catalase em meios contendo sangue). A tem-
de contaminação fecal, sendo usados como indica- peratura ótima da maioria é de 35-37 ºC. Muitas
dores de contaminação remota, porque conseguem espécies (mas não todas) crescem a 42 ºC (e até
sobreviver por longos períodos de tempo. Moore et a 45 ºC) e também a 10 ºC. São muito resistentes
al. (2007) avaliaram o uso dos enterococos como à secagem. As seguintes características são co-
indicadores de contaminação fecal em amostras de muns a quase todas as espécies, com raras exce-
água da California (esgoto urbano, baías e oceano), ções (alguns testes ainda não foram relatados para
observando que 42 a 54% das cepas isoladas eram algumas espécies menos conhecidas): crescem
de espécies associadas a plantas (E. casseliflavus na presença de bile (40%), hidrolisam a esculina
e E. mundtii. As demais eram espécies de origem (atividade de b-glicosidase) e produzem leucina
fecal, predominando E. faecalis e E faecium nas arilamidase (LAP). As características considera-
amostras de esgoto, como esperado. das típicas do gênero não se aplica à várias das
As espécies mais comuns em alimentos são E. fa- espécies descritas mais recentemente: apresentam
ecium e E. faecalis, embora E. casseliflavus, E. o antígeno do grupo D de Lancefield, resistem à
durans, E. gallinarum, E. hermanniensis, E. hi- azida de sódio (0,4%), crescem a 10 e 45 ºC e na
rae, E. italicus e E. mundtii também sejam encon- presença de 6,5% de NaCl, produzem pirrolidonil
tradas (Silva et al., 2013). De acordo com Craven arilamidase (PYR).
et al. (1997) o uso dos enterococos como indica- A 2ª edição do Bergey’s Manual of Systematic Bac-
dores em alimentos já não é tão comum, devido teriology (Svec & DeVriese, 2009) divide as espé-
à sua maior resistência a fatores ambientais, em cies de Enterococcus em grupos, cujos membros
comparação com as enterobactérias. Como po- apresentam características fenotípicas similares e
dem sobreviver em condições que seriam letais são dificilmente diferenciados uns dos outros:

▪ Grupo E. faecalis: E. faecalis, E. caccae, E. ▪ Grupo E. italicus: E. italicus e E. camelliae.

hemoperoxidus, E. moraviensis, E. silesiacus e E. Apresentam pouca atividade bioquímica, em
termitis. Formam colônias vermelho escuras com comparação com as outras espécies.
brilho metálico no Ágar Slanetz-Bartley (m-Ente-
13.1.1.3. Diferenciação entre
rococcus). Crescem a 10 ºC e em 6,5% de NaCl.
Enterococcus e Streptococcus fecais
Produzem o antígeno do grupo D de Lancefield.
Sobrevivem ao calor a 60 ºC por 30 minutos. As características mais usadas para diferenciar es-
tes dois grupos são apresentadas na tabela 13.2.
▪ Grupo E. faecium: E. faecium, E. durans, E.
canis, E. hirae, E. mundtii, E. ratti e E. villorum. De maneira geral, Svec & DeVriese (2009) con-
Essas espécies são estreitamente relacionadas e a sideram como Enterococcus presuntivos os co-
diferenciação por testes bioquímicos não é confi- cos Gram positivos, catalase negativos, com bom
ável. E. faecium cresce em pH 9,6 e sobrevive ao crescimento em meios seletivos contendo 0,4% de
calor a 60 ºC por 30 minutos. azida de sódio e na presença de 6,5% de NaCl.
Dentre os estreptococos fecais, apenas cepas de S.
▪ Grupo E. avium: E. avium, E. DeVriesei, E.
bovis apresentam características similares às dos
gilvus, E.maloduratus, E.pseudoavium e E. raffi-
Enterococcus nesses meios, mas não crescem em
nosus. A maioria dessas espécies forma colônias
6,5% de NaCl.
pequenas e fortemente hemolíticas em Ágar San-
gue e cresce lentamente no Ágar m-Enterococcus.
Crescem a 10º e 45 ºC e na presença de 6,5% de 13.1.2. Comentários sobre os
NaCl. Fermentam adonitol e L-sorbose. A presen- métodos de análise
ça do antígeno do grupo D de Lancefield pode ser As informações abaixo são da 5ª edição do Com-
negativa. pendium of Methods for the Microbiological Exa-
▪ Grupo E. gallinarum: E. gallinarum e E. cas- mination of Foods (Laird, 2015) e, no caso da
seliflavus. São móveis (com raras cepas imóveis). análise de água, da 22ª edição do Standard Me-
O crescimento no Ágar m-Enterococcus é pobre, thods for the Examination of Water and Wastewa-
podendo ser favorecido em atmosfera de CO2. ter (Hunt, 2012).
Tabela 13.2. Características mais usadas para diferenciar Enterococcus de Streptococcus intestinais
(Svec & DeVriese, 2009, Whiley & Hardie, 2009).
Crescimento
Hidrólise da
Microrganismo 6,5% 40% PYRb LAPb
10 ºC 45 ºC pH 9,6 esculina
NaCl Bile
Enterococcus +c +c +c +c +c +c +c +c
Streptococcus alactolyticus - + - - - + - +
Streptococcus entericus - - - + ND + d +
Streptococcus equinus - + - - + + - +
S. gallolyticus subsp. gallolyticus + + - ND ND + - +
S. gallolyticus subsp. macedonicus - + d ND ND - - +
Streptococcus infantarius ND ND - ND ND d - +
a
Streptococcus caballi ND ND - ND + + - +
a
Streptococcus henryi ND ND - ND + + - +
Símbolos usados nos resultados mostrados para as espécies de Streptococcus (exceto S. henryi e S. caballi):
+, <85% positivo; d, varia entre as cepas (16-84% positivo); -, 0-15% positivo; w, reação fraca; ND, não determinado (Whiley & Hardie, 2009).
a
= Dados de Milinovich et al., 2008.
b
= PYR = produção de pirrolidonil arylamidase = pirrolidonil aminopeptidase; LAP = produção de leucina arilamidase = leucina aminopeptidase.
c
= O resultado positivo é tradicionalmente considerado típico do gênero Enterococcus, mas não se aplica a algumas das espécies descritas mais recentemente
(Svec & DeVriese, 2009).

O método mais usado na análise de alimentos é o seja mais rara na análise de alimentos. O meio de
plaqueamento em Ágar KF Streptococcus, exceto cultura é o KF Streptococcus na forma de caldo
para leite e seus derivados que, para inibir os lac- e a ocorrência de crescimento com viragem ama-
tobacilos e estreptococos lácticos, exigem meios rela e sem produção espuma (gás) é considerada
mais seletivos. O KF é um meio seletivo diferen- confirmativa.
cial, que utiliza a azida de sódio como principal Na análise de água a contagem de estreptococos
agente seletivo, o cloreto de trifeniltetrazolium fecais e enterococos pode ser feita pela técnica
(TTC) como agente diferencial e os carboidra- da membrana filtrante, segundo método da 22ª
tos maltose (2%) e lactose (0,1%) como fontes edição do Standard Methods for the Examina-
de carbono. Nesse meio, E. faecalis reduz o TTC tion of Water and Wastewater (Hunt, 2012) e ISO
até o seu derivativo final, formazan, produzindo 7899-2:2000. Sua principal aplicação é a análise
colônias vermelho-escuras. Outros enterococos de água mineral ou natural, destinadas ao consu-
também podem crescer, mas são redutores fracos mo humano, com filtração de 100 ml da amostra,
do TTC, produzindo colônias róseas. A reação das como recomendado pela legislação brasileira. O
novas espécies de Enterococcus descobertas de- meio de cultura de uso mais simples é o Ágar
pois da criação do gênero, ainda não foi descrita. m-Enterococcus, seletivo diferencial, que utiliza a
A maioria das demais bactérias lácticas são par- azida de sódio como agente seletivo para bactérias
cial ou totalmente inibidas no Ágar KF, embora Gram negativas, o cloreto de trifeniltetrazolium
algumas cepas de Pediococcus, Lactobacillus e (TTC) como agente diferencial e a glicose, como
Aerococcus possam crescer e produzir colônias carboidrato para fermentação. O desenvolvimento
levemente róseas. A azida de sódio também pode de colônias típicas é considerado presuntivo para
inibir várias cepas de S. bovis, S. equinus e, possi- Enterococcus + Streptococcus fecais, confirma-
velmente, diversas das novas espécies do gênero dos pela morfologia, coloração de Gram e teste de
Enterococcus. catalase (Hunt, 2012) ou teste de crescimento em
Ágar Bile Esculina Azida (ISO 7899-2:2000). A
Alternativamente, pode ser utilizado o Ágar Gen-
diferenciação dos Enterococcus é opcional.
tamicina Tálio Carbonato Fluorogênico (FGTC),
que substitui a azida por outros agentes seletivos
e utiliza o amido e um substrato fluorogênico 13.2. Método de plaqueamento
como agentes diferenciais. O FGTC pode elevar
APHA 10.5:2015 para
em duas vezes ou mais a recuperação de enteroco-
cos em alimentos, com um período de incubação contagem de enterococos
bem menor (18-24h) do que o do KF (48h). Assim em alimentos
como o KF, ainda não foi testado com as novas
espécies de Enterococcus.
Para a análise de produtos lácteos, o Capítulo 8 da Compendium of Methods for the Microbiological
17ª edição do Standard Methods for the Examina- Examination of Foods (Laird, 2015). Incluídas
tion of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) re- também as recomendações específicas do Capítu-
comenda o plaqueamento em profundidade usan- lo 8 do Standard Methods for the Examination of
do como meio de cultivo o Ágar Citrato Azida, Dairy Products (Frank & Yousef, 2004), para a
com sobrecamada do mesmo meio e incubação análise de produtos lácteos.
a 37 ºC/48-72h. As colônias dos enterococos são Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
coradas de azul, pelo azul de tetrazólio presente orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os
no meio. detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
A contagem pelo método do Número Mais Pro- microrganismos em placas, da seleção das dilui-
vável (NMP) também pode ser utilizada, embora ções ao cálculo dos resultados. O procedimento

descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- 13.2.2. Procedimento

O esquema geral de análise para contagem de en-
terococos em alimento pelo método de plaquea-
mento APHA 10.5:2015 encontra-se descrito na
análise Figura 13.1.
Preparação da amostra e diluições seriadas a) Preparação da amostra e inoculação. Para a
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou preparação da amostra e diluições seriadas, se-
Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) guir as recomendações do Capítulo 2. No caso
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptonada de alimentos desidratados, preparar uma dilui-
0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) ção inicial de 1:1, homogeneizar, manter em
□ Pipetas de 1 ou 2 ml repouso por uma hora sob refrigeração e adicio-
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- nar o restante do diluente, até completar 1:10.
tulo 2 para verificar casos especiais em que o Selecionar três diluições adequadas da amostra
tipo ou volume de diluente variam em função e inocular 1 ml de cada diluição, em profundi-
da amostra analisada. dade, no Ágar KF Streptococcus (KF) ou no
Contagem em placas Ágar Gentamicina Tálio Carbonato Fluoro-
□ Ágar KF Streptococcus (KF) ou Ágar Genta- gênico (FGTC). No caso de produtos lácteos,
micina Tálio Carbonato Fluorogênico (FGTC) utilizar o Ágar Citrato Azida e, depois da so-
□ Ágar Citrato Azida (para produtos lácteos) lidificação, cobrir com uma sobrecamada do
□ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC mesmo meio.
Figura 13.1. Esquema de análise para quantificação de enterococos em alimentos pelo

método de plaqueamento APHA 10.5:2015 (Laird, 2015).

b) Incubação. Aguardar a completa solidificação microrganismos pelo NMP, da seleção das dilui-
do meio e incubar nas seguintes condições: ções ao cálculo dos resultados. O procedimento
▪ Ágar KF: 35±1 ºC/48±2h descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres-
▪ Ágar FGTC: 35±1 ºC/18-24h. supondo que sejam conhecidos pelo analista.
▪ Ágar Citrato Azida: 37±1 ºC/48-72h
c) Contagem de colônias e cálculo dos resulta- 13.3.1. Material requerido para a
dos. No Ágar KF, selecionar placas com 25 a análise
250 colônias e contar apenas as colônias típicas, Preparação da amostra e diluições seriadas
que são vermelhas ou róseas. Determinar o nú- □ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou
mero de UFC/g ou ml multiplicando o número Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
de colônias típicas pelo inverso da diluição. □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptona-
No Ágar FGTC as colônias com halo trans- da 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2
parente (hidrólise do amido) sob luz visível (PB)
e com fluorescência azulada brilhante sob luz □ Pipetas de 1 ou 2 ml
ultravioleta, ondas longas na faixa de 365nm Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí-
(degradação do substrato fluorogênico) são tulo 2 para verificar casos especiais em que o
indicativas de S. bovis. Colônias fluorescentes tipo ou volume de diluente variam em função
sem hidrólise do amido são indicativas de E. da amostra analisada.
faecium e biótipos relacionados. Colônias sem
Contagem pelo NMP
fluorescência e sem hidrólise de amido são in-
□ Caldo KF Streptococcus
dicativas de E. faecalis, E. avium, S. equinus e
outros estreptococos. Para a enumeração total
□ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC
dos enterococos, contar as colônias de todos
os tipos e determinar o número de UFC/g ou
ml multiplicando o número de colônias pelo 13.3.2. Procedimento
inverso da diluição. O esquema geral de análise para contagem de ente-
No Ágar Citrato Azida, selecionar placas com rococos em alimentos pelo método do NMP APHA
25 a 250 colônias e contar apenas as colônias 10.2:2015 encontra-se descrito na Figura 13.2.
típicas, que são azuis. Determinar o número de
a) Preparação da amostra e diluições seriadas.
UFC/g ou ml multiplicando o número de co-
Seguir as recomendações do Capítulo 2. No
lônias típicas pelo inverso da diluição.
caso de alimentos desidratados, preparar uma
diluição inicial de 1:1, homogeneizar, manter
13.3. Método do NMP em repouso por uma hora sob refrigeração e
APHA 10.2:2015 para adicionar o restante do diluente, até completar
1:10.
contagem de enterococos em
b) Inoculação. Inocular três alíquotas de 1 ml
alimentos das três primeiras diluições da amostra, em
O método do NMP é recomendado (mas não des- uma série de três tubos com 10 ml de caldo KF
crito) no Capítulo 10 da 5ª edição do Compendium Streptococcus. Se as contagens esperadas são
of Methods for the Microbiological Examination baixas, inocular alíquotas maiores, seguindo as
of Foods (Laird, 2015). A descrição encontra-se orientações do Capítulo 4.
no Difco & BBL Manual (Zimbro & Power, 2003). c) Incubação. Incubar os tubos a 35±1 ºC/46-48h,
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as com as tampas ligeiramente afrouxadas. Ob-
orientações do Capítulo 4, que apresenta todos os servar se ocorre crescimento com viragem do
detalhes e cuidados envolvidos na contagem de indicador, alterando a cor do meio de roxo para

Figura 13.2. Esquema de contagem de enterococos em alimentos pelo método do NMP APHA 10.2:2015 (Laird, 2015).
amarelo, sem produção de espuma (gás), indi- 13.4. Método de filtração em

cativo de enterococos.
membrana APHA/AWWA/WEF
d) Confirmação. A confirmação só é necessária
se houver produção de espuma. Nesse caso,
9230C.3c:2012 para contagem
verificar a morfologia e coloração de Gram das de enterococos em água
culturas e considerar como enterococos todas
as culturas de cocos Gram positivos em pares Método da 22ª edição do Standard Methods for the
ou pequenas cadeias. Examination of Water and Wastewater (Hunt, 2012).
e) Cálculo dos resultados. Anotar o número de Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
tubos positivos e determinar o NMP/g confor- orientações do Capítulo 3, que apresenta todos
me a orientação do Capítulo 4, usando uma das os detalhes e cuidados envolvidos na contagem
tabelas de NMP. de microrganismos pela técnica da filtração em
membrana. O procedimento descrito abaixo não
apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam
conhecidos pelo analista.

13.4.1. Material requerido para a □ Estufa incubadora regulada a 35±0,5 ºC

análise Confirmação
□ Ágar Infusão Cérebro Coração (BHI)
□ Conjunto de filtração previamente esterilizado
□ Pinças para transferência das membranas,
□ Reagente de catalase
mergulhadas em etanol
de 0,45mm, brancas e quadriculadas
□ Provetas de 100 ml estéreis O esquema geral de análise para contagem de en-
□ Água de diluição (Tampão Fosfato com clore- terococos em água pelo método de filtração em
to de magnésio) membrana APHA/AWWA/WEF 9230C.3.c:2012
□ Placas de Petri com Ágar m-Enterococos encontra-se descrito na Figura 13.3.
Figura 13.3. Esquema de análise para contagem de enterococos em água pelo método de filtração
em membrana APHA/AWWA/WEF 9230C.3.c:2012 (Hunt, 2012).

a) Preparação da amostra e filtração. Seguindo submeter à coloração de Gram e teste de ca-

os procedimentos descritos no Capítulo 3, fil- talase. As culturas Gram positivas (cocos ou
trar 100 ml da amostra em membrana de 47mm bastonetes) catalase negativas são considera-
de diâmetro, porosidade de 0,45mm, brancas e das confirmadas como enterococos ou estrep-
quadriculadas. tococos fecais.
Nota a.1) A filtração de 100 ml da amostra é o procedi- d) Cálculo dos resultados. Considerar como En-
mento padrão para análise de água mineral, na qual
terococcus + Streptococcus fecais as culturas
se espera ausência, sendo esse o volume mínimo exi-
gido pela legislação brasileira. No caso da análise de Gram positivas (cocos ou bastonetes) catalase
águas não destinadas ao consumo humano, nas quais negativas.
a população possa atingir contagens superiores, a téc- Nas situações normais, em que são filtrados
nica de filtração não é a mais recomendada, uma vez
100 ml da amostra, o número total de colônias
que objetiva concentrar os microrganismo. Entretan-
to, na indisponibilidade de outra técnica no labora- na placa não ultrapassou 200 e o número de
tório, pode ser utilizada, selecionando-se o volume colônias típicas manteve-se na faixa recomen-
em função da contaminação estimada na amostra, de dada de 20 a 60, o número de unidades forma-
forma a resultar em placas com contagens na faixa de doras de colônias (UFC)/100 ml da amostra é
20 a 200 colônias. Pode ser feito o fracionamento dos
dado pela fórmula:
100 ml em duas porções de 50 ml, 4 porções de 25 ml
ou 3 porções de 70, 25 e 5 ml, respectivamente, ou, se No colônias confirmadas
UFC/100 ml = N o colônias x
necessário, ser feita a filtração de diluições. típicas No colônias submetidas à
Nota a.2) No preparo de diluições utilizar como diluente confirmação
a água de diluição (Tampão Fosfato com cloreto de
magnésio) e pipetas com capacidade de, no máximo,

Se foi filtrado um volume diferente de 100 ml,
10% dos volumes a serem transferidos. As diluições
podem ser preparadas transferindo-se 10 ml (da considerar o volume no cálculo do resultado.
amostra ou diluição anterior) para 90 ml do diluente Nesse caso, o número de UFC/100 ml é dado
ou 1 ml (da amostra ou diluição anterior) para 9 ml pela seguinte fórmula:
do diluente.
N o colônias N o colônias confirmadas
Nota a.3) Quando o volume a ser filtrado for menor do UFC/100 ml = x
que 20 ml, adicionar ao copo do conjunto de filtra- típicas N o colônias 100/
ção cerca de 20-30 ml de água de diluição (Tampão submetidas x volume
Fosfato com cloreto de magnésio), antes da adição à confirmação filtrado
da amostra. Não é necessária uma medida exata do

volume de tampão, cuja função é aumentar o volume Se não houver desenvolvimento de colônias tí-
a ser filtrado, facilitando uma melhor distribuição dos picas em nenhuma placa, expressar o resultado
microrganismos na membrana.
como ausência ou menor que 1/100 ml.
b) Incubação e contagem das colônias. Transfe- Se nenhuma placa apresentar contagem acima
rir a membrana para uma placa de Ágar m-En- de 20 colônias típicas, utilizar o número obtido
terococos e incubar 35±0,5 ºC/48±4h, inverti- no cálculo do resultado.
da. Contar apenas as colônias típicas (vermelho Se as placas apresentarem mais de 60 colônias
claro ou escuro) e selecionar para contagem as típicas, fazer a contagem desde que o número
placas com número total de colônias inferior a total de colônias na placa não exceda 200.
200 e número de colônias típicas entre 20 e 60. Quando a placa contiver um número de colô-
c) Confirmação: Selecionar cinco colônias típi- nias superior a 200, impedindo a contagem,
cas de cada placa para confirmação e, se hou- relatar o resultado como presença ou ausência,
ver menos de cinco, selecionar todas. Inocular dependendo da presença de colônias típicas
(estrias de esgotamento) cada colônia em uma confirmadas.
placa de Ágar Infusão Cérebro Coração (BHI) Nota d.1) Os resultados obtidos não diferenciam os
e incubar a 35±0,5 ºC por 24±2h a 48±4h. A membros do gênero Enterococcus e os membros do
partir de uma colônia bem isolada do BHI, gênero Streptococcus.

13.5. Método de □ Estufa incubadora regulada a 36±2 ºC

□ Estufa incubadora regulada a 44±0,5 ºC
filtração em membrana
ISO 7899-2:2000 para
contagem de enterococos
O esquema geral de análise para contagem de en-
em água
terococos em água pelo método de filtração em
Método da International Organization for Standar- membrana ISO 7899-2:2000 encontra-se descrito
dization (ISO 7899-2:2000) para contagem de en- na Figura 13.4.
terococos em água. Segundo a norma, Enterococ- a) Preparação da amostra, filtração e incu-
cus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus bação. Seguindo os procedimentos descritos
durans e Enterococcus hirae são as espécies nor- no Capítulo 3, filtrar um volume adequado
malmente detectadas por este método, mas outras da amostra em filtro membrana de 0,45mm.
espécies de Enterococcus e algumas espécies de Transferir a membrana para uma placa de Ágar
Streptococcus (S. bovis e S. equinus) podem ser m-Enterococos e incubar a placa, invertida, a
ocasionalmente detectadas. Esses Streptococcus 36±2 ºC/44±4h.
não sobrevivem por muito tempo na água e pro- Nota a.1) A filtração de 100 ml da amostra é o procedi-
vavelmente não serão quantificados. O objetivo mento padrão para análise de água mineral, na qual
da norma é a detecção dos enterococos indicado- se espera ausência, sendo esse o volume mínimo exi-
gido pela legislação brasileira. No caso da análise de
res de contaminação fecal, ainda que espécies de
águas não destinadas ao consumo humano, nas quais
origem não fecal também possam estar presentes a população possa atingir contagens superiores, se-
na água. O escopo principal do método é a análise lecionar o volume em função da contaminação esti-
de água de consumo humano (potável) e a água mada na amostra, de forma a resultar em placas com
de piscinas, mas pode ser aplicado a qualquer tipo contagens na faixa de 10 a 200 colônias. Pode ser
feito o fracionamento dos 100 ml em duas porções
de água que não contenha material em suspensão. de 50 ml, 4 porções de 25 ml ou 3 porções de 70, 25
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as e 5 ml, respectivamente, ou, se necessário, ser feita a
orientações do Capítulo 3, que apresenta todos filtração de diluições.
os detalhes e cuidados envolvidos na contagem
b) Confirmação das colônias. Selecionar placas
de microrganismos pela técnica da filtração em
com 10 a 200 colônias e verificar a presença
membrana. O procedimento descrito abaixo não
de colônias típicas, que são aquelas com uma
apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam
coloração vermelha, marrom ou pink no cen-
conhecidos pelo analista.
tro ou em toda a massa de células. Havendo
colônias típicas, transferir a membrana para
13.5.1. Material requerido para a uma placa de Ágar Bile Esculina Azida (sem
análise inverter). Incubar as placas a 44±0,5 ºC/2h e
□ Conjunto de filtração previamente esterilizado ler imediatamente. Considerar como enteroco-
□ Pinças para transferência das membranas, cos as colônias típicas que apresentarem escu-
mergulhadas em etanol recimento do meio em seu redor (cor castanha
□ Membranas de porosidade de 0,45μm a preta) devido à hidrólise da esculina.
□ Diluente (Solução Salina 0,85%, Tampão Fosfa- c) Cálculo dos resultados. Contar as colônias
to ou Água Peptonada Tamponada) se necessário confirmadas e relatar como UFC/volume fil-
□ Placas de Ágar m-Enterococos trado. Para cálculo em situações não usuais,
□ Placas de Ágar Bile Esculina Azida seguir as orientações do capítulo 3.

Figura 13.4. Esquema de análise para contagem de enterococos em água pelo

método de filtração em membrana ISO 7899-2:2000.

13.6. Referências
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14 Contagem de bactérias lácticas
Item 14.1 (revisado) Taxonomia atualizada.
Item 14.4 (novo) Inserido Método de plaqueamento ISO15214:1998 para contagem de bactérias lácticas em ali-
mentos.
14.1. Introdução (L. carnis, L. divergens e L. piscicola). São de-

teriorantes de alimentos de origem animal e de
Bactérias lácticas são um grupo que tem como pescados, isolados predominantemente de embu-
principal característica a fermentação de car- tidos cárneos embalados à vácuo refrigerados. As
boidratos com produção de ácido láctico. Origi- espécies predominantemente isoladas de carnes e
nalmente, esse grupo incluia quatro gêneros de produtos cárneos são Carnobacterium divergens
grande importância em alimentos: Lactobacillus, e Carnobacterium maltaromaticum, que provo-
Leuconostoc, Pediococcus e Streptococcus. Gra- cam descoloração, acidificação e odor estranho,
dativamente, esses gêneros foram subdivididos atingindo carne não processada, presunto cozido,
nos novos gêneros Carnobacterium, Enterococ- lombo de porco defumado, salsichas e carne de
cus, Fructobacillus, Lactococcus, Oenococcus, aves. Carnobacterium viridans provoca esverdea-
Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella, cujas mento em salsichas. Carnobacterium gallinarum
principais características encontram-se sumaria- e Carnobacterium mobile são encontrados em
das no Quadro 14.1. carne de aves. Queijos são um grande reservatório
Todas são Gram positivas, não esporogênicas, de carnobactérias e Carnobacterium maltaroma-
anaeróbias facultativas, catalase e oxidase nega- ticum provoca odor de malte em leite. O intestino
tivas. O metabolismo de carboidratos pode ser e as guelras de peixes são habitat dessas bacté-
homofermentativo, resultando primordialmente rias e algumas cepas de C. maltaromaticum (an-
em ácido láctico, ou heterofermentativo, resul- teriormente classificadas como “Carnobacterium
tando em ácido láctico, CO2 e outros produtos de piscicola”) são patogênicas para peixes. Carno-
fermentação. As exigências nutricionais são com- bacterium inhibens e Carnobacterium divergens
plexas, a maioria dependendo da presença de vi- são comumente associados com peixes saudáveis
taminas, carboidratos e outros fatores para o cres- marinhos e de água doce. Carnobacterium malta-
cimento. Acetato e tween 80 são estimuladores do romaticum, Carnobacterium divergens e Carno-
crescimento para a maioria, sendo normalmente bacterium mobile também são associados à frutos
adicionados aos meios de isolamento. do mar embalados à vácuo ou em atmosfera mo-
dificada.
Carnobacterium Collins et al. 1987
Descrição do gênero feita por Hammes & Hertel
Informações: Hammes & Hertel (2009a). Atuali- (2009a): Bastonetes Gram positivos não esporo-
zação da nomenclatura: Euzéby (2016). Esse gê- gênicos, finos, retos ou ligeiramente arqueados,
nero foi criado em 1987, para acomodar espécies isolados, aos pares ou em pequenas cadeias. Mó-
anteriormente classificadas como Lactobacillus veis ou imóveis. São muito semelhantes aos Lac-

Quadro 14.1. Principais características das bactérias lácticas associadas com alimentos (referências
citadas entre parênteses).
Característica Carnobacterium Enterococcus Fructobacillus Lactococcus Lactobacillus
Maioria bastonetes
Morfologia Bastonetes (6) Cocos (6) Bastonetes (6) Cocos (6)
mas há cocobacilos (6)
Gram + (6) + (6) + (6) + (6) + (6)
Motilidade d (1) d (3) - (6) - (3) d (1)
Catalase - (6) - (6) - (6) - (6)
Temperatura ótima ( ºC) 35-37 (6) 30 (6) 30-40 (6)
pH ótimo 6,8-9,0 (6) 6,5 (6) 5,5-6,2 (6)
Crescimento a 10 ºC + (6) + (3) + (3)
Crescimento a 15 ºC + (1) + (6) d (1)
Crescimento a 45 ºC - (1) + (3) - (3) a d (1)
Crescimento em pH 4.5 + (6)
Crescimento em pH 5.0 + (6) + (6)
Crescimento em pH 9.0 + (6)
Crescimento em pH 9.6 + (6) d, e - -
Crescimento em 6.5% NaCl + (3) + (6) d (3)
Crescimento em 40% bile + (6) d, e +/-
CO2 a partir de glicose d (1) - (3) + (6) - (3) + ou - (6)
PYR (pirrolidonil arilamidase) + (3) + (3)
LAP (leucine arilamidase) + (3) + (3)
ADH (arginine dehydrolase) + (4) + ou - (6) + ou - (6)
Teste de bile esculina + (5) + (5) e
Hidrólise da esculina + ou -
Sensibilidade à vancomicina S (3) S (3)
Crescimento em Ágar Acetato - (1) + (7) + (6) + (6) + (1)
Formação de dextrana a partir de sacarose - (4) maioria - (4)
Redução do nitrato - (6) pouco comum
Característica Leuconostoc Pediococcus Streptococcus Tetragenococcus Weissella
Cocos, cocobacilos
Morfologia Cocos (6) Cocos (6) Cocos (6) Cocos (6)
ou bastonetes (6)
Gram + (6) + (6) + (6) + (6) + (6)
Motilidade - (1,3) - (3) - (3) - (6) - (1)
Catalase - (6) - (6) - (6) - (6) - (6)
Temperatura ótima ( ºC) 20-30 (6) 25-35 (6) 37 (6) 25-35 (6)
pH ótimo 7,0-8,0 (6)
Crescimento a 10 ºC + (3) - (3) - (3) - (6) +/- (5)
Crescimento a 15 ºC + ou - (6) + (1)
Crescimento a 45 ºC d (3) + (3) d (3) - (6) d (1)
Crescimento em pH 4.5 pode ocorrer (6) + (6) - (6)
Crescimento em pH 5.0 + (6) + (2) - (2)
Crescimento em pH 9.0 - (2) + (2)
Crescimento em pH 9.6 +/- +/-
Crescimento em 6.5% NaCl d (3) d (3) - (3)b + (6) + (5)
Crescimento em 40% bile +/- +/-
CO2 a partir de glicose + (1,3) - (3) - (3) - (6) + (1)
PYR (pirrolidonil arilamidase) - (3) - (3) - (3)c - (5) - (5) d
LAP (leucine arilamidase) - (3) + (3) + (3) + (5) - (5) d
ADH (arginine dehydrolase) - (4) maioria - (4) - (6) maioria + (4)
Teste de bile esculina +/- (5) + (5) +/- (5) + (5)
Sensibilidade à vancomicina R (3) R (3) S (3) S (5) R (5) d
Crescimento em Ágar Acetato + (6) + (6) + (6) + (6) f + (6)
Formação de dextrana a partir de sacarose maioria - (4) - (4) maioria - (4)
Redução do nitrato - (6) - (6) - (6)
Símbolos: Usados nas referências 1 e 3 citadas entre parênteses, +, >85% das cepas positivas; d, varia entre as cepas (16-84% positive); -, 0-15% das cepas
positivas. As referências 1, 4, 5 e 6 não relatam a porcentagem de cepas que apresentam o resultado + ou -.
Referências citadas entre parênteses: 1) Tabela 87 de Leiner & Vancanneyt (2009); 2) Tabela 89 de Holzapfel, Frans et al. (2009); 3) Tabela 93 de Ezaki &
Kawamura (2009); 4) Tabela 121 de Holzapfel et al. (2009); 5) Tabela de Euzéby (2006); 6) dado obtido das referências citadas na descrição do gênero.
a b
Algumas cepas crescem lentamente a 45oC. Alguns estreptococos b-hemolíticos crescem em 6.5% de NaCl.
c d
Há cepas de Streptococcus pyogenes que apresentam atividade. Característica não verificada para todas as espécies.
e f
Com algumas exceções. Com o pH ajustado em 7.0 e a concentração de NaCl ajustada em 4-6%.

Contagem de bactérias lácticas □ 211
tobacillus, mas, ao contrário desses, não crescem bastonetes, o que difere dos membros do gênero
em meios ricos em acetato, como o Caldo ou o Leuconostoc sensu stricto, que são cocóides ou
Ágar Rogosa SL (que contém 2,5% de acetato de alongadas. Fructobacillus são encontrados em
sódio). O Ágar MRS (De Man Rogosa & Sharpe) frutos, flores e em alimentos fermentados deriva-
sem acetato é uma opção favorável ao isolamento, dos de frutas com alto teor de D-frutose, o que
com a formação de colônias de 0,5 a 2mm. Não sugere uma adaptação a esses ambientes.
acidúricos, são favorecidos em pH neutro ou al- Descrição do gênero feita por Endo & Okada
calino (6,8 a 9,0) e o uso de meios com pH 8,0 a (2008): Bastonetes Gram positivos não esporo-
9,0 previne o crescimento de lactobacilos acom- gênicos, isolados, aos pares ou em pequenas ca-
panhantes na análise de alimentos. Não crescem deias, imóveis. Anaeróbios facultativos, crescem
em 8% de NaCl. Psicrotróficos, a maioria cresce ativamente usando D-frutose como substrato, mas
a 0 ºC mas não a 45 ºC. Catalase e oxidase nega- pobremente usando D-glicose. Heterofermentati-
tivos (algumas espécies apresentam atividade de vos, produzem ácido láctico, CO2 e ácido acético
catalase na presença de heme). Anaeróbios facul- a partir da glicose, frutose e alguns outros poucos
tativos, heterofermentativos atípicos, produzem carboidratos. Não produzem etanol. Não reduzem
ácido láctico a partir da glicose, frequentemente o nitrato. A temperatura ótima é de aproximada-
sem CO2, mas o CO2 pode ser produzido depen- mente 30 ºC e o pH ótimo é de aproximadamente
dendo do substrato. Uma espécie, Carnobacte- 6,5. Xerotolerantes, crescem em 5% de NaCl e
rium pleistocenium produz etanol, ácido acético 40% de D-frutose, pobremente em 7,5% de NaCl
e CO2 a partir de carboidratos, mas não produz e 50% de futose.
ácido láctico. Assim, a definição de bactéria lácti-
ca não se aplica a esta espécie. Lactobacillus Beijerinck 1901
emend. Cai et al. 2012
Enterococcus (ex Thiercelin & Jouhaud
Informações: Hammes & Hertel (2009b). Atuali-
1903) Schleifer & Kilpper-Bälz 1984
zação da nomenclatura: Euzéby (2016).
Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016). É um dos gêneros originais de bactérias lácticas e
Este gênero foi criado em 1984 para acomodar os várias espécies de importância em alimentos fo-
anteriormente chamados “estreptococos fecais” do ram reclassificadas nos novos gêneros Carnobac-
grupo serológico de Lancefield D, que têm o trato terium e Weissella. São bactérias extremamente
intestinal como seu habitat natural e ocorrem em úteis, muitas delas reconhecidas como probióti-
grandes quantidades nas fezes de humanos e ou- cas, incluindo Lactobacillus acidophilus, Lacto-
tros animais. Para maiores informações sobre sua bacillus rhamnosus e Lactobacillus casei. Nos
importância em alimentos e descrição do gênero alimentos, podem ser utilizadas como coadjuvan-
consulte o capítulo específico para enterococos. tes de fabricação de inúmeros produtos fermenta-
dos: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Fructobacillus Endo & Okada 2008
é utilizado como fermento láctico na produção de
Informações: Endo & Okada 2008. Atualização iogurtes e leites fermentados. Lactobacillus hel-
da nomenclatura: Euzéby (2016). veticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis e
Este gênero foi criado para acomodar quatro espé- Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, em
cies previamente classificadas como Leuconostoc combinação com Streptococcus thermophilus,
(L. durionis, L. ficulneum, L. fructosum e L. pseu- são utilizados como fermento na produção de
doficulneum). Essas espécies foram consideradas queijos. Lactobacillus brevis, Lactobacillus plan-
atípicas no gênero Leuconostoc em função de suas tarum, Lactobacillus curvatus e Lactobacillus
características bioquímicas e/ou sua posição filo- sakei são associados à fermentação de chucrute e
genética determinada na análise da sequência do pepinos. Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
gene do rRNA 16S. Além disso, suas células são sakei, Lactobacillus curvatus, em associação com

Staphylococcus e Micrococcus, são utilizados Lactococcus Schleifer et al. 1986

como fermento na fabricação de produtos cárne-
os fermentados. Em contraste, também são dete- Informações: Teuber (2009). Atualização da no-
riorantes de produtos ácidos, incluindo maionese menclatura: Euzéby (2016).
e outros molhos para saladas, produtos vegetais, Esse gênero foi criado em 1986 para acomodar
sucos de frutas, refrigerantes cervejas, vinhos e espécies anteriormente classificadas como Strep-
outros alimentos. Lactobacilos também fazem tococcus (S. lactis, S. raffinolactis, S. cremoris,
parte da flora normal da boca, trato intestinal e S. garvieae, S. plantarum) e Lactobacillus (L.
vagina de humanos e outros animais. Não são pa- hordniae e L. xylosus). São bactérias extrema-
togênicos. mente úteis, isolados predominantemente de leite
Descrição do gênero feita por Hammes & Hertel e produtos lácteos, onde ocorrem naturalmente.
(2009b) e Haakensen et al. (2009): Gram positi- Também são encontrados naturalmente na pas-
vos não esporogênicos, imóveis com raras exce- tagem, nos equipamentos de ordenha, no úbere,
ções. A morfologia da maioria das espécies é de na saliva e na pele do gado leiteiro. Lactococcus
bastonetes de diversos tamanhos, mas o formato lactis subsp. cremoris e Lactococcus lactis subsp.
de cocobacilos ocorre em várias espécies (as cé- lactis são utilizados como fermento na produção
lulas de Lactobacillus dextrinicus, anteriormen- de vários produtos lácteos fermentados. Várias
te “Pediococcus dextrinicus” são cocos). Várias cepas produzem bacteriocinas (peptídeos com
espécies apresentam uma mistura de bastonetes ação antibacteriana sobre bactérias estreitamente
curtos e longos como é o caso de Lactobacillus relacionadas). A bacteriocina mais conhecida é a
fermentum e Lactobacillus brevis. As colônias nisina, produzida por Lactococcus lactis subsp.
em meios sólidos geralmente são pequenas, com lactis, com ação sobre uma vasta gama de bac-
margens perfeitas, não pigmentadas ou, em raros térias Gram-positivas. Em contraste, Lactococ-
casos, amareladas ou avermelhadas. Em meios cus piscium é deteriorante de carnes refrigeradas
líquidos o crescimento se dá por todo o líquido, embaladas a vácuo. Quanto à patogenicidade, em
mas as células sedimentam assim que a multipli- raras ocasiões Lactococcus lactis foi isolado de
cação cessa. O sedimento é liso e homogêneo, ra- casos humanos de infecção do trato urinário, in-
ramente granular ou gomoso. Catalase e oxidase fecção de feridas e pacientes com endocardite.
negativos (algumas espécies apresentam ativida- Descrição do gênero feita por Teuber (2009): Co-
de de catalase ou pseudo catalase em meios con- cos Gram positivos não esporogênicos, isolados,
tendo sangue). A reação de benzidina é negativa. aos pares ou em cadeias, imóveis. Os cocos fre-
Anaeróbios facultativos, o crescimento é acen- quentemente são levemente alongados na direção
tuado em atmosfera anaeróbia ou microaerófila. das cadeias. As colônias em Ágar Elliker ou M17
Podem ser homofermentativos (produzindo dois são pequenas, lisas, circulares com margens per-
moles de ácido láctico por mol de hexose) ou he- feitas. Catalase negativos, quimio-organotróficos,
terofermentativos (produzindo ácido láctico, CO2 apresentam requerimentos nutricionais comple-
e etanol ou ácido acético a partir de hexoses). xos, requerendo aminoácidos, ácidos graxos, de-
Os requerimentos nutricionais são complexos, rivados de ácidos nucleicos, vitaminas e carboi-
exigindo aminoácidos, peptídeos, ácidos graxos, dratos fermentáveis para crescimento. Anaeróbios
derivados de ácidos nucleicos, vitaminas, sais e facultativos, microaerófilos, homofermentativos.
carboidratos fermentáveis para crescimento. A Mesófilos, crescem entre 10 e 40 ºC, alguns tam-
temperatura ótima é de 30 a 40 ºC e a faixa de bém a 7 ºC sob incubação prolongada (10 a 14
crescimento é de 2 ºC a 53 ºC. Acidúricos, o pH dias). Lactococcus picium cresce a 5 ºC e a 30 ºC,
ótimo é de 5,5 a 6,2, crescendo em pH 5,0 ou me- mas não a 40 ºC. O pH ótimo é neutro e o mínimo
nor e tendo a velocidade de crescimento reduzida está por volta de 4,5. Geralmente crescem em 4%
em pH neutro ou alcalino. de NaCl (exceto Lactococcus lactis subsp. cremo-

ris) mas não em 6,5. A maioria pertence ao grupo Descrição do gênero feita por Holzapfel et al.
sorológico N de Lancefield. (2009): Cocos Gram positivos elipsoidais a esfé-
ricos, frequentemente alongados, usualmente aos
Leuconostoc van Tieghem 1878
pares ou em pequenas cadeias, imóveis, não es-
Informações: Holzapfel et al. (2009). Atualização porogênicos. Quimio-organotróficos, anaeróbios
da nomenclatura: Euzéby (2016). facultativos, crescem melhor em condição micro-
É um dos gêneros originais de bactérias lácticas aerófila a anaeróbia. Apresentam requerimentos
e algumas espécies de importância em alimentos nutricionais complexos, requerendo meios ricos
foram reclassificadas nos novos gêneros Oenococ- e um carboidrato fermentável para crescimento.
cus e Weissella. Nos alimentos podem ser encon- Heterofermentativos, produzem ácido láctico,
trados como deteriorantes ou como coadjuvantes CO2 e etanol a partir da glicose. Catalase e oxida-
de fabricação de produtos fermentados. Leuco- se negativos. A temperatura ótima é de 20 a 30 ºC,
nostoc mesenteroides subsp. cremoris e Leuco- com mínimo de 5 ºC para a maioria das espécies.
nostoc lactis são frequentemente incorporados Cepas isoladas de carne podem crescer em tempe-
como fermento em produtos lácteos fermentados. raturas mais baixas, como Leuconostoc gasicomi-
Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, tatum, que cresce a 4 ºC e Leuconostoc carnosum
embora não seja a espécie dominante, exerce um e Leuconostoc gelidum, que crescem a 1 ºC. Não
papel importante no início da fermentação de chu- acidofílicos, podem crescer em pH 4,5, mas pre-
crute e pepinos fermentados. Leuconostoc fallax ferem meios com pH inicial de 6,5.
também está envolvido nos primeiros estágios da
Oenococcus Dicks et al. 1995
fermentação de chucrute. Leuconostoc citreum,
emend. Endo & Okada 2006
Leuconostoc gelidum, Leuconostoc kimchi e Leu-
conostoc mesenteroides dominam os estágios ini- Informações: Dicks & Holzapfel (2009). Atuali-
ciais da fermentação do “kimchi” (um prato corea- zação da nomenclatura: Euzéby (2016).
no feito de couve, rabanete e pepino fermentados). Esse gênero foi criado em 1995 para acomodar
Leuconostoc mesenteroides subesp. mesenteroides uma única espécie, Oenococcus oeni, anterior-
e subsp. dextranicum estão associados à produção mente classificada como “Leuconostoc oenos” (o
de “tapai” (arroz ou mandioca doces fermenta- nome específico foi corrigido). Quando o gênero
dos). Leuconostoc mesenteroides subsp. mesen- foi criado as características fenotípicas que dis-
teroides também está envolvido na fermentação tinguiam Oenococcus oeni dos leuconostocs era
submersa de grãos de café. Em sucos de frutas, sua natureza acidofílica (O. oeni cresce em pH
ao contrário, os leuconostocs são deteriorantes, 3,5-3,9 com ótimo em 4,8, enquanto Leuconostoc
provocando alteração do sabor, devido à produção não cresce em condições tão ácidas), a exigência
de acetoína e diacetil. Também participam da de- de um fator de crescimento presente no suco de
terioração de diversos tipos de produtos cárneos tomate (um glico derivativo do ácido pantotê-
(embutidos, embalados à vácuo ou em atmosferas nico que Leuconostoc não exige) e a resistência
modificadas), provocando limosidade superficial ao álcool (cresce na presença de 10% de etanol,
e aroma de fermentado. Leuconostoc carnosum e enquanto Leuconostoc não cresce). Posterior-
Leuconostoc gelidum são deteriorantes de presun- mente duas novas espécies de Oenococcus foram
to fatiado embalado à vácuo, onde provocam pon- descritas, que não apresentam todas essas carac-
tos de coloração amarela. Na produção de açúcar, terísticas típicas. Oenococcus oeni é encontrado
Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides quase que exclusivamente em mosto de uva, em
provoca perda de rendimento, consumindo até 5% vinho e em cidra. Esta espécie tem um papel im-
da sacarose da cana por dia, entre a colheita e o portante na manufatura de certos tipos de vinho,
processamento. Também produz a goma dextrana, nos quais converte ácido málico em ácido láctico
que interfere nas etapas de refino. (fermentação maloláctica). Este tipo de fermenta-

ção secundária contribui para o desenvolvimento pediococos compartilham o mesmo habitat de

do flavor e textura de vinhos com baixo pH. Em outras bactérias lácticas, principalmente Lactoba-
outros tipos de vinho, ao contrário, é indesejável cillus, Leuconostoc e Weisella. Algumas espécies
porque resulta em alteração do aroma e sabor, são naturalmente associadas à plantas e frutas.
bem como na criação de condições favoráveis à Nos alimentos podem ser encontrados como dete-
multiplicação de outros tipos de bactérias deterio- riorantes ou como coadjuvantes de fabricação de
rantes. Oenococcus kitaharae foi isolado a partir produtos fermentados. Pediococcus acidilactici,
da compostagem do resíduo de “shochu”, uma Pediococcus pentosaceus, Pediococcus parvulus,
bebida alcoólica japonesa destilada, produzida a Pediococcus inopinatus e Pediococcus dextrini-
partir de arroz, batata doce, cevada e outros mate- cus são associados à fermentação de chucrute, pe-
riais amiláceos. Oenococcus alcoholitolerans foi pinos, azeitonas, ensilagens de forragem e outros
isolado de cachaça e do processo de fermentação produtos de origem vegetal. Em vários países da
usado na produção de álcool Ásia são adicionados a substratos ricos em amido,
Descrição do gênero feita por Dicks & Holzap- para a produção de bebidas alcoólicas. Em produ-
fel (2009): Cocos Gram positivos elipsoidais a tos cárneos como linguiças curadas, Pediococcus
esféricos, usualmente aos pares ou em pequenas acidilactici e Pediococcus pentosaceus também
cadeias, imóveis, não esporogênicos. Quimio-or- parecem participar do processo de fermentação e
ganotróficos, anaeróbios facultativos, apresentam maturação. Pediococcus damnosus é associado à
requerimentos nutricionais complexos, requeren- deterioração de cervejas e vinhos. Algumas cepas
do meios ricos com aminoácidos, fatores de cres- de pediococos têm sido associadas à infecções
cimento complexos e, dependendo da espécie, em humanos e podem ser consideradas patógenos
suco de tomate, suco de uva, ácido pantotênico ou oportunistas.
ácido 4’-O-(b-glicopiranosil)-D-pantotênico. He- Descrição do gênero feita por Holzapfel, Frans et
terofermentativos, produzem ácido láctico, CO2 al. (2009): Cocos Gram positivos não esporogêni-
e etanol ou acetato partir da glicose. Catalase e cos, isolados, aos pares ou em tétrades (grupo de
oxidase negativos. Microaerófilos, o crescimento quatro células), imóveis. Pediococcus e Tetrage-
superficial é favorecido em atmosfera com 10% nococcus são as únicas bactérias lácticas cujas cé-
de CO2. As colônias geralmente só se desenvol- lulas se dividem em dois planos perpendiculares,
vem com cinco dias de incubação e são pequenas formando arranjos em pares e em tétrades, mas
(menos de 1mm). Dependendo da espécie podem nunca em cadeias. As células são perfeitamente
ser acidofílicos (preferindo pH inicial de 4,8 para esféricas e raramente ovóides, ao contrário do que
crescer) ou não acidofílicos (crescendo em pH 5,0 se observa em outras bactérias láticas na forma
a 7,5, com ótimo em 6,0-6,8). A faixa de tempera- de cocos, como Leuconostoc, Lactococcus e En-
tura de crescimento é de 20 a 30 ºC. Resistentes ao terococcus. Quimio-organotróficos, anaeróbios
álcool, crescem em 5% de etanol e, dependendo facultativos, homofermentativos, produzem áci-
da espécie, também em 10%. do láctico sem CO2 a partir da glicose. Catalase
e oxidase negativos (há relatos de que algumas
Pediococcus Claussen 1903
cepas de Pediococcus pentosaceus produzem ca-
Informações: Holzapfel et al. (2005) e Holzapfel, talase ou pseudo catalase). Não reduzem o nitrato.
Frans et al. (2009). Atualização da nomenclatura: A temperatura ótima é de 25 a 35 ºC, dependendo
Euzéby (2016). da espécie. Crescem em pH 4,5 mas não em 9,0.
Pediococcus é um dos gêneros originais de bac-
térias lácticas mas uma espécie foi reclassificada Streptococcus Rosenbach 1884
no novo gênero Tetragenococcus (T. halophilus), Informações: Hardie (1986) e Whiley & Hardie
uma no gênero Lactobacillus (L. dextrinicus) e (2009). Atualização da nomenclatura: Euzéby
uma no gênero Aerococcus (A. urinaeequi). Os (2016).

Streptococcus é um dos gêneros originais de e bioquímicas dos tetragenococos são as mesmas

bactérias lácticas, mas a maioria das espécies de dos pediococos, dos quais são diferenciados prin-
importância em alimentos foram reclassificadas cipalmente pela tolerância ao sal (crescem em con-
nos novos gêneros Enterococcus e Lactococcus. centrações maiores do que 10% de NaCl e Tetra-
Uma espécie, Streptococcus thermophilus, é am- genococcus halophilus cresce em mais de 18%).
plamente utilizada como fermento láctico na pro- Também são menos tolerantes à acidez do que os
dução de iogurtes, leites fermentados e queijos. pediococos, crescendo em valores mais altos de
Streptococcus uberis e Streptococcus dysgalac- pH mas não em pH 4,5 ou menor Estão envolvidos
tiae provocam mastite em gado leiteiro, contamina fermentação láctica de alimentos como molhos
nando o leite cru (Lafarge et al., 2004). As espé- de soja fermentado, “shottsuru” (molho de peixe
cies do grupo “bovis” são habitantes normais do fermentado), “kimchi” (vegetais fermentados) e
trato intestinal de bovinos e equinos, respectiva- outros fermentados com alto teor de sal.
mente, sendo consideradas “estreptococos fecais” Descrição do gênero feita por Dicks et al. (2009):
e apresentando várias características em comum Cocos Gram positivos não esporogênicos, imó-
com os Enterococcus (vide capítulo específico de veis. Ocorrem isolados, aos pares ou, caracteris-
Enterococcus). ticamente, dividem-se em dois planos perpendi-
Descrição do gênero feita por Whiley & Har- culares formando tétrades (grupo de quatro cé-
die (2009): Cocos esféricos ou ovóides, Gram lulas). As células são perfeitamente esféricas e
positivos não esporogênicos, imóveis, ocorren- ocasionalmente ovóides. Quimio-organotróficos,
do aos pares ou em cadeias quando crescem em anaeróbios facultativos, homofermentativos, pro-
meios líquidos. Normalmente não pigmentados duzem ácido láctico sem CO2. Catalase e oxidase
(Streptococcus agalactiae é amarelo, laranja ou negativos. A temperatura ótima varia entre 25 e 35
vermelho). Quimio-organotróficos, apresentam ºC e não crescem a 10 nem a 45 ºC. Levemente al-
requerimentos nutricionais complexos. Anaeró- calofílicos, o pH ótimo é de 7,0-8,0 e não crescem
bios facultativos, algumas espécies exigem CO2 em pH 4,5. Moderadamente halofílicos, crescem
adicional para crescimento (condição microaeró- em concentrações de NaCl entre 4 e 18%, com
fila). Homofermentativos, produzem ácido láctico ótimo entre 5 e 10%. A maioria também cresce em
sem CO2 a partir da glicose. Catalase negativos. 1% e em 25% de NaCl.
Geralmente produzem leucina arilamidase (LAP)
Vagococcus Collins et al. 1990
e não produzem pirrolidonil arilamidase (PYR).
A temperatura ótima é de 37 ºC, com máxima e Informações: Collins (2009). Atualização da no-
mínima variando entre as espécies. Streptococcus menclatura: Euzéby (2016):
thermophilus é termodúrico, sobrevive à pasteuri- Esse gênero foi criado para acomodar, inicialmen-
zação clássica (60 ºC/30min), cresce rapidamente te, uma nova espécie de bactéria, com todas as ca-
a 45 ºC e não cresce a 15 ºC. racterísticas de Lactococcus, porém, móvel com
flagelos peritríquios (Vagococcus fluvialis). Essa
Tetragenococcus Collins et al. 1993
espécie, originalmente isolada de fezes de fran-
Informações: Dicks et al.(2009). Atualização da gos e de água doce, mais tarde foi encontrada em
nomenclatura: Euzéby (2016): diversas outras fontes, podendo ser um patógeno
Esse gênero foi criado em 1993 para acomodar oportunista para humanos e animais. Outras novas
uma espécie halofílica (Tetragenococcus halo- espécies foram descobertas posteriormente, isola-
philus) anteriormente classificada como Pedio- das de diversos ambientes. Várias causam doen-
coccus. Novas espécies foram posteriormente des- ças em peixes. Vagococcus carniphilus foi isolado
cobertas e uma espécie anteriormente classificada de carne bovina. Vagococcus penaei foi isolado da
como Enterococcus (E. solitarius) foi também microbiota de camarão cozido deteriorado. A pa-
alocada no gênero. As características morfológicas togenicidade dessas bactérias, sua participação no

desenvolvimento de doenças ou sua importância cocobacilos ou cocos ovais, Gram positivos, não
em alimentos ainda são pouco conhecidas. esporogênicos, isolados, aos pares ou em peque-
Descrição do gênero feita por Collins (2009): nas cadeias. Pode ocorrer pleomorfismo em cepas
Cocos ovóides, Gram positivos não esporogêni- de algumas espécies como Weissella minor. Imó-
cos, isolados, aos pares ou em pequenas cadeias, veis com exceção de Weissela beninensis. Qui-
móveis (a maioria) ou imóveis. Não pigmenta- mio-organotróficos, anaeróbios facultativos, apre-
dos. Anaeróbios facultativos, homofermentativos, sentam requerimentos nutricionais complexos, re-
produzem ácido láctico mas não CO2 a partir da querendo aminoácidos, peptídeos, ácidos graxos,
glicose e outros carboidratos. Catalase negati- derivados de ácidos nucleicos, vitaminas e um
vos. Não reduzem o nitrato. Crescem a 10 mas carboidrato fermentável para crescimento. Hete-
não a 45 ºC. Algumas cepas crescem em pH 9,6 rofermentativos, produzem ácido láctico, CO2 e
e outras não. Geralmente não crescem em 6,5% etanol ou ácido acético a partir da glicose. Catala-
de NaCl. Produzem leucina arilamidase (LAP) se e oxidase negativos. A faixa de temperatura de
e pirrolidonil arilamidase (PYR). Não produzem crescimento é de 15 a 42-45 ºC. Acidúricos.
arginina dehidrolase e beta glicuronidase. Não
Comentários sobre os métodos de
hidrolizam o hipurato. Sensíveis à vancomicina. análise
Provocam alfa hemólise em ágar sangue de car-
neiro ou cavalo. Alguns reagem com o antisoro do A contagem de bactérias lácticas apresentada nes-
grupo sorológico N de Lancefield, outros reagem se capítulo objetiva quantificar todas as bactérias
fracamente com o grupo D, outros não reagem a do grupo, sem diferenciação entre os gêneros. Os
qualquer grupo. meios de cultura utilizados são especialmente for-
mulados para garantir o crescimento das espécies
Weissella Collins et al. 1994 mais exigentes. A incubação normalmente é feita
emend. Padonou et al. 2010 em condições microaerófilas, para recuperar as
Informações: Björkroth et al. (2009). Atualização espécies mais sensíveis ao oxigênio.
da nomenclatura: Euzéby (2016). Para a contagem de bactérias lácticas em alimen-
Esse gênero foi criado em 1994, para acomodar tos em geral a ISO 15214:1998 recomenda o pla-
espécies anteriormente classificadas como Leuco- queamento em profundidade, utilizando o Ágar
nostoc (L. paramesenteroides) e Lactobacillus (L. de Man Rogosa & Sharpe (MRS) como meio de
confusus, L. halotolerans, L. kandleri, L. minor e cultivo. A incubação é feita a 30 ºC/72h, indica-
L. viridescens). Nos alimentos podem ser encon- da para a contagem de mesófilos, em atmosfera
tradas como deteriorantes ou como coadjuvantes anaeróbia ou microaerófila.
de fabricação de produtos fermentados. Weissella Para a contagem total de bactérias lácticas em
cibaria, Weissella confusa e Weissella koreensis produtos lácteos, fermentados ou não, o Capítu-
são associadas à fermentação de alimentos de lo 8 do Standard Methods for the Examination of
origem vegetal. Weissella confusa é associada à Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) recomen-
queijos gregos, “pozol” mexicano e “chili bo” da da, o plaqueamento em profundidade, utilizando o
Malásia. Weissella halotolerans, Weissella helle- Ágar de Man Rogosa & Sharpe (MRS) ou o Ágar
nica e Weissella viridescens são frequentemente Elliker como meios de cultivo. A incubação a 32
isoladas de carnes e podutos cárneos deteriora- ºC/48h é indicada para a contagem de mesófilos
dos (podem provocar esverdeamento em cárne- e a 37 ºC/48h para a contagem de termodúricos.
os curados) e também são encontradas em leite. Para garantir condições microaerófilas pode ser
Weissella minor tem sido isolada de equipamentos usada sobrecamada do mesmo meio ou jarros com
utilizados na indústria láctea. atmosfera microaerófila.
Descrição do gênero feita por Björkroth et al. Para a contagem de bactérias lácticas deterioran-
(2009) e Padonou et al. (2010): Bastonetes curtos, tes em diversos produtos, há recomendações em

vários capítulos da 5ª edição do Compendium of ágar MRS já esterilizado, fundido e resfria-

Methods for the Microbiological Examination of do, até que o pH chegue a 5,5±0,1 (Njong-
Foods, incluindo o Capítulo 19 (Njongmeta et al., meta et al., 2015, Taylor & Pérez, 2015).
2015), o Capítulo 47 (Bradley Jr. et al., 2015), o a.3) Ágar MRS Acidificado Frutose 1%. A adi-
Capítulo 53 (Ananth et al., 2015), o Capítulo 58 ção de 1% de frutose ao MRS acidificado,
(Parish et al., 2015) e o Capítulo 63 (Taylor & incubado a 30 ºC, favorece o crescimento de
Pérez, 2015). Lactobaccilus fructivorans e Lactobacillus
Dois métodos podem ser usados, o plaqueamento plantarum deteriorantes de produtos vegetais.
em profundidade ou a técnica do Número Mais Preparar o meio adicionando 10 ml de uma
Provável (NMP), com uma série de opções de solução aquosa 10% de frutose (esterilizada
meios de cultura. Esses meios, suas principais por filtração) a 100 ml do ágar MRS (estéril,
aplicações, método de utilização e condições de fundido e resfriado) e ácido acético glacial
incubação encontram-se sumariados no Quadro estéril até que o pH chegue a 5,4±0,2 (Njong-
14.2 e descritas abaixo. meta et al., 2015, Taylor & Pérez, 2015).
a) Ágar/Caldo MRS. O MRS (de Man Rogosa & a.4) Ágar MRS Ácido Sórbico 0,1%. A adição
Sharpe) é um meio desenvolvido para favore- de 0,1% de ácido sórbico ao MRS é feita
cer o crescimento de vários lactobacilos, par- para inibir leveduras. É particularmente
ticularmente os do leite. Permite também um útil para a contagem de bactérias lácticas
crescimento luxurioso de Leuconostoc e Pedio- deteriorantes em produtos cárneos fermen-
coccus (Bradley et al., 2015). O caldo é reco- tados. Para a preparação do meio, ajustar
mendado para a contagem de bactérias lácticas o pH do MRS (estéril, fundido e resfriado)
heterofermentativas pelo método do NMP, em em 5,7±0,1, com ácido clorídrico 5N. Adi-
diferentes produtos (Njongmeta et al., 2015). cionar então o ácido sórbico (dissolvido
O ágar é um dos meios mais usados para a con- em NaOH), na quantidade necessária para
tagem em placas, podendo ser acidificado e/ou concentração final 0,1% (Njongmeta et al.,
suplementado com vários componentes, para 2015). A ISO 15214:1998 recomenda a con-
conferir uma certa seletividade e/ou especifi- centração final de 0,14% de ácido sórbico
cidade. para esta finalidade.
a.1) Ágar MRS Frutose 0,5%. A adição de a.5) Ágar MRS Ácido Sórbico Cisteína. Essa
0,5% de frutose ao MRS, incubado a 20-28 modificação objetiva inibir leveduras e bac-
ºC, favorece o crescimento de Lactobac- térias Gram negativas, na contagem de bac-
cilus fructivorans e Lactobacillus brevis térias lácticas deteriorantes em produtos cár-
deteriorantes de maionese e outros molhos neos fermentados. Para a preparação do meio,
para saladas. A suplementação é feita adi- suplementar o MRS com 0,1% de cloridrato
cionando-se 5 ml de uma solução aquosa de cisteína (cisteína-HCl) e esterilizar. Ajustar
10% de frutose (esterilizada por filtração) a o pH do meio estéril, fundido e resfriado em
100 ml do ágar MRS estéril, fundido e res- 5,7±0,1, com ácido clorídrico. Adicionar en-
friado (Ananth et al., 2015). tão o ácido sórbico (dissolvido em NaOH), na
a.2) Ágar MRS Acidificado. A acidificação do quantidade necessária para concentração final
MRS é feita para inibir bactérias esporogê- 0,02% (Njongmeta et al., 2015).
nicas. Usado no plaqueamento em profun- a.6) Ágar MRS com sobrecamada de Ágar APT
didade, tem-se mostrado útil na enumeração Acidificado. Essa combinação de meios é
de bactérias lácticas deteriorantes totais em particularmente útil para a a quantificação
produtos vegetais. A acidificação é feita adi- de bactérias lácticas deteriorantes de mo-
cionado-se ácido acético glacial estéril ao lhos para saladas. O plaqueamento em pro-

Quadro 14.2. Meios de cultura para contagem de bactérias lácticas em alimentos, suas principais apli-
cações e forma de utilização.
Meio a (referência) Aplicação Método b Condição de incubação
32±1 ºC/48±3h (favorece mesófi-

Ágar MRS ou Ágar Elliker Contagem total de bactérias Plaqueamento em profundidade
los) ou 37±1 ºC/48±3h (favorece
(Frank & Yousef, 2004) lácticas em produtos lácteos e sobrecamada do mesmo meio
termodúricos) atmosfera normal
Contagem total de bactérias 30±1 ºC/72±3h anaerobiose ou
Ágar MRS (ISO 15214:1998) Plaqueamento em profundidade
lácticas em alimentos em geral microaerofilia
Favorecer Lactobacillus
Plaqueamento em profundidade
Ágar MRS Frutose 0,5% fructivorans e Lactobacillus 20-28 ºC/até 14 dias sobrecamada
e sobrecamada do mesmo meio
(Ananth et al., 2015) brevis deteriorantes em ou microaerofilia
ou atmosfera microaerófila
maionese e molhos para saladas
Ágar MRS Acidificado Contagem total de bactérias
Plaqueamento em profundidade 35±1 ºC/72±3h anaerobiose
(Njongmeta et al., 2015) lácticas em produtos vegetais
Favorecer Lactobacillus
Ágar MRS Acidificado Frutose
fructivorans e Lactobacillus Plaqueamento em profundidade
1% 30±1 ºC/5 dias atmosfera normal
plantarum deteriorantes em e sobrecamada do mesmo meio
(Njongmeta et al., 2015)
produtos vegetais
Contagem de lácticas
Ágar MRS Ácido Sórbico 0,1% deteriorantes em produtos
Plaqueamento em profundidade 20±1 ºC/5 dias anaerobiose
(Njongmeta et al., 2015) cárneos fermentados, inibindo
leveduras
Contagem de lácticas
Ágar MRS Ácido Sórbico deteriorantes em produtos
Cisteína cárneos fermentados, inibindo Plaqueamento em profundidade 20±1 ºC/5 dias anaerobiose
(Njongmeta et al., 2015) leveduras e bactérias Gram
negativas
Ágar MRS com sobrecamada de Contagem de lácticas Plaqueamento em profundi-
APT acidificado deteriorantes em molhos dade e sobrecamada de APT 35±1 ºC/96±4h atmosfera normal
(Njongmeta et al., 2015) para saladas acidificado
Enumerar lácticas heterofer-
Ágar APT Plaqueamento em profundidade
mentativas em produtos cárneos 25±1 ºC/72±3h atmosfera normal
(Njongmeta et al., 2015) e sobrecamada do mesmo meio
curados e propagar pediococos
Enumerar lácticas deteriorantes
Ágar APT Sacarose BCP de produtos cárneos, diferen- Plaqueamento em profundidade
25±1 ºC/48-72h atmosfera normal
(Njongmeta et al., 2015) ciando de outras bactérias (não e sobrecamada do mesmo meio
produtoras de ácido) presentes
Ágar APT Glicose Enumerar lácticas deteriorantes
Plaqueamento em profundidade 20±1 ºC/72±3h anaerobiose
(Njongmeta et al., 2015) de frutos do mar
Enumerar microrganismos
deteriorantes (não só lácticas)
Plaqueamento em profundidade
OSA (Parish et al., 2015) de suco de laranja concentrado 30±1 ºC/48±3h atmosfera normal
e sobrecamada do mesmo meio
congelado e outros produtos
derivados de laranja
Caldo MRS
Contagem de bactérias lácticas
(com tubos de Durham) Técnica do NMP 35±1 ºC/4 dias atmosfera normal
heterofermentativas
(Njongmeta et al., 2015)
Rogosa
Caldo Rogosa SL c e 45±1 ºC/3 a 5 dias atmosfera
Contagem de bactérias lácticas
Ágar MRS Modificado Técnica do NMP normal
em matéria vegetal
(Njongmeta et al., 2015) MRS Modificado
30±1 ºC/72±3h anaerobiose
a MRS = de Man Rogosa & Sharpe, APT = All Purpose Tween, BCP = Púrpura de bromocresol, OSA = Agar Soro de Laranja.
b Em todos os procedimentos descritos as culturas isoladas devem ser confirmadas por coloração de Gram (+), forma das células (cocos,
bastonetes ou cocobacilos) e teste de catalase (-).
c Nesse procedimento o Caldo Rogosa SL pode ser substituído por leite em pó reconstituído a 10%, suplementado com 0,05% de glicose e
0,1% de extrato de levedura, incubado a 30±1 ºC/3-5 dias.

fundidade permite uma certa recuperação do d) Ágar/Caldo Rogosa SL/Ágar MRS Modifi-
“stress” no Ágar MRS, antes da adição da cado. Rogosa SL é um meio com caracterís-
sobrecamada. Depois de adicionada, a sobre- ticas seletivas (pH 5,4 e alta concentração de
camada de APT acidificado elimina a inter- acetato), desenvolvido para o cultivo de Lacto-
ferência de bactérias esporogênicas, frequen- bacillus de origem oral e fecal. Suplementado
temente presentes nesses produtos. O Ágar com 0,04% de cicloeximida é indicado para a
APT acidificado é preparado adicionando-se contagem de bactérias lácticas deteriorantes
ácido tartárico (solução aquosa a 10%, este- de matéria vegetal, pela técnica do NMP. Para
rilizada a 121 ºC/15min) ao Ágar APT esté- o plaqueamento é utilizado o Ágar MRS Mo-
ril, fundido e resfriado, até que o pH chegue dificado, preparado adicionando-se 0,01% de
a 4,0±0,1 (Njongmeta et al., 2015). TTC (cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólium) ao
Ágar MRS. Nesse procedimento o Caldo Ro-
b) Ágar APT (All Purpose Tween). Original-
gosa pode ser substituído por leite em pó re-
mente desenvolvido para a contagem de bac-
constituído a 10%, suplementado com 0,05%
térias lácticas em produtos cárneos curados, é
de glicose e 0,1% de extrato de levedura, es-
também utilizado para a propagação de Pedio-
terilizado a 108 ºC/10min (Njongmeta et al.,
coccus. Pode ser suplementado com sacarose
2015, Taylor & Pérez, 2015).
ou glicose, para conferir uma certa especifici-
dade ao meio (Njongmeta et al., 2015).
b.1) Ágar APT BCP Sacarose 2%. A adição 14.2. Métodos de
de 2% de sacarose ao APT com 0,032g/l de
BCP (púrpura de bromocresol) é utilizada
plaqueamento
para enumerar bactérias lácticas deterioran- APHA 19.52:2015 para
tes de produtos cárneos, diferenciando de contagem de bactérias
outras bactérias não produtoras de ácidos. lácticas em alimentos
Preparar o meio adicionando 20g de sacaro-
se e 0,032g de BCP a um litro de APT, antes Metodologia da American Public Health Associa-
da esterilização (Njongmeta et al., 2015). tion (APHA), descrita no Capítulo 19 da 5ª edição
b.2) Ágar APT Glicose 1,5%. A adição de mais do Compendium of Methods for the Microbiolo-
5g/l de glicose ao APT, que já contém 10g/l, gical Examination of Foods (Njongmeta et al.,
é utilizada para enumerar bactérias lácticas 2015) e no Capítulo 8 da 17ª edição do Standard
deteriorantes de pescados e frutos do mar. Methods for the Examination of Dairy Products
Preparar o meio adicionando 5g de glico- (Frank & Yousef, 2004).
se a um litro de APT, antes da esterilização Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
(Njongmeta et al., 2015). orientações dos Capítulo 3, que apresenta todos
c) Ágar Soro de Laranja (OSA). Meio de en- os detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
riquecimento desenvolvido especificamente microrganismos em placas. O procedimento des-
para o cultivo e enumeração de microrganis- crito abaixo não apresenta esses detalhes, pressu-
mos associados com a deterioração de produ- pondo que sejam conhecidos pelo analista.
tos derivados de frutas cítricas, permite ótimo Atenção. Recomenda-se que amostras destinadas
crescimento de Lactobacillus e outros micror- à enumeração de bactérias lácticas não sejam
ganismos acidúricos. É particularmente indi- congeladas, em função da alta sensibilidade
cado para a contagem total de microrganismos desses microrganismos às injúrias pelo conge-
aeróbios em suco de laranja concentrado con- lamento. Se o produto é normalmente congela-
gelado e outros produtos derivados de laranja, do, não deve ser descongelado e recongelado
incubação a 30 ºC/48h (Parish et al., 2015). antes das análises.

14.2.1. Material requerido para a □ Estufa incubadora regulada na temperatura re-

análise comendada no Quadro 14.2.
Confirmação
Preparação da amostra e diluições seriadas □ Reagentes para coloração de Gram
□ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) e tu- □ Reagente de catalase
bos de diluição com 9 ml de Água Peptonada
0,1% (H2Op) 14.2.2. Procedimento
O procedimento de análise de bactérias lácticas em
Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- alimentos pelo método de plaqueamento APHA
tulo 2 para verificar casos especiais em que o 19.52:2015 encontra-se descrito na Figura 14.1.
tipo ou volume de diluente variam em função a) Preparação da amostra e diluições seriadas.
da amostra analisada. Seguir os procedimentos descritos no Capítu-
Contagem em placas lo 2. Atenção: Não deve ser utilizado Tampão
□ Meio(s) de cultura: selecionar de acordo com Fosfato na preparação das amostras, porque
as orientações do Quadro 14.2 pode causar injúrias às células. O diluente re-
□ Sistema de geração de atmosfera anaeróbia ou comendado pelo Compendium é a Água Pep-
microaerófila (se recomendado no Quadro 14.2) tonada 0,1%.
Figura 14.1. Esquema de análise de bactérias lácticas em alimentos pelo método de plaqueamento APHA 19.52:2015
(Njongmeta et al., 2015).

Nota a.1) Segundo o capítulo 47 do Compendium (Bra- função do número de colônias confirmadas e
dley et al., 2015), pode ser vantajoso utilizar liquidi- diluição inoculada.
ficador na homogeneização de amostras para conta-
gem de fermentos lácteos em produtos fermentados Exemplo. Plaqueamento em profundidade, dilui-
(ajuda a romper cadeias de bactérias lácticas). Isso é ção 10-2, 25 colônias presentes, cinco submeti-
particularmente útil para produtos recentemente fadas à confirmação, quatro confirmadas (80%).
bricados, podendo resultar em contagens mais acura-
UFC/g ou ml = 25x102x0,8 = 2,0x103.
das das bactérias presentes. O copo do liquidificador
e o diluente devem ser resfriados antes da homoge-
neização.
14.3. Métodos de NMP
APHA 19.526:2015 e
das e inocular 1 ml de cada diluição em placas
de Petri estéreis vazias, adicionando, em segui- APHA 19.524:2015 para
da, o meio de cultura mais adequado à amos- contagem de bactérias
tra analisada. Para a seleção do meio, seguir a lácticas em alimentos
orientação do Quadro 14.2. Nas situações em
que seja recomendada a utilização de sobre- Metodologia da American Public Health Associa-
camada, aguardar a completa solidificação do tion (APHA), descrita no Capítulo 19 da 5ª edição
ágar e adicionar uma pequena quantidade do do Compendium of Methods for the Microbiolo-
meio recomendado para a sobrecamada, cobrin- gical Examination of Foods (Njongmeta et al.,
do totalmente a superfície do meio inoculado. 2015).
c) Incubação. Incubar as placas invertidas, nas Há dois procedimentos recomendados, um utili-
condições estabelecidas no Quadro 14.2. Pla- zando o Caldo MRS, para bactérias lácticas hete-
cas com sobrecamada podem ser incubadas rofermentativas, e outro utilizando o Caldo Rogo-
em atmosfera normal. Placas sem sobrecama- sa SL, para bactérias lácticas totais. Antes de ini-
da devem ser acondicionadas em jarro com at- ciar as atividades, ler atentamente as orientações
mosfera anaeróbia ou microaerófila, conforme do Capítulo 4, que apresenta todos os detalhes e
a recomendação do Quadro 14.2. Para obten- cuidados envolvidos na contagem de microrganis-
ção da atmosfera anaeróbia, podem ser utiliza- mos pelo NMP, da seleção das diluições ao cálcu-
dos sistemas geradores de anaerobiose dispo- lo dos resultados. O procedimento descrito abaixo
níveis comercialmente, como o BD Bioscien- não apresenta esses detalhes, pressupondo que se-
ces GasPak® Anaerobic Systems, o Anaerogen jam conhecidos pelo analista.
Oxoid, o Anaerocult A Merck e o Anaerobac
Atenção: Amostras destinadas à enumeração de
Probac do Brasil. Para a geração da atmosfe-
bactérias lácticas não devem ser congeladas,
ra microaerófila também podem ser utilizados
em função da alta sensibilidade desses micror-
sistemas disponíveis comercialmente, como o
ganismos às injúrias pelo congelamento. Se o
Anaerocult C Merck e o Microaerobac Probac
produto é normalmente congelado, não deve ser
do Brasil.
descongelado e recongelado antes das análises.
d) Confirmação das colônias e cálculo dos re-
sultados. Selecionar para a contagem as pla-
cas com 25 a 250 colônias e contar todas. Se-
análise
lecionar pelo menos cinco colônias presentes
nas placas e submeter à coloração de Gram e Preparação da amostra e diluições seriadas
teste de catalase. As culturas Gram positivas □ Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op)
(cocos ou bastonetes) catalase negativas são □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptona-
consideradas confirmadas como bactérias lác- da 0,1% (H2Op)
ticas. Calcular o número de UFC/g ou ml em □ Pipetas de 1 ou 2 ml

Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capí- d) Cálculo dos resultados. Anotar o número de
tulo 2 para verificar casos especiais em que o tubos confirmados e determinar o NMP/g ou
tipo ou volume de diluente variam em função ml conforme a orientação do Capítulo 4, usan-
da amostra analisada. do uma das tabelas de NMP.
Contagem utilizando o Caldo MRS
□ Caldo MRS (DeMan Rogosa & Sharpe) 14.3.3. Procedimento
□ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC APHA 19.524:2015 utilizando o
Contagem utilizando o Caldo Rogosa SL Caldo Rogosa SL
□ Caldo Rogosa SL
O procedimento de análise de bactérias lácticas
□ Ágar MRS Modificado
pelo método do NMP APHA 19.524:2015 utili-
□ Sistema de geração de atmosfera anaeróbia zando o Caldo Rogosa SL encontra-se descrito na
□ Estufa incubadora regulada 45±1 ºC Figura 14.3.
□ Estufa incubadora regulada 30±1 ºC
a) Preparação da amostra e diluições seriadas.
Confirmação Seguir os procedimentos descritos no Capítu-
□ Reagentes para coloração de Gram lo 2. Atenção: não deve ser utilizado Tampão
□ Reagente de catalase Fosfato na preparação das amostras, porque
pode causar injúrias às células. O diluente re-
comendado pelo Compendium é a Água Pep-
tonada 0,1%.
APHA 19.526:2015 utilizando o
b) Inoculação e incubação. Selecionar três di-
Caldo MRS
luições adequadas da amostra e inocular uma
O procedimento de análise de bactérias lácticas série de três tubos de Caldo Rogosa SL por di-
heterofermentativas pelo método do NMP APHA luição, adicionando 1 ml da diluição por tubo
19.526:2015 utilizando o Caldo MRS encontra-se com 10 ml de Rogosa. Incubar os tubos por
descrito na Figura 14.2. três a cinco dias a 45±1 ºC. O Caldo Rogosa
a) Preparação da amostra e diluições seriadas. SL pode ser substituído por leite em pó recons-
Seguir os procedimentos descritos no Capítu- tituído a 10%, suplementado com 0,05% de
lo 2. Atenção: não deve ser utilizado Tampão glicose. Nesse caso os tubos devem ser incu-
Fosfato na preparação das amostras, porque bados por três a cinco dias a 30±1 ºC.
pode causar injúrias às células. O diluente re- c) Plaqueamento. De cada tubo com crescimen-
comendado pelo Compendium é a Água Pep- to, estriar (estrias de esgotamento) uma alçada
tonada 0,1%. da cultura em placas de Ágar MRS Modificado
b) Inoculação e incubação. Selecionar três di- e incubar as placas a 30±1 ºC/72±3h, em at-
luições adequadas da amostra e inocular uma mosfera anaeróbia.
série de três tubos de Caldo MRS por diluição, d) Confirmação. Selecionar duas colônias isola-
adicionando 1 ml da diluição por tubo com 10 das de cada placa e submeter à coloração de
ml de MRS com tubos de Durham. Incubar os Gram e teste de catalase. As culturas Gram
tubos a 35±1 ºC/4 dias. positivas (cocos ou bastonetes) catalase nega-
c) Confirmação. Verificar os tubos com cresci- tivas são consideradas confirmadas como bac-
mento e produção de gás, indicativos de bacté- térias lácticas.
rias lácticas heterofermentativas, e submeter à e) Cálculo dos resultados. Anotar o número de
coloração de Gram e teste de catalase. As cul- tubos confirmados e determinar o NMP/g ou
turas Gram positivas (cocos ou bastonetes) ca- ml conforme a orientação do Capítulo 4, usan-
talase negativas são consideradas confirmadas. do uma das tabelas de NMP.

Figura 14.2. Esquema de análise de bactérias lácticas heterofermentativas em alimentos

pelo método de NMP APHA 19.526:2015 (Njongmeta et al., 2015).

Figura 14.3. Esquema de análise de bactérias lácticas em alimentos pelo

método de NMP APHA 19.524:2015 (Njongmeta et al., 2015).

14.4. Método de plaqueamento amostra por leveduras usar o MRS com suple-
mentado com 0,14% de ácido sórbico.
ISO 15214:1998 para
Nota a.1) O método ISO 7932:2004 especifica plaquea-
contagem de bactérias mento em duplicata, mas a ISO 7218:2007/Amd
lácticas em alimentos 1:2013 dispensou a duplicata quando for feita a ino-
culação de pelo menos duas diluições.
Método da International Organization for Stan- Nota a.2) O pH estabelecido pela ISO 15214:1998 para
dardization, aplica-se a todos os alimentos desti- o Ágar MRS é de 5,7±0,1, enquanto nos equivalentes
comerciais é de 6,2±0,2. A ISO considera aceitável
nados ao consumo humano e às rações animais. o uso dos equivalentes comerciais mas recomenda
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as levar em conta o fato de que pode haver alguma dife-
orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os rença entre os resultados obtidos.
detalhes e cuidados envolvidos na contagem de Incubar as placas invertidas a 30±1 ºC/72±3h
microrganismos em placas, da seleção das dilui- em jarros com atmosfera anaeróbia ou micro-
ções ao cálculo dos resultados. O procedimento aerófila. Para obtenção da atmosfera anaeró-
descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- bia, podem ser utilizados sistemas geradores
supondo que sejam conhecidos pelo analista. de anaerobiose disponíveis comercialmente,
como o BD Biosciences GasPak® Anaerobic
14.4.1. Material requerido para a Systems, o Anaerogen Oxoid, o Anaerocult A
análise Merck e o Anaerobac Probac do Brasil. Para
□ Diluente: Água Peptonada Tamponada (BPW) a geração da atmosfera microaerófila também
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptona- podem ser utilizados sistemas disponíveis co-
da Tamponada (BPW) mercialmente, como o Anaerocult C Merck e
□ Placas de Ágar DeMan Rogosa & Sharpe (MRS) o Microaerobac Probac do Brasil. Uma outra
□ Sistema de geração de atmosfera anaeróbia ou forma de obter a atmosfera microaerófila é
microaerófila acender uma vela no jarro, imediatamente an-
□ Reagentes para coloração de Gram tes de fechar. Depois que a vela apagar, a at-
□ Reagente de catalase mosfera obtida é adequada para o crescimento
□ Estufa incubadora regulada a 30±1 ºC das bactérias lácticas.
Nota a.3) Em alguns produtos há bactérias lácticas psi-
14.4.2. Procedimento crotróficas ou termodúricas que podem não crescer
ou crescer lentamente a 30 ºC.
O esquema geral de análise para contagem de bac-
b) Contagem e confirmação das colônias. Sele-
térias lácticas em alimentos pelo método de pla-
cionar para a contagem placas com 15 a 300
queamento ISO 15214:1998 encontra-se descrito
colônias. Selecionar cinco colônias de cada
na Figura 14.4.
placa e submeter à coloração de Gram e teste
a) Preparação da amostra, inoculação e incu- de catalase, conforme descritos no Capítulo 5.
bação. Para a preparação da amostra e dilui- As culturas de bactérias Gram positivas (cocos
ções seriadas, seguir os procedimentos descri- ou bastonetes) catalase negativas são conside-
tos no Capítulo 2. radas confirmadas como bactérias lácticas.
Selecionar pelo menos duas diluições adequadas
da amostra e inocular 1 ml de cada diluição em Nota b.1) Na ISO 15214:1998 a confirmação das colônias
é opcional, devendo ser feita quando há suspeita de
placas de Ágar DeMan Rogosa & Sharpe (MRS)
presença de outros tipos de microrganismos.
(plaqueamento em profundidade). Se não houver
Nota b.2) Algumas espécies de Leuconostoc podem
necessidade de diluições, inocular duas alíquotas formar colônias grandes e gomosas que impedem o
de 1 ml em duas placas de MRS (duplicata). Se desenvolvimento de outras colônias. Havendo obser-
houver suspeita de excessiva contaminação da vação desse tipo de colônia levar em consideração

Figura 14.4. Esquema de análise para contagem de bactérias lácticas em alimentos pelo
método de plaqueamento ISO 15214:1998.

o fato de que a contagem total de bactérias lácticas Diluição 10-1 Diluição 10-2
pode estar sendo subestimada. Colônias típicas na placa (C) 150 17
c) Cálculo dos resultados. Segundo a ISO 5 5
confirmação (A)
7218:2007/Amd 1:2013, calcular usando a Colônias típicas confirmadas dentre
4 3
fórmula: as submetidas à confirmação (b)
Número de colônias consideradas (4x150/5)
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d] (3x17/5) = 10
confirmadas nas placas [a = (b.C/A)] = 120
onde: Primeira diluição retida para -1
10 = 0,1
a = (b.C /A) sendo C = número de colônias típicas presentes contagem (d)
em cada placa selecionada para contagem, Somatória das colônias consideradas
120+10 = 130
A = número de colônias típicas submetidas à confirmação confirmadas nas placas (∑a)
(geralmente cinco) e 130 / [0,1 x (1+0,1 x 1) x
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
b = número de colônias típicas confirmadas, dentre as que 0,1] = 130/0,011 = 1,2x104
v = volume inoculado em cada placa. Exemplo 2) Inoculados 0,1 ml da diluição 10-1,
n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele- em duplicata (n1 = 2 e n2 = 0). Os resultados
cionada obtidos foram:
cionada Placa 1 Placa 2
d = primeira diluição retida para contagem Colônias típicas na placa (C) 18 20
(100=1, 10-1= 0,1, 10-2= 0,01 e assim por diante). Colônias típicas submetidas à
5 5
confirmação (A)
Exemplo 1) Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1e as submetidas à confirmação (b)
4 5
10-2, uma placa por diluição (n1 = 1 e n2 = 1). Os Número de colônias consideradas
(4x18/5) = 14 (5x20/5) = 20
confirmadas nas placas [a = (b.C/A)]
resultados obtidos foram:
Primeira diluição retida para -1
10 = 0,1
contagem (d)
14+20 = 34
34 / [0,1x(2+0,1x0)x0,1] =
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
34/0,02 = 1,7x103
14.5. Referências
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15 Campylobacter
15.1. Introdução 15.1.1.1. Campylobacter

Sebald & Véron 1963
Campylobacter é uma das principais causas de emend. Vandamme et al. 2010
diarreia em humanos, em vários países superando As células da maioria das espécies de Campylo-
Salmonella em importância. Campylobacter jeju- bacter são bastonetes finos espiralados (0,2-0,5μm
ni subsp. jejuni é a espécie mais frequentemente de espessura e 0,5-5μm de comprimento), com
associada com gastrenterites agudas veiculadas uma ou mais espirais (em algumas espécies pre-
por alimentos, seguido de Campylobacter coli dominam bastonetes curvos ou retos). Gram ne-
(Habib et al., 2013). Campylobacter lari e Cam- gativos, não esporogênicos. Apresentam arranjo
pylobacter upsaliensis também são reconhecidos típico em forma de “S” ou “asa de gaivota”, quan-
como patógenos primários, mas não isolados com do as células se juntam duas a duas. Em culturas
tanta frequência (WHO, 2000). velhas tendem a apresentar morfologia cocoide.
As doenças de origem alimentar (DTAs) provoca- São móveis em sua maioria, apresentando motili-
das por C. jejuni subsp. jejuni incluem gastroente- dade característica em movimentos tipo saca-ro-
rite, septicemia, meningite, aborto e síndrome de lha ou vaivém.
Guillain-Barré (SGB). A SGB é classificada pela
Microaerófilos com metabolismo respirató-
International Commission on Microbiological
rio. Várias espécies requerem anaerobiose para
Specifications for Foods (ICMSF, 2002) no grupo
crescimento ótimo e crescem apenas microae-
de risco IB, que inclui as doenças “de severo peri-
robicamente na presença de fumarato com for-
go para população restrita, representando ameaça
miato e hidrogênio. Requerem concentração de
de morte, sequelas crônicas ou longa duração”.
oxigênio entre 3 e 15% e concentrações de CO2
entre 3 e 15%. O sangue ou o soro estimulam o
15.1.1. Taxonomia crescimento, mas não são indispensáveis. O me-
Campylobacter faz parte da família Campylo- tabolismo energético é oxidativo e são oxidase
bacteriaceae, que inclui as bactérias na forma de positivos, exceto C. gracilis e algumas cepas de
bastonetes curvos espiralados (Vandamme et al., C. concisus e C. showae. Quimioorganotróficos.
2005a). A descrição do gênero foi publicada em Não utilizam carboidratos como fonte de energia,
2005 na 2ª edição do Bergey’s Manual of Syste- sempre derivada da oxidação de aminoácidos ou
matic Bacteriology (Vandamme et al., 2005b), de ácidos intermediários do ciclo do ácido tri-
sendo posteriormente corrigida por Vandamme et carboxílico. Tipicamente não proteoliticos, não
al. (2010). hidrolisam gelatina, caseína, amido ou tirosina

(embora C. ureolyticus seja capaz de digerir ge- Segundo a ICMSF (1996) a temperatura de cres-
latina e caseína). cimento de C. jejuni subsp. jejuni está na faixa
São inativos na maior parte dos testes bioquí- de 32 a 45 ºC, não crescendo a 25 ou a 47 ºC.
micos convencionais, não produzindo ácidos ou Esta subespécie não é resistente ao calor, sendo
compostos neutros de metabolismo. Vermelho de facilmente destruída pela pasteurização (D55 ºC va-
metila (VM) e Voges-Proskauer (VP) negativos. riando entre 0,6 e 2,3min). O pH ótimo de cresci-
Algumas espécies apresentam atividade de aril- mento está entre 6,5 e 7,5 e o máximo entre 9,0 e
sulfatase mas não de lecitinase ou lipase. A maio- 9,5. Não cresce em pH 4,7 e morre rapidamente
ria reduz o nitrato. Não produzem pigmentos. em pH 4,0. É bastante sensível à secagem e não
Crescem a 35-37 ºC, não crescem a 4 ºC. cresce na presença de 2% de NaCl. Vandamme et
A maioria das espécies são patogênicas para o ho- al. (2005b) relatam ainda crescimento em meios
mem e/ou outros animais, sendo encontradas nos sólidos contendo 1-1,5% de ox-bile e 0,02% de
órgãos reprodutivos, trato intestinal e cavidades safranina. Reduzem e toleram 0,04% de cloreto
orais de diversas espécies. de trifeniltetrazólio (TTC) (90% das cepas). A
maioria cresce na presença de 100 mg/l de 5-flu-
15.1.1.2. Campylobacter termotolerantes orouracil (90% das cepas) e 32 mg/l de cefalotina
As espécies de Campylobacter normalmente as- (95% das cepas).
sociadas com doenças transmitidas por alimentos As células de C. coli apresentam a morfologia tí-
são C. jejuni subsp. jejuni, C. coli, C. lari e C. pica das espécies do gênero Campylobacter e tam-
upsaliensis, que constituem um grupo distinto no bém tendem a assumir forma cocoide com a idade
gênero Campylobacter, chamado de termotole- ou exposição a concentrações tóxicas de oxigênio.
rantes. Caracteristicamente, essas espécies apre- As colônias em meios sólidos são redondas, com
sentam temperatura ótima de crescimento por vol- 1-2mm em diâmetro, convexas (elevadas), lisas e
ta de 42 ºC e não crescem abaixo dos 30 ºC (Corry brilhantes. Nos meio úmido tendem a espalhar-se
& Line, 2015). na direção das estrias, adquirindo uma aparência
No Quadro 15.1 são apresentadas as principais ca- plana e acinzentada. A maioria das cepas não são
racterísticas dessas espécies, em comparação com hemolíticas (mas não todas). Crescem em meios
outras que também crescem a 42 ºC mas não a 25 sólidos contendo 1-1,5% de ox-bile, 0,02% de sa-
ºC. franina, 32 mg/l de cefalotina e 0,04% de cloreto
As células de C. jejuni apresentam a morfologia de trifeniltetrazólio (TTC). Reduzem o TTC e a
típica das espécies do gênero Campylobacter, po- maioria (76% das cepas) é resistente a 100 mg/l
dendo assumir forma cocoide com a idade ou expo- de 5-fluorouracila (Vandamme et al., 2005b).
sição a concentrações tóxicas de oxigênio. São mó-
A diferenciação entre C. coli e C. jejuni subsp.
veis com um único flagelo polar, que parece ser um
jejuni é difícil. A característica mais usada para
fator de virulência necessário à colonização do trato
esta finalidade é a incapacidade de C. coli para
intestinal por essa espécie. Em meios sólidos forma
hidrolisar o hipurato, embora algumas cepas de
dois tipos de colônias: O primeiro tipo são colô-
C. jejuni subsp. jejuni também apresentem resul-
nias acinzentadas, planas, com bordas irregulares
tado negativo.
e tendência a espalhar-se e aglomerar-se ao longo
das estrias. O segundo são colônias convexas, com
bordas regulares e centro preto. A maioria das cepas
15.1.2. Epidemiologia
é fracamente hemolítica em ágar sangue, mas esta A doença causada pelo C. jejuni subsp. jejuni é
característica pode ser afetada pela composição do chamada de campilobacteriose, cuja manifestação
meio, atmosfera de incubação e tempo/temperatura mais comum é uma gastroenterite (enterite por
de incubação. Todas as cepas crescem na presença Campylobacter) que geralmente não requer trata-
de 1% de ox-bile (Vandamme et al., 2005b). mento. A dose infectiva é estimada em 10.000 cé-

Campylobacter □ 231
Quadro 15.1. Características bioquímicas e de crescimento das espécies de Campylobacter descritas

até junho de 2016.
1) Oxidase, 2) Catalase, 3) Urease, 4) Redução nitrato, 5) Hidrólise do hipurato, 6) Hidrólise do indoxil
acetato, 7) H2S em TSI, 8) α-Hemólise, 9) Crescimento a 25 ºC, 10) Crescimento a 42 ºC, 11) Cresci-
mento em Ágar Charcoal Cefoperazona Desoxicolato (CCDA), 12) Crescimento na presença de Glicina
1%, 13) Resistência ao ácido nalidíxico 30µg, 14) Resistência à cefalotina 30µg
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Espécie
Ox Cat Ure Nit Hip Ind H2S Hem 25 ºC 42 ºC CCDA Gli Ac Nal Cef
C. iguaniorum a + + - + - - + + + - + + + -
C. avium a + + - + + + - - - + - - - +
C. canadensis a + v v v - - v - - + + v v -
C. coli a + + - + - + - (-) - + + (+) - +
C. concisus a v - - (-) - - - (-) - (+) (-) (-) (+) -
C. corcagiensis b + + + (+) - v + - + (ana) + (ana) ND + + ND
C. cuniculorum a + - - + - + - - - (+) (+) - v (+)
C. curvus a + - - + (-) v (-) (-) - v (+) + + -
C. fetus subsp. fetus a + + - + - - - - + (+) + + + -
C. fetus subsp. venerealis a + (+) - (+) - - - v + - + (-) v -
C. fetus subsp. testudinum c + + - + - - - ND + + (69%) ND + ND ND
C. gracilis a - (-) - (+) - (+) - - - v v + v -
C. helveticus a + - - + - + - + - + + v - -
C. hominis a + - - v - - - ND - (-) ND + v -
C. hyointestinalis subsp.
+ + - + - - + v (-) + + + + (-)
hyointestinalis a
C. hyointestinalis subsp.
+ + - + - - + v - + + v + -
lawsonii a
C. insulaenigrae a + + - - - - - ND - - ND - + +
C. jejuni subsp. doylei a + v - - + + - + - - + (-) - -
C. jejuni subsp. jejuni a + + - + + + - + - + + + - +
C. lanienae a + + - + - - - + - + ND - + +
C. lari subsp. concheus a + + - + - ND ND ND - + + (+) - +
C. lari subsp. lari a + + - + - - - + - + + + (+) +
C. mucosalis a + - - (-) - - + - - + + (-) (+) -
C. peloridis a + + ND ND - ND ND ND - + + + (+) (-)
C. rectus a + (-) - + - + - + - (-) - + (+) -
C. showae a v + - + - v v + - v + v - -
C. sputorum a + ND ND (+) - - + + - + (+) + (+) -
C. subantarcticus a + + ND + - + - + - + ND (+) + -
C. upsaliensis a + - - + - - - + - + + + - (-)
C. ureolyticus d + v + + - v - v - v + + - -
C. volucris a + + ND + - - ND ND - + ND - + +
a Dados de Gilbert et al., 2015: +, 90–100% das cepas positivas; (+), 75–89% das cepas positivas; v, 26–74% das cepas positivas; (-), 11–25% das cepas positi-
vas; -, 0–10% das cepas positivas; ND, não determinado.
b Dados de Koziel et al. (2014): +, positivo; w, fracamente positivo; (+), 68-95% das cepas positivas; v, 34-67% das cepas positivas; (-), 5-33% das cepas positi-
vas; -, negativo.
c Dados de Fitzgerald et al. (2014), que não relata a porcentagem de cepas relacionadas aos símbolos na maioria dos casos.
d Dados de Vandamme et al. (2010), que não relata a porcentagem de cepas relacionadas aos símbolos.

lulas, porém, há estudos mostrando que a ingestão partir de uma infecção por Campylobacter. Acre-
de menos de 500 organismos levou ao desenvol- dita-se que os antígenos presentes nas células de
vimento de sintomas em voluntários. O período C. jejuni são semelhantes aos presentes em certos
de incubação geralmente é de dois a cinco dias tecidos do sistema nervoso em seres humanos, o
e a duração é de dois a dez dias. Os principais que leva à reação auto-imune (FDA, 2012).
sintomas são febre, diarreia, cólicas abdominais e As cepas de Campylobacter são amplamente dis-
vômito. A diarreia pode ser aquosa, com ou sem tribuídas em animais de sangue quente, domésti-
muco e com ou sem sangue (que pode estar ocul- cos ou silvestres. São prevalentes em frangos, bo-
to) e leucócitos fecais. Outros sintomas são dor vinos, suínos, ovinos e em animais de estimação,
abdominal, náusea, dor de cabeça e dores mus- incluindo cães e gatos. A principal rota de trans-
culares. A maior parte das infecções é auto-limi- missão é o consumo de alimentos contaminados,
tada e não necessita tratamento com antibióticos principalmente carne mal cozida, produtos cárne-
(FDA, 2012). os e leite cru. Água contaminada não tratada tam-
Crianças com menos de 5 anos de idade e adultos bém é uma fonte reconhecida de infecção. A cam-
jovens de 15 a 29 anos de idade são o grupo mais pilobacteriose é considerada uma zoonose, isto é,
frequentemente atingido pela gastroenterite, sen- uma doença transmitida dos animais ou produtos
do maior a incidência entre crianças de seis a 12 animais para o homem. Nos animais raramente
meses de idade. Em indivíduos com HIV/AIDS provoca doenças (WHO, 2000).
estima-se que a incidência seja 40 vezes maior, Campylobacter é um contaminante comum em
em comparação com outros indivíduos da mesma aves, que normalmente podem carregar 102 a 105
faixa etária (FDA, 2012). células por carcaça. Considerando-se que menos
Complicações não são comuns, embora possam de 500 células podem causar infecção, produtos
ocorrer bacteremia e infecções em outros órgãos, de aves representam um risco significativo para
como meningite, hepatite, colecistite, e pancreati- os consumidores (FDA, 2012) O congelamento
te. Estima-se em 1,5 a cada 1.000 casos a frequ- reduz a população, mas os estudos demonstram
ência de bacteremia. Mulheres grávidas também que Campylobacter pode ser detectado em carne
podem ser afetadas, levando à infecção do feto de frango mesmo depois de várias semanas a -20
(sepse neonatal), aborto ou morte fetal. Síndrome ºC (Habib et al., 2013, Jasson et al., 2007, Alter
hemolítico-urêmica e colite recorrente após a in- & Scherer, 2006, Babakhani et al., 1993). A con-
fecção por C. jejuni também têm sido documenta- taminação das carcaças é primariamente superfi-
das (FDA, 2012). cial, mas as células podem penetrar em aberturas
Doenças auto-imunes são outra complicação po- e fendas da pele, onde proteínas, ácidos graxos e
tencial de longo prazo associadas à campilobac- gorduras oferecem proteção contra a ação deleté-
teriose. Uma delas é a atrite reativa, que pode ser ria do congelamento (Solow et al., 2003, Davis &
desencadeada em cerca de 2% dos casos de gas- Conner, 2007).
troenterite. Outra é a síndrome de Guillain-Barré
(SGB), que pode ocorrer duas a três semanas após 15.1.3. Comentários sobre os
a infecção. A doença é uma paralisia semelhante à
poliomielite, que pode resultar em disfunção neu-
rológica respiratória grave ou, eventualmente, em Os métodos da International Organization for
morte. A duração é de várias semanas, requerendo Standardization (ISO 10272-1 e 2, 2006), da Food
cuidados intensivos. Estima-se que uma em cada and Drug Administration (Hunt et al., 2001) e do
2.000 infecções diagnosticadas evoluem para United States Department of Agriculture ( mlG/
SGB. Nem todos os casos de SGB são associados USDA, 2016) são direcionados às espécies termo-
à campilobacteriose, mas vários estudos têm mos- tolerantes de Campylobacter, com temperatura de
trado que até 40% dos quadros de SGB evoluem a incubação de 41,5 ou 42 ºC. As principais etapas

Quadro 15.2. Meios e condições de incubação recomendados pela FDA, USDA e ISO nas diversas
etapas da análise de Campylobacter em alimentos.
Seleção das culturas

Método Pré-enriquecimento a Enriquecimento a Plaqueamento a
para confirmação
BEB b Transferir para 42±1 ºC
37±2 ºC/4h ou Manter por 23-24h com AHB e m-CCDA e
Forma, arranjo e
BAM/FDA:2001 30±2 ºC/3h + 37±2 ºC/2h agitação ou 28-29h sem 42±1 ºC/24-48h
motilidade típicos
Agitação agitação c Atmosfera microaerófila
Atmosfera microaerófila Atmosfera microaerófila
Forma, arranjo e
BEB Campy-Cefex
mlG/USDA:2016 motilidade típicos;
Não tem 42±1 ºC/48±2h 42±1 ºC/48±2h
Presença ausência Teste sorológico
em látex
Carcaças de frango: rinsar com 400 ml de BPW;
Campy-Cefex Forma, arranjo e
Cortes de frango: diluição 1:5 em BPW;
mlG/USDA:2016 (0,3-0,3-0,3-0,1 ml) motilidade típicos;
Esponjas: Recolher em 25 ml de BPW;
Contagem em placas 42±1 ºC/48±2h Teste sorológico
Plaquear 1 ml do BPW diretamente em superfície,
Atmosfera microaerófila em látex
sem pré-enriquecimento ou enriquecimento
m-CCDA d e 2º meio de
BEB Transferir para 41,5±1 ºC
ISO 10272-1:2006 escolha do laboratório e Forma, arranjo e
37±1 ºC/4-6h Manter por 44±4h
Presença/ausência 41,5±1 ºC/44±4h motilidade típicos
Atmosfera microaerófila
Plaqueamento em superfície
Preparar a 1ª diluição e as diluições subsequentes conforme
m-CCDA d e 2º meio de
ISO 10272-2:2006 orientação do Capítulo 2, passando diretamente ao plaque- Forma, arranjo e
escolha do laboratório e
Contagem em placas amento em superfície, sem pré-enriquecimento ou enrique- motilidade típicos
41,5±1 ºC/44±4h
cimento
Atmosfera microaerófila
BAM/FDA = Bacteriological Analytical Manual Online da Food and Drug Administration (Hunt et al., 2001),
mlG/USDA = Microbiological Laboratory Guidebook Online do United States Department of Agriculture (USDA, 2016).
a AHB = Ágar Abeyta-Hunt-Bark, BEB = Caldo Bolton, BPW = Água Peptonada Tamponada, m-CCDA = Ágar Campylobacter Charcoal Diferencial Modifica-
do = Ágar Charcoal Cefoperazona Desoxicolato Modificado, HEB = Caldo de Enriquecimento de Hunt.
b 37±2 ºC/4h para amostras com menos de 10 dias de produção e produtos lácteos, 30±2 ºC/3h seguidas de 37±2 ºC/2h para amostras que tenham sido mantidas
sob refrigeração por mais de 10 dias e amostras de moluscos e crustáceos.
c Moluscos e crustáceos 27-28h sob agitação ou 48h sem agitação, produtos lácteos 48h com ou sem agitação.
d A formulação do m-CCDA descrita pelo BAM/FDA e ISO 10272-1/2 são ligeiramente diferentes (vide Capítulo de preparo de meios e reagente).
e Recomenda-se selecionar meios baseados em princípios diferentes do m-CCDA. O Ágar de Skirrow, o Ágar de Preston ou o Ágar Karmali podem ser utilizados.
de cada um desses procedimentos estão descritas amostras. A ISO 10272-1 (2006) destaca a sen-
no Quadro 15.2. São muito semelhantes, incluin- sibilidade de Campylobacter ao congelamento e
do uma etapa de pré-enriquecimento em caldo se- à secagem, recomendando que as amostras não
letivo incubado a 37 ºC (exceto o mlG/USDA, sejam congeladas e que sejam protegidas contra
que dispensa esta etapa), uma etapa de enriqueci- a perda de umidade. Indica estocagem à 3±2 ºC e
mento no mesmo caldo, mas com temperatura de análise o mais rápido possível.
incubação elevada para 41,5 ou 42 ºC, uma etapa O BAM/FDA apresenta maiores detalhes e con-
de plaqueamento em um ou dois meios seletivos siderações, destacando que Campylobacter é
diferenciais, incubados a 41,5 ou 42 ºC e uma se- sensível ao ar, secagem, baixo pH, aquecimento,
leção inicial das culturas para confirmação, base- congelamento e estocagem prolongada, podendo
ada nas características típicas de forma, arranjo e sofrer injúrias que dificultam a detecção. Células
motilidade de Campylobacter. velhas ou estressadas gradualmente adquirem for-
Todos esses métodos fazem menção à necessi- ma cocoide e se tornam mais difíceis de cultivar.
dade de cuidados no transporte e estocagem das Para estocagem prolongada, C. jejuni subsp jejuni

pode sobreviver duas a quatro semanas sob refri- O método de presença/ausência ISO 10272-1,
geração (4 ºC), se for garantida baixa tensão de descrito nesse capítulo, utiliza apenas quatro
oxigênio e proteção contra perda de umidade (ex- testes para a confirmação de Campylobacter ter-
ceto no caso de leite cru). Nas mesmas condições, motolerantes em nível de gênero, a morfologia,
também pode sobreviver dois a cinco meses a 20 arranjo e motilidade típicos (culturas atípicas po-
ºC negativos. Outras espécies, nas mesmas condi- dem ser descartadas), o teste de oxidase positi-
ções, podem sobreviver (mas não se multiplicar) vo, o crescimento negativo a 25 ºC em condições
uma a três semanas a 4 ºC (exceto no caso de leite microaerófilas e a incapacidade de crescer em
cru). A população diminui dois ciclos logarítmi- condições aeróbias a 41,5 ºC. A diferenciação das
cos a 20 ºC negativos, mas os sobreviventes po- quatro espécies alvo do ensaio (C. jejuni subsp.
dem ser recuperados após mais de cinco meses. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis) é opcio-
Uma vez abertos os frascos ou embalagens, a aná- nal e utiliza cinco testes: catalase, sensibilidade
lise deve ser feita o mais rápido possível, porque ao ácido nalidíxico, sensibilidade à cefalotina, hi-
a introdução de oxigênio é particularmente dele- drólise do hipurato e hidrólise do indoxil acetato.
téria para as células, já debilitadas pela estocagem O método de contagem em placas ISO 10272-2 é
prolongada. idêntico, a partir do plaqueamento em superfície
Na realização do ensaio, a incubação é feita sob do m-CCDA e do segundo meio opcional de es-
condições microaerófilas. O BAM/FDA indica colha do laboratório.
uma composição gasosa com 5% de O2, 10% de O BAM/FDA e o mlG/FSIS/USDA também uti-
CO2 e 85% de N2. O mlG/USDA indica 6 a 12% lizam a morfologia, arranjo e motilidade típicos
de O2 e 5 a 8% de CO2. A ISO 10272-1 (2006) e a para seleção ou descarte das culturas, comprovan-
ISO 10272-2 (2006) indicam 5±2% de O2, 10±3% do a importância dessas características na iden-
de CO2, menos de 10% de H2 (opcional) e a quan- tificação de Campylobacter. Para a confirmação,
tidade de N2 necessária para completar 100%. entretanto, indicam um número maior de testes
Para aumentar a tolerância ao oxigênio, os meios que, em havendo interesse, podem ser acessados
de cultivo contém diversas combinações dos gratuitamente no BAM ou mlG online (endereço
seguintes agentes sequestrantes: sulfato ferro- eletrônico nas referências).
so, metabissulfito de sódio, piruvato de sódio (a
combinação desses três é chamada de suplemen-
to FBP), charcoal, heme e sangue. Esses agentes
previnem o acúmulo de foto-derivativos do oxigê-
15.2. Método
nio nos meios de cultura e neutralizam o peróxido presença/ausência
de hidrogênio produzido durante o crescimento ISO 10272-1:2006
(particularmente o sangue, o charcoal e o piruvato
de sódio) (Bolton et al., 1984). O sangue também Método da International Organization for Stan-
neutralisa inibidores da trimetroprima. dardization, aplica-se a todos os alimentos desti-
Para reduzir a competição da microbiota acom- nados ao consumo humano, às rações animais e à
panhante os meios contém diversas combinações amostras do ambiente de fabricação ou manipula-
dos seguintes antibióticos: cefoperazona de sódio, ção de alimentos.
trimetroprima, vancomicina, rifampicina, anfo- Amostras destinadas à detecção de Campylobac-
tericina B e cicloeximida. A vancomicina inibe ter devem ser transportadas e estocadas a 3±2 ºC
bactérias Gram positivas, a trimetroprima inibe e analisadas o mais rapidamente possível. O con-
Proteus, a cefoperazona de sódio inibe bactérias gelamento não é recomendado, em função da alta
Gram negativas entéricas e algumas Gram posi- sensibilidade desses microrganismos ao congela-
tivas, a anfotericina B e a cicloeximida inibem mento. A desidratação das amostras também deve
fungos. ser prevenida.

15.2.1. Material requerido para a Nota a.2) A obtenção da atmosfera microaerófila pode
ser feita da forma mais adequada às necessidades
análise do laboratório, incluindo o uso de jarros com “kits”
Obrigatórios comerciais de geração de gás. Nesse caso, deve ser
obedecida a orientação do fabricante, particularmen-
□ Caldo Bolton te quanto aos “kits” mais adequados à capacidade dos
□ Ágar Charcoal Cefoperazona Desoxicolato jarros utilizados. Uma alternativa ao uso de atmos-
Modificado (mCCDA) fera microaerófila é fazer a incubação em frascos de
□ Ágar Columbia Sangue (CBA) tampa de rosca, totalmente preenchidos pela amostra
homogeneizada (espaço livre de menos de 2cm) e
□ Caldo Brucella
com as tampas bem apertadas.
□ Reagente de Kovacs para teste de oxidase
□ Sistema de geração de atmosfera microaerófila b) Plaqueamento diferencial. De cada cultura
□ Estufa incubadora a 37±1 ºC em Caldo Bolton, estriar uma alçada (estrias
□ Estufa incubadora a 41,5±1 ºC de esgotamento) em Ágar Charcoal Cefope-
□ Estufa incubadora a 25±1 ºC razona Desoxicolato Modificado (m-CCDA)
Opcionais e uma alçada em um segundo meio, de livre
□ Ágar Mueller Hinton 5% Sangue escolha do laboratório. Incubar as placas de
□ Reagente de Catalase m-CCDA a 41,5±1 ºC/44±4h, em atmosfera
(peróxido de hidrogênio 3%) microaerófila. Incubar as placas do segundo
□ Discos de ácido nalidíxico (30μg) meio opcional de acordo com a orientação do
□ Discos de cefalotina (30μg) fabricante, em atmosfera microaerófila.
□ Solução de hipurato de sódio Nota b.1) Para selecionar o segundo meio de plaquea-
mento, a ISO 10272 recomenda optar por meios ba-
□ Solução de ninidrina
seados em princípios diferentes do m-CCDA. O Ágar
□ Discos de indoxil acetato (2,5 a 5,0μg) de Skirrow, o Ágar de Preston ou o Ágar Karmali
podem ser utilizados. Seguir as orientações do fa-
bricante para selecionar as colônias típicas no meio
15.2.2. Procedimento opcional.
O esquema da análise de Campylobacter spp pelo c) Seleção das colônias e purificação das cultu-
método ISO 10272-1:2006 encontra-se descri- ras para a confirmação. Após o período de
to na Figura 15.1. Antes de iniciar as atividades, incubação, verificar se há desenvolvimento de
ler atentamente as orientações do Capítulo 5, que colônias típicas de Campylobacter nos meios de
apresenta todos os detalhes e cuidados envolvidos plaqueamento diferencial. No Ágar m-CCDA
na detecção da presença/ausência de microrganis- as colônias típicas são acinzentadas, geralmen-
mos. O procedimento descrito abaixo não apre- te com brilho metálico, planas e úmidas, com
senta esses detalhes, pressupondo que sejam co- tendência ao espalhamento. Outras formas de
nhecidos pelo analista. colônias podem ocorrer. No segundo meio de
a) Enriquecimento. Seguindo as orientações plaqueamento, seguir as orientações do fabri-
do Capítulo 2, homogeneizar uma porção de cante para verificar as características típicas das
25g ou 25 ml da amostra em 225 ml de Caldo colônias de Campylobacter.
Bolton. Incubar em atmosfera microaerófila a No fundo de cada placa inoculada, marcar
37±1 ºC/4-6h e transferir para 41,5±1 ºC/44±4h. cinco colônias típicas para a confirmação e,
Composição da atmosfera microaerófila: 5±2% se houver menos de cinco, marcar todas. Sele-
de O2, 10±3% de CO2, menos de 10% de H2 cionar uma das colônias marcadas, submeter à
(opcional) e a quantidade de N2 necessária confirmação e, se o resultado dessa for negati-
para completar 100%. vo, submeter as outras à confirmação.
Nota a.1) A quantidade de amostra na unidade analítica Estriar (estrias de esgotamento) a cultura de
pode variar, desde que mantida a diluição 1:10. cada colônia selecionada em uma placa de

Figura 15.1. Esquema da análise de presença/ausência de Campylobacter pelo método ISO 10272-1(2006).

Ágar Columbia Sangue (CBA), para purifica- dez segundos (teste positivo). O não-desen-
ção. Incubar as placas a 41,5±1 ºC/24-48h, em volvimento da cor azul no intervalo de um
atmosfera microaerófila. Após a incubação, minuto indica teste negativo. As espécies de
utilizar a cultura em CBA para a realização dos Campylobacter termotolerantes alvo desse
testes de confirmação. ensaio são oxidase positivas.
d) Confirmação e) Identificação da espécie (opcional). Havendo
d.1) Morfologia e motilidade. A partir das pla- interesse em identificar a espécie isolada, po-
cas de CBA, suspender uma colônia em 1 ml dem ser utilizados os testes abaixo:
de Caldo Brucella e examinar a morfologia e.1) Teste de catalase. Em uma lâmina de mi-
e motilidade ao microscópio, em montagens croscópio, depositar uma alçada da cultura
úmidas. Manter para os testes subsequentes em uma gota de Reagente de Catalase (pe-
as culturas típicas de Campylobacter, que róxido de hidrogênio 3%). Observar a ocor-
são bastonetes curvos com motilidade tipo rência de borbulhamento em 30s (teste posi-
“saca rolha”. tivo) ou não (teste negativo).
e.2) Teste de sensibilidade à cefalotina e ao
Cuidado. Vazamentos para fora da lamínula ácido nalidíxico. Suspender uma alçada da
podem conter uma dose infectiva de Cam- cultura em Caldo Brucella, ajustando para
pylobacter. Trabalhar com luvas, descartar 0,5 na escala de McFarland. Diluir a suspen-
imediatamente as lâminas em frasco com são a 1:10 com o mesmo caldo e cobrir a su-
álcool 70%, descontaminar as bancadas e a perfície de uma placa de Ágar Mueller Hin-
mesa e lente do microscópio. ton 5% Sangue com a cultura. Deixar em
d.2) Teste de crescimento a 25 ºC em atmosfe- contato por cinco minutos, drenar o excesso
ra microaerófila. A partir das placas de CBA, de líquido e secar a placa em estufa, a 37
estriar uma alçada da cultura em uma nova ºC/10min. Colocar um disco de ácido nali-
placa de CBA e incubar a 25±1 ºC/44±4h, díxico (30 mg) e um disco de cefalotina (30
em atmosfera microaerófila. As espécies de mg) na superfície da placa e incubar a 37±1
Campylobacter termotolerantes alvo desse ºC/22±2h em atmosfera microaerófila, sem
ensaio não crescem a 25 ºC. inverter. Crescimento da cultura em contato
d.3) Teste de crescimento a 41,5 ºC em atmos- com o disco é considerada resistência, en-
fera aeróbica. A partir das placas de CBA, quanto a presença de uma zona de inibição
estriar uma alçada da cultura em uma nova em redor do disco, de qualquer diâmetro, é
placa de CBA e incubar a 41,5±1 ºC/44±4h, considerada sensibilidade.
em atmosfera aeróbica normal. Campylo- e.3) Teste de hidrólise do hipurato. Transferir
bacter não cresce em atmosfera aeróbica. uma alçada com inóculo pesado da cultura
d.4) Teste de oxidase. Colocar um disco ou fita para um tubo com 0,4 ml de solução de hipu-
de papel de filtro no interior de uma placa rato de sódio, com o cuidado de não carregar
de Petri e embeber o centro do papel com ágar junto com o inóculo. Misturar bem por
o reagente de Kovacs para teste de oxida- agitação e incubar a 37±1 ºC/4h em estufa ou
se (solução aquosa 1% de cloridrato de 37±1 ºC/2h em banho maria. Cuidadosamen-
N,N,N,N-tetrametil-p-fenilenodiamina). te, adicionar ao tubo 0,2 ml de solução de ni-
Com uma alça de platina ou palitos estéreis nidrina, sobre a superfície da solução de hipu-
(não utilizar alça de níquel-cromo), remo- rato. Não agitar. Reincubar a 37±1 ºC/10min
ver uma pequena quantidade da cultura em e observar o desenvolvimento de uma cor
CBA e espalhar sobre o reagente no papel, violeta escura (teste positivos) ou a não alte-
observando se ocorre o desenvolvimento de ração da cor (teste negativo). Cor levemente
uma cor azul intensa, em aproximadamente violeta é considerada negativa.

e.4) Teste de hidrólise do indoxil acetato. Co- Se foram feitos os testes de identificação das
locar uma alçada da cultura sobre um disco espécies, interpretar os resultados de acordo
de indoxil acetato (2,5 a 5,0 mg) e adicionar com o Quadro 15.3 abaixo:
uma gota de água destilada. Observar a mu-
Quadro 15.3. Características das espécies de
dança de cor do disco para azul escuro, em
Campylobacter termotolerantes nos testes de
cinco a dez minutos (teste positivo) ou não
identificação.
alteração de cor (teste negativo).
Teste C. jejuni C. coli C. lari C. upsaliensis
f) Interpretação dos resultados. Considerar
- ou
como Campylobacter spp as culturas que apre- Catalase + + +
levemente +
sentarem características típicas nos testes de Sensibilidade ao
Sa Sa Varia S
ácido nalidíxico
confirmação do item d: morfologia de peque-
Sensibilidade à
nos bastonetes curvos, motilidade tipo “saca cefalotina
R R R S
rolha, crescimento microaeróbico a 25 ºC ne- Hidrólise do

+ - - -
gativo, crescimento aeróbico a 41,5 ºC negati- hipurato
Hidrólise do
vo, teste de oxidase positivo. indoxil acetato
+ + - +
a
Tem sido observada elevação na resistência.

15.3. Referências
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16 Cronobacter
Item 16.1.3 (revisado) Ecologia atualizada.
16.1. Introdução um novo gênero, chamado de Cronobacter. Em

2008 foi publicada oficialmente por Iversen et al.
Cronobacter (Enterobacter sakazakii) é um gêne- (2008) a taxonomia do novo gênero e das novas
ro de bactérias patogênicas, cujas doenças trans- espécies.
mitidas por alimentos (DTAs) são classificadas
Cronobacter Iversen et al. 2008, gen. nov.
pela International Commission on Microbiologi-
cal Specifications for Foods (ICMSF, 2002) no Morfologia de bastonete, Gram negativo, geral-
grupo de risco IB, que inclui as doenças “de semente móvel com flagelos peritríquios, não espo-
vero perigo para população restrita, representan- rogênico, anaeróbio facultativo, catalase positivo
do ameaça de morte, sequelas crônicas ou longa e oxidase negativo. Reduz o nitrato, utiliza o citra-
duração”. A população de risco são crianças de até to, hidrolisa a esculina e a arginina e descarboxila
um ano, particularmente os prematuros e os recém a ornitina. Geralmente a fermentação da glicose
nascidos de baixo peso corporal, que podem sofrer e outros carboidratos é do tipo butilenoglicólica,
doenças graves. O veículo mais comum das infec- produzindo acetoína e apresentando teste de Vo-
ções tem sido fórmulas infantis em pó, utilizadas ges Proskauer (VP) positivo e teste de vermelho
em hospitais e maternidades para a preparação de de metila (VM) negativo. Não produz H2S, cresce
mamadeiras. A partir das fórmulas em pó, focos na faixa de temperatura entre seis e 45 ºC e na
de contaminação podem acumular-se em frascos e faixa de pH entre cinco e dez, nenhuma cepa cres-
utensílios usados na preparação das mamadeiras, cendo abaixo de 4,5. Cresce na presença de 7% de
facilitando a disseminação da bactéria. NaCl, mas não em 10%.
A diferenciação das cepas de Cronobacter de ou-
16.1.1. Taxonomia tras espécies da família Enterobacteriaceae en-
contra-se sumariada no Quadro 16.1. A diferen-
As informações abaixo são de Iversen et al. (2007) ciação entre as espécies de Cronobacter encontra-
e Iversen et al. (2008). se no Quadro 16.2.
Cronobacter é um gênero da família Enterobac-
Características nutricionais e de
tericeae, cujas cepas, até 1980, eram designadas
crescimento
como variantes de Enterobacter cloacae pig-
mentadas de amarelo. Em 1980 Farmer III et al. As informações abaixo são de Farmer III et al.
(1980) propuseram a alocação dessas cepas numa (1980), Iversen & Forsythe (2003) e Iversen et al.
nova espécie, chamada de Enterobacter saka- (2004).
zakii. Iversen et al. (2007) propuseram a divisão Cronobacter cresce utilizando glicose ou citra-
das cepas em várias novas espécies, alocadas em to como únicas fontes de carbono e energia, não

Quadro 16.1. Características bioquímicas de Cronobacter spp. e outras enterobactérias (Iversen et al., 2007).
Espécie α-GLI VP ADH ODC SAC RAF CEL ARA CIT VM ADO SOR LDC H2S
Cronobacter spp. + + + + + + + + + - - - - -
Buttiauxella agrestis v - - + - + + + + + - - - -
Citrobacter koseri - - v + v - + + + + + + - -
Citrobacter freundii - - v - v v v + v + - + - +
Edwardsiella tarda - - - + - - - - - + - - + +
Enterobacter aerogenes - + - + + + + + + - + + + -
Enterobacter asburiae - - v + + v + + + + - + - -
Enterobacter cancerogenus - + + + - - + + + - - - - -
Enterobacter cloacae - + + + + + + + + - v + - -
Enterobacter georgoviae - + - + + + + + + - - - + -
Enterobacter hormaechei - + v + + - + + + v - - - -
Enterobacter pyrinus v v - + + - + + - v - - + -
Enterobacter helveticus + - - - - - + + - + - - - -
Enterobacter turicensis + - - - - - + + - + - - - -
Escherichia coli - - v v v v - + - + - + (+) -
Hafnia alvei (-) (+) - + - - (-) + - v - - + -
Klebsiella pneumoniae (-) + - - + + + + + - + + + -
Kluyvera spp. v - - + + + + + (+) + - v v -
Leclercia adecarboxylata - - - - v v + + - + + - - -
Morganella morganii - - - + - - - - - + - - - (-)
Pantoea spp. - v - - v v v + v v - v - -
Proteus vulgaris + - - v (+) - - - v v - - - +
Providencia spp. - - - - v - - - v + v - - v
Rahnella aquatilis - - v - + + + + (-) - - + - -
Raoultella terrigena - + - (-) + + + + v v + + + -
Salmonella sv. - - v (+) - - v (+) v + - v (+) v
Serratia marcescens v + - + + - - - + (-) v + + -
Yersinia enterocolitica - - - + + - v + - + - + - -
α-GLI = produção da enzima α-glicosidase, VP = Voges Proskauer, ADH = arginina dehidrolase, ODC = ornitina descarboxilase, SAC = ácido a partir de saca-
rose, RAF = ácido a partir de rafinose, CEL = ácido a partir de celobiose, ARA = ácido a partir de arabinose, CIT = utilização do citrato, VM = vermelho
de metila, ADO = ácido a partir de adonitol, SOR = ácido a partir de sorbitol, LDC = lisina descarboxilase, H2S = produção de sulfeto de hidrogênio.
+ = 90 a 100% das cepas positivas, (+) = 80 a 90% das cepas positivas, v = 20 a 80% das cepas positivas, (-) = 10 a 20% das cepas positivas, - = menos de 10%
das cepas positivas.
Quadro 16.2. Características bioquímicas das espécies de Cronobacter spp. (Iversen et al., 2008).
C. dublinensis C. dublinensis C. dublinensis
C. Cronobacter C.
Características a C. sakazakii C. turicensis subsp. subsp. subsp.
malonaticus genosp. 1 muytjensii
dublinensis lactaridi lausannensis
Indol b - - - - + + + v
Dulcitol c - - + + + - - -
Lactulose + + + + + + + -
Malonato d - + + v + + - -
Maltitol + + + + - + + -
Palatinose + + + + v + + +
Putrescina + v + v + + + v
Melezitose - - + - - + - -
Turanose + + + v v + v -
myo-Inositol c v v + + + + + -
cis-Aconitato + + + + v + + +
trans-Acontitato - + - + v + + +
1-0-metil-α-D-
+ + + + - + + +
glicopiranosídeo
4-Aminobutirato + + + v + + + +
+ = 90 a 100% das cepas positivas, v = 20 a 80% das cepas positivas, - = menos de 10% das cepas positivas.
a Dados obtidos usando o Biotype 100 System (BioMérieux) com o Biotype Medium 1, exceto quando especificada outra condição.
b Usando reagente de Kovacs após crescimento em caldo triptona.
c Dado obtido usando o Biolog Phenotype MicroArray (Biolog).
d Usando o Caldo Malonato Fenilalanina.

Cronobacter □ 243
apresentando requerimento de vitaminas, amino- 440 vezes, o sedimento é similar ao produzido por
ácidos ou outros fatores orgânicos de crescimen- Pantoea agglomerans, contendo aglomerados de
to. Forma cápsulas de material polissacarídico, células e massas amorfas (talvez de células aglo-
composto de ácido glicurônico (29-32%), D-gli- meradas). Em Caldo E. coli (EC), usado na conta-
cose (23-30%), D-galactose (19-24%), D-fucose gem de coliformes termotolerantes (fecais), 70 a
(13-22%) e D-manose (0-8%). Sua condição de 90% das cepas produzem gás de lactose a 35 ºC
anaeróbio facultativo permite crescimento sob at- mas apenas 58% o fazem a 44,5 ºC. Esses dados
mosfera anaeróbia (jarro ou caixa de luvas sem indicam que o microrganismo pode não ser detec-
oxigênio). A temperatura ótima varia na faixa de tado no ensaio de coliformes fecais em Caldo EC,
37 a 43 ºC, dependendo do meio de cultura. O que verifica a produção de gás a 44,5-45,5 ºC.
tempo de geração a 37 ºC varia na faixa de 14 a 29 Resistência térmica. Iversen et al. (2004) rea-
minutos, em diferentes meios de cultura e na faixa lizaram uma avaliação da resistência térmica de
de 19 a 21 minutos em fórmula infantil reconstitu- duas cepas de Cronobacter (linhagem tipo e uma
ída. A seis e a 21 ºC o tempo de geração é de 13,7 linhagem encapsulada) em Caldo Tripticase de
e 1,7h, respectivamente (em fórmula infantil re- Soja (TSB) e em fórmula infantil reconstituída.
constituída), podendo portanto crescer, ainda que Os resultados estabeleceram valor D58 na faixa
lentamente, sob refrigeração. de 1,3 a 3,8 minutos e valor D62 na faixa de 0,2
Características em meios de cultura sólidos à a 0,4 minutos, sem diferença significativa entre
base de peptonas. Como membro da família En- as linhagens ou entre o TSB e a fórmula infan-
terobacteriaceae, Cronobacter cresce em todos os til reconstituída. O valor z médio obtido para as
meios seletivos utilizados para isolamento e conta- duas cepas foi de 5,7 ºC. Esses dados de termoto-
gem de enterobactérias, como o Agar MacConkey, lerância foram considerados pelos autores como
o Ágar Vermelho Violeta Bile (VRB), o Ágar Eo- similares aos de outras enterobactérias, como Sal-
sina Azul de Metileno (EMB) e outros. Todas as monella em leite em pó reconstituído. Utilizando
cepas crescem rapidamente em Ágar Trpticase de os valores de D60 (1,1 min) e z (5,7 ºC) os autores
Soja (TSA) e, após 48h a 25 ºC, formam colônias fizeram uma previsão do valor D a 71,2 ºC, es-
de 2 a 3mm de diâmetro, com uma coloração ama- timado em 0,7 segundos. Com base nessa previ-
rela brilhante. Essa pigmentação, intensa à 25 ºC, são concluíram que o processo de pasteurização
é muito reduzida na incubação a 36 ºC. Quando HTST (high temperature short time = 71,7 ºC/15s)
recém isoladas, as cepas apresentam dois ou mais é eficaz contra Cronobacter, podendo promover
tipos morfológicos de colônias no primeiro repi- 21 reduções decimais na população alvo.
que de purificação por estrias de esgotamento: co-
lônias secas ou mucóides, com bordas imperfeitas, 16.1.2. Epidemiologia
elásticas e difíceis de remover com uma alça ou Segundo a FDA (2012) há um número relativa-
agulha de inoculação (tipo A) e colônias lisas e fá- mente pequeno de casos de infecções por Cro-
ceis de remover (tipo B). Culturas estoque feitas a nobacter documentados e o organismo tem sido
partir de colônias tipo A rapidamente convertem raramente encontrado em alimentos e espécimes
ao tipo B. Algumas cepas também produzem co- clínicos. Desde 1958 houve 120 casos notificados
lônias lisas com pigmentação muito fraca, difíceis em recém-nascidos, com uma média de menos de
de reconhecer como amarelas. cinco casos/ano em todo o mundo. Estudos epi-
Características de crescimento em meios líqui- demiológicos sugerem uma taxa de menos de 1%
dos. O crescimento é rápido em Caldo Tripticase de confirmação entre os pacientes com sintomas
de Soja (TSB), passando de 104 a 109 em uma noi- suspeitos, embora este dado não leve em conside-
te. A massa de células tende a sedimentar e, ob- ração os potenciais falso-negativos.
servado em montagens úmidas com aumento de Por outro lado, embora seja raro, esse microrga-

nismo tem uma taxa de mortalidade muito alta en- (1988) em 141 amostras de fórmulas infantis em
tre a população de risco (10 a 80%) que, em 75% pó, originadas de 28 países, detectou a presença
dos casos notificados são bebes com menos de um de membros da família Enterobacteriaceae em
mês de vida (em 50% dos casos com menos de 52,5%. As espécies mais frequentemente encon-
uma semana). Crianças com mais de seis meses tradas foram Pantoea agglomerans (em 35 amos-
são raramente afetadas e adultos são considera- tras), Enterobacter cloacae (em 30 amostras),
dos de baixo risco, embora alguns poucos casos Cronobacter (em 20 amostras) e Klebsiella pneu-
tenham sido relatados envolvendo idosos e indiví- moniae (em 13 amostras). A contagem desses mi-
duos imunocomprometidos (FDA, 2012). crorganismos foi menor do que uma UFC/100g
A maioria das infecções se dá pela rota oral, em- em 78% das amostras e as maiores contagens ob-
bora haja casos de transmissão no canal de parto servadas foram de 92 UFC/100g (E. cloacae) e 66
ou através de feridas. A dose infectiva não foi bem UFC/100g (Cronobacter).
determinada, mas parece estar entre 10 e 100 cé- Nazarowec-White & Farber (1997) avaliaram 120
lulas. Os sintomas em recém nascidos são severos amostras de fórmulas infantis de três diferentes
e ocorrem poucos dias após o contato com o mi- fabricantes do Canadá, detectando Cronobacter
crorganismo, incluindo falta de resposta à alimen- em 6,7%. A contagem mais frequentemente en-
tação, irritabilidade, icterícia, ronqueira ao respi- contrada foi de 0,36 NMP/100g.
rar, instabilidade na temperatura corporal, convul- Heuvelink et al. (2001) avaliaram 40 amostras de
sões, abscesso cerebral, hidrocefalia e atraso no fórmulas infantis e 170 amostras de leite em pó
desenvolvimento. Com a evolução da infecção (presença/ausência em 25g), detectando Crono-
Cronobacter pode atingir o sistema nervoso cen- bacter em uma amostra de fórmula e sete amos-
tral e a corrente sanguínea. O organismo também tras de leite em pó.
tem sido associado com septicemia, meningite e
No Brasil, Santos et al. (2005), em levantamen-
enterocolite necrotizante, embora não tenha sido
to realizado pelo ITAL (Instituto de Tecnologia
firmemente estabelecido como o agente causador
de Alimentos de Campinas, SP), analisaram, no
(FDA, 2012).
período de maio de 2004 a outubro de 2005, 86
Dentre os sobreviventes de infecções por Crono- amostras de fórmulas infantis em pó, 20 de fór-
bacter a colonização varia de duas a oito semanas mulas reconstituídas (mamadeiras prontas) e cin-
e os atingidos por meningite podem desenvolver co de amido, originárias de hospitais de Campi-
complicações neurológicas graves. Os casos fa- nas (SP), indústrias ou distribuidores. A presença
tais ocorrem principalmente entre os prematuros e de Cronobacter foi detectada em 12 das amos-
os recém nascidos com baixo peso corporal. Nos tras de fórmula em pó, em quatro das amostras de
últimos anos a principal causa tem sido a septi- amido e em nenhuma das mamadeiras. A conta-
cemia, que pode levar à morte poucas horas ou gem mais frequentemente encontrada foi de 0,51
alguns dias após os primeiros sinais da infecção NMP/100g.
generalizada (FDA, 2012).
De acordo com a FAO/WHO (2004), esses da-
dos indicaram que o nível de contaminação das
16.1.3. Ecologia
fórmulas infantis por Cronobacter era baixo mas,
Segundo a FAO (Food and Agriculture Organiza- ainda assim, de alto risco, dado o potencial de
tion) e a OMS (Organização Mundial de Saúde) multiplicação no intervalo entre a preparação e o
(FAO/WHO, 2004), o reservatório de Cronobac- consumo do produto reconstituído. Com base nas
ter é desconhecido em muitos casos, porém, um conclusões preliminares da análise de risco mi-
número grande de relatos confirmaram as fórmu- crobiológico (risk assessment), a inclusão de uma
las infantis em pó como fonte e veículo de infec- etapa letal no momento do preparo e a redução
ções. Um levantamento feito por Muytjens et al. do intervalo entre a reconstituição e o consumo

Cronobacter □ 245
reduziriam o risco (FAO/WHO, 2004). Iversen & 147 amostras e detectaram Cronobacter em 35
Forsythe (2003) destacaram também a importân- (24%). O microrganismo foi encontrado em quase
cia da higiene dos utensílios usados na prepara- todos os ambientes e a análise estatística mostrou
ção, como liquidificadores, por exemplo. Segun- não haver diferença significativa na proporção de
do esses autores é muito provável que focos do amostras positivas entre os ambientes. Segundo
microrganismo nos utensílios sejam a principal os autores, esses dados são uma forte indicação
fonte de contaminação das mamadeiras e porções de que Cronobacter é um microrganismo ampla-
servidas. De fato, na investigação de vários surtos mente distribuído no ambiente doméstico e nas
e casos esporádicos, o microrganismo foi isolado fábricas de alimentos.
dos liquidificadores, frascos, escovas de limpeza e Na água, solo, lodo, fezes de pássaro, roedores,
outros itens do ambiente de preparação (Kandhai animais domésticos e gado, Nazarowec-White &
et al., 2004). Farber (1997) não conseguiram isolar este micror-
Nos ingredientes usados na formulação de alimen- ganismo de nenhuma amostra.
tos infantis (leite em pó, amido, lactose, sacarose, Em 2008 foi feito um levantamento de dados para
lecitina, vitaminas), a FAO/WHO (2004) destaca a FAO/OMS, em que laboratórios de oito países,
que vários apresentam alto risco de conter Ente- incluindo o do Instituto de Tecnologia de Alimen-
robacteriaceae (amido, por exemplo), enquanto tos (ITAL/Brasil), analisaram amostras locais de
outros não (óleos, por exemplo). No levantamento fórmulas infantis, alimentos infantis e bebidas
apresentado nessa publicação, o amido e a lactose infantis, para a presença de Cronobacter. Esse
foram os mais frequentemente contaminados com estudo foi publicado por Chap et al. (2009), en-
enterobactérias e Cronobacter. contrando Cronobacter em três de 89 amostras
Além das fórmulas infantis e seus ingredientes, de fórmulas infantis (3%) e em 24 de 170 amos-
Iversen & Forsythe (2003) destacam alguns re- tras de outros alimentos e bebidas infantis (14%).
latos de isolamento de Cronobacter em queijo, Nesse estudo a unidade analítica utilizada nos en-
pão fermentado, tofu, chá azedo, carnes curadas, saios foi de 25g.
carne moída, linguiça e pão tipo Khamir (o orga- Ainda em 2008 o Codex Alimentarius estabele-
nismo faz parte da microbiota superficial da se- ceu o “Code of Hygienic Practice for Powdered
mente de sorgo e também da semente de arroz). Formulae for Infants and Young Children” (Co-
Considerando que Cronobacter não faz parte da dex Alimentarius/CAC/RCP 66, 2008 revisão 1
microbiota normal do homem e outros animais, é 2009), definindo o plano de amostragem de lotes
provável que o solo, a água e os vegetais sejam as e o padrão microbiológico de fórmulas infantis
principais fontes de contaminação dos alimentos em pó (produto acabado). O escopo desse código
e que ratos e moscas sejam fontes adicionais de abrange os seguintes produtos em pó:
contaminação (Iversen & Forsythe, 2003). Ainda ▪ Fórmulas infantis e fórmulas para finalidades
segundo os autores, é plausível supor que o orga- médicas especiais, a serem usadas como a úni-
nismo ocorra em uma gama maior de alimentos, ca fonte de nutrição.
porém, não há estudos detalhados que comprovem ▪ Fórmulas infantis de seguimento, a serem usa-
isso, até o momento. Destacam, entretanto, que há das em combinação com outros alimentos, como
variação na eficiência dos métodos de isolamento parte da dieta de amamentação de crianças.
utilizados e que os levantamentos existentes pro- ▪ Fórmulas em pó para finalidades médicas es-
vavelmente subestimam a prevalência e a concen- peciais, destinadas a substituir ou suplementar
tração de Cronobacter nos alimentos. parcialmente o leite materno, as fórmulas in-
No ambiente doméstico e industrial (fábricas de fantis ou as fórmulas da continuação.
leite em pó, chocolate, cereais, condimentos, mas- ▪ Fortificadores do leite materno, destinados a
sas e farinhas), Kandhai et al. (2004) analisaram suplementar o leite de peito.

Quadro 16.3. Critérios microbiológicos do Codex Alimentarius para lotes de fórmulas infantis em pó
(produto acabado) (Codex Alimentarius/CAC/RCP 66, 2008 revisão 1 2009).
Microrganismo n c m M Tipo de plano
Cronobacter sp 30 0 ausência em 10g não se aplica duas classes
Salmonella 60 0 ausência em 25g não se aplica duas classes
Enterobacteriaceae 10 2 ausência em 10g não se aplica duas classes
Aeróbios mesófilos totais 5 2 5,0x102 UFC/g 5,0x103 UFC/g três classes
n: é o número de unidades de amostras a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote, para serem analisadas individualmente.
m: é o padrão microbiológico.
M: é um limite tolerável, acima do padrão, que pode ser atingido por algumas (c) unidades de amostra, mas não pode ser ultrapassado por nenhuma.
c: dentre as n unidades de amostra que constituem a amostra representativa do lote, c é o número máximo de unidades que podem ser aceitas com contagens
acima do padrão m, desde que não acima do limite M. Nos casos em que o padrão microbiológico é ausência, c é igual a zero e aplica-se o plano de duas
classes.
Além de Cronobacter, o Codex também incluiu contaminação das fórmulas infantis no Brasil era
os ensaios de Salmonella, Enterobacteriaceae e muito baixa e atendia o padrão que foi posterior-
aeróbios mesófilos totais, para a avaliação de lotes mente fixado pelo Codex (plano de amostragem
de produto final (Quadro 16.3). n = 30, c = 0, m = ausência em 10g, que implica
No Brasil há poucos estudos relatados na litera- numa contagem média detectável de 1/340g se o
tura sobre a ocorrência de Cronobacter spp em desvio padrão for de 0,8 ou 1/100g se o desvio pa-
fórmulas infantis. Todos os trabalhos encontra- drão for de 0,5, probablidade de detecção de 95%
dos (Santos et al., 2013, Oliveira et al., 2011, nos dois casos).
Santos, 2011, Freitas et al., 2011, Chap et al., Também é importante destacar que o estudo de
2009, Palcich et al., 2009, Gillio, 2006, San- Santos (2006), que detectou a maior porcentagem
tos, 2006) são de amostragens realizadas entre de amostras positivas relatada, é uma tese de mes-
2004 e 2008, antes da publicação do “Code of trado desenvolvida com amostras suspeitas envia-
Hygienic Practice for Powdered Formulae” pelo das por fabricantes ou importadores, no ano do
Codex Alimentarius (2008 revisão 2009). No primeiro “recall” de fórmulas infantis feito pela
total de estudos relatados foram analisadas 368 ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sani-
amostras de fórmulas infantis em pó e encontra- tária) no Brasil.
das 13 amostras positivas (3,5%). A maioria das Alguns estudos analisaram, além das fórmulas in-
amostras positivas (12) foi detectada no estudo fantis em pó, também as mamadeiras preparadas
de Santos (2006), que analisou 98 amostras com com essas fórmulas e o ambiente e utensílios de
unidade analítica de 500g, fracionada em cinco preparação dessas mamadeiras. No total de estu-
alíquotas de 100g para determinar o número mais dos relatados foram analisadas 187 amostras de
provável (NMP). A contagem de Cronobacter utensílios e ambiente de preparação, sendo en-
spp encontrada nessas amostras variou de 0,22 contrada uma amostra positiva (0,5%). No total
a 0,92 NMP/100g (média de 0,54 NMP/100g e foram também analisadas 142 amostras de fórmu-
desvio padrão de 0,39). A outra amostra positiva las reconstituídas, incluindo mamadeiras recém
foi relatada por Palcich et al. (2009), que ana- preparadas, mamadeiras refrigeradas e restos de
lisaram 186 amostras com unidade analítica de mamadeiras, coletados depois da alimentação das
333g e encontraram uma amostra positiva, com crianças. Apenas uma amostra (0,7%) de resto de
contagem de 0,3 NMP/100g. mamadeira foi positiva para Cronobacter spp.
Os dados encontrados mostram que, mesmo antes Um estudo (Palcich et al., 2009), determinou a
da publicação do “Code of Hygienic Practice for variação na população de Cronobacter spp nas
Powdered Formulae” pelo Codex Alimentarius, a fórmulas reconstituídas, quando mantidas a 25 ºC

Cronobacter □ 247
(temperatura das UTIs neonatais) por 4h (tempo normalmente é adicionada aos meios de cultura
médio entre o preparo e o consumo das fórmu- para inibir bactérias Gram positivas.
las nas UTIs neonatais visitadas pelos pesquisa- O plaqueamento diferencial é feito no Ágar de
dores). A população sofreu uma elevação de dois Isolamento de Enterobacter sakazakii (ESIA),
ciclos logarítmicos. meio seletivo diferencial que contém desoxicola-
to de sódio e cristal violeta, agentes usados em
16.1.4. Métodos de análise meios de isolamento de enterobactérias, para ini-
bir Gram positivos. Contém ainda 5-bromo-4-clo-
Em 2006 a International Organization for Stan-
ro-3-indolil-a-D-glocopiranosídeo, um substrato
dardization publicou a ISO/TS 22964 (2006), para
cromogênico para a a-glicosidase. As colônias
a detecção da presença/ausência de Cronobacter
das cepas que produzem a-glicosidase são ver-
em fórmulas infantis, leite em pó e amostras do
de azuladas, podendo ser diferenciadas das que
ambiente de fabricação desses produtos. O mé-
não produzem a enzima. Essa primeira triagem é
todo segue quatro etapas: O pré-enriquecimento,
seguida da observação da produção de pigmento
para a reparação de células injuriadas, o enrique-
amarelo em TSA, aumentando significativamente
cimento seletivo, para elevar a população alvo a
a probabilidade de selecionar as culturas de Cro-
níveis detectáveis, o plaqueamento seletivo dife-
nobacter. As provas bioquímicas recomendadas
rencial, para obtenção de colônias com caracterís-
são as mais discriminatórias para diferenciar Cro-
ticas típicas e a confirmação, para verificar se as
nobacter das outras enterobactérias que produ-
culturas isoladas são de Cronobacter.
zem a-glicosidase e pigmento amarelo.
O pré-enriquecimento é feito em Água Peptonada
Tamponada (BPW), podendo ser aplicado a qual-
quer tipo de amostra e utilizado no ensaio simul- 16.2. Método de presença/
tâneo de Salmonella. A norma não especifica a ausência ISO 22964:2006
quantidade de amostra a ser inoculada, mas reme-
te-se à ISO 8261 (2001) que, para fórmulas infan- Esse método é aplicável a leite em pó, fórmulas
tis e leite em pó recomenda 10g. Essa quantidade infantis em pó e amostras do ambiente de fabrica-
é a mínima necessária, não havendo impedimen- ção desses produtos.
tos ao uso de quantidades maiores, em uma única
alíquota (presença/ausência) ou múltiplas alíquo- 16.2.1. Material requerido para a
tas (NMP), desde que mantida a diluição de 1:10. análise
O enriquecimento seletivo é feito em Caldo Lau- □ Caldo de pré-enriquecimento: Água Peptona-
ril Sulfato Triptose Modificado Vancomicina ( da Tamponada (BPW)
mlST-V), que contém 3,4% (p/v) de NaCl e 10 □ Caldo de enriquecimento seletivo: Caldo Lau-
mg/l de vancomicina. O caldo LST original não ril Sulfato Triptose Modificado Vancomicina
contém vancomicina e o teor de sal é de 0,5%. É o (m-LST-V)
meio tradicionalmente utilizado para a contagem □ Placas de Ágar de Isolamento de Enterobacter
de coliformes em alimentos pelo NMP, incubado a sakazakii (ESIA)
35 ºC/24h. A elevação do teor de sal e a incubação □ Placas de Ágar Tripticase de Soja (TSA)
a 44 ºC criam condições mais competitivas para □ Reagente de Kovacs para teste de oxidase (so-
Cronobacter, em relação às enterobactérias. Cro- lução aquosa 1% de cloridrato de N,N,N,N-te-
nobacter cresce a 44 ºC (Brenner et al., 2005), ao trametil-p-fenilenodiamina)
contrário de inúmeros coliformes e, segundo Bre- □ Alça de platina ou palitos estéreis para teste de
euwer et al. (2003), também é mais resistente à oxidase
secagem e à pressão osmótica do que E. coli, Sal- □ “Kits” API 20E (BioMérieux) ou os meios a
monella e outras enterobactérias. A vancomicina seguir para provas bioquímicas:

▪ Caldo Descarboxilase 0,5% L-Lisina 8261 (2001) deve ser de no mínimo 10g para pro-
▪ Caldo Descarboxilase 0,5% L-Ornitina dutos lácteos. No levantamento feito por Chap et al.
(2009) para a FAO/OMS, com amostras de oito paí-
▪ Caldo Descarboxilase 0,5% L-Arginina ses, a unidade analítica foi de 25g.
▪ Caldo Vermelho de Fenol D-Sorbitol
▪ Caldo Vermelho de Fenol L-Rhamnose b) Enriquecimento seletivo. De cada alíquota
▪ Caldo Vermelho de Fenol D-Sacarose pré-enriquecida, transferir 0,1 ml para 10 ml
▪ Caldo Vermelho de Fenol D-Melibiose de Caldo Lauril Sulfato Triptose Modificado
▪ Caldo Vermelho de Fenol Amidaglina Vancomicina ( mlST-V). Incubar os frascos de
▪ Ágar Citrato de Simmons m-LST-V a 44±0,5 ºC/24±2h.
□ Banho-maria ou estufa incubadora regulada a c) Plaqueamento seletivo diferencial. Agitar
44±0,5 ºC cuidadosamente os frascos de caldo m-LST-V
□ Estufa incubadora regulada a 44±1 ºC e estriar uma alçada de cada cultura (estrias de
□ Estufa incubadora regulada a 37±1 ºC esgotamento) em uma placa de Agar de Iso-
□ Estufa incubadora regulada a 30±1 ºC lamento de Enterobacter sakazakii (ESIA).
□ Estufa incubadora regulada a 25±1 ºC Incubar as placas 44±1 ºC/24±2h.
d) Confirmação das colônias típicas. Selecionar
16.2.2. Procedimento uma a cinco colônias típicas para os testes de
confirmação. As colônias de Cronobacter em
O esquema geral de análise para detecção de Cro-
ESIA são pequenas a médias (1 a 3mm), ver-
nobacter pelo método da ISO 22964 (2006) en-
des ou verde azuladas. As colônias atípicas
contra-se descrito na Figura 16.1.
geralmente são violeta e levemente transpa-
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as rentes. Se for selecionada apenas uma colônia,
orientações do Capítulo 5, que apresenta todos os manter a placa de ESIA sob refrigeração, para
detalhes e cuidados envolvidos nos testes de pre- a seleção de novas colônias se a primeira não
sença/ausência de microrganismos. O procedimen- for confirmada.
to descrito abaixo não apresenta esses detalhes, Estriar cada colônia selecionada (estrias de
pressupondo que sejam conhecidos pelo analista. esgotamento) em uma placa de Ágar Trptica-
a) Pré-enriquecimento. Preparar a diluição 1:10, se de Soja (TSA) e incubar a 25±1 ºC/44-48h.
homogeneizando m gramas da amostra com Após a incubação, verificar a presença ou não
9m mililitros de Água Peptonada Tampona- de colônias pigmentadas de amarelo. Em caso
da (BPW). Não agitar as amostras de leite ou negativo e, se apenas uma colônia de ESIA foi
fórmula infantil em pó, aguardando que o ma- selecionada para a confirmação, repetir esse
terial disperse naturalmente. Se a amostra não procedimento com mais quatro colônias tí-
estiver completamente dissolvida depois de picas da placa de ESIA. Se houver menos de
30minutos, agitar levemente para completar a quatro, selecionar todas.
dissolução. Incubar os frascos de BPW a 37±1 De cada placa de TSA, selecionar uma colônia
ºC/18±2h. pigmentada de amarelo e submeter aos teste
Nota a.1) O procedimento descrito é um teste de presen-
bioquímicos descritos abaixo, para confirma-
ça/ausência, que pode ser adaptados para contagem ção. Utilizar o material da mesma colônia, para
pelo NMP. No caso de leite ou fórmulas infantis em a realização de todos os teste bioquímicos, que
pó, podem ser analisadas separadamente cinco alí- podem ser substituídos pelos disponíveis em
quotas de 100g da amostra, por exemplo, num teste
“kits” miniaturizados de identificação, como o
de diluição única, ou três alíquotas de 100g, três de
10g e três de 1g da amostra, num teste de diluição API 20E da BioMérieux ou equivalente.
múltipla. d.1) Teste de oxidase. Colocar um disco ou fita
Nota a.2) A ISO 22964 (2006) não especifica a quanti- de papel de filtro no interior de uma placa de
dade de amostra a ser analisada que, segundo a ISO Petri e embeber o centro do papel com o re-

Cronobacter □ 249
Figura 16.1. Esquema geral de análise para detecção de Cronobacter pelo método ISO 22964 (2006).

agente de Kovacs para teste de oxidase (so- d.2) Teste de citrato. Inocular cada cultura
lução aquosa 1% de cloridrato de N,N,N,N- em tubos de Ágar Citrato de Simmons, por
tetrametil-p-fenilenodiamina). De prefe- estrias na rampa. Incubar os tubos a 30±1
rência, utilizar discos ou tiras impregnados ºC/24±2h e observar se ocorre desenvolvi-
com o reagente, disponíveis comercialmen- mento de cor azul (teste positivo) ou não
te. Com uma alça de platina ou palitos es- (teste negativo).
téreis, remover uma pequena quantidade da d.3) Teste de arginina dehidrolase e lisina/or-
cultura e espalhar sobre o reagente no papel, nitina descarboxilase. Inocular cada cultu-
observando se ocorre o desenvolvimento de ra em tubos de Caldo Descarboxilase com
uma cor azul intensa, em aproximadamente 0,5% de L-Lisina, Descarboxilase com
10 segundos (teste positivo). O não desen- 0,5% de L-Ornitina e Descarboxilase com
volvimento da cor azul no intervalo de um 0,5% de L-Arginina. Depositar o inóculo
minuto indica teste negativo. As cepas de logo abaixo da superfície do líquido e incu-
Cronobacter são oxidase negativas. bar os tubos a 30±1 ºC/24±2h. O bservar se
ocorre desenvolvimento de cor violeta (teste
Atenção. Não devem ser utilizadas alças positivo) ou amarela (teste negativo).
de níquel-cromo na transferência do inócu- d.4. Teste de fermentação de carboidratos.
lo para o teste de oxidase. Não considerar Inocular cada cultura em tubos de Caldo
qualquer alteração da cor do reagente após Vermelho de Fenol Carboidratos (D-Sorbi-
um minuto de contato com a cultura. Não tol, L-Rhamnose, D-Sacarose, D-Melibiose,
cultivar culturas destinadas ao teste de oxi- Amigdalina), logo abaixo da superfície do
dase em meios contendo glucose, pois a líquido. Incubar os tubos a 30±1 ºC/24±2h e
fermentação desse carboidrato inibe a ativi- observar se ocorre desenvolvimento de cor
dade de oxidase e pode resultar em falsas amarela (teste positivo) ou vermelha (teste
reações negativas. O reagente de Kovacs é negativo).
instável, devendo ser preparado no dia do e) Interpretação dos resultados. Considerar
uso. Havendo interesse em estocar, deve-se como confirmadas as culturas com o seguinte
distribuir porções de 1-2 ml em frascos es- perfil bioquímico:
curos e manter sob congelamento (-20 ºC)
Oxidase (-) L-Rhamnose (+)
até o momento do uso. O descongelamento
Lisina descarboxilase (-) D-Sacarose (+)
deve ser feito 3 a 4 horas antes do uso e todo
Ornitina descarboxilase (+) D-Melibiose (+)
o volume descongelado não utilizado deve
Arginina dehidrolase (+) Amigdalina (+)
ser descartado.
Sorbitol (-) Citrato (+)

Cronobacter □ 251
16.3. Referências
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17 Escherichia coli O157:H7
Item 17.1 (revisado) Introdução, atualizada com a classificação dos grupos de E. coli enteropatogênicas. Taxo-
nomia complementada com dados de temperatura, atividade de água e pH de crescimento das cepas STEC.
Epidemiologia atualizada.
Item 17.2 (revisado) A versão de 2002 do método BAM/FDA foi substituída pela versão de junho de 2016, com
alterações em quase todos os itens.
17.1. Introdução os sorotipos envolvidos em surtos, o O157:H7

responde por cerca de 75% dos casos relatados no
Há seis grupos de Escherichia coli enteropatogêni- mundo. Para diferenciar das demais cepas STEC,
cas reconhecidos atualmente: 1) E. coli enteropato- os sorotipos patogênicos têm sido chamados de
gênica (EPEC), 2) E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enterohemorrágicas (EHEC), porque trans-
3) E. coli enteroinvasiva (EIEC), 4) E. coli ente- mitem uma colite hemorrágica que pode evoluir
roagregativa (EAggEC ou EAEC), 5) E. coli de para doenças mais graves como a síndrome hemo-
aderência difusa (DAEC) e 6) E. coli shiga toxigê- lítico-urêmica (HUS) e a púrpura trombocitopêni-
nica (STEC) ou verotoxigênica (VTEC), do qual ca trombótica (PTT) (FDA, 2012). Essas doenças
faz parte a E. coli O157:H7 (Brenner et al., 2005). são veiculadas por alimentos e classificadas pela
A denominação verotoxigênica (VTEC) é asso- International Commission on Microbiological
ciada às citotoxinas que essas cepas podem pro- Specifications for Foods (ICMSF, 2002) no grupo
duzir no intestino. No momento são conhecidas de risco IA, que inclui as doenças “ de severo pe-
pelo menos duas, chamadas de verotoxinas (VT rigo para a população em geral, representando ris-
1 e 2) devido ao seu efeito citopático irreversível co de morte, sequelas crônicas ou longa duração”.
sobre células Vero (linhagem de células do rim do
macaco verde africano Cercopithecus aethiops) 17.1.1. Taxonomia
(Eduardo et al., 2002). A denominação shiga toxi- E. coli é uma espécie da família Enterobacteria-
gênica (STEC) é devida à semelhança das veroto- ceae, definida como bastonetes Gram negativos
xinas com a toxina produzida pela Shigella dysen- anaeróbios facultativos e oxidase negativos. As
teriae tipo I (Weagant et al., 1995), motivo pelo cepas do sorotipo O157:H7 apresentam a maio-
qual também são chamadas de toxinas shiga ou ria das características típicas da espécie E. coli,
“shiga-like” toxinas (SLT 1 e 2). Os genes respon- que são os seguintes, de acordo com o Bergey’s
sáveis pela codificação das toxinas shiga, chama- Manual of Systematic Bacteriology (Brenner et
dos stx1 e stx2, são usados como marcadores em al., 2005): teste de indol positivo (98% das ce-
métodos moleculares de detecção ou confirmação pas), teste de VM positivo (99% das cepas), teste
de cepas STEC. de VP negativo (100% das cepas), teste de citrato
Dependendo da referência citada existe hoje entre negativo (99% das cepas), teste de H2S negativo
200 e 400 sorotipos STEC, muitos dos quais não (99% das cepas) e teste de urease negativo (99%
estão associados a doenças em humanos. Dentre das cepas).

A sorotipagem de E. coli, assim como a de Salmo- como 40% das cepas de K. ascorbata e 30% das
nella, é baseada nas diferenças antigênicas encon- cepas de P. agglomerans (Brenner et al., 2005).
tradas no envelope celular ou cápsula (antígenos As características bioquímicas que permitem di-
K), na parede celular (antígenos O) e nos flagelos ferenciar essas espécies de E. coli O157:H7 estão
(antígenos H). Cada sorotipo é designado por uma descritas no Quadro 17.1. E. hermannii é a mais
fórmula contendo 1º) os antígenos somáticos, 2º) os frequentemente citada como causa de falsos pre-
antígenos capsulares e 3º) os antígenos flagelares. suntivos no isolamento de E. coli O157:H7 no
As fímbrias, quando presentes, também podem ser Ágar MacConkey Sorbitol.
usadas para a caracterização sorológica. E. coli
O157:H7 significa antígeno somático O157, antí- 17.1.2. Epidemiologia
geno capsular ausente e antígeno flagelar H7.
As doenças causadas pelas cepas EHEC podem va-
O Bergey’s Manual não relata os resultados dos riar de diarreias ligeiras ou assintomáticas a compli-
testes bioquímicos separadamente para o sorotipo cações com risco de vida. Os sintomas agudos são
O157:H7, mas Ratnam et al. (1988) caracteriza- chamados colite hemorrágica (HC) que, em até 10%
ram 174 cepas de E. coli O157:H7 isoladas de sur- dos doentes (particularmente crianças e idosos),
tos e casos esporádicos de doenças, com os resul- evolui para doenças graves como a síndrome hemo-
tados apresentados no Quadro 17.1. As principais lítico-urêmica (HUS) ou a púrpura trombocitopêni-
características que diferenciam esse sorotipo das ca trombótica (PTT) (WHO, 2011, FDA, 2012).
demais cepas de E. coli são a incapacidade de A colite hemorrágica (HE) provocada pelas cepas
fermentar o sorbitol e de produzir a enzima b-gli- EHEC é caracterizada por dores abdominais se-
curonidase. veras, náusea ou vômito e diarreia, inicialmente
Segundo Brenner et al. (2005), 94% das cepas de aquosa e posteriormente sanguinolenta. Em al-
E. coli são sorbitol positivas e, segundo Feng & guns casos a diarreia pode ser intensa, ocorrendo a
Hartman (1982), 96% produzem b-glicuronida- cada 15 ou 30 minutos e consistindo quase que in-
se. E. coli O 157:H7 é uma exceção, embora haja teiramente de sangue. Febre, quando ocorre, é bai-
relatos de isolamento de variantes sorbitol e/ou xa. O tempo de incubação geralmente é de três a
b-glicuronidase positivas (Gunzer et al., 1992, quatro dias, mas pode variar entre um e nove dias.
Hayes et al., 1995). A duração, quando não ocorrem complicações, é
As cepas STEC crescem numa faixa de tempera- de dois a nove dias, com uma média de oito dias.
tura variando entre 7 e 50 ºC, com ótimo em 37 A dose infectiva é muito baixa, variando entre 10
ºC. Várias podem crescer em produtos ácidos com e 100 células no caso do sorotipo O157:H7. No
pH 4,4 e em atividade de água de 0,95. São des- caso dos outros sorotipos EHEC parece ser ligei-
truídas pelo cozimento, quando todo o conteúdo ramente maior (FDA, 2012).
atinge 70 ºC ou mais (WHO, 2011). A síndrome hemolítico-urêmica (HUS) é a cau-
Várias espécies de enterobactérias são capazes sa mais comum de insuficiência renal aguda em
de reagir com o anti-soro O157 (reação cruzada), crianças pequenas. Pode causar complicações
incluindo, segundo Silveira et al. (1999): Entero- neurológicas (convulsão, acidente vascular ce-
bacter sp (particularmente E. cloacae), Klebsiella rebral e coma) em 25% dos pacientes e sequela
sp (particularmente K. pneumoniae e K. oxyto- renal crônica (geralmente leve) em cerca de 50%
ca), Citrobacter sp (particularmente C. freundii), dos sobreviventes (WHO, 2011). A taxa de morta-
Serratia sp (particularmente S. rubidaea), Hafnia lidade é de 3 a 5% (FDA, 2012).
alvei, Pantoea agglomerans, Kluyvera ascorbata, A púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) é
Escherichia hermannii e Escherichia fergusonii. outra complicação extra intestinal que pode ocor-
Dessas, E. hermannii, E. fergusonii, H. alvei e S. rer nas infecções causadas pelas cepas EHEC. É
rubidaea também são sorbitol negativas, assim uma doença mais rara, caracterizada por cinco si-

Escherichia coli O157:H7 □ 255
Quadro 17.1. Principais características bioquímicas de E. coli O157:H7 em comparação com as demais
cepas de E. coli e com outras enterobactérias sorbitol negativas que podem provocar reação cruzada
com o anti-soro O157.
E. coli Escherichia Escherichia Escherichia Hafnia Kluyvera Pantoea Serratia

Característica
O157:H7 a coli b hermannii b fergusonii b alvei b ascorbata b agglomerans b rubidaea b
b-glicuronidase 0 96a - a NR c NR c NR c NR c NR c
Sorbitol 0 94 0 0 0 40 30 1
Pigmento amarelo 0 0 98 0 0 0 75 0
Salicina 0 40 40 65 13 100 65 99
Esculina 0 35 40 46 7 99 60 94
Arginina 0 17 0 5 6 0 0 0
Adonitol 0 5 0 98 0 0 7 99
Inositol 0 1 0 0 0 0 15 20
Celobiose 0 2 97 96 15 100 55 94
Urease 0 1 0 0 4 0 20 2
Citrato 0 1 1 17 10 96 50 95
KCN 0 3 94 0 95 92 35 25
Sacarose 87 50 45 0 10 98 75 99
Glicose (ácido) 100 100 100 100 100 100 100 100
Glicose (gás) 98 95 97 95 98 93 20 30
Indol 100 98 99 98 0 92 21 0
Arabinose 100 99 100 98 95 100 95 100
Trehalose 100 98 100 96 95 100 97 100
Manitol 100 98 100 98 99 10 100 100
Lactose 100 95 45 0 5 98 40 100
Maltose 100 95 100 96 100 100 89 99
Rhamnose 100 80 97 92 97 100 85 1
Xilose 100 95 100 96 98 99 93 99
Lisina 100 90 6 95 100 97 0 55
Ornitina 100 65 100 100 98 100 0 0
Rafinose 100 50 40 0 2 98 30 99
Dulcitol 100 60 19 60 0 25 15 0
a Porcentagem de cepas positivas, dados relatados por Ratnam et al. (1988).
b Porcentagem de cepas positivas, dados relatados por Brenner et al. (2005), exceto quando especificada outra fonte.
c Não relatado.

nais e sintomas: anemia hemolítica microangio- clínicas mais graves são o O111:H8/NM (predo-
pática, trombocitopenia, distúrbios neurológicos, minante na Austrália), o O26:H11, o O103:H2 e o
febre e disfunção renal (Eduardo et al., 2002). Os O113:H21 (Griffin & Tauxe, 1991, WHO, 1998,
sintomas neurológicos podem ser cefaléia, confu- Eduardo et al., 2002). Nos Estados Unidos, seis
são, afasia e alterações da consciência (da letargia sorotipos têm-se destacado: O26, O45, O103,
ao coma) (Rocha, 2003). O111, O121 e O145 (FDA, 2012).
Segundo a FDA (2012) o sorotipo O157:H7 é o Na América do Sul, o Uruguai, o Chile e, espe-
mais frequentemente associado a surtos de colite cialmente, a Argentina apresentam incidências de
hemorrágica e HUS (cerca de 75% das infecções), infecções humanas por STEC e de casos de HUS
mas outros sorotipos não-O157 também têm sido relativamente altas atingindo 12,2 casos a cada
implicados. É importante destacar, entretanto, que 100.000 crianças menores de 5 anos de idade, em
o isolamento de cepas não-O157, embora bastante 2002 (Caldorin et al., 2013).
comum, nem sempre está associado ao desenvol- No Brasil, levantando-se apenas os casos de diar-
vimento dos sintomas, sendo também encontrados reia em humanos, a frequência de isolamento de
em indivíduos sãos. Além disso, há vários relatos cepas STEC é muito baixa (Cantarelli et al., 2000,
de pacientes apresentando cepas não-O157 nas fe- Guth et al., 2002a, Irino et al., 2002, Caldorin et
zes e, ao mesmo tempo, altos níveis de anticorpos al., 2013). Desde 1989 o sorotipo O111:NM é o
contra o antígeno O157 (Tarr & Neill, 1996), su- mais frequente em nosso ambiente (Guth et al.,
gerindo a presença desse sorotipo como causa dos 2002a), porém, casos de doença associados com
sintomas, embora não detectado. os sorotipos O157:H7 e O26:H11 já foram iden-
O fato é que distinguir as cepas STEC verdadeira- tificados (Irino et al., 2000, Guth et al., 2002b,
mente patogênicas não é tão simples, uma vez que Caldorin et al., 2013). Em reservatórios animais,
a mera produção das verotoxinas não é suficiente ao contrário, as cepas STEC são bastante comuns
para conferir virulência, havendo outros fatores (Cerqueira et al., 1997, Cerqueira et al., 1999,
envolvidos. Isso teve reflexos sobre a nomencla- Caldorin et al., 2013), embora poucos dos soroti-
tura do grupo, sendo reconhecida a seguinte situ- pos isolados sejam reconhecidos como patógenos.
ação (Nataro & Kaper, 1998, FDA, 2012): STEC O trato intestinal de bovinos parece ser o principal
e VTEC são termos equivalentes e ambos se re- reservatório das cepas entero-hemorrágicas de E.
ferem a todas as cepas de E. coli que produzem coli. Outros ruminantes como ovinos e caprinos
uma ou mais verotoxinas. Como não está claro se também são considerados reservatórios importan-
a simples presença dos genes que codificam estes, enquanto que em suínos, equinos e aves (fran-
sas toxinas é capaz de conferir patogênicidade, na gos e perus) as cepas EHEC são encontradas ape-
ausência de outros fatores de virulência, o termo nas ocasionalmente (FDA, 2012, WHO, 2011).
E. coli enterohemorrágica (EHEC) fica reservado A transmissão se dá predominantemente através
às cepas que provocam colite hemorrágica, HUS do consumo de alimentos contaminados, embora
ou PTT, produzem toxinas shiga, aderem às cé- a contaminação pessoa-pessoa também já tenha
lulas do epitélio intestinal, provocam lesões A/E sido bem documentada (FDA, 2012, WHO, 2011).
(“attaching and effacing”) e possuem o plasmídio A contaminação fecal de água e de outros alimen-
pO157, associado à produção de enterohemolisi- tos, bem como a contaminação cruzada durante a
nas e potenciais fatores de aderência. Dessa for- preparação dos alimentos (com produtos de carne
ma, EHEC denota um subgrupo da classe STEC e bovina e outras carnes, superfícies contaminadas
inclui uma conotação clínica não extensiva a todo e utensílios de cozinha), também são fontes co-
o grupo. De acordo com essa definição, todas as muns de transmissão (FDA, 2012, WHO, 2011).
cepas EHEC são patogênicas, sendo seu princi- Já foram incriminados em surtos, dentre outros
pal representante o sorotipo O157. Os outros so- alimentos, a carne bovina mal-cozida e outros
rotipos que têm sido associados às manifestações produtos à base de carne (hambúrgueres, salames,

salsichas tipo “hot-dog”), o leite cru, os vegetais com Piruvato (mBPWp), que é a Água Pep-
(especialmente aqueles consumidos crus), os mo- tonada Tamponada (BPW) suplementada com
lhos preparados para saladas, a maionese e o suco peptona de caseína, extrato de levedura, lacto-
de maçã. O sorotipo O157:H7 pode desenvolver se e piruvato de sódio.
tolerância ao ácido, o que foi evidenciado por sur- 2º) Enriquecimento seletivo por 18-24h a 42 ºC
tos nos quais alimentos ácidos (pH menor do que no mesmo meio (mBPWp) mas com adição
4,6) foram implicados, tais como iogurte, maione- dos suplementos seletivos ACV (acriflavina,
se, salsichas, queijos fermentados e sucos de fruta cefsulodina e vancomicina).
pasteurizados (FDA, 2012, WHO, 2011). 3º) Plaqueamento seletivo diferencial em dois
No geral, pode-se dizer que a carne bovina é meios de cultura; a) o Ágar MacConkey Sor-
uma das principais fontes potenciais de E. coli bitol Telurito Cefixima (TC-SMAC), que é o
O157:H7, uma vez que o trato gastrointestinal de Ágar MacConkey Sorbitol suplementado com
bovinos é o reservatório desses microrganismos. 2,5 mg/l de telurito de potássio e 0,05 mg/l de
A carne bovina moída (hambúrguer já foi o princi- Cefixima, para triagem inicial das cepas sorbi-
pal agente de surtos registrados nos Estados Uni- tol negativas, consideradas presuntivas. b) um
dos e outros países da Europa, presumindo-se que meio cromogênico que pode ser o Rainbow
a operação de moagem transfira os microrganis- Agar O157 ou R&F E. coli O157:H7 Agar.
mos da superfície para todo o interior da massa de 4º) Confirmação preliminar das colônias típicas
carne, aumentando assim a área de contato para o obtidas no TC-SMAC e no meio cromogênico,
desenvolvimento bacteriano. A água também tem através do teste sorológico somático O157 em
sido implicada na transmissão da doença (incluin- látex, teste de atividade das enzimas b-galacto-
do água potável e água recreacional) e a conta- sidase e b-glicuronidase e teste de indol.
minação através de verduras (alface, espinafre e 5º) Confirmação definitiva das culturas b-galac-
broto de alfafa) e frutas tem sido cada vez mais tosidase positivas, b-glicuronidase negtivas e
frequente (FDA, 2012, WHO, 2011). indol positivas através do teste sorológico fla-
gelar H7 e testes bioquímicos no “kit” API 20E
No Brasil, o monitoramento realizado pelo ITAL
(BioMérieux). A base de dados do API 20E
(Instituto de Tecnologia de Alimentos de Campi-
não diferencia as cepas O157 das demais cepas
nas, SP) (Silva et al., 2003) analisou, no período
de E. coli. No entanto, segundo Haldane et al.
de janeiro de 1997 a outubro de 1999, 2.095 amos-
(1986), a combinação mais típica dessas cepas
tras de alimentos, incluindo 1.111 de produtos cár-
nos 21 primeiros testes da cartela de resulta-
neos, 115 do ambiente industrial e 869 de vegetais.
dos (Figura 17.1) é “5144172” (91,9% das ce-
Em nenhuma amostra foi detectada a presença de
pas), podendo também ocorrer as combinações
E. coli O157:H7. Essa amostragem é pequena,
“5144152” (cepas sacarose negativas, 2,7%) e
comparada com o volume de produção do país,
“5144162” (cepas rhamnose negativas, 5,4%).
mas os resultados indicam que a ocorrência no
6º) Testes moleculares de detecção de genes as-
Brasil deve ser bem mais baixa do que em outros
sociados à fatores de virulência, como as shi-
países, onde amostragens similares têm detectado
ga toxinas (stx1 e stx2), a enterohemolisina
a presença em 0,2 a 3,7% das amostras analisadas.
(ehxA) e a gama-intimina (eae).
Os métodos culturais foram bastante usados nas
métodos de análise décadas de 80 e 90, mas gradativamente vêm
O método cultural da Food and Drug Administra- sendo substituídos por métodos imunológicos ou
tion apresenta cinco etapas (Feng et al., 2016): moleculares. Esses métodos, na sua maioria, são
1º) Pré-enriquecimento por cinco horas a 37 ºC “kits” analíticos com marca registrada, definidos
em Água Peptonada Tamponada Modificada pela AOAC International como: “sistemas con-

+ - + + - - - - + - - + + - - + + + - + -
1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4
ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX
5 1 4 4 1 7 2
Figura 17.1. Características típicas das cepas de E. coli O157:H7 no “Kit”API 20E da BioMérieux (Haldane et al., 1986).
ONPG = orto-nitro-fenil-b-D-galactopiranosídeo (atividade de b-galactosidase), ADH = atividade de arginina dehidrolase, LDC = atividade de lisina descarboxi-
lase, ODC = atividade de ornitina descarboxilase, CIT = utilização de citrato, H2S = produção de H2S, URE = atividade de urease, TDA = atividade de triptofano
deaminase, IND = produção de indol, VP = produção de acetoína (teste de VP), GEL = atividade de gelatinase, GLU = fermentação/oxidação da glicose, MAN =
fermentação/oxidação do manitol, INO = fermentação/oxidação do inositol, SOR = fermentação/oxidação do sorbitol, RHA = fermentação/oxidação da rhamnose,
SAC = fermentação/oxidação da sacarose, MEL = fermentação/oxidação da melibiose, AMY = fermentação/oxidação da amigdalina, ARA = fermentação/oxi-
dação da arabinose, OX = atividade de citocromo oxidase. Os números que acompanham o teste são os pontos a serem atribuídos quando o resultado for positivo,
para compor a combinação numérica.
Quadro 17.2. “Kits” analíticos oficializados pela AOAC International para a detecção de E. coli O157
AOAC Official
Analito Fabricante Nome do “kit Aplicação
Method
Alimentos, ingredientes e
996.09 E. coli O157:H7 BioControl Systems, Inc. VIP for EHEC
amostras ambientais
996.10 E. coli O157:H7 BioControl Systems, Inc. Transia AG EHEC for E. coli O157:H7 Diversos alimentos
997.11 E. coli O157 Neogen Corporation ISO-Grid + SD39 Agar Alimentos
Carne bovina, alface e outros
2000.13 E. coli O157 Neogen Corp. REVEAL for E. coli O157 8h
alimentos
Carne bovina, alface, cidra
2000.14 E. coli O157 Neogen Corp. REVEAL for E. coli O157 20h de maçã, outros alimentos e
amostras ambientais
2005.04 E. coli O157:H7 BioControl Systems, Inc. Assurance GDS™ for E. coli O157:H7 Diversos alimentos
2005.05 E. coli O157:H7 BioControl Systems, Inc. Assurance GDS™ for Shigatoxin Genes Diversos alimentos
tendo todos os componentes chave para a realiza- 17.2.1. Material requerido para a
ção da análise de um ou mais microrganismos, em análise
um ou mais tipos de alimentos, segundo um deter-
minado método” (Andrews, 1997). A grande van- □ Água Peptonada Tamponada Modificada com
tagem dos “kits” é que o material requerido nos Piruvato (mBPWp)
ensaios (todo ou parte dele) é comercializado em □ Placas de Ágar MacConkey Sorbitol Telurito
conjunto, eliminando a preparação no laboratório. Cefixima (TC-SMAC)
□ Placas de Rainbow Agar O157 (Biolog,
Já foram oficializados pela AOAC para a análise
Hayward, CA) ou R&F E. coli O157:H7 Agar
de E. coli O157 os “kits” analíticos descritos no
(R&F Laboratories, Downers Grove, IL)
Quadro 17.2.
□ Placas de Ágar Tripticase de Soja Extrato de
Levedura (TSA-YE)
□ Discos de Coli Complete (BioControl Sys-
17.2. Método BAM/FDA:2016
tems, Inc)
para presença/ausência □ Reagente de Kovacs para teste de indol
de E. coli O157:H7 □ “Kit” de aglutinação em látex para o antígeno
em alimentos somático O157 (Remel ou Oxoid)
□ “Kit” de aglutinação em látex para o antígeno
Método da US Food and Drug Administration flagelar H7(Remel ou Oxoid)
(FDA), descrito no Bacteriologycal Analytical □ “Kit” API 20E (BioMérieux)
Manual (BAM) (Feng et al., 2016) □ Estufa incubadora a 42±1 ºC

17.2.2. Procedimento Nota a.1) No caso de vegetais folhosos (exceto coentro e

salsa) adicionar 450 ml de mBPWp a 200g de amos-
O esquema de análise para a detecção de E. coli tra. Não é necessário agitar ou homogeneizar em sto-
O157:H7 pelo método BAM/FDA:2016 encon- macher ou liquidificador. No caso de coentro e salsa,
trabalhar com 25g da amostra em 225 ml de mBPWp,
tra-se descrito na Figura 17.2. também sem agitar ou homogeneizar.
Nota a.2) No caso de amostras de sucos, leite ou outras
orientações do Capítulo 5, que apresenta todos bebidas turvas, centrifugar 200 ml a 10.000xg/10min,
os detalhes e cuidados envolvidos nos testes de descartar o sobrenadante e suspender o material em
presença/ausência de microrganismos. O proce- 225 ml de mBPWp.
dimento descrito abaixo não apresenta esses de- Nota a.3) No caso de água ou outros produtos líquidos
não turvos, adicionar 125 ml da amostra a 125 ml de
talhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo
mBPWp em concentração dupla.
analista.
Cuidado. A análise de E. coli O157:H7 deve ser Após as 5h de pré-enriquecimento, adicionar
conduzida por pessoal bem treinado, para garan- à mBPWp o suplemento seletivo ACV (acri-
tir a segurança do analista e do laboratório. Du- flavina = 10 mg/l, cefsulodina = 10 mg/l, van-
rante a realização das análises, recomendam-se comicina = 8 mg/l). Incubar a 42±1 ºC/18-24h
os seguintes cuidados: 1) que todo o manuseio (enriquecimento seletivo).
das amostras e meios de cultura seja feito sobre b) Plaqueamento seletivo diferencial. Agitar
bandejas e não diretamente sobre as bancadas, delicadamente os frascos de mBPWp e estriar
2) que nenhuma coleta de líquido seja feita com uma alçada de cada cultura (estrias de esgo-
a boca e sim com pipetadores, 3) que ao trabalhar tamento) em uma placa de Ágar MacConkey
em capela de fluxo laminar se utilize um mode- Sorbitol Telurito Cefixima (TC-SMAC) e uma
lo vertical, adequado ao manuseio de patógenos, alçada em um meio cromogênico (Rainbow
4) que se mantenha ao alcance das mãos um frasco Agar O157 ou R&F E. coli O157:H7 Agar).
de desinfetante como solução de cloro a 100ppm Se houver suspeita de uma população alta de
ou solução de álcool iodado, para descontaminar E. coli O157:H7, preparar diluições e fazer a
qualquer descarga inadvertida de material conta- inoculação por plaqueamento em superfície
minado, 5) que todo o descarte de material seja (10-2 a 10-4).
precedido da descontaminação em autoclave a Incubar as placas a 37±1°C/18-24h. Depois da
121 ºC/30min, 6) que toda a área de trabalho seja incubação, pelo menos uma das placas deve
prontamente descontaminada, uma vez concluídas conter colônias isoladas para confirmação.
as análises, 7) que no preparo e homogeneização Nota b.1) Após o enriquecimento o método BAM/FDA
das amostras se tomem precauções para evitar a inclui uma etapa de screening por PCR, descartando
as amostras negativas e submetendo ao plaqueamen-
formação de aerossóis. Para tanto, recomenda-se to seletivo diferencial e às estapas subsequentes do
que a homogeneização seja feita preferencialmen- ensaio apenas as amostras positivas no PCR (presun-
te em “stomacher” e que, na homogeneização em tivas).
liquidificador, a tampa seja protegida por papel c) Seleção de colônias para a confirmação. Ob-
amarrado com barbante, aguardando-se a acomo- servar a presença de colônias típicas nas pla-
dação do material homogeneizado, antes da aber- cas. No Ágar TC-SMAC as colônias de E. coli
tura do frasco. O157 são incolores ou acinzentadas, com cen-
a) Pré enriquecimento e enriquecimento sele- tro esfumaçado e 1-2mm de diâmetro. Bacté-
tivo. Seguindo as orientações do Capítulo 2, rias sorbitol positivas, incluindo a maioria das
homogeneizar 25g ou ml da amostra em 225 cepas de E. coli, formam colônias pink a ver-
ml de Água Peptonada Tamponada Modificada melhas. No Ágar Rainbow O 157 e no Ágar
com Piruvato (mBPWp). Incubar a 37±1 ºC/5h R&F E. coli O157:H7 as colônias de E. coli
(pré-enriquecimento). O157:H7 são pretas ou azul bem escuras.

ACV = Acriflavina (10 mg/l), Cefsulodina (10 mg/l), Vancomcina (8 mg/l).
Figura 17.2. Esquema de análise para a detecção de E. coli O157:H7 em alimentos pelo
método BAM/FDA:2016 (Feng et al., 2016).

c.1) Teste sorológico O157 de aglutinação em to de uma cor vermelho violeta (teste posi-
látex. Selecionar as colônias para confirmativo) ou não (teste negativo). E. coli O157
ção verificando a presença do antígeno so- é indol positiva, podendo ser descartadas
mático O157. Usar uma pequena quantidade todas as culturas negativas.
do material de cada colônia para a realiza- d) Confirmação definitiva. Submeter à confir-
ção do teste sorológico de aglutinação em mação definitiva pelo menos 10 colônias b-ga-
látex usando um kit comercial (Remel ou lactosidase positivas, b-glicuronidase negati-
Oxoid). Seguir a orientação do fabricante na vas e indol positivas. Os testes usados são o
realização do teste. Selecionar pelo menos sorológico flagelar H7 e os testes bioquímicos
10 colônias O157 positivas e se houver me- do “kit” API 20E (BioMérieux).
nos de 10, todas. d.1) Teste sorológico flagelar H7. Apenas as
c.2) Teste de atividade de β-galactosidase e culturas positivas no teste sorológico somá-
β-glicuronidase. Repicar as colônias típicas tico O157 devem ser submetidas ao soroló-
O157 positivas por estrias de esgotamento gico flagelar. O procedimento mais comum
em Ágar Tripticase de Soja Extrato de Le- é a utilização de “kits” de aglutinação em
vedura (TSA-YE). No primeiro quadrante látex, cujo princípio é o mesmo do O157,
das estrias (região com inóculo mais pesa- substituindo-se o antissoro. Para a realiza-
do) posicionar um disco de ColiComplete ção do teste, devem ser seguidas as orien-
(BioControl), que contém substratos para a tações do fabricante. Se o resultado for ne-
b-galactosidase (X-GAL) e b-glicuronidase gativo, prosseguir com os testes de confir-
(MUG). Usar como controle positivo uma mação abaixo, porque pode tratar-se de uma
placa de TSA-YE inoculada de forma similar variante não-móvel (O157: NM). Recomen-
com uma cultura de E. coli b-glicuronidase da-se também cultivar em Ágar Sangue para
positiva. Incubar as placas a 37±1°C/18-24h induzir a motilidade e repetir o teste soroló-
e observar a reação no disco de ColiCom- gico flagelar.
plete. E. coli e E. coli O157:H7 são b-galac- d.2) Confirmação bioquímica com o “kit”
tosidase positivas e provocam uma cor azul API 20E. O teste deve ser feito seguindo
intensa sobre o disco e em volta dele. E. coli as orientações do fabricante. A combina-
O157:H7 é b-glicuronidase negativa e não ção mais típica de E. coli O157:H7 nos
provoca fluorescência sobre sobre o disco ou 21 primeiros testes da cartela de resultados
em volta dele quando observado sobre luz é “5144172” (91,9% das cepas), podendo
UV (365-366nm), enquanto a cepa controle também ocorrer as combinações “5144152”
positivo sim.. (cepas sacarose negativas) e “5144162” (ce-
c.3) Teste de indol. Colocar uma folha de papel pas rhamnose negativas).
de filtro em uma placa de Petri e umedecer
com o reagente de Kovacs para teste de in- Culturas confirmadas devem ser enviadas a um
dol. A partir das placas de TSA-YE com re- laboratório apto à realização dos testes molecula-
ação típica no disco de ColiComplete (azul res necessários à detecção de genes associados à
sem fluorescência) espalhar uma pequena fatores de virulência, como as shiga toxinas (stx1
quantidade da cultura sobre o reagente no e stx2), a enterohemolisina (ehxA) e a gama-inti-
papel. Observar se ocorre o desenvolvimen- mina (eae).

17.3. Referências
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62(11):133-1335.

18 Listeria monocytogenes
Item 18.1 (revisado) A introdução foi atualizada em quase todos os itens (taxonomia, epidemiologia, comentários
sobre os métodos de análise, quadro 18.4).
Item 18.2 (revisado). A versão de 2003 do método BAM/FDA foi substituída pela versão de 2016, sendo inseridas
orientações para a estocagem de amostras e as seguintes alterações:
Item 18.2.2.a, b, c Além do teste de presença/ausência, foram inseridos procedimentos para determinação do
NMP e para contagem direta em placas.
Item 18.2.2.b Os meios e condições de incubação recomendados para o plaqueamento seletivo diferencial
foram alterados.
Item 18.2.2.d Inseridas orientações para confirmação usando “kits”. O teste de motilidade passa a ser feito no
Meio Teste de Motilidade, na temperatura de 20-25 ºC. A inoculação para o teste de hemólise passa a ser feita
por picada, em placas com camada grossa de ágar sangue.
Item 18.3 (revisado) A versão de 2009 do método mlG/FSIS/USDA foi substituída pela versão de 02/01/2017,
com as seguintes alterações:
18.3.2.a (corrigido) O caldo de enriquecimento seletivo primário é o Caldo Universidade de Vermont Modi-
ficado.
18.3.2.a.1 (revisado) O tempo de incubação do UVM no enriquecimento seletivo primário passa para 20 a 26
horas. Inseridas notas com detalhes sobre procedimento de preparação de determinadas amostras.
Item 18.4 (2010) (eliminado) Foi eliminado o método APHA (2001) de plaqueamento direto para contagem de L.
monocytogenes em placas.
Item 18.4.2.a (2017) (corrigido) Caldo Half-Fraser Base em lugar de Caldo Half-Fraser (vide nota a.1).
Item 18.4.2.f (2017) (revisado) Cálculo dos resultados revisado segundo a ISO 7218:2007/Amd 1:2013.
18.1. Introdução IB, que inclui as doenças “de severo perigo para
população restrita, representando ameaça de mor-
Listeria monocytogenes é uma bactéria patogê-
te, sequelas crônicas ou longa duração”.
nica potencialmente letal para o homem e outros
animais. As doenças de origem alimentar (DTAs)
18.1.1. Taxonomia
provocadas em humanos são classificadas pela
International Commission on Microbiological Na 9ª edição do Bergey’s Manual of Determinative
Specifications for Foods (ICMSF, 2002) em dois Bacteriology (Holt et al., 1994) o gênero Listeria
grupos de risco: Para a população em geral são estava alocado no Grupo 19, que incluía todos os
classificadas no Grupo II, que inclui as doenças bastonetes regulares Gram positivos. Na 2ª edição
“de sério perigo, não representando ameaça de do Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology os
morte e normalmente não deixando sequelas, mas membros do Grupo 19 foram divididos em dois
incapacitando por períodos moderados”. Para mu- phyla: o gênero Renibacterium foi transferido
lheres grávidas, indivíduos com o sistema imuno- para o philum Actinobacteria e os outros gêneros
lógico comprometido são classificadas no Grupo de bastonetes regulares Gram positivos, incluindo

Listeria, foram transferidos para o phylum “Fir- descritas no Quadro 18.2, em comparação com as
micutes” (Garrity & Holt, 2001). espécies originais.
O phylum “Firmicutes” inclui todas as bactérias As espécies do gênero Listeria são compostas de
Gram positivas com baixo teor de G+C no DNA bastonetes Gram positivos, não esporogênicos,
(<50) (Schleifer, 2009). O gênero Listeria foi móveis ou imóveis. Quando móveis apresentam
classificado na família Listeriaceae, que também motilidade característica a 25 ºC, com movimen-
inclui o gênero Brochothrix (Ludwig et al., 2009). tos rotatórios ou de tombamento, em montagens
úmidas observadas ao microscópio sob imersão.
De acordo com McLauchlin & Rees (2009), Listeria
Em meios de motilidade como o Ágar Indol Sul-
e Brochothrix podem ser diferenciados pela morfo-
feto Motilidade (SIM), desenvolvem uma zona de
logia das células, pela motilidade (Brochothrix é
migração típica, espalhando-se na parte superior
imóvel) e pela aparência das colônias (Brochothrix
do meio e mantendo-se restritas à picada no fundo
não apresenta coloração azulada sob luz oblíqua).
do tubo. Esse tipo de migração produz uma mas-
Além disso, a temperatura ótima de Brochothrix é
sa de crescimento característica, lembrando um
de 20-25 ºC e o crescimento ocorre na faixa entre 0
guarda-chuva (McLauchlin & Rees, 2009, Weller
e 30 ºC, enquanto Listeria tem um ótimo entre 30 e
et al., 2015).
37 ºC e cresce entre <0 e 45 ºC. L. monocytoges é
As seis espécies originalmente alocadas no gênero
psicrotrófica e cresce bem sob refrigeração.
Listeria (Quadro 18.1), incluindo Listeria mono-
Duas espécies de Listeria são reconhecidamente
cytogenes, são anaeróbias facultativas e requerem
patogênicas: L. monocytogenes, patogênicas para
a presença de um carboidrato para crescimento.
humanos e outros animais e L. ivanovii, patogêni-
Produzem ácido mas não gás a partir da glicose e
ca para animais e raramente encontrada em huma-
outros carboidratos. Catalase positivas e oxidase
nos (Low & Donachie, 1997). Essas duas espécies
negativas. Não sobrevivem à pasteurização clás-
contém genes para fatores de virulência associa-
sica (60 ºC/30min). Crescem na faixa de pH entre
dos à entrada da bactéria na célula do hospedeiro,
6,0 e 9,0, suportam a presença de 10% de NaCl
que são a listeriosina O (LLO) (uma proteína de
(algumas cepas suportam até 20%) e de 40% de
58kDa codificada pelo gene hly), a fosfatidili-
bile. Em meios de cultura de cor clara (creme ou
nositol fosfolipase C (PI-PLC) (uma proteína de
bege) produzem colônias que, observadas sob luz
33kDa codificada pelo gene plcA) e a fosfatidil-
oblíqua, apresentam uma coloração levemente
colinia fosfolipase C (PC-PLC) (uma proteína de
azulada e iridescente (McLauchlin & Rees, 2009).
29kDa codificada pelo gene plcB) (Schmid et al.,
Nem todas essas características são relatadas na
2005, Liu, 2006).
descrição das novas espécies.
Listeria é amplamente distribuída na natureza Todas as listerias hidrolizam esculina (Weller et
e no ambiente de produção de alimentos (solo, al., 2015, McLauchlin & Rees, 2009), um glico-
água, vegetação, fezes de animais saudáveis, in- sídeo de ocorrência natural usado para detectar
cluindo humanos, esgoto, resíduos de abatedou- atividade da enzima b-glicosidase (esculinase).
ros, ração animal, frango resfriado e congelado), O produto da hidrólise da esculina, esculetina
mas a doença é transmitida primordialmente atra- (6,7-dihidróxicumarina), pode ser detectado em
vés do consumo de alimentos contaminados por meios de cultura contendo sais de ferro, através da
L. monocytogenes (McLauchlin & Rees, 2009). formação de um complexo preto ou castanho. A
Até a publicação da 2ª edição do Bergey’s Manual esculina é o substrato da b-glicosidase mais usado
of Systematic Bacteriology o gênero Listeria era em meios de cultura, mas uma gama de glicosíde-
composto de seis espécies (McLauchlin & Rees, os sintéticos também estão disponíveis atualmen-
2009), descritas no Quadro 18.1. Após a publica- te, que resultam em produtos coloridos.
ção do Bergey’s 11 novas espécies foram desco- L. monocytogenes, L. ivanovii e L. seeligeri são
bertas (Euzéby, 2016), cujas características estão hemolíticas em meios contendo sangue. As de-

Listeria monocytogenes □ 267
Quadro 18.1. Características usadas na diferenciação das seis espécies originais do gênero Listeria,
descritas até a publicação da 2ª edição do Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (McLauchlin
& Rees, 2009).
Característica L.monocytogenes L.grayi L.innocua L.ivanovii L.seeligeri L.welshmeri
b-hemólise + - - + + -
CAMP Test – S. aureus + - - - + -
CAMP Test – R. equii - - - + - -
Lecitinase + - - + d -
Catalase + + + + + +
Oxidase - - - - - -
Hidrólise da esculina + + + + + +
Crescimento em Ágar Bile + + + + + +
Redução do nitrato - -a - - - -
D-manitol - + - - - -
D-xilose - - - + + +
L-rhamnose + + d - - d
a-D-manosídeo + + + - - +
Símbolos: +, mais de 85% das cepas positivas; d, varia entre as cepas (16-84% positivas); -, 0 a 15% das cepas positivas.
a
Positivo para L. grayi subsp. murrayi.
Quadro 18.2. Características usadas por Weller et al. (2015) na diferenciação das espécies de Listeria,
incluindo as que foram descritas após a publicação da 2ª edição do Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology.
1. L. monocytogenes, 2. L. innocua, 3. L. seeligeri, 4. L. ivanovii, 5. L. welshimeri, 6. L. grayi, 7. L. marthii, 8. L. rocour-
tiae, 9. L. weihenstephanensis, 10. L. cornellensis, 11. L. riparia, 12. L. grandensis, 13. l. fleischmannii, 14. L. aquatica,
15. L. floridensis, 16. L. newyorkensis, 17. L. booriae.
Característica 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Motilidade + + + + + + + - - - - - - - - - -
Hemólise + - + + - - - - - - - - - - - - -
PI-PLC (fosfatidil inositol fosfolipase C) + - - + - - - - - - - - - - - - -
Voges Proskauer (VP) + + + + + + + - - - - - - v - - -
Redução do nitrato - - - - - v - + + + + + + + - + +
Vermelho de Metila (VM) + + + + + + + v v v + v + + + + +
D-Manitol - - - - - + - + + - v - v - - + +
D-Xilose - - + + + - - + + + + + + + + + +
L-Rhamnose + v - - v - - + + - + - + + + v +
a-Manosidase + + - - + v + + - - + - - + - - +
Maltose + + + + + + + + + + + + + - + + +
Lactose + + + + + + + + v (+) + - + - + + +
Sacarose + + + + + - - - - - - - v - - - -
D-Ribose - - - + - + - + - + v + + + - + v
L-Arabinose - - - - - - - - - v + - - + + + +
D-Arabitol + + + + + + + - + - - v + - - - +
Símbolos: + = positivo, (+) = fracamente positivo, - = negativo, v = variável, ND = não determinado.

mais espécies não são hemolíticas (Weller et al., principais grupos de risco são mulheres grávidas e
2015). A zona de hemólise produzida por L. mono- seus fetos ou recém-nascidos (infecção perinatal e
cytogenes e L. seeligeri é restrita, com margem in- neonatal), indivíduos com o sistema imunológico
distinta. L.ivanovii, ao contrário, produz um halo enfraquecido devido à utilização de medicamentos
de hemólise mais extenso e com margens clara- (corticosteróides, drogas para câncer e para trans-
mente definidas. Para melhor visualização do halo plantados), pacientes com câncer (particularmente
de hemólise de L. monocytogenes é recomendado leucemia), pacientes de AIDS e, menos frequente-
o uso do ágar sangue em sobrecamada fina (uma mente, diabéticos, cirróticos, asmáticos, indivíduos
camada de meio base sem sangue e sobre esta, com colite ulcerativa, idosos e indivíduos fazendo
depois de solidificada, uma sobrecamada fina do uso de antiácidos ou cimetidina
meio completo contendo o sangue) (McLauchlin A dose infectiva de L. monocytogenes é desconhe-
& Rees, 2009). cida, mas acredita-se que varia de uma cepa para
Também pode ser usado o teste CAMP para re- outra, bem como em função da susceptibilidade
alçar a reação de hemólise de L. monocytogenes do hospedeiro e do tipo de alimento contaminado.
na proximidade de uma cultura de Staphylococcus Em casos provocados pelo consumo de leite cru
aureus ou de Rhodococcus equi. L. monocytoge- ou inadequadamente pasteurizado há evidências
nes e L. seeligeri apresentam halo de hemólise de que menos de 1.000 células provocaram a do-
realçado (CAMP positivo) próximo a S. aureus ença em indivíduos susceptíveis.
mas não de R. equi. L. ivanovii é CAMP positiva A duração da(s) doença(s) também depende do
com R. equi e negativa com S. aureus. As demais estado de saúde do indivíduo infectado, podendo
espécies de Listeria não são hemolíticas no teste variar de alguns dias a várias semanas.
CAMP (McLauchlin & Rees, 2009, Weller et al.,
A gastroenterite geralmente é auto-limitada e, no
2015).
caso de indivíduos saudáveis, os sintomas são le-
Nas investigações epidemiológicas é comum a ves (ou inexistentes), não requerendo tratamento
sorotipagem de L. monocytogenes, que tem 13 so- ou hospitalização. Podem ocorrer febre, dores
rotipos (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, musculares, náusea, vômito e, eventualmente,
4c, 4d, 4e e 7). Os mais comuns nas infecções de diarreia. O período de incubação é curto variando
origem alimentar são 1/2a, 1/2b e 4b. entre poucas horas e 2-3 dias.
A forma severa e invasiva, por outro lado, está
18.1.2. Epidemiologia entre as principais causas de óbito por doenças de
As informações abaixo são da 2ª edição do Bad Bug origem alimentar, com taxa de mortalidade média
Book - Foodborne Pathogenic Microorganisms entre 15 e 30%. Quando provoca meningite, a taxa
and Natural Toxins (FDA, 2012). de mortalidade média pode chegar a 70%. No caso
A ingestão de alimentos contaminados com L. mode septicemia a média é de 50% e no caso de in-
nocytogenes pode causar dois tipos de doença, uma fecções perinatais ou neonatais é de mais de 80%.
não invasiva com sintomas típicos de gastroente- As grávidas, embora mais susceptíveis à listerio-
rite e uma muito mais grave, que ocorre quando a se, podem desenvolver um quadro leve (seme-
infecção atinge a corrente sanguínea (septicemia) e lhante ao da gripe) e se recuperar, mas seus fetos
espalha-se pelo sistema nervoso (incluindo o cére- geralmente não sobrevivem. Pode ocorrer aborto
bro), resultando em meningite e outros problemas ou morte antes do nascimento (um terço dos casos
potencialmente fatais. A forma de manifestação relatados) e os bebes que nascem vivos podem de-
tende a ser dependente do hospedeiro. Em indiví- senvolver bacteremia ou meningite
duos saudáveis fora dos grupos de risco geralmente Muitos alimentos têm sido associados à transmis-
ocorre a gastroenterite, mas nos grupos de risco a são de L. monocytogenes, incluindo leite cru, leite
forma mais grave normalmente se manifesta. Os pasteurizado inadequadamente, leite achocolata-

do, queijos (particularmente os frescos macios), (BAM) da Food and Drug Administration (FDA)
sorvetes, vegetais crus, carnes (bovina e de aves) (Hitchins et al., 2016), os métodos de detecção ou
cruas, derivados de carne (linguiças cruas fermen- contagem (NMP) do Microbiology Laboratory
tadas, salsichas tipo hot dog, peixes crus e defu- Guidebook ( mlG) do United States Department
mados e frutos do mar. of Agriculture (USDA, 2017) e os métodos de de-
A natureza psicrotrófica de L. monocytogenes, tecção ou contagem em placas da ISO (Internatio-
com bom crescimento sob refrigeração, é um pro- nal Organization for Standardization). Os proce-
blema para a indústria de alimentos. As fontes a dimentos, embora apresentem algumas variações
partir das quais atinge os alimentos nas fábricas na seleção dos meios de cultura e forma de prepa-
inclui os trabalhadores, o ar, os produtos usados ração das amostras, seguem basicamente as mes-
como matéria prima e as próprias superfícies do mas etapas que podem ser aplicadas a qualquer
ambiente de fabricação. A recontaminação pós tipo de alimento. No Quadro 18.3 encontram-se
processo é uma das causas mais comuns de pre- sumarizadas as etapas de subcultura, meios uti-
sença de L. monocytogenes no produto final. lizados e condições de incubação recomendados
em cada um desses métodos.
18.1.3. Comentários sobre os 18.1.3.1 Os métodos de detecção
métodos de análise (presença/ausência)
Um grande número de métodos de detecção ou Os métodos de detecção (presença/ausência) en-
contagem de L. monocytogenes em alimentos fo- volvem quatro etapas, duas de enriquecimento,
ram desenvolvidos ao longo dos anos, sendo mais para elevar a população de L. monocytogenes na
amplamente difundidos e utilizados os métodos amostra, uma de plaqueamento seletivo diferen-
de detecção ou contagem (NMP ou plaqueamen- cial, para separar e diferenciar L. monocytogenes
to direto) do Bacteriological Analitycal Manual das outras bactérias presentes (obtenção de colô-
Quadro 18.3. Etapas de subcultura, condições de incubação e meios de cultura utilizados na análise de
Listeria monocytogenes em alimentos pelos métodos da FDA, USDA e ISO.
Método a Primeiro enriquecimento b Segundo enriquecimento b Plaqueamento diferencial b
FDA/BAM (2016) BLEB sem os agentes BLEB com os agentes Escolher dois meios,
presença/ausência seletivos a 30 ºC/4h seletivos a 30 ºC/24 e 48h uma à base de esculina
FDA/BAM (2016) NMP Não tem BLEB (completo) a 30 ºC/48h (OXA ou equivalente c ) e
FDA/BAM (2016) um cromogênico
Não tem Não tem (ALOA ou equivalente d )
contagem em placas
USDA/MLG (2017) Caldo Fraser a 35±2 ºC/26-48±2h
UVM a 30±2 ºC/20-26h MOX a 35±2 ºC/26±2h
presença/ausência e NMP ou MOPS-BLEB a 35±2 ºC/18-24h
ISO 11290-1:1996 ALOA a 37±1 ºC/24±3h
Caldo Fraser a 35±1 ºC/48h ou
amendment 1:2004 Half-Fraser a 30±1 ºC/24h ou 48±6h
37±1º/48h
presença/ausência 2º Opcional e
ISO 11290-2:1998
BPW ou Half-Fraser Base a
amendment 1:2004 Não tem ALOA a 37±1 ºC/24±3h ou 48±6h
20±2 ºC/1h±5min
contagem em placas
a FDA/BAM = Food and Drug Administration, Bacteriological Analitycal Manual (Hitchins et al., 2016), USDA/MLG = Microbiology Laboratory Guidebook/
United States Department of Agriculture (USDA, 2017), ISO = International Organization for Standardization.
b ALOA = Ágar Listeria Ottaviani & Agosti (AES Laboratoire), BLEB = Caldo de Enriquecimento de Listeria Tamponado, BCM = Biosynth C-0608 e C-0637,
BPW = Água Peptonada Tamponada, CHROMagar Listeria = BBL 215085, Half-Fraser = Caldo Fraser com apenas metade da concentração dos agentes
seletivos ácido nalidíxico e acriflavina HCl, LPM-esculina FE3+ = Ágar Cloreto de Lítio Feniletanol Moxalactan suplementado com esculina e Fe3+,
MOPS-BLEB = Caldo de Enriquecimento de Listeria Tamponado com Ácido Morpholinopropanosulfonico (MOPS), MOX = Ágar Oxford Modificado,
OCLA = Ágar Oxoid Listeria Cromogênico (Oxoid), OXA = Ágar Oxford, Palcam = Palcam Listeria Selective Agar, Rapid’ L.mono = Bio-Rad 356-3694
e 355-5294, UVM = Caldo Universidade de Vermont.
c Meios recomendados à base de esculina: OXA, MOX ou Palcam a 35 ºC/24-48h, LPM-esculina-Fe3+ a 30 ºC/24-48h.
d Meios recomendados cromogênicos: ALOA®, OCLA, CHROMagar Listeria, Rapid’ L.mono a 37 ºC/24-48h, BCM a 35 ºC/24-48h
e O segundo meio é de livre escolha do laboratório, complementar ao ALOA, como o OXA ou Palcam (incubação conforme orientação do fabricante).

nias típicas isoladas) e uma de confirmação, para cam, todos tendo em comum o Ágar Columbia
verificar se as colônias típicas obtidas são mesmo como base, o cloreto de lítio como agente seletivo
de L. monocytogenes. e a esculina combinada com o citrato férrico amo-
Nas duas etapas de enriquecimento, o primei- niacal, para detectar a atividade da b-glicosidase.
ro (pré-enriquecimento), é feito em caldos nu- A diferença entre esses meios está no tipo de anti-
tritivos não seletivos ou parcialmente seletivos, microbianos adicionados para inibir a microbiota
objetivando o cultivo e a reparação de células acompanhante, que inclui diferentes combinações
injuriadas. O segundo (enriquecimento seletivo), de um ou mais dos seguintes antibióticos: cicloe-
objetiva favorecer a multiplicação de L. mono- ximida, colistina, acriflavina, cefotetan, fosfomi-
cytogenes e inibir a microbiota acompanhante. cina, moxalactan e ceftazidima. Um outro meio
Geralmente é feito nos mesmos caldos de pré-en- que também pode ser usado, embora a formulação
riquecimento, só que suplementados com vários original não contenha esculina nem citrato férrico,
agentes antimicrobianos (usualmente ácido nali- é o Ágar Cloreto de Lítio Feniletanol Moxalactan
díxico, acriflavina e cicloeximida). (LPM), desde que suplementado com esses com-
ponentes. O LPM foi muito usado em anos pas-
No caso da ISO 11290-1:1996/Amd 1:2004, o
sados, para observação das características típicas
meio de enriquecimento seletivo é o Caldo Fraser,
das colônias de Listeria sob luz oblíqua (transilu-
que além dos agentes seletivos, também contém
minação, que pode ser obtida através de uma fonte
esculina e citrato férrico, para detectar a atividade
forte de luz branca na parte inferior das placas,
da b-glicosidase. No pré-enriquecimento é usado
posicionadas em ângulo de 45º em relação à fonte
o mesmo meio, porém, com a concentração de
de luz). Nessas condições, as colônias de Listeria
ácido nalidíxico e de acriflavina reduzidas à me-
tendem a apresentar uma coloração azulada com
tade (situação em que é chamado de Caldo Half-
aparência de vidro moído, enquanto as colônias
-Fraser ou Caldo Demi-Fraser).
dos competidores tendem a apresentar-se amare-
A USDA/MLG também usa o Caldo Fraser no en-
ladas ou alaranjadas.
riquecimento seletivo e, no pré-enriquecimento,
Com relação aos meios cromogênicos, há no mer-
utiliza o Caldo Universidade de Vermont Modi-
cado dois grupos de formulações para Listeria, se-
ficado (UVM), cuja composição é basicamente a
gundo Reissbrodt (2004). O primeiro grupo inclui
mesma do Caldo Fraser, com a concentração de
o Ágar Listeria de Ottaviani & Agosti (ALOA) e o
acriflavina reduzida pela metade.
CHROMagar, que incorporam dois substratos di-
A FDA/BAM usa o Caldo de Enriquecimento ferenciais; um cromogênico, para a b-glicosidase,
para Listeria Tamponado (BLEB) no enriqueci- e um não cromogênico, para a(s) fosfolipase(s). O
mento seletivo e o mesmo meio, sem os agentes CHROMagar™ é uma marca registrada e sua for-
seletivos, no pré-enriquecimento. mulação é confidencial (propriedade dos fabrican-
No plaqueamento seletivo diferencial geralmen- tes). O meio é produzido pela CHROMagar (Fran-
te são usados dois diferentes meios de cultura, um ça) e pela Becton, Dickinson & Company (USA),
à base de esculina, que diferencia Listeria (todas) como BBL™ CHROMagar™. O ALOA foi intro-
da microbiota acompanhante b-glicosidase nega- duzido pela ISO em 2004, através das emendas
tiva, e um cromogênico que, além de diferenciar às normas ISO 11290-1:1996 e 11290-2:1998. A
Listeria através da atividade da b-glicosidase, formulação é conhecida e contém uma mistura de
também diferencia L. monocytogenes/L. ivanovii agentes seletivos que objetivam inibir bactérias
das demais listerias, através da atividade de fos- Gram negativas e Gram positivas (ácido nalidíxi-
folipase(s). co, ceftazidima, polimixina), bem como bolores
Os meios seletivos diferenciais baseados em es- e leveduras (cicloeximida ou anfotericina). Dois
culina mais usados são o Ágar Oxford (OXA), o agentes diferenciais foram incorporados. Um é o
Ágar Oxford Modificado (MOX) e o Ágar Pal- X-Glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-glicopira-

nosídeo), substrato cromogênico para a enzima alíquotas por diluição, em uma série de tubos (ou
b-glicosidase de Listeria, cujo produto de reação frascos) contendo o caldo de pré-enriquecimento
confere às colônias uma coloração verde azula- (como no método da USDA/MLG) ou de enrique-
da. O outro é o fosfatidilinositol, para detectar a cimento seletivo (como no método da FDA). Uma
atividade da enzima fosfatidilinositol fosfolipase vez feita a inoculação o ensaio segue normalmen-
C (PI-PLC), reconhecida como um fator de viru- te para cada tubo separadamente.
lência de L. monocytogenes. No meio de cultura, Na contagem em placas (FDA/BAM e ISO
a atividade dessa enzima provoca a formação de 11290-2) são usados um ou dois meios seletivos
um halo opaco em redor das colônias. L. ivanovii diferenciais para a inoculação direta da amostra,
também produz fosfatidilinositol fosfolipase, deos mesmos recomendados no teste de presença/
senvolvendo colônias similares no ALOA, porém, ausência. A preparação da amostra para a análise
seu crescimento é retardado nesse meio. L. inno- segue os procedimentos padrão descritos no Ca-
cua cresce bem no ALOA, mas não forma o halo pítulo 2. No método da FDA/BAM as amostras
de fosfolipase, enquanto L. seeligeri é inibida. sólidas são homogeneizadas com a base do Caldo
O segundo grupo de meios cromogênicos rela- BLEB (sem os agentes seletivos) para preparar a
tados por Reissbrodt (2004) inclui o BCM®, o diluição 10-1, inoculando-se pelo menos três dilui-
Rapid’L.mono e o LIMONO-Ident-Agar, que ções por plaqueamento em superfície. No método
utilizam o X-phos-Inositol (5-bromo-4-cloro- ISO 11290-2 a diluição 10-1 pode ser preparada no
3-indoxil mio-inositol-1-fosfato) como substrato diluente padrão da ISO, que é a Água Peptona-
cromogênico para a fosfatidilinositol fosfolipase da Tamponada (BPW), ou no Caldo Half-Fraser
C (PI-PLC). A formulação desses meios é confi- Base (Caldo Fraser, sem qualquer agente seleti-
dencial, mas o substrato X-phos-Inositol é produ- vo), se também houver interesse em submeter a
zido pela Biosynth (Suíça) que, em 2006, dispo- mesma unidade analítica ao teste de presença/
nibilizou as seguintes informações, relatadas por ausência. Antes do plaqueamento a ISO 11290-2
Silva et al. (2013): O substrato X-phos-Inositol recomenda incubar a diluição 10-1 a 20 ºC por uma
é utilizado na formulação do BCM® (Biosynth hora, para reparação de injúrias.
Listeria monocytogenes Plating Media) I e II, no
18.1.3.3. Os “kits” analíticos
Rapid´L.mono (BioRad) e no LIMONO-Ident-A-
gar (Heipha, Eppelheim, Germany). A clivagem Outros métodos que já foram oficializados pela
do X-phos-Inositol pelas listerias patogênicas (L. AOAC International para a análise de Listeria
monocytogenes e L. ivanovii) resulta em colônias monocytogenes em alimentos são os “kits” analí-
de cor turquesa. As demais listerias não patogê- ticos descritos no Quadro 18.4.
nicas formam colônias brancas. O BCM® II e o
LIMONO-Ident-Agar contém, adicionalmente, 18.1.3.4. Cuidados especiais na
realização das análises
uma mistura de lecitinas, para detectar tanto a PI-
-PLC quanto a PC-PLC, através da formação de A análise de L. monocytogenes deve ser conduzi-
um halo branco de precipitação em redor das co- da por pessoal bem treinado, para garantir a segu-
lônias turquesa. rança do analista e do laboratório. Nenhum indi-
víduo que faça parte dos grupos de risco, mesmo
18.1.3.2. Os métodos de contagem treinado, deve ser autorizado a realizar essas aná-
A contagem pelo NMP (FDA/BAM e USDA/ lises ou a entrar no laboratório durante a sua reali-
MLG) segue basicamente as mesmas etapas da zação. Os principais grupos de risco são mulheres
detecção de presença/ausência, mas aplicadas grávidas (e seus fetos) e indivíduos com o sistema
a uma série de alíquotas da amostra. O procedi- imunológico temporária ou definitivamente com-
mento padrão é a inoculação de três ou quatro prometido. Para esses indivíduos, a taxa de mor-
diluições decimais sequenciais da amostra, três talidade por listeriose é alta.

Quadro 18.4. “Kits” analíticos oficializados pela AOAC International para a detecção de Listeria mo-
nocytogenes em alimentos (Latimer, 2016, AOAC International, 2016).
AOAC Official
Analito Fabricante Nome do “kit” Aplicação
Method
993.09 Listeria spp. Neogen Corporation GENE TRAK Listeria Assay Alimentos
Alimentos e amostras
994.03 Listeria spp. Organon Teknika Listeria-Tek
ambientais
Alimentos e relacionados,
995.22 e 2002.09 Listeria spp. TECRA Diagnostics TECRA Listeria VIA
amostras ambientais
996.14 Listeria spp. BioControl Systems, Inc. Transia AG Listeria
amostras ambientais
997.03 Listeria spp. BioControl Systems, Inc. VIP for Listeria
amostras ambientais
999.06, 2004.06 Listeria spp. BioMerieux VIDAS Listeria (LIS)
amostras ambientais
Bax PCR Automated System for
2003.12 Listeria monocytogenes Dupont/Qualicon Alimentos
L.monocytogenes
VIDAS Listeria monocytogenes
2004.02 Listeria monocytogenes BioMerieux Alimentos
II (LMO2) Immunoassay
VIDAS Listeria (LIS)
2004.06 Listeria spp. BioMerieux Immunoassay using Alimentos
Demi-Fraser and Fraser Broths
Diversos alimentos e
2013.10 Listeria spp. BioMerieux VIDAS UP Listeria (LPT) superfícies do ambiente
de fabricação
VIDAS Listeria monocytogenes
2013.11 Listeria monocytogenes BioMerieux Diversos alimentos
Xpress (LMX)
Diversos alimentos e
3M Microbiology 3M™ Molecular Detection
2014.06 Listeria spp superfícies do ambiente
Products System Assay for Listeria spp
de fabricação
3M™ Molecular Detection Diversos alimentos e
3M Microbiology
2014.07 Listeria monocytogenes System Assay for superfícies do ambiente
Products
Listeria monocytogenes de fabricação
No tratamento das amostras para a análise de ali- Nas carnes embaladas à vácuo é concentrado na
mentos refrigerados, o Compendium of Methods superfície ou próximo da superfície em contato
for the Microbilogical Examination of Foods com o filme. 4) O crescimento de L. monocytoge-
(Ryser & Donnelly, 2015) apresenta alguns cui- nes nesses alimentos também tende a ser errático
dados: 1) Na análise quantitativa, é importante ou pontual, concentrando-se em algumas porções
que as amostras sejam analisadas o mais rápido de um lote e em outras não. Assim, a amostragem
possível, porque L. monocytogenes cresce nessas de lotes no varejo deve contemplar um número
temperaturas, podendo ocorrer uma elevação na grande de unidades de amostra, para uma avalia-
quantidade originalmente presente. 2) Não é re- ção mais precisa da extensão da contaminação.
comendado, a menos que estritamente necessário, Durante a realização das análises, recomendam-se
o congelamento dessas amostras porque, embora os seguintes cuidados: 1) que todo o manuseio das
L. monocytogenes seja relativamente resistente ao amostras e meios de cultura seja feito sobre ban-
congelamento, pode ocorrer redução em alguns dejas e não diretamente sobre as bancadas, 2) que
alimentos. 3) O crescimento de L. monocytogenes nenhuma coleta de líquido seja feita com a boca e
não é uniforme nesses produtos, devendo-se tomar sim com pipetadores, 3) que ao trabalhar em ca-
a unidade analítica nas regiões onde o crescimento pela de fluxo laminar se utilize um modelo verti-
é concentrado. Em queijos a região de concentra- cal, adequado ao manuseio de patógenos, 4) que
ção é a parte interna mais próxima da superfície. se mantenha ao alcance das mãos um frasco de

desinfetante como solução de cloro a 100ppm, so- □ Tubos de Caldo Tripticase de Soja Extrato de
lução de álcool 70% ou solução de álcool iodado, Levedura (TSB-YE)
para descontaminar qualquer descarga inadvertida □ Tubos de Meio Teste de Motilidade
de material contaminado, 5) que todo o descarte □ Reagente de catalase (peróxido de hidrogênio
de material seja precedido da descontaminação a 3%)
em autoclave a 121 ºC/30min, 6) que toda a área □ Reagentes para coloração de Gram
de trabalho seja prontamente descontaminada, □ Sistema comercial de identificação como o
uma vez concluídas as análises, 7) que no preparo API Listeria (BioMeriéux) ou MICRO-IDTM
e homogeneização das amostras se tomem pre- (Remel) ou Vitek 2 Automatic Gram Positive
cauções para evitar a formação de aerossóis. Para card (bioMerieux)
tanto, recomenda-se que a homogeneização seja □ Material para provas bioquímicas (opcional na
feita preferencialmente em “stomacher” e que, indisponibilidade de “kits” comerciais)
na homogeneização em liquidificador, a tampa □ Placas de Ágar Sangue Nº 02
seja protegida por papel amarrado com barbante, □ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5%
aguardando-se a acomodação do material homo- dextrose
geneizado, antes da abertura do frasco. □ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5%
maltose
□ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5% es-
18.2. Método culina
FDA/BAM.10:2016 para □ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5% xi-
detecção ou contagem de lose
□ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5%
Listeria monocytogenes
rhamnose
em alimentos □ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5%
manitol
Método da US Food and Drug Administration
□ Tubos de Caldo Nitrato
(FDA), descrito no Capítulo 10 do Bacteriologi-
□ Reagentes de Nitrato (Solução 0,8% de áci-
cal Analitycal Manual (BAM) Online (Hitchins et
do sufanílico, Solução 0,5% de alfa-naftol)
al., 2016). Aplicação: todos os alimentos.
□ Cultura de Staphylococcus aureus beta-he-
molítico (ATCC 49444, ATCC 25923, NCTC
18.2.1. Material requerido para a 7428 ou CIP 5710) (vide nota 18.2.2.d.7)
análise □ Cultura de Rhodococcus equi (ATCC 6939
□ Caldo Enriquecimento para Listeria Tampona- ou NCTC 1621)
do (BLEB) □ Estufa incubadora a 30 ºC (não especificada a
□ Placas de Ágar Oxford (OXA) ou Ágar Oxford variação de temperatura aceitável no método
Modificado (MOX) ou Ágar Palcam Listeria da FDA)
Seletivo ou Ágar Cloreto de Lítio Feniletanol □ Estufa incubadora a 35 ºC (não especificada a
Moxalactan (LPM) suplementado com esculi- variação de temperatura aceitável no método
na e Fe3+ da FDA).
□ Placas de Ágar Listeria Ottaviani & Agosti
(ALOA®) (AES Laboratoire) ou Ágar Oxoid
Listeria Cromogênico (OCLA Oxoid CM 1084)
ou CHROMagarTM Listeria (BBL 215085) ou Os esquemas de análise para a detecção ou conta-
Rapid’ L.mono (Bio-Rad 356-3694 e 355-5294) gem em placas de L. monocytogenes pelo método
□ Tubos de Ágar Tripticase de Soja Extrato de FDA/BAM.10:2016 encontram-se descritos nas
Levedura (TSA-YE) inclinados Figuras 18.1.a e 18.1.b.

Figura 18.1.a. Esquema de análise para a detecção (presença/ausência) de L. monocytogenes em alimentos pelo método
FDA/BAM.10:2016 (Hitchins, et al., 2016).
OXA = Ágar Oxford, MOX = Ágar Oxford Modificado, PALCAM = Ágar Palcam Listeria Seletivo, LPM-Esculina-FE3+ = Ágar Cloreto de Lítio Feniletanol
Moxalactan (LPM) suplementado com esculina e Ferro3+, ALOA = Ágar Listeria Ottaviani & Agosti, OCLA = Ágar Oxoid Listeria Cromogênico (Oxoid CM
1084), CHROMagar Listeria (BBL 215085), Rapid’ L.mono (Bio-Rad 356-3694 e 355-5294).

Figura 18.1.b. Esquema de análise para a contagem de L. monocytogenes em alimentos pelo método de plaqueamento
FDA/BAM.10:2016 (Hitchins, et al., 2016).
OXA = Ágar Oxford, MOX = Ágar Oxford Modificado, PALCAM = Ágar Palcam Listeria Seletivo, LPM-Esculina-FE3+ = Ágar Cloreto de Lítio Feniletanol
Moxalactan (LPM) suplementado com esculina e Ferro3+, ALOA = Ágar Listeria Ottaviani & Agosti OCLA = Ágar Oxoid Listeria Cromogênico (Oxoid CM
1084), CHROMagar Listeria (BBL 215085), Rapid’ L.mono (Bio-Rad 356-3694 e 355-5294).

Recomendação do BAM para a estocagem das BLEB e três alíquotas de 1 ml da 10-2 para
amostras. A estocagem de alimentos perecíveis três tubos com 9 ml de BLEB (inoculados
comercializados sem congelamento deve ser feita 3x10g, 3x1g, 3x0,1g e 3x0,01g da amostra).
a 4±2 ºC pelo menor tempo possível. Se não for Incubar todos os frascos e tubos 30 ºC/48h.
possível realizar a análise em curto prazo, conge- Realizar todas as etapas subsequentes do en-
lar as amostras e manter a -20±5 ºC. saio para cada frasco ou tubo separadamente.
Cuidado. Ler atentamente as recomendações da Nota a.2.1) A prática usual nas análises de vigilância sa-
introdução do capítulo, item 18.1, subitem “cui- nitária da FDA é fazer a contagem apenas se o resul-
tado for positivo no teste de presença/ausência. Já na
dados especiais na realização das análises”, para
investigação de amostras suspeitas de surtos de lis-
familiarizar-se com as medidas necessárias à se- teriose, as amostras são imediatamente enumeradas.
gurança do analista e do laboratório.
b) Plaqueamento seletivo diferencial. No caso
a) Pré enriquecimento e enriquecimento seletivo. do teste de presença/ausência, fazer o plaquea-
a.1) Teste de presença/ausência. Seguindo as mento seletivo diferencial com 24 horas de en-
orientações do Capítulo 2, homogeneizar riquecimento, reincubar o caldo e repetir o pla-
25g da amostra com 225 ml de Caldo de queamento com 48 horas. No caso da contagem
Enriquecimento para Listeria Tamponado do NMP fazer o plaqueamento com 48 horas,
(BLEB), com piruvato de sódio mas sem os não sendo necessário plaquear com 24 horas.
agentes seletivos. Incubar a 30 ºC/4h, adi-
A partir das culturas obtidas em cada frasco ou
cionar os agentes seletivos e continuar a in-
tubo de BLEB inocular (estrias de esgotamento)
cubação a 30 ºC até completar 24-48 horas.
uma alçada em um dos seguintes meios seleti-
Nota a.1.1) Guardar 50g da amostra para posterior enu- vos contendo esculina. Incubar as placas confor-
meração, se necessária. Amostras de alimentos res-
friados devem ser mantidas a 5 ºC e amostras de ali-
me descrito para cada meio. L.monocytogenes
mentos congelados devem ser mantidas congeladas. forma colônias pretas ou rodeadas por um halo
Nota a.1.2) Pode ser feita a composição de até 10 amos- preto de hidrólise da esculina nesses meios. Re-
tras, da seguinte forma: Juntar 50g ou ml de cinco alizar a leitura com 24h de incubação e, se não
amostras (total 250g ou ml) e homogeneizar com houver desenvolvimento de colônias típicas nes-
250 ml de BLEB (com piruvato e sem os agentes se-
se intervalo, reincubar até completar 48 horas.
letivos). Proceder da mesma forma com as demais
cinco amostras. Juntar 50g ou ml de cada uma dessas ▪ Ágar Oxford (OXA), incubado a 35 ºC/
amostras compostas, já homogeneizadas e adicionar 24-48h.
200 ml de BLEB (com piruvato e sem os agentes se- ▪ Ágar Oxford Modificado (MOX), incubado
letivos). Incubar a 30 ºC/4h, adicionar os agentes se- a 35 ºC/24-48h.
letivos e continuar a incubação a 30 ºC até completar
24-48 horas. Manter 100g ou ml de cada amostra
▪ Ágar Palcam Listeria Seletivo, incubado a
composta original sob refrigeração (5 ºC) para poste- 35 ºC/24-48h.
rior repetição ou enumeração, se necessárias. ▪ Ágar Cloreto de Lítio Feniletanol Moxa-
Nota a.1.3) O método não especifica a variação aceitável lactan (LPM) suplementado com esculina e
na temperatura de incubação. Fe3+, incubado a 30 ºC/24-48h.
a.2) Contagem pela técnica do NMP. Seguindo Repetir este procedimento a partir das cultu-
as orientações do Capítulo 2, homogeneizar ras obtidas em cada frasco ou tubo de BLEB,
50g da amostra com 450 ml de Caldo de inoculando uma alçada em um dos seguintes
Enriquecimento para Listeria Tamponado meios seletivos cromogênicos para Listeria.
(BLEB) (10-1). Transferir três alíquotas de Incubar as placas e interpretar o resultado con-
100 ml da diluição 10-1 para três frascos es- forme descrito para cada meio. Realizar a lei-
téreis vazios, três alíquotas de 10 ml da 10-1 tura com 24h de incubação e, se não houver
para três tubos estéreis vazios, três alíquotas desenvolvimento de colônias típicas nesse in-
de 1 ml da 10-1 para três tubos com 9 ml de tervalo, reincubar até completar 48 horas.

▪ Ágar Listeria Ottaviani & Agosti (ALOA®) fazer o plaqueamento direto da amostra, sem
(AES Laboratoire) ou Ágar Oxoid Listeria enriquecimento, para contagem em placas.
Cromogênico (OCLA - Oxoid CM 1084) ou Seguindo as orientações do Capítulo 2, homo-
CHROMagar™ Listeria (BBL 215085), in- geneizar 25g da amostra com 225 ml da base
cubados a 37 ºC/24-48h. As colônias típicas do Caldo de Enriquecimento para Listeria
de L. monocytogenes e L. ivanovii são ver- Tamponado (BLEB sem agentes seletivos) (di-
de azuladas (1-3mm) com um halo branco luição 10-1). Preparar duas ou mais diluições
opaco em redor. Outras listerias também for- seriadas e inocular (plaqueamento em superfí-
mam colônias verde azuladas, mas sem halo. cie) 0,1 ml de cada diluição nos mesmos meios
▪ BCM® (Biosynth C-0608 e C-0637), incu- seletivos descritos no item b acima. Se a conta-
bado a 35 ºC/24-48h. As colônias típicas de gem esperada for baixa, plaquear 1 ml da 10-1,
L. monocytogenes e L. ivanovii são lisas, distribuindo o volume em quatro placas (três
convexas, 1-3mm, verde azuladas com um placas com 0,3 ml e uma placa com 0,1 ml).
pequeno halo verde azulado em redor. Outras
Incubar as placas nas mesmas condições des-
listerias formam colônias brancas sem halo.
critas no item b acima e continuar o ensaio
▪ Rapid’ L.mono (Bio-Rad 356-3694 e 355-
conforme descrito nos itens abaixo.
5294), incubado a 37 ºC/24-48h. As colônias
d) Confirmação das colônias típicas. Selecionar
típicas de L. monocytogenes são lisas, con-
pelo menos cinco colônias típicas de cada pla-
vexas, 1-3mm, verde azuladas. As colônias
ca de meio contendo esculina ou duas colônias
de L. ivanovii são iguais, mas com um halo
típicas de cada placa de meio cromogênico,
amarelo de fermentação da xilose. Outras
para confirmação. Estriar (estrias de esgota-
listerias formam colônias brancas, com ou
mento) cada colônia em uma placa de Ágar
sem halo amarelo. Observação: O Rapid’
Tripticase de Soja com 0,6% de extrato de le-
L.mono contém D-xylose e vermelho de fe-
vedura (TSA-YE), para purificação. Incubar as
nol para distinguir L. monocytogenes (xilo-
placas a 30 ºC/24-48h e observar as colônias
se negativa) de L. ivanovii (xilose positiva),
usando uma fonte forte de luz branca na parte
através da formação de um halo amarelo de
inferior das placas, posicionadas em ângulo de
fermentação da xilose em redor das colô-
45º em relação à fonte de luz. Selecionar uma
nias de L. ivanovii. No entanto, esta distin-
colônia azulada típica, bem isolada, para a rea-
ção nem sempre é confiável, porque a flora
lização das provas de confirmação.
acompanhante xilose positiva pode mudar a
cor de todo o meio (viragem por difusão de Com uma alça de inoculação, transferir a co-
ácido), dificultando a observação de halo em lônia para um tubo de TSA-YE inclinado e
volta de cada colônia individualmente. Outro um tubo de Caldo Tripticase de Soja Extrato
fato a ser considerado é que este meio apre- de Levedura (TSB-YE), incubando os tubos
senta uma cor vermelha (devido ao vermelho a 30 ºC/24h. Usar a cultura em ágar ou caldo
de fenol), que pode mascarar a coloração para a realização das provas bioquímicas, po-
azulada das colônias típicas (parecerão pretas dendo-se manter os tubos de TSB-YE a 4 ºC
contra o fundo vermelho). Conforme a flora por vários dias e usá-los repetidamente como
acompanhante xilose positiva for crescendo e inóculo.
mudando a cor do meio para amarelo, o verde A confirmação pode ser feita através dos testes
azulado das colônias típicas ficará evidente. bioquímicos descritos abaixo ou usando um
c) Plaqueamento para contagem direta em pla- dos kits miniaturizados de identificação abai-
cas. O plaqueamento seletivo diferencial nor- xo, seguindo as instruções do fabricante.
malmente é feito a partir das culturas obtidas ▪ API Listeria (bioMerieux, Durham, NC),
no enriquecimento, mas também é possível que requer um teste adicional de β-hemólise

para identificação final (ou CAMP teste, op- úmida, a partir da cultura em TSA-YE. Em
cional). uma lâmina de vidro, emulsionar uma alça-
▪ Micro-ID Listeria Identification System da com inóculo pesado da cultura em uma
(Remel, Lenexa, KS) que requer um teste gota de solução salina 0,85%, cobrir com
adicional de β-hemólise e o CAMP teste uma lamínula e observar imediatamente sob
para identificação final. imersão. As cepas de Listeria spp são bas-
▪ Vitek 2 Automatic Gram Positive card (bio- tonetes curtos e finos, com motilidade rota-
Merieux, Hazelwood, MO), que requer um cional (tumbling motility). Sempre compa-
teste adicional de β-hemólise e o CAMP tes- rar com uma cultura padrão de L. monocy-
te para identificação final. togenes.
Os kits analíticos oficializados pela AOAC d.4) Teste de verificação de hemólise. Com
International para a detecção de Listeria mo- uma caneta vidrográfica, demarcar 20 a
nocytogenes em alimentos (Quadro 18.4) tam- 25 setores no fundo de uma placa de Ágar
bém podem ser usados para confirmação de Sangue Nº 2 suplementado com sangue de
culturas puras. carneiro. A partir dos tubos de TSA-YE,
inocular cada uma das culturas suspeitas em
d.1) Teste de catalase. A partir dos tubos de
um dos setores demarcados. Fazer a inocu-
TSA-YE, transferir uma alçada da cultura
lação por picada, até bem próximo do fundo
para uma lâmina de microscopia, cobrir com
da placa, mas sem tocar o fundo. Usar uma
uma gota do reagente de catalase (peróxido
camada grossa de meio para este teste. In-
de hidrogênio 3%) e observar a ocorrência
cubar as placas a 35 ºC/24-48h. Para a lei-
de borbulhamento imediato (teste positivo)
tura, iluminar as placas por trás e observar
ou não-borbulhamento (teste negativo). As
a formação de uma região transparente de
cepas de Listeria são catalase positivas.
hemólise em redor da picada. As cepas de L.
d.2) Coloração de Gram. A partir dos tubos de
monocytogenes e L. seeligeri formam zonas
TSA-YE (16-24h), preparar um esfregaço e
discretas, que não se estendem muito para
submeter à coloração de Gram. As células
fora da região da picada, enquanto L. ivano-
de Listeria são bastonetes curtos Gram po-
vii forma zonas grandes e bem definidas e
sitivos. Culturas velhas podem ser Gram va-
L. innocua não apresenta hemólise. Resulta-
riáveis e, em esfregaços muito carregados,
dos duvidosos podem ser esclarecidos pelo
as células podem apresentar arranjo tipo
CAMP Test (item d.7, abaixo).
paliçada.
d.3) Teste de motilidade. A partir dos tubos de Nota d.4.1) Além das colônias selecionadas para confir-
TSA-YE, inocular cada cultura suspeita em mação, outras colônias típicas, se presentes nas pla-
cas de plaqueamento seletivo diferencial, podem ser
tubos de Meio Teste de Motilidade, por pi- também submetidas a este teste.
cada no centro do meio de cultura, até uma
distância a 1cm do fundo. Incubar os tubos d.5) Teste de fermentação da dextrose, xilo-
a 20-25 ºC/7 dias, observando diariamente. se, rhamnose, manitol, maltose e hidrólise
As cepas de Listeria são móveis e desen- da esculina. A partir dos tubos de TSB-YE,
volvem uma zona de migração típica, espa- inocular uma alçada de cada cultura em tu-
lhando-se na parte superior do meio e man- bos de caldo Púrpura Base suplementado
tendo-se restritas à picada no fundo do tubo. com 0,5% do carboidrato a ser testado. In-
Esse tipo de migração produz uma massa de cubar a 35 ºC/7 dias e observar diariamente
crescimento característica, lembrando um se há produção de ácido (alteração da cor
guarda-chuva. Alternativamente, observar do meio de púrpura para amarelo) e produ-
a motilidade ao microscópio, em montagem ção de gás (opcional, coletado em tubos de

Durham). Nenhuma cepa de Listeria produz mais nítido. As cepas de L. ivanovii, ao con-
gás a partir desses compostos de carbono e trário, apresentam halo mais nítido nas pro-
todas fermentam a dextrose e a maltose e hi- ximidades da estria de R. equi. L. seeligeri
drolisam a esculina. L monocytogenes tam- apresenta reação semelhante à de L. monocy-
bém fermenta a rhamnose mas não fermenta togenes. As outras espécies de Listeria não
a xilose e o manitol. O teste de hidrólise da são hemolíticas e não reagem nesse teste.
esculina pode ser omitido se a reação nas Nota c.7.1) No catálogo da ATCC (Americam Type Cul-
placas de plaqueamento seletivo diferencial ture Collection) a denominação atual da cepa No
à base de esculina se mostrou bem caracte- 49444 é Staphylococcus pseudintermedius, embora
rística. tenha sido originalmente depositada como Staphylo-
coccus aureus.
d.6) Teste de nitrato (opcional). A partir dos
tubos de TSA-YE, inocular uma alçada de
cada cultura em tubos com 5 ml de Caldo 18.3. Método
Nitrato e incubar a 35 ºC/5 dias. Após a in-
USDA/MLG 8.10:2017
cubação, adicionar aos tubos 0,2 ml de cada
um dos reagentes de nitrato: 1º) Reagente para detecção ou
A = solução 0,8% de ácido sulfanílico, 2º) contagem (NMP) de
Reagente B = solução 0,5% de α-naftol. Ob- Listeria monocytogenes
servar o desenvolvimento de uma cor rósea
avermelhada em no máximo 10min (tes-
em carnes/aves/ovos
te positivo) e, em caso negativo, adicionar Método do United States Department of Agricul-
uma pitada de pó de zinco, deixar em repou- ture (USDA), descrito no Capítulo 8.10 do Micro-
so por 10min e observar se o meio perma- biology Laboratory Guidebook Online (USDA,
nece com a cor inalterada (teste positivo) ou 2017). Aplicação: carnes vermelhas, aves, ovos,
adquire uma coloração rósea avermelhada peixe pronto para consumo e amostras ambientais.
(teste negativo). As cepas de L. monocyto-
genes não reduzem o nitrato.
d.7) CAMP Test (Christie-Atkins-Munch-Pe-
terson Test) (opcional). Inocular uma cultu-
análise
ra b-hemolítica de Staphylococcus aureus □ Caldo Universidade de Vermont Modificado
(ATCC 49444, ATCC 25923, NCTC 7428 (UVM)
ou CIP 5710) e uma cultura de Rhodococ- □ Caldo Fraser ou Caldo de Enriquecimento de
cus equi (ATCC 6939 ou NCTC 1621) em Listeria Tamponado com ácido morfolinopro-
uma placa de Ágar Sangue Nº 2 previamente panosulfônico (MOPS-BLEB)
preparada. Cada cultura deve ser inoculada □ Placas de Ágar Oxford Modificado (MOX)
em uma única estria, mantendo as duas es- □ Placas de Ágar Sangue de Cavalo em Sobreca-
trias paralelas entre si. No espaço entre as mada (HL)
estrias de S. aureus e R. equi, inocular uma □ Tubos de Caldo Infusão Cérebro Coração
única estria de cada cultura suspeita, perpen- (BHI)
dicular às outras duas, porém, sem tocá-las. □ Tubos de Ágar Infusão Cérebro Coração
Incubar a placa a 35 ºC/24-48h e observar a (BHIA) ou Tripticase de Soja Extrato de Leve-
ocorrência de halo transparente de hemólise dura (TSA-YE)
em redor das estrias inoculadas. As cepas de □ Cultura b-hemolítica de Staphylococcus pseu-
L. monocytogenes produzem uma reação de dointermedius (ATCC 49444) ou Staphylococ-
hemólise discreta, porém, nas proximidades cus aureus (ATCC 25923)
da estria de S. aureus, o halo torna-se maior e □ Cultura de Rhodococcus equi (ATCC 6939)

□ Discos de β-lysin (opcional) versidade de Vermont Modificado (UVM).

□ Sistema comercial de identificação API® Lis- Preparar diluições decimais seriadas usando
teria ou VITEK 2 Compact ou MICRO-ID® Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampão
Listeria (não citados os fabricantes) Fosfato (PB) nos tubos de diluição. Trans-
□ Estufa incubadora a 30±2 ºC ferir três alíquotas de 10 ml da diluição 10-1
□ Estufa incubadora a 35±2 ºC para três tubos estéreis vazios, três alíquo-
□ Estufa incubadora entre 18 e 25 ºC tas de 1 ml da 10-1 para três tubos com 9
ml de UVM e três alíquotas de 1 ml da 10-2
para três tubos com 9 ml de UVM. Incubar
todos os tubos e o restante da diluição 10-1
O esquema de análise para a detecção ou conta- a 30±2 ºC/20-26h. Realizar todas as etapas
gem (NMP) de L. monocytogenes pelo método subsequentes do ensaio para cada tubo se-
USDA/MLG 8.10:2017 encontra-se descrito na paradamente, bem como para o restante da
Figura 18.2. diluição 10-1.
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as Nota a.2.1) As alíquotas indicadas acima (1 – 0,1 e 0,01g)
orientações do Capítulo 5, que apresenta todos os são as mais adequadas para amostras com contagem
esperada abaixo de 10/g. No caso de amostras com
detalhes e cuidados envolvidos nos testes de pre-
contagem esperada acima desse nível, inocular dilui-
sença/ausência de microrganismos. O procedimen- ções mais altas, seguindo as orientações do Capítulo 4.
to descrito abaixo não apresenta esses detalhes,
b) Enriquecimento seletivo secundário. Agi-
pressupondo que sejam conhecidos pelo analista.
tar cuidadosamente cada frasco ou tubo de
Cuidado. Ler atentamente as recomendações da
enriquecimento seletivo primário e transferir
introdução do capítulo, item 18.1, subitem “cui-
0,1±0,02 ml do caldo UVM para um tubo com
dados especiais na realização das análises”, para
10±0,5 ml de Caldo Fraser ou Caldo de Enri-
familiarizar-se com as medidas necessárias à se-
quecimento de Listeria Tamponado com Ácido
gurança do analista e do laboratório.
Morfolinopropanosulfônico (MOPS-BLEB).
a) Enriquecimento seletivo primário. Incubar o Caldo Fraser a 35±2 ºC/26-48±2h ou
a1.) Teste de presença/ausência. Seguindo as o MOPS-BLEB a 35±2 ºC/18-24h. Verificar a
orientações do Capítulo 2, homogeneizar ocorrência de escurecimento do meio, devido à
25±1g da amostra com 225±5 ml do Cal- hidrólise da esculina. Em caso positivo, seguir
do Universidade de Vermont Modificado para o plaqueamento diferencial (item c). Em
(UVM) e incubar a 30±2 ºC/20-26h. caso negativo, reincubar o Caldo Fraser até
Nota a.1.1) Para amostras compostas (5x25g) homoge- completar 48±2h e verificar novamente o es-
neizar as 125±5g com 1.125±25 ml de UVM e incu- curecimento, submetendo ao plaqueamento as
bar a 30±2 ºC/23-26h.
amostras positivas e descartando as amostras
Nota a.1.2) Produtos em pó como as sopas desidratadas negativas.
podem exigir diluição maior que 1:10 devido à di-
ficuldade de absorção do caldo por essas amostras. c) Plaqueamento seletivo diferencial.
Nota a.1.3) Para a análise de esponjas, adicionar 225±5 A partir do Caldo UVM e do Caldo Fraser ou
ml de UVM à bolsa com uma esponja. Para amostras MOPS-BLEB, estriar 0,1±0,02 ml da cultura
compostas com até cinco esponjas, adicionar 100±2 em placas de Ágar Oxford Modificado (MOX).
ml de UVM para cada esponja. Agitar em stomacher Incubar as placas de MOX a 35±2 ºC/26±2h
(2min) ou massagear as esponjas com as mãos por
fora das bolsas plásticas.
e observar a presença de colônias típicas de
L. monocytogenes, que são pequenas (1mm) e
a.2) Contagem pela técnica do NMP. Seguindo rodeadas por um halo preto de hidrólise da es-
as orientações do Capítulo 2, homogeneizar culina. Em caso negativo, reincubar as placas
25g da amostra com 225 ml do Caldo Uni- por mais 26±2h e verificar novamente.

MOPS-BLEB = Caldo de Enriquecimento de Listeria Tamponado com ácido morfolinopropanosulfônico
Figura 18.2. Esquema de análise para a detecção ou contagem (NMP) de L. monocytogenes pelo
método USDA/MLG 8.10:2017 (USDA, 2017).

d) Confirmação das colônias típicas. Tomar 20 49444) ou Staphylococcus aureus (ATCC

colônias típicas de cada placa de MOX (ou o 25923) e uma cultura de Rhodococcus equi
número colônias presentes, se for menor que (ATCC 6939) em uma placa de Ágar Tripti-
20) e estriar todas numa mesma placa de Ágar case de Soja com 5% de sangue de carneiro
Sangue de Cavalo em Sobrecamada (HL). In- (TSA-SANGUE) previamente preparada.
cubar as placas a 35±2 ºC/22±4h e verificar a Cada cultura deve ser inoculada em uma
presença de colônias típicas de L. monocyto- única estria, mantendo as duas estrias pa-
genes, translúcidas com um pequeno halo de ralelas com um espaço de 3-4cm entre si.
b-hemólise. A partir de uma mesma colônia tí- No espaço entre as estrias de S. aureus ou
pica, inocular um tubo de Caldo Infusão Cére- S. intermedius e R. equi, inocular uma úni-
bro Coração (BHI) e um tubo de Ágar Infusão ca estria de cada cultura suspeita, perpen-
Cérebro Coração (BHIA) ou Ágar Tripticase dicular às outras duas, porém, sem tocá-las
de Soja Extrato de Levedura (TSA-YE). Incu- e mantendo um espaço de 2-4mm entre si.
bar o Caldo BHI entre 18 e 25 ºC, por 16 a Incluir uma cepa controle positivo de L. mo-
18 horas, para o teste de motilidade. Incubar nocytogenes e uma controle negativo de L.
o Ágar BHIA ou TSA-YE a 35 ºC/24h para innocua. Incubar a placa a 35 ºC/24±2h e
os testes bioquímicos de confirmação. Para o observar a ocorrência de halo transparente
teste de motilidade seguir o mesmo procedi- de hemólise em redor das estrias inoculadas.
mento descrito no método da FDA (montagem As cepas de L. monocytogenes e L. seeligeri
úmida). Para os testes bioquímicos, utilizar produzem uma reação de hemólise discre-
os sistemas comerciais de identificação API® ta, porém, nas proximidades da estria de
Listeria, VITEK® 2 Compact ou MICRO-ID® S. aureus ou S. intermedius, o halo torna-se
Listeria (não citados os fabricantes). maior e mais nítido. As cepas de L. ivanovii,
Se utilizado o API Listeria, o mlG/FSIS/ ao contrário, apresentam halo mais nítido
USDA recomenda que cepas com resultado L. nas proximidades da estria de R. equi. Se
monocytogenes/L.innocua sejam submetidas à uma cepa suspeita que se mostrou β-hemo-
caracterização molecular baseada no RNA ri- lítica em HL não apresentar resultado típico
bossomal. Os sistemas comerciais GeneTrak® em 24h, reincubar a placa de TSA-Sangue a
L. monocytogenes ou GenProbe AccuProbe® 35±2 ºC até completar 48±2h. Se o resultado
L. monocytogenes (não citados os fabricantes) continuar atípico, recomenda-se que a cepa
podem ser utilizados, seguindo as orientações seja submetida à caracterização molecular
dos fabricantes. baseada no RNA ribossomal (GeneTrak®
Se utilizado o MICRO-ID® Listeria, o mlG/ L. monocytogenes ou GenProbe AccuPro-
FSIS/USDA recomenda que seja realizado be® L. monocytogenes).
o CAMP Test, para corroborar os resultados. d.2) β-lysin CAMP Teste. Esse método é o mais
Dois procedimentos podem ser utilizados para recomendado pelo mlG/FSIS/USDA. Posi-
o CAMP Test, o método tradicional e teste cionar um disco de β-lysin no centro de uma
usando discos de β-lysin. placa preparada com uma camada fina (9±1
d.1) CAMP Test (método tradicional Christie- ml) de Ágar Tripticase de Soja com 5% de
-Atkins-Munch-Peterson Test). Esse proce- sangue de carneiro (TSA-SANGUE). Inocu-
dimento é o mesmo descrito no método do lar até seis culturas suspeitas na placa, fazen-
BAM/FDA, mas recomenda o Ágar Tripti- do uma estria radial a partir da região bem
case de Soja com 5% de sangue de carneiro próxima do disco de β-lysin, mas sem tocá-
(TSA-SANGUE) em lugar do Ágar Sangue -lo. Incluir uma cepa controle positivo de L.
Nº 2. Inocular uma cultura b-hemolítica de monocytogenes e uma controle negativo de
Staphylococcus pseudointermedius (ATCC L. innocua. Incubar a placa a 35±2 ºC/24±2h

e observar a ocorrência de halo transparente □ Alça de espalhamento (Drigalski) mergulhada

de hemólise em redor das estrias, na região em etanol 70%
próxima do disco de β-lysin (teste positivo). □ Estufa incubadora regulada a 20±2 ºC
As cepas de L. monocytogenes, L.seeligeri □ Estufa incubadora regulada a 37±1 ºC
e L. ivanovii apresentam resultado positivo Confirmação
nesse teste, mas L.ivanovii apresenta β-he- □ Placas de Ágar Tripticase de Soja Extrato de
mólise intensificada na região mais afastada Levedura (TSA-YE)
do disco, o que permite distingui-la. As espé- □ Tubos de Caldo Tripticase de Soja Extrato de
cies de Listeria não hemolíticas não reagem Levedura (TSB-YE)
nesse teste. Se uma cepa suspeita β-hemolí- □ Tubos de Meio Teste de Motilidade ISO (op-
tica em HL não apresentar resultado positivo cional)
em 24h, reincubar a placa de TSA-Sangue a
□ Reagente de catalase (peróxido de hidrogênio
35±2 ºC até completar 48±2h. Se o resultado
a 3%)
continuar negativo, recomenda-se que a cepa
seja submetida à caracterização molecular
□ Placas de Ágar Sangue Nº 02
baseada no RNA ribossomal (GeneTrak®
L. monocytogenes ou GenProbe AccuProbe® □ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5% xilose
L. monocytogenes). □ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5% rham-
nose
□ Cultura de Staphylococcus aureus beta-hemo-
18.4. Método de plaqueamento lítico (ATCC 25923, NCTC 1803 ou as citadas
ISO 11290-2:1998/ no método BAM/FDA) (opcional)
Amendment 1:2004 □ Cultura de Rhodococcus equi (ATCC 6939 ou
NCTC 1621) (opcional)
para contagem
□ Estufa incubadora a 25±1 ºC (opcional para
de L. monocytogenes teste de motilidade)
em alimentos □ Estufa incubadora a 37±1 ºC

dardization, aplica-se a todos os alimentos desti-
nados ao consumo humano e às rações animais. O esquema de análise para a contagem de L. mo-
Limite de detecção do procedimento padrão: 100 nocytogenes em placas pelo método ISO 11290-
UFC/g de alimentos sólidos e 10 UFC/ml de pro- 2:1998 amendment 1:2004 encontra-se descrito
dutos líquidos. na Figura 18.3.
análise
Preparação da amostra e diluições seriadas ções ao cálculo dos resultados. O procedimento
□ Diluente: Água Peptonada Tamponada (BPW) descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres-
ou Caldo Half-Fraser Base supondo que sejam conhecidos pelo analista.
□ Tubos de diluição com 9 ml de BPW Cuidado. Ler atentamente as recomendações da
□ Pipetas de 1 ml introdução do capítulo, item 18.1, subitem “cui-
Contagem dados especiais na realização das análises”, para
□ Placas de Ágar Listeria Ottaviani & Agosti familiarizar-se com as medidas necessárias à se-
(ALOA) gurança do analista e do laboratório.

Figura 18.3. Esquema de análise para a contagem de L. monocytogenes em placas

pelo método ISO 11290-2:1998 amendment 1:2004.

a) Preparação da amostra e reparação de células Nota c.2) Há cepas de L. monocytogenes que apresen-
injuriadas. Homogeneizar 25g da amostra com tam atividade fraca de fosfatidil inositol fosfolipase,
detectada apenas com incubação prolongada (quatro
225 ml de Água Peptonada Tamponada (BPW) dias, por exemplo). Algumas dessas cepas são pato-
ou Caldo Half-Fraser Base, seguindo as orienta- gênicas.
ções do Capítulo 2. Incubar a 20±2 ºC/1h±5min,
Selecionar para a confirmação cinco colônias
para reparação de células injuriadas.
típicas de cada placa com menos de 150 co-
Nota a.1) O uso do Caldo Half-Fraser Base é recomenda- lônias típicas. Havendo menos de cinco em
do quando há interesse em submeter a mesma unidade
alguma placa, selecionar todas. Purificar a
analítica ao método quantitativo e, também, qualitativo
de análise (ISO 11290-1:1996 – amendment 1:2004). cultura de cada colônia inoculando por estrias
É o Caldo Fraser, sem qualquer agente seletivo (sem de esgotamento em uma placa de Ágar Tripti-
cloreto de lítio, acriflavina e ácido nalidíxico). Não é case de Soja Extrato de Levedura (TSA-YE).
possível usar a base dos equivalentes comerciais do Incubar as placas a 37±1 ºC/18-24h ou até que
Caldo Fraser porque todo já contém cloreto de lítio e
em alguns a acriflavina e o ácido nalidíxico também já
o crescimento seja satisfatório. No TSA-YE,
estão misturados aos ingredientes da base. as colônias de Listeria são azuladas, quando
observadas com uma fonte forte de luz branca
b) Inoculação e incubação. Após o período de na parte inferior das placas, posicionadas em
reparação das células, inocular 0,1 ml dessa ângulo de 45º em relação à fonte de luz. Utili-
primeira diluição da amostra na superfície de zar uma colônia típica bem isolada da placa de
placas de Ágar Listeria Ottaviani & Agosti TSA-YE para os testes de confirmação.
(ALOA), plaqueamento em superfície, em
duplicata. Espalhar o inóculo com uma alça d) Confirmação das colônias típicas. A confir-
de Drigalski, até que todo o excesso de líqui- mação segue basicamente os mesmos testes
do seja absorvido. Se a contagem estimada de e procedimentos do método BAM FDA, com
L. monocytogenes na amostra for menor do alguma variação na temperatura e tempo de in-
que 100/g ou ml, inocular 1 ml da primei- cubação de alguns ensaios:
ra diluição, em duplicata, em uma placa de d.1) Teste de catalase. Segue o mesmo pro-
140mm de diâmetro ou distribuindo o volume cedimento descrito no método BAM/FDA
em três placas de 90mm de diâmetro. Se, ao (item 18.2.2.d.1).
contrário, a contagem estimada for mais alta, d2) Coloração de Gram. Segue o mesmo pro-
preparar e inocular diluições decimais seria- cedimento descrito no método BAM/FDA
das, usando BPW como diluente. Aguardar (item 18.2.2.d.2).
que as placas sequem e incubar invertidas, a d.3) Teste de motilidade (opcional). Para ob-
37±1 ºC/24±3h-48±6h. servação da motilidade ao microscópio, em
montagem úmida, cultivar a cultura em Cal-
Nota b.1) A ISO 7218:2007(E) já não exige a inoculação do Tripticase de Soja Extrato de Levedura
em duplicata quando são inoculadas pelo menos duas
diluições decimais seriadas.
(TSB-YE), a 25±1 ºC/8-24h (o tempo neces-
sário para crescimento visível). O procedi-
c) Contagem das colônias presuntivas e seleção mento é o mesmo descrito no método BAM/
para confirmação. Contar as colônias típicas FDA (item 18.2.2.d.3). Para observação da
com 24±3h de incubação ou, se o crescimen- motilidade em meio semissólido, utilizar a
to for muito pobre ou ausente, com 48±6h. As cultura obtida em TSA-YE para inocular um
colônias de L. monocytogenes no ALOA são tubo de Meio Teste de Motilidade ISO, por
verde-azuladas e rodeadas por um halo opaco. picada, até uma distância a 1cm do fundo.
Incubar os tubos a 25±1 ºC/48h e observar
Nota c.1) Há cepas de L. monocytogenes que, em condi-
ções de “stress” (particularmente provocado por áci- as mesmas características descritas no mé-
dos), formam halo muito fraco ou não formam halo. todo BAM/FDA (item 18.2.2.d.3).

Quadro 18.5. Características típicas das espécies de Listeria para interpretação dos testes de confirma-
ção no método ISO 11290-2:1998 amendment 1:2004.
Ácido a partir de CAMP Test

Espécie β-hemólise
Rhamnose Xilose S. aureus R. equi
L. monocytogenes + + - + -
L. innocua - V - - -
L. ivanovii + - + - +
L. seeligeri (+) - + (+) -
L. welshimeri - V + - -
L. grayi - - - - -
V = variável, (+) = fraco, + = 90% das cepas positivas, - = negativo.
Nota. Há raras cepas de L. monocytogenes que não apresentam β-hemólise ou uma reação positiva no CAMP Test, nas condições recomendadas nesse método.
Nota d.3) O teste de motilidade é opcional, podendo ser

UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
dispensado se o analista é bem treinado na rotina de
detecção de L. monocytogenes. onde:
a = (b.C /A) sendo C = número de colônias típicas presentes
d.4) Teste de verificação de β-hemólise. Segue
o mesmo procedimento do método BAM/ A = número de colônias típicas submetidas à confirmação
FDA (item 18.2.2.d.4), mas a incubação (geralmente cinco) e
das placas de Ágar Sangue é feita a 37±1 b = número de colônias típicas confirmadas, dentre as que
ºC/24±2h. Pode ser substituído pelo CAMP foram submetidas à confirmação.
Test. n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele-
d.5) Teste de fermentação da xilose e rham- cionada
nose. Segue o mesmo procedimento do mé- n2 = número de placas contadas da segunda diluição sele-
todo BAM/FDA (item 18.2.2.d.5), mas a cionada
incubação dos tubos é feita a 37±1 ºC por
até cinco dias.
d.6) CAMP Test (Christie-Atkins-Munch-Pe- Exemplo 1) Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1e
terson Test) (opcional). Segue o mesmo 10-2, uma placa por diluição (n1 = 1 e n2 = 1). Os
procedimento do método BAM/FDA (item resultados obtidos foram:
18.2.2.d.7), mas a incubação é feita a 37±1 Diluição 10-1 Diluição 10-2
ºC/18-24h. Não é requerido se os resultados Colônias típicas na placa (C) 150 17
do teste de hemólise são conclusivos. Colônias típicas submetidas à
5 5
e) Interpretação dos resultados dos testes de confirmação (A)
confirmação. Seguir as orientações do Quadro 4 3
18.4. As cepas de L. monocytogenes são basto- Número de colônias consideradas (4x150/5)
(3x17/5) = 10
netes Gram positivos, móveis (motilidade ro- confirmadas nas placas [a = (b.C/A)] = 120
tacional em montagens úmidas ou tipo “guar- Volume inoculado em cada placa (v) 0,1 ml 0,1 ml
da-chuva” em meio semissólido), usualmente Primeira diluição retida para
10-1 = 0,1
contagem (d)
catalase positivas.
f) Cálculo dos resultados. Segundo a ISO confirmadas nas placas (∑a)
120+10 = 130
7218:2007/Amd 1:2013, calcular usando a 130/[0,1 x (1+0,1 x 1) x 0,1]

UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
fórmula: = 130/0,011 = 1,2x104

Exemplo 2) Inoculados 0,1 ml da diluição 10-1, □ Placas de Ágar Sangue Nº 02

em duplicata (n1 =2 e n2 = 0). Os resultados ob- □ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5% xilose
tidos foram: □ Tubos de Caldo Púrpura Base com 0,5% rham-
Placa 1 Placa 2 nose
Colônias típicas na placa (C) 18 20 □ Cultura de Staphylococcus aureus beta-hemo-
Colônias típicas submetidas à lítico (ATCC 25923, NCTC 1803 ou as citadas
5 5
confirmação (A)
no método BAM/FDA) (opcional)
4 5
as submetidas à confirmação (b) □ Cultura de Rhodococcus equi (ATCC 6939 ou
(4x18/5) = 14 (5x20/5) = 20 NCTC 1621) (opcional)
Primeira diluição retida para -1
□ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC ou 37±1
10 = 0,1
contagem (d) ºC
14+20 = 34 □ Estufa incubadora a 25±1 ºC (opcional para
34 / [0,1x(2+0,1x0)x0,1] = teste de motilidade)
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
34/0,02 = 1,7x103
O esquema de análise para a detecção de L. mono-
18.5. Método ISO 11290- cytogenes pelo método ISO 11290-1:1996 amend-
-1:1996/Amendment 1:2004 ment 1:2004 encontra-se descrito na Figura 18.4.
para presença ou ausência de a) Enriquecimento primário. Homogeneizar
25g da amostra com 225 ml de Caldo Half-
L. monocytogenes -Fraser, seguindo as orientações do Capítulo 2.
em alimentos Incubar a 30±1 ºC/24±2h. Pode ocorrer escu-
recimento do meio durante a incubação.
b) Enriquecimento secundário. Inocular 0,1 ml
dardization, aplica-se a todos os alimentos desti-
da amostra enriquecida em 10 ml de Caldo
nados ao consumo humano e às rações animais.
Fraser. Incubar a 35±1 ºC ou 37±1 ºC/48±2h.
Nota b.1) A temperatura de incubação (35 ou 37 ºC) deve
18.5.1. Material requerido para a ser acordada entre as partes e relatada no relatório.
análise
c) Plaqueamento seletivo diferencial. A partir
□ Caldo Half-Fraser do caldo Half-Fraser, inocular uma alçada da
□ Caldo Fraser cultura (estrias de esgotamento) em uma placa
□ Placas de Ágar Listeria Ottaviani & Agosti de Ágar Listeria Ottaviani & Agosti (ALOA)
(ALOA) e uma alçada em um segundo meio, de livre
□ Placas de um 2º meio opcional, de escolha do escolha do laboratório. Repetir esse procedi-
laboratório mento com o caldo Fraser. Incubar as placas
□ Placas de Ágar Tripticase de Soja Extrato de de ALOA invertidas, a 37±1 ºC/24±3h. Se não
Levedura (TSA-YE) inclinados houver desenvolvimento de colônias típicas ou
□ Tubos de Caldo Tripticase de Soja Extrato de se o crescimento for muito pobre, reincubar as
Levedura (TSB-YE) placas por 24±3h adicionais.
□ Tubos de Meio Teste de Motilidade ISO (op- Incubar as placas do segundo meio opcional de
cional) acordo com a orientação do fabricante ou de
□ Reagente de catalase (peróxido de hidrogênio outros métodos em que sejam utilizadas.
a 3%) Nota c.1) O segundo meio de plaqueamento é de livre es-
□ Reagentes para coloração de Gram colha do laboratório, podendo ser usados, por exem-

Figura 18.4. Esquema de análise para a detecção de L. monocytogenes pelo método ISO 11290-1:1996 amendment 1:2004.

plo: Ágar Oxford (OXA 35 ºC/24-48h), Ágar Palcam em que sejam utilizados, para verificar as caracte-
(35 ºC/24-48h), Ágar Oxford Modificado (MOX 35 rísticas típicas das colônias de L. monocytogenes.
ºC/24-48h) ou Ágar Cloreto de Lítio Feniletanol Mo-
xalactan suplementado com esculina e Fe3+ (LPM 30
No fundo de cada placa inoculada, marcar cin-
ºC/24-48h). co colônias típicas para a confirmação e, se
d) Seleção das colônias e purificação das cul- houver menos de cinco, marcar todas. Estriar
turas para a confirmação. Após o período (estrias de esgotamento) a cultura de cada co-
de incubação, verificar se há desenvolvimento lônia selecionada em uma placa de Ágar Trip-
de colônias típicas de L. monocytogenes nos ticase de Soja Extrato de Levedura (TSA-YE),
meios de plaqueamento diferencial. No ALOA para purificação. Incubar as placas, invertidas,
as colônias típicas são verde-azuladas e rodea- a 35±1 ºC ou 37±1 ºC/18-24h ou até que o
das por um halo opaco. crescimento seja satisfatório. No TSA-YE, as
colônias de Listeria são azuladas, quando ob-
Nota d.1) Há cepas de L. monocytogenes que, em condi- servadas com uma fonte forte de luz branca na
ções de “stress” (particularmente provocado por áci-
parte inferior das placas, posicionadas em ân-
dos), formam halo muito fraco ou não formam halo.
gulo de 45º em relação à fonte de luz. Utilizar
Nota d.2) Há cepas de L. monocytogenes que apresen-
tam atividade fraca de fosfatidil inositol fosfolipase, uma colônia típica bem isolada para os testes
detectada apenas com incubação prolongada (quatro de confirmação.
dias, por exemplo). Algumas dessas cepas são pato- e) Confirmação das colônias típicas e interpre-
gênicas.
tação dos resultados. Segue o mesmo proce-
No segundo meio de plaqueamento, seguir as dimento descrito no método ISO 11290-2 de
orientações do fabricante ou dos outros métodos contagem em placas.

18.6. Referências
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19 Salmonella
Item 19.1.1 (revisado) Taxonomia e nomenclatura atualizadas.
Quadro 19.4 (atualizado) Inseridos métodos AOAC 2009.03, 2013.01, 2013.02, 2013.09 e 2014.01.
Item 19.2.2.a (corrigido) Na nota a.2 o procedimento diferenciado é para cacau, não para coco.
Item 19.3 (revisado) A versão de dezembro de 2007 do método BAM/FDA foi substituída pela versão de agosto
de 2016, com as seguintes alterações:
Item 19.3.2.a (revisado) Alterado procedimento para preparação de amostras de ovos (Notas a.4.1 e a.4.2,
Quadro 19.6).
Item 19.4 (revisado) A versão de fevereiro de 2008 do método mlG/FSIS/USDA foi substituída pela versão de
janeiro de 2017, com as seguintes alterações:
Item 19.4.2.a (revisado) Alterado procedimento para preparação das amostras.
Item 19.4.2.b (corrigido) No enriquecimento seletivo em TTH, transferir 0,5±0,05 ml da amostra enriquecida
para 10 ml (não 100 ml) de Caldo Tetrationato Hajna (TTH).
19.1. Introdução cos, anaeróbios facultativos e oxidase negativos.

A classificação e a nomenclatura são controverti-
Salmonella é o principal agente global de doenças
das, conforme sumarizado por Euzéby (2016a,b,c)
de origem alimentar, com dezenas de milhões de
e Grimont et al. (2000):
casos por ano em todo o mundo (WHO, 2013) e
também no Brasil. De acordo com a Secretaria de a) De acordo com Grimont et al. (2000), a aná-
Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde (MS/ lise dos antígenos O e H resultou na descri-
SVS, 2015), entre 2000 e 2015 foram notificados ção de um grande número de sorotipos de
10.666 surtos de doenças transmitidas por alimen- Salmonella ao longo dos anos. Cada sorotipo
tos no país, envolvendo 209.240 doentes. Dos era considerado uma espécie e mais de 2.000
surtos com etiologia identificada (41,5%), 34,7% receberam nomes, como ‘Salmonella london’,
foram devido à Salmonella, envolvendo 30.130 por exemplo. Com base nas características
pacientes. Nos Estados Unidos o CDC (Center for bioquímicas, por sua vez, o gênero foi dividi-
Disease Control and Prevention) estima a ocor- do por Kauffmann em quatro subgêneros, que
rência de mais de um milhão de casos a cada ano foram designados por números romanos (I a
(FDA, 2012). IV), sem uma nomenclatura formal. Le Minor
et al. (1970) consideraram os subgêneros de
Kauffmann como espécies, denominando-as
19.1.1. Classificação taxonômica
como ‘S. kauffmannii’ (subgênero I), ‘S. sa-
de Salmonella
lamae’ (subgênero II), S. arizonae (subgênero
Salmonella é um gênero da família Enterobacte- III) e ‘S. houtenae’ (subgênero IV). Mais tarde
riaceae, definido por Brenner & Farmer III (2005) um grupo adicional (subgênero V) foi identifi-
como bastonetes Gram negativos não esporogêni- cado (Grupo Bongor).

b) Em 1980 foi publicada a “Approved Lists sinônimos de Salmonella enterica subsp. en-
of Bacterial Names” (Skerman et al., 1980), terica. A requisição foi negada porque incluía
que objetivou rever todos os nomes de espé- o reconhecimento de uma única espécie no
cies bacterianas existentes e estabelecer uma gênero Salmonella (uma questão taxonômica)
lista com aqueles considerados válidos. Essa o que ultrapassava as atribuições da comissão
lista foi publicada e colocada em vigor em judicial (restrita à questões de nomenclatura)
01/01/1980. A partir desta data a citação dos (Grimont et al., 2000). Ainda assim, o uso do
nomes mantidos na lista deveria ser feita com nome Salmonella enterica disseminou-se entre
destaque (geralmente em itálico) e qualquer os bacteriologistas, mesmo não tendo sido va-
proposta de nome publicada fora do Interna- lidado (Euzéby, 2016b).
tional Journal of Systematic and Evolutionary e) Em 2005 a Comissão Judicial resolveu se
Microbiology (IJSEM), periódico oficial de ta- manifestar sobre o assunto, emitindo a Opi-
xonomia bacteriana, só seria considerada vali- nião Judicial 80 (Judicial Commission of the
da após ser reconhecida pelo IJSEM, em uma International Committee on Systematics of
lista publicada periodicamente com os nomes Prokaryotes, 2005), que tratava de várias no-
validados. O gênero Salmonella foi incluído vas requisições resultantes da requisição ini-
na lista de 01/01/80 com cinco espécies: Sal- cial de Le Minor & Popoff. A comissão decidiu
monella choleraesuis, Salmonella enteritidis, que o epíteto enterica deveria ser conservado
Salmonella typhi, Salmonella typhimurium e sobre todos os anteriores e que as subspécies
Salmonella arizonae (Euzéby, 2016b). e novas combinações de nomes propostas por
c) Com base em estudos de DNA, Le Minor et al. Le Minor & Popoff (1987) deveriam ser con-
(1982, 1986) consideraram que todas as cepas sideradas válidas. No entanto, a comissão não
de Salmonella existentes constituíam uma úni- rejeitou, concomitantemente, o epíteto chole-
ca espécie (Salmonella choleraesuis), com sete raesuis, gerando uma situação problemática,
subspécies: S. choleraesuis subsp. arizonae, S. ou seja, após a Opinião Judicial 80, existem
choleraesuis subsp. bongori, S. choleraesuis dois sistemas de nomenclatura de Salmonella,
subsp. choleraesuis, S. choleraesuis subsp. ambos igualmente válidos (Quadro 19.1): o
diarizonae, S. choleraesuis subsp. houtenae, sistema “velho” (ou seja, nomes validamen-
S. choleraesuis subsp. indica e S. choleraesuis te publicados antes da publicação do parecer
subsp. salamae. Posteriormente Reeves et al. Judicial 80) e o sistema “novo” (ou seja, no-
(1989) elevaram a subspécie bongori à catego- mes validamente publicados em consequência
ria de espécie. O nome Salmonella bongori e das conclusões Judicial 80). Os dois sistemas
os outros seis nomes das subspécies de S. cho- podem ser usados, mas o “velho” tem sido
leraesuis propostos por Le Minor continuam abandonado por um número crescente de orga-
válidos (Euzéby 2016a,b). nizações (Euzéby, 2016b), incluindo o “World
d) Em 1987 Le Minor & Popoff (1987) submete- Health Organization Collaborating Center for
ram uma solicitação à “Judicial Commission Reference and Research on Salmonella”, o
of the International Committee on Systemati- “Center for Disease Control and Prevention”
cs of Prokaryotes” propondo substituir epite- (CDC) e a “American Society for Microbio-
to choleaesuis pelo epíteto enterica no nome logy” (ASM) (Ellermeier & Slauch, 2005). Os
das sete subspécies de Salmonella, porque o nomes dos sorotipos não são mais considera-
epíteto choleraesusis também era usado na de- dos como nomes de espécies e, portanto, não
nominação de um sorotipo. Eles também re- devem ser impressos em itálico. Somente os
quisitaram que os nomes Salmonella cholerae- sorotipos de S. enterica subsp enterica conti-
suis, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi e nuam recebendo nomes (geralmente referên-
Salmonella typhimurium fossem considerados cias geográficas), enquanto os das outras su-

Salmonella □ 293
Quadro 19.1. Os dois sistemas válidos de nomenclatura de Salmonella (Euzéby, 2016a,b).

Designação por O sistema “velho” O sistema “novo”
numeral romano (publicados antes da Opinião Judicial 80*) (publicados depois da Opinião Judicial 80*)
Salmonella enterica
Salmonella choleraesuis
(heterotypic synonym Salmonella choleraesuis)
Salmonella enterica subsp. enterica
(heterotypic synonyms Salmonella choleraesuis subsp. choeraesuis,
I Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis
Salmonella enteritidis, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi e
Salmonella typhimurium)
Salmonella enterica subsp. salamae
II Salmonella choleraesuis subsp. salamae
(homotypic synonym Salmonella choleraesuis subsp. salamae)
Salmonella enterica subsp. arizonae
IIIa Salmonella choleraesuis subsp. arizonae (homotypic synonyms Salmonella arizonae e Salmonella cholerae-
suis subsp. arizonae)
Salmonella enterica subsp. diarizonae
IIIb Salmonella choleraesuis subsp. diarizonae
(homotypic synonym Salmonella choleraesuis subsp. diarizonae)
Salmonella enterica subsp. houtenae
IV Salmonella choleraesuis subsp. houtenae
(homotypic synonym Salmonella choleraesuis subsp. houtenae)
Salmonella enterica subsp. indica
VI Salmonella choleraesuis subsp. indica
(homotypic synonym Salmonella choleraesuis subsp. indica)
Salmonella bongori
V Salmonella bongori (homotypic synonyms Salmonella enterica subsp. bongori e Salmo-
nella choleraesuis subsp. bongori)
Salmonella enteritidis Salmonella enterica subsp. enterica
Salmonella paratyphi Salmonella enterica subsp. enterica
Salmonella typhi Salmonella enterica subsp. enterica
Salmonella typhimurium Salmonella enterica subsp. enterica
*Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Prokaryotes (2005).
bespécies são designados por sua fórmula an- raramente são patogênicas para humanos (Popoff
tigênica White-Kauffmann-LeMinor (Grimont & Le Minor, 2005, ICMSF, 1996).
et. al. (2000).
f) Shelobolina et al. (2004) descobriram uma 19.1.2. Classificação sorológica de
nova espécie, Salmonella subterranea, cujo Salmonella
nome foi validado em 2005. Entretando, Eu-
zèby (2016a) reportou que, de acordo com A classificação de Salmonella em espécies é pou-
uma comunicação pessoal de Shelobolina co usada nos estudos epidemiológicos, sendo
(05/06/2010), esta espécie é estreitamente re- mais conhecida e utilizada a nomenclatura rela-
lacionada à Escherichia hermannii e não per- cionada com a sorotipagem. O esquema utilizado
tence ao gênero Salmonella. na divisão em sorotipos é o de White-Kauffmann-
Le Minor, baseado nas diferenças encontradas em
As cepas mais frequentemente envolvidas nas do-
certas estruturas superficiais das células, que são
enças humanas são as de S. enterica subsp. en-
antigênicas. Essas estruturas são o envelope celu-
terica, que tem por habitat os animais de sangue
lar ou cápsula (antígenos capsular “Vi”), a parede
quente e respondem por 99% das salmoneloses
celular (antígenos somáticos “O”) e os flagelos
humanas (Brenner et al., 2000). S. enterica subsp.
(antígenos flagelares “H”) (Ellermeier & Slauch,
salamae, subsp. arizonae e subsp. diarizonae são
2005, Popoff & Le Minor, 2005).
frequentemente isoladas do conteúdo intestinal de
animais de sangue frio e raramente de humanos Os antígenos somáticos têm sua base química na
ou animais de sangue quente (Popoff & Le Minor, diversidade de polissacarídeos da parede celular
2005). S. enterica subsp. houtenae e S. bongori das bactérias Gram negativas. A parede celular é
são predominantemente isoladas do ambiente e composta de uma camada interna de peptidoglica-

no, seguida de uma dupla camada lipídica externa, Os antígenos capsulares, muito comuns em ou-
composta de lipoproteínas, fosfolipídios e lipopo- tros gêneros de enterobactérias (Escherichia coli
lissacarídeos (LPS). Os LPS são divididos em três e Klebsiella, por exemplo), são encontrados em
porções, o lipídio A, interno, o core, intermediário poucos sorotipos de Salmonella. Um antígeno
e uma cadeia polissacarídica externa, que constitui capsular específico bem conhecido é o antígeno
a região antigênica “O”. A cadeia polissacarídica é Vi, que ocorre em apenas três sorotipos de Sal-
a parte imunologicamente dominante da molécula monella, Typhi, Paratyphi C e Dublin. As cepas
e atinge o microambiente externo que envolve as desses sorotipos podem apresentar ou não o antí-
células. É composta de unidades repetidas de te- geno Vi que, se presente, encobre os antígenos so-
tra ou penta sacarídeos, de natureza hidrofílica e máticos e impede sua aglutinação com o anti-soro
resistentes ao calor (100 ou 120 ºC/2h) (Rycroft, somático. O aquecimento a 100 ºC geralmente
2000). Estruturalmente, essa cadeia pode diferir, solubiliza o Vi, permitindo a aglutinação com o
de um sorotipo para outro, no tipos de monossa- anti-soro somático apropriado (Popoff & Le Mi-
carídeos presentes, nos tipos de ligação entre es- nor, 2005). O antigeno Vi é o único palissacarídeo
ses monossacarídeos e em modificações meno- verdadeiramente capsular produzido por Salmo-
res, como a acetilação dos monossacarídeos, por nella spp, sendo chamado de Vi por ser associado
exemplo (Ellermeier & Slauch, 2005). à virulência (Rycroft, 2000).
Há um grande número de fatores antigênicos carac- Os antígenos flagelares “H” são derivados do fla-
terizados, identificados por números. Desses, o es- gelo das cepas móveis. São termossensíveis e de-
quema de Kauffman-White reconhece 67, que são correm de variações na sequência de aminoácidos
usados para a identificação sorológica de Salmonella. da proteína flagelar (flagelina, uma subunidade do
Em função da sua importância no diagnóstico, os filamento helicoidal que forma o flagelo). A maio-
fatores são classificados como antígenos maiores ria das salmonelas apresenta expressão antigêni-
ou principais e antígenos menores ou secundários. ca flagelar bifásica, isto é, uma mesma cepa pode
Os antígenos maiores servem de base para a se- produzir dois tipos de flagelos, com características
paração das cepas de Salmonella em sorogrupos antigênicas diferentes. A alternância na produção
somáticos. Por exemplo, o Grupo somático “A” de hora um, hora outro tipo de flagelo é chamada
inclui todas as cepas que apresentam o fator O:2, de variação de fase. Alguns poucos sorotipos são
não encontrado em qualquer outro sorogrupo. Os monofásicos, produzindo apenas um tipo de flage-
antígenos menores são aqueles com menor valor lo (sorotipos Typhi e Enteritidis, por exemplo) e
discriminatório, podendo ser encontrados em ce- outros são imóveis, não produzindo qualquer tipo
pas de mais de um sorogrupo. Por exemplo, todas de flagelo (sorotipos Pullorum e Gallinarum, por
as cepas dos grupos “A”, “B” e “D” apresentam o exemplo) (Grimont et al., 2000, Grimont & Weill,
fator O:12, além do fator que caracteriza o grupo. 2007). Os fatores antigênicos da fase um foram
Os grupos somáticos O inicialmente foram desig- originalmente identificados por letras minúsculas
nados por letras, mas quando as letras do alfabeto e, quando todas as letras do alfabeto foram utiliza-
esgotaram foi necessário continuar com os núme- das, a letra z, seguida de um número subscrito pas-
ros 51 a 67. A correspondência entre a antiga de- sou a ser utilizada para identificar os novos fatores
signação (utilizando letras) e a nova designação (o último descrito é z71). Os antígenos da fase dois
(usando números ) é apresentado por Grimont et. são designados por números, mas algumas cepas
al. (2007): produzem antígenos da fase um na fase dois que,
A → O:2 D2 → O:9/O:46 G1-G2 → O:13 L → O:21 Q → O:39 V → O:44
B → O:4 D3 → O:9/O:46/O:27 H → O:6/O:14 M → O:28 R → O:40 W → O:45
C1-C4 → O:6/O:7 E1-E2-E3 → O:3/O:10 I → O:16 N → O:30 S → O:41 X → O:47
C2-C3 → O:8 E4 → O:1/O:3/O:19 J → O:17 O → O:35 T → O:42 Y → O:48
D1 → O:9 F → O:11 K → O:18 P → O:38 U → O:43 Z → O:50

Salmonella □ 295
nesse caso, também são identificados por letras Salmonella serovar London; Salmonella enterica
(Ellermeier & Slauch, 2005). subsp. enterica serovar London (nome completo).
O esquema de White – Kauffmann – Le Minor Cabe lembrar, entretanto, que os nomes de quatro
identifica os sorotipos de Salmonella através de sorotipos ainda se encontram na lista de nomes
uma fórmula composta de números e letras, que oficiais do sistema “velho” de nomenclaturas de
definem o(s) antígeno(s) “O”, “Vi” e “H” presen- Salmonella: S. enteritidis, S. typhi, S. paratyphi e
tes. A sequência é: 1º) os antígenos somáticos, S. typhimurium.
2º) o antígeno Vi, se presente e, entre parênteses Os sorotipos mais comuns. Na 9ª edição do livro
se a presença não for constante naquele sorotipo, Antigenic Formulae of the Salmonella Serovars
3º) os antígenos flagelares da fase um e 4º) os an- (Grimont & Weill, 2007) há 2579 sorotipos de
tígenos flagelares da fase dois, se presentes (Gri- Salmonella descritos, sendo mais de 50% (1531)
mont & Weill, 2007). Exemplos: pertencentes à S. enterica subsp. enterica, 505
Sorotipo 9,12,[Vi]:d:- significa fator somático pertencentes à S. enterica subsp. salamae, 336
maior O:9, menor O:12, Vi pode estar presente à S. enterica subsp. diarizonae, 99 à S. enterica
ou não (entre parênteses), o antígeno flagelar da subsp. arizonae, 73 à S. enterica subsp. houtenae,
fase um é d, e não apresenta antígeno flagelar da 13 à S. enterica subsp. indica e 22 à S. bongori.
fase dois (monofásico). Dentre esses, os sorogrupos somáticos mais co-
Sorotipo 1,4,[5],12:b:1,2 significa: fator somáti- muns são A, B, C1, C2, D, E1 e E4 (Brenner et
co O:1 sublinhado (indica que foi originado por al., 2000, Ellermeier & Slauch, 2005). Esses soro-
conversão fágica), fator somático maior O:4, fa- grupos respondem por aproximadamente 99% das
tores somáticos menores O:5 (entre parênteses in- infecções por Salmonella em humanos e animais
dicando que pode estar presente ou não) e O:12, de sangue quente, incluindo sorotipos amplamen-
o antígeno flagelar da fase um é b e os antígenos te conhecidos como Paratyphi A (Grupo A), Pa-
flagelares da fase dois são 1 e 2. ratyphi B e Typhimurium (Grupo B), Paratyphi
Mais de 2.500 diferentes sorotipos de Salmonella C e Choleraesuis (Grupo C), Typhi, Enteritidis
já foram identificados. A fórmula antigênica de e Gallinarum (Grupo D). Os fatores antigênicos
cada um desses sorotipos é definida e mantida encontrados nesses sorogrupos somáticos encon-
pelo Centro de Referência e Pesquisa em Salmo- tram-se descritos por Grimont & Weill, 2007):
nella do Instituto Pasteur (França), colaborador
Group O:2 (A): Outros antígenos que podem ser
da Organização Mundial de Saúde (Grimont &
encontrados em cepas deste grupo: O:1 e O:12.
Weill, 2007).
Inclui o sorotipo Paratyphi A.
A nomenclatura dos sorotipos. Os sorotipos de
S. enterica subsp. enterica também são definidos Group O:4 (B): Outros antígenos que podem ser
por nomes que, por muito tempo foram conside- encontrados em cepas deste grupo: O:1, O:5,
rados espécies. Essa é outra fonte de confusão e O:12, O:27. Inclui os sorotipos Paratyphi B e
controvérsia na nomenclatura de Salmonella. De Thyphimurium.
acordo com Euzéby (2016b), a designação dos Group O:7 (C1): Outros antígenos que podem
sorotipos não é regulamentada mas é aconselhá- ser encontrados em cepas deste grupo: O:6,
vel que não sejam grafados da mesma forma es- O:14, Vi. Inclui os sorotipos Paratyphi C e
tabelecida para espécies, que é: nome do gênero Choleraesuis. O sorotipo contendo o antígeno
em maiúscula, nome da espécie (e subspécie) em Vi é o Paratyphi C.
minúscula, normalmente em itálico ou destacado Group O:8 (C2-C3): Outros antígenos que po-
de outra forma, como negrito ou sublinhado. As dem ser encontrados em cepas deste grupo:
seguintes formas de grafar os nomes dos soro- O:6, O:20.
tipos podem ser utilizadas: Salmonella London Group O:9 (D1): Outros antígenos que podem
(nomenclatura curta); Salmonella ser. London; ser encontrados em cepas deste grupo: O:1,

O:12, Vi. Inclui os sorotipos Typhi, Enteritidis a) Fermentam a glicose com produção de ácido
e Gallinarum. Os sorotipos contendo o antíge- (100% das cepas) e gás (96% das cepas).
no Vi são Typhi e Dublin. b) Não fermentam a lactose e a sacarose (99%
Group O:9,46 (D2): Outros antígenos que podem das cepas).
ser encontrados em cepas deste grupo: O:1 c) Descarboxilam a lisina (98% das cepas) com
Group O:9,46,27 (D3): Outros antígenos que exceção do sorotipo Paratyphi A (100% das
podem ser encontrados em cepas deste grupo: cepas negativas).
O:1, O:12. d) Produzem H2S (95% das cepas), com exceção
Group O:3,10 (E1): Outros antígenos que podem dos sorotipos Paratyphi A (90% das cepas nega-
ser encontrados em cepas deste grupo: O:15, tivas) e Choleraesuis (50% das cepas negativas).
O:34. e) Não produzem urease (99% das cepas).
Group O:1,3,19 (E4): Outros antígenos que po- f) Fermentam o dulcitol (96% das cepas), com
dem ser encontrados em cepas deste grupo: exceção dos sorotipos Typhi (100% das cepas
O:10, O:15. negativas), Pullorum (100% das cepas negati-
vas) e Choleraesuis (95% das cepas negativas).
19.1.3. Características bioquímicas g) Não crescem na presença de KCN (100% das
de Salmonella cepas).
h) Não utilizam o malonato (100% das cepas).
As principais características bioquímicas das es-
i) Utilizam o citrato (95% das cepas), com ex-
pécies e subspécies de Salmonella e de alguns so-
ceção dos sorotipos Typhi, Paratyphi A, Pullo-
rotipos importantes encontram-se sumariadas no
rum e Gallinarum (100% das cepas negativas)
Quadro 19.2. De acordo com Popoff & Le Minor
e Choleraesuis (75% das cepas negativas).
(2005), as salmonelas, como todas as Enterobac-
j) Não produzem indol (99% das cepas).
teriaceae, são oxidase negativas. Também não
produzem butilenoglicol (Voges-Proskauer nega- k) Não produzem a enzima b-galactosidase, com
tivas) nem fenilalanina deaminase. Normalmen- teste de ONPG (Orto-nitrofenil-b-D-galac-
te são móveis, mas as cepas dos sorotipos Galli- topiranosídeo) negativo (98% das cepas).
narum e Pullorum, ao contrário, usualmente são
imóveis. Reduzem nitrato a nitrito (exceto 2% das 19.1.4. Epidemiologia
cepas do sorotipo Choleraesuis) e são VM (ver- O principal habitat das salmonelas é o trato in-
melho de metila) positivas (exceto 9% das cepas testinal de humanos e animais. Alguns poucos
do sorotipo Pullorum). Normalmente produzem sorotipos são restritos a um hospedeiro, como
gás a partir de glicose, mas as cepas dos sorotipos Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A e C
Typhi e Gallinarum são negativas. e Salmonella Sendai em humanos, Salmonella
De acordo com a ICMSF (1996), a temperatura Abortusovis em ovinos, Salmonella Abortusequi
de crescimento varia entre 5-7 e 46 ºC, com ótima em equinos, Salmonella Gallinarum em aves, Sal-
entre 35 e 43 ºC. O pH de crescimento varia entre monella Typhisuis em suínos, Salmonella Chole-
3,8 e 9,5, com ótimo entre 7,0 e 7,5. A atividade raesuis em suínos (mais raramente, em humanos)
de água mínima para crescimento é de 0,94. e Salmonella Dublin em bovinos (mais raramen-
As cepas de Salmonella enterica subsp. enterica te, em humanos e ovinos) (Ellermeier & Slauch,
são o principal alvo das análises em alimentos e 2005). Quando esses sorotipos provocam doenças
seu perfil bioquímico descrito abaixo (dados de em humanos, o processo geralmente é invasivo e
Popoff & Le Minor, 2005) é o que, normalmente, apresenta risco de vida (WHO, 2005).
se considera como típico nos ensaios de detec- A maioria dos sorotipos, entretanto, têm um es-
ção. pectro de hospedeiros amplo e, tipicamente, pro-

Salmonella □ 297
Quadro 19.2. Principais características das espécies de Salmonella e de alguns sorotipos importantes
epidemiologicamente (Brenner & Farmer III, 2005).
Salmonella serovar
Salmonella serovar
Salmonella serovar
Salmonella serovar
Salmonella serovar
S. enterica subsp.
S. enterica subsp.
S. enterica subsp.
S. enterica subsp.
S. enterica subsp.
S. enterica subsp.
Choleraesuis
Paratyphi A
Gallinarum
diarizonae
S. bongori
Pullorum
houtenae
arizonae
salamae
enterica
indica
Typhi
Teste
Oxidase - - - - - - - - - - - -
Glicose acido + + + + + + + + + + + +
Glicose gás + (96) + (95) - + (99) + (90) - + (99) + (99) + + + + (94)
Lactose - (99) - - - - - (99) - (85) + (85) - - (78) - (99) -
Sacarose - (99) - - - - - - (99) - (95) - - - (99) -
H 2S + (95) +/- (50/50) + - (90) + (90) + (97) + (99) + (99) + + + +
Lisina + (98) + (95) + (90) - + + (98) + (99) + (99) + + + +
Urease - (99) - - - - - - - - (98) - - -
Dulcitol + (96) - (95) + (90) + (90) - - - - (99) - + (67) + (90) + (94)
KCN - - - - - - - (99) - (99) + (95) - - +
Malonato - - - - - - + (95) + (95) - - + (95) -
Indol - (99) - - - - - - (99) - (98) - - - (98) -
VM + + + + + (90) + + + + + + +
VP - - - - - - - - - - - -
Citrato + (95) - (75) - - - - + (99) + (98) + (98) + (89) + + (94)
Fenilalanina - - - - - - - - - - - -
Motilidade + (95) + (95) - + (95) - + (97) + (99) + (99) + (98) + + (98) +
Nitrato + + (98) + + + + + + + + + +
ONPG - (98) - - - - - + + (92) - - (56) - (85) + (94)
+ = 100% das cepas são positivas, exceto quando outra porcentagem estiver especificada entre parênteses.
- = 100% das cepas são negativas, exceto quando outra porcentagem estiver especificada entre parênteses.
vocam gastroenterites sem complicações e sem ção, dor de cabeça, perda de apetite e, eventual-
necessidade de tratamento. Em crianças, idosos e mente, erupção cutânea. A duração normalmente
indivíduos com o sistema imunológico debilitado é de duas a quatro semanas. Podem ocorrer com-
ou comprometido, ao contrário, essas infecções plicações, incluindo septicemia e artrite séptica.
podem ser severas. Os sorotipos mais importantes Também pode ocorrer infecção crônica da vesí-
na transmissão dessas salmoneloses de animais cula biliar, situação em que o indivíduo se torna
para humanos são Salmonella Enteriditis e Sal- um carreador da bactéria. A taxa de mortalidade
monella Typhimurium (WHO, 2005). da febre tifóide (não tratada) é de 10%.
De acordo com a US Food and Drug Administra- Nas gastroenterites provocadas pelas outras sal-
tion (FDA, 2012), Salmonella Typhi e Paratyphi monelas, os sintomas ocorrem entre seis e 72 ho-
causam febre tifoide em humanos, que normal- ras, incluindo febre, dor de cabeça, cólicas abdo-
mente ocorre entre uma e três semanas após a minais, diarreia, náusea e vômito. A duração varia
exposição, mas que pode demorar até dois meses de quatro a sete dias podendo prolongar-se depen-
para manifestar-se. A dose infectiva é de menos dendo do hospedeiro, da dose ingerida e da cepa
de mil células e os sintomas incluem febre alta, de Salmonella envolvida. A doença geralmente é
letargia, dores abdominais, diarreia ou constipa- auto-limitada em individuos saudáveis e com o

sistema imunológico normal, com taxa de morta- para sobremesas, gelatina, creme de amendoim,
lidade menor que 1% no geral. Crianças, idosos, cacau e chocolate. A contaminação cruzada é ou-
pacientes sujeitos à quimioterapia e à drogas imu- tra forma comum de contaminação alimentar por
nosupressoras são mais vulneráveis. Pacientes de Salmonella (FDA, 2012).
AIDS são atingidos por salmoneloses com uma
frequência 20 vezes maior do que a população em 19.1.5. Comentários sobre os
geral, sofrendo de episódios recorrentes (FDA, métodos tradicionais de análise
2012). de Salmonella
A fonte usual de Salmonella Typhi e Salmonella
Paratyphi no ambiente é a agua contaminada com A técnica tradicional de detecção de Salmonella em
esgoto não tratado. Outras salmonelas são co- alimentos é um método cultural clássico de presen-
muns nos animais e espalham-se através da rota ça/ausência, desenvolvido com a finalidade de ga-
fecal-oral, atingindo a água, o solo e os insetos, rantir a detecção mesmo em situações extremamen-
contaminando a carne, os vegetais no campo, os te desfavoráveis. Esse é o caso de alimentos com
equipamentos nas linhas de produção de alimen- uma microbiota competidora muito maior do que
tos, as mãos e os utensílios de cozinhas. A doença a população de Salmonella e/ou alimentos em que
é contraída através do consumo de alimentos de as células de Salmonella se encontrem em número
origem animal contaminados (carnes, ovos, leite muito reduzido e/ou alimentos em que as células
e seus derivados, pescados e frutos do mar), mas se encontrem injuriadas pelo processo de preserva-
verduras, frutas e vegetais também têm sido im- ção (aplicação de calor, congelamento, secagem).
plicados na transmissão, bem como produtos de Os procedimentos recomendados por diferentes
baixa atividade de água (temperos). Na verdade, órgãos reguladores, embora apresentem algumas
Salmonella atinge toda a cadeia de produção de variações na seleção dos meios de cultura e forma
alimentos, desde a matéria prima até os produtos de preparação das amostras, seguem basicamente
finais. Outros alimentos que já foram implicados quatro etapas que podem ser aplicadas a qualquer
na transmissão de salmoneloses incluem levedura tipo de alimento. Essas etapas e os meios utilizados
seca, coco e derivados, molhos, coberturas para pelos diferentes órgãos reguladores internacionais
saladas, misturas para bolos, cremes e coberturas encontram-se sumariados no Quadro 19.3.
Quadro 19.3. Meios e condições de incubação recomendados pela ISO, FDA e USDA nas diversas
etapas do ensaio de Salmonella em alimentos.
Método a Pré-enriquecimento b Enriquecimento seletivo b Plaqueamento diferencial b
ISO 6579:2002/Corr RVS a 41,5±1 ºC/24±3h XLD a 37±1 ºC/24±3h
BPW a 37±1 ºC/18±2h c
1:2004/Amd 1:2007 MKTTn a 37±1 ºC/24±3h 2º Opcional e
HE a 35±2 ºC/24±2h
RV a 42±0,2 ºC/24±2h
BAM/FDA:2016 CL a 35±2 ºC/24±2h c BS a 35±2 ºC/24±2h
TT a 35±2 ºC/24±2h ou 43±0,2 ºC/24±2h d
XLD a 35±2 ºC/24±2h
RV ou RVS a 42±0,5 ºC/22-24h BGS a 35±2 ºC/18-24h
mlG/FSIS:2017 BPW a 35±2 ºC/18-24h
TTH a 42±0,5 ºC/22-24h XLT4 ou DM-LIA a 35±2 ºC/18-24h
a ISO 6579:2002/Corr 1:2004/Amd 1:2007 = Método da International Organization for Standardization, BAM/FDA:2016 = Método do Bacteriological
Analytical Manual Online da Food and Drug Administration (Andrews et al., 2016), mlG/FSIS:2017 = Método do Microbiological Laboratory Guidebook
Online do Food Safety and Inspection Service, United States Department of Agriculture ( mlG/FSIS, 2017).
b BPW = Água Peptonada Tamponada, BGS = Ágar Verde Brilhante Sulfa, BS = Ágar Bismuto Sulfito, CL = Caldo Lactosado, DM-LIA = Ágar Lisina Ferro
Duplamente Modificado, HE = Ágar Entérico de Hectoen, MKTTn = Caldo Tetrationato Muller-Kauffmann Novobiocina, RV = Caldo Rappaport-Vas-
siliadis Modificado, RVS = Caldo Rappaport-Vassiliadis Soja, TT = Caldo Tetrationato, TTH = Caldo Tetrationato Hajna, XLD = Ágar Xilose Lisina
Desoxicolato, XLT4 = Ágar Xilose Lisina Tergitol 4.
c Há algumas variações, apresentadas na descrição do procedimento.
d Alimentos com baixa carga microbiana a 35 ºC e com alta carga microbiana a 43 ºC.
e Selecionar um meio adequado para o isolamento de cepas lactose positivas e dos sorotipos Typhi e Paratyphi. O Ágar Verde Brilhante (BG) e o Ágar Bismuto
Sulfito (BS) podem ser utilizados.

Salmonella □ 299
Pré-enriquecimento em caldo não seletivo. Ob- distingam dos competidores, para posterior con-
jetiva a reparação de células injuriadas, conseguida firmação sorológica e bioquímica. Assim como na
incubando-se a amostra em condições não seletivas, etapa de enriquecimento seletivo, recomenda-se
por pelo menos 18 horas. Os meios mais utilizados que o plaqueamento diferencial seja feito em mais
são a Água Peptonada Tamponada (BPW) e o Caldo de um tipo de meio de cultura, havendo diversos
Lactosado (CL), com algumas exceções apresenta- meios disponíveis para utilização nessa etapa.
das na descrição dos procedimentos. Os mais utilizados são os meios que diferenciam
Salmonella através da não fermentação da lactose
Enriquecimento em caldo seletivo. Objetiva ini-
e da produção de H2S, como o Ágar Entérico de
bir a multiplicação da microbiota acompanhante
Hectoen (HE), o Ágar Xilose Lisina Desoxicolato
e promover a elevação preferencial do número
(XLD) e o Ágar Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4).
de células de Salmonella, incubando-se a amos-
Como há cepas de Salmonella que fermentam a
tra pré-enriquecida em caldo seletivo, por 18 a 24
lactose ou não produzem H2S, é importante que
horas. Nesta etapa, recomenda-se a utilização de
o segundo ou o terceiro meio de plaqueamento
dois diferentes meios de enriquecimento, porque
não seja baseado nessas duas características. Uma
a resistência de Salmonella aos agentes seletivos
dessas opções é o Ágar Verde Brilhante (BG), que
varia de cepa para cepa. Os meios mais recomen-
baseia-se na fermentação da lactose mas não na
dados são o Caldo Rappaport-Vassiliadis Modifi-
produção de H2S, e o Ágar Bismuto Sulfito (BS),
cado (RV) ou Rappaport-Vassiliadis Soja (RVS) e
que baseia-se na produção de H2S mas não na fer-
diversas formulações do Caldo Tetrationato, com
mentação da lactose.
algumas exceções apresentadas na descrição dos
procedimentos. A seletividade do RV e do RVS é
Confirmação. Objetiva verificar se as colônias
baseada na presença de verde de malaquita oxa-
típicas obtidas nas placas são realmente colônias
lato, na alta pressão osmótica (presença de clo-
de Salmonella, através de provas bioquímicas e
reto de magnésio em alta concentração) e no pH
sorológicas. A confirmação bioquímica verifica o
relativamente ácido (5,1). O Caldo Tetrationato
perfil bioquímico característico das cepas de Sal-
tem várias formulações comerciais, que são uti-
monella enterica subsp. enterica apresentado no
lizadas por diferentes órgãos reguladores. Essas
item 19.1.3. De maneira geral, os diferentes órgãos
formulações são bem definidas na descrição dos
reguladores também recomendam o uso de “kits”
procedimentos. A base da seletividade do meio é
comerciais miniaturizados, que permitem a reali-
a presença de verde brilhante, bile (ou desoxico-
zação de um número maior de provas bioquímicas.
lato de sódio), iodo e tiossulfato de sódio. O iodo
A confirmação sorológica verifica a presença de
é adicionado no momento do uso, reagindo com
antígenos “O”, “Vi” e “H”, por testes de agluti-
o tiossulfato para formar o tetrationato. O cresci-
nação com anti-soros polivalentes. Esses anti so-
mento das enterobactérias que reduzem o tetratio-
ros devem conter anticorpos para os fatores mais
nato, como Salmonella, é relativamente normal,
comumente encontrados que, no caso do teste so-
enquanto os coliformes e outras enterobactérias
rológico somático, são os dos sorogrupos “A” a
não redutoras são suprimidas. A redução do tetra-
“E”. Alguns anti-soros comerciais contém, além
tionato produz ácido, neutralizado pelo carbonato
dos anticorpos para os fatores dos grupos “A” a
de cálcio presente na formulação. Proteus tam-
“E”, também para o antígeno Vi. Algumas marcas
bém são redutores de tetrationato e podem crescer
incluem um “pool”completo, com os somáticos
nesse meio, interferência que pode ser reduzida
“A” a “E”, os flagelares e o Vi, juntos. Os métodos
com a adição de novobiocina.
de análise de alimentos terminam a confirmação
Plaqueamento seletivo diferencial. Objetiva pro- nessa etapa, porque a caracterização completa de
mover o desenvolvimento preferencial de colônias cepas de Salmonella normalmente é feita por pou-
de Salmonella, com características típicas que as cos laboratórios de referência em cada país.

19.1.6. Comentários sobre os cos. Esses métodos seguem a tendência atual de

métodos alternativos de análise desenvolvimento de “kits” analíticos com marca
de Salmonella registrada, definidos pela AOAC International
como: “sistemas contendo todos os componentes
O método tradicional é bastante sensível, com limi- chave para a realização da análise de um ou mais
te de detecção de uma unidade formadora de colô- microrganismos, em um ou mais tipos de alimen-
nia/25g de amostra, porém, é lento e trabalhoso. Em tos, segundo um determinado método” (Andrews,
função disso, há um grande interesse por métodos 1997). A grande vantagem dos “kits” é que o ma-
alternativos mais rápidos e mais simples, que pos- terial requerido nos ensaios (todo ou parte dele) é
sam ser utilizados em lugar do método tradicional. comercializado em conjunto, eliminando a prepa-
Nos últimos vinte anos houve um grande avanço ração no laboratório.
no desenvolvimento de novos métodos, particu- Já foram oficializados pela AOAC para a análi-
larmente os métodos imunológicos e, em menor se de Salmonella os “kits” analíticos descritos no
escala, os métodos baseados nos ácidos nuclei- Quadro 19.4.
Quadro 19.4. “Kits” analíticos oficializados pela AOAC International para a detecção de Salmonella
AOAC Official Method Analito Fabricante Nome do “kit Aplicação
986.35; 987.11; 993.08 Salmonella spp. Organon Teknika Salmonella Tek Alimentos
987.10 Salmonella spp. Neogen Corporation GENE TRAK Salmonella Assay Alimentos
BioControl Systems, Alimentos, ingredientes e amos-
989.13 Salmonella spp. 1-2 Test
Inc. tras ambientais
Alimentos e correlatos, amostras
989.14, 998.09 Salmonella spp. TECRA Diagnostics TECRA Salmonella VIA
ambientais
GENE TRAK Salmonella DLP
990.13 Salmonella spp. Neogen Corporation Alimentos
Assay
992.11 Salmonella spp. Assurance Salmonella EIA
996.08, 2004.03 Salmonella spp. BioMérieux Inc. VIDAS (SLM) Immunoassay Todos os alimentos
Rhone-Poulenc Diag-
997.16 Salmonella spp LOCATE ELISA Alimentos
nostics
999.08 Salmonella spp. Transia AG Salmonella EIA
999.09 Salmonella spp. VIP for Salmonella
Alimentos e correlatos, amostras
2000.07 Salmonella spp. TECRA Diagnostics TECRA Salmonella Unique
ambientais
2001.07, 2001.08, VIDAS Immuno-Concentration
Salmonella spp. BioMérieux Inc. Todos os alimentos
2001.09 Salmonella (ICS)
2003.09 Salmonella spp. Qualicon Inc. Bax System Alimentos
2004.03 Salmonella spp. BioMérieux Inc. VIDAS (SLM) Immunoassay Alimentos
GeneQuence Salmonella DNA Aves, ovos, leite, chocolate,
2007.02 Salmonella spp. Neogen Corporation
Hybridization Method rações
BioControl Systems, Assurance GDS Salmonella PCR Alimentos e amostras do ambien-
2009.03 Salmonella spp.
Inc. Assay te de fabricação
Vidas UP Salmonella (SPT) EIA Diversos alimentos e superfícies
2013.01 Salmonella spp. BioMérieux Inc.
Method do ambiente de fabricação
Bax System Real Time PCR Diversos alimentos e superfícies
2013.02 Salmonella spp. Qualicon Inc.
Salmonella Assay do ambiente de fabricação
3M Microbiology Diversos alimentos e superfícies
2013.09 Salmonella spp. 3M Molecular Detection Assay
Products do ambiente de fabricação
3M Microbiology 3M Petrifilm Salmonella Express
2014.01 Salmonella spp. Diversos alimentos
Products System

Salmonella □ 301
19.1.7. Composição de amostras 19.2. Método ISO 6579

para a análise para presença/ausência de
Na análise de diversas unidades de amostra de lo- Salmonella em alimentos
tes, havendo evidências de que a composição não
afeta o resultado para aquele tipo de alimento, po- Método da International Organization for Stan-
de-se utilizar a prática de compor as amostras. O dardization, aplica-se a todos os alimentos desti-
BAM/FDA (Andrews et al., 2016) especifica que nados ao consumo humano, às rações animais e à
até 15 unidades de amostra podem ser compostas, amostras do ambiente de fabricação ou manipu-
com exceções apresentadas no Quadro 19.6. lação de alimentos. Pode não recuperar cepas dos
sorotipos Typhi e Paratyphi.
Composição a seco. Consiste em coletar uma uni-
dade analítica (geralmente de 25g) de cada uma 19.2.1. Material requerido para a
das unidades de amostra e juntar todas as uni-
análise
dades analíticas numa única amostra composta,
misturando bem o conteúdo. A essa amostra com- □ Água Peptonada Tamponada (BPW)
posta adiciona-se o caldo de pré-enriquecimento, □ Caldo Rappaport Vassiliadis Soja (RVS)
na quantidade necessária para diluição 1:10. Esse □ Caldo Tetrationato Muller Kauffmann Novo-
tipo de composição é recomendado para amostras biocina (MKTTn)
em que se espera ausência de Salmonella ou, em □ Placas de Ágar Xilose Lisina Desoxicolato
caso de presença, não seja importante determinar (XLD)
qual unidade de amostra está contaminada. Não é □ Placas de um segundo meio opcional, de esco-
recomendada para alimentos que não permitam a lha do laboratório
obtenção de uma amostra composta homogênea. □ Placas de Ágar Nutriente (NA)
□ Tubos de Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)
Composição úmida. Consiste em pré-enriquecer
□ Tubos de Ágar Uréia de Christensen
cada unidade analítica separadamente e compor
□ Tubos de Caldo Descarboxilase 0,5% L-Lisina
os caldos de pré-enriquecimento obtidos. Nesse
□ Tubos de Caldo Triptona 1%
caso, o volume de caldo de enriquecimento sele-
□ Tubos de Caldo VM-VP
tivo deve ser suficiente para manter a proporção
□ Reagente de Beta-Galactosidase (orto-nitrofe-
recomendada de pré-enriquecimento a ser trans-
nil-β-D-galactopiranosídeo - ONPG)
ferido. Por exemplo, a transferência para o Cal-
□ Reagente de Kovacs para teste de indol
do Rappaport-Vassiliadis (RV ou RVS) é feita na
□ Reagentes de VP para teste de Voges Proskauer
proporção 0,1 ml de pré-enriquecimento para 10
(Solução de α-naftol 5%, Solução de KOH
ml de RV ou RVS. Então, para compor 10 amos-
40%, Creatina em cristais)
tras, são necessários 100 ml de RV ou RVS. Esse
□ Anti-soro somático polivalente (Poli O)
tipo de composição é recomendado para alimen-
□ Anti-soro flagelar polivalente (Poli H)
tos que não permitam a obtenção de uma amostra
□ Anti-soro Vi
composta homogênea, na composição a seco, ou
□ Estufa incubadora a 37±1 ºC
quando é importante determinar qual unidade de
□ Banho a 37±1 ºC
amostra está contaminada, em caso de presença.
□ Banho ou estufa incubadora a 41,5±1 ºC
Nessa situação, é possível analisar individual-
mente cada unidade pré-enriquecida, preservada
sob refrigeração.
O esquema da análise de Salmonella pelo méto-
do ISO 6579:2002/Corr 1:2004/Amd 1:2007 en-
contra-se descrito na Figura 19.1. Antes de iniciar

Figura 19.1. Esquema da análise de Salmonella pelo método ISO ISO 6579:2002/Corr 1:2004/Amd 1:2007. (continua)

Salmonella □ 303
Figura 19.1. Esquema da análise de Salmonella pelo método ISO ISO 6579:2002/Corr 1:2004/Amd 1:2007. (continuação)

as atividades, ler atentamente as orientações do c) Plaqueamento diferencial. De cada cultura

Capítulo 5, que apresenta todos os detalhes e cui- em RVS, estriar uma alçada (estrias de esgo-
dados envolvidos na detecção da presença/ausên- tamento) em Ágar Xilose Lisina Desoxicolato
cia de microrganismos. O procedimento descrito (XLD) e uma alçada em um segundo meio, de
abaixo não apresenta esses detalhes, pressupondo livre escolha do laboratório. Repetir esse pro-
que sejam conhecidos pelo analista. cedimento com o caldo MKTTn. Incubar as
a) Pré-enriquecimento. Seguindo as orienta- placas de XLD invertidas, a 37±1 ºC/24±3h.
ções do Capítulo 2, homogeneizar uma por- Incubar as placas do segundo meio opcional de
ção de 25g ou 25 ml da amostra em 225 ml de acordo com a orientação do fabricante.
Água Peptonada Tamponada (BPW). Incubar Nota c.1) Para selecionar o segundo meio de plaquea-
a 37±1 ºC/18±2h. mento, a ISO 6579 recomenda optar por meios ade-
quados ao isolamento de cepas lactose positivas e
Nota a.1) Para a composição de amostras a seco, manter cepas dos sorotipos Typhi e Paratyphi. O Ágar Ver-
a proporção 1:10 na diluição da amostra composta de Brilhante (BG) e o Ágar Bismuto Sulfito (BS),
em BPW. Se o volume de BPW for grande, preaque- podem ser utilizados. Seguir as orientações do fa-
cer o caldo a 37 ºC antes da inoculação. bricante para selecionar as colônias típicas no meio
Nota a.2) Para a análise de cacau ou produtos contendo opcional.
mais de 20% de cacau, utilizar BPW suplementada Nota c.2) Para obter colônias isoladas, a ISO 6579 reco-
com 50g/l de caseína (não utilizar caseína ácida) ou, menda utilizar placas grandes (140mm de diâmetro)
na indisponibilidade da caseína, com 100g/l de leite para as estrias de esgotamento. Na indisponibilida-
em pó desnatado. Se for esperada uma alta contami- de dessas placas, recomenda estriar a mesma alçada
nação da amostra por bactérias Gram positivas, incu- em duas placas pequenas (100mm de diâmetro), sem
bar o caldo a 37±1 ºC/2h e então adicionar 0,018g/l flambar a alça entre uma placa e outra.
de verde brilhante, continuando a incubação até com-
pletar 18±2h. d) Seleção das colônias e purificação das cultu-
Nota a.3) Para a análise de produtos ácidos, utilizar BPW ras para a confirmação. Após o período de
em concentração dupla, para garantir que o pH não
incubação, verificar se há desenvolvimento de
atinja valores inferiores a 4,5 durante o período de
incubação. colônias típicas de Salmonella nos meios de
plaqueamento diferencial. No Ágar XLD as co-
b) Enriquecimento seletivo. Agitar cuida- lônias típicas são cor de rosa escuro, com centro
dosamente o frasco de pré-enriquecimen- preto e uma zona avermelhada levemente trans-
to (BPW) e transferir 0,1 ml para 10 ml de parente em redor. Cepas de Salmonella H2S for-
Caldo Rappaport-Vassilidis Soja (RVS) e 1 temente positivas podem produzir colônias com
ml para 10 ml de Caldo Tetrationato Muller centro preto grande e brilhante, ou mesmo intei-
Kauffmann Novobiocina (MKTTn). Incubar ramente pretas. Cepas de Salmonella H2S nega-
o Caldo RVS a 41,5±1 ºC/24±3h e o Caldo tivas produzem colônias cor de rosa com centro
MKTTn a 37±1 ºC/24±3h. rosa mais escuro, mas não preto. Cepas de Sal-
Nota b.1) Para a composição úmida das amostras, multi- monella lactose positivas produzem colônias
plicar o volume BPW a ser transferido pelo número amarelas com ou sem centro preto. No segundo
de unidades de amostra compostas, na transferência meio de plaqueamento, seguir as orientações do
para os caldos RVS e MKTTn. O volume de RVS e
fabricante para verificar as características típi-
MKTTn também deve ser multiplicado pelo núme-
ro de unidades de amostra compostas, para manter cas das colônias de Salmonella.
a proporção. No fundo de cada placa inoculada, marcar
Nota b.2) Se a incubação for feita em banho, é recomen- cinco colônias típicas para a confirmação e,
dado o uso de um agente bactericida na água do base houver menos de cinco, marcar todas. Se-
nho. A dose infectiva de Salmonella é muito baixa e
qualquer contaminação acidental da água pela amos-
lecionar uma das colônias marcadas, submeter
tra, durante a incubação, é potencialmente perigosa à confirmação e, se o resultado dessa for ne-
para o pessoal do laboratório. gativo, submeter as outras à confirmação. Em

Salmonella □ 305
estudos epidemiológicos, pelo menos cinco negativo. A maioria das cepas de Salmo-
colônias de cada placa devem ser submetidas nella são urease negativas.
à confirmação. e.3) Teste de lisina descarboxilase. Inocular
Estriar (estrias de esgotamento) a cultura de cada cultura em um tubo de Caldo Descarbo-
cada colônia selecionada em uma placa de xilase 0,5% L-Lisina, logo abaixo da super-
Ágar Nutriente (NA), para purificação. Incubar fície do líquido. Incubar a 37±1 ºC/24±3h e
as placas, invertidas, a 37±1 ºC/24±3h. Após a observar se ocorre turvação com viragem al-
incubação, selecionar uma colônia bem isola- calina do indicador, alterando a cor do meio
da de cada placa de NA, para a realização dos para roxo azulado (teste positivo) ou viragem
testes de confirmação. ácida para amarelo (teste negativo). A maio-
e) Confirmação bioquímica. Para os testes bio- ria das salmonelas são lisina-positivas, mas
químicos pode ser utilizado um “kit” miniatu- as cepas do sorotipo Paratyphi são negativas.
rizado de identificação, adequado para Entero- e.4) Teste de Voges-Proskauer. Inocular cada
bacteriaceae. Alternativamente, aplicar a série cultura em um tubo com 3 ml de caldo VM-
bioquímica descrita abaixo. -VP e incubar a 37±1 ºC/24±3h. Após a in-
e.1) Teste de crescimento em Ágar Tríplice cubação, adicionar ao tubo os Reagentes de
Açúcar Ferro (TSI). Com uma agulha de VP: duas gotas de solução aquosa 0,5% de
inoculação, inocular cada cultura em um creatina monohidrato, três gotas de solução
tubo inclinado de TSI, por picada e estrias na de α-naftol 5% e duas gotas de solução de
rampa. Incubar os tubos a 37±1 ºC/24±3h, KOH 40%, nesta sequência e agitando o
com as tampas ligeiramente afrouxadas, tubo entre um reagente e outro. O desenvol-
para manter condições aeróbicas e prevenir vimento de uma cor rosa escuro ou vermelha
a excessiva produção de H2S. Observar se no meio de cultura, no intervalo de 15min,
há ocorrência de reação típica de Salmo- indica teste positivo. O não desenvolvimen-
nella: rampa alcalina (vermelha), fundo to da cor rosa ou vermelha indica teste nega-
ácido (amarelo) com produção de gás (bo- tivo. As salmonelas são VP negativas.
lhas ou rachaduras no meio de cultura), com e.5) Teste de Indol. Inocular cada cultura em
ou sem produção de H2S (escurecimento um tubo com 5 ml de Caldo Triptona 1%
ou não do meio no fundo). Eventualmente suplementado com 1g/l de DL-Triptofano e
pode crescer uma cepa lactose positiva de incubar a 37±1 ºC/24±3h. Após a incubação
Salmonella, provocando uma reação ácida adicionar, para cada 5 ml de cultura, 1 ml
(amarela) atípica na rampa. Essas cepas não do Reagente de Kovacs para teste de indol e
devem ser descartadas sem levar em conta observar se há desenvolvimento de um anel
os resultados dos demais testes. vermelho-violeta na superfície do meio de
e.2) Teste de urease. Inocular cada cultura em cultura (teste positivo), ou se o anel perma-
um tubo de Ágar Uréia de Christensen incli- nece amarelado, cor do reagente de Kovacs
nado (estrias na rampa). Incubar os tubos a (teste negativo). Desenvolvimento de vários
37±1 ºC/24±3h e observar a ocorrência de tons entre vermelho e rosa indica teste inde-
viragem alcalina do indicador, com altera- terminado. A maioria das cepas de Salmo-
ção da cor do meio de pêssego para cor de nella são indol-negativas.
rosa escuro (teste positivo), ou permanên- e.6) Teste de β-galactosidase. Suspender uma
cia do meio na cor original (teste negativo). alçada de cada cultura em um tubo com 0,25
Ocasionalmente, tubos não inoculados de ml de solução salina 0,85% estéril. Adicio-
Ágar Uréia de Christensen podem sofrer nar ao tubo uma gota de tolueno, agitar
viragem alcalina, sendo recomendável incu- bem e incubar em banho a 37±1 ºC/5min.
bar um tubo não inoculado como controle Adicionar ao tubo 0,25 ml do reagente de

β-galactosidase (orto-nitrofenil-b-D-galac- Brasil (São Paulo) discrimina anticorpos para o Vi e

topiranosídeo, ONPG), agitar bem e incubar para os fatores dos sorogrupos A, B, C1, C2, D, E1,
E2, E3 e E4 e o soro da Becton Dikinson (BD Difco
em banho a 37±1 ºC/24±3h, examinando 222641) discrimina anticorpos para o Vi e para os
periodicamente. O desenvolvimento de uma fatores dos sorogrupos somáticos A até I (O:1 a O:16,
cor amarela no líquido, geralmente no inter- O:19, O:22 a O:25 e O:34).
valo de 20min, é indicativa de teste positivo. f.2) Detecção do antígeno Vi. O procedimento
A maioria das cepas de Salmonella enterica é o mesmo descrito para os antígenos somá-
subsp. enterica são negativas. ticos, substituindo o anti-soro polivalente
Nota e.6.1) O teste pode ser realizado usando-se discos somático pelo Vi.
impregnados com o ONPG, disponíveis comercial-
mente com os seguintes códigos: Taxo™ ONPG Discs Nota f.2.1) Alguns anti-soros polivalentes já incluem o
(BBL 231249), ONPG Discs (Oxoid DD013), ONPG Vi junto com os somáticos, não sendo necessário tes-
Discs (Fluka 49940). Nesse caso, deve ser seguida a tar separadamente.
orientação do fabricante para a realização do teste. f.3) Detecção dos antígenos flagelares (poli H).
f) Confirmação sorológica Inocular cada cultura em um tubo de Ágar
f.1) Detecção dos antígenos somáticos (poli Nutriente semi sólido (0,4% de ágar) não in-
O). Marcar dois quadrados de aproximada- clinado e incubar a 37±1 ºC/24±3h. A partir
mente 2cm2 em uma lâmina de vidro, usan- dessa cultura, realizar o teste de aglutinação
do um lápis de marcar vidro de material em lâmina, da mesma forma descrita para
hidrofóbico. Colocar uma gota de solução o teste sorológico somático, substituindo o
salina 0,85% estéril em um dos quadrados e anti-soro somático pelo anti-soro flagelar
uma gota de anti-soro somático polivalente polivalente anti-Salmonella.
anti-Salmonella no outro. Emulsionar uma Nota f.3.1) Alguns anti-soros polivalentes incluem os
parte da colônia suspeita na gota de solu- flagelares junto com os somáticos, mas o teste des-
ção salina e outra parte na gota de anti-soro. crito pela ISO deve ser feito separadamente, porque é
precedido do cultivo da cultura em meio semissólido
Segurando a lâmina contra um fundo preto (enriquecimento de flagelos).
bem iluminado, fazer delicados movimen-
tos de inclinação e rotação da lâmina, para g) Interpretação dos resultados. Interpretar os
movimentar a emulsão, observando se ocor- resultados de acordo com a orientação do Qua-
re aglutinação no quadrado com o anti-soro. dro 19.5.
Comparar com a aparência da emulsão no Quadro 19.5. Interpretação dos testes de confir-
quadrado com salina (controle negativo), mação no ensaio de Salmonella pelo método
para não confundir a aparência turva da ISO 6579 (2007).
emulsão com reação de aglutinação. Even-
Resultados Resultados dos
tualmente pode ocorrer aglutinação em am- Auto
dos testes testes soroló- Interpretação
aglutinação
bos os quadrados, indicação de que a cepa é bioquímicos gicos
Confirmada
auto-aglutinante. Essas cepas não precisam Típicos a Não
“O”, “Vi” ou “H”
como
ser submetidas a outros testes sorológicos. positivos
Salmonella
Nota f.1.1) Os anti-soros somáticos polivalentes devem Típicos a Não todos negativos
conter, no mínimo, anticorpos para os fatores antigê- Típicos a Sim Não se aplica Pode ser
b
nicos dos grupos sorológicos somáticos “A” até “E”, “O”, “Vi” ou “H” Salmonella
Atípicos Não/Sim
descritos no Quadro 19.2. De preferência, devem positivos
conter também anticorpos para o antígeno capsular Não confirmada
Atípicos Não/Sim todos negativos
como Salmonella
Vi que, se presente, vai encobrir os antígenos somá-
a Resultados típicos: TSI com rampa alcalina, fundo ácido, produção de
ticos. Na aquisição de marcas comerciais, escolher
gás e produção de H2S, urease negativo, lisina descarboxilase positivo,
fornecedores que discriminem os fatores detectados b-galactosidase negativo, VP negativo, indol negativo.
pelo “pool” de anticorpos presentes. Por exemplo: o b Essas cepas devem ser enviadas a um laboratório apto à realização da
Soro Salmonella Polivalente Somático da Probac do confirmação definitiva.

Salmonella □ 307
19.3. Método BAM/FDA:2016 Uréia Rápido

□ Caldo Descarboxilase de Falkow (com 0,5%
para presença/ausência de de L-Lisina)
Salmonella em alimentos □ Caldo Vermelho de Fenol Base ou Caldo
Método da Food and Drug Administration (FDA), Púrpura Base com 0,5% de dulcitol (com
revisão de Agosto de 2016 do Capítulo 5 do Bac- tubo de Durham)
teriological Analytical Manual Online (Andrews □ Caldo Vermelho de Fenol Base ou Caldo
et al., 2016). Púrpura Base com 0,5% de lactose (com
O método da FDA é aplicável a todos os alimen- tubo de Durham)
tos, contendo descrição detalhada de variações no □ Caldo Vermelho de Fenol Base ou Caldo
procedimento para alguns produtos em particular Púrpura Base com 0,5% de sacarose (com
(tipo de caldo, forma de homogeneização, dilui- tubo de Durham)
ção inicial). Essas variações são apresentadas no □ Caldo Triptona 1%
Quadro 19.6 e em notas ao longo do texto, que □ Caldo Cianeto de Potássio com tampa de ro-
devem ser consultadas. lha recobertas de parafina
□ Caldo Malonato Modificado
□ Caldo Tripticase de Soja (TSB) ou Caldo In-
fusão Cérebro Coração (BHI)
análise
□ Ágar Citrato de Simmons
□ Caldo de pré-enriquecimento (depende da □ Reagente de Kovacs para teste de indol
amostra, vide Quadro 19.6) □ Reagentes de VP para teste de Voges
□ Solução de NaOH ou HCl 1N para ajuste do Proskauer (solução de a-naftol 5%, solução
pH de KOH 40%, cristais de creatina)
□ Caldo Rappaport-Vassiliadis Modificado (RV) □ Reagente de VM para teste de vermelho de
□ Caldo Tetrationato (TT) metila
□ Caldo Selenito Cistina (SC) (para a análise de □ Banho com circulação forçada a 42±0,2 ºC
goma guar ou alimentos suspeitos de contami- □ Banho com circulação forçada a 43±0,2 ºC
nação com Salmonella Typhi) □ Estufa incubadora a 35±2 ºC
□ Ágar Entérico de Hectoen (HE) □ Estufa incubadora a 37±0,5 ºC
□ Ágar Bismuto Sulfito (BS) □ Banho a 48-50 ºC
□ Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD)
□ Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) 19.3.2. Procedimento
□ Ágar Lisina Ferro (LIA)
□ Solução Salina Formalinizada (Formalina) O esquema da análise de Salmonella pelo método
□ Anti-soro flagelar polivalente anti-Salmonella BAM/FDA:2016 encontra-se descrito na Figura
□ Anti-soro Spicer-Edwards flagelar 19.2. Antes de iniciar as atividades, ler atenta-
□ Anti-soro somático polivalente anti-Salmo- mente as orientações do Capítulo 5, que apresenta
nella todos os detalhes e cuidados envolvidos na detec-
□ “Kits” de identificação: API 20E (BioMeriéux ção da presença/ausência de microrganismos. O
Vitek) ou Vitek 2GN (BioMérieux Vitek) ou procedimento descrito abaixo não apresenta esses
Enterotube II (Becton Dickinson) ou Entero- detalhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo
bacteriaceae II (Becton Dickinson) ou Micro analista.
ID (Remel) a) Pré-enriquecimento. Seguindo as orientações
□ Meios e reagentes para provas bioquímicas (se do Capítulo 2, transferir uma porção de 25g ou
não for usado um “kit”) 25 ml da amostra para um frasco ou bolsa de
□ Caldo Uréia de Rustigian & Stuart ou Caldo homogeneização estéril, adicionar 225 ml de

Figura 19.2. Esquema da análise de Salmonella pelo método BAM/FDA:2016. (continua)

Salmonella □ 309
Figura 19.2. Esquema da análise de Salmonella pelo

método BAM/FDA:2016. (continuação)

caldo de pré-enriquecimento e homogeneizar a te, quebrar a casca, transferir o conteúdo interno para
amostra. Seguir as instruções do Quadro 19.6 uma bolsa plástica estéril e, com as mãos por fora da
bolsa, homogeneizar até que a gema esteja totalmen-
e das notas abaixo para a seleção do caldo, te misturada com a clara. Para o pré-enriqueciento,
eventuais variações na diluição inicial e pro- homogeneizar a amostra com Caldo Tripticase de
cedimento subsequente. Se for utilizada com- Soja (TSB) na proporção de 100 ml para cada ovo.
posição de amostras a seco, manter a propor- Incubar a 35 ºC/24±2h. Ovos cozidos com a casca
intacta devem ser desinfetados da mesma forma e en-
ção 1:10 na diluição da amostra composta no
riquecidos em TSB na proporção 1:10 (25g em 225
Caldo de enriquecimento. Fechar bem o frasco ml de caldo).
e deixar descansar por 60±5min à temperatura Nota a.4.2) Para amostras de ovo líquido, incubar a uni-
ambiente. Agitar bem, retirar uma alíquota de dade analítica a 20-24 ºC/96±2h. Após este período,
volume conhecido e verificar o pH. Se neces- adicionar TSB, na quantidade necessária para dilui-
sário, ajustar em 6,8±0,2 com NaOH ou HCl ção 1:10 e deixar descansar por 60±5min à tempe-
ratura ambiente. Se necessário, ajustar em 6,8±0,2 e
1N, verificando o volume de ácido ou base incubar a 35 ºC/24±2h.
consumido na alíquota e adicionando à amos- Nota a.5) Para a análise de corantes e coloríficos há dois
tra um volume proporcional da solução esté- procedimentos: Corantes cuja solução aquosa a 10%
ril. Incubar os frascos a 35±2 ºC/24±2h, com a apresentem pH maior ou igual a 6,0 podem ser ana-
tampa ligeiramente afrouxada. lisados da forma normal. Para corantes cuja solução
aquosa a 10% apresente pH menor que 6,0, a etapa de
Nota a.1) Para a análise de alimentos congelados, reco- pré-enriquecimento pode ser suprimida, adicionan-
menda-se não descongelar a amostra antes do pré-endo-se 25g da amostra diretamente em 225 ml de Cal-
riquecimento, para prevenir injúria às células de Sal- do Tetrationato (TT) não suplementado com Verde
monella e reduzir a multiplicação de competidores. Brilhante. Misturar bem, deixar descansar por uma
Se não for possível retirar a unidade analítica sem hora à temperatura ambiente, agitar e retirar uma
descongelar, uma quantidade adequada da amostra alíquota de volume conhecido para verificar o pH.
deve ser descongelada em banho, sob agitação, com Se necessário, acertar em 6,8±0,2 e adicionar 2,25
temperatura abaixo de 45 ºC por não mais do que ml de uma solução de Verde Brilhante 0,1%. Agitar
15min. Alternativamente, descongelar em geladeira e incubar a 35±2 ºC/24±2h com a tampa do frasco
(2 a 5 ºC) por 18h. ligeiramente afrouxada. Essa etapa corresponde ao
Nota a.2) Para a análise de alimentos em pó com baixa enriquecimento seletivo, seguindo-se então para o
solubilidade (misturas para preparo de sopas, ovo em plaqueamento seletivo diferencial.
pó etc.), recomenda-se adicionar o caldo de enrique- Nota a.6) Para a análise de gelatina deve-se pesar 25g
cimento gradualmente e com constante agitação, para da amostra e adicionar 225 ml de Caldo Lactosado e
evitar a formação de grumos. Adicionar às 25g da 5 ml de uma solução aquosa de papaína a 5% (5g de
amostra um pequeno volume inicial do caldo (15-20 papaina em 95 ml de água destilada estéril). Homo-
ml) e recorrer ao auxílio de uma bagueta ou de um agi- geneizar em “stomacher” ou por agitação, fechar bem
tador magnético, para facilitar a homogeneização, este- o frasco e incubar a 35±2 ºC/60±5min. Agitar bem,
rilizando previamente a bagueta ou a barra magnética. ajustar o pH em 6,8±0,2 e incubar a 35 ºC/24±2h,
Sempre sob agitação, adicionar mais 10 ml do caldo e com a tampa do frasco ligeiramente afrouxada.
repetir esse procedimento uma terceira vez. Adicionar Nota a.7) Para a análise de goma guar, adicionar 225 ml
então o volume remanescente do caldo e manter a agi- de Caldo Lactosado e 2,25 ml de uma solução aquosa
tação até obter uma suspensão homogênea. de celulase a 1% (1g de celulase em 99 ml de água
Nota a.3) Para a análise de leite em pó, recomenda-se destilada estéril, esterilizada por filtração) em um
adicionar a amostra ao caldo de enriquecimento em frasco estéril. Colocar o caldo em um agitador mag-
pequenas porções, cada porção espalhada em cama- nético (esterilizar antes a barra magnética) e adicionar
das finas sobre a superfície do líquido, sem agitação, 25g da amostra ao caldo, sob constante e vigorosa
até que seja totalmente absorvida. Após o descanso agitação. Fechar bem o frasco e deixar descansar por
de 60±5min, não agitar nem ajustar o pH para a in- 60±5min à temperatura ambiente. Em seguida incubar
cubação. a 35±2 ºC/24±2h com a tampa do frasco ligeiramente
Nota a.4.1) Para a análise do conteúdo interno de ovos afrouxada, não sendo necessário o ajuste do pH.
“in natura”, remover qualquer material aderido à cas- Nota a.8) Para análise de carcaças de coelhos, transferir
ca. Mergulhar e manter por 10s em álcool iodado 3:1, a carcaça para um saco plástico estéril tarado e pesar.
remover e deixar secar naturalmente. Assepticamen- Adicionar Caldo Lactosado na quantidade requerida

Salmonella □ 311
Quadro 19.6. Orientações para a seleção do caldo de pré-enriquecimento, diluição e eventuais variações
no pré-enriquecimento de alimentos para análise de Salmonella pelo método BAM/FDA (Andrews
et al., 2016). (continua)
Variações no
Amostra Caldo de pré-enriquecimento
procedimento
Alimentos em geral (25g ou ml) 225 ml de Caldo Lactosado (CL)
225 ml de Leite em Pó Desnatado reconstituído suplementado
Balas, confeitos, coberturas para confeitos (25g) com 0,45 ml de solução de Verde Brilhante 1% após o descan-
so de 60min e ajuste do pH
225 ml de Caldo Lactosado (CL) suplementado com 2,25 ml de
Carne, subprodutos de carne, substâncias animais, produtos
Tergitol 7 aniônico ou 2-3 gotas de Triton X-100 estéril, após o
glandulares em pedaços (25g)
descanso de 60min e ajuste do pH
Caseína láctica (25g) 225 ml de Caldo de Pré-enriquecimento Universal 2, 3
Caseína de renina (25g) 225 ml de Caldo Lactosado (CL) 2, 3
Caseinato de sódio (25g) 225 ml de Caldo Lactosado (CL)
225 ml de Leite em Pó Desnatado reconstituído suplementado
Chocolate (25g) com 0,45 ml de solução de Verde Brilhante 1% estéril, após o
Coco ralado ou leite de coco (25g) Tergitol 7 aniônico ou 2-3 gotas de Triton X-100 estéril, após o
Condimentos e vegetais em pó ou flocos (pimenta-do-reino,
pimenta branca, pimenta malagueta em pó, cominho, pápri-
225 ml de Caldo Tripticase de Soja (TSB)
ca, salsa em flocos, alecrim, sementes de gergelim, tomilho,
aipo em sementes, pó ou flocos) (25g)
225 ml de Caldo Tripticase de Soja (TSB) suplementado com
Condimentos (alho e cebola em pó ou em flocos) (25g)
K2SO3 (5g/l)
Caldo Tripticase de Soja (TSB) na quantidade necessária para
Condimentos (pimenta da Jamaica, canela e orégano)
diluição 1:100
Condimentos (cravo da Índia)
diluição 1:1000
Outros condimentos em folha
hidratar as folhas (diluição > 1:10)
Corantes e coloríficos com pH maior ou igual a 6,0 em
225 ml de Caldo Lactosado (CL) 1
solução aquosa 10%
Corantes e coloríficos com pH menor que 6,0 em solução Passar diretamente ao meio de enriquecimento seletivo - 225
1, 4
aquosa 10% ml de Caldo Tetrationato (sem verde brilhante)
Farinha de soja (25g) 225 ml de Caldo Lactosado (CL) 2, 3, 7
225 ml de Caldo Lactosado (CL) suplementado com 5 ml de solu-
Gelatina (25g) 5
ção de papaína 5%, adicionada no momento da homogeneização
Glacês e outras coberturas para produtos de confeitaria (25g) 225 ml de Caldo Nutriente
Goma guar (25g) solução de celulase 1%, adicionada no momento da homoge-
neização, que deve ser feita com agitador magnético
Leite líquido (25 ml) 225 ml de Caldo Lactosado (CL)
Leite em pó desnatado instantâneo (25g) 225 ml de Água Verde Brilhante 2, 3
Leite em pó desnatado ou integral não instantâneo (25g) 225 ml de Água Verde Brilhante 2, 3, 7
225 ml de Caldo Tripticase de Soja (TSB), agitando até obter
Levedura seca ativa ou inativa (25g)
uma suspensão homogênea
Ovos “in natura” 100 ml de Caldo Tripticase de Soja (TSB) para cada ovo 6
Ovos cozidos (25g) 225 ml de Caldo Tripticase de Soja (TSB) 6
Ovo líquido integral homogeneizado (25g) 225 ml de Caldo Tripticase de Soja (TSB)
Ovo em pó (25g) 225 ml de Caldo Lactosado (CL) 1
Suco de laranja, suco de maçã, melão descascado em peda-
225 ml de Caldo de Pré-enriquecimento Universal 3
ços (25g ou ml)

Quadro 19.6. Orientações para a seleção do caldo de pré-enriquecimento, diluição e eventuais variações
no pré-enriquecimento de alimentos para análise de Salmonella pelo método BAM/FDA (Andrews
et al., 2016). (continua)
Variações no
Amostra Caldo de Pré-enriquecimento
procedimento
Mangas descascadas em pedaços, tomates em pedaços (25g) 225 ml de Água Peptonada Tamponada (BPW)
“Swabs” e esponjas 225 ml de Caldo Lactosado
225 ml de Caldo de Pré-enriquecimento Universal
Polpa de mamei (25g) (se houver suspeita de presença de Salmonella Typhi, preparar 3
o caldo sem citrato férrico amoniacal)
1. Adicionar o caldo de enriquecimento gradualmente e com constante agitação, para evitar a formação de grumos. Adicionar às 25g da amostra um pequeno
volume inicial do caldo (15-20 ml) e recorrer ao auxílio de uma bagueta ou de um agitador magnético, para facilitar a homogeneização (esterilizando previa-
mente a bagueta ou a barra magnética). Sempre sob agitação, adicionar mais 10 ml do caldo e repetir esse procedimento uma terceira vez. Adicionar então o
volume remanescente do caldo e manter a agitação até obter uma suspensão homogênea.
2. Adicionar a amostra ao caldo de enriquecimento em pequenas porções, cada porção espalhada em camadas finas sobre a superfície do líquido, sem agitação,
até seja totalmente absorvida.
3. Não ajustar o pH nem agitar após o descanso de 60min.
4. Após a homogeneização da amostra, deixar descansar por 60±5min à temperatura ambiente, ajustar o pH em 6,8±0,2 e adicionar 2,25 ml de uma soluçãode
verde brilhante 0,1%. Incubar a 35±2 ºC/24±2h e passar diretamente ao plaqueamento diferencial.
5. O descanso de 60min deve ser feito a 30 ºC.
6. Descontaminar a casca em álcool iodado 3:1 se estiver intacta.
7. Para esse produto não deve ser feita a composição a seco.
para diluição 1:10. Agitar bem, deixar descansar por Pré-enriquecimento Universal. Deixar descansar por
60±5min à temperatura ambiente e ajustar o pH em 60±5min à temperatura ambiente. Em seguida incu-
6,8±0,2, se necessário. Incubar a 35±2 ºC/24±2h. bar a 35±2 ºC/24±2h com a tampa do frasco ligeira-
Nota a.9) Para a análise de melões e tomates inteiros, mente afrouxada, sem ajustar o pH. Se houver sus-
mergulhar a fruta em Caldo de Pré-enriquecimento peita de contaminação da amostra com Salmonella
Universal (UP), na quantidade necessária para a fruta Typhi, preparar o Caldo de Pré-enriquecimento Uni-
flutuar (aproximadamente 1,5 vezes o peso da fruta, versal sem o citrato férrico amoniacal. Tratar essas
no caso dos melões, ou uma vez o peso dos toma- amostras como produtos de baixa carga microbiana.
tes). Sem agitar, deixar descansar por por 60±5min à
temperatura ambiente e, sem ajustar o pH, incubar a
b) Enriquecimento seletivo. Agitar cuidadosa-
35±2 ºC/24±2h. mente o frasco com o caldo de pré-enriqueci-
Nota a.10) Para a análise de mangas inteiras, mergulhar mento e transferir 0,1 ml para 10 ml de Caldo
a fruta em Água Peptonada Tamponada (BPW), na Rappaport-Vassiliadis Modificado (RV) e 1 ml
quantidade necessária para a fruta flutuar (aproxima- para 10 ml de Caldo Tetrationato (TT). Incu-
damente uma vez o peso da fruta). Sem agitar, dei-
bar o RV a 42±0,2 ºC/24±2h (em banho com
xar descansar por 60±5min à temperatura ambiente,
ajustar o pH em 6,8±0,2 (se necessário) e incubar a circulação forçada) e o TT a 35±2 ºC/24±2h
35±2 ºC/24±2h. (produtos com baixa carga microbiana) ou
Nota a.11) Para a análise de amostras ambientais (“swa- 43±0,2 ºC/24±2h em banho com circulação
bs” e esponjas), assim que for feita a coleta mergulhar forçada (produtos com alta carga microbiana).
em Caldo Dey-Engley (DE), na quantidade necessá-
ria para cobrir o “swab” ou a esponja. Transportar Nota b.1) No caso de goma guar ou alimentos suspeitos
em caixa de isopor com gelo em gel ou gelo comum de contaminação com Salmonella Typhi, transferir
contido em bolsas plásticas, para evitar o acúmulo de 1 ml do caldo de pré-enriquecimento para 10 ml de
água nas caixas. Estocar sob refrigeração (4±2 ºC) Caldo Selenito Cistina (SC) e 1 ml para 10 ml de
até o momento da análise, que deve ser feita dentro Caldo Tetrationato (TT). Incubar os dois caldos a
de 48 horas. Para o ensaio, transferir o “swab” ou a 35±2 ºC/24±2h.
esponja para um frasco com 225 ml de Caldo Lacto- Nota b.2) Há várias formulações do Caldo Tetrationato
sado (CL), agitar e deixar descansar por 60±5min à disponíveis no mercado. A formulação descrita no
temperatura ambiente. Agitar bem, ajustar o pH em método da FDA é a de Mueller modificada por Kau-
6,8±0,2 (se necessário) e incubar a 35±2 ºC/24±2h. ffmann, disponível comercialmente com os seguin-
Nota a.12) Para a análise de polpa de mamei, homo- tes códigos: Tetrathionate Broth Base Difco 210430,
geneizar 25g da amostra com 225 ml de Caldo de Merck 1.05285, Oxoid CM 671, Acumedia 7241.

Salmonella □ 313
Nota b.3) Para alimentos desidratados a AOAC validou nias cor de rosa com centro rosa mais escuro,
o procedimento de refrigeração dos caldos de pré-en- mas não preto. Cepas de Salmonella lactose
riquecimento e enriquecimento seletivo (TT e SC)
durante o final de semana. As amostras enriqueci-
positivas produzem colônias amarelas com ou
das podem ser mantidas a 4±1 ºC por até 72 horas sem centro preto. Na ausência de colônias tí-
(AOAC Official Method 994.04). O Caldo RV não picas essas colônias devem ser selecionadas
faz parte do escopo dessa validação. em seu lugar.
Nota b.4) Se for utilizada a composição úmida, o vo-
Ágar BS. Colônias castanhas, cinza ou pre-
lume de caldo RV, TT ou SC deve ser multiplicado
pelo número de amostras compostas, para receber o tas, com ou sem brilho metálico. O meio em
inóculo de cada pré-enriquecimento individual, na redor das colônias muda gradativamente para
mesma proporção. uma coloração castanha a preta, com o pro-
c) Plaqueamento diferencial. Agitar os tubos de longamento do tempo de incubação. Algumas
enriquecimento seletivo em agitador tipo “vor- cepas de Salmonella podem apresentar colô-
tex” e estriar (estrias de esgotamento) uma al- nias atípicas, verdes, com pouco ou nenhum
çada do caldo TT em placas de Ágar Entérico escurecimento do meio em redor. Na ausência
de Hectoen (HE), Ágar Bismuto Sulfito (BS) e de colônias típicas após 48h de incubação, es-
Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). Re- sas colônias devem ser selecionadas em seu
petir esse procedimento com o caldo RV (ou lugar. Observação: Os fabricantes recomen-
SC no caso de goma guar e alimentos suspei- dam que as placas de BS sejam preparadas
tos de contaminação com Salmonella Typhi). no dia do uso, porém, diversos estudos têm
Incubar as placas invertidas a 35±2 ºC/24±2h demonstrado que o meio recém-preparado
e verificar se há desenvolvimento de colônias é tóxico para várias cepas de Salmonella. A
típicas de Salmonella. No caso do BS, fazer FDA recomenda preparar um dia antes do uso
uma leitura e seleção de colônias com 24 ho- e estocar à temperatura ambiente, ao abrigo
ras e reincubar, repetindo a leitura e seleção de da luz.
colônias com 48 horas. Características típicas d) Confirmação preliminar das colônias típi-
das colônias de Salmonella nos meios de placas de Salmonella. Selecionar pelo menos
queamento: duas colônias típicas de cada placa, para con-
Ágar HE. Colônias transparentes, verde-azula- firmação preliminar. Na ausência de colônias
das, com ou sem centro preto. Cepas fortemen- típicas, selecionar as atípicas descritas acima.
te produtoras de H2S podem produzir colônias Com o auxílio de uma agulha de inoculação,
com centro preto grande e brilhante, ou mesmo tocar levemente a massa de células, no centro
inteiramente pretas. Colônias de fermentadores da colônia e inocular em um tubo inclinado de
de lactose ou sacarose são de cor salmão e não Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI), por estrias
transparentes. Algumas poucas cepas de Sal- na rampa e picada no fundo. Com o mesmo
monella podem apresentar colônias atípicas, inóculo, sem flambar a agulha, inocular a cul-
amarelas, com ou sem centro preto. Na ausên- tura em um tubo de Ágar Lisina Ferro (LIA),
cia de colônias típicas essas colônias devem ser com duas picadas no fundo e estrias na rampa.
selecionadas em seu lugar. Guardar as placas sob refrigeração (5 a 8 ºC) e
Ágar XLD. Colônias cor de rosa escuro, com incubar os tubos a 35±2 ºC/24±2h.
centro preto e uma zona avermelhada leve- Nota d.1) Os tubos de LIA devem ser inclinados com
mente transparente em redor. Cepas de Sal- fundo de no mínimo 4cm, para garantir condições
monella H2S fortemente positivas podem pro- anaeróbias (a reação de descarboxilação da lisina
ocorre anaerobicamente). Na incubação as tampas de
duzir colônias com centro preto grande e bri- ambos os tubos, LIA e TSI, devem ser afrouxadas,
lhante, ou mesmo inteiramente pretas. Cepas para manter condições aeróbicas na rampa (prevenir
de Salmonella H2S negativas produzem colô- a excessiva produção de H2S).

Após o período de incubação, observar se há Alternativamente, aplicar a série bioquímica

ocorrência de reação típica de Salmonella: Em descrita abaixo. Os testes sorológicos não de-
TSI rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido vem ser substituídos por “kits” comerciais.
(amarelo), com ou sem produção de H2S (es- e.1) Teste de urease. Transferir uma alçada
curecimento do ágar). Em LIA fundo e rampa da cultura em TSI para um tubo com Cal-
alcalinos (roxo, sem alteração da cor do meio), do Uréia de Rustigian & Stuart e incubar
com ou sem produção de H2S (escurecimento a 35±2 ºC/24±2h. Incubar paralelamente
do meio). um tubo controle não inoculado, porque o
Se nenhuma cultura de uma dada placa apre- Caldo Uréia ocasionalmente apresenta uma
sentar reação típica em TSI, inocular duas no- falsa reação positiva. Observar viragem al-
vas colônias dessa placa em TSI, para confir- calina do indicador, com alteração da cor
mação. Se alguma cultura apresentar evidência do meio de pêssego para cor de rosa escuro
de contaminação (cultura mista), estriar em (teste positivo), ou permanência do meio na
placas de HE, XLD ou Ágar MacConkey, para cor original (teste negativo). Opcionalmente
purificação. Incubar as placas a 35±2 ºC/24±2h pode ser utilizado o teste rápido: transferir
e observar se há colônias típicas: HE e XLD, duas alçadas (inóculo pesado) da cultura em
já descritas, Ágar MacConkey colônias trans- TSI para um tubo de caldo Uréia Rápido.
parentes, sem cor, eventualmente com centro Incubar em banho a 37±0,5 ºC/2h e observar
preto e, na presença de contaminantes que como no teste convencional. De acordo com
precipitam a bile, provocam o clareamento da o método BAM, todas as cepas de Salmo-
zona de precipitação em seu redor. Selecionar nella são urease negativas. De acordo com
duas colônias típicas bem isoladas e inocular Popoff & Le Minor (2005), 1% das cepas de
novamente em LIA e TSI. S. enterica subsp. enterica e 2% das cepas
Submeter as culturas à confirmação definitiva de S. enterica subsp. houtenae são positivas
obedecendo os seguintes critérios: (Quadro 19.2).
e.2) Teste de descarboxilação da lisina no Cal-
Reação em LIA Reação em TSI Continuação do Descarboxilase de Falkow. Este teste é
Rampa alcalina fundo requerido apenas para as culturas cuja rea-
Rampa e fundo alcalinos
com ou sem H2S (típica)
ácido com ou sem H2S continuar ção em LIA não tenha sido satisfatória (atí-
(típica)
picas com fundo amarelo e rampa alcalina,
Rampa e fundo alcalinos Rampa e fundo ácidos
continuar com ou sem produção de H2S), porém não
com ou sem H2S (típica) com ou sem H2S (atípica)
descartada em função da reação típica em
Fundo ácido e rampa Rampa alcalina fundo TSI. A partir da cultura em TSI, transferir
alcalina com ou sem H2S ácido com ou sem H2S continuar
(atípica) (típica) uma alçada com inóculo leve para um tubo
Fundo ácido e rampa de Caldo Descarboxilase de Falkow (com
Rampa e fundo ácidos
alcalina com ou sem H2S
(atípica)
descartar 0,5% de L-Lisina). Incubar a 35±2 ºC/48±2h
(atípica)
com a tampa bem fechada e observar, com
e) Confirmação definitiva. Utilizar as culturas 24 e 48h, se ocorre viragem alcalina do in-
em TSI na realização das provas sorológicas dicador, alterando a cor do meio de esverde-
e bioquímicas de confirmação. Para os testes ado para púrpura azulado (teste positivo) ou
bioquímicos, utilizar um dos seguintes “kits” viragem ácida para amarelo (teste negativo).
de identificação validados pela AOAC para e.3) Teste de fermentação do dulcitol. Transfe-
Enterobacteriaceae: API 20E (BioMeriéux Vi- rir uma alçada com inóculo leve da cultura
tek), Vitek 2GN (BioMeriéux Vitek), Entero- em TSI, para um tubo de Caldo Vermelho
tube II (Becton Dickinson), Enterobacteriace- de Fenol Base ou Caldo Púrpura Base su-
ae II (Becton Dickinson) e Micro ID (Remel). plementado com 0,5% de dulcitol (com tubo

Salmonella □ 315
de Durham). Incubar a 35±2 ºC/48±2h com três alçadas (inóculo pesado) em um tubo
a tampa ligeiramente afrouxada e observar, de Caldo Malonato Modificado. Incubar a
com 24 e 48h. Ocorrência de viragem ácida 35±2 ºC/48±2h, incluindo um tubo não ino-
do indicador, alterando a cor do meio para culado como controle, porque o Caldo Ma-
amarela, com ou sem formação de gás in- lonato eventualmente pode sofrer viragem
dica teste positivo. Viragem alcalina (para para azul (falso positivo). Observar com 24
rosa escuro no Caldo Vermelho de Fenol ou e 48h a ocorrência de viragem alcalina do
para roxo no Caldo Púrpura) ou não altera- indicador, alterando a cor do meio de ver-
ção da cor do meio, acompanhada da ausên- de para azul (teste positivo). A permanência
cia de gás indica teste negativo. da cor verde do meio inalterada indica teste
e.4) Teste de indol. Transferir uma alçada negativo. Eventualmente pode ocorrer vira-
com inóculo leve da cultura em TSI, para gem ácida do indicador, alterando a cor do
tubos com Caldo Triptona 1% e incubar a meio para amarelo, devido à fermentação da
35±2 ºC/24±2h. Após a incubação, transfe- glucose presente (teste negativo).
rir uma alíquota de 5 ml da cultura para um e.7) Detecção dos antígenos flagelares (poli
tubos estéril vazio (para o teste de indol) e H). Transferir uma alçada da cultura em
reservar o restante para inoculação dos testes TSI, para um tubo com 5 ml de Caldo
de malonato e crescimento em KCN. Para Tripticase de Soja (TSB) e incubar a 35±2
o teste de indol, adicionar 0,2 a 0,3 ml do ºC/24±2h. Opcionalmente, para realização
Reagente de Kovacs aos 5 ml de cultura em do teste no mesmo dia, usar o Caldo Brain
Caldo Triptona e agitar levemente. Observar Heart Infusion (BHI) e incubar a 35±2 ºC/
se há desenvolvimento de um anel vermelho- 4-6h ou até crescimento visível. Adicionar
-violeta na superfície do meio de cultura (tes- aos 5 ml de cultura em TSB ou BHI, 2,5 ml
te positivo), ou se o anel permanece amare- de Solução Salina Formalinizada (Forma-
lado, cor do reagente de Kovacs (teste nega- lina), para a obtenção do antígeno flagelar
tivo). Desenvolvimento de vários tons entre a ser detectado no teste. Transferir para um
vermelho e rosa indica teste indeterminado. tubo de 10x75mm ou 13x100mm, 0,5 ml da
e.5) Teste de crescimento em KCN. O teste cultura formalinizada (antígeno) e 0,5 ml de
é feito em Caldo Cianeto de Potássio, que anti-soro flagelar polivalente contra Salmo-
deve ser preparado em tubos com tampa de nella (anticorpos). Preparar um tubo contro-
rolha recobertas de parafina (vide Anexo 1 le negativo, com 0,5 ml do antígeno (cul-
de Preparo de Meios e Reagentes Para Aná- tura formalinizada) e 0,5 ml de formalina.
lises). Cuidado!! O meio é tóxico e deve ser Incubar os tubos a 48-50 ºC/1h, em banho,
preparado e manuseado com luvas. A par- e observar os resultados de 15 em 15 mi-
tir da cultura reservada em Caldo Triptona nutos, manuseando delicadamente os tubos,
1%, inocular três alçadas (inóculo pesado) para evitar agitação. A ocorrência de aglu-
em um tubo de Caldo Cianeto de Potássio. tinação/floculação no tubo-teste, porém não
Flambar a boca do tubo, aquecendo para controle negativo, indica teste positivo. A
formar um selo de parafina ao tampar com a ausência de aglutinação/floculação nos dois
rolha. Incubar a 35±2 ºC/48±2h e observar, tubos indica teste negativo. A ocorrência
com 24 e 48 horas, se ocorre crescimento de floculação nos dois tubos indica reação
(turvação do meio), indicativo de teste posi- não específica. Nesse caso, repetir o proce-
tivo. Não turvação do meio indica não cres- dimento usando o antisoro Spicer-Edwards.
cimento, teste negativo. Nota e.7.1) Nessa etapa do procedimento, todas as cultu-
e.6) Teste de malonato. A partir da cultura re- ras que apresentarem os seguintes conjuntos de resul-
servada em Caldo Triptona 1%, inocular tados podem ser descartadas como não Salmonella:

teste de indol positivo e teste sorológico flagelar po- aos testes adicionais descritos nos itens abaixo (e.9
livalente negativo ou teste de lisina descarboxilase a e.11).
negativo e crescimento em KCN positivo.
e.9) Teste de fermentação da lactose e sacarose.
e.8) Detecção dos antígenos somáticos (poli Seguir o mesmo procedimento descrito para
O). A partir da cultura de 24 horas em TSI, o teste de fermentação do dulcitol, substi-
emulsionar uma alçada em 2 ml de solu- tuindo o dulcitol por 1% de lactose ou sa-
ção salina 0,85% estéril. Marcar dois qua- carose. Descartar como não Salmonella as
drados de aproximadamente 2cm2 em uma culturas lactose positivas, exceto as malona-
placa de Petri ou lâmina de vidro, usando to positivas (podem ser da subsp. arizonae)
um lápis de marcar vidro de material hi- ou as que apresentaram rampa ácida em TSI
drofóbico. Transferir uma gota da cultura com reação típica em LIA. Descartar como
em salina para cada um dos quadrados de- não Salmonella as culturas sacarose positi-
marcados, posicionando a cultura na parte vas, exceto as que apresentaram rampa áci-
superior do quadrado. Adicionar uma gota da em TSI com reação típica em LIA.
de solução salina fisiológica estéril na po- e.10) Teste de vermelho de metila e Voges
sição inferior de um dos quadrados e emul- Proskauer. Transferir uma alçada com inó-
sionar bem a cultura. Sobre a parte inferior culo leve da cultura em TSI, para um tubo
do outro quadrado, adicionar uma gota do com caldo VM-VP e incubar a 35 ºC/48h.
anti-soro somático polivalente anti-Salmo- Para o teste de VP, transferir assepticamen-
nella e emulsionar bem. Segurando a lâmi- te 1 ml da cultura para um tubo de ensaio,
na contra um fundo preto bem iluminado, adicionar os Reagentes de VP, na seguinte
fazer delicados movimentos de inclinação e ordem: 0,6 ml de uma solução de a-naftol
rotação da lâmina, para movimentar a emul- 5% e agitar. Adicionar em seguida 0,2 ml de
são, observando se ocorre aglutinação no uma solução de KOH 40%, agitar e adicio-
quadrado com o anti-soro. Comparar com a nar uma pitada leve de cristais de creatina,
aparência da emulsão no quadrado com sa- para acelerar a reação. Deixar descansar à
lina (controle negativo), para não confundir temperatura ambiente e fazer a leitura após
a aparência turva da emulsão com reação de quatro horas. O desenvolvimento de uma
aglutinação. Eventualmente pode ocorrer cor rosa escuro ou vermelho rubi no meio de
aglutinação em ambos os quadrados (reação cultura indica teste positivo. A permanência
inespecífica). Atenção. Antes da realização do meio na cor do reagente (amarelada ou
dos testes, verificar a qualidade do anti-soro ligeiramente esverdeada) indica teste nega-
em cada frasco utilizado. Para tanto, aplicar tivo. Reincubar a cultura remanescente no
o teste sorológico somático a uma cepa pa- caldo VM/VP por 48 horas adicionais e re-
drão de Salmonella. alizar o teste de VM com 96 horas de incu-
Nota e.8.1) Nessa etapa do procedimento podem ser bação. Para a realização do teste, adicionar
consideradas como Salmonella as culturas que apre- a cada 5 ml de cultura, cinco a seis gotas do
sentarem o seguinte perfil: fermentação da glicose Reagente de VM e observar imediatamente
em TSI positiva (fundo ácido), lisina descarboxilase
se o meio adquire uma coloração vermelha
positiva (fundo e rampa alcalinos em LIA ou fundo
ácido mas lisina positiva no teste em Caldo Descar- (teste positivo) ou amarela (teste negativo).
boxilase de Falkow), produção de H2S positiva em e.11) Teste de citrato. Com uma agulha de ino-
TSI e LIA, teste de urease negativo, fermentação do culação, transferir um inóculo leve da cul-
dulcitol positiva, crescimento em KCN negativo, tes- tura para um tubo de Ágar Citrato de Sim-
te de malonato negativo, teste de indol negativo, teste
sorológico flagelar polivalente positivo e teste soro-
mons inclinado, estriando a rampa e pican-
lógico somático polivalente positivo. Culturas com do o fundo. Incubar a 35 ºC/96h e observar
uma ou mais reações atípicas devem ser submetidas se há crescimento com viragem alcalina do

Salmonella □ 317
indicador, alterando a cor do meio de verde ▪ Lisina descarboxilase (-) e crescimento em

para azul (teste positivo). A não ocorrência KCN (+)
de crescimento, mantendo a cor do meio ▪ Fermentação da lactose (+) exceto as ma-
inalterada, indica teste negativo. lonato positivas (podem ser da subsp. ari-
zonae) ou as que apresentaram rampa ácida
f) Interpretação dos resultados em TSI com reação típica em LIA
f.1) Se foi utilizado um “kit” miniaturizado de ▪ Fermentação da sacarose (+) exceto as que
identificação, validado pela AOAC apresentaram rampa ácida em TSI com rea-
f.1.a) Considerar como Salmonella as culturas ção típica em LIA
identificadas como tal pelo “kit” e que apre- ▪ VM (-), VP (+) e crescimento em KCN (+)
sentarem testes sorológico flagelar e somá-
tico polivalentes positivos.
19.4. Método
f.1.b) Descartar as culturas não identificadas
como Salmonella pelo “kit”. MLG/FSIS/USDA:2017 para
f.1.c) Culturas que não se enquadrarem nos presença/ausência ou NMP de
itens f.1.a ou f.1.b devem ser enviadas a um Salmonella em alimentos
laboratório apto à realização dos testes ne-
cessários para a confirmação definitiva. Método do Food Safety and Inspection Service,
f.2) Se foram feitos os testes bioquímicos des- United States Department of Agriculture (USDA),
critos no item e: revisão de 02/01/2017 do Capítulo 4.09 do Mi-
crobiology Laboratory Guidebook ( mlG/FSIS/
f.2.1) Considerar como Salmonella as cultu-
USDA, 2017).
ras com o perfil abaixo:
Em princípio o método do FSIS-USDA é aplicá-
▪ Fermentação da glicose em TSI (+) (fundo
vel a carnes e produtos derivados de carnes, aves e
ácido)
ovos, porém, a revisão de junho de 2014 também
▪ Lisina descarboxilase (em LIA ou no Caldo
inclui molhos desidratados, leite em pó, alimen-
Descarboxilase de Falkow) (+)
tos prontos para consumo, misturas em pó para
▪ Produção de H2S em TSI e em LIA (+)
o preparo de pão, peixes e produtos derivados e
▪ Teste de urease (-)
amostras do ambiente de fabricação (esponjas).
▪ Fermentação do dulcitol (+)
Variações no procedimento em função do tipo de
▪ Crescimento em KCN (-)
produto são apresentadas em notas ao longo do
▪ Teste de malonato (-)
texto, que devem ser consultadas para cada amos-
▪ Teste de indol (-)
tra analisada. O método não se aplica ao isola-
▪ Teste sorológico flagelar polivalente (+)
mento e identificação de Salmonella Typhi.
▪ Teste sorológico somático polivalente (+)
▪ Fermentação da lactose (-) Precauções recomendadas pelo mlG/FSIS/USDA
▪ Fermentação da sacarose (-) na condução dos ensaios: Seguir as orientações do
▪ Teste de VP (-) CDC (US Center for Disease Control and Preven-
▪ Teste de VM (+) tion) para patógenos de risco nível 2 e trabalhar
em capela de fluxo laminar com nível de seguran-
f.2.2) Descartar como não Salmonella as cul-
ça classe II.
turas com qualquer um dos conjuntos de re-
sultados apresentados abaixo:
▪ Teste de urease (+) 19.4.1. Material requerido para a
▪ Teste de indol (+) e teste flagelar polivalente (-) análise
▪ Teste de indol (+) e teste Spicer Edwards □ Água Peptonada Tamponada (BPW)
flagelar (-) □ Água Peptonada Tamponada com cristal viole-

ta (1 ml da solução aquosa 1% por litro) (para mos. O procedimento descrito abaixo não apre-
a análise de produtos fermentados) senta esses detalhes, pressupondo que sejam co-
□ Caldo Tripticase de Soja (TSB) (para amostras nhecidos pelo analista.
de carne bovina) a) Pré-enriquecimento.
□ Carbonato de cálcio (CaCO3) estéril para a a.1) Teste de presença/ausência ( mlG/FSIS/
análise de produtos fermentados USDA 2017). Seguindo as orientações do
□ Caldo Rappaport-Vassiliadis Modificado (RV) Capítulo 2, homogeneizar a amostra com
ou Caldo Rappaport-Vassiliadis Soja (RVS) o caldo de pré-enriquecimento, que nor-
□ Caldo Tetrationato Hajna (TTH) malmente é a Água Peptonada Tamponada
□ Ágar Verde Brilhante Sulfa (BGS) (BPW), exceto no caso de produtos de carne
□ Ágar Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4) ou Ágar bovina, em que se usa o Caldo Tripticase de
Lisina Ferro Duplamente Modificado (DM-LIA) Soja (TSB). A unidade analítica, o fator de
□ Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) diluição e as condições de incubação variam
□ Ágar Lisina Ferro (LIA) em função da amostra analisada e estão de-
□ “Kits” de identificação terminadas no Quadro 19.7.
Nota a.1.1) Para a análise de carcaças de aves intei-
□ Banho ou estufa incubadora a 42±0,5 ºC ras, drenar o excesso de líquido das embalagens e
transferir a carcaça para uma bolsa plástica estéril.
19.4.2. Procedimento Adicionar 400 ml de BPW na cavidade da carcaça
e, segurando a carcaça com uma mão e fechando a
O esquema da análise de Salmonella pelo mé- abertura da bolsa com a outra, agitar rodando o líqui-
todo mlG/FSIS/USDA:2017 encontra-se descri- do na bolsa, de forma a lavar a parte interna e externa
to na Figura 19.3. Antes de iniciar as atividades, da carcaça. Transferir 30 ml do líquido de lavagem
para uma bolsa ou frasco com 30 ml de BPW, para
ler atentamente as orientações do Capítulo 5, que continuar a análise. Se, além de Salmonella, ou-
apresenta todos os detalhes e cuidados envolvidos tras análises forem requeridas para essas amostras,
na detecção da presença/ausência de microrganis- a BPW pode ser usada para o preparo de diluições
Quadro 19.7. Orientações para o preparo de amostras e pré-enriquecimento de Salmonella no método

mlG/FSIS/USDA:2017.
Produto Unidade analítica Volume de caldo Tempo de incubação
Produtos prontos para consumo 325±6,5g 975±19,5 ml 35±2 ºC/18-24h
Produtos de carne de frango crus 325±32,5g ou 25±2.5g 1.625±32,5 ml ou 225±4,5 ml de BPW 35±2 ºC/20-24h
Produtos de carne bovina crus 325±32,5g ou 25±2.5g 975±19,5 ml ou 75±1,5 ml de TSB 42±1 ºC/15-24h
Amostras superficiais (esponjas)
uma esponja pré-umedecida 50±1 ml de BPW
de carcaças de frango ou 35±2 ºC/20-24h
com 10 ml de tampão fosfato (levando a um volume total de 60 ml*)
ambiente de fabricação
Amostras superficiais (esponjas)
uma esponja pré-umedecida 50±1 ml de TSB
de carcaças bovinas ou ambiente 42±1 ºC/15-24h
com 10 ml de tampão fosfato (levando a um volume total de 60 ml*)
de fabricação
Fluído de lavagem de carcaças 30±0.6 ml do fluído de
30±0.6 ml de BPW 35±2 ºC/20-24h
de aves inteiras lavagem
Ovo (líquido pasteurizado ou
100±2g 900±18 ml de BPW 35±2 ºC/18-24h
congelado, em pó)
Produtos de peixe crus 25±2,5g 225±4,5 ml 35±2 ºC/22-26h
2.925±58,5 ml de BPW suplementado com
325±6,5g + 10g de carbonato
Produtos fermentados 1 ml de solução aquosa de cristal violeta 35±2 ºC/18-24h
de cálcio esterilizado
1%
Misturas para pão, molhos
325±6,5g 2.925±58,5 ml 35±2 ºC/18-24h
desidratados e leite em pó
* Ou mantendo uma proporção de 1:6 para diferentes volumes de diluente usado para umedecer as esponjas, como 25 ml de tampão fosfato + 125 de caldo, por
exemplo. BPW = Água Peptonada Tamponada, TSB = Caldo Tripticase de Soja.

Salmonella □ 319
Figura 19.3. Esquema da análise de Salmonella pelo método mlG/FSIS/USDA:2017. (continua)

Figura 19.3. Esquema da análise de

Salmonella pelo método mlG/FSIS/USDA:2017. (continu-
ação)

Salmonella □ 321
subsequentes ou pode-se efetuar a lavagem das Modificado (DM-LIA). Repetir esse proce-
carcaças com Tampão Fosfato (em lugar do BPW) dimento com o caldo RV ou RVS. Incubar as
e transferir 30 ml do líquido de lavagem para uma
bolsa ou frasco com 30 ml de BPW em concentração
placas invertidas a 35±2 ºC/18-24h e verificar
dupla. se há desenvolvimento de colônias típicas de
Salmonella. Em caso negativo, reincubar as
Nota a.1.2) Para a análise de ovo em pó, leite em pó, mo-
lhos desidratados e misturas em pó para o preparo de placas e repetir a leitura com 48 horas. Carac-
pão, adicionar um pequeno volume inicial de BPW, terísticas típicas das colônias de Salmonella
homogeneizar até obter uma suspensão homogênea nos meios de plaqueamento:
e adicionar então o volume remanescente do caldo.
▪ Ágar BGS. Colônias opacas, róseas, lisas,
a.2) Contagem pela técnica do NMP ( mlG/ com bordas perfeitas e rodeadas por um halo
FSIS/USDA 2014). Seguindo as orienta- vermelho. Em placas muito cheias, as colônias
ções do Capítulo 2, homogeneizar 25±0,5g têm uma aparência acastanhada contra um fun-
da amostra em 225 ml do mesmo caldo de do verde.
enriquecimento indicado no teste de presen- ▪ Ágar XLT4. Colônias vermelhas com ou
ça/ausência (a.1). Preparar diluições deci- sem centro preto ou colônias inteiramente pre-
mais seriadas usando Água Peptonada 0,1% tas. Com 24 horas as bordas podem apresen-
(H2Op) ou Tampão Fosfato (PB) nos tubos tar-se amarelas mas, com o prolongamento da
de diluição. Transferir três alíquotas de 10 incubação, passam para vermelho.
ml da diluição 10-1 para três tubos estéreis ▪ Ágar DM-LIA. Colônias roxas com ou sem
vazios, três alíquotas de 1 ml da 10-1 para centro preto. A cor do meio permanece inalte-
três tubos com 9 ml de BPW e três alíquotas rada (descarboxilação da lisina, sem fermenta-
de 1 ml da 10-2 para três tubos com 9 ml de ção da lactose ou sacarose).
BPW. Incubar todos os tubos e o restante da
d) Confirmação preliminar das colônias típicas
diluição 10-1 nas mesmas condições indica-
de Salmonella. Selecionar pelo menos três co-
das para o teste de presença/ausência. Rea-
lônias típicas de cada placa, para confirmação
lizar todas as etapas subsequentes do ensaio
preliminar. Submeter aos testes de crescimento
para cada tubo separadamente, bem como
em Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) e Ágar
para o restante da diluição 10-1.
Lisina Ferro (LIA), da mesma forma descrita
Nota a.2.1) As alíquotas indicadas acima (1 – 0,1 e 0,01g) no método da FDA. Retirar o inóculo da super-
são as mais adequadas para amostras com contagem fície do centro da colônia, sem tocar o meio de
esperada abaixo de 10/g. No caso de amostras com
contagem esperada acima desse nível, inocular dilui-
cultura em redor, pois os meios são altamente
ções mais altas, seguindo as orientações do Capítulo 4. seletivos e podem inibir o crescimento de vá-
rias cepas viáveis.
b) Enriquecimento seletivo. Transferir 0,1±0,02 Submeter ao teste de detecção dos antígenos
ml da amostra enriquecida para 10 ml de Cal- somáticos (poli O) e flagelares (poli H), da
do Rappaport-Vassiliadis Modificado (RV) mesma forma descrita no método da FDA.
ou Caldo Rappaport-Vassiliadis Soja (RVS) e Para a detecção dos antígenos flagelares pode
0,5±0,05 ml para 10 ml de Caldo Tetrationato também ser utilizado o Oxoid Salmonella La-
Hajna (TTH). Incubar os caldos de enriqueci- tex Test, seguindo a instrução do fabricante. Se
mento seletivo a 42±0,5 ºC/22-24h. o teste em latex for negativo e a cultura apre-
c) Plaqueamento diferencial. Estriar uma al- sentar características indicativas de Salmo-
çada do caldo TTH em placas de Ágar Verde nella, repetir o teste da forma convencional.
Brilhante Sulfa (BGS) e um segundo meio, Submeter as culturas à confirmação definitiva
que pode ser o Ágar Xilose Lisina Tergitol 4 obedecendo os seguintes critérios:
(XLT4) ou o Ágar Lisina Ferro Duplamente

Poli Poli e) Confirmação definitiva. O mlG/FSIS não

Reação em TSI Reação em LIA Continuação
O H descreve as provas bioquímicas de confirma-
Rampa alcalina fundo Fundo alcalino
ácido com H2S com H2S
+ + continuar ção. Recomenda o uso de um “kit” de iden-
Rampa alcalina fundo Fundo alcalino tificação ou as provas descritas pelo método
+ - continuar
ácido com H2S com H2S AOAC 967.27, que são as mesmas usadas no
Rampa alcalina fundo Fundo alcalino
ácido sem H2S sem H2S
continuar método da FDA.
Rampa alcalina fundo Fundo ácido sem
+ + continuar*
ácido sem H2S H2S
Rampa alcalina fundo Fundo ácido sem
- - descartar
ácido sem H2S H2S
Rampa alcalina fundo Fundo ácido com
continuar
ácido com H2S ou sem H2S
Rampa e fundo Fundo alcalino
descartar
ácidos sem H2S ou ácido sem H2S
Rampa e fundo Fundo alcalino
continuar**
ácidos com H2S com H2S
Sem alteração de cor
descartar
no meio
* Salmonella Typhisuis eventualmente encontrada em suínos nos Estados

Unidos.
** Salmonella enterica subsp arizonae ou diarizonae.

Salmonella □ 323
19.5. Referências
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20 Vibrios patogênicos
Item 20.2 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, com
orientações atualizadas sobre estocagem de amostras e as seguintes alterações:
Item 20.2.2.a Alterado o procedimento para enriquecimento das amostras.
Item 20.2.2.b, c Incluída mais uma opção de meio para o plaqueamento seletivo diferencial.
Item 20.3 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, com as
seguintes alterações:
Item 20.3.2.a Alterado o procedimento para enriquecimento das amostras.
Item 20.3.2.b Incluída mais uma opção de meio para o plaqueamento seletivo diferencial e alteradas as con-
dições de incubação do m-CPC e CC.
Item 20.3.2.c Alterado o procedimento para confirmação.
20.1. Introdução A doença provocada por V. parahaemolyticus é

classificada no grupo de risco III, que inclui as do-
Os membros do gênero Vibrio são bactérias pri-
enças “de perigo moderado, usualmente de curta
mariamente aquáticas, encontradas em água doce
duração, sem ameaça de morte ou sequelas, com
ou salgada e, frequentemente, associadas com
sintomas auto limitados mas que causam severo
animais e plantas. Três espécies respondem pela
desconforto”.
maioria das doenças transmitidas por alimentos
Outras espécies de vibrios também têm sido iso-
(DTAs): Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyti-
ladas de espécimens clínicos, indicando que são
cus e Vibrio vulnificus.
patogênicas para humanos. De ocorrência em es-
A cólera, doença provocada pelas cepas de V. cho-
pécimens intestinais incluem-se V. alginolyticus,
lerae dos sorotipos O1 e O139, é classificada pela
V. fluvialis, V. furnissii, V. hollisae e V. mimicus.
International Commission on Microbiological
De ocorrência em espécimens extra intestinais in-
Specifications for Foods (ICMSF, 2002) no gru-
cluem-se V. cincinnatiensis, V. damsela, V. harveyi
po de risco IA, que inclui as doenças “de severo
e V. metschnikovii (Brenner et al., 2005).
perigo para a população em geral, com ameaça de
morte, sequelas crônicas ou longa duração”.
20.1.1. Taxonomia
As doenças provocadas por V. vulnificus são classi-
ficadas no grupo de risco IB, que inclui as doenças As informações abaixo são da 2ª edição do Ber-
“de severo perigo para população restrita, com ame- gey’s Manual of Systematic Bacteriology (Bren-
aça de morte, sequelas crônicas ou longa duração”. ner et al., 2005).
Os grupos de risco são indivíduos com níveis altos Vibrio é um gênero da família Vibrionaceae, defi-
de ferro no sangue ou com distúrbios hepáticos, re- nida como bactérias Gram negativas na forma de
lacionados com alto consumo de álcool. bastonetes retos ou curvos, móveis com flagelos

peritríqueos e não esporogênicas. São anaeróbias Aeromonadaceae e o gênero Plesiomonas para a

facultativas, apresentando metabolismo respirató- família Enterobacteriaceae. Esses microrganismos
rio e fermentativo. A maioria das espécies é oxida- também são aquáticos e, eventualmente, podem ser
se positiva, reduz nitrato a nitrito e utiliza a glicose isolados junto com os vibrios. Não são bactérias
como única fonte de carbono e energia. A maioria marinhas, mas podem ser encontradas em sistemas
não cresce na ausência de NaCl, exigindo íons Na+ marítimos que têm interface com água doce.
para crescimento. V. cholerae cresce na ausência Allomonas e Listonella são gêneros novos e ain-
de NaCl mas a concentração ótima de NaCl para da não foram descritos separadamente nessa 2ª
a maioria dos outros encontra-se na faixa de 0,5 a edição do Bergey’s Manual. As espécies existen-
3%. V. vulnificus, que pode ser confundido com V. tes nesse gêneros estavam anteriormente classifi-
parahaemolyticus no isolamento, apresenta reque- cadas como vibrios e assim continuam descritas:
rimento mínimo de NaCl por volta de 0,5%, menor Allomonas enterica como Vibrio fluvialis, Listo-
do que o de V. parahaemolyticus, que é de 2 a 3%. nella anguillarum como Vibrio anguillarum e
Na 1ª edição do Bergey’s Manual of Systematic Listonella pelagia como Vibrio pelagius.
Bacteriology (Krieg & Holt, 1984) a família Vi- As principais características que diferenciam os
brionaceae incluía os gêneros Vibrio, Photobac- gêneros da família Vibrionaceae entre si e de Ae-
terium, Aeromonas e Plesiomonas. Na 2ª edição romonas e Plesiomonas encontram-se descritas
(Brenner et al., 2005) foram feitas várias mudan- no Quadro 20.1. A resistência a 150 mg do agente
ças na classificação e a família passou a incluir vibriostático O/129 (fosfato de 2,4-diamino-6,-
os gêneros Vibrio, Photobacterium, Salinivibrio, 7-diisopropil-pteridina) é usada para diferenciar
Allomonas e Listonella. Vibrio (geralmente sensível), de Aeromonas (ge-
O gênero Aeromonas foi transferido para a família ralmente resistente). Em menores concentrações é
Quadro 20.1. Características que diferenciam os gêneros Vibrio, Photobacterium, Salinivibrio, Aero-
monas e Plesiomonas a (Brenner et al., 2005).
Vibrios
Photobacterium Salinivibrio Aeromonas Plesiomonas
patogênicos
Oxidase (+) Variável + + +
Oxidação/Fermentação O/F O/F O/F O/F O/F
Resistência ao O/129 b (10 mg) Variável S NR R NR
Resistência ao O/129 b (150 mg) Sc S NR R S
Teste do fio d + NR NR - -
Crescimento na ausência de NaCl (-) - Variável + +
Crescimento em 6,5% (p/v) de NaCl (+) NR + - -
Gás a partir de glicose - Variável NR Variável -
Ornitina descarboxilase Variável - - (-) +
Fermentação do inositol (-) - NR - +
Fermentação do manitol + - Variável (+) -
Fermentação da sacarose (+) - + (+) -
Liquefação da gelatina + - + + -
Crescimento em Água Peptonada Alcalina (APA) + + NR + +
Crescimento em TCBS e (+) + NR (-) -
a Símbolos: + = positivo para a maioria das espécies do gênero, - = negativo para a maioria das espécies do gênero, (+) = positivo para a maioria das espécies
mas algumas poucas podem ser negativas, (-) = negativo para a maioria das espécies mas algumas poucas podem ser positivas, NR = Não relatado, R =
Resistente, S = Sensível.
b Agente vibriostático fosfato de 2,4-diamino-6,7-diisopropil-pteridina (discos com 150 mg)
c Os vibrios geralmente são sensíveis mas crescem os relatos de resistência em cepas de V. cholerae na Índia e Bangladesh.
c Descrito no procedimento para a análise V. cholerae.
e Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose.

Vibrios patogênicos □ 327
usada para diferenciar algumas espécies de Vibrio também, a mais importante epidemiologicamente,
entre si. O teste do fio, que verifica a lise das célu- embora nem todas as cepas sejam patogênicas. A
las na presença de 0,5% de desoxicolato de sódio, espécie é dividida em cerca de 180 sorotipos so-
é usado para diferenciar Vibrio (geralmente posi- máticos e as cepas responsáveis pelas epidemias e
tivo) de Aeromonas e Plesiomonas (geralmente pandemias de cólera são do sorotipo O1 ou, nos
negativas). A capacidade de crescer na ausência casos mais recentes, do sorotipo O139. As cepas do
de NaCl mas não em 6,5% diferencia Aeromonas sorótipo O1 são ainda divididas nos subtipos Inaba,
e Plesiomonas dos vibrios halofílicos. Ogawa e Hikojima, que apresentam fórmulas anti-
A 2ª edição do Bergey’s Manual também traz, gênicas do tipo AB, AC e ABC, respectivamente.
separadamente, tabelas com as principais caracte- Uma segunda subdivisão das cepas O1 de V. cho-
rísticas que diferenciam as 12 espécies de vibrios lerae, baseada nas características de resistência a
patogênicos para o homem. Para facilitar a dife- fagos, resistência à polimixina e outros caracteres
renciação, essas espécies podem ser divididas em bioquímicos, distingue dois biotipos de V. chole-
seis grupos, apresentados no Quadro 20.2. rae: o biotipo clássico e o biotipo El-Tor. As prin-
O grupo um inclui os vibrios patogênicos capazes cipais características que distinguem esses dois
de crescer na absoluta ausência de NaCl (V. cho- biotipos encontram-se descritas no Quadro 20.4.
lerae e V. mimicus), o grupo dois inclui os oxida- Assim como V. cholerae, nem todas as cepas de
se e nitrato negativos (V. metschnikovii), o grupo V. parahaemolyticus são patogênicas. As patogê-
três inclui os que fermentam inositol (V. cincinna- nicas distinguem-se das não patogênicas pela pro-
tiensis), o grupo quatro inclui os arginina e lisina dução de uma hemolisina termoestável conhecida
negativos (V. hollisae), o grupo cinco inclui os ar- como “Thermostable Direct Hemolysin” (TDH).
ginina positivos (V. damsela, V. fluvialis e V. fur- A produção da TDH pode ser detectada através da
nissii) e o grupo seis inclui os arginina negativos hemólise de eritrócitos humanos no Ágar Wagat-
e lisina positivos (V. alginolyticus, V. harveyi, V. suma, reação conhecida como fenômeno ou rea-
parahaemolyticus e V. vulnificus). As demais ca- ção de Kanagawa. As cepas que provocam gas-
racterísticas das espécies patogênicas encontram- troenterites em humanos são quase sempre Kana-
se descritas no Quadro 20.3. gawa positivas, enquanto as isoladas de água ou
V. cholerae é a espécie tipo do gênero Vibrio e, produtos do mar são quase sempre negativas.
Quadro 20.2. Características-chave para a separação dos vibrios patogênicos em grupos a,b (Brenner et
al., 2005).
Crescimento Redução Fermentação Arginina Lisina
Grupo Espécies Oxidase
em 0% NaCl nitrato mio-inositol dehidrolase descarboxilase
V. cholerae +
1
V. mimicus +
2 V. metschinkovii - - - d
3 V. cincinnatiensis - + + +
4 V. hollisae - + + - - -
V. damsela - + + - +
5 V. fluvialis - + + - +
V. furnissii - + + - +
V. alginolyticus - + + - - +
V. harveyi - + + - - +
6
V. parahaemolyticus - + + - - +
V. vulnificus - + + - - +
a Todos os dados são da reação após incubação a 35-37 ºC/48h.
b Símbolos: + = maioria das cepas positivas (geralmente 90-100%), d = variável entre as cepas (25-75% positivas), - = maioria das cepas negativas (geralmente
90-100%).

Quadro 20.3. Principais características das espécies patogênicas de Vibrio (Brenner et al., 2005).
parahaemolyticus
V. cincinnatiensis
V. metchnikovii
V. alginolyticus
V. vulnificus
V. furnissii
V. cholerae
V. fluvialis
V. mimicus
V. damsela
V. hollisae
V. harveyi
Teste a
V.
Muito Pobre Muito Pode ser Bom Bom
Bom Bom Bom Bom Bom Bom
TCBS Agar b pobre Verdes pobre pobre Verdes Verdes
Amarelas Amarelas Amarelas Amarelas Amarelas Verdes
Amarelas (95) Verdes Amarelas (99) (90)
mCPC Agar cg Roxas Não cresce NR NR Não cresce Não cresce NR Não cresce Não cresce Não cresce Não cresce Amarelas
CC Agar dg Roxas Não cresce NR NR Não cresce Não cresce NR Não cresce Não cresce Não cresce Não cresce Amarelas
AIA eg Ka KA NR NR KK KK NR Ka KK KA KA KA
Oxidase + + + + + + + + - + + +
Nitrato (1% NaCl) + (99) + + + + + + + - + + +
Indol (BHI 1% NaCl) f + (99) + (85) - (92) - - (87) - (89) + + (97) - (80) + (98) + (98) + (97)
VP (1% NaCl) + (75) + (95) - + (95) - - +/- (50/50) - + (96) - (91) - -
Urease - - - - - - - - - - (99) - (85) - (99)
Arginina
- - - + (95) + (93) + - - + (60) - - -
(Moellers 1% NaCl)
Lisina
+ (99) + (99) + (57) +/- (50/50) - - + - - (65) + + + (99)
(Moellers 1% NaCl)
Ornitina
+ (99) +/- (50/50) - - - - - - - + (99) + (95) + (55)
(Moellers 1% NaCl)
Gelatinase
+ (90) + (90) - - (94) + (85) + (86) - - + (65) + (65) + (95) + (75)
(1% NaCl - 22 ºC)
Glicose ácido + + + + + + +/- (50/50) + + + + +
Glicose gás - - - - (90) - + - - - - - -
Acido de
L-Arabinose - - (99) + - + (93) + - + (97) - - (99) + (80) -
D-Arabitol - - - - + (65) + (89) - - - - - -
Celobiose - (92) - (97) + - - (70) - (89) +/- (50/50) - - (91) - - (95) + (99)
Lactose - (93) - - - - (97) - - - +/- (50/50) - (79) - (99) + (85)
Maltose + (99) + + + + + + - + + (99) + (99) +
D-manitol + (99) + + - + (97) + +/- (50/50) - + (96) + (99) + - (55)
D-manose + (78) + (99) + + + + +/- (50/50) + + + (99) + + (98)
Sacarose + + (99) + - (95) + + +/- (50/50) - + - - (99) - (85)
Salicina - (99) - (96) + - - - - - - (91) - - (99) + (95)
Lipase + (92) + (85) - (64) - + (90) + (89) - - + - (83) + (90) + (92)
Teste ONPG + (94) - + (86) - - (60) - (65) - - +/- (50/50) + (90) - (95) + (75)
Crescimento (pv)
0% NaCl + - - - - - - - - + - -
1% NaCl + + (99) + + + (99) + (99) + + (99) + + + + (99)
3% NaCl g + + NR NR + + NR + + + + +
6% NaCl + (53) + + + (95) + (96) + + + (83) + (78) - (51) + (99) + (65)
8% NaCl - (99) + (94) + (62) - + (71) + (78) - - - (56) - + (80) -
10% NaCl - + (69) - - - (96) - - - - (96) - - (98) -
12% NaCl - - (83) - - - - - - - - - (99) -
Crescimento 42 ºC g + + NR NR Variável - NR NR Variável + + +
Sensibilidade O/129
S R NR NR R R NR NR S S R S
(10µg) gh
Sensibilidade O/129
S S NR NR S S NR NR S S S S
(150µg) gh
a Resultados após incubação a 36 ºC/48h (a menos que especificada outra condição): (1% NaCl) = meio padrão com concentração de NaCl ajustada em 1%
(p/v), + = 100% das cepas positivas e - = 100% das cepas negativas (a menos que especificada outra porcentagem entre parênteses), NR = Não relatado.
b Crescimento e cor das colônias no Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose
c Cor das colônias no Ágar Celobiose Polimixina Colistina Modificado.
d Cor das colônias no Ágar Celobiose Colistina.
e Reação no Ágar Arginina Ferro, KK = rampa e fundo alcalinos, KA = rampa alcalina e fundo ácido, Ka = rampa alcalina e fundo levemente ácido.
f Caldo Infusão Cérebro Coração com 1% de NaCl.
g Dados do Bacteriological Analitycal Manual Online (Kaysner & De Paola, 2004), não especifica a % de cepas que apresentam o resultado relatado.
h Agente vibriostático 2,4-diamino-6,7-diisopropilpteridina

Quadro 20.4. Características que diferenciam as cepas de V. cholerae O1 nos biotipos clássico e El-Tor a
(Brenner et al., 2005).
Característica Biotipo clássico Biotipo El-Tor
Frequência de ocorrência no subcontinente indiano Ocasional Comum
Frequência de ocorrência no resto do mundo Muito raro Comum
Hemólise de células vermelhas do sangue - +
Teste de VP - +
Sensibilidade à polimixina B (discos de 50 unidades) + -
Aglutinação de células vermelhas do sangue de galinhas - +
Lise pelo bacteriófago Clássico IV + -
Lise pelo bacteriófago FK + -
Lise pelo bacteriófago El Tor 5 - +
a Símbolos: + = maioria das cepas positivas (geralmente 90-100%), d = variável entre as cepas (25-75% positivas), - = maioria das cepas negativas (geralmente
90-100%).
20.1.2. Epidemiologia Haiti, na República Dominicana, em Cuba e no

México, com risco de reintrodução da cólera no
As informações abaixo são do Manual das Doen-
Brasil. A epidemia brasileira iniciou-se em 1991,
ças Transmitidas por Alimentos, do Centro de Vi-
com casos até 2005, sendo que mais de 80% ocor-
gilância Epidemiológica (CVE) do Estado de São
reram no período de 1992 a 1994.
Paulo (Informe-Net DTA, 2014a,b,c).
V. cholerae é transmitido por via oral, ou seja, pela
20.1.2.1. V. cholerae ingestão de água ou alimentos contaminados com
V. cholerae é o agente etiológico da cólera, uma fezes de indivíduos infectados, não sendo comum
doença infecciosa intestinal aguda, geralmente a transmissão de pessoa para pessoa. Qualquer in-
moderada ou assintomática, que manifesta-se com divíduo é susceptível à infecção, mas a doença é
quadro grave em cerca de 5% das pessoas atingi- mais grave em crianças que sofrem de desnutri-
das. Caracteriza-se, em sua forma mais evidente, ção. A probabilidade é maior em áreas pobres com
por diarreia aquosa súbita e profusa, com aspecto alta densidade populacional e em pessoas que não
de “água de arroz”, vômitos ocasionais, desidra- tenham sido previamente expostas ao organismo,
tação rápida e cãibras nas pernas. Sem terapia de uma vez que, geralmente, é conferida imunidade
reidratação a taxa de mortalidade pode atingir de por infecção.
30 a 50% dos casos. Entretanto, com tratamento O diagnóstico é confirmado pelo isolamento do or-
adequado, a taxa é menor que 1%. O período de ganismo causador nas fezes de pessoas infectadas.
incubação geralmente é de três dias, podendo, em Os alimentos incriminados incluem peixes e uma
alguns casos, ocorrer na faixa de algumas horas. variedade de frutos do mar (ostras, mexilhões,
Os sintomas são provocados pela ingestão das cé- caranguejo, lagosta, camarão e lula), geralmente
lulas do microrganismo, que colonizam o intesti- consumidos crus ou mal cozidos. As principais
no e liberam uma enterotoxina que induz à secre- medidas preventivas, além da educação sanitária
ção intestinal. A ação da toxina altera o equilíbrio e do saneamento básico, são a fervura ou cloração
de transporte de íons e provoca a perda de grandes da água nos locais sem água potável, e a cocção
quantidades de água e eletrólitos. dos alimentos como peixes e frutos do mar.
Estima-se que V. cholerae cause cerca de 11 mi-
20.1.2.2. V. parahaemolyticus
lhões de casos de doença por ano no mundo, atin-
gindo vários continentes (7ª pandemia em curso As ingestão de alimentos contaminados com ce-
na Ásia, África, América Latina, América Central pas patogênicas de V. parahaemolyticus provoca
e Caribe). Desde 2010 há surtos epidêmicos no gastroenterites caracterizadas por diarreia com ou

sem sangue, cólicas abdominais, náuseas, vômi- vesiculares e necrose. A infecção pode se tornar
tos, febre e calafrios. A dose infectiva média é de sistêmica, causando febre, calafrios, estado mental
100 milhões de organismos, mas há evidências alterado e hipotensão. O tempo médio para o iní-
de que pode ser mil vezes menor. A doença geral- cio dos sintomas pode ser de apenas quatro horas.
mente é leve ou moderada, causando diarreia au- A gastroenterite é provocada pela ingestão de ali-
to-limitada. Alguns casos (menos de 40%) podem mentos contaminados com V. vulnificus, podendo
requerer hospitalização. O período de incubação atingir qualquer indivíduo saudável. Os sintomas
médio é de 17 horas, podendo variar de quatro a são febre, diarreia, cólicas abdominais, náuseas e
90 horas após a ingestão. A duração média da do- vômitos. A dose infectiva é estimada em 1.000 or-
ença é de 2 a 6 dias. ganismos. Estima-se também que, com uma dose
Casos esporádicos e surtos têm sido registrados de um milhão de organismos, o risco de doença
em várias partes do mundo como Japão, Sul da para pessoas sensíveis seja de 1:50.000. O período
Ásia e Estados Unidos, ocorrendo principalmen- de incubação varia entre 12 horas e 21 dias após
te em meses quentes. Não há dados sobre a fre- a ingestão.
quência do patógeno no Brasil. O reservatório é O meio ambiente marinho é o habitat natural de
o ambiente marinho e os alimentos associados Vibrio vulnificus e casos esporádicos podem ocor-
são peixes e moluscos (em geral ostras), crus ou rer nos meses quentes do ano, mas não há dados
mal cozidos. Há uma correlação entre a doença e sobre a frequência do patógeno no Brasil. Os ali-
o consumo dos alimentos nos meses quentes do mentos frequentemente associados à gastroente-
ano. Refrigeração inadequada ou manutenção dos rite são ostras, mexilhões, caranguejos e outros
alimentos contaminados em temperatura favorá- mariscos, encontrados em águas quentes durante
vel à proliferação são as principais causas da do- o verão.
ença. A prática de lavar os pescados e frutos do
mar com a água do mar são também uma causa de 20.1.3. Comentários sobre os
contaminação. Indivíduos de qualquer faixa etária
são susceptíveis e o diagnóstico é confirmado pelo
isolamento de vibrios Kanagawa positivos das fe- Os métodos culturais da American Public Health
zes dos pacientes. Association (APHA) (De Paola & Jones, 2015),
para o isolamento ou contagem de víbrios em
20.1.2.3. V. vulnificus
alimentos, são baseados, principalmente, na ca-
V. vulnificus pode causar gastroenterites, infec- pacidade de crescer em condições alcalinas e na
ções em feridas ou uma síndrome conhecida como presença de concentrações relativamente altas de
“septicemia primária”. sais biliares. O teste de presença/ausência e a de-
A septicemia primária (choque séptico) atinge terminação do NMP incluem uma etapa de enri-
principalmente grupos de risco mais susceptíveis, quecimento, em que é utilizada a Água Peptona-
que incluem indivíduos com comprometimento da Alcalina (APA), com pH entre 8,4 e 8,6, tanto
hepático, imunodeprimidos, crianças, gestantes e para V. cholerae como para V. parahaemolyticus
idosos. Mais de 60% dos pacientes desenvolvem e V. vulnificus. Na análise de V. cholerae, o perío-
lesões secundárias nas extremidades. O tempo do de incubação não deve ser muito prolongado,
médio para o início dos sintomas é de quatro dias. sob o risco de ocorrer um predomínio da micro-
A infecção de feridas geralmente ocorre durante biota competidora (exceto no caso de alimentos
o manuseio de peixes, crustáceos, moluscos ou processados ou com população esperada muito
quando um ferimento pré-existente é exposto a baixa, em que a incubação é prolongada por 18-
águas marinhas ou estuarinas contaminadas com 21h). Alguns laboratórios optam pela incubação
o organismo. A contaminação provoca inflamação de todas as amostras durante a noite (16-18h),
no local, que pode progredir para a celulite, lesões para acomodar os trabalhos ao horário comercial.

Quadro 20.5. Características das colônias algumas espécies de Vibrio no CHROMagar e no TCBS
(Hara-Kudo, 2001).
Colônias em CHROMagar Colônias em TCBS
Espécie
Tamanho (mm) Cor Tamanho (mm) Cor
V. parahaemolyticus 3-5 violetas 2-4 verdes
V. cholerae O1 3 azul pálidas 3 amarelas
V. vulnificus 5 azul pálidas 1 verdes
V. mimicus 3-4 azul pálidas 1-2 verdes
V. alginolyticus 5-6 brancas leitosas 3-4 amarelas
V. hollisae 4 brancas leitosas 3 verdes
Essa prática, entretanto, é menos recomendável e por Hara-Kudo et al. (2001) para diferenciar V.
deve ser evitada sempre que possível. parahaemolyticus. O meio contém substratos cro-
No plaqueamento diferencial, o meio mais ampla- mogênicos para a enzima β-galactosidase, resul-
mente utilizado é o Ágar Tiossulfato Citrato Bile tando em colônias de diferentes, cores, dependen-
Sacarose (TCBS), especialmente desenvolvido do da espécie presente (Quadro 20.5).
para o isolamento de víbrios em geral. Esse meio Na caracterização bioquímica é recomendado o
explora a resistência à bile e a capacidade de cres- uso do “kit” miniaturizado API 20E da BioMé-
cer em condições alcalinas (pH 8,6) como prin- rieux, porque essas espécies não são facilmente
cipais características seletivas. A característica de diferenciadas umas das outras através de provas
diferenciação entre as espécies é a fermentação bioquímicas tradicionais. O uso de “kits” que
ou não da sacarose, cepas positivas produzindo disponham de uma chave de identificação cons-
colônias amarelas e cepas negativas produzindo tantemente atualizada é essencial para o sucesso
colônias verdes. O TCBS é utilizado para o isolada identificação. No caso da análise de V. chole-
mento de V. cholerae (colônias amarelas) e V. pa- rae pode ser feita uma seleção inicial das cepas
rahaemolyticus / V. vulnificus (colônias verdes). suspeitas com base na capacidade de crescer na
V. mimicus, que é estreitamente relacionado ao V. ausência de NaCl e na lise das células com deso-
cholerae, pode ser diferenciado no TCBS, pela in- xicolato de sódio 0,5% (teste do fio).
capacidade de fermentar a sacarose.
Para o isolamento preferencial de V. vulnificus são
20.2. Método APHA 40.61:2015
recomendados o Ágar Celobiose Polimixina Co-
listina Modificado (m-CPC) ou o Ágar Celobio- para presença/ausência ou
se Colistina (CC), que utilizam a fermentação da NMP de Vibrio cholerae em
celobiose a 40 ºC como característica diferencial. alimentos e água
Vários outros vibrios e a maioria das cepas de V.
parahaemolyticus não crescem nesses meios. Em Método da American Public Health Association
função disso, são também recomendados como (APHA), descrito na 5ª edição do Compendium
segundo meio de plaqueamento na análise de V. of Methods for the Microbiological Examination
cholerae, para reduzir a interferência dos outros of Foods (De Paola & Jones, 2015). Aplica-se à
vibrios. As cepas do biotipo clássico de V. cho- análise de alimentos e água.
lerae, sensíveis à polimixina, não vão crescer no Alimentos destinados à detecção de vibrios de-
m-CPC, mas essas cepas são muito raras. vem ser estocados sob resfriamento moderado
Uma outra opção de meio de plaqueamento dife- (7-10 ºC) e analisadas entre 24 e 48h após a co-
rencial que foi introduzida na 5ª edição do Com- leta. O contato direto com gelo deve ser evitado,
pendium é o CHROMagar Vibrio, desenvolvido porque as células podem ser injuriadas se o res-

friamento for rápido. O congelamento das amos- □ Solução de desoxicolato de sódio 0,5% para
tras é desaconselhado e, em caso de absoluta ne- teste do fio
cessidade, deve ser feito a 80 ºC negativos. □ Solução salina 0,85% aquosa estéril
Cuidado. A análise deve ser conduzida por pes- □ Reagente de Kovacs para teste de oxidase
soal bem treinado, para garantir a segurança do □ Alça de platina ou palitos estéreis para teste de
analista e do laboratório. Durante a realização oxidase
das análises, recomendam-se os seguintes cuida- □ Anti-soro somático O1 polivalente e O139
dos: 1) que todo o manuseio das amostras e meios □ Anti-soros Inaba e Ogawa
de cultura seja feito sobre bandejas e não direta- □ ‘Kit”API 20E (BioMérieux)
mente sobre as bancadas, 2) que nenhuma coleta □ Banho-maria ou estufa incubadora regulada a
de líquido seja feita com a boca e sim com pipe- 42±1 ºC
tadores, 3) que ao trabalhar em capela de fluxo □ Estufa incubadora regulada a 35±2 ºC
laminar se utilize um modelo vertical, adequado
ao manuseio de patógenos, 4) que se mantenha 20.2.2. Procedimento
ao alcance das mãos um frasco de desinfetan- O esquema da análise de V. cholerae pelo método
te como solução de cloro a 100ppm ou solução APHA 40.61:2015 encontra-se descrito na Figura
de álcool iodado, para descontaminar qualquer 20.1. Antes de iniciar as atividades, ler atenta-
descarga inadvertida de material contaminado, mente as orientações do Capítulo 5, que apresen-
5) que todo o descarte de material seja precedido ta todos os detalhes e cuidados envolvidos na de-
da descontaminação em autoclave a 121 ºC por tecção da presença/ausência de microrganismos.
30min, 6) que toda a área de trabalho seja pron- O procedimento descrito abaixo não apresenta
tamente descontaminada, uma vez concluídas as esses detalhes, pressupondo que sejam conheci-
análises, 7) que no preparo e homogeneização dos pelo analista.
das amostras se tomem precauções para evitar a
a) Enriquecimento
formação de aerossóis. Para tanto, recomenda-se
que a homogeneização seja feita preferencial- a1) Teste de presença/ausência. Seguindo as
mente em “stomacher” e que, na homogeneiza- orientações do Capítulo 2, homogeneizar
ção em liquidificador, a tampa seja protegida por 25g da amostra com 225 ml de Água Pepto-
papel amarrado com barbante, aguardando-se a nada Alcalina (APA). Incubar a 42±1 ºC/6-8h
acomodação do material homogeneizado, antes e, no caso de alimentos processados ou
da abertura do frasco. com população esperada muito baixa, rein-
cubar até completar 18-21h. A incubação
pode ser feita em banho-maria ou em estu-
fa incubadora.
análise
Para a análise de amostras de ostras “in
□ Água Peptonada Alcalina (APA) natura”, homogeneizar o conteúdo de 10
□ Placas de Ágar Tiossulfato Citrato Bile Saca- a 12 organismos com Tampão Fosfato Sa-
rose (TCBS) lina (PBS), na quantidade necessária para
□ Placas de Ágar Celobiose Polimixina Colistina diluição 1:2 (peso/peso). Transferir 50g
Modificado (m-CPC) ou Ágar Celobiose Colis- desse material para 2.475 ml de APA (di-
tina (CC) ou CHROMagar Vibrio (opcionais) luição final resultante = 1:100) e incubar a
□ Tubos de Ágar T1N1 ou Ágar Tripticase de 42±1 ºC/18-21h. Se a incubação for feita
Soja (TSA) em estufa incubadora, trabalhar com o cal-
□ Tubos de Caldo T1N0 e T1N3 (mesma for- do APA pré-aquecido a 42 ºC.
mulação do T1N1 sem ágar e com 0 e 3% de Para a análise de água pode-se inocular 100
NaCl, respectivamente) ml da amostra em 10 ml de APA 10 vezes

Figura 20.1. Esquema da análise de V. cholerae pelo método APHA 40.61:2015 (De Paola & Jones, 2015).

concentrado ou um litro da amostras em 100 rada muito baixa, reincubar até completar 18-21h.
ml de APA 10 vezes concentrado. A incubação pode ser feita em banho-maria ou em
estufa incubadora.
a2) Determinação do NMP. Seguindo as orien-
tações do Capítulo 2, homogeneizar 25g da b) Plaqueamento diferencial. A partir de cada
amostra com 225 ml de Água Peptonada Al- frasco ou tubo de enriquecimento coletar da
calina (APA). A partir dessa primeira diluição película na superfície do meio, onde se con-
(10-1), preparar diluições decimais usando centra a massa de células, uma alçada do ma-
Tampão Fosfato Salina (PBS). Escolher três terial, sem agitar o líquido. Estriar (estrias de
diluições adequadas à contaminação esperada esgotamento) em placas de Ágar Tiossulfato
e inocular 3x1 ml de cada diluição em séries Citrato Bile Sacarose (TCBS). Incubar as pla-
de três tubos com 9 ml de APA por diluição. cas de TCBS a 35±2 ºC/18-24h.
Inocular mais de três diluições se não for pos- Nota b.1) Para aumentar a probabilidade de isolamento
sível estimar a contaminação esperada. de V. cholerae, pode ser incluído o plaqueamento em
Para a análise de amostras de ostras “in um ou mais meios seletivos adicionais, como o Ágar
Celobiose Polimixina Colistina Modificado (m-CPC)
natura”, homogeneizar o conteúdo de 10 a
(incubado a 40±2 ºC), o Ágar Celobiose Colistina
12 organismos com Tampão Fosfato Salina (CC) (incubado a 40±2 ºC) ou o CHROMagar Vibrio
(PBS), na quantidade necessária para dilui- (incubado a 35±2 ºC).
ção 1:2 (peso/peso). Preparar a diluição 10-1
c) Confirmação preliminar. Selecionar para a
adicionando 2 ml da diluição 1:2 em 8 ml
confirmação três ou mais colônias típicas de
de APA. Preparar as diluições subsequentes
cada placa. Em TCBS as colônias de V. cho-
usando PBS. Escolher três diluições ade-
lerae são grandes (2-3mm), lisas, amarelas,
quadas à contaminação esperada e inocular
planas com centro opaco e bordas translúci-
3x1 ml de cada diluição em séries de três
das. Em m-CPC e CC são pequenas (1mm), li-
tubos com 9 ml de APA por diluição. Inocu-
sas, opacas, verdes a roxas e desenvolvem um
lar mais de três diluições se não for possível
fundo roxo se a incubação for prolongada. No
estimar a contaminação esperada.
CHROMagar Vibrio são pequenas, lisas, opa-
Nota a2.1) Para aumentar a sensibilidade do método, po- cas, verde azuladas a turquesa.
de-se iniciar a série de três com a diluição 100, ino-
culando-se 3x2 ml da diluição 1:2 em 3x8 ml de APA
Repicar cada colônia em Ágar T1N1 ou Ágar
seguidos de 3x1 ml da 10-1 e 3x1 ml da 10-2 em séries Tripticase Soja (TSA) inclinado e incubar a
de três tubos com 9 ml de APA por diluição (limite de 35±2 ºC/18-24h, para os testes de confirma-
detecção 0,3/g). ção. Submeter as culturas aos seguintes testes
Para a análise de água, preparar diluições se- de confirmação:
riadas em PBS e escolher três diluições ade- c1) Teste de crescimento na presença/ausên-
quadas à contaminação esperada para inocu- cia de NaCl. A partir dos tubos de T1N1
lação. Inocular 3x1 ml de cada diluição em ou TSA, inocular cada cultura em tubos de
séries de três tubos com 9 ml de APA por di- Caldo T1N0 e T1N3 (mesma formulação do
luição. Inocular mais de três diluições se não T1N1, sem ágar e com 0 e 3% de NaCl, res-
for possível estimar a contaminação esperada. pectivamente). Incubar a 35±2 ºC/18-24h e
Nota a2.2) Para aumentar a sensibilidade do método, po-
observar o crescimento. Cepas de V. chole-
de-se iniciar a série de três inoculando-se 3x10 ml da rae e V. mimicus vão crescer na ausência de
amostra em 3x1 ml de APA 10 vezes concentrado. Ou NaCl (T1N0).
ainda 3x100 ml da amostra em 3x10 ml de APA 10 c2) Teste do fio (“string test”). Transferir uma
vezes concentrado.
gota de solução de desoxicolato de sódio
Incubar todos os tubos a 42±1 ºC/6-8h e, no caso 0,5% para uma lâmina de vidro limpa e
de alimentos processados ou com população espe- seca. A partir da cultura em T1N1 ou TSA,

transferir uma alçada com inóculo pesado de pontos de aglutinação, movimentando a

da cultura para a gota de desoxicolato de só- lâmina em cuidadosos movimentos de incli-
dio e emulsionar bem. Em aproximadamen- nação e rotação, por um minuto. As cepas
te um minuto, as cepas de V. cholerae for- de V. cholerae desses sorotipos dão reação
mam uma massa de material viscoso, que se fortemente positiva com o respectivo an-
estica quando puxado para cima com a alça, ti-soro. Cepas não aglutinantes podem ser
formando um fio que pode atingir 2-3cm de V.cholerae não O1/O139.
comprimento, antes de romper-se (lise das c5) Diferenciação dos subtipos somáticos Ina-
células e liberação do DNA). ba/Ogawa/Ikojima. Para as culturas identifi-
c3) Teste de oxidase. Colocar um disco ou fita cadas com V. cholerae O1 nos testes soroló-
de papel de filtro no interior de uma placa de gicos e bioquímicos, realizar o teste de aglu-
Petri e embeber o centro do papel com o rea- tinação com os anti-soros Inaba e Ogawa,
gente de Kovacs para teste de oxidase (solu- da mesma forma descrita para o O1 e O139.
ção aquosa 1% de cloridrato de N,N,N,N-te- Cepas do subtipo Inaba e Ogawa aglutinam
trametil-p-fenilenodiamina). Com uma alça com os respectivos anti-soros. Cepas do
de platina ou palitos estéreis, remover uma subtipo Ikojima aglutinam com ambos.
pequena quantidade da cultura em T1N1 ou d) Confirmação definitiva. Submeter à confirma-
TSA e espalhar sobre o reagente no papel, ção definitiva as culturas oxidase positivas, com
observando se ocorre o desenvolvimento de teste do fio e teste de aglutinação O1 ou O139 po-
uma cor azul intensa, em aproximadamen- sitivos. Repicar cada cultura em um novo tubo de
te 10 segundos (teste positivo). O não de- Ágar T1N1 inclinado, incubar a 35±2 ºC/18-24h
senvolvimento da cor azul no intervalo de e utilizar a cultura de 24h para a realização das
um minuto indica teste negativo. As cepas provas bioquímicas de confirmação.
de V. cholerae são oxidase positivas. Não Para a realização das provas bioquímicas, uti-
devem ser utilizadas alças de níquel-cromo lizar o “kit”de identificação API 20E (BioMé-
na transferência do inóculo para o teste de rieux), seguindo a orientação do fabricante.
oxidase. Não considerar qualquer alteração
Nota d1) Há cepas de V. cholerae não aglutinantes com
da cor do reagente após um minuto de con- os anti-soros O1/139 (NAG), que apresentam todas
tato com a cultura. as demais reações típicas da espécie. Essas cepas,
c4) Teste de aglutinação com os anti-soros O1 embora não provoquem cólera, também podem ser
e O139. Com um lápis de ponta hidrofóbi- submetidas à confirmação, para determinar se perten-
cem à espécie.
ca, demarcar três retângulos de aproxima-
damente 2x3cm em uma lâmina de vidro e) Interpretação dos resultados. Considerar
ou placa de Petri e, a cada área demarcada, como V.cholerae as culturas com todas as ca-
adicionar uma gota de solução salina 0,85% racterísticas morfológicas e bioquímicas típi-
aquosa estéril. Transferir uma alçada da cul- cas da espécie, incluindo as não aglutinantes
tura em T1N1 ou TSA para uma das áreas (NAG) com os anti-soros O1 ou O139.
demarcadas e emulsionar bem. Repetir esse Considerar como V.cholerae O1 ou O139 as cul-
procedimento nas outras áreas demarcadas turas com todas as características morfológicas
e observar se ocorre auto-aglutinação. Em e bioquímicas típicas da espécie e que aglutina-
caso negativo, adicionar a uma das áreas ram com os anti-soros O1 ou O139. Na investi-
demarcadas uma gota do anti-soro somático gação de alimentos suspeitos de envolvimento
O1 polivalente e emulsionar. A uma das ou- na transmissão de cólera, essas cepas devem ser
tras áreas, adicionar uma gota do anti-soro enviadas a um laboratório oficial de saúde públi-
somático O139 e emulsionar. Sobre um fun- ca, para verificação da enterotoxigenicidade.
do escuro iluminado, observar a formação Para o cálculo dos resultados dos ensaios

quantitativos, anotar o número de tubos confir- cuidados envolvidos na contagem de microrganis-

mados e determinar o Número Mais Provável mos pelo NMP, da seleção das diluições ao cálcu-
(NMP)/g ou ml conforme a orientação do Ca- lo dos resultados. O procedimento descrito abaixo
pítulo 4, usando uma das tabelas de NMP. não apresenta esses detalhes, pressupondo que se-
jam conhecidos pelo analista.
20.3. Métodos a) Enriquecimento

a1) Teste de presença/ausência. Seguindo as
APHA 40.62/40.63:2015 orientações do Capítulo 2, homogeneizar 25g
para presença/ausência ou da amostra com 225 ml de Água Peptonada
NMP de V. parahaemolyticus Alcalina (APA). Incubar a 35±2 ºC/18-24h.
e V. vulnificus Para a análise de água pode-se inocular 100
ml da amostra em 10 ml de APA 10 vezes
Métodos da American Public Health Association concentrado ou um litro da amostras em 100
(APHA), descritos na 5ª edição do Compendium ml de APA 10 vezes concentrado. Incubar a
of Methods for the Microbiological Examination 35±2 ºC/18-24h.
of Foods (De Paola & Jones, 2015). Aplicam-se à a2) Determinação do NMP. Seguindo as orien-
análise de alimentos e água. tações do Capítulo 2, homogeneizar 25g da
A estocagem das amostras e os cuidados na rea- amostra com 225 ml de Água Peptonada Al-
lização dos ensaios são os mesmos descritos para calina (APA). A partir dessa primeira diluição
V. cholerae. (10-1), preparar diluições decimais usando
Tampão Fosfato Salina (PBS). Escolher três
20.3.1. Material requerido para a diluições adequadas à contaminação esperada
análise e inocular 3x1 ml de cada diluição em séries
de três tubos com 9 ml de APA por diluição.
□ Tampão Fosfato Salina (PBS) Inocular mais de três diluições se não for pos-
□ Água Peptonada Alcalina (APA) sível estimar a contaminação esperada.
□ Placas de Ágar Tiossulfato Citrato Bile Saca-
Nota a2.1) Para aumentar a sensibilidade do método,
rose (TCBS) ou CHROMagar Vibrio para
pode-se iniciar a série inoculando-se 3x10 ml da di-
V. parahaemolyticus luição 10-1 em 3x1 ml de APA 10 vezes concentrado.
□ Placas de CHROMagar Vibrio ou Ágar
Celobiose Polimixina Colistina Modificado Para a análise de amostras de ostras “in
(m-CPC) ou Ágar Celobiose Colistina (CC) natura”, homogeneizar o conteúdo de 10 a
□ Ágar T1N1 ou Tripticase Soja (TSA) suple- 12 organismos com Tampão Fosfato Salina
mentado com 2% de NaCl (PBS), na quantidade necessária para dilui-
□ “Kit” API 20E (BioMérieux) e Solução de ção 1:2 (peso/peso). Preparar a diluição 10-1
NaCl 2% estéril adicionando 2 ml da diluição 1:2 em 8 ml
□ Estufa incubadora a 35±2 ºC de APA. Preparar as diluições subsequentes
□ Estufa incubadora a 40±2 ºC (opcional) usando PBS. Escolher três diluições ade-
quadas à contaminação esperada e inocular
3x1 ml de cada diluição em séries de três
tubos com 9 ml de APA por diluição. Inocu-
O esquema da análise de V. parahaemolyticus e V. lar mais de três diluições se não for possível
vulnificus pelos métodos APHA 40.62/40.63:2015 estimar a contaminação esperada.
encontra-se descrito na Figura 20.2. Antes de ini-
Nota a2.2) Para aumentar a sensibilidade do método, po-
ciar as atividades, ler atentamente as orientações de-se iniciar a série de três com a diluição 100, ino-
do Capítulo 4, que apresenta todos os detalhes e culando-se 3x2 ml da diluição 1:2 em 3x8 ml de APA

Figura 20.2. Esquema da análise de V. parahaemolyticus e V. vulnificus pelos métodos APHA 40.62/40.63:2015
(De Paola & Jones, 2015).

seguidos de 3x1 ml da 10-1 e 3x1 ml da 10-2 em séries c) Confirmação. Selecionar para a confirmação
de três tubos com 9 ml de APA por diluição (limite de três ou mais colônias típicas de cada placa.
detecção 0,3/g).
Use as placas de TCBS ou CHROMagar para
Para a análise de água, preparar diluições
isolar colônias presuntivas de V. parahaemoly-
seriadas em PBS e escolher três diluições
ticus. Em TCBS colônias grandes (2-3mm),
adequadas à contaminação esperada para
verdes ou azuladas, redondas e opacas. V. vul-
inoculação. Inocular 3x1 ml de cada dilui-
nificus também cresce produzindo colônias
ção em séries de três tubos com 9 ml de APA
semelhantes. Em CHROMagar colônias gran-
por diluição. Inocular mais de três diluições
des, redondas e opacas, de cor malva ou roxa.
se não for possível estimar a contaminação
Use as placas de CHROMagar, mCPC ou CC
esperada.
para isolar colônias presuntivas de V. vulni-
Nota a2.3) Para aumentar a sensibilidade do método, po- ficus. Em CHROMagar colônias pequenas,
de-se iniciar a série de três inoculando-se 3x10 ml da
lisas, opacas, de cor verde azulada ou tur-
amostra em 3x1 ml de APA 10 vezes concentrado,
ou, ainda, 3x100 ml da amostra em 3x10 ml de APA quesa. Em mCPC ou CC colônias planas, re-
10 vezes concentrado. dondas, 1-2mm em diâmetro, opacas e de cor
amarela.
Incubar todos os tubos a 35±2 ºC/18-24h.
Repicar cada colônia em Ágar T1N1 ou Ágar
b) Plaqueamento diferencial. A partir de cada
Tripticase de Soja (TSA) suplementado com 2%
frasco ou tubo de APA com crescimento, co-
de NaCl inclinados e incubar a 35±2 ºC/18-24h,
letar da película na superfície do meio, onde
para os testes de confirmação.
se concentra a massa de células, uma alçada
Para a confirmação, utilizar o “kit” API 20E
do material, sem agitar o líquido. Para o isola-
(BioMérieux), seguindo a orientação do fabri-
mento de V. parahaemolyticus estriar (estrias
cante. Para inoculação do API 20E, suspender
de esgotamento) em placas de Ágar Tiossulfa-
a cultura em uma solução de cloreto de sódio
to Citrato Bile Sacarose (TCBS) ou placas de
(NaCl) 2%.
CHROMagar. Para o isolamento de V. vulnifi-
cus, estriar em placas de CHROMagar ou Ágar d) Interpretação dos resultados. Considerar
Celobiose Polimixina Colistina Modificado como V.parahaemolyticus ou V. vulnificus as
(m-CPC) ou Ágar Celobiose Colistina (CC). culturas assim identificadas pelo API 20E.
Incubar as placas nas seguintes condições: Para o cálculo dos resultados dos ensaios
▪ TCBS ou CHROMagar a 35±2 ºC/18-24h. quantitativos, anotar o número de tubos confir-
▪ m-CPC ou CC a 40±2 ºC/18-24h ou, na in- mados e determinar o Número Mais Provável
disponibilidade de uma estufa a essa tempe- (NMP)/g ou ml conforme a orientação do Ca-
ratura, a 35±2 ºC/18-24h. pítulo 4, usando uma das tabelas de NMP.

20.4. Referências
BRENNER, D.J., KRIEG, N.R. & STALEY, J.T. (Eds) Bergey’s tro de Vigilância Epidemiológica - CVE, Secretaria de
Manual of Systematic Bacteriology, 2 nd Ed. Volume 2. Estado da Saúde de São Paulo. Disponível no site <
New York: Springer Science+Business Media Inc., 2005. ftp://ftp.cve.saude.sp.gov.br/doc_tec/hidrica/doc/18V-
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& TORTORELLO, M.L. (eds.), Compendium of Me- INFORME-NET DTA, 2014b. Vibrio parahaemolyticus.
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5 th ed. American Public Health Association, Washing- Paulo: Centro de Vigilância Epidemiológica - CVE,
ton, D. C., 2015. Chapter 40, p.527-573. Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Dispo-
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molyticus in seafood. Applied and Environmental Mi- INFORME-NET DTA, 2014c. Vibrio vulnificus. Manual das
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ICMSF (International Commission on Microbiological Spe- tro de Vigilância Epidemiológica - CVE, Secretaria
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7. Microbiological Testing in Food Safety Manage- < ftp://ftp.cve.saude.sp.gov.br/doc_tec/hidrica/doc/
ment. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New 20Vibrio_vulnificus.pdf >, acesso em 11/05/16.
York (ISBN0-306-47262-7). KRIEG, N.R., HOLT, J.G. Bergey’s Manual of Systematic
INFORME-NET DTA, 2014a. Vibrio cholerae. Manual das Bacteriology, 1 st Ed. Volume 1. Baltimore: Williams &
Doenças Transmitidas por Alimentos. São Paulo: Cen- Wilkins, 1984.

21 Yersinia enterocolitica
Item 21.2.2.a Incluída Nota a.1.
Item 21.2.2.b Reduzido o tempo de tratamento com KOH para 2-3 segundos e prolongado o tempo de incu-
bação do Ágar MacConkey para 24-48h.
Item 21.3 (novo) Incluído método ISO 10273:2003 para presença/ausência presuntiva de Yersinia enterocolitica
patogênica em alimentos.
21.1. Introdução motilidade, produção de acetilmetilcarbinol (tes-

te de VP), atividade de ornitina descarboxilase e
Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuber-
b-galactosidase, produção de indol, utilização do
culosis são bactérias patogênicas cujas doenças
citrato e fermentação de celobiose e rafinose, ex-
transmitidas por alimentos (DTAs) são classifica-
pressadas mais constantemente a 28 ºC.
das pela International Commission on Microbio-
logical Specifications for Foods (ICMSF, 2002) As principais características das onze espécies de
no grupo de risco II, que inclui as doenças “de Yersinia incluídas na 2ª edição do Bergey’s Manu-
sério perigo, não representando ameaça de morte al of Systematic Bacteriology encontram-se des-
e normalmente não deixando sequelas, mas inca- critas no Quadro 21.1, destacando-se as respostas
pacitando por períodos moderados”. obtidas a 25-28 e a 37 ºC. Após a publicação da
2ª edição do Bergey’s, sete novas espécies foram
21.1.1. Taxonomia descritas (Euzéby, 2016).
De acordo com a 2ª edição do Bergey’s Manual ▪ Yersinia aleksiciae Sprague & Neubauer 2005,
of Systematic Bacteriology (Bottone et al., 2005), sp. nov, criada com cinco cepas originalmente
Yersinia é um gênero da família Enterobacteriace- caracterizadas como Y. kristensenii.
ae, definido como bastonetes a cocobacilos Gram ▪ Yersinia similis Sprague et al. 2008, sp. nov.,
negativos anaeróbios facultativos, oxidase negati- criada com seis cepas originalmente caracteri-
vos, catalase positivos e, usualmente, urease e ni- zadas como Y. pseudotuberculosis.
trato redutase positivos. Fermentam a glicose com ▪ Yersinia massiliensis Merhej et al. 2008
pouca ou nenhuma produção de gás e são psicro- emend. Souza et al. 2011, sp. nov., isolada de
tróficos, com temperatura ótima de crescimento água doce na França.
entre 28 e 29 ºC. Apresentam atividade bioquími- ▪ Yersinia entomophaga Hurst et al. 2011, sp.
ca mais ativa a 28 do que a 37 ºC, sendo mais in- nov. isolada da larva do besouro Costelytra ze-
fluenciadas pela temperatura as características de alandica (Coleoptera: Scarabaeidae).

Quadro 21.1. Características das espécies de Yersinia na 2ª edição do Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology (Bottone et al., 2005).
Y. pseudotuberculosis
Y. enterocolitica
Y. frederiksenii
Y. kristensenii
Y. intermedia
Y. bercovieri
Y. mollaretii
Y. aldovae
Y. ruckeri
Y. rohdei
Y. pestis
Característica
Oxidase e Gram - - - - - - - - - - -
Lisina - - - - - - - - - - -
Arginina - - - - - - - - - - -
Ornitina 37 ºC - d [+] + + + + [+] - [-] +
Ornitina 25-28 ºC - + + + + + + + - [+] +
Motilidade 37 ºC - - - - - - - - - - -
Motilidade 25-28 ºC - + + + + + + + + + [+]
Urease 37 ºC - [+] d [+] [+] [+] [+] [-] + d -
Urease 25-28 ºC - + + + + + + + + d -
Fenilalanina deaminase - - - - - - - - - - -
Voges-Proskauer 37 ºC - - - - - - - - - - -
Voges-Proskauer 25-28 ºC - + - + + + - - - - -
Citrato Simmons 37 ºC - - - - [-] - - - - - -
Citrato Simmons 25-28 ºC - d - - d - - - - [+] -
Indol - - - V + + V - - - -
Glicerol 37 ºC d - - + [+] d d [-] d d d
Glicerol 25-28 ºC d + [+] + + + + + + [+] d
Mio-inositol 37 ºC - - - d [-] [-] [-] - - - -
Mio-inositol 25-28 ºC - + d d - [+] d d - - -
Manitol + + + + + + + + + + +
Sorbitol d d + + + + + + - + d
Celobiose - d + + + + + + - - -
Adonitola - - - - - - - - - - -
Melibiose 37 ºC [-] - - - - [+] - - d d -
Melibiose 25-28 ºC d - - - - + - - + d -
Rafinose 37 ºC - - - - d d - - [-] d -
Rafinose 25-28 ºC - - - - - + - - [-] d -
L-rhamnose 37 ºC - - - - + + - - d - -
L-rhamnose 25-28 ºC - + - - + + - - + - -
Sacarose - - + + + + - + - + -
Salicina 37 ºC d - [-] [-] + + [-] [-] [-] - -
Salicina 25-28 ºC [+] + - [-] + + - [-] d - -
D-xilose 37 ºC + d + d + + [+] d + d -
D-xilose 25-28 ºC + + + d + + + + + + -
Mucato 37 ºC - - - - - - - - - - -
Mucato 25-28 ºC - d + - [-] d - + - - -
Hidrólise esculina 37 ºC d - [-] [-] [+] [-] - - + - -
Hidrólise esculina 25-28 ºC + + [+] d + + - [-] + - -
Lipasea - +/- - +/- +/- +/- +/- - - -
Pirazinamidase - - V V + + + - - + +
+ = 90% ou mais cepas são positivas, - = 90% ou mais cepas são negativas, d = 11-89% das cepas são positivas, [+] = 26 a 75% das cepas positivas, [-] = 11 a
25% das cepas positivas, +/- = varia entre as cepas.
a Dados do Bacteriological Analytical Manual (Weagant et al., 2001).

Yersinia enterocolitica □ 343
▪ Yersinia nurmii Murros-Kontiainen et al. flagelares). Vários esquemas de biotipagem fo-

2011a, sp. nov., isolada de carne cozida emba- ram desenvolvidos ao longo dos anos, muitos de-
lada em atmosfera modificada. les ultrapassados. Atualmente o Bergey’s Manual
▪ Yersinia pekkanenii Murros-Kontiainen et al. divide as cepas em seis biotipos, com base nas ca-
2011b, sp. nov., isolada da água, solo e amos- racterísticas fenotípicas descritas no Quadro 21.2.
tras de alface. A biotipagem e a sorotipagem são importantes
▪ Yersinia wautersii Savin et al. 2014, sp. nov., nas investigações epidemiológicas, uma vez que
criada com cepas que originalmente faziam par- nem todos os biotipos ou sorotipos são patogêni-
te do complexo Yersinia pseudotuberculosis. cos. Por esse motivo, é recomendável que todas
Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis podem as cepas isoladas de alimentos suspeitos de envol-
crescer em pH variando de 4,0 a 10,0, geralmente vimento em surtos sejam encaminhadas a um la-
com ótimo em 7,6. Toleram muito bem condições boratório de referência em Yersinia, familiarizado
alcalinas, em comparação com condições ácidas com os esquemas de biotipagem e sorotipagem
(FDA, 2012). correntes. Até o momento, os biotipos mais co-
mumente implicados em surtos de yersiniose são:
Y. enterocolitica é psicrotrófica, podendo crescer
em temperaturas abaixo de 4 ºC. O tempo de ge- ▪ Biotipo 4 do sorotipo 0:3 – infecções gastroin-
ração a 30 ºC é de 34min, a 22 ºC é de uma hora e testinais na Europa, Canadá, África do Sul e,
a 7 ºC é de cinco horas. Resiste ao congelamento mais frequentemente, nos Estados Unidos.
e pode sobreviver por longos períodos em alimen- ▪ Sorotipo O:8 – até hoje o mais frequentemente
tos congelados (FDA, 2012). isolado nos Estados Unidos, mas a frequência
Y. enterocolitica é uma espécie heterogênea, cujas tem diminuído, sendo esporadicamente relata-
cepas podem ser subdivididas em biotipos (com do em outras partes do mundo também.
base em caracteres bioquímicos) e sorotipos (com ▪ Sorotipo O:9 – é o segundo mais comum na
base em características sorológicas somáticas e Europa e Japão.
Quadro 21.2. Diferenciação dos biotipos de Y. enterocolitica (Bottone et al., 2005).

Biotipo
Característica a
1A 1B 2 3 4 5
Atividade de lipase + + - - - -
Salicina ácido + - - - - -
Hidrólise da esculina +/- - - - - -
Xilose ácido + + + + - V
Trehalose ácido + + + + + -
Indol + + V - - -
Ornitina descarboxilase + + + + + + (+)
Voges-Proskauer (VP) + + + + + + (+)
Atividade de pirazinamidase + - - - - -
Sorbose ácido + + + + + -
Inositol ácido + + + + + +
Redução do nitrato + + + + + -
b-Glicosidase b + - - - - -
a Símbolos: + = positivo, - = negativo, (+) = lento, V = variável.

b Dados do Bacteriological Analytical Manual (Weagant et al., 2001)

21.1.2. Epidemiologia tem sido isolada do apêndice doente de humanos.

A transmissão se dá pela via fecal-oral, através da
Três espécies de Yersinia são potencialmente pa-
água e alimentos contaminados, ou por contato
togênicas para o homem: Y. pestis, Y. pseudotu-
com indivíduos ou animais infectados. Y. entero-
berculosis e Y. enterocolitica. A primeira, Y. pestis
colitica tem sido isolada de leite cru, carne (bovi-
é o agente causador da peste bubônica, porém não
na, suína, ovina), pescados, ostras e caranguejos.
é comumente associada com alimentos. Y. entero-
A refrigeração não reduz o risco de transmissão,
colitica e Y. pseudotuberculosis causam gastroen-
porque Y. enterocolitica é psicrotrófica e se mul-
terites (FDA, 2012).
tiplica em alimentos refrigerados (FDA, 2012). A
Yersiniose é o nome atribuído à gastroenterite transmissão hospitalar também tem sido relatada,
veiculada por alimentos e causada por Y. entero- assim como a transmissão em transfusões de san-
colitica e Y. pseudotuberculosis. Caracteriza-se gue, de doadores assintomáticos ou que tiveram
por diarreia aguda e febre (principalmente em gastroenterite leve (Informe-Net DTA, 2003).
crianças pequenas), dor abdominal e linfadeni-
te mesentérica aguda, simulando apendicite (em
crianças mais velhas e adultos). Em alguns casos
podem ocorrer complicações como eritema nodo- métodos de análise
so (em cerca de 10% dos adultos, principalmen- Os métodos de detecção de Yersinia em alimen-
te mulheres), artrite pós-infecciosa (em 50% dos tos são baseados na sua natureza psicrotrófica,
adultos infectados) e infecção sistêmica. Pode que permite o enriquecimento em condições pou-
também ocorrer diarreia sanguinolenta em 10 a co seletivas, com incubação em baixas tempera-
30% das crianças infectadas por Y. enterocolitica turas. Exploram também outras características,
(Informe-Net DTA, 2003). como a resistência a concentrações relativamente
A dose infectiva permanece desconhecida, mas é altas de sais biliares, típica da família Enterobac-
estimada entre 104 e 106 organismos. O período teriaceae e a resistência a certas drogas, como a
de incubação geralmente é de menos de dez dias, cefsulodina, a novobiocina e o irgasan. As cepas
mas ocasionalmente pode levar meses. A duração de Yersinia são mais resistentes às condições alca-
varia de poucos dias a três semanas, a menos que linas do que as demais bactérias Gram negativas,
que se transforme em enterocolite crônica, que característica explorada no tratamento do caldo
pode durar vários meses. Os grupos de maior ris- de enriquecimento com solução de KOH 0,5%,
co são crianças, indivíduos debilitados ou imuno- por curto período de tempo. Os métodos descri-
deprimidos e idosos (FDA, 2012). tos abaixo incluem uma etapa de enriquecimen-
Segundo o Informe-Net DTA (2003), o reservató- to no Caldo Peptona Sorbitol Bile (PSBB), que
rio dessas bactérias são os animais, principalmen- contem sais biliares, para inibir bactérias Gram
te suínos, que carregam Y. enterocolitica na farin- positivas e sorbitol, para favorecer as Gram nega-
ge. Y. pseudotuberculosis é encontrada em várias tivas capazes de utilizar esse açúcar álcool, como
espécies de aves e mamíferos, incluindo-se os é o caso de Yersinia enterocolitica. A incubação
roedores e outros pequenos mamíferos. Ambas as é feita a 10 ºC por dez dias, favorecendo os psi-
espécies são encontradas em suínos, pássaros, es- crotróficos, seguindo-se uma etapa de tratamento
quilos, gatos e cães. De acordo com FDA (2012), com álcali, para eliminar a microbiota acompa-
Y. enterocolitica não faz parte da flora normal nhante não resistente. O isolamento é feito em
humana, mas, tem sido isolada de fezes, feridas, dois meios de cultura, o Ágar MacConkey, de
escarro e linfonodos mesentéricos de seres huma- uso geral para enterobactérias, e o Ágar Cefsu-
nos. Também tem sido encontrada no ambiente, lodina Irgasan Novobiocina (CIN), desenvolvido
como o solo e a água, mas a maioria das cepas iso- especificamente para Yersinia enterocolitica. As
ladas não são patogênicas. Y. pseudotuberculosis colônias típicas desenvolvidas nesses meios são

então selecionadas para a confirmação, através de rhamnose, rafinose, melibiose, salicina, treha-
uma bateria de testes bioquímicos. lose e xilose
□ Ágar Citrato de Simmons
□ Ágar Pirazinamidase
21.2. Método APHA 41:2015 □ Glicerol estéril
para presença/ausência de □ Reagente de Kovacs para teste de oxidase
Yersinia enterocolitica em □ Solução de cloreto férrico 10%
□ Reagente de Kovacs para teste de indol
alimentos
□ Reagentes de VP para teste de Voges Proskauer
Método da American Public Health Association (solução a-naftol 5%, solução KOH 40%, cris-
(APHA), descrito no Capítulo 41 da 5ª edição do tais de creatina)
Compendium of Methods for the Microbiological □ Reagente de beta-glicosidase (b-D-glicopira-
Examination of Foods (Ceylan, 2015). nosídeo)
□ Solução de sulfato ferroso amoniacal 1%
21.2.1 Material requerido para a aquosa (recém preparada)
□ Estufa incubadora a 35-37 ºC
análise
Enriquecimento e plaqueamento diferencial 21.2.2. Procedimento
□ Caldo Peptona Sorbitol Bile (PSBB)
□ Solução de hidróxido de potássio salina 0,5% O esquema da análise de Yersinia enterocolitica
(recém preparada) pelo método da APHA 41:2015 (Ceylan, 2015)
□ Placas de Ágar Cefsulodina Irgasan Novobio- encontra-se descrito na Figura 21.1. Antes de ini-
cina (CIN) ciar as atividades, ler atentamente as orientações
□ Placas de Ágar MacConkey do Capítulo 5, que apresenta todos os detalhes e
□ Estufa incubadora ajustada a 10 ºC cuidados envolvidos na detecção da presença/au-
□ Estufa incubadora ajustada a 30 ºC sência de microrganismos. O procedimento des-
Confirmação preliminar crito abaixo não apresenta esses detalhes, pressu-
□ Tubos de Ágar Lisina Arginina Ferro (LAIA) pondo que sejam conhecidos pelo analista.
□ Tubos de Ágar Uréia de Christensen Os alimentos destinados à detecção de Y. entero-
□ Tubos ou placas de Ágar Bile Esculina colitica devem ser transportados e estocados sob
□ Estufa incubadora ajustada a 22-26 ºC refrigeração, não devendo ser congelados. A re-
Confirmação definitiva frigeração não deve ser prolongada porque outras
□ Ágar Gema de Ovo Anaeróbico (AEY) bactérias psicrotróficas também podem se multi-
□ Caldo Infusão de Vitela plicar, dificultando o isolamento de Yersinia.
□ Caldo Descarboxilase de Falkow com 0,5% de Cuidado. Y. enterocolitica é altamente infectiva
L-Lisina e a detecção em alimentos deve ser conduzida por
□ Caldo Descarboxilase de Falkow com 0,5% de pessoal bem treinado, para garantir a segurança do
L-Ornitina analista e do laboratório. Recomenda-se que todo
□ Caldo Descarboxilase de Falkow com 0,5% de o manuseio de amostras suspeitas e de meios de
L-Arginina cultura seja feito sobre bandejas e não diretamente
□ Ágar Fenilalanina Deaminase sobre as bancadas. Que nenhuma coleta de líquido
□ Meio Teste de Motilidade seja feita com a boca e sim com pipetadores e que,
□ Caldo Triptona 1% ao se trabalhar em capela de fluxo laminar, seja
□ Caldo VM-VP utilizado um modelo vertical, adequado ao manu-
□ Caldo Púrpura Base com 0,5% de manitol, sor- seio de patógenos. Que se mantenha ao alcance
bitol, celobiose, adonitol, inositol, sacarose, das mãos um frasco de desinfetante como solução

Figura 21.1. Esquema da análise de Yersinia enterocolitica pelo método de presença/ausência da APHA 41:2015
(Ceylan, 2015).

de cloro a 100ppm ou solução de álcool iodado, duz colônias pequenas (1-2mm em diâmetro),
para descontaminar qualquer descarga inadverti- planas, incolores ou levemente rosadas. No
da de material contaminado. Que todo o descarte Ágar CIN as colônias são pequenas (1-2mm),
de material seja precedido da descontaminação com centro vermelho-escuro e rodeadas por
em autoclave a 121 ºC/30min. Na preparação e uma borda lisa incolor. Com o auxílio de uma
homogeneização das amostras para a análise, é agulha de inoculação, remover uma porção da
particularmente importante que se tomem precau- massa de células, do centro da colônia típica e
ções para evitar a inalação das células de Yersinia inocular os meios teste de confirmação preli-
eventualmente presentes. Para tanto, recomen- minar, utilizando a mesma alçada para todos
da-se que a homogeneização seja feita preferen- os meios. Não é necessário nem recomendável
cialmente em “stomacher”, que reduz o risco de flambar a agulha e retirar outra porção da colô-
formação de aerossóis e que, na homogeneização nia, entre um meio e outro.
em liquidificador, a tampa do copo seja protegida c.1) Teste de crescimento em Ágar Lisina Ar-
por papel amarrado com barbante, aguardando-se ginina Ferro (LAIA). Inocular cada colônia
a acomodação do material homogeneizado antes típica em um tubo de LAIA inclinado, por
da abertura do frasco. picada e estrias na rampa. Incubar os tubos
a) Enriquecimento a 22-26 ºC/48h, com as tampas afrouxadas
Seguindo as orientações do Capítulo 2, homo- e observar as características de crescimento.
geneizar 25g da amostra com 225 ml de Caldo As cepas de Y. enterocolitica vão apresen-
Peptona Sorbitol Bile (PSBB). Incubar o caldo tar rampa alcalina (vermelha), fundo ácido
a 10 ºC/10 dias. (amarelo), nenhuma produção de gás e não
Nota a.1) Se houver suspeita de uma contaminação alta produção de H2S (ausência de precipitado
por Yersinia o procedimento descrito no item b pode preto no meio de cultura).
ser aplicado antes de incubar o Caldo PSBB, bem
como depois. c.2) Teste de urease. Inocular cada colônia tí-
pica em um tubo de Ágar Uréia de Chris-
b) Tratamento com KOH e plaqueamento di-
tensen inclinado e incubar a 22-26 ºC/48h.
ferencial
A ocorrência de viragem alcalina na rampa,
Transferir uma alçada da cultura obtida em
de rosa claro ou pêssego para rosa escuro,
PSBB para 0,1 ml de solução de hidróxido de
indica resultado positivo. Permanência do
potássio salina 0,5% (solução 0,5% de KOH,
meio na cor original indica resultado nega-
preparada usando solução aquosa 0,5% de
tivo. As cepas de Y. enterocolitica são ure-
NaCl como solvente). Agitar bem por 2-3 se-
ase positivas.
gundos e estriar (estrias de esgotamento) uma
alçada do material no Ágar Cefsulodina Irgasan c.3) Teste de crescimento em Ágar Bile Esculi-
Novobiocina (CIN) e uma alçada no Ágar Mac- na. Inocular cada colônia típica em um tubo
Conkey. Repetir esse procedimento transferin- ou placa de Ágar Bile Esculina (picada) e
do 0,1 ml da cultura para 1 ml de uma solução incubar a 22-26 ºC/48h. Crescimento indica
aquosa 0,5% de NaCl por 10 segundos e es- resistência à bile e escurecimento do ágar
triando o material nos mesmos meios. Incubar indica hidrólise da esculina. As cepas de Y.
as placas de Ágar MacConkey a 30 ºC/24-48h e enterocolitica crescem na presença de bile e
as placas de Ágar CIN 30 ºC/24h. podem hidrolisar ou não a esculina.
c) Confirmação preliminar d) Confirmação definitiva
Selecionar duas ou mais colônias típicas de Submeter à confirmação definitiva as cultu-
cada placa, para os testes de confirmação. No ras urease positivas, com reações típicas em
Ágar MacConkey, descartar todas as colônias LAIA e, preferencialmente, que não hidroli-
vermelhas ou mucóides; Y. enterocolitica pro- zam a esculina.

d.1) Reação de lipase. Utilizar a cultura obtida deve ser feito três a quatro horas antes do uso
em LAIA para inocular (estrias de esgotamen- e todo o volume descongelado não utilizado
to) uma placa de Ágar Gema de Ovo Anaeró- deve ser descartado.
bico (AEY) e incubar a placa a 22-26 ºC d.3) Teste de descarboxilação da lisina, orni-
por dois a cinco dias. Verificar a reação de li- tina e arginina. Inocular a cultura em Caldo
pase, indicada pelo desenvolvimento de co- Descarboxilase de Falkow suplementado
lônias oleosas e iridescentes como pérolas, com 0,5% do aminoácido a ser testado. Co-
rodeadas por um anel de precipitação e por brir a superfície do caldo com óleo mineral
uma zona clara e transparente, mais externa. estéril e incubar a 22-26 ºC/72h. Observar
Se estiver pura, utilizar a cultura em AEY a ocorrência de viragem ácida do indicador
para coloração de Gram e inoculação dos (cor amarela), indicativa de teste negativo
demais meios testes de confirmação abaixo. ou não (teste positivo).
Nota d.1. Plasmídios relacionados à virulência de d.4) Teste de fenilalanina deaminase. Inocular
Yersinia são facilmente perdidos nos repiques da a cultura em Ágar Fenilalanina Deaminase
cultura. Por esse motivo, é importante preservar as
cepas suspeitas nessa etapa do ensaio, para eventu-
e incubar 22-26 ºC/72h. Adicionar à cultura
ais testes posteriores de patogenicidade. Para tanto, na rampa, duas ou três gotas de solução de
inocular também um tubo de Caldo Infusão de Vi- cloreto férrico 10%. O desenvolvimento de
tela, a partir da cultura em AEY, e incubar a 22-26 uma cor verde indica teste positivo.
ºC/48h. Após a incubação, adicionar glicerol estéril
ao caldo, na quantidade necessária para concentra- d.5) Teste de motilidade a 22-26 e 35-37 ºC.
ção final 10%. Congelar imediatamente, preferen- Inocular a cultura em dois tubos de Meio
cialmente a 70 ºC negativos. Teste de Motilidade, com uma agulha de
inoculação (não utilizar alça para esse tes-
d.2) Teste de oxidase. Colocar um disco ou fita
te). Incubar um tubo a 22-26 ºC/72h e o
de papel de filtro no interior de uma placa de
outro a 35-37 ºC/24h, observando se houve
Petri e embeber o centro do papel com o rea-
migração de células para regiões fora da li-
gente de Kovacs para teste de oxidase (solu-
nha de inoculação (motilidade positiva), ou
ção aquosa 1% de cloridrato de N,N,N,N-te-
se o crescimento restringiu-se à região da
trametil-p-fenilenodiamina). De preferência,
picada (motilidade negativa).
utilizar discos ou tiras impregnados com o
reagente, disponíveis comercialmente. Com d.6) Teste de indol. Inocular a cultura em Caldo
uma alça de platina ou palitos estéreis (não Triptona 1% e incubar a 22-26 ºC/72h. Adi-
utilizar alças de níquel-cromo), remover cionar cinco gotas do reagente de Kovacs a
uma pequena quantidade da cultura e espa- cada 4 ml de cultura e agitar levemente. Ob-
lhar sobre o reagente no papel, observando servar se há desenvolvimento de um anel ver-
se ocorre o desenvolvimento de uma cor azul melho-violeta na superfície do meio de cultu-
intensa, em aproximadamente 10 segundos ra (teste positivo) ou se o anel permanece na
(teste positivo). O não-desenvolvimento da cor amarela do reagente (teste negativo).
cor azul no intervalo de um minuto indica d.7) Teste de Voges-Proskauer (VP). Inocular
teste negativo. Não considerar qualquer alte- a cultura em um tubo de Caldo VM-VP e
ração da cor do reagente após um minuto de incubar a 22-26 ºC/48h. Para o teste de VP,
contato com a cultura. O reagente de Kovacs transferir assepticamente 1 ml da cultura
é instável, devendo ser preparado no dia do para um tubo de ensaio, adicionar os rea-
uso. Havendo interesse em estocar, deve-se gentes de VP, na seguinte ordem: 0,6 ml de
distribuir porções de 1-2 ml em frascos es- solução de a-naftol 5% e agitar. Em segui-
curos e manter sob congelamento (-20 ºC) da 0,2 ml de solução de KOH 40%, agitar
até o momento do uso. O descongelamento e adicionar uma pitada leve de cristais de

creatina, para acelerar a reação. Deixar des- pirazinóico, formado por ação da enzima pi-
cansar e observar periodicamente, por até razinamidase (teste positivo). O não desen-
quatro horas, o desenvolvimento de uma cor volvimento da cor rosa indica teste negativo.
vermelha ou rósea no meio de cultura (teste d.12) Teste de de autoaglutinação. Inocular a
positivo). A permanência do meio na cor do cultura em dois tubos de Caldo VM-VP. In-
reagente (amarelada ou ligeiramente esver- cubar um tubo a 22-26 ºC/24h (pode ser o
deada) indica teste negativo. mesmo tubo usado no teste de VP) e o outro
d.8) Testes de fermentação de carboidratos. Ino- a 35-37 ºC/24h. As culturas presuntivas para
cular uma alçada de cada cultura em tubos presença de plasmídios virulentos vão apre-
de Caldo Púrpura Base suplementados com sentar as seguintes características: No tubo
0,5% dos seguintes carboidratos: manitol, incubado a 22-26 ºC, apenas turvação nor-
sorbitol, celobiose, adonitol, inositol, saca- mal de todo o caldo, decorrente do cresci-
rose, rhamnose, rafinose, melibiose, salicina, mento. No tubo incubado a 35-37 ºC, aglu-
trehalose e xilose. Incubar a 22-26 ºC/72h e tinação das células nas paredes ou no fundo
observar se ocorre produção de ácido, com do tubo e sobrenadante claro, sem turvação.
viragem da cor do meio de roxo para amarelo Qualquer outra combinação de resultados
(teste positivo), ou se o meio permanece na nesses dois tubos é considerada negativa
cor roxa original (teste negativo). para a presença de plasmídios virulentos.
d.9) Teste de citrato. Inocular uma alçada com e) Interpretação dos resultados
inóculo leve de cada cultura na rampa de tu- As cepas de Yersinia são bastonetes Gram ne-
bos de Ágar Citrato de Simmons e incubar a gativos oxidase negativos. Utilizar os Quadros
22-26 ºC/72h. Observar se há ocorrência de 21.1 e 21.2 para determinar a espécie e o bioti-
crescimento com viragem alcalina do indi- po das cepas submetidas à confirmação.
cador, alterando a cor do meio de verde para
azul (teste positivo), ou não crescimento e
não alteração de cor (teste negativo). 21.3. Método ISO 10273:2003
d.10) Teste de beta-glicosidase. Preparar o re-
agente de beta-glicosidase adicionando 0,1g
para presença/ausência
de 4-nitrofenil-b-D-glicopiranosídeo em de Yersinia enterocolitica
100 ml de solução aquosa 0,666M de fos- patogênica presuntiva em
fato monossódico (NaH2PO4) pH 6,0. Dis- alimentos
solver e esterilizar por filtração. Emulsionar
uma alçada da cultura em salina fisiológi- Método da International Organization for Stan-
ca e ajustar para três na escala McFarland. dardization, aplica-se a alimentos de consumo hu-
Adicionar 0,75 ml dessa suspensão a 0,25 mano, rações animais e ambiente de fabricação e
ml do reagente e incubar a 30 ºC uma noi- manipulação de alimentos.
te. Observar o desenvolvimento de uma cor
amarela (teste positivo) no meio de cultura
21.3.1 Material requerido para a
ou não (teste negativo).
análise
d.11) Teste de pirazinamidase. Inocular uma
alçada na rampa do Ágar Pirazinamidase Enriquecimento e plaqueamento diferencial
e incubar a 22-26 ºC/72h. Adicionar sobre □ Caldo Peptona Sorbitol Bile (PSBB)
a rampa 1 ml de solução de sulfato ferroso □ Caldo Irgasan Ticarcilina Clorato (ITC)
amoniacal 1% aquosa (recém preparada) e □ Solução de Hidróxido de Potássio Salina 0,5%
observar. O desenvolvimento de uma cor rosa □ Ágar Cefsulodina Irgasan Novobiocina (CIN)
em 15min é indicativa da presença de ácido □ Ágar Salmonella-Shigella Desoxicolato (SSDC)

Figura 21.2. Esquema da análise de Yersinia enterocolitica patogênica presuntiva pelo

método de presença/ausência da ISO 10273:2003.

Screening medidas regulatórias do país deve ser verificada

□ Ágar Nutriente (NA) antes do uso.
□ Caldo Infusão de Vitela Recomendações da ISO 10273:2003 para o
□ Glicerol estéril transporte e estocagem de amostras: As amos-
□ Caldo Uréia de Rustigian & Stuart tras não devem sofrer alteração durante o trans-
□ Ágar Kligler Ferro (KIA) porte e estocagem. Congelamento não é recomen-
□ Reagente de Kovacs para Teste de Indol dado. Resfriamento não deve ser prolongado de-
□ Reagente de Kovacs para Teste de Oxidase vido à outras bactérias psicrotróficas que podem
Confirmação bioquímica e biotipagem vir a multiplicar-se e dificultar o posterior isola-
□ Caldo Descarboxilase 0,5% Aminoácido (lisi- mento de Yersinia.
na e ornitina) a) Enriquecimento
□ Caldo Vermelho de Fenol 1% Carboidratos Seguindo as orientações do Capítulo 2, homo-
(sacarose, rhamnose, trehalose e xilose). geneizar m gramas da amostra com 9m mili-
□ Vaselina liquida, parafina ou óleo mineral estéril litros de Caldo Peptona Sorbitol Bile (PSBB)
□ Ágar Citrato de Simmons (diluição 10-1). Homogeneizar uma segunda
□ Ágar Pirazinamidase porção de m gramas da amostra com 90m mi-
□ Ágar Tween Esterase lilitros de Caldo Irgasan Ticarcilina Clorato
Testes de patogenicidade presuntiva (ITC) (diluição 10-2).
□ Ágar Bile Esculina Incubar o Caldo PSBB a 22-25 ºC por 48 a 72h
□ Ágar Pirazinamidase com agitação ou cinco dias sem agitação.
□ Ágar Tripticase de Soja (TSA) Incubar o Caldo ITC 25±1 ºC/48h.
□ Ágar Tripticase de Soja (TSA) com Magnésio
b) Tratamento com KOH e plaqueamento di-
e Oxalato
ferencial
□ Solução de 1% de Sulfato Ferroso Amoniacal
Estriar (estrias de esgotamento) uma alçada
Incubação do Caldo PSBB em Ágar Cefsulodina Irgasan
□ Estufa incubadora regulada a 25±1 ºC Novobiocina (CIN).
□ Estufa incubadora regulada a 30±1 ºC Estriar (estrias de esgotamento) uma alçada do
□ Estufa incubadora regulada a 37±1 ºC Caldo ITC em Ágar Salmonella-Shigella De-
soxicolato (SSDC).
21.3.2. Procedimento Transferir 0,5 ml do Caldo PSBB para 4,5 ml de
solução de hidróxido de potássio salina 0,5%.
O esquema da análise de Yersinia enterocoli- Agitar bem e, após 20±5 segundos estriar (es-
tica patogênica presuntiva pelo método ISO trias de esgotamento) uma alçada do material no
10273:2003 encontra-se descrito na Figura 21.2. Ágar Cefsulodina Irgasan Novobiocina (CIN).
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as Incubar todas as placas, invertidas, a 30±1 ºC
orientações do Capítulo 5, que apresenta todos os por 24-48h.
detalhes e cuidados envolvidos na detecção da c) Confirmação preliminar
presença/ausência de microrganismos. O proce- Após 24h de incubação verifique a presença de
dimento descrito abaixo não apresenta esses de- colônias típicas de Y. enterocolitica nas placas.
talhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo Se não houver colônias típicas ou se o cresci-
analista. mento for escasso ou a cor muito fraca, rein-
Precauções recomendadas pela ISO 10273:2003: cube as placas por 24h adicionais e verifique
Este método pode envolver materiais perigosos e novamente.
deve ser conduzido obedecendo práticas apropria- No Ágar CIN as colônias são pequenas
das de segurança. A necessidade de aplicação de (≤1mm), com um centro vermelho e bordas

transparentes (não iridescentes e com aparên- indica fermentação da glicose; vermelho ou

cia granular sob luz obliqua). sem alteração indica não fermentação da gli-
No Ágar SSDC as colônias são pequenas cose. Escurecimento do fundo indica produ-
(≤1mm), cinzentas, com borda indistinta (não ção de sulfeto de hidrogênio (H2S) e bolhas
iridescentes e com aparência granular sob luz ou rachaduras no ágar indicam formação de
oblíqua). gás. Rampa amarela indica fermentação da
Nota c.1) De acordo com a ISO 10273:2003, a luz oblí- lactose; vermelha ou sem alteração indica
qua ajuda a distinguir as colônias de Y. enterocolitica não fermentação da lactose.
das colônias de Pseudomonas, muito semelhantes.
c.4) Teste de oxidase. Usando uma alça de pla-
Selecione cinco colônias típicas de cada platina ou de plástico descartável, estriar uma
ca para a confirmação preliminar e, se houver porção do material da colônia em um peda-
menos de cinco, selecionar todas. Purificar as ço de papel de filtro umedecido (uma gota)
culturas por estrias de esgotamento em Ágar com o Reagente de Kovacs para Teste de
Nutriente (NA), incubando a 30±1 ºC/24h. Oxidase (não usar alça de níquel cromo por-
Usar as culturas do NA para preservação e reaque interfere no resultado). O desenvolvi-
lização dos testes de confirmação. mento de uma cor azul escura em 10s indica
c.1) Preservação das cepas. Plasmídios rela- teste positivo. Também podem ser usados
cionados à virulência de Yersinia são facil- kits comerciais para prova de oxidase (dis-
mente perdidos nos repiques da cultura. Por cos ou fitas). Neste caso, seguir a orientação
esse motivo, é importante preservar as cepas do fabricante para realização do teste.
suspeitas nessa etapa do ensaio, para even-
tuais testes posteriores de patogenicidade. d) Confirmação bioquímica
Para tanto, inocular um tubo de Caldo In- Selecionar para a confirmação definitiva as
fusão de Vitela, a partir da cultura em NA, culturas oxidase negativas, urease e indol po-
e incubar a 22-25 ºC/24-48h. Após a incu- sitivas, com fundo amarelo e rampa vermelha
bação, adicionar glicerol estéril ao caldo, em KIA, sem gás ou H2S.
na quantidade necessária para concentração Nota d.1) Cepas urease negativas têm sido reportadas,
final 10%. Congelar imediatamente, prefe- mas não reconhecidas como patogênicas.
rencialmente a 70 ºC negativos. Nota d.2) Y. enterocolitica geralmente não produz gás,
c.2) Teste de urease e teste de indol. Inocular mas algumas cepas (como as do biotipo 3) podem
produzir uma ou duas bolhas em KIA (pequena pro-
(inóculo pesado) cada cultura em tubos de
dução de gás).
Caldo Uréia de Rustigian & Stuart e incubar
Nota d.3) Cepas lactose positivas têm sido isoladas, mas
a 30±1 ºC/24h, de preferência em banho-ma- geralmente não patogênicas.
ria. O desenvolvimento de uma cor rósea es-
cura (pink) indica teste positivo. Cor laranja Podem ser usados kits miniaturizados para a
amarelado indica teste negativo. Para realizar identificação, mas vários deles não identificam
o teste de indol, adicionar 0,1 a 0,2 ml do Re- corretamente Y. mollaretii e Y. bercovieri (an-
agente de Kovacs para teste de indol a cada teriormente biotipos 3A e 3B de Y. enterocoli-
0,5 ml de cultura. O desenvolvimento de um tica). Neste caso, o teste de mucato pode ser
anel vermelho na superfície do caldo dentro usado para diferenciar essas espécies.
de 15min indica reação positiva. d.1) Teste de lisina e ornitina descarboxila-
c.3) Teste de crescimento em Ágar Kligler se. Inocular cada cultura em tubos de Cal-
Ferro (KIA). Inocular os tubos de KIA por do Descarboxilase com 0,5% de ornitina e
picada no fundo e estrias na rampa. Incubar tubos de caldo com 0,5% de lisina. Cobrir
a 30±1 ºC/24-48h. Interpretar as mudanças a superfície do meio com 1 ml de vaselina
no meio da seguinte forma: Fundo amarelo liquida, parafina ou óleo mineral estéril. In-

cubar a 30±1 ºC/24h. Turvação e viragem e.1) Teste de hidrólise da esculina: Inocular
do meio para roxo indicam teste positivo. cada cultura em tubos de Ágar Bile Esculina,
Viragem para amarelo indica teste negativo. por estrias na rampa. Incubar a 30±1 ºC/24h.
d.2) Teste de fermentação de carboidratos. Inocu- O desenvolvimento de um halo preto em re-
lar cada cultura em tubos de Caldo Vermelho dor das colônias indica teste positivo.
de Fenol-Carboidratos contendo 1% de saca- Nota e.1.1) Este teste é equivalente ao de fermentação
rose, 1% de rhamnose, 1% de trehalose e 1% da salicina.
de xilose. Incubar a 30±1 ºC/24h. Viragem do
e.2) Teste de pirazinamidase: Inocular cada
meio para amarelo indica teste positivo. Vira-
cultura em tubos de Ágar Pirazinamidase,
gem para vermelho indica teste negativo.
estriando uma área grande da rampa. Incu-
d.3) Teste de citrato. Inocular cada cultura em bar os tubos a 30±1 ºC/48h. Adicionar aos
tubos de Ágar Citrato de Simmons, por es- tubos 1 ml de uma Solução de 1% de Sulfato
trias na rampa. Incubar a 30±1 ºC/24h. Vira- Ferroso Amoniacal e observar o desenvol-
gem para azul indica teste positivo. vimento de uma cor rósea amarronzada em
d.4) Teste de tween esterase. Inocular cada 15min, indicativa de teste positivo.
cultura em tubos de Ágar Tween Esterase, e.3) Teste de exigência de cálcio a 37 ºC: Pre-
por estrias na rampa. Incubar a 25±1 ºC por parar uma suspensão de cada cultura em
cinco dias e verificar periodicamente. A for- Solução Salina 0,5% (cerca de 103 UFC/
mação de uma zona opaca (cristais de oleato ml). Inocular (plaqueamento em superfície)
de cálcio) indica teste positivo. duas alíquotas de 0,1 ml dessa suspensão
e) Testes de patogenicidade presuntiva em duas placas de Ágar Tripticase de Soja
Submeter a esses testes as culturas lisina des- (TSA) com Magnésio e Oxalato. Inocular
carboxilase negativas, ornitina descarboxilase duas outras alíquotas de 0,1 ml em duas pla-
positivas, sacarose positivas, rhamnose e citra- cas de Ágar Tripticase de Soja (TSA) (pla-
to negativas. cas de referência, sem magnésio e oxalato).
Incubar uma placa de cada meio a 25±1
Nota e.1) Algumas raras cepas de Y. enterocolitica sacaro-
ºC/48h e as outras duas a 37±1 ºC/48h. A
se negativas têm-se mostrado patogênicas presuntivas.
cultura é considerada cálcio dependente
Note e.2) Cepas ornitina descarboxilase negativas de Y.
enterocolitica biotipos 4 e 5 têm sido relatadas. a 37 ºC quando é parcialmente inibida no
TSA com Magnésio e Oxalato incubado a
Quadro 21.3. Orientação da ISO 10273:2003 para interpretar os testes presuntivos de patogenicidade
de Yersinia enterocolitica.
Resultado de Y. enterocolitica Resultado de Y. enterocolitica
Teste Teste
patogênica presuntiva patogênica presuntiva
Urease + Fermentação da Sacarose +
Indol + ou - a Fermentação da Trehalose + ou - b
Fermentação da glicose (KIA) + Fermentação da Rhamnose + ou - b
Gás (KIA) - Fermentação da Xilose + ou - b
Fermentação da lactose (KIA) - Citrato -
Sulfeto de hidrogênio (H2S) (KIA) - Tween esterase + ou - b
Oxidase - Esculina -
Lisina descarboxilase - Pirazinamidase -
Ornitina descarboxilase + Dependência de cálcio a 37 ºC c +
a Biotipo 1 e vários sorotipos do biotipo 2 são indol positivos. Biotipos 3, 4, 5 e vários sorotipos do biotipo 2 são indol negativos.
b Depende do biotipo de Y. enterocolitica (vide quadro 21.4).
c Patogenicidade transmitida por plasmidio de virulência.

37 ºC (inibição indicada pela ocorrência Os resultados também podem ser usados para
de mais de 20% das colônias de menos de determinar o biotipo isolado (Quadro 21.4). As
0,1mm e as demais não passando de 0,5 a cepas dos biotipos 1B, 2, 3, 4 e 5 são reconhe-
1mm) e não inibida no TSA (com ou sem cidas como patogênicas.
magnésio e oxalato) incubado a 25 ºC (to- Cepas de Y. enterocolitica não dependentes de
das as colônias com tamanho igual). cálcio a 37 ºC e esculina e/ou pirazinamidase
positivas não são reconhecidas como patogêni-
Nota e.3.1) Esta característica pode ser perdida a 37 ºC
porque os genes envolvidos são carreados por plas- cas. Ao contrário, cepas dependentes de cálcio
mídios. Esse teste pode ser substituído pelo de utili- a 37 ºC e esculina e/ou pirazinamidase negati-
zação do acetato de sódio. vas são reconhecidas como patogênicas.
Nas investigações com finalidade epidemio-
f) Interpretação dos resultados lógica deve ser verificado o sorotipo somáti-
As cepas de Y. enterocolitica patogênicas pre- co das cepas isoladas. As cepas patogênicas
suntivas geralmente apresentam os resultados presuntivas geralmente são dos sorotipos O:3,
mostrados no Quadro 21.3. O:8, O:9 e O:5,27.
Quadro 21.4. Os biotipos de Yersinia enterocolitica segundo a ISO 10273:2003.

Biotipo
Característica
1A a 1B 2 3 4 5
Tween esterase + + - - - -
Esculina + - - - - -
Pirazinamidase + - - - - -
Indol + + (+) b - - -
Xilose + + + + - Db
Trehalose + + + + + -
a Não patogênica.
b Geralmente fraca ou lenta.

21.4. Referências
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http://www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/yersi_en- ch/LaboratoryMethods/ucm072633.htm [acesso em
tero.htm [acesso em 30/06/2016]. 30/06/2016].

o
22 Contagem de esporos
de bactérias
Item 22.1.1 (novo) Incluída revisão bibliográfica sobre as características dos esporos bacterianos.
Item 22.2 (revisado) Substituída a versão de 2001 (4ª edição) pela de 2015 (5ª edição) do Compendium, sem
alterações.
alterações.
alterações.
alterações.
alterações.
Item 22.7 (2010) Excluídos métodos APHA (2001) para a detecção ou contagem de Alicyclobacillus.
22.1. Introdução comercialmente estéreis são leite cru, leite em pó,

condimentos, amido, açúcar, frutas, sucos de fru-
Esporos são estruturas de resistência das bactérias tas, vegetais e cereais.
e, uma vez formados, permanecem em estado de
dormência. Ao contrário das células vegetativas,
22.1.1. O esporo bacteriano
não apresentam atividade metabólica, e não se
multiplicam, mas, em condições favoráveis, podem Endosporo é o nome usado quando a estrutura é
germinar e dar origem a novas células vegetativas. formada intracelularmente, antes de ser liberado
Os esporos são resistentes a condições ambientais para o ambiente. Os esporos são formados no fi-
que seriam letais para as células vegetativas. Su- nal da fase de crescimento exponencial e sua for-
portam o congelamento, a desidratação, a irradia- mação pode ser induzida por vários fatores, como
ção, a presença de conservantes, o tratamento com densidade populacional, privação nutricional,
desinfetantes e a exposição a altas temperaturas. temperatura de crescimento, pH do ambiente, dis-
Devido à resistência térmica, são particularmente ponibilidade de oxigênio, presença e concentra-
deletérios nos alimentos submetidos ao proces- ção de sais minerais, carbono e fontes de fósforo
so de esterilização comercial, onde a microbiota (Logan & De Vos, 2009b).
competidora é eliminada pelo calor. Nos ingre- Sequência de formação do esporo. Hilbert & Pi-
dientes desses produtos, devem ser controlados, ggot (2004) avaliaram a formação de esporos re-
porque contagens elevadas aumentam a probabi- sistentes ao calor a partir de células vegetativas de
lidade de sobrevivência e posterior germinação Bacillus subtilis, o que leva cerca de sete horas a
no alimento processado. Os ingredientes mais 37 ºC. Os autores descreveram a sequência básica
comumente utilizados na formulação de produtos de alterações morfológicas durante a esporulação,

que é semelhante para Bacillus e Clostridium. um espaço substancial. Sua forma varia de uma
Fase 0 é a célula vegetativa. Fase I é a formação espécie para outra e sua função é desconhecida.
de um filamento axial da cromatina, com duas có-
Mecanismos de resistência do esporo. Nichol-
pias do cromossomo. Fase II é a divisão celular
son et al. (2000) fizeram uma revisão sobre os
assimétrica, para formar uma célula maior (célula
mecanismos de resistência dos esporos, que ainda
mãe ou esporângio) e uma célula menor (pres-
não são bem compreendidos. A genética é extre-
poro ou foresporo). Fase III é engolfamento do
mamente importante para a resistência ao calor: os
presporo pela célula mãe. Fase IV é a formação
esporos de termófilos são mais resistentes do que
do córtex, com duas camadas de peptidoglicano
os esporos de mesófilos, que por sua vez são mais
em torno da presporo, e a formação da parede das
resistentes do que os esporos de psicrófilos. As
células germinativas primordiais (que irão formar
condições de esporulação também têm um efeito
a camada de peptidoglicano de uma nova célula
significativo, particularmente a temperatura, uma
após a germinação). Fase V é a construção da
vez que esporulação a uma elevada temperatura
capa, uma estrutura complexa de proteínas na su-
resulta em esporos com maior resistência ao calor.
perfície exterior do presporo. Depois que o córtex
O teor de água do núcleo parece estar inversamen-
e a capa são formados o presporo desidrata e ad-
te relacionado com a resistência dos esporos ao
quire sua aparência brilhante. Fase VI é a matura-
calor. A capa parece impedir o acesso de enzimas
ção, quando o esporo adquire sua refratividade e
capazes de lizar o peptidoglicano do córtex e pro-
resistência plena.
teger contra o peróxido de hidrogênio e a radiação
Estrutura do esporo. Driks (2004) descreveu a UV. As SASPs parecem proteger o DNA do calor
estrutura dos esporos de Bacillus, que é composta e de danos oxidativos. Logan & De Vos (2009b)
de várias camadas concêntricas. A camada interior também fazem referência ao ácido piridina-2-6-
é o núcleo, onde está localizado o cromossomo. dicarboxilico, também chamado de ácido dipico-
O núcleo é preenchido com pequenas proteínas línico (DPA), um componente único dos esporos,
solúveis em ácido (small acid-soluble proteins - que compreende 5-14% do peso seco. O Ca 2+ e
SASP), que saturam o DNA e mantém o material outros cátions divalentes estão quelados ao DPA,
genético num estado cristalino estável. As SASPs mas o seu papel exato na resistência de esporos
são sintetizadas apenas durante a esporulação e ainda é incerto.
são degradadas quando a germinação do esporo
Germinação. Logan & De Vos (2009b) descre-
começa. Ligam-se ao DNA e alteram as proprieda-
veram o mecanismo de germinação no gênero
des conformacionais e químicas da molécula, que
Bacillus, que envolve três etapas: ativação, ger-
se torna menos reativa a vários produtos químicos.
minação e crescimento. A ativação pode ser con-
Em redor do núcleo há uma membrana lipídica e, seguida por aplicação de calor (tempo e tempera-
em seguida, uma camada espessa de peptidoglica- tura subletais para o microrganismo) ou por enve-
no especializado, o córtex, o que difere do pepti- lhecimento em baixa temperatura. Os esporos de
doglicano normalmente encontrado na parede ce- várias espécies não requerem o passo de ativação,
lular. O córtex é responsável pela baixa atividade mas os métodos para o isolamento de esporos em
de água do esporo. alimentos sempre usam o calor, para destruir as
Rodeando o córtex há a complexa estrutura de células vegetativas.
proteína da capa, em várias camadas, que serve de A germinação pode ser induzida por exposição
barreira contra a entrada de grandes moléculas tó- a nutrientes como aminoácidos e açúcares, por
xicas e desempenha um papel na germinação. Os misturas destes, por não-nutrientes (dodecilami-
esporos de B. anthracis e de algumas outras espé- na, por exemplo), por enzimas e por alta pressão
cies de Bacillus possuem uma camada adicional, hidrostática. Para muitas espécies, L-alanina é um
o exosporium, que é separada do revestimento por germinante importante, enquanto a D-alanina atua

Contagem de esporos de bactérias □ 359
como inibidor competitivo, podendo ligar-se no Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium e

mesmo local da L-alanina. Moorella são anaeróbios estritos e não crescem na
Uma vez quebrada a dormência do esporo, o córtex presença de oxigênio. Os demais são aeróbios, a
é rapidamente hidrolisado, as SASPs são degrada- maioria incluindo tanto espécies aeróbias estritas
das e refratilidade desaparece. O protoplasto do como espécies anaeróbias facultativas. Sporolac-
esporo germinado então cresce, observando-se um tobacillus é anaeróbio facultativo, mas cresce me-
visível inchamento, devido à absorção de água. A lhor em atmosfera microaerófila.
biossíntese recomeça e uma nova célula vegetativa Com relação à temperatura de crescimento, os gê-
emerge quando a capa do esporo é destruída. neros Aeribacillus, Alicyclobacillus, Aneuriniba-
Resistência térmica. A resistência térmica é ava- cillus, Anoxybacillus, Desulfotomaculum, Geoba-
liada através dos parâmetros D (tempo de redução cillus, Moorella, Thermoanaerobacter e Thermoa-
decimal) e z (coeficiente de temperatura). O va- naerobacterium são termófilos. O gênero Bacillus,
lor D, também chamado de razão letal, é definido embora inclua hoje espécies predominantemente
como o tempo necessário para reduzir a um dé- mesófilas, ainda aloca espécies termófilas facul-
cimo a população de um dado microrganismo, a tativas. O termo termófilo facultativo é usado, no
uma dada temperatura. O valor z é definido como Compendium of Methods for the Microbiological
a variação de temperatura necessária para provo- Examination of Foods (Stevenson & Lembke,
car uma variação de dez vezes no valor D, ou seja, 2015), principalmente para diferenciar Geoba-
promover uma redução ou uma elevação decimal cillus stearothermophilus, termófilo estrito que
no valor D. A esterilização comercial e os parâme- não cresce abaixo de 35 ºC, de Bacillus coagulans,
tros D e z são discutidos no capítulo específico de termófilo facultativo que cresce bem a 30-35 ºC e
esterilidade comercial. também a 55 ºC.
Aeribacillus Miñana-Galbis et al. 2010
22.1.2. Taxonomia das bactérias
Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016).
esporogênicas importantes em Aeribacillus é um gênero novo, criado por Miña-
alimentos na-Galbis et al. (2010) para acomodar uma espé-
Até 1990, as bactérias esporogênicas associa- cie, Aeribacillus pallidus, originalmente descrita
das com alimentos estavam restritas aos gêneros como Bacillus pallidus por Scholz et al. (1987) e,
Clostridium, Desulfotomaculum, Bacillus e Spo- posteriormente, transferida para o gênero Geoba-
rolactobacillus. Com o avanço dos estudos filoge- cillus por Banat et al. (2004). Não há relatos sobre
néticos, entretanto, diversos novos gêneros foram o envolvimento de A. pallidus na deterioração dos
criados, para classificar novas espécies e reclas- alimentos, mas Scheldeman et al. (2006) encon-
sificar espécies dos gêneros anteriores, que mostraram esta espécie como uma das mais frequen-
traram diversidade genética suficiente para sepa- tes em leite cru, em equipamentos e em amostras
ração. Dentre o total de gêneros esporogênicos do ambiente de fazendas leiteiras. Na pesquisa
existentes, os de ocorrência comum em alimentos realizada por esses autores, a espécie foi isolada
encontram-se descritos a seguir. somente após incubação a 55 ºC, não sendo detec-
Na maioria, as bactérias desses gêneros apresentada a 37 ºC.
tam parede celular Gram positiva, mas, na colo- Descrição do gênero e da espécie feita por Logan
ração de Gram, podem mostrar-se Gram positiva, et al. (2009) (como Geobacillus pallidus) e por
variável ou, mesmo, negativa. A morfologia é de Miñana-Galbis et al. (2010) (como Aeribacillus
bastonetes retos ou levemente curvos, com tama- pallidus): Os aeribacilos são termófilos, aeróbios,
nhos variados. na forma de bastonetes, Gram positivos, móveis,
Com relação ao requerimento de oxigênio para ocorrendo isolados, aos pares ou em cadeias. Os
crescimento, Clostridium, Desulfotomaculum, esporos são centrais a terminais, elipsoidais ou

cilíndricos, provocando leve dilatação do espo- cie deterirorante mais comum, mas outras espécies
rângio. As colônias em meios sólidos são planas também podem ocorrer. As produtoras de guaiacol
a convexas, circulares ou lobadas (bordas irre- atualmente conhecidas são positivas no teste da
gulares), lisas e opacas, com 2-4mm de diâmetro peroxidase e crescem em temperaturas inferiores
após quatro dias a 55 ºC. A temperatura ótima de a 65 ºC. As cepas que crescem a 65 ºC ou acima,
crescimento varia entre 60 e 65 ºC com um míni- ao contrário, oferecem pouco risco de deterioração
mo de 37 ºC e um máximo de 65-70 ºC. Alcalofí- de sucos de frutas. Outras espécies que têm sido
licas, crescem em pH 8,0-8,5 mas não em pH 6.0. isoladas de produtos ácidos são A. acidocaldarius,
Crescem na presença de 10% de NaCl. Catalase A. acidiphilus, A. contaminans, A. fastidiosus, A.
e oxidase positivas. Nitrato não é reduzido, citra- herbarius, A. pomorum e A. sacchari.
to não é utilizado como única fonte de carbono. Descrição do gênero feita por Costa et al. (2009):
Produzem ácido sem gás a partir da glicose e um Bastonetes móveis ou imóveis, com composição
pequeno número de outros carboidratos. Caseína, de parede celular Gram-positiva, mas coloração
gelatina e uréia não são hidrolisadas e amido é hi- Gram positiva ou variável. Os esporos são ovais,
drolisado fracamente. terminais ou subterminais, provocando ou não di-
latação do esporângio. Aeróbios com metabolis-
Alicyclobacillus
mo estritamente respiratório, mas algumas poucas
Wisotzkey et al. 1992
emend. Goto et al. 2003 cepas são capazes de crescer por via anaeróbia,
emend. Karavaiko et al. 2005 usando nitrato ou Fe3+ como aceptores finais de
elétrons. Oxidase e catalase positivas ou negati-
Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016). vas. Todas as espécies são acidófilas, crescendo
Esse gênero foi proposto por Wisotzkey et al. na faixa de pH entre 0,5 e 6,5, com ótimo entre
(1992), para reclassificar as espécies de Bacillus 1,5 e 5,5. As espécies podem ser agrupadas em
termófilas e acidófilas, com composição da mem- três categorias em função da temperatura de cres-
brana celular típica, contendo principalmente áci- cimento. Um grupo inclui as espécies termófilas
dos graxos ω-alicíclicos. A descrição do gênero foi estritas (A. acidocaldarius e outras) que crescem
emendada por Goto et al. (2003) e posteriormen- entre 45 ºC e 70 ºC, com ótimo perto de 65 ºC.
te por Karavaiko et al. (2005), quando espécies Outro grupo inclui as espécies termófilas facul-
anteriormente classificadas como Sulfobacillus tativas (A. acidoterrestris e outras) que crescem
foram transferidas para o gênero Alicyclobacillus entre 20 ºC e 65 ºC, com ótimo entre 40 ºC e 55
e novas espécies foram descobertas. Com essas ºC. O terceiro grupo inclui espécies que crescem
alterações nem todas as espécies contém esse tipo entre 4 ºC e 55 ºC, com ótimo entre 35 ºC e 42 ºC.
de ácido graxo e nem todas são termófilas, como Alicyclobacillus acidiphilus: Espécie nova des-
descrito originalmente. crita em 2002, isolada a partir de uma bebida áci-
Segundo a International Federation of Fruit Juice da com odor de guaiacol. Descrição da espécie
Producers (IFU, 2007), Alicyclobacillus é um dos feita por Costa et al. (2009): As células são bas-
deteriorantes de maior importância para a indústria tonetes Gram positivos, móveis. Forma esporos
de suco de frutas. Provoca um tipo de deterioração ovais, terminais ou subterminais, com dilatação
caracterizada pelo desenvovimento de odor e sabor do esporângio. As colônias em meios sólidos não
estranho, resultante da produção de compostos me- são pigmentadas. Termófilo facultativo, cresce
tabólicos como o guaiacol e os halofenóis. Os espo- entre 20 e 55 ºC, com temperatura ótima de 50 ºC.
ros de Alicyclobacillus sobrevivem à pasteurização Acidófilo cresce na faixa de pH entre 2,5 e 5,5,
de sucos e também sobrevivem por longos períodos com ótimo em 3,0. Aeróbio estrito, produz ácido
em matérias-primas concentradas (concentrados de mas não gás a partir de carboidratos. Catalase po-
frutas, açúcar líquido, xaropes), embora não se mul- sitivo, oxidase negativo, não reduz nitrato a nitrito
tipliquem sem diluição. A. acidoterrestris é a espé- e não exige fatores de crescimento.

Alicyclobacillus acidoterrestris: Anteriormente entre 2,0 e 6,0, com ótimo em torno de 3,0 a 4,0.
chamado de (Bacillus acidoterrestris), esta espé- Termófilo estrito, a faixa de temperaturas para o
cie é considerada por Evancho et al. (2015) como crescimento é de 45 a 70 ºC, com ótimo entre 60 e
termófila facultativa e tipicamente flat sour, pro- 65 ºC. Não exige fatores de crescimento. Oxidase
duzindo ácido mas não gás a partir de carboidra- negativo e catalase fracamente positivo.
tos. Comum em frutas frescas, sucos de frutas e Alicyclobacillus contaminans: Espécie nova des-
concentrados de frutas, a deterioração causada crita em 2007, isolada a partir do solo e de suco
por A. acidoterrestris resulta em aroma e odor de laranja. Descrição da espécie feita por Costa
alterados (descritos como “medicinal” ou “fenó- et al. (2009): As células são bastonetes móveis,
lico”), devido à produção de guaiacol durante o Gram positivos (culturas velhas podem apresen-
crescimento. A deterioração não ocorre em sucos tar coloração de Gram variável). Forma esporos
concentrados com Brix acima de 30º. Os esporos elipsoidais, subterminais, com dilatação do espo-
podem sobreviver ao processamento térmico apli- rângio. As colônias em meios sólidos são circu-
cado aos sucos de frutas e permanecem viáveis. lares, com bordas perfeitas ou umbunadas, não
Descrição da espécie feita por Costa et al. (2009): pigmentadas. Termófilo facultativo, cresce entre
Bastonetes Gram-positivos, forma esporos ovais, 35 e 60 ºC, com temperatura ótima entre 50 e 55
terminais a subterminais, geralmente sem dilatar o ºC. Acidófilo cresce na faixa de pH entre mais de
esporângio. Motilidade não determinada (positiva 3,0 e menos de 6,0 (não cresce em 3,0 e 6,0), com
segundo Evancho et al., 2015). As colônias em ótimo entre 4,0 e 4,5. Aeróbio estrito, produz áci-
meios sólidos não são pigmentadas. Não reduz ni- do mas não gás a partir de carboidratos. Catalase e
trato a nitrito e não exige fatores de crescimento. oxidase negativo, não reduz nitrato a nitrito. Cres-
Cresce na faixa de 35 a 55 ºC, com ótimo entre 42 ce em 2% de NaCl mas não em 5%.
e 53 ºC. A faixa de pH para crescimento é de 2,2 a
5,8, com ótimo em torno de 4,0. Oxidase negativo Alicyclobacillus dauci: Espécie nova descrita em
e catalase fracamente positivo. Não cresce na pre- 2015, isolada a partir de uma mistura de suco de
sença de 5% de NaCl. Foi descrito como aeróbio frutas e vegetais deteriorada com flavor de guaia-
por Wisotzkey et al. (1992) e Costa et al. (2009), col. Descrição da espécie feita por Nakano et al.
mas Evancho et al. (2015) relatam a existência de (2015): As células são bastonetes imóveis, Gram
cepas anaeróbias facultativas. variáveis, esporogênicas (características dos espo-
Alicyclobacillus acidocaldarius: Anteriormente ros não descritas). As colônias em meios sólidos
chamada de (Bacillus acidocaldarius) esta espécie são circulares, opacas, brancas, opalescentes, lisas
não é um deteriorante frequente, havendo poucos e convexas, com 1-1,5mm após 72h a 40 ºC em
relatos sobre sua presença em alimentos ácidos Ágar BAM. Moderadamente termofílico, cresce
(suco de manga e concentrados esterilizados pelo entre 20 e 50 ºC, com temperatura ótima de 40 ºC.
processo UHT) (Gouws et al., 2005). Descrição Acidófilo cresce na faixa de pH entre 3,0 e 6,0,
da espécie feita por Costa et al. (2009): Células com ótimo em 4,0. Aeróbio estrito, produz ácido
na forma de bastonetes Gram positivos, frequen- mas não gás a partir de carboidratos. Catalase po-
temente arranjados em cadeias curtas. Forma es- sitivo e oxidase negativo.
poros elipsoidais, terminais a subterminais, sem Alicyclobacillus fastidiosus: Espécie nova descri-
dilatar o esporângio. As colônias em meios sóli- ta em 2007, isolada a partir do solo e de suco de
dos não são pigmentadas. Aeróbio, as fontes de maçã. Descrição da espécie feita por Costa et al.
carbono e de energia utilizadas para o crescimento (2009): As células são bastonetes imóveis, Gram
incluem hexoses, dissacarídeos, ácidos orgânicos positivos (culturas velhas podem apresentar co-
e aminoácidos. Não reduz nitrato a nitrito. Cres- loração de Gram variável). Forma esporos elip-
ce usando amônia mas não nitrato como fonte de soidais, subterminais, com dilatação do esporân-
nitrogênio. A faixa de pH para crescimento está gio. As colônias em Ágar BAM são planas, com

3-4mm após 48h, circulares com bordas perfeitas, nais, com dilatação do esporângio. As colônias
opacas e não pigmentadas. Moderadamente ter- em Ágar BAM são circulares, opacas, com bordas
mofílico, cresce entre 20 e 55 ºC, com tempera- perfeitas ou umbunadas, não pigmentadas. Cres-
tura ótima entre 40 e 45 ºC. Acidófilo cresce na ce entre 30 e 55 ºC, com temperatura ótima entre
faixa de pH entre mais de 2,0 e menos de 5,5 (não 45 e 50 ºC. Acidófilo cresce na faixa de pH entre
cresce em 2,0 e 5,5), com ótimo entre 4,0 e 4,5. mais de 2,0 e menos de 6,0 (não cresce em 2,0 e
Aeróbio estrito, produz ácido mas não gás a partir 6,0), com ótimo entre 4,0 e 4,5. Cresce em 2%
de carboidratos. Catalase positivo e oxidase nega- de NaCl mas não em 5%. Aeróbio estrito, produz
tivo. Cresce em 2% de NaCl mas não em 5%. ácido a partir de vários carboidratos. Catalase e
Alicyclobacillus herbarius: Espécie nova descri- oxidase negativo, não reduz nitrato a nitrito.
ta em 2002, isolada a partir de chá feito de flo-
res secas de hibisco. Descrição da espécie feita Aneurinibacillus Shida et al. 1996
por Costa et al. (2009): As células são bastonetes emend. Heyndrickx et al. 1997
móveis, Gram positivos. Forma esporos ovais, Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016).
subterminais, com dilatação do esporângio. As Esse gênero foi proposto por Shida et al. (1996),
colônias em meios sólidos não são pigmentadas. para reclassificar as cepas anteriormente classifi-
Termófilo facultativo, cresce entre 35 e 65 ºC, cadas como (Bacillus aneurinolyticus) e (Bacillus
com temperatura ótima entre 55 e 60 ºC. Acidófilo migulanus), que caracteristicamente, decompõem
cresce na faixa de pH entre mais de 3,0 e menos a tiamina. Levantamento relatado por Schelde-
de 6,5 (não cresce em 3,0 e 6,5), com ótimo entre man et al. (2006) revelou a presença de espécies
4,5 e 5,0. Não exige fatores de crescimento. Aeró- desse gênero em leite cru, equipamentos e am-
bio estrito, produz ácido a partir de vários carboi- biente de fazendas de produção leiteira. Logan &
dratos. Catalase positivo, oxidase negativo, reduz De Vos (2009a) relataram o isolamento de Aneu-
nitrato a nitrito. rinibacillus thermoaerophilus a partir de açúcar
Alicyclobacillus pomorum: Espécie nova descrita de beterraba.
em 2003, isolada a partir de suco misto de várias Descrição do gênero feita por Logan & De Vos
frutas deteriorado. Descrição da espécie feita (2009a): Bastonetes Gram positivos, móveis, for-
por Costa et al. (2009): As células são bastonetes mam esporos elipsoidais, centrais, paracentrais
móveis, Gram positivos (culturas velhas podem ou subterminais, podendo dilatar ou não o espo-
apresentar coloração de Gram variável). Forma rângio. Estritamente aeróbios, mas uma espécie é
esporos ovais, subterminais, com dilatação do es- microaerófila. Cresce em meios rotineiros como
porângio. As colônias em meios sólidos não são Ágar Nutriente (NA) e Ágar Tripticase de Soja
pigmentadas. Cresce entre 30 e 60 ºC, com tempe- (TSA). Decompõem a tiamina. Catalase positi-
ratura ótima entre 45 e 50 ºC. Acidófilo cresce na vos, fracamente positivos ou negativos. Crescem
faixa de pH entre mais de 2,5 e menos de 6,5 (não entre 20 a 65 ºC e em pH variando de 5,5 a 9,0.
cresce em 2,5 e 6,5), com ótimo entre 4,5 e 5,0. Crescem na presença de 2 a 5% de NaCl e algu-
Não exige fatores de crescimento. Aeróbio estrito, mas cepas também em 7% (pobremente). Poucos
produz ácido partir de vários carboidratos. Cata- carboidratos são assimilados, com pouca ou ne-
lase e oxidase positivo, não reduz nitrato a nitrito. nhuma produção de ácido a partir deles. Utiliza
Alicyclobacillus sacchari: Espécie nova descrita aminoácidos e alguns ácidos orgânicos como fon-
em 2007, isolada do solo e de açúcar líquido. Des- tes de carbono.
crição da espécie feita por Costa et al. (2009): Aneurinibacillus thermoaerophilus: Anterior-
As células são bastonetes Gram positivos (cultu- mente chamado de (Bacillus thermoaerophilus), a
ras velhas podem apresentar coloração de Gram cepa original foi isolada num dos estágios de ex-
variável). Forma esporos elipsoidais, subtermi- tração e refino de açúcar de beterraba. Descrição

da espécie feita por Logan & De Vos (2009a): As variáveis, isolados, em pares ou em pequenas ca-
células são bastonetes Gram positivos, móveis. deias. Forma esporos ovais, terminais ou subter-
Forma esporos centrais ou paracentrais, com di- minais, com leve dilatação do esporângio. As co-
latação do esporângio. As colônias em Ágar Nu- lônias em meios sólidos são circulares, com bor-
triente (NA) após 24h a 55 ºC são creme acinzen- das perfeitas e centro elevado, opacas e brilhantes,
tadas, planas, irregulares e com tendência a espa- de cor creme. Moderadamente termofílico, a tem-
lhamento. Cresce entre 40 e 60 ºC e em pH entre peratura máxima de crescimento varia entre 40 e
7,0 e 8,0. Cresce em 3% de NaCl mas não em 5%. 60 ºC, com ótima de 50 ºC. Alcalitolerante, cresce
Aeróbio estrito, utiliza uma gama de aminoáci- na faixa de pH entre 4,0-5,0 e 9,0-10, com ótimo
dos, carboidraos e ácidos orgânicos como fonte em 7,0. Cresce em 5% de NaCl, mas não exige sal
de carbono. Catalase variável, não reduz nitrato para crescimento. Quimio-organotrófico, anaeró-
a nitrito. bio facultativo, produz pequenas quantidade de
ácido, sem gás, a partir da glicose e outros carboi-
Anoxybacillus Pikuta et al. 2000 dratos. Catalase positivo, oxidase negativo, reduz
emend. Pikuta et al. 2003 nitrato a nitrito.
Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016): Anoxybacillus tepidamans: Isolado de uma plan-

Este gênero foi criado para conter Anoxybacillus ta de processamento de açúcar de beterraba, esta
pushchinensis, uma espécie nova de bactéria anaeró- espécie, anteriormente chamada de (Geobacillus
bica alcalofílica moderadamente termofílica isolada tepidamans), foi reclassificada no gênero Ano-
de estrume e para reclassificar (Bacillus flavother- xybacillus em 2012. Descrição da espécie feita
mus) como Anoxybacillus flavithermus. A maioria por Coorevits et al. (2012): As células são basto-
das espécies do gênero tem sido isolada de fontes netes Gram positivos. Forma esporos elipsoidais,
de água quente, mas a nova espécie Anoxybacillus terminais com dilatação do esporângio. As colô-
contaminans foi isolada a partir de gelatina. nias em Ágar Nutriente (NA) após 24h a 60 ºC são
Descrição do gênero feita por Pikuta (2009): circulares (0,5mm), com bordas perfeitas, brancas
Bastonetes Gram positivos ou Gram variáveis, re- opacas e brilhantes. Termófilo estrito, cresce entre
tos ou levemente curvos, móveis ou imóveis. Di- 40 e 65 ºC, com ótimo de 55 ºC. Cresce na faixa
visão angular e células em forma de “Y” podem de pH entre 6,0 e 9,0 mas não em pH 5,0. Tolera
ocorrer, frequentemente formando arranjos em até 5% de NaCl. Hidrolisa esculina e amido mas
pares ou pequenas cadeias. Formam esporos esfé- não caseína e gelatina. Anaeróbio facultativo, pro-
rico, ovais ou cilíndricos. Quimio-organotróficos, duz ácido mas não gás a partir da glicose e outros
há espécies aeróbias, anaeróbias facultativas ou carboidratos. Catalase positivo, oxidase negativo.
anaeróbias estritas. O metabolismo é fermentati-
vo. As colônias em meios sólidos variam com a Bacillus Cohn 1872
espécie, podendo apresentar-se amarelas, brancas Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016).
com centro amarelado ou creme. Catalase variá- Bacillus é um dos gêneros originais de bactérias
vel. Moderadamente termofílicos, crescem entre esporogênicas comuns em alimentos, mas muitas
30-45 ºC e 60-72 ºC, com ótimo entre 50 e 62 ºC. espécies foram reclassificadas nos novos gêneros
Há espécies alcalofílicas, alcalitolerantes ou neu- Aeribacillus, Alicyclobacillus, Aneurinibacillus,
trofílicas, mas a maioria cresce em pH neutro. Po- Brevibacillus, Geobacillus, Lysinibacillus, Pae-
dem ser sacarolíticos ou proteolíticos. nibacillus e Virgibacillus. Dentre as espécies que
Anoxybacillus contaminans: Espécie nova des- permanecem no gênero Bacillus as mais impor-
crita em 2004, isolada de gelatina. Descrição da tantes são B. cereus (discutido em capítulo sepa-
espécie feita por Pikuta (2009): As células são rado) e as espéceis termófilas facultativas B. coa-
bastonetes curvos ou espiralados, móveis, Gram gulans, B. smithii e B. sporothermodurans (discu-

tidas abaixo). Outros bacilos encontrados em ali- com ótimo entre 25 e 40 ºC. Há espécies modera-
mentos e ambientes de produção de alimentos são damente termofílicas, crescendo entre 25-40 ºC e
B. licheniformis e B. subtilis, frequentes em leite 55-65 ºC, com ótimo entre 40 e 55 ºC. Há espécies
cru, equipamentos e outras amostras de fazendas termófilas estritas, crescendo entre 37 ºC e 65-75
de produção leiteira, isolados tanto a 20 quanto ºC, com ótimo entre 55 e 70 ºC. Há espécies psi-
a 37 e a 55 ºC (Scheldeman et al., 2005). Em in- crotróficas e psicrófilas. O pH ótimos da maioria
gredientes de alimentos comercialmente estéreis das espécies é neutro, mas há espécies alcalofíli-
(açúcar, amido, cereais, condimentos, leite em pó, cas e espécies acidúricas.
cacau, gelatina, tomate e outros vegetais) desta- Bacillus coagulans. É uma espécie conhecida há
cam-se B. coagulans, B. licheniformis, B. subtilis, décadas como deteriorante de alimentos levemen-
B. circulans e B. pumilus, isolados por Richmond te ácidos. De acordo com Evancho et al. (2015)
& Field (1966) a 55 ºC (não foi utilizada outra provoca deterioração tipo “flat sour”, assim cha-
temperatura). Dados levantados por Kalogridou- mada porque ocorre produção de ácido mas sem
-Vassiliadou (1992) destacaram o envolvimen- gás, o que resulta em embalagens não estufadas.
to de B. licheniformis e B. subtilis em casos de Atinge principalmente derivados de tomate, mas
deterioração tipo “flat sour” de leite evaporado. também tem sido implicado na deterioração de
Dados levantados por Scheldeman et al. (2006) produtos lácteos, frutas e vegetais. Segundo Lo-
destacam o envolvimento de B. sphaericus e B. li- gan & De Vos (2009b), é usado como probiótico
cheniformis na contaminação de leite esterilizado para frangos e leitões e, também, na fabricação de
pelo processo UHT ou convencional. produtos de alto valor comercial, como o ácido
Descrição do gênero feita por Logan & De Vos láctico, enzimas termoestáveis e o peptídeo anti-
(2009b): Bastonetes móveis ou imóveis, isolados, microbiano coagulina. A descrição dessa espécie
aos pares, cadeias e, em alguns casos, longos fila- foi corrigida por De Clerck et al. (2004), porque
mentos. A coloração de Gram pode apresentar-se muitas cepas isoladas e identificadas como B. co-
positiva (em alguns casos apenas nos estágios ini- agulans, ao longo dos anos, foram posteriormen-
ciais do crescimento) ou negativa. Formam espo- te reclassificadas como Bacillus smithii, Bacillus
ros (apenas um por célula) que, dependendo da licheniformis ou Geobacillus stearothermophilus.
espécie, podem ser de diversos formatos e posi- Descrição da espécie feita por Logan & De Vos
ções, dilatando ou não o esporângio. A resistên- (2009b): Bastonetes Gram positivos, móveis.
cia térmica dos esporos varia entre as espécies e, Esporogênico, embora nem todas as cepas pro-
em alguns casos, entre as cepas de uma mesma duzam esporos facilmente. Os esporos são elip-
espécie. A maiorias das espécies encontradas em soidais, mas em alguns casos, parecem esféricos.
alimentos crescem em meios de cultura rotineiros A localização é subterminal ou, ocasionalmente,
como o Ágar Nutriente (NA), formando colônias paracentral ou terminal, com leve dilatação do es-
com características variadas. Colônias grandes, porângio. As colônias em Àgar Tripticase de Soja
planas, com bordas irregulares e espalhadas são (TSA) são brancas (tendendo a creme com a ida-
muito comuns. B. licheniformis é capaz de formar de da cultura), convexas, com margens perfeitas e
colônias de diferentes tipos numa mesma placa de superfície lisa. É termófilo facultativo, crescendo
cultivo, podendo dar a impressão de uma cultu- entre 30 e 57-61 ºC, mas não a 65 ºC, com ótimo
ra mista. Aeróbios ou anaeróbios facultativos, a entre 40 e 57 ºC. Levemente acidúrico, cresce em
maiorias das espécies é catalase positiva. Oxida- valores de pH na faixa de 4,0 a 10,5-11,0, com
de positiva ou negativa. A maioria das espécies ótimo em 7,0. Não cresce na presença de 5% de
utiliza glicose e/ou outro carboidrato fermentável NaCl. Catalase positivo, anaeróbio facultativo,
como única fonte de carbono ou energia (algumas utiliza carboidratos com produção de ácido lácti-
não usam carboidratos). A maioria das espécies co, sem gás. O valor D121,1 ºC relatado por Stumbo
é mesófila, crescendo entre 5-20 ºC e 35-55 ºC, (1973) varia entre 0,01 e 0,07min.

Bacillus smithii. É uma espécie nova, proposta pécies mesófilas de Bacillus. O valor D121 ºC é de
em 1988 para reclassificar cepas anteriormente 2,25min, ligeiramente inferior ao de Geobacillus
classificadas como B. coagulans. Descrição da stearothermophilus, que é termófilo estrito e a
espécie feita por Logan & De Vos (2009b): A mais resistente das bactérias esporogênicas aeró-
morfologia é de bastonetes, Gram positivos, mó- bias. Em temperaturas mais altas, como as utili-
veis. Esporogênico, forma esporos elipsoidais a zadas no processo UHT do leite, é extremamente
cilíndricos, terminais ou subterminais, sem dila- resistente. O valor D140 ºC é de cinco segundos,
tação ou com dilatação leve do esporângio. As co- enquanto o de G. stearothermophilus é de 0,9 se-
lônias em meios sólidos são circulares com mar- gundos. Não é uma espécie comum no leite cru ou
gens perfeitas, cerca de 2mm em diâmetro, não no ambiente das fazendas produtoras de leite, pa-
pigmentadas, É termófilo facultativo, crescendo recendo ter sido introduzida através de concentra-
entre 25 e 60 ºC, a maioria das cepas também a 65 dos nutritivos utilizados na alimentação do gado
ºC. Cresce em pH 5,7 mas não em 4,5 ou abaixo. leiteiro. Os esporos dessas cepas não apresentam
Catalase e oxidase positivo, não cresce em 3% de a mesma resistência observada nas cepas isoladas
NaCl ou 0,001% de lisozima. Anaeróbio faculta- de produtos processados, havendo evidências de
tivo, utiliza carboidratos com produção de ácido, que a maior resistência foi decorrente da adapta-
sem gás (“flat sour”). Isolado de leite evaporado, ção às condições do processo UHT. Descrição da
enlatados, queijos e caldo de beterraba para pro- espécie corrigida por Heyndrickx et al. (2012):
dução de açúcar. Bastonetes Gram positivos, usualmente móveis
Bacillus sporothermodurans. É uma espécie e usualmente arranjados em em cadeias. Requer
nova, proposta por Pettersson et al. (1996). De vitamina B12 para crescimento satisfatório. As
acordo com uma revisão publicada por Schelde- colônias após dois dias em Ágar BHI suplemen-
man et al. (2006), esta espécie foi descoberta em tado com 5 mg/l de MnSO4 e 1 mg/l de vitamina
lotes de leite UHT e leite esterilizado na Itália, na B12 são circulares (2mm), planas, com bordas
Áustria e na Alemanha em 1985, 1990 e 1995. O perfeitas, bege ou creme. Forma esporos esfé-
problema afetou posteriormente outros produtos, ricos a elipsoidais, paracentrais e subterminais,
incluindo leite UHT integral, desnatado, evapora- eventualmente terminais, com dilatação leve ou
do e reconstituído, creme de leite e leite achoco- sem dilatação do esporângio. A esporulação não é
latado UHT, leite de coco UHT e leite em pó. O frequente mas pode ser induzida pelo cultivo em
microrganismo normalmente atinge contagens de BHI suplementado com e MnSO4, vitamina B12
105 células vegetativas e 103 esporos por mililitro e extrato de solo. Os esporos de cepas isoladas de
de leite, após incubação a 30 ºC durante 15 dias. leite UHT são altamente resistentes e sobrevivem
O pH do leite não é afetado e a estabilidade ou a ao processo UHT, mas essa resistência diminui
qualidade sensorial geralmente não são alteradas. com o repique das culturas em laboratório. As
Esporos de cepas isoladas de leite UHT sobrevi- cepas isoladas do ambiente das fazendas leiteiras
vem ao tratamento UHT e os estudos disponíveis geralmente podem crescer mais rapidamente do
sugerem que estes esporos altamente resistentes que as isoladas do leite UHT, mas apresentam re-
ao calor foram adaptados e selecionados pelo sistência térmica menor. Aeróbio estrito, catalase
stress subletal no processo industrial. O melhor e oxidase positivo, produz ácido sem gás a partir
método para isolamento a partir de leite cru é a de glicose, frutose, maltose e sacarose, mas a re-
aplicação de choque térmico (autoclave/5min ou ação pode ser fraca. Não hidrolisa caseína nem
100 ºC/30-40min), plaqueamento em Ágar Infu- amido, mas gelatina e esculina sim. Reduz nitra-
são Cérebro Coração (BHI) suplementado com to a nitrito. Urease, indol e H2S negativo. ONPG
vitamina B12 (1 mg/l) e incubação a 37 ºC/48h. negativo. Mesófilo, cresce entre 20 e 55 ºC, com
Os esporos apresentam resistência térmica anor- temperatura ótima de 37 ºC. Cresce entre pH 5 e
malmente alta, em comparação com outras es- 9 e em 5% de NaCl.

Brevibacillus Shida et al. 1996, gen. nov. Clostridium Prazmowski 1880

Esse gênero foi proposto em 1996 para reclas-
Clostridium é um dos gêneros originais de bac-
sificar cepas anteriormente classificadas como
térias esporogênicas comuns em alimentos, mas
(Bacillus brevis) (que foram divididas em nove
muitas espécies foram reclassificadas nos novos
espécies) e posteriormente novas espécies foram
gêneros Desulfotomaculum, Moorella e Thermo-
descobertas. Dados levantados por Scheldeman
anaerobacterium. Dentre as que permaneceram
et al. (2006) destacam a presença de B. brevis,
no gênero Clostridium as espécies patogênicas
B. agri, B. borstelensis e outros brevibacilos em
veiculadas por alimentos são C. botulinum (dis-
leite cru, equipamentos e ambiente de fazendas
cutido nesse capítulo) e C. perfringens (discuti-
de produção leiteira. Destacam também o en-
do em capítulo específico). Além dessas, há três
volvimento de B. brevis e/ou B. borstelensis na
grupos importantes como deteriorantes de ali-
contaminação de leite esterilizado pelo proces-
mentos: os clostrídios proteolíticos (putrefativos)
so UHT ou convencional. Dados levantados por
(C. botulinum, C. sporogenes, C. bifermentans,
Logan & De Vos (2009c) relatam o isolamento
C. putrefasciens, C. histolyticum), os clostrídios
de B. laterosporus em água, leite coalhado, mas-
sacarolíticos (não proteolíticos) (C. butyricum, C.
sa de pão, e soja fermentada, B. centrosporus em
pasteurianum, C. tyrobutyricum, C. beijerinckii,
espinafre, B. parabrevis em queijo, B. agri em
C. acetobutylicum) e os clostrídios, psicrófilos ou
leite esterilizado, no ambiente de uma planta de
psicrotróficos deteriorantes de carnes embaladas
processamento de gelatina e de uma rede públi-
à vácuo refrigeradas (C. estertheticum, C. algidi-
ca de abastecimento de água (envolvida em um
carnis, C. gasigenes).
surto de doença de origem hídrica) e B. brevis
Descrição do gênero feita por Rainey et al.
e B. laterosporus em embalagens de papel para
(2009): São bastonetes móveis ou imóveis, ge-
alimentos.
ralmente com coloração de Gram positiva (pelo
Descrição do gênero feita por Logan & De Vos
menos nos estágios iniciais do crescimento),
(2009c): São bastonetes com coloração de Gram
mas em algumas espécies não se observa células
positiva, varável ou negativa. Produzem esporos
Gram positivas. A maioria produz esporos ovais
elipsoidais com dilatação do esporângio. A maio-
ou esféricos, geralmente com dilatação do espo-
ria cresce em Ágar Nutriente (NA) e Ágar Tripti-
rângio. Quimio-organotróficos (algumas espécies
case de Soja (TSA) formando colônias planas, li-
são quimiolitotróficas ou quimioautotróficas),
sas, cinza amareladas. Há espécies que produzem
anaeróbios estritos, produzem ácidos orgânicos e
outros pigmentos (vermelho, castanho). Aeróbios
alcoóis a partir de carboidratos e peptonas. Po-
estritos em sua maioria ou anaeróbios facultativos,
dem ser proteolíticos, sacarolíticos, nenhum dos
podem assimilar carboidratos mas a maioria das
dois ou ambos. Usualmente catalase negativos,
espécies produz pouco ou nenhum ácido. Catala-
embora traços de catalase possa ser encontrado
se positivos em sua maioria, a reação de oxidase
em algumas cepas.
varia entre as espécies. Voges Proskauer (VP) ne-
gativos. Redução do nitrato e hidrólise da caseína, Clostridium botulinum. É uma espécie de grande
gelatina e amido varia entre as espécies. O cresci- risco para a saúde pública, porque produz toxinas
mento é inibido por 5% de NaCl. O pH ótimo é 7 e altamente potentes, causadoras de botulismo. Se-
a maioria não cresce em pH 5,5. A temperatura de gundo o CVE (2002), as toxinas atuam no siste-
crescimento varia consideravelmente; a maioria ma nervoso e são letais por ingestão, na dose de
cresce a 20 ºC, mas não a 50 ou 55 ºC, com ótimo 1/100 a 1/120ng. Termolábeis, são destruídas pelo
entre 28 e 45 ºC. As espécies capazes de crescer a aquecimento à 65-80 ºC/30min ou 100 ºC/5min.
50-55 ºC também apresentam temperatura ótima A doença é provocada pela ingestão de alimentos
mais alta, acima de 40 ºC. contaminados com a toxina, caracterizando-se por

manifestações neurológicas seletivas, de evolução Todos apresentam morfologia de bastonetes retos

dramática e alta taxa de mortalidade. Pode iniciar- ou levemente curvos, Gram positivos, usualmen-
-se com vômitos e diarreia (mais comumente com te móveis, catalase negativos. Produzem esporos
constipação), debilidade e vertigem. Em seguida ovais, subterminais, usualmente com dilatação do
são observadas alterações da visão (visão turva, esporângio. Nenhum cresce em pH abaixo de 4,6.
visão dupla, fotofobia), flacidez das pálpebras, Descrição das cepas de C. botulinum grupo I
modificações da voz (rouquidão, afonia, fonação feita por Rainey et al. (2009): O grupo I inclui ce-
lenta), distúrbios da deglutição, flacidez muscular pas do tipo A e cepas proteolíticas dos tipos B e
generalizada, dificuldade de movimentos, agita- F. As células são bastonetes retos ou ligeiramente
ção psicomotora e outras alterações relacionadas curvos, móveis, produzindo esporos ovais, subter-
com os nervos cranianos. Esse quadro resulta em minais, com dilatação do esporângio. A temperatu-
dificuldade respiratória e cardiovascular, levando ra ótima para o crescimento é de 30-40 ºC. Algu-
à morte por parada cárdio-respiratória. mas cepas crescem bem a 25 ºC e poucas a 45 ºC.
Em função das propriedades antigênicas das toxi- O crescimento é inibido por 6,5% de NaCl, 20%
nas produzidas, as cepas de C. botulinum foram de bile e pH 8,5. A produção de toxina é retardada
classificadas em oito tipos (A, B, C1, C2, D, E, F, em atmosfera de 100% de CO2, que pode ser letal
G). Dados da International Commission on Mi- dependendo da concentração e tempo de exposi-
crobiological Specifications for Foods (ICMSF, ção. Digerem gelatina, leite e carne (proteolítica).
1996) indicam que o tipo A atinge humanos e Produzem amônia e H2S. Os produtos finais de fer-
frangos, sendo mais comum em partes da América mentação incluem grandes quantidades de ácido e
do Norte e nos países da antiga União Soviética. É gás hidrogênio (H2). Dados da ICMSF (1996): Os
o tipo mais encontrado nos casos de botulismo re- esporos deste grupo são os mais resistentes entre
latados no Brasil (CVE, 2006). Os veículos mais os produzidos por C. botulinum. O valor D121.1 ºC
comuns são conservas caseiras de vegetais, frutas, relatado em diferentes substratos varia entre 0,05 e
carnes e peixes. O tipo B atinge humanos, bovi- 0,32min. A temperatura mínima para o crescimen-
nos e equinos, sendo mais comum na América do to é de 10-12 ºC. Não crescem na presença de 10%
Norte, Europa e países da antiga União Soviética de NaCl. Sob condições ótimas de temperatura e
(cepas não proteolíticas). Os veículos mais co- atividade da água, o valor mínimo de pH para o
muns são carnes preparadas, particularmente su- crescimento é de 4,6. A multiplicação é caracteri-
ína. Os tipos C e D atingem aves aquáticas, bovi- zada por odor pútrido e produção de gás.
nos e equinos, mas não humanos. O tipo E atinge Descrição das cepas de C. botulinum grupo II
humanos e peixes e os veículos mais comuns são feita por Rainey et al. (2009): O grupo II inclui
pescados e frutos do mar. Ocorre principalmente cepas do tipo E e cepas sacarolíticas dos tipos B
em regiões de alto consumo desses produtos, in- e F. As células são bastonetes retos, móveis, pro-
cluindo Japão, Dinamarca, Suécia, Alasca, Labra- duzindo esporos ovais, centrais a subterminais,
dor e países da antiga União Soviética. O tipo F geralmente com dilatação do esporângio. A tem-
atinge humanos, sendo mais comum na Dinamar- peratura ótima para o crescimento é de 25-37 ºC
ca, América do Norte, América do Sul e Escócia. e não crescem ou crescem muito pobremente a 45
Os veículos mais frequentes são produtos cárneos. ºC. O crescimento é estimulado pela presença de
O tipo G foi isolado do solo na Argentina e não carboidratos fermentáveis e é inibido por 6,5% de
há surtos confirmados de botulismo provocado NaCl, 20% de bile e pH 8,5. Os produtos finais
por esse tipo em humanos. Nunca foi encontrado de fermentação incluem ácido e gás hidrogênio
em alimentos e, em1988, foi reclassificado como (H2). Dados da ICMSF (1996): Os esporos deste
Clostridium argentinense. grupo são menos resistentes que os do grupo I,
Em função das características metabólicas, as ce- com valor D82,2 ºC relatado em diferentes substra-
pas são divididas em quatro grupos (I, II, III, IV). tos variando entre 0,25 e 73,61min. A temperatura

mínima é 3,3 ºC, havendo relatos de crescimento conserva (palmito, aspargo, cogumelos, alcacho-
sob refrigeração. Não crescem na presença de 5% fra, pimentão, beringela, alho, picles etc.), peixes,
de NaCl. Sob condições ótimas de temperatura e frutos do mar, e outros. Um levantamento feito
atividade de água, o valor mínimo de pH para o pelo Food Safety Inspection Service do United
crescimento é de 5,2. A multiplicação é caracteri- States Department of Agriculture (FSIS/USDA,
zada por produção de gás, sem desenvolvimento 1997) apresenta casos ocorridos em vários países,
de odor pútrido. envolvendo conservas de pimenta em óleo, carne
Descrição das cepas de C. botulinum grupo III cozida, salmão, atum, sopas, cogumelos e outros.
feita por Rainey et al. (2009): O grupo III inclui Embora C. botilunum não cresça em alimentos
cepas dos tipos C e D. As células são bastonetes ácidos, o envolvimento esporádico de conservas
retos, móveis, produzindo esporos ovais, subter- acidificadas em casos de botulismo tem sido rela-
minais, com dilatação do esporângio. A tempera- tado. No levantamento do FSIS/USDA (1997), a
tura ótima para o crescimento é de 30-37 ºC. A principal causa desses eventos é a multiplicação
maioria cresce bem a 45 ºC mas não crescem ou de outros microrganismos no produto, elevando o
crescem muito pobremente a 25 ºC. O crescimen- pH até a faixa de crescimento de C. botulinum.
to é estimulado pela presença de carboidratos fer- No Brasil, o Centro de Referência do Botulismo
mentáveis e é inibido por 6,5% de NaCl, 20% de (CR BOT), criado em 1999 e sediado na Central
bile e pH 8,5. A maioria digere a carne e a gelatina de Vigilância Epidemiológica (Disque CVE), do
e acidifica, coagula e digere o leite e a carne. A Centro de Vigilância Epidemiológica (CVE), re-
produção de amônia e H2S varia entre as cepas. latou a ocorrência de 30 casos de botulismo entre
Os produtos finais de fermentação incluem ácido 1999 e 2006 (CVE, 2006). Alguns casos foram
e grandes quantidades de gás hidrogênio (H2). Da- confirmados clinicamente mas não foram deter-
dos da ICMSF (1996): a temperatura mínima para minados os alimentos envolvidos. Nos demais ca-
o crescimento é de 15 ºC e não crescem na presen- sos, foram envolvidos palmito industrializado em
ça de 3% de NaCl. conserva, jurubeba em conserva, carne de porco
Descrição das cepas de C. botulinum grupo IV em conserva caseira, patê de fígado, patê de fíga-
feita por Rainey et al. (2009): O grupo IV inclui do de porco caseiro, chouriço industrializado, tofu
cepas do tipo G. As células são bastonetes retos, (uma espécie de queijo feito de soja) fermentado
móveis, produzindo esporos ovais, subterminais, em conserva e torta de frango com requeijão (as-
com dilatação do esporângio. A temperatura óti- sada em supermercado e mantida à temperatura
ma para o crescimento é de 30-37 ºC. Crescem ambiente até a venda e também na residência do
bem a 25 e a 45 ºC. O crescimento é inibido por consumidor). Nos alimentos ou espécimens clí-
6,5% de NaCl, 20% de bile. Gelatina e caseína nicos analisados, foram encontradas as toxinas A
são digeridas rapidamente. A carne e o leite são e/ou B, com predomínio do tipo A.
digeridos no intervalo de três semanas. Produzem Clostrídios proteolíticos (dados de Tortorelli &
amônia e H2S. Os produtos finais de fermentação Anderson, 2015): Os clostrídios proteolíticos (pu-
incluem ácido e grandes quantidades de gás hidro- trefativos) são capazes de decompor proteínas,
gênio (H2). Dados da ICMSF (1996): A tempera- peptídeos e aminoácidos anaerobicamente, produ-
tura mínima para o crescimento é de 12 ºC e não zindo compostos sulfurosos com odor pútrido. As
crescem na presença de 3% de NaCl. espécies frequentemente associadas a alimentos são
Os esporos de C. botulinum são amplamente dis- C. botulinum tipos A e B, C. sporogenes, C. bifer-
tribuídos na natureza, podendo ocorrer em quase mentans, C. putrefasciens e C. hystolyticum. Essas
todos os alimentos, incluindo os de origem ve- espécies não crescem em pH menor do que 4,6 e,
getal e os de origem animal. Muitos alimentos já com exceção de C. putrefaciens, são mesófilas,
foram implicados na transmissão, incluindo em- crescendo entre 10 e 50 ºC. C. putrefaciens é psi-
butidos cárneos, doces, hortaliças e legumes em crotrófico, crescendo entre 0 e 30 ºC. Os esporos

são relativamente resistentes ao calor, C. sporoge- xima de 13 ºC e mínima de 1 ºC. A subsp. lara-
nes apresentando valor D121,1 ºC entre 0,1 e 1,5min miensis cresce na faixa de 3 ºC negativos a 21 ºC
(Stumbo, 1973). Podem deteriorar qualquer tipo de positivos, com ótima de 15 ºC. São batonetes Gram
alimento com pH 4,8 ou acima, sendo a principal positivos móveis, esporogênicos e os esporos re-
causa da deterioração de enlatados de baixa acidez sistem ao tratamento térmico a 80 ºC/10min mas
subprocessados. A condição clássica encontrada não a 90 ºC/10min. São sacarolíticos e os princi-
nesses produtos é o estufamento e o odor pútrido, pais produtos de fermentação de C. estertheticum
mas alteração sem gás também pode ocorrer. subsp. estertheticum são os ácidos butírico e acé-
tico (proporção 4:1) e os gases hidrogênio (30%)
Clostrídios sacarolíticos (dados de Tortorelli &
e CO2 (70%). Além disso produzem também buta-
Anderson, 2015): Os clostrídios sacarolíticos não
nol, butil butanoato, butil acetato e uma complexa
digerem proteínas e fermentam carboidratos com
mistura de ésteres e compostos sulfurosos, princi-
produção de ácidos butírico e acético, além de di-
palmente H2S e metanotiol. Na fermentação de C.
óxido de carbono e hidrogênio. As espécies mais
estertheticum subsp. laramiense predominam o
comuns em alimentos são C. butyricum, C. pas-
ácido butírico, o 1-butanol e os gases hidrogênio e
teurianum, C. tyrobutyricum, C. beijerinckii e C.
CO2, produzindo ainda ácido láctico, ácido acéti-
acetobutylicum, capazes de crescer em pH 4,2-4,4
co, ácido fórmico e etanol. A deterioração de car-
e deteriorar enlatados levemente ácidos (deriva-
nes embaladas a vácuo, chamada de “blown-pa-
dos de tomate e frutas pouco ácidas). São mesó-
ck”, não está relacionada à condições de abuso de
filos, mas alguns podem crescer em temperaturas
temperatura, ocorrendo em produtos estocados sob
de refrigeração. Os esporos são pouco resistentes
condições adequadas de refrigeração. Provoca odor
ao calor, comparados aos dos putrefativos, geral-
desagradável e estufamento acentuado das embala-
mente não sobrevivendo ao tratamento térmico
gens. Na deterioração por C. estertheticum subsp.
em autoclaves, aplicado aos alimentos de baixa
estertheticum, o odor imediatamente detectado na
acidez. São mais comuns na deterioração por con-
abertura das embalagens é descrito como sulfuro-
taminação pós-processo (vazamento) do que por
so, mudando para odor de fruta e odor de solvente,
subprocessamento. O crescimento é caracterizado
após 5min de exposição à temperatura ambiente.
por odor butírico e produção de gás.
Nos 10min seguintes passa a forte odor de queijo e
Clostrídios psicrófilos ou psicrotróficos dete- odor butanoico.
riorantes de carnes embaladas à vácuo refrige- Em 1994 foi relatado o isolamento de uma nova
radas. Os primeiros relatos associando clostrídios espécie de Clostridium de amostras deterioradas
psicrófilos à deterioração de carnes refrigeradas de carne de porco cozida, refrigerada e embala-
embaladas a vácuo foram publicados por Dain- da a vácuo, denominada Clostridium algidicarnis
ty et al. (1989) e Kalchayanand et al. (1989). As (Lawson et al. 1994). Essa espécie é psicrotrófica,
cepas isoladas foram posteriormente caracteri- com temperatura ótima na faixa de 25 a 30 ºC,
zadas como novas espécies, sendo denominadas máxima de 37 ºC e mínima (testada) de 4 ºC. Sa-
Clostridium estertheticum (Collins et al., 1992) e carolítico, fermenta carboidratos com produção
Clostridium laramie (Kalchayanand et al. 1993). de ácidos, predominando butírico e acético, mas
Estudos posteriores demonstraram estreita relação sem produção de gás. A deterioração é caracte-
entre essas cepas, que foram reclassificadas em rizada por odor nauseante, sem estufamento das
uma única espécie, dividida em duas subspécies embalagens.
- Clostridium estertheticum subsp. estertheticum Uma terceira nova espécie de Clostridium dete-
e Clostridium estertheticum subsp. laramiense riorante de carne embalada a vácuo, refrigerada
(Spring et al. 2003). Ambos são psicrófilos ver- em condições de abuso de temperatura, foi relata-
dadeiros, a subsp. estertheticum com temperatura da em 1999, denominada Clostridium frigidicar-
ótima de crescimento de 6 a 8 ºC, temperatura má- nis (Broda et al. 1999). Essa espécie é psicrotrófi-

ca, com temperatura ótima na faixa de 30-38,5 ºC, por Khianngam et al. (2010): Gram-positivos ou
máxima de 40,5 ºC e mínima de 3,8 ºC. É sacaro- negativos. Aeróbios estritos ou anaeróbios facul-
lítica, fermentando carboidratos com produção de tativos. A maioria é termotolerante e cresce bem
ácido acético, butírico, láctico e outros, etanol e em Ágar Nutriente (NA) e Ágar Tripticase de Soja
gases hidrogênio e CO2. A deterioração em carnes (TSA) a 25-30 ºC e também a 55 ºC. Algumas es-
embaladas a vácuo é do tipo “blown-pack”. pécies crescem a 10 ou 60 ºC. Algumas espécies
A quarta nova espécie de Clostridium deterio- crescem em 3% de NaCl.
rante de carne refrigerada embalada a vácuo foi Desulfotomaculum
relatada em 2000, denominada Clostridium gasi- Campbell & Postgate 1965
genes (Broda et al. 2000). Essa espécie é psicro-
trófica, com temperatura ótima na faixa de 20-22 Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016). O
ºC, máxima de 26 ºC e mínima de 1,5 ºC nega- gênero Desulfotomaculum foi criado por Campbell
tivos. É sacarolítica, fermentando carboidratos & Postgate (1965) para acomodar as bactérias es-
com produção de etanol, ácido acético, butírico porogênicas anaeróbias capazes de reduzir sulfato,
e láctico, ésteres butíricos e gases hidrogênio e produzindo sulfeto de hidrogênio (H2S). Desulfo-
CO2. A deterioração em carnes embaladas a vá- tomaculum nigrificans, anteriormente chamado de
cuo é do tipo “blown-pack”, embora com estu- “Clostridium nigrificans” é a espécie normalmente
famento menos acentuado do que o causado por encontrada em alimentos.
C. estertheticum. A deterioração não está rela- Descrição do gênero feita por Kuever & Rainey
cionada à condições de abuso de temperatura, (2009): São bastonetes retos ou curvos, com pare-
ocorrendo em produtos estocados sob condições de celular Gram positiva, mas coloração de Gram
adequadas de refrigeração. variando entre positiva e negativa. Móveis, mas
a motilidade pode ser perdida durante o cultivo.
Cohnella Kämpfer et al. 2006 Produzem esporos ovais ou esféricos, terminais
emend. Khianngam et al. 2010. a centrais, com dilatação do esporângio. Catalase
Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016). negativos, anaeróbios estritos, apresentam meta-
Esse gênero foi criado em 2006 com duas espé- bolismo respiratório, utilizando sulfato, sulfito e
cies novas, Cohnella thermotolerans, isolada em tiosulfato como aceptores de elétrons, reduzidos
uma linha de processamento de amido na Suécia a H2S. Enxofre e nitrato não são utilizados como
e Cohnella hongkongensis, isolada como “Paeni- aceptores de elétrons. Quimio-organotróficos ou
bacillus hongkongensis” (este nome nunca foi va- quimioautotróficos, utilizam compostos orgânicos
lidamente publicado) a partir de uma criança com simples como fontes de carbono e doadores de
neutropenia febril e pseudobacteremia. Posterior- elétrons, podendo ser completamente oxidados a
mente novas espécies foram adicionadas ao gêne- CO2 ou parcialmente a acetato. Metabolismo fer-
ro, cuja descrição foi corrigida por García-Fraile mentativo já foi observado em algumas espécies.
et al. (2008) e Khianngam et al. (2010). Cohnella Apresenta espécies mesófilas, com temperatura
fontinalis foi isolada a partir de água doce de uma ótima de crescimento de 30-37 ºC, e espécies ter-
fonte (Shiratori et al., 2010). mófilas, com ótima de 50-65 ºC. Crescem em pH
variando de 5,5 a 8,9, com ótimo entre 6,5 e 7,5.
Descrição do gênero feita por Kampfer et al.
(2006): Bastonetes Gram positivos, imóveis, es- Desulfotomaculum nigrificans. Anteriormente
porogênicos. Termotolerantes, crescem bem em chamado “Clostridium nigrificans”, essa espécie
Ágar Nutriente (NA) e Ágar Tripticase de Soja é reconhecida como contaminante e deteriorante
(TSA) após 24h de incubação a 25-30 ºC e tam- de alimentos comercialmente estéreis. Segundo
bém a 55 ºC. Aeróbios estritos. Correção feita Ronner & Elliott (2015) o açúcar e o amido são
por García-Fraile et al. (2008): Imóveis ou mó- as principais fontes desse microrganismo em ali-
veis. A maioria é termotolerante. Correção feita mentos. Nos produtos enlatados de baixa acidez

provocam deterioração sulfidrica, com escureci- subterminais, podendo dilatar levemente ou não
mento do conteúdo interno das embalagens, sem dilatar o esporângio. O tamanho e morfologia
estufamento. O escurecimento é causado pela das colônias é variável. Quimio-organotróficos, a
reação do H2S com o ferro das latas. Não é uma maioria não exige vitaminas, NaCl, KCl ou outros
ocorrência comum, acontecendo quando o produ- fatores de crescimento. Produzem ácido mas não
to permanece por tempo prolongado a temperatu- gás a partir de carboidratos, a maioria utilizan-
ras elevadas, permitindo a germinação de esporos do glicose, frutose, maltose, sacarose, manose e
sobreviventes. Pode ser causada por resfriamento trehalose, mas não lactose e gentibiose. Podem ser
lento e/ou estocagem em temperaturas superiores aeróbios ou anaeróbios facultativos, mas o cresci-
a 43 ºC (vending machines). mento anaeróbio pode ser fraco. Usam o oxigênio
Descrição da espécie feita por Ronner & Elliott como aceptor de elétrons, que pode ser substituí-
(2015): Anaeróbios estritos, as células são bas- do por nitrato em algumas espécies. Catalase po-
tonetes retos ou curvos, móveis, com parede ce- sitiva, oxidase variável. São termófilos, crescendo
lular típica de Gram positivos mas coloração de entre 30 e 80 ºC, com temperatura ótima na faixa
Gram negativa. Forma esporos ovais a esféricos, de 50 a 60 ºC. Neutrofílicos, o pH de crescimento
terminais a subterminais, com leve dilatação do varia entre 5 e 9, com ótimo entre 6,2 e 7,5. Fe-
esporângio. Os esporos são altamente resistentes nilalanina deaminase, indol e tirosina negativos.
ao calor, com D120 ºC entre 2 e 3min. É termófilo Hidrolisam a esculina e a gelatina, a maioria tam-
estrito, crescendo na faixa de 43 a 65-70 ºC, com bém o amido. A hidrólise da caseína varia entre as
ótimo em 55 ºC. Neutrofílicos, o pH de cresci- espécies e a do ONPG é rara.
mento varia entre 6,8 e 7,3. Crescimento muito
escasso ocasionalmente ocorre em pH 5,6, mas o Geobacillus stearothermophilus. Anteriormente
valor de 6,2 é considerado como limite inferior e chamado de “Bacillus stearothermophilus”, é um
7,8 como limite superior. “flat sour” típico, assim como B. coagulans, mas,
ao contrário de B. coagulans, a maioria das cepas
Geobacillus Nazina et al. 2001 é termófila estrita, não crescendo abaixo de 40
emend. Coorevits et al. 2012. ºC. Segundo Coorevits et al. (2012) a descrição
Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016). original dessa espécie (feita por Donk, 1920) foi
Esse gênero foi proposto por Nazina et al. (2001), baseada em número não relatado de cepas, usan-
para reclassificar as espécies de Bacillus carac- do poucas características e métodos não compa-
teristicamente termófilas. Segundo Logan et al. ráveis aos usados atualmente. Na 2ª edição do
(2009) Geobacillus stearothermophilus, anterior- Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology a
mente denominado “Bacillus stearothermophilus” taxonomia de G. stearothermophilus foi revisa-
é a espécie normalmente encontrada em alimen- da por Logan et al. (2009), que concluíram não
tos, mas Geobacillus kaustophilus, anteriormente haver uma descrição útil da espécie, reconhecida
denominado “Bacillus kaustophilus”, foi isolado como um importante deteriorante na indústria de
pela primeira vez a partir de leite pasteurizado, enlatados e de produtos lácteos. Seus esporos são
sendo também encontrado em enlatados deterio- extremamente resistentes (D121,1 ºC = 4-5min se-
rados. Geobacillus tepidamans foi isolado a partir gundo Stumbo, 1973) e capazes de sobreviver ao
de suco de beterraba na produção de açúcar. processamento térmico de alimentos de baixa aci-
Descrição do gênero feita por Coorevits et al. dez. Ainda segundo Logan et al. (2009), G. stea-
(2012): As células vegetativas são bastonetes com rothemophilus pode representar até um terço dos
composição de parede celular Gram positiva, mas termófilos isolados de alimentos e pode chegar
a coloração de Gram variando entre positiva e ne- a dois terços dos isolados de leite. Entretanto, a
gativa. Podem ser móveis ou imóveis e formam coleção de cepas reunidas ao longo dos anos, an-
esporos (um por célula) elipsoidais, terminais ou tes da criação do gênero Geobacillus (chamadas

de “Bacillus stearothermophilus”) era marcada- cresce entre 40 e 60 ºC. A faixa de pH de cresci-

mente heterogênea em suas características feno- mento é de 6 a 9. Tolera 1% de NaCl mas não 5%.
típicas e genotípicas. A descrição da espécie apre- Hidrolisa gelatina, amido, esculina e caseína, mas
sentada na 8ª edição do Bergey’s Manual of Deter- a reação com esculina e caseína pode ser fraca.
minative Bacteriology (Gibson & Gordon, 1974) Oxidase negativa. Voges Proskauer positivo, re-
reconhecia como “Bacillus stearothermophilus” dução do nitrato variável. Negativo para arginina
apenas os termófilos estritos capazes de crescer a dehidrolase, utilização do citrato (Simmon), pro-
65 ºC. Essa restrição teve o efeito de excluir as dução de H2S, indol, urease, triptofano deamina-
cepas com temperatura máxima entre 55 ºC e 65 se, lisina e ornitina descarboxilase e reação com
ºC, embora essas não pudessem ser distinguidas ONPG. Produz ácido mas não gás a partir de car-
dos termófilos estritos por nenhuma outra caracte- boidratos (flat sour).
rística. A 1ª edição do Bergey’s Manual of Syste-
matic Bacteriology (Claus & Berkeley, 1986) não Lysinibacillus Ahmed et al. 2007
mudou a taxonomia de “Bacillus stearothermo- emend. Jung et al. 2012
philus” e quando a espécie foi transferida para o emend. Zhao et al. 2015
gênero Geobacillus, a descrição feita por Nazina
et al. (2001) era praticamente a mesma de Claus & Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016).
Berkeley (1986), com muitas incoerências em re- Este gênero foi proposto para reclassificar espé-
lação aos outros relatos disponíveis. Por exemplo, cies de Bacillus (“Bacillus fusiformis” e “Bacillus
Claus & Berkeley (1986) relataram 90% ou mais sphaericus”) que apresentam lisina e aspartato no
cepas incapazes de crescer em pH 5,7, enquando peptidoglicano da parede celular e que, caracte-
White et al. (1993) encontraram 88% das cepas risticamente podem crescer na presença de boro
capazes de crescer em 5.5. Nazina et al. (2001) (60mM ou mais). Dados coletados por Schelde-
reportaram 11 a 89% das cepas como anaeróbias man et al. (2006) relatam o envolvimento de Ly-
facultativas, enquanto White et al. (1993) encon- sinibacillus sphaericus na contaminação de leite
traram 99% de cepas anaeróbias facultativas. Co- esterilizado pelo processo UHT.
orevits et al. (2012) realizaram um estudo com 62 Descrição do gênero feita por Ahmed et al.
cepas de termófilos aeróbios esporogênicos, usan- (2007): Bastonetes Gram positivos, móveis. For-
do a taxonomia polifásica (hibridização DNA-D- mam esporos elipsoidais ou esféricos com dilata-
NA, análise da sequência do gene do rRNA 16S, ção do esporângio. Catalase positivos e ativida-
análise da composição de lipídios polares e ácidos de de oxidase variável. Crescem em temperatura
graxos e caracterização fenotípica), publicando a variando de 10 a 45 ºC e em pH entre 5,5 e 9,5.
descrição corrigida de Geobacillus stearothermo- Lysinibacillus sphaericus foi descrito no gênero
philus válida atualmente. Bacillus (“Bacillus sphaericus”) na 2ª edição do
Descrição da espécie feita por Coorevits et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Lo-
(2012): Bastonetes Gram positivos, negativos ou gan & De Vos, 2009b): Bastonetes Gram positi-
varáveis, isolados ou em pequenas cadeias. Forma vos, móveis, aeróbios. Forma esporos esféricos,
esporos elipsoidias, subterminais e/ou terminais, terminais, com dilatação do esporângio. As colô-
podendo ou não dilatar o esporângio. Após 24h a nias em meios sólidos são opacas, não pigmen-
60 ºC em Ágar Tripticase de Soja (TSA) suas co- tadas, lisas e geralmente com bordas perfeitas. A
lônias são circulares, com 0,5 a 2mm, geralmen- temperatura mínima de crescimento é de 10-15 ºC
te convexas, podendo apresentar superfície lisa e e a máxima é de 30-45 ºC . Cresce em pH 7 a 9,5;
borda crenada (recortada). Cresce pobremente ou algumas cepas crescem em pH 6. Catalase e oxi-
não cresce na ausência de oxigênio. A temperatura dase positivo. Cresce na presença de 5% de NaCl
mínima de crescimento está entre 30 e 45 ºC e a mas não em 7%. Não produz ácido ou gás a partir
máxima entre 60 e 70 ºC, mas a maioria das cepas de glicose ou outros carboidratos.

Moorella Collins et al. 1994 apresentaram D121 ºC de 83min e 111min. Esses es-
poros estão entre os mais termorresistentes conhe-
Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016). cidos até o momento.
Este gênero foi proposto para reclassificar as
espécies de Clostridium que produzem aceta-
to como único produto final da fermentação de Paenibacillus Ash et al. 1994
carboidratos (“Clostridium thermoaceticum” e emend. Shida et al. 1997, gen. nov.
emend. Behrendt et al. 2010
“Clostridium thermoautotrophicum). As espécies
de Moorella têm sido isoladas predominantemen- Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016).
te de fontes termais, mas também têm sido encon- Esse gênero foi criado para reclassificar espécies
tradas em estrume de cavalo, lodo de esgoto, sedi- de Bacillus mesófilas e caracteristicamente capa-
mentos de água doce e alimentos enlatados. Car- zes de hidrolizar carboidratos complexos (amido,
lier & Bedora-Faure (2006) isolaram seis cepas a pectina, carboximetilcelulose, quitina e outros). A
partir de vários enlatados deteriorados, incluindo proposta de criação do gênero foi feita por Ash et
sopa de peixe e carne cozida. Prevost et al. (2010) al. (1993), mas o nome só foi validado em 1994 e
avaliaram 34 produtos enlatados que falharam no a descrição foi emendada por Shida et al. (1997)
teste de estabilidade a 55 ºC e encontraram Mo- e por Behrendt et al. 2010. As espécies contami-
orella thermoacetica/thermoautotrophica em 14 nantes de alimentos são Paenibacillus polymyxa,
amostras, incluindo bolinho de peixe, refeição Paenibacillus macerans e Paenibacillus lactis.
com carne, refeição com frango e legumes enlata- Stevenson & Lembke (2015) relataram casos
dos (ervilhas e cenouras, legumes mistos). esporádicos de perda de vácuo em enlatados de
Descrição do gênero feita por Wiegel (2009): baixa acidez devido á P. macerans e P. polymyxa.
Bastonetes retos isolados, aos pares ou cadeias. Segundo os autores as cepas de P. macerans e P.
Em condições de stress apresentam tendência ao polymyxa apresentam valor D100 ºC geralmente en-
polimorfismo. Geralmente Gram positivos mas tre 0,1 e 0,5min. Dados coletados por Scheldeman
culturas velhas podem se mostrar Gram negati- et al. (2006) mostraram a presença de P. lactis em
vas. Formam esporos esféricos a levemente ovais, leite cru, equipamentos de fazendas de produção
terminais ou subterminais, com dilatação do es- leiteira e leite esterilizado pelo processo UHT.
porângio. Anaeróbios estritos, quimiolitoautotró- Descrição do gênero feita por Priest (2009): Bas-
ficos e/ou heterotróficos, produzem acetato como tonetes com composição de parede celular Gram
único produto final de fermentação de carboidra- positiva mas coloração de Gram negativa ou va-
tos e outras fontes de carbono. (homoacetogêni- riável. Forma esporos ovais com dilatação do es-
cos). Termófilos estritos, a temperatura ótima é de porângio. Aeróbios ou anaeróbios facultativos, a
56-60 ºC, a máxima é de 65-68 ºC e a mínima é de maioria com reação de catalase positiva. As colô-
40-47 ºC. Byrer et al. (2000) avaliaram a resistên- nias em meios sólidos geralmente são pequenas,
cia térmica dos esporos de duas cepas de Moorella lisas, brancas ou levemente castanhas e, em alguns
thermoacetica isoladas de meio de cultura que ha- casos, amarelas ou róseas. Paenibacillus alvei e al-
via sido autoclavado a 121 ºC por 45min. Para a gumas outras espécies formam colônias que se es-
ativação dos esporos foram necessários mais de palham sobre a superfície do meio. A temperatura
2min a 100 ºC e até 90min para atingir a porcenta- ótima de crescimento encontra-se entre 28 e 40 ºC
gem máxima de germinação. O valor D121 ºC variou e o pH ótimo é 7. São inibidos por 10% de NaCl.
entre 23 e 111min, dependendo das condições de O produto final da utilização de carboidratos varia:
esporulação. Os esporos obtidos das duas cepas Paenibacillus macerans (anteriormente chamado
cultivadas em condição quimio-organotrófica a de “Bacillus macerans”) é anaeróbio facultativo e
60 ºC apresentaram D121 ºC de 44min e 38 min. Os converte glicose inicialmente a etanol, ácido acéti-
obtidos em cultura quimiolitoautotrófica a 60 ºC co e pequenas quantidades de ácido fórmico. Com

o tempo o acetato e o formato são catabolizados a Thermoanaerobacter Wiegel & Ljungdahl

H2, CO2 e acetona, mas as características usadas na 1982 emend. Lee et al. 2007
identificação são a produção inicial de ácido e a fi- Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016). O
nal de gás. Paenibacillus polymyxa (anteriormente novo gênero Thermoanaerobacter foi criado em
chamado de “Bacillus polymyxa”) é anaeróbio fa- 1982 com a descrição de uma única espécie reco-
cultativo e produz 2,3-butanodiol, etanol, CO2 e nhecida, Thermoanaerobacter ethanolicus sp. nov.
H2 a partir de carboidratos. Paenibacillus lactis é Posteriormente novas espécies foram descobertas
aeróbio estrito e produz ácido mas não gás a partir e alocadas no gênero, cuja descrição foi corrigida
de carboidratos. por Lee et al. (2007).
Dotzauer et al. (2002) isolaram Thermoanaero-
Sporolactobacillus bacter spp. a partir de vários alimentos enlatados
Kitahara & Suzuki 1963 deteriorados (carne com vegetais, carne com arroz,
Atualização da nomenclatura: Yanagida & Suzuki massa de tomate, macarrão com vegetais, espina-
(2009): O gênero Sporolactobacillus foi estabele- fre, batatas). A linhagem tipo de Thermoanaero-
cido inicialmente como um subgênero do gênero bacter mathranii subsp. alimentarius foi isolada a
Lactobacillus, para acomodar uma nova espécie 55 ºC de carne deteriorada e Thermoanaerobacter
de bactéria láctica (Sporolactobacillus inulinus) thermohydrosulfuricus tem sido isolado de várias
que se mostrava capaz de produzir esporos. Pos- fontes, incluindo suco de beterraba usado na ex-
teriormente o subgênero foi elevado ao nível de tração de açúcar (Onyenwoke & Wiegel, 2009a).
gênero e recebeu novas espécies. Descrição do gênero feita por Onyenwoke &
De acordo com Stevenson & Lembke (2015), Spo- Wiegel (2009a): Bastonetes com parede celular de
rolactobacillus não parece ser de grande importân- composição Gram positiva mas coloração de Gram
cia como deteriorante de alimentos, uma vez que variável. A maioria das espécies é móvel com mo-
forma esporos com resistência térmica comparati- vimentos lentos e vagarosos. A formação de espo-
vamente baixa e aparentemente encontra-se em nú- ros não é observada em todas as espécies, mas em
mero baixo nos produtos. Banks (1989) relata valor muitas dessas espécies foi demonstrada a presen-
D90 ºC de 4 a 7min para Sporolactobacillus inulinus ça dos genes responsáveis por produzir esporos.
e sumariza algumas poucas ocorrências em pro- As espécies que apresentam os genes mas não os
dutos como pickles, sucos de frutas concentrados, esporos (produto da sua expressão) são chamadas
produtos lácteos e mostos fermentados. Fujita et al. de asporogênicas, para distinguir de espécies não
(2010) isolaram uma espécie nova, Sporolactoba- esporogênicas (que não têm os genes da esporula-
cillus putidus, em suco de laranja deteriorado. ção). Termófilos estritos, crescem entre 35 e 78 ºC,
Descrição do gênero feita por Yanagida & Suzuki com ótimo entre 55 e 75 ºC. O pH de crescimento
(2009): Bastonetes retos Gram positivos, isolados, varia entre 4,0 e 9,9, com ótimo entre 5,8 e 8,5.
em pares e, mais raramente, em pequenas cadeias,
Thermoanaerobacterium Lee et al. 1993,
móveis em sua maioria. Os esporos são raramen-
gen. nov. emend. Cann et al. 2001
te observados e resistem ao calor a 80 ºC/10min.
Anaeróbios facultativos ou microaerófilos, homo- Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016).
fermentativos, produzem ácido láctico a partir de Esse gênero foi criado para reclassificar as espé-
glicose e de um número limitado de outros carboi- cies de Clostridium caracteristicamente termófilas
dratos. A presença de um carboidrato fermentável e sacarolíticas.
é essencial para o crescimento, crescendo bem De acordo com Onyenwoke & Wiegel (2009b) o
em meios contendo glicose. Não cresce ou cresce habitat dessas bactérias são fontes termais, mas
muito pobremente em Caldo Nutriente (NB). Me- também têm sido encontradas em associação
sófilos, catalase e oxidase negativos. com resíduos da produção de sucos de frutas. A

espécie de maior importância em alimentos co- prolongada em temperaturas acima de 35 ºC, por-
mercialmente estéreis é Thermoanaerobacterium que dificilmente crescem a 32 ºC. Podem provo-
thermosaccharolyticum. O envolvimento das ou- car deterioração em 14 dias a 37 ºC se os espo-
tras espécies com alimentos não é claro. Thermo- ros germinarem enquanto o produto ainda estiver
anaerobacterium polisaccharolyticum e Thermo- numa temperatura maior. A alteração é caracteri-
anaerobacterium zeae são espécies novas, desco- zada por estufamento (grande formação de gás),
bertas no resíduo orgânico do processamento de perda de vácuo e decréscimo do pH. As principais
milho verde e outros vegetais enlatados (Cann et causas são resfriamento lento e/ou estocagem em
al., 2001). Entretanto, nas condições testadas pe- temperaturas superiores a 35 ºC (como em ven-
los autores, não foi observada a produção de es- ding machines). Também pode ocorrer contami-
poros por essas espécies. Dotzauer et al. (2002), nação das latas por vazamento se o microrganis-
investigando a causa de perda de vácuo em vá- mo crescer e se acumular na área de resfriamento
rios alimentos enlatados, detectaram a presença das autoclaves hidrostáticas. A fonte mais comum
de Thermoanaerobacterium saccharolyticum, dos esporos é o solo e os ingredientes como açú-
Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes e car, leite em pó, amidos e farinhas. Descrição da
Thermoanaerobacterium sp em produtos de baixa espécie feita por Enache & Podolak (2015): Bas-
acidez e em purê de tomate. tonetes longos e finos, retos ou levemente curvos.
Descrição do gênero feita por Onyenwoke & Coram fracamente na coloração de Gram, pare-
Wiegel (2009b): São bastonetes móveis com es- cendo Gram negativos. Formam esporos terminais
trutura de parede celular Gram positiva, mas vá- dilatando o esporângio. Os esporos são altamente
rias cepas apresentam coloração de Gram nega- resistentes ao calor, com valor D121 ºC de 3-4min ou
tiva. Nem todas as espécies produzem esporos mais e valor z de 6-7 ºC (8,9 a 12,2 ºC de acordo
nas condições testadas até o momento, mas os com Stumbo, 1973). Anaeróbios estritos, forte-
genes responsáveis por esporulação estão presen- mente sacarolíticos, não crescem na ausência de
tes (espécies asporogênicas). Anaeróbios estritos, um carboidrato fermentável. Produzem ácido acéti-
catalase negativos. Quimiorganotróficos, saca- co, butírico e láctico, bem como grande quantidade
rolíticos, fermentam carboidratos com produção gás (H2 e CO2) a partir da glicose, lactose, sacarose,
de gás. Os principais produtos da fermentação da salicina e amido. Não hidrolisam proteínas. Não
glicose são ácido acético, etanol, ácido láctico, H2 reduzem nitrato a nitrito. Não patogênicos, não
e CO2. São termófilos estritos, com temperatura produzem toxinas. A temperatura ótima de cresci-
mínima de 35 ºC, máxima de 75 ºC e ótima entre mento é de 55 a 68 ºC e raramente crescem a 32 ºC.
55 e 70 ºC. O pH de crescimento varia na faixa O pH ótimo é de 6,2 a 7,2, crescem rapidamente
de 3,2 a 8,5. A espécie com menor pH ótimo é em pH 4,7 e já foram implicados na deterioração
Thermoanaerobacterium aotearoense (pH 5,2) e de produtos de tomate com pH de 4,1 a 4,5. Segun-
a espécie com menor pH mínimo é Thermoanae- do Onyenwoke & Wiegel (2009b) o pH ótimo para
robacterium aciditolerans (pH 3,2). esporulação é de 5,0-5,5 e as células não esporulam
T. thermosaccharolyticum. Anteriormente cha- em meios contendo glicose.
mado de “Clostridium thermosaccharolyticum”,
esta espécie é conhecida há decadas por provocar Virgibacillus Heyndrickx et al. 1998, gen.
nov. emend. Heyrman et al. 2003
estufamento em enlatados. Segundo Enache &
Podolak (2015), seus esporos podem sobreviver Atualização da nomenclatura: Euzéby (2016).
ao processamento térmico normal de alimentos Esse gênero foi proposto por Heyndrickx et al.
de baixa acidez, uma vez que se encontram entre (1998), para reclassificar cepas anteriormente
os mais resistentes conhecidos. Sua multiplicação classificadas como “Bacillus pantothenticus”, de-
nos produtos, entretanto, não é uma ocorrência pendentes de ácido pantotênico, tiamina e biotina
comum e só acontece em caso de permanência para crescimento.

De maneira geral, não são contaminantes normais dium of Methods for the Microbiological Exami-
de alimentos, mas levantamento feito por Schelde- nation of Foods (Evancho et al., 2015, Olson &
man et al. (2005) detectou a presença de espécies Sorrells, 2015).
desse gênero em leite cru, equipamentos e ambien- No Capítulo 26 (Olson & Sorrells, 2015) o Com-
te de fazendas de produção leiteira. Virgibacillus pendium trata da contagem de esporos de termófilos
pantothenticus foi originalmente isolado do solo, “flat sour” em geral. O objetivo é a quantificação de
mas também foi encontrado em carne de frango G. stearothermophilus e B. coagulans, “flat-sour”
enlatada. Virgibacillus proomii já foi isolado do típicos que produzem ácido suficiente para provo-
solo e da água (Heyrman et al., 2009). Tanasu- car viragem ácida (halo amarelo) no Ágar Dextrose
pawat et al. (2010) isolaram Virgibacillus dokdo- Triptona (DTA), incubado entre 50 e 55 ºC/48-72h.
nensis, Virgibacillus halodenitrificans, Virgiba- Outras espécies termófilas também podem crescer
cillus marismortui, Virgibacillus siamensis e Virgi- e as que produzem quantidades menores de ácido
bacillus sp. a partir de um tipo de peixe fermentado não apresentam o halo amarelo (que também pode
(pla-ra) na Tailândia. Kim et al. (2011) isolaram ser perdido por reversão alcalina). Os termófilos ae-
Virgibacillus alimentarius de um tipo tradicional róbios totais são a soma de todas essas cepas, que
de refeição coreana feita com frutos do mar salga- produzem colônias com e sem viragem ácida.
dos e fermentados. Quesada et al. (2007) isolaram
No Capítulo 25 (Evancho et al., 2015) o Compen-
Virgibacillus olivae a partir do resíduo do proces-
dium trata mais especificamente dos termófilos
samento de azeitonas verdes em conserva. Seiler
“flat sour” acidúricos ou acidófilos, sendo B. coa-
& Wenning (2013) isolaram Virgibacillus haloto-
gulans e A. acidoterrestris as espécies típicas des-
lerans a partir de cream cheese com pH 5,8-6,2
se grupo. Os métodos para Alicyclobacillus são
processado a 90-95 ºC/5-10min.
diferenciados mas, para a contagem de B. coagu-
Descrição do gênero feita por Heyrman et al. lans, são basicamente os mesmos do Capítulo 26,
(2009): Bastonetes Gram positivos, isolados, em com pequenas variações.
pares em cadeias e, em culturas velhas, em fila-
mentos. Formam esporos esféricos a elipsoidais, 22.2.1. Material requerido para a
terminais (às vezes subterminais ou paracentrais) análise
e dilatam o esporângio. Aeróbios estritos ou fraca-
mente anaeróbios facultativos. Catalase positivos. □ Água destilada estéril
Tolerantes ao sal, o crescimento é estimulado pela □ Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,02N
presença de 4 a 10% de NaCl, algumas espécies estéril (para análise de leite em pó)
não crescem ou crescem pobremente em sua au- □ Ágar Dextrose Triptona (DTA)
sência e várias crescem em 20 a 25%. A tempera- □ Ágar Selo (ágar 2% para sobrecamada na aná-
tura de crescimento varia entre 10 e 50 ºC, com lise de amido)
ótimo entre 28 e 37 ºC. □ Ágar Thermoacidurans (TAA) (opcional para
a contagem separada de B. coagulans)
□ Mistura aquosa de goma tragacanto 2% e goma
arábica 1% estéril (para a análise de creme de
22.2. Métodos APHA 25:2015 e leite)
APHA 26:2015 para contagem □ Erlenmeyer de 250 ml estéril
de esporos de termófilos □ Tubos de 25x150mm estéreis (para a análise
aeróbios totais e “flat-sour” de tomates, polpa ou purê de tomate e leite
concentrado)
Metodologia da American Public Health Associa- □ Placas de Petri estéreis vazias
tion (APHA) para a análise de alimentos, descrita □ Banho-maria à temperatura de ebulição ou ba-
nos Capítulos 25 e 26 da 5ª edição do Compen- nho de óleo a 110 ºC

□ Banho-maria à temperatura de 90 ºC (para a Inoculação e incubação. Após o choque térmico,

análise de tomates, polpa ou purê de tomate e distribuir 10 ml da solução em cinco placas de Pe-
leite concentrado) tri estéreis (2 ml/placa) e verter aproximadamente
□ Autoclave operando a 108,4 ºC (5 libras de 20 ml de Ágar Dextrose Triptona (DTA) sobre o
pressão) inóculo, misturando bem. Aguardar a solidifica-
□ Estufa incubadora regulada entre 50 e 55 ºC ção do ágar e incubar as placas invertidas, à tem-
□ Estufa incubadora regulada a 55±1 ºC peratura de 50 a 55 ºC por 48 a 72h.
□ Termômetro calibrado Contagem das colônias e cálculo dos resulta-
dos. Para a enumeração dos esporos de termófilos
22.2.2. Procedimento para a aeróbios totais, contar as colônias presentes em
análise de açúcar todas as placas, multiplicar por cinco e apresen-
Descrito no Capítulo 26 do Compendium (Olson tar o resultado como o número de esporos/10g de
& Sorrells, 2015), também é o procedimento pa- amostra. Para a enumeração dos esporos dos ter-
drão da AOAC International (AOAC Official Me- mófilos “flat-sour”, contar apenas as colônias com
thod 972.45), recomendado pela National Food halo amarelo, características dos “flat-sour”, mul-
Processors Association (NFPA) norte-america- tiplicar por cinco e apresentar o resultado como o
na (anteriormente chamada de National Canners número de esporos de termófilos “flat-sour”/10g
Association) para o controle da contaminação de de amostra. Para obter o número de esporos/g, di-
enlatados por esporos de bactérias termófilas. No vidir o número de colônias por dois.
padrão da NFPA para termófilos “flat sour”, amos-
tras de lotes de açúcar para enlatados não devem 22.2.3. Procedimento para a
apresentar mais do que 75 esporos, no total de cin- análise de amido
co unidades de amostra e média de não mais que 50 Descrito no Capítulo 26 do Compendium (Olson
esporos/10g. Para esporos de termófilos totais, não & Sorrells, 2015), é o procedimento recomen-
devem apresentar mais do que 150 esporos no total dado pela National Food Processors Association
das cinco unidades de amostra e média de não mais (NFPA) norte-americana, para o controle da con-
que 125 esporos/10g. Essas recomendações podem taminação de enlatados por esporos de bactérias
ser usadas como guia para outros ingredientes, le- termófilas. No padrão da NFPA para termófilos
vando em conta a proporção do ingrediente no pro- “flat sour”, amostras de lotes de amido para enla-
duto final, em comparação com o açúcar. tados não devem apresentar mais do que 75 espo-
Choque térmico. Pesar 20g da amostra (ou o peso ros, no total de cinco unidades de amostra e média
equivalente a 20g, no caso de açúcar líquido) em de não mais que 50 esporos/10g. Para esporos de
um Erlenmeyer de 250 ml com marcação no volu- termófilos totais, não devem apresentar mais do
me de 100 ml. Adicionar água destilada estéril até que 150 esporos no total das cinco unidades de
a marca de 100 ml, dissolver o açúcar por agitação, amostra e média de não mais que 125 esporos/10g.
aquecer a solução até a fervura e manter sob fervu-
Choque térmico. Pesar 20g da amostra em um
ra por cinco minutos. Resfriar imediatamente e re-
Erlenmeyer de 250 ml seco, com marcação no vo-
por o volume evaporado com água destilada estéril.
lume de 100 ml. Adicionar água destilada estéril
Nota) Cálculo do peso equivalente (PE) a 20g para açú-
até a marca de 100 ml e suspender o amido. Sob
car líquido: Considerar a graduação Brix como a
percentagem (peso/peso) de açúcar na solução, cal- constante agitação, pipetar 10 ml da suspensão
culando o valor equivalente por regra de três simples. e transferir para um Erlenmeyer com 100 ml de
Exemplo: açúcar líquido com 50ºBrix. Ágar Dextrose Triptona (DTA) estéril, fundido e
100g de solução ...................................... 50g de açúcar resfriado a 55-60 ºC. Transferir o frasco para um
Peso equivalente (PE) ............................. 20g de açúcar banho fervente e garantir que o volume de água
PE = 100 x 20/50 = 40g do banho seja suficiente para cobrir o frasco até a

altura da superfície do meio. Manter no banho por temperatura do banho, contar cinco minutos e res-
três minutos, sob constante agitação, para gelati- friar imediatamente em banho de gelo, descartan-
nizar o amido. Aplicar então o choque térmico em do o tubo controle. Na análise de produtos recém
autoclave, 108,4 ºC/10min (procedimento padrão processados, submetidos à temperatura de 82 ºC
da NFPA), ou mantendo no próprio banho, sob ou maior, o choque térmico pode ser dispensado.
fervura, até completar 30min. Inoculação e incubação. Após o choque térmi-
Inoculação e incubação. Após o choque térmi- co, transferir quatro porções de 1 ml da amostra
co, resfriar a amostra, agitando delicadamente, (e diluições decimais, se necessárias) para quatro
para evitar a incorporação de bolhas. Distribuir os placas de Petri estéreis vazias. Para a contagem de
100 ml de DTA em cinco placas de Petri estéreis esporos de termófilos aeróbios totais e “flat sour”,
(aproximadamente 20 ml/placa). Aguardar a so- verter sobre duas placas, 18-20 ml de Ágar Dextro-
lidificação do meio, cobrir a superfície com uma se Triptona (DTA). Para contar apenas B. coagu-
sobrecamada de ágar 2% estéril, para prevenir es- lans, verter sobre as outras duas placas, 18-20 ml
palhamento. Incubar as placas invertidas a 50-55 de Ágar Thermoacidurans (TAA). Homogeneizar
ºC/48-72h. bem, aguardar a completa solidificação do meio e
Contagem das colônias e cálculo dos resulta- incubar as placas invertidas a 55±1 ºC/48±3h.
dos. Para a enumeração dos esporos de termófilos Contagem das colônias e cálculo dos resul-
aeróbios totais, contar as colônias presentes em tados. Para a determinação do número de espo-
todas as placas, multiplicar por cinco e apresen- ros de termófilos aeróbios totais/ml de amostra,
tar o resultado como o número de esporos/10g de contar todas as colônias das duas placas de DTA,
amostra. Para a enumeração dos esporos dos ter- multiplicar pelo inverso da diluição (se foi feita
mófilos “flat-sour”, contar apenas as colônias com diluição), tirar a média e apresentar o resultado
halo amarelo, características dos “flat-sour”, mul- como o número de esporos/ml de amostra. Para
tiplicar por cinco e apresentar o resultado como o a enumeração dos esporos dos termófilos “flat-
número de esporos de termófilos “flat-sour”/10g -sour”, contar apenas as colônias com halo ama-
de amostra. Para obter o número de esporos/g, di- relo nas placas de DTA, multiplicar pelo inverso
vidir o número de colônias por dois. da diluição (se foi feita diluição), tirar a média e
apresentar o resultado como o número de esporos/
22.2.4. Procedimento para a ml de amostra. Para a determinação do número
análise de tomates inteiros, de esporos de B. coagulans/ml de amostra, contar
polpa de tomate, purê de tomate todas as colônias das duas placas de TAA, multi-
e leite concentrado plicar pelo inverso da diluição (se foi feita dilui-
ção), tirar a média e apresentar o resultado como
Descrito no Capítulo 25 do Compendium (Evan- o número de esporos/ml de amostra.
cho et al., 2015).
Choque térmico. Transferir duas porções de 10 ml 22.2.5. Procedimento para
da amostra para dois tubos estéreis de 25x150mm.
a análise de leite em pó
Os tomates inteiros devem ser homogeneizados
desnatado
em liquidificador, sem adição de diluente, para a
retirada da unidade analítica de 10 ml. Colocar os Descrito no Capítulo 25 do Compendium (Evan-
tubos em um banho a 90 ºC, garantindo que o vo- cho et al., 2015).
lume de água do banho seja suficiente para cobrir Choque térmico. Pesar 10g da amostra em um
os tubos até a altura da superfície da amostra. Con- Erlenmeyer de 250 ml, com marcação no volume
trolar a temperatura de subida do produto com um de 100 ml. Dissolver o leite em uma solução esté-
termômetro introduzido em um dos tubos (contro- ril de NaOH 0,02N, adicionada até a marca de 100
le). A partir do instante em que o produto atingir a ml. Autoclavar por 10min a cinco psi de pressão

(108,4 ºC), resfriar imediatamente e repor o volu- todas as placas, multiplicar por cinco e apresentar
me evaporado com NaOH 0,02N estéril. o resultado como o número de esporos/10 ml de
Inoculação e incubação. Distribuir 20 ml da amostra. Para a enumeração dos esporos dos ter-
amostra em 10 placas de Petri estéreis (2 ml/pla- mófilos “flat-sour”, contar apenas as colônias com
ca) e verter 18 a 20 ml de DTA sobre o inóculo, halo amarelo, características dos “flat-sour”, mul-
misturando bem. Aguardar a completa solidifica- tiplicar por cinco e apresentar o resultado como o
ção do meio e incubar as placas invertidas a 55±1 número de esporos de termófilos “flat-sour”/10 ml
ºC/48±3h. de amostra. Para obter o número de esporos/ml,
dividir o número de colônias por dois.
Contagem das colônias e cálculo dos resulta-
aeróbios totais, contar as colônias presentes em 22.2.7 Procedimento para a análise
todas as placas, multiplicar por cinco e apresen- de outros alimentos (geral)
tar o resultado como o número de esporos/10g de O esquema geral de análise para contagem de es-
amostra. Para a enumeração dos esporos dos ter- poros de termófilos aeróbios totais e “flat sour”
mófilos “flat-sour”, contar apenas as colônias com em alimentos encontra-se descrito na Figura 22.1.
halo amarelo, características dos “flat-sour”, mul- O Capítulo 26 do Compendium (Olson & Sorrells,
tiplicar por cinco e apresentar o resultado como o 2015), recomenda os mesmos métodos utilizados
número de esporos de termófilos “flat-sour”/10g para açúcar ou amido, com as modificações ade-
de amostra. Para obter o número de esporos/g, di- quadas às características físicas ou químicas da
vidir o número de colônias por dois. amostra. O procedimento descrito abaixo é simi-
lar ao descrito para amido e aplica-se a uma gama
22.2.6. Procedimento para a bastante variada de produtos.
análise de creme de leite Inoculação e choque térmico. Pesar 20g da
amostra em um frasco com marcação no volume
Descrito no Capítulo 25 do Compendium (Evan- de 100 ml. Adicionar água destilada estéril até a
cho et al., 2015). marca de 100 ml e homogeneizar. Transferir 10
Choque térmico. Misturar 2g de goma tragacanto ml da amostra homogeneizada para um Erlen-
e 1g de goma arábica em 100 ml de água destila- meyer de 300 ml, com 100 ml de Ágar Dextrose
da e esterilizar a 121 ºC/20min. Transferir 20 ml Triptona (DTA) estéril, fundido e resfriado a 55-
da amostra de creme de leite para um Erlenmeyer 60 ºC. Misturar a amostra com o meio de cultura,
de 250 ml, com marcação no volume de 100 ml. transferir o Erlenmeyer para um banho fervente e
Misturar o creme com a mistura de gomas, adicio- manter no banho por 30min. Garantir que o volu-
nada até a marca de 100 ml. Autoclavar por 5min me de água do banho seja suficiente para cobrir
a cinco libras de pressão (108,4 ºC). o Erlenmeyer até a altura da superfície do meio.
Inoculação e incubação. Sem esfriar a amostra, O choque térmico também pode ser feito a 110
distribuir imediatamente 10 ml em cinco placas ºC/10min (banho de óleo ou autoclave).
de Petri (2 ml/placa), adicionando o meio de cul- Nota) O choque térmico especificado no Capítulo 26 do
tura (18-20 ml de DTA) antes da amostra, devido Compendium (Olson & Sorrells, 2015), para apli-
cação geral, é de 30min a 100 ºC ou 10min a 110
à viscosidade do material. Misturar o inóculo com
ºC. Não é citada a necessidade de controle da subida
o meio da maneira usual. Aguardar a completa soda temperatura, pressupondo-se que a contagem do
lidificação do meio e incubar as placas invertidas tempo seja iniciada a partir do momento em que os
a 55±1 ºC/48±3h. frascos sejam colocados no banho ou autoclave. É
importante que o choque térmico seja feito em Er-
Contagem das colônias e cálculo dos resulta- lenmeyer de 300 ml, porque o procedimento, sem
dos. Para a enumeração dos esporos de termófilos acompanhar o tempo de subida da temperatura, é pa-
aeróbios totais, contar as colônias presentes em dronizado para esse tipo de frasco.

Figura 22.1. Esquema de análise para contagem de esporos de termófilos aeróbios totais e “flat sour” em alimentos
pelo método APHA 26:2015 (Olson & Sorrells, 2015).

Incubação. Após o choque térmico, resfriar a produto, sem uma exata quantificação. Sua princi-
amostra, agitando delicadamente, para evitar a pal aplicação é o controle da matéria-prima, para
incorporação de bolhas. Distribuir os 100 ml de limitar a introdução dos esporos na formulação de
DTA em cinco placas de Petri estéreis (aproxima- enlatados, embora também possa ser aplicada na
damente 20 ml/placa), aguardar a completa soli- análise dos produtos processados ou na linha de
dificação do ágar e incubar as placas, invertidas, a processamento. Amostras de lotes de matéria-pri-
50-55 ºC/48-72h. ma para enlatados não devem apresentar esporos
Nota) O Capítulo 26 do Compendium (Olson & Sorrells, em mais do que 60% das unidades de amostra ana-
2015) não estabelece a variação máxima de tempera- lisadas ou em mais do que 66% dos tubos de meio
tura e tempo recomendável na incubação. No Capí- de cultura inoculados por unidade de amostra.
tulo 25 (Evancho et al., 2015), mais específico para
“flat sour” acidúricos, estabelece a temperatura de 55 Alimentos enlatados com suspeita de deterioração
ºC, com variação máxima de ±1 ºC. por termófilos anaeróbios não devem ser refrige-
rados porque as células vegetativas dessas bac-
Contagem das colônias e cálculo dos resulta-
térias morrem sob refrigeração e não é comum a
produção de esporos nos produtos.
aeróbios totais, contar as colônias presentes em
todas as placas, multiplicar por cinco e apresen-
tar o resultado como o número de esporos/10g de
amostra. Para a enumeração dos esporos dos ter- análise
mófilos “flat-sour”, contar apenas as colônias com □ Água destilada estéril
halo amarelo, características dos “flat-sour”, mul- □ Tubos de Meio PE-2 ou Caldo de Fígado (CF)
tiplicar por cinco e apresentar o resultado como o □ Ágar Selo (Ágar 2%) ou Vaspar (Vaselina:Pa-
número de esporos de termófilos “flat-sour”/10g rafina 1:1)
de amostra. Para obter o número de esporos/g, di- □ Frasco ou Erlenmeyer estéril e seco (com pé-
vidir o número de colônias por dois. rolas de vidro no caso de amostras de amido e
farinhas)
□ Banho-maria à temperatura de ebulição
22.3. Métodos APHA 27:2015 □ Estufa incubadora regulada a 55±2 ºC
para detecção de esporos □ Termômetro calibrado
de termófilos anaeróbios
não produtores de H2S 22.3.2. Procedimento para a
(Thermoanaerobacterium análise de açúcar e leite em pó
thermosaccharolyticum) Choque térmico. Pesar 20g da amostra (ou o
peso equivalente a 20g, no caso de açúcar líquido)
Metodologia da American Public Health Associa- em um frasco ou Erlenmeyer com marcação no
tion (APHA) para a análise de alimentos, descrita volume de 100 ml. Adicionar água destilada esté-
no Capítulo 27 da 5ª edição do Compendium of ril até a marca de 100 ml, dissolver a amostra por
Methods for the Microbiological Examination of agitação, aquecer a solução até a fervura e manter
Foods (Enache & Podolak, 2015). sob fervura por cinco minutos. Resfriar imediata-
Esses métodos objetivam a detecção de T. ther- mente e repor o volume evaporado com água des-
mosaccharolyticum, espécie típica de bactéria tilada estéril. Para o cálculo do peso equivalente a
esporogênica anaeróbia sacarolítica, produtora de 20g para açúcar líquido, seguir as orientações do
gás e não produtoras de H2S. Os ensaios não são item 22.2.2.
quantitativos, mas sim, técnicas que detectam a Inoculação e incubação. Após o choque térmi-
presença dos esporos em uma dada quantidade de co, distribuir 20 ml da amostra diluída (equiva-

lente a 4g da amostra original) em seis tubos de ca de 100 ml, agitando até obter uma suspensão
Meio PE-2 ou Caldo de Fígado (CF) previamente homogênea. Sob constante agitação, distribuir 20
desaerados (aproximadamente 3,3 ml/tubo). Re- ml da suspensão (4g da amostra) em seis tubos
cobrir a superfície do meio com uma camada de (3,3 ml/tubo) de meio PE-2 ou Caldo de Fígado
15mm de ágar selo (ágar 2%) ou vaspar. Aguar- (CF) previamente desaerados e submeter à fervu-
dar a solidificação do ágar e incubar os tubos a ra em banho por 15min. Garantir que o volume de
55±2 ºC/72h. Observação: Usar tubos com tam- água do banho seja suficiente para cobrir os tubos
pão de algodão ou tubos de rosca com as tampas até a altura da superfície do meio. Durante os pri-
afrouxadas na incubação, para permitir o escape meiros cinco minutos de fervura, até a gelatiniza-
do excesso de gás. ção da amostra, agitar constante e delicadamente
Nota) Para o sucesso das análises, é importante garan-
os tubos por inversão, de forma a dispersar amos-
tir a ausência de resíduos de pesticidas nas ervilhas tra, porém, sem introduzir ar no meio de cultura.
utilizadas na formulação do Meio PE-2. Além disso, Incubação e leitura dos resultados. Após o choque
antes da esterilização, as ervilhas devem permaner térmico, resfriar os tubos em banho de gelo e cobrir
uma hora de molho no caldo de cultura, para garantir
a eficiência da esterilização. Os lotes de PE-2 pre-
a superfície do meio de cultura com uma camada de
parados devem ser testados com uma cepa padrão 3 ml de ágar selo ou vaspar. Incubar a 55±2 ºC/72h,
de T. thermosaccharolyticum, para verificar se não interpretando os resultados da mesma forma descri-
há inibição e prevenir falsos resultados negativos. ta para açúcar e leite em pó (item 22.3.2).
Tubos não utilizados podem ser submetidos a novo
processo de esterilização, sem prejuízo das análises.
O método padrão da AOAC para açúcar (AOAC Of-
ficial Method 972.45) recomenda o Caldo de Fígado
22.3.4. Procedimento para a
em lugar do PE-2. Entretanto, o Compendium reco- análise de cereais e massas
menda que seja utilizado o meio comercial, porque, alimentícias
na formulação preparada em laboratório, o fígado
bovino pode conter inibidores, incluindo antibióti- Pesar 50g da amostra em um frasco de homoge-
cos. Tanto o PE-2 como o CF devem ser desaerados neização e adicionar 200 ml de água destilada es-
antes do uso, por fervura em banho/15min, com as
téril. Homogeneizar por três minutos em liquidifi-
tampas desrosqueadas, e resfriamento imediato em
banho de gelo. cador e distribuir 20 ml da amostra em seis tubos
(3,3 ml/tubo) de meio PE-2 ou Caldo de Fígado
Leitura e interpretação dos resultados. A ob- previamente desaerados. Submeter ao choque tér-
servação de crescimento em um ou mais tubos de mico e incubação da mesma forma descrita para
cultura, com abundante produção de gás, deslo- amido e farinhas (item 22.3.3), porém, interpretar
cando o ágar selo para cima, indica a presença de os resultados assumindo que 10 ml da amostra ho-
esporos de anaeróbios termófilos não-produtores mogeneizada contêm 2g da amostra original.
de H2S, na quantidade de amostra inoculada. Ter-
mófilos tipo “flat-sour” também podem crescer
nessas condições, mas não produzem gás e, no 22.3.5. Procedimento para a
PE-2, podem ser diferenciados pela alteração da análise de cogumelos frescos
cor do meio (viragem de púrpura para amarelo).
Homogeneizar 200g da amostra em um liquidi-
ficador estéril, sem adição de diluente, interrom-
pendo o processo e agitando o jarro várias vezes,
análise de amido e farinhas
para uma boa homogeneização. Transferir 20g
Inoculação e choque térmico. Pesar 20g da da amostra homogeneizada para um frasco com
amostra em um frasco seco, com marcação no marcação no volume de 100 ml e seguir o mesmo
volume de 100 ml, contendo algumas pérolas de procedimento descrito para açúcar e leite em pó
vidro. Adicionar água destilada estéril até a mar- (item 22.3.2).

22.3.6. Procedimento para a □ Erlenmeyer de 250 ml estéril e seco (com pé-

análise de produtos na linha de rolas de vidro no caso de amostras de amido e
processamento farinhas)
□ Banho-maria à temperatura de ebulição
Transferir 100g da amostra para um frasco de ho-
□ Autoclave operando a 108,4 ºC (5 libras de
mogeneização e homogeneizar por três minutos
pressão)
em liquidificador, sem adição de diluente. Dis-
□ Estufa incubadora regulada entre 50 e 55 ºC
tribuir 20g ou 20 ml da amostra homogeneizada
□ Estufa incubadora regulada entre 55±1 ºC
em seis tubos de meio PE-2 ou Caldo de Fíga-
(para a análise de isolados proteicos de soja)
do previamente desaerados e continuar a análise
da mesma forma descrita para amido e farinhas □ Termômetro calibrado
(item 22.3.3).
análise de açúcar
22.4. Métodos APHA 28:2015 AOAC Official Method 972.45, descrito no Capí-
para contagem de esporos tulo 28 do Compendium (Ronner & Elliott, 2015).
de termófilos anaeróbios Choque térmico. Pesar 20g da amostra (ou o
peso equivalente a 20g, no caso de açúcar líquido)
produtores de H2S em um Erlenmeyer de 250 ml com marcação no
(Desulfotomaculum volume de 100 ml. Adicionar água destilada esté-
nigrificans) ril até a marca de 100 ml, dissolver o açúcar por
agitação, aquecer a solução até a fervura e manter
Metodologia da American Public Health Associa- sob fervura por cinco minutos. Resfriar imediata-
tion (APHA) para a análise de alimentos, descrita mente e repor o volume evaporado com água des-
no Capítulo 28 da 5ª edição do Compendium of tilada estéril. Para o cálculo do peso equivalente
Methods for the Microbiological Examination of a 20g para açúcar líquido, seguir a orientação do
Foods (Ronner & Elliott, 2015). O procedimento item 22.2.2.
para a análise de açúcar é o padrão da Association Inoculação e incubação. Após o choque térmico,
of Official Analytical Chemists (AOAC Official distribuir 20 ml da solução (4g da amostra) em seis
Method 972.45). tubos de Ágar Sulfito previamente fundidos e de-
Esses métodos objetivam a detecção de Desulfo- saerados. Depositar o inóculo abaixo da superfície
tomaculum nigrificans, espécie típica de bactéria do meio e agitar delicadamente por inversão, para
esporogênica anaeróbia sacarolítica produtora de misturar sem introduzir ar. Resfriar rapidamente em
H2S. banho de gelo e incubar a 50-55 ºC/48h. Fazer uma
leitura preliminar com 20-24±3 horas de incubação,
22.4.1. Material requerido para a pois pode haver crescimento de cepas termófilas
análise anaeróbias que não produzem H2S mas reduzem o
sulfato e produzem gás, escurecendo completamen-
□ Água destilada estéril
te o meio e provocando o rompimento do ágar.
□ Água peptonada 0,1% (para análise de isola-
dos proteicos de soja) Contagem das colônias e cálculo dos resulta-
dos. Após o período de incubação, contar as colô-
□ Tubos de Ágar Sulfito
nias características de D. nigrificans em todos os
□ Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,02N tubos inoculados (colônias pretas, sem formação
estéril (para análise de leite em pó) de gás) e calcular o número de Esporos/10g = 10 x
□ Vaspar ou Ágar Selo (Ágar 2%) Número total de colônias nos seis tubos/4.

22.4.3. Procedimento para a to previamente fundidos e desaerados. Depositar

análise de amido e farinhas o inóculo abaixo da superfície do meio e agitar
delicadamente por inversão, para misturar sem
Adaptado a partir do AOAC Official Method introduzir ar. Incubar a 50-55 ºC/24-48±3h. Fa-
972.45, descrito no Capítulo 28 do Compendium zer uma leitura preliminar com 20-24±3 horas de
(Ronner & Elliott, 2015). incubação, pois pode haver crescimento de cepas
Pesar 20g da amostra em um Erlenmeyer seco termófilas anaeróbias que não produzem H2S mas
com marcação no volume de 100 ml, contendo al- reduzem o sulfato e produzem gás, escurecendo
gumas pérolas de vidro. Adicionar água destilada completamente o meio e provocando o rompi-
estéril até a marca de 100 ml, agitando até obter mento do ágar. Contar as colônias características
uma suspensão homogênea. Sob constante agita- de D. nigrificans nos dois tubos inoculados (co-
ção, distribuir 20 ml da suspensão (4g da amostra) lônias pretas, sem formação de gás) e calcular o
em seis tubos de Ágar Sulfito previamente fundi- número de Esporos/10g = 50 x Número total de
dos e desaerados. Depositar o inóculo abaixo da colônias nos dois tubos.
superfície do meio e agitar delicadamente por in-
versão, para misturar sem introduzir ar. Submeter 22.4.5. Procedimento para a análise
os tubos à fervura em banho por 15min, agitan- de isolados proteicos de soja
do frequente e delicadamente por inversão, dis-
persando a amostra sem introduzir ar no meio de Descrito no Capítulo 28 do Compendium (Ronner
cultura. Garantir que o volume de água do banho & Elliott, 2015).
seja suficiente para cobrir os tubos até a altura da Preparar uma suspensão 10% da amostra em água
superfície do meio. Após o choque térmico, res- peptonada 0,1% e ajustar o pH em 7,0. Autoclavar
friar os tubos em banho de gelo e incubar a 50-55 por 20min a cinco libras de pressão (108,4 ºC) e
ºC/24-48h. Fazer uma leitura preliminar com 20- resfriar imediatamente. Transferir dez porções de
24±3 horas de incubação, pois pode haver cres- 1 ml da amostra para dez tubos de Ágar Sulfito
cimento de cepas termófilas anaeróbias que não previamente fundidos e desaerados. Depositar o
produzem H2S mas reduzem o sulfato e produzem inóculo abaixo da superfície do meio e agitar de-
gás, escurecendo completamente o meio e provo- licadamente por inversão, para misturar sem in-
cando o rompimento do ágar. Contar as colônias troduzir ar. Cobrir a superfície do meio com uma
características de D. nigrificans em todos os tubos camada de 15mm de ágar selo ou vaspar. Incubar
inoculados (colônias pretas, sem formação de gás) a 55±1 ºC por até 14 dias, com leitura em 2, 7 e 14
e calcular o número de Esporos/10g = 10 x Núme- dias. Contar as colônias características de D. ni-
ro total de colônias nos seis tubos/4. grificans em todos os tubos inoculados (colônias
pretas, sem formação de gás) e calcular o número
de Esporos/10g = 10 x Número total de colônias
22.4.4. Procedimento para a análise nos 10 tubos.
de leite em pó desnatado
Descrito no Capítulo 28 do Compendium (Ronner
& Elliott, 2015). 22.5. Métodos APHA 23:2015
Pesar 10g da amostra em um Erlenmeyer de 250 para contagem de esporos de
ml, com marcação no volume 100 ml. Dissolver
mesófilos aeróbios
o leite em uma solução estéril de NaOH 0,02N,
adicionada até a marca de 100 ml. Autoclavar por Método da American Public Health Association
10 minutos a cinco libras de pressão (108,4 ºC) (APHA) para a análise de alimentos, descrito
e resfriar imediatamente. Transferir duas porções no Capítulo 23 da 5ª edição do Compendium of
de 2 ml da amostra para dois tubos de Ágar Sulfi- Methods for the Microbiological Examination of

Foods (Stevenson & Lembke, 2015). Incluídas água peptonada 0,1%, homogeneizando a amos-
também as recomendações do item 8.090 do Ca- tra, de acordo com as recomendações do Capítu-
pítulo 8 da 17ª edição do Standard Methods for lo 2. Transferir porções de dez, um e 0,1 ml da
the Examination of Dairy Products (Frank & You- amostra homogeneizada para três frascos diferen-
sef, 2004) específicas para a análise de produtos tes, contendo 100 ml de Ágar Triptona Glicose
lácteos, e as da Seção 9218 da 22ª edição do Stan- Extrato de Carne (TGE) previamente fundido e
dard Methods for the Examination of Water and resfriado a 50-55 ºC. Misturar bem o inóculo ao
Wastewater (Hunt, 2012), para a análise de água. meio de cultura e submeter a um choque térmi-
Esse grupo, tradicionalmente, objetivava a detec- co de 10min a 80 ºC, em banho com temperatu-
ção de espécies mesófilas de Bacillus. Atualmen- ra controlada. Garantir que o volume de água do
te essas espécies estão alocadas nos vários novos banho seja suficiente para cobrir os frascos até a
gêneros derivados do gênero Bacillus (Paeniba- altura da superfície do meio. Iniciar a contagem
cillus, Brevibacillus, Aneurinibacillus, Virgiba- dos 10min a partir do momento em que os fras-
cillus). As mais importantes são Paenibacillus cos atingirem a temperatura de 80 ºC, usando um
macerans, Paenibacillus polymyxa e Bacillus li- frasco de TGE não inoculado para acompanhar a
cheniformis. subida da temperatura com um termômetro. Pe-
riodicamente, agitar levemente os frascos, para
auxiliar na distribuição do calor.
análise Nota) Quando o choque térmico é feito em Erlenmeyer
de 500 ml, o procedimento descrito no Compendium
□ Água peptonada 0,1% (H2Op) é de 30min a 80 ºC, contados a partir do momen-
to em que os frascos são colocados no banho (não é
□ Ágar Triptona Glicose Extrato de Carne (TGE)
necessário acompanhar a subida da temperatura para
□ Ágar Padrão para Contagem (PCA) suplemen- contar o tempo). Quando são usados outros tipos de
tado com 0,1% de amido solúvel (para a análi- frascos, o choque térmico é de 10min a 80 ºC, mas o
se de leite e produtos lácteos) tempo só é contado depois que o meio atinge a tem-
peratura de 80 ºC (é necessário acompanhar a subida
□ Ágar Nutriente Azul de Tripano (para a análise
da temperatura em um frasco não inoculado de TGE,
de água) idêntico ao usado para as amostras).
□ Placas de Petri estéreis
Incubação. Após o tratamento térmico, resfriar o
□ Banho-maria regulado a 80±1 ºC
meio de cultura em água corrente e distribuir cada
□ Estufa incubadora regulada a 35±1 ºC (±0,5 ºC
porção de 100 ml de TGE em cinco placas de Petri
para a análise de água)
estéreis vazias. Aguardar a completa solidificação
□ Estufa incubadora a 32±1 ºC (para a análise de do ágar e incubar as placas invertidas a 35 ºC/48h.
leite e produtos lácteos)
Contagem das colônias e cálculo dos resultados.
Contar as colônias desenvolvidas nas cinco placas
22.5.2. Procedimento para da diluição apropriada para a contagem (com 25 a
alimentos em geral 250 colônias) e apresentar o resultado por grama
de amostra: Nº esporos/g = soma das colônias no
Descrito no Capítulo 23 do Compendium (Steven- frasco com 10 ml da amostra ou 10 vezes soma
son & Lembke, 2015). das colônias no frasco com 1 ml da amostra ho-
O esquema de análise para contagem de espo- mogeneizada ou 100 vezes soma das colônias no
ros de mesófilos aeróbios pelo método APHA frasco com 0,1 ml da amostra homogeneizada. O
23:2015 (Stevenson & Lembke, 2015) encontra- número de esporos que pode ser quantificado por
se descrito na Figura 22.2. essa técnica varia na faixa de um a 150.000/g
Choque térmico. Pesar 50g da amostra em um
frasco de homogeneização e adicionar 450 ml de

Figura 22.2. Esquema de análise para contagem de esporos de mesófilos aeróbios em alimentos pelo método APHA 23:2015
(Stevenson & Lembke, 2015).

22.5.3. Procedimento para a análise 22.5.4. Procedimento para a

de leite e produtos lácteos análise de água
Descrito no item 8.090 do Capítulo 8 do Standard Descrito na Seção 9218 da 22ª edição do Standard
Methods for the Examination of Dairy Products Methods for the Examination of Water and Was-
(Frank & Yousef, 2004). tewater (Hunt, 2012).
Aplicação: contagem de esporos de aeróbios me- Choque térmico. Homogeneizar bem a amostra e
sófilos ou psicrotróficos em leite fluído cru ou transferir porções de igual volume para frascos ou
submetido a tratamento térmico, leite evaporado Erlenmeyers diferentes estéreis. O volume total
e outros produtos de leite enlatados, leite em pó e de amostra a ser analisada depende da contagem
outros produtos em pó derivados de leite. estimada de esporos. Submeter a choque térmico
Choque térmico. Homogeneizar bem a amostra e a 75 ºC/15min ou 80 ºC/10min, em banho com
transferir duas porções de 200 ml para dois fras- temperatura controlada. Garantir que o volume de
cos estéreis (os dois frascos devem ser iguais). água do banho seja suficiente para cobrir os fras-
Submeter a choque térmico a 80±1 ºC/12min, cos até a altura da superfície da amostra. Iniciar a
em banho com temperatura controlada. Garantir contagem do tempo de tratamento térmico a partir
que o volume de água do banho seja suficiente do momento em que os frascos atingirem a tem-
para cobrir os frascos até a altura da superfície peratura de choque térmico (usar um dos frascos
da amostra. Iniciar a contagem do tempo de tra- de amostra para acompanhar a subida da tempera-
tamento térmico a partir do momento em que os tura, com um termômetro). Periodicamente, agitar
frascos atingirem a temperatura de 80 ºC (usar um os frascos, para auxiliar na distribuição do calor.
dos frascos de amostra para acompanhar a subida Após o tratamento térmico, resfriar imediatamen-
da temperatura, com um termômetro). Periodica- te a amostra em banho de gelo.
mente, agitar os frascos, para auxiliar na distribui- Inoculação e incubação. Inocular a amostra em
ção do calor. Após o tratamento térmico, resfriar Ágar Nutriente Azul de Tripano, utilizando a téc-
imediatamente a amostra em banho de gelo. nica de filtração em membrana descrita no Capítu-
lo 3. Incubar as placas a 35±0,5 ºC/24±2h.
Nota) Embora o procedimento acima seja aplicável a
leite em pó e outros produtos em pó derivados de Contagem das colônias e cálculo dos resultados.
leite, o Standard Methods for the Examination of Contar as colônias e calcular o Nº de esporos/ml,
Dairy Products não descreve a forma de hidratação como descrito no Capítulo 3.
dessas amostras para o choque térmico. Uma alter-
nativa razoável é fazer a diluição 1:10 (50g em 450
ml de água destilada) e calcular o número de esporos
por grama de amostra. Outra é diluir na proporção 22.6. Método APHA 24:2015
recomendada para o uso ou consumo final do produ-
to, calculando o número de esporos por mililitro de para contagem de esporos de
amostra reconstituída. mesófilos anaeróbios
Inoculação e incubação. Inocular a amostra em Metodologia da American Public Health Associa-
Ágar Padrão para Contagem (PCA) suplementado tion (APHA) para a análise de alimentos, descrito
com 0,1% de amido solúvel, utilizando a técni- no Capítulo 24 da 5ª edição do Compendium of
ca de plaqueamento em profundidade ou super- Methods for the Microbiological Examination of
fície descrita no Capítulo 3. Incubar as placas a Foods (Tortorelli & Anderson, 2015). Incluídas
32±1 ºC/48h. também as recomendações do item 8.100 do Ca-
Contagem das colônias e cálculo dos resultados. pítulo 8 do Standard Methods for the Examination
Contar as colônias e calcular o Nº de esporos/ml, of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) espe-
como descrito no Capítulo 3. cíficas para a análise leite fluído e queijos.

22.6.1. Material requerido para a (CF) previamente desaerados (fervura em banho

análise por 15min, com as tampas desrosqueadas e res-
friamento imediato em banho de gelo). Incubar
□ Água destilada estéril os tubos a 30-35 ºC/72h e observar. Não havendo
□ Meio de Carne Cozida (CMM), Meio PE-2 ou crescimento, reincubar até completar sete dias.
Caldo de Fígado (CF) Relatar o resultado como presença ou ausência
□ Meio Reforçado para Clostrídios (RCM) (para de esporos de bactérias mesófilas anaeróbias na
a análise de leite fluído e queijos) quantidade de amostra inoculada.
□ Meio Reforçado para Clostrídios com Lactato
Nota) O CMM e o PE-2 não precisam ser cobertos com
de Sódio (RC ml) (opcional para a contagem Ágar Selo ou Vaspar, mas o CF sim. Para o suces-
de Clostridium tyrobutyricum em leite fluído so das análises, é importante garantir a ausência de
e queijos) resíduos de pesticidas nas ervilhas utilizadas na for-
□ Meio de Carne Cozida (CMM) suplementado mulação do Meio PE-2. Além disso, antes da esteri-
lização, as ervilhas devem permanecer uma hora de
com 0,1% de amido solúvel e 0,1% de glicose
molho no caldo de cultura, para garantir a eficiência
(para a detecção preferencial de clostrídios não da esterilização. No caso do CF, recomenda-se que
proteolíticos) seja utilizado o meio comercial, porque, na formula-
□ Ágar Dextrose Triptona (DTA) ou Caldo Soro ção preparada em laboratório, o fígado bovino pode
conter inibidores, incluindo antibióticos.
de Laranja (para a detecção preferencial de
clostrídios butíricos) Cuidado! Os meios de cultura permitem o cres-
□ Ágar Selo ou Vaspar (se usar Caldo de Fígado) cimento e a produção de toxina de Clostridium
□ Ágar Selo Tioglicolato (para a análise de leite botulinum. Após a incubação, o manuseio e o
fluído e queijos) descarte devem ser feitos com o máximo cuida-
□ Erlenmeyer de 250 ml do, para evitar riscos de contaminação do analista
□ Banho-maria sob fervura e do laboratório. Colocar luvas, trabalhar com o
□ Banho-maria a 60 ºC (para a detecção prefe- material sobre bandejas, não diretamente sobre as
rencial de clostrídios não proteolíticos e gupo bancadas, desinfetar todas as superfícies com so-
butírico) lução de NaOH 1N e esterilizar todo o material de
□ Banho-maria a 80±1 ºC descarte a 121 ºC/30min.
□ Estufa incubadora regulada a 30-35 ºC
□ Estufa incubadora regulada a 37±1 ºC (para a
análise de leite fluído e queijos)
análise de amido, farinhas e
outros produtos de cereais
Descrito no Capítulo 24 do Compendium (Torto-
análise de açúcar
relli & Anderson, 2015).
Descrito no Capítulo 24 do Compendium (Torto- Pesar 11g da amostra, adicionar 99 ml de água
relli & Anderson, 2015). destilada estéril e suspender sob agitação. Sob
Pesar 20g da amostra (ou o peso equivalente a constante agitação, distribuir 20 ml da suspensão
20g, no caso de açúcar líquido, calculado confor- (2g de amostra) em seis tubos de Meio de Carne
me descrição do item 22.2.2) em um Erlenmeyer Cozida (CMM), Meio PE-2 ou Caldo de Fígado
de 250 ml e adicionar água destilada estéril até (CF) previamente desaerados. Transferir os tubos
completar 100 ml. Dissolver o açúcar, aquecer para um banho sob fervura e manter no banho por
até a fervura e manter sob fervura por 5min. Res- 20min, garantindo que o volume de água do ba-
friar imediatamente e distribuir 20 ml da solução nho seja suficiente para cobrir os tubos até a altura
(4g de amostra) em seis tubos de Meio de Carne da superfície do meio. Agitar periodicamente os
Cozida (CMM), Meio PE-2 ou Caldo de Fígado tubos (por inversão), durante a fervura, sem intro-

duzir ar. Resfriar imediatamente e incubar a 30-35 incubar a 30-35 ºC/72h. Reincubar os tubos nega-
ºC/72h. Reincubar os tubos negativos por até sete tivos por até sete dias. Relatar o resultado como
dias. Relatar o resultado como presença ou ausên- presença ou ausência de esporos de bactérias me-
cia de esporos de bactérias mesófilas anaeróbias sófilas anaeróbias na quantidade de amostra ino-
na quantidade de amostra inoculada. culada.
Nota) O CMM e o PE-2 não precisam ser cobertos com Nota) O CMM e o PE-2 não precisam ser cobertos com
Ágar Selo ou Vaspar, mas o CF sim. Para o suces- Ágar Selo ou Vaspar, mas o CF sim. Para o suces-
so das análises, é importante garantir a ausência de so das análises, é importante garantir a ausência de
resíduos de pesticidas nas ervilhas utilizadas na for- resíduos de pesticidas nas ervilhas utilizadas na for-
mulação do Meio PE-2. Além disso, antes da esteri- mulação do Meio PE-2. Além disso, antes da esteri-
lização, as ervilhas devem permanecer uma hora de lização, as ervilhas devem permanecer uma hora de
molho no caldo de cultura, para garantir a eficiência molho no caldo de cultura, para garantir a eficiência
da esterilização. No caso do CF, recomenda-se que da esterilização. No caso do CF, recomenda-se que
seja utilizado o meio comercial, porque, na formula- seja utilizado o meio comercial, porque, na formula-
ção preparada em laboratório, o fígado bovino pode ção preparada em laboratório, o fígado bovino pode
conter inibidores, incluindo antibióticos. conter inibidores, incluindo antibióticos.
Cuidado! Os meios de cultura permitem o cres- Cuidado! Os meios de cultura permitem o cres-
cimento e a produção de toxina de Clostridium cimento e a produção de toxina de Clostridium
botulinum. Após a incubação, o manuseio e o botulinum. Após a incubação, o manuseio e o
descarte devem ser feitos com o máximo cuida- descarte devem ser feitos com o máximo cuida-
do, para evitar riscos de contaminação do analista do, para evitar riscos de contaminação do analista
e do laboratório. Colocar luvas, trabalhar com o e do laboratório. Colocar luvas, trabalhar com o
material sobre bandejas, não diretamente sobre as material sobre bandejas, não diretamente sobre as
bancadas, desinfetar todas as superfícies com so- bancadas, desinfetar todas as superfícies com so-
lução de NaOH 1N e esterilizar todo o material de lução de NaOH 1N e esterilizar todo o material de
descarte a 121 ºC/30min. descarte a 121 ºC/30min.
22.6.4. Procedimento para a análise 22.6.5. Procedimento para a

de vegetais desidratados análise de condimentos
Descrito no Capítulo 24 do Compendium (Torto- Descrito no Capítulo 24 do Compendium (Torto-
relli & Anderson, 2015). relli & Anderson, 2015).
Pesar 10g da amostra em um Erlenmeyer de 250 Em um Erlenmeyer de 250 ml com marcação no
ml, adicionar 190 ml de água destilada estéril e volume de 100 ml, pesar 10g da amostra (no caso
manter em repouso por 30min, sob refrigeração de grãos inteiros) ou 1-2g, no caso de condimen-
(4-5 ºC), para reidratação. Após o repouso, agitar tos triturados ou moídos. Adicionar água desti-
por 2-3min (lavagem superficial), transferir para lada estéril até completar o volume de 100 ml e
um banho sob fervura e manter no banho por 20- agitar vigorosamente, para liberar os esporos no
30min, agitando constantemente durante a fer- líquido. Aquecer até a fervura, manter sob fervu-
vura. Garantir que o volume de água do banho ra por 5min e resfriar imediatamente. Aguardar a
seja suficiente para cobrir os frascos até a altura sedimentação das partículas, distribuir 20 ml do
da superfície da amostra. Opcionalmente, o cho- líquido em seis tubos de Meio de Carne Cozida
que térmico pode ser feito em autoclave, a 108 (CMM), Meio PE-2 ou Caldo de Fígado (CF) pre-
ºC/10min. Resfriar imediatamente, distribuir 20 viamente desaerados e incubar a 30-35 ºC/72h.
ml do líquido (1g de amostra lavada) em tubos Reincubar os tubos negativos por até sete dias.
de Meio de Carne Cozida (CMM), Meio PE-2 ou Relatar o resultado como presença ou ausência
Caldo de Fígado (CF) previamente desaerados e de esporos de bactérias mesófilas anaeróbias na

quantidade de amostra inoculada (2g no caso de Nota) O CMM e o PE-2 não precisam ser cobertos com
grãos inteiros ou 0,2 a 0,4g no caso de condimen- Ágar Selo ou Vaspar, mas o CF sim. Para o suces-
so das análises, é importante garantir a ausência de
tos triturados ou moídos). resíduos de pesticidas nas ervilhas utilizadas na for-
Nota) O CMM e o PE-2 não precisam ser cobertos com mulação do Meio PE-2. Além disso, antes da esteri-
Ágar Selo ou Vaspar, mas o CF sim. Para o suces- lização, as ervilhas devem permanecer uma hora de
so das análises, é importante garantir a ausência de molho no caldo de cultura, para garantir a eficiência
resíduos de pesticidas nas ervilhas utilizadas na for- da esterilização. No caso do CF, recomenda-se que
mulação do Meio PE-2. Além disso, antes da esteri- seja utilizado o meio comercial, porque, na formula-
lização, as ervilhas devem permanecer uma hora de ção preparada em laboratório, o fígado bovino pode
molho no caldo de cultura, para garantir a eficiência conter inibidores, incluindo antibióticos.
da esterilização. No caso do CF, recomenda-se que
seja utilizado o meio comercial, porque, na formula- Cuidado! Os meios de cultura permitem o cres-
ção preparada em laboratório, o fígado bovino pode cimento e a produção de toxina de Clostridium
conter inibidores, incluindo antibióticos.
botulinum. Após a incubação, o manuseio e o
Cuidado! Os meios de cultura permitem o cres- descarte devem ser feitos com o máximo cuida-
cimento e a produção de toxina de Clostridium do, para evitar riscos de contaminação do analista
botulinum. Após a incubação, o manuseio e o e do laboratório. Colocar luvas, trabalhar com o
descarte devem ser feitos com o máximo cuida- material sobre bandejas, não diretamente sobre as
do, para evitar riscos de contaminação do analista bancadas, desinfetar todas as superfícies com so-
e do laboratório. Colocar luvas, trabalhar com o lução de NaOH 1N e esterilizar todo o material de
material sobre bandejas, não diretamente sobre as descarte a 121 ºC/30min.
bancadas, desinfetar todas as superfícies com so-
lução de NaOH 1N e esterilizar todo o material de 22.6.7. Procedimento para a análise
descarte a 121 ºC/30min. de leite fluido e queijos
Método do NMP descrito no item 8.100 do Capí-
22.6.6. Procedimento para a análise
tulo 8 do Standard Methods for the Examination
de ovo em pó, leite em pó e
of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004).
outros produtos lácteos em pó
Choque térmico. Para amostras de queijos, pe-
Descrito no Capítulo 24 do Compendium (Torto- sar 50g, preparar a primeira diluição (conforme
relli & Anderson, 2015). descrito no Capítulo 2) e transferir duas porções
Adicionar 11g da amostra em um frasco com 99 de 200 ml para dois Erlenmeyers diferentes esté-
ml de água destilada estéril e pérolas de vidro. reis. No caso de leite fluído, homogeneizar bem a
Agitar vigorosamente até que todo o material seja amostra e transferir duas porções de 200 ml para
dispersado. Distribuir 20 ml da suspensão homo- dois Erlenmeyers diferentes estéreis. Colocar os
geneizada (2g de amostra) em seis tubos de Meio frascos em um banho com temperatura controlada
de Carne Cozida (CMM), Meio PE-2 ou Caldo de a 82±1 ºC e acompanhar a subida da temperatura
Fígado (CF) previamente desaerados, transferir os da amostra com um termômetro em um dos fras-
tubos para um banho sob fervura por 20min, agi- cos. Agitar frequentemente e garantir que o volu-
tando constantemente durante a fervura. Garantir me de água do banho seja suficiente para cobrir
que o volume de água do banho seja suficiente os frascos até a altura da superfície da amostra.
para cobrir os tubos até a altura da superfície do Quando a amostra atingir a temperatura de 80 ºC,
meio. Resfriar imediatamente e incubar a 30-35 contar 12min de tratamento térmico e resfriar ime-
ºC/72h. Reincubar os tubos negativos por até sete diatamente em banho de gelo. Se houver suspeita
dias. Relatar o resultado como presença ou ausên- de esporos injuriados (como em queijo fresco),
cia de esporos de bactérias mesófilas anaeróbias reduzir o tratamento térmico para 62,5 ºC/30min.
na quantidade de amostra inoculada. Inoculação e incubação. Selecionar três dilui-

ções adequadas da amostra e inocular uma série termófilos facultativos, se presentes, também po-
de três tubos de Meio Reforçado para Clostrídios derão ser detectados.
(RCM) por diluição, adicionando 1 ml da diluição Para detecção dos clostrídios não proteolíticos,
por tubo com 10 ml de RCM previamente desae- pode ser usado o CMM suplementado com 0,1%
rado. Depositar o inóculo abaixo da superfície do de amido solúvel e 0,1% de glicose, choque térmi-
meio e agitar delicadamente por inversão, para co a 60 ºC/30min.
misturar sem introduzir ar. Utilizar o Meio Refor- Para a detecção preferencial dos clostrídios bu-
çado para Clostrídios com Lactato de Sódio (RC tíricos, pode-se substituir o CMM, CF ou PE-2
ml) se houver interesse em favorecer Clostridium pelo Ágar Dextrose Triptona (DTA) ou pelo Cal-
tyrobutyricum. Selar os tubos com Ágar Selo Tio- do Soro de Laranja (o ágar não é recomendado
glicolato e incubar a 37±1 ºC/7 dias. devido à quantidade de gás produzida). Choque
Leitura e cálculo dos resultados. Tubos com térmico a 60 ºC/30min.
crescimento e produção de gás (deslocamento do
ágar selo para cima) são indicativos de presen-
ça de esporos de bactérias anaeróbias mesófilas. 22.7. Método IFU 12:2007 para
Calcular o NMP de esporos/g ou ml conforme a
orientação do Capítulo 4, usando uma das tabelas
detecção e contagem
de NMP. de Alicyclobacillus
Cuidado! Os meios de cultura permitem o cres-
Método da International Federation of Fruit Juice
cimento e a produção de toxina de Clostridium
Producers (IFU 12/2007), para Alicyclobacillus
botulinum. Após a incubação, o manuseio e o
em geral e diferenciação de cepas deteriorantes
descarte devem ser feitos com o máximo cuida-
presuntivas. Aplica-se à análise de sucos de fru-
do, para evitar riscos de contaminação do analista
tas, refrescos, molhos e outros produtos ácidos
e do laboratório. Colocar luvas, trabalhar com o
prontos para consumo. Aplica-se também à análi-
material sobre bandejas, não diretamente sobre as
se de matéria prima destinada à formulação desses
bancadas, desinfetar todas as superfícies com so-
produtos, incluindo polpas de frutas, sucos con-
lução de NaOH 1N e esterilizar todo o material de
centrados, xaropes, açúcar, essências, gomas, es-
descarte a 121 ºC/30min.
pessantes e água de processo, dentre outras.
O procedimento inclui a contagem direta em pla-
22.6.8. Outros procedimentos
cas (plaqueamento em superfície) e o teste de pre-
Os procedimentos do Capítulo 23 do Compen- sença/ausência com enriquecimento em caldo de
dium não são quantitativos, seu objetivo é detec- cultura. O ensaio pode ser feito para a detecção
tar a presença dos esporos em uma dada quantida- e contagem de esporos de Alicyclobacillus (com
de de amostra. Havendo interesse na quantifica- choque térmico) ou para a detecção e contagem
ção, pode-se utilizar a técnica de inoculação em de células vegetativas (sem choque térmico). Para
tubos múltiplos, determinando-se a contagem de amostras de matéria prima, é recomendada a con-
esporos pelo método do Número Mais Provável. tagem e a detecção de esporos, após choque térmi-
Nem todos os esporos de mesófilos presentes nas co a 80 ºC/10min. Para amostras do produto final
amostras serão detectados, porque os diferentes pronto para consumo, é recomendada a pré-incu-
grupos e espécies de clostrídios mesófilos exi- bação da amostra a 45 ºC por sete dias, seguida da
gem tratamentos diferenciados para a ativação contagem.
dos esporos. O CMM, o CF e o PE-2 favorecem A contagem em placas é feita inoculando-se a
os clostrídios putrefativos e, na interpretação dos amostra em dois meios de cultura, o Ágar K e o
resultados é importante considerar que os bacilos Ágar Bacillus acidoterrestris (BAT) ou o Ágar
anaeróbios facultativos, tanto mesófilos quanto Extrato de Levedura Amido Glicose (YSG). O

YSG e o BAT permitem o crescimento de Alicy- (opcional, podendo ser substituído pelo YSG)
clobacillus em geral, sendo utilizados para a de- □ Placas de Ágar Padrão Para Contagem (PCA)
tecção de qualquer espécie presente. O Ágar K, ou o Ágar Tripticase de Soja (TSA) ou o Ágar
incubado a 45 ºC, permite o crescimento vigoroso Infusão Cérebro Coração (BHI)
de A. acidoterrestris e limita o crescimento de A. □ Reagentes para coloração de esporos (opcional)
acidocaldarius e A. acidiphilus. É utilizado para □ Banho-maria a 80±1 ºC
favorecer o desenvolvimento preferencial de co-
lônias de A. acidoterrestris.
Nos dois meios as colônias são presuntivas e de-
vem ser confirmadas. Para confirmar se a cultura
pertence ao gênero Alicyclobacillus, é verificada a
morfologia de bastonetes das células, a produção análise de matéria-prima
de esporos e a inabilidade de crescer em pH neutro, Aplicação: Procedimento para a contagem e de-
que são características típicas de todas as espécies. tecção da presença/ausência de esporos de Alicy-
Para verificar se a cultura é deteriorante presuntiva, clobacillus em matéria prima (sucos concentra-
é verificada a capacidade de crescimento a 65 ºC e dos de frutas, polpas de frutas, xaropes, açúcar,
pode ser aplicado o teste de peroxidase para a pro- essências, gomas, espessantes, água de processo
dução de guaiacol, que é opcional. O teste de pe- e outras) destinada à formulação sucos de frutas,
roxidase verifica a capacidade da cepa em produzir refrescos, molhos e outros produtos ácidos termo-
guaiacol a partir de ácido vanílico. A espécie mais processados prontos para consumo.
frequente em produtos deteriorados é A. acidoter-
restris, que não cresce a 65 ºC e dá resultado positi-
vo no teste de peroxidase. O resultado é considera-
do presuntivo para deteriorantes porque há outras
espécies que dão resultados similares, incluindo A.
acidiphilus e A herbarius, mas que não necessaria-
mente produzem guaiacol em sucos de frutas.
a) Choque térmico
a.1) Para a análise de amostras sólidas, concen-
análise
tradas ou pastosas de matéria prima em geral
□ Frascos com 90 ml de Caldo Extrato de Leve- (polpas de frutas, xaropes, açúcar, essências,
dura Amido Glicose (YSG) (para a análise de gomas, espessantes e outros). Homogeneizar
matéria prima em geral) (pode ser substituído duas porções 10g da amostra em dois fras-
pelo Caldo Bacillus acidoterrestris - BAT) cos com 90 ml de Caldo Extrato de Levedu-
□ Frascos com 100 ml de Caldo Extrato de Le- ra Amido Glicose (YSG) ou Caldo Bacillus
vedura Amido Glicose (YSG) em concentra- acidoterrestris (BAT). Submeter a choque
ção dupla (para a análise de água) (pode ser térmico em banho-maria a 80±1 ºC/10min.
substituído pelo Caldo Bacillus acidoterrestris Garantir que o volume de água do banho
– BAT em concentração dupla) seja suficiente para cobrir os frascos até a
□ Frascos com 90 ml de água destilada estéril altura da superfície da amostra. Controlar
(para a análise sucos concentrados) subida da temperatura do produto com um
□ Placas de Ágar K termômetro introduzido em um dos frascos
□ Placas de Ágar Extrato de Levedura Amido (controle). O tempo de subida até 80 ºC não
Glicose (YSG) deve ultrapassar cinco minutos. Após o cho-
□ Placas de Ágar Bacillus acidoterrestris (BAT) que térmico, descartar o frasco controle.

Nota a.1) No caso de gomas e espessantes, será neces- presentativo de cada tipo de colônia presente
sário utilizar uma diluição maior, como 1:50 (10g da em cada placa, para a confirmação. A partir da
amostra em 490 ml de caldo) ou 1:100 (10g da amos-
tra em 990 ml de caldo), dependendo do produto.
mesma colônia, inocular cada cultura (estrias
de esgotamento) nos meios cultura para os tes-
a.2) Para a análise de amostras de sucos con-
tes de confirmação abaixo.
centrados. Diluir duas porções 10g da amos-
tra em dois frascos com 90 ml de água des- Nota d.1) A IFU 12/2007 não determina um número mí-
tilada estéril. Submeter a choque térmico da nimo de colônias para a confirmação. Como orien-
mesma forma descrita para matéria prima. tação, pode-se seguir a prática dos métodos da ISO
para contagem de microrganismos em placas, que
a.3) Para a análise de água. Transferir duas estabelece cinco colônias de cada placa e, se houver
porções de 100 ml da amostra para dois menos de cinco, todas. Escolher colônias de diferen-
frascos com 100 ml de Caldo Extrato de tes tipos para a confirmação. No YSG ou no BAT,
Levedura Amido Glicose (YSG) ou Caldo que permitem o crescimento de Alicyclobacillus em
geral, pode haver uma variedade maior de tipos de
Bacillus acidoterrestris (BAT) em concen-
colônias, em comparação com o Ágar K, que é mais
tração dupla. Submeter a choque térmico da favorável a A. acidoterrestris e restritivo para A. aci-
mesma forma descrita para matéria prima. docaldarius e A. acidiphilus. Nesse caso, é recomen-
dável selecionar pelo menos uma colônia de cada
b) Inoculação para a contagem dos esporos
tipo presente no BAT ou YSG.
Após o choque térmico, inocular 0,1 ml da amos-
tra em uma placa de Ágar K (plaqueamento em d.1) Para verificar a morfologia das células e
superfície) e 0,1 ml em uma placa de Ágar Extra- a formação de esporos, inocular uma alça-
to de Levedura Amido Glicose (YSG) ou Ágar da da colônia em uma placa de Ágar K e
Bacillus acidoterrestris (BAT) (plaqueamento uma alçada em uma placa de YSG. Incubar
em superfície). Incubar as placas a 45±1 ºC por as placas a 45±1 ºC por três a cinco dias. A
dois a cinco dias, observando diariamente. partir da cultura desenvolvida no Ágar K,
Nota b.1) Para melhorar o limite de detecção do méto- verificar a formação de esporos em observa-
do, pode-se inocular 1 ml da amostra, distribuindo ção microscópica (montagem úmida ou co-
o volume por quatro placas, três com 0,3 ml e uma loração de esporos, descritos no Capítulo 5).
com 0,1 ml.
Se não houver crescimento no Ágar K, uti-
c) Enriquecimento para a detecção lizar cultura obtida na placa de YSG para a
(presença/ausência) dos esporos observação. As espécies de Alicyclobacillus
Após a retirada do inóculo para a contagem dos formam esporos.
esporos, incubar o restante da amostra a 45±1 d.2) Para verificar o crescimento em pH neu-
ºC por cinco dias, para enriquecimento. Após tro, inocular uma alçada da colônia em uma
a incubação, inocular uma alçada do material placa de um meio com pH neutro, como o
em uma placa de Ágar K (estrias de esgota- Ágar Padrão Para Contagem (PCA) ou o
mento) e uma alçada em uma placa de Ágar Ágar Tripticase de Soja (TSA) ou o Ágar
Extrato de Levedura Amido Glicose (YSG) ou Infusão Cérebro Coração (BHI). Incubar
Ágar Bacillus acidoterrestris (BAT) (estrias de as placas a 45±1 ºC por três a cinco dias.
esgotamento). Incubar as placas a 45±1 ºC por Culturas de Alicyclobacillus são acidófilas
dois a cinco dias, observando diariamente. estritas e não crescem em pH neutro.
Nota c.1) O plaqueamento pode ser feito com dois dias d.3) Para verificar o crescimento a 65 ºC, ino-
de incubação, mas, em caso negativo, deve ser repe- cular uma alçada da colônia em uma placa
tido com cinco dias.
de YSG e incubar 65±1 ºC por três a cinco
d) Confirmação das colônias presuntivas dias. As espécies de Alicyclobacillus consi-
Examinar as colônias desenvolvidas nos dois deradas deteriorantes presuntivas no méto-
meios inoculados. Selecionar um número re- do IFU 12/07 não crescem a 65 ºC.

d.4) Teste de peroxidase para produção de perfície) e 0,1 ml em uma placa de Ágar Extra-
guaiacol (opcional). A IFU 12/07 recomen- to de Levedura Amido Glicose (YSG) ou Ágar
da que esse teste seja feito com o “kit” co- Bacillus acidoterrestris (BAT) (plaqueamento
mercial da Kyokuto Pharmaceutical Indus- em superfície). Incubar as placas a 45±1 ºC por
trial Co. Ltda, Japan (contact: inagaki@ dois a cinco dias, observando diariamente.
kyokutoseiyaku.com.jp), seguindo a orien-
Nota b.1) Para melhorar o limite de detecção do méto-
tação do fabricante. do, pode-se inocular 1 ml da amostra em cada meio
de cultura, distribuindo o volume por quatro placas,
três com 0,3 ml e uma com 0,1 ml. Se a amostra for
22.7.3. Procedimento para a análise líquida e límpida, sem sólidos em suspensão, pode-se
de produto final filtrar duas porções de 100 ml em filtro-membrana de
poro 0,45µm e transferir as membranas para as pla-
Aplicação: Procedimento para a contagem de cas de meio de cultura. O volume de 100 ml também
Alicyclobacillus em sucos e néctares de frutas, pode ser dividido em duas porções de 50 ml para a
refrescos, molhos e outros produtos ácidos ter- filtração.
moprocessados prontos para consumo (produto fi- Nota b.2) Se ao final de cinco dias não houver desen-
volvimento de colônias, mas o produto apresentar
nal), que oferecem condição para a multiplicação
evidência de presença de Alicyclobacillus, recomen-
de Alicyclobacillus. da-se repetir o ensaio com a aplicação de choque
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as térmico (ativação de esporos). Para tanto, transferir
orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os duas porções de 100 ml da amostra para dois frascos
detalhes e cuidados envolvidos na contagem de estéreis vazios e submeter a choque térmico em ba-
nho-maria a 80±1 ºC/10min. Garantir que o volume
microrganismos em placas, da seleção das dilui- de água do banho seja suficiente para cobrir os fras-
ções ao cálculo dos resultados. O procedimento cos até a altura da superfície da amostra. Controlar
descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pres- a subida da temperatura do produto com um termô-
supondo que sejam conhecidos pelo analista. metro introduzido em um dos frascos (controle). O
tempo de subida até 80 ºC não deve ultrapassar cinco
a) Pré-incubação minutos. Após o choque térmico, descartar o frasco
Antes do ensaio, incubar a amostra, em sua em- controle e repetir o plaqueamento.
balagem original, fechada, por sete dias a 45±1
c) Confirmação das colônias presuntivas
ºC. A pré-incubação é exigida para amostras de
Da mesma forma descrita para a análise de ma-
produtos recém processados. No caso de amos-
téria prima, no item 22.7.2.d.
tras coletadas no varejo é opcional e, no caso de
amostras deterioradas, não é necessária.
22.7.4. Interpretação e cálculo dos
b) Inoculação e incubação
resultados
Homogeneizar bem o conteúdo da embalagem
antes da abertura. Inocular 0,1 ml da amostra Utilizar as características abaixo na interpretação
em uma placa de Ágar K (plaqueamento em su- dos resultados da confirmação.
Perfil 2
Perfil 1
Característica Alicyclobacillus potencialmente deteriorantes
Alicyclobacillus spp
(principalmente A. acidoterrestris)
Crescimento em Ágar YSG ou BAT a 45 ºC + +
Crescimento em pH neutro (PCA/TSA/BHI) a 45 ºC - -
Formação de esporos + +
Crescimento em YSG ou BAT a 65 ºC + -
Crescimento em Ágar K A maioria negativo +

Considerar como pertencente ao gênero Alicy- percentagem de colônias confirmadas.

clobacillus todas as culturas que apresentarem os Exemplo. Plaqueamento em superfície, inocula-
perfis 1 ou 2. Considerar como Alicyclobacillus dos 0,1 ml da diluição 10-1, 25 colônias pre-
potencialmente deteriorante apenas as culturas sentes, cinco submetidas à confirmação, três
que apresentarem o perfil 2. confirmadas (60%).
Calcular o número de UFC/g ou ml em função do UFC/g ou ml = 25x10x101x0,6 = 1,5x103.
número de colônias típicas, diluição inoculada e
22.8. Referências
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Thermoanaerobium brockii, Clostridium thermosul-
fer of Bacillus massiliensis and Bacillus odysseyi to
furogenes, and Clostridium thermohydrosulfuricum
the genus Lysinibacillus as Lysinibacillus massiliensis
E100-69 as Thermoanaerobacter brockii comb. nov.,
comb. nov. and Lysinibacillus odysseyi comb. nov.
Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes comb.
with emended description of the genus Lysinibacillus.
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23 Esterilidade comercial
ou causa da deterioração
Quadro 23.1 (atualizado).
Item 23.2.2.a Incluídas orientações para inativação de toxinas botulínicas em caso de acidente.
Item 23.2.2.e, f, g, h, i Excluídos CF, BCP e RCM como opções de meio de cultura. Alterado tempo de incu-
bação dos caldos para até sete dias. Incluída placa de TSA controle.
Item 23.2.2.e, f, g, h, i Excluída inoculação em Caldo EM, Alterado tempo de incubação dos caldos para até
7 dias. Incluídas placas de TAA controle.
23.1. Introdução conservadores ou outros agentes inibitórios além

dos ácidos. O tratamento térmico aplicado é sufi-
As informações abaixo são do Compendium of ciente para atingir a esterilidade comercial, mas
Methods for the Microbiological Examination não produz esterilidade completa.
of Foods (Elliott & Kataoka, 2015, Parkinson &
Francis, 2015) e do Bacteriological Analytical Definição de esterilidade comercial
Manual Online (Landry et al., 2001). De acordo com Elliott & Kataoka (2015), a le-
gislação americana define esterilidade comercial
No âmbito deste capítulo, o termo “alimentos
como a condição atingida nas seguintes situações:
comercialmente estéreis” refere-se a produtos
a) aplicação de calor suficiente para tornar o ali-
alimentícios submetidos a tratamento térmico e
mento isento de microrganismos capazes de se
acondicionados em embalagens herméticas, ca-
reproduzir no produto, em condições de esto-
pazes de impedir a entrada de microrganismos
cagem e distribuição não-refrigerada e isento
(Elliott & Kataoka, 2015). O acondicionamen-
de microrganismos patogênicos viáveis, inclu-
to pode ser feito em latas, embalagens de vidro,
sive esporos.
embalagens flexíveis (“pouches”) ou embalagens
b) aplicação combinada de calor e redução do pH
cartonadas (caixinhas). De maneira geral, as la-
ou calor e redução da atividade de água, su-
tas e as embalagens de vidro são seladas a vácuo,
ficientes para tornar o alimento isento de mi-
enquanto os “pouches” e caixinhas não. Garan-
crorganismos capazes de se desenvolver no
tindo-se a integridade da selagem, esses produtos
produto, sob estocagem não-refrigerada.
são microbiologicamente estáveis, podendo ser
mantidos indefinidamente à temperatura ambien- Classificação dos alimentos
te. Com exceção de alguns produtos cárneos en- comercialmente estéreis
latados curados, a estabilidade da maioria dos ali- A definição de esterilidade comercial deixa cla-
mentos comercialmente estéreis não depende de ro que um alimento comercialmente estéril pode

conter microrganismos viáveis, desde que não são preestabelecidos, porque dependem do produto.
sejam capazes de se multiplicar no produto, à Nos alimentos com pH levemente ácido (4,2-4,4),
temperatura ambiente. O dimensionamento dos os clostrídios sacarolíticos (C. butyricum, C. pas-
processos térmicos, ou seja, a quantidade de ca- teurianum, C. tyrobutyricum, C. beijerinckii e C.
lor que deve ser aplicada, depende da resistência acetobutylicum) devem ser considerados, bem como
térmica dos microrganismos capazes de se multi- Bacillus coagulans. Nos produtos mais ácidos, ape-
plicar nessa condição. Os tipos microbianos que nas Alicyclobacillus, bolores, leveduras e bactérias
podem crescer, por sua vez, dependem do pH e da lácticas podem crescer. Nos produtos com atividade
atividade de água do produto, porque interferem de água abaixo de 0,85, apenas bolores e leveduras
no crescimento dos microrganismos. são relevantes.
Em função do pH e da atividade de água, a Food
and Drug Administration (FDA) (Landry et al., 23.1.1. Parâmetros de avaliação
2001) classifica os alimentos comercialmente es- da resistência térmica dos
téreis como de baixa acidez ou ácidos. microrganismos
Alimentos de baixa acidez. Incluem os produtos As informações abaixo são de Stumbo (1973).
com pH maior que 4,6 e atividade de água maior Dois parâmetros são utilizados para avaliar a re-
que 0,85 (exceto bebidas alcoólicas), como os de- sistência térmica dos microrganismos: o tempo de
rivados de carne (salsichas em lata, almôndegas redução decimal (valor D), determinado através
em lata, patês de fígado ou presunto em lata ou vida curva de sobrevivência e o coeficiente de tem-
dro), derivados de peixes (sardinha em lata, atum peratura (valor z), determinado através da curva
em lata), derivados de leite (leite longa vida, creme de destruição térmica.
de leite em lata ou caixinha), vegetais em lata ou
vidro (ervilha, milho, seleta de legumes) e mistu- Curva de sobrevivência e tempo de
ras (feijoada em lata, sopas em lata). Permitem o redução decimal (valor D)
crescimento da maioria dos microrganismos, por- Na destruição de microrganismos expostos a uma
que o pH e a atividade de água não são restritivos. temperatura letal constante, a redução do número
Tanto espécies patogênicas quanto não patogênicas de células viáveis ao longo do tempo é exponen-
podem crescer, incluindo esporogênicas e não es- cial. Isso significa que, num gráfico com o logarit-
porogênicas. O alvo do processo de esterilização, mo do número de sobreviventes no eixo y e o tem-
nesse caso, são os esporos bacterianos e, dentre po de exposição no eixo x (Figura 23.1), a curva
eles, os de Clostridium botulinum, porque é a espé- de sobrevivência obtida é uma reta, descrita pela
cie de maior risco para a saúde pública. equação (1) de primeira ordem:
Alimentos ácidos. Incluem os produtos com pH Equação (1) Log N0 – Log Nf = t/D
menor ou igual a 4,6, como os derivados de tomate,
os vegetais acidificados (palmito, picles, azeitonas), onde:
N0 = número inicial de microrganismos
as frutas em calda (figos, pêssegos, abacaxi) e os su-
Nf = número final de microrganismos (número de sobrevi-
cos de frutas em lata ou caixinha. Permitem o cres- ventes)
cimento de uma gama menor de microrganismos, t = tempo (em minutos) de exposição à temperatura letal
porque o pH é restritivo. Podem crescer os bolores, constante
as leveduras e as bactérias acidúricas. Dentre as bac- D = tempo (em minutos) de redução decimal
térias acidúricas encontram-se Lactobacillus e ou- O valor D, também chamado de razão letal, é
tras bactérias lácticas (não esporogênicas) e algumas definido como o tempo (em minutos) necessário
espécies esporogênicas dos gêneros Bacillus, Clos- para reduzir a 1/10 a população de um dado mi-
tridium, Alicyclobacillus e Sporolactobacillus. Os crorganismo, a uma dada temperatura. Em outras
microrganismos alvo do processo, nesse caso, não palavras, é o tempo necessário para promover uma

Esterilidade comercial ou causa da deterioração □ 403
Figura 23.1. Curva de sobrevivência e determinação do valor D.
redução decimal na população ou, ainda, para des- D85 ºC = 0,5min, porque, com o mesmo tempo de
truir 90% da população. O valor D é característico tratamento, 90% da segunda foi destruída numa
de cada microrganismo e estabelecido a cada tem- temperatura muito mais baixa do que a primeira.
peratura, separadamente. Por isso, a notação usada
para o valor D é sempre acompanhada da tempe- Número de reduções decimais
ratura de referência usada na determinação. Exem-
A equação (1) da curva de sobrevivência também
plo: D121,1 ºC = 4-5min para esporos de Geobacillus
pode ser escrita como:
stearothermophilus, significando que o valor D de
G. stearothermophilus a 121 ºC é de 4 a 5min. Equação (1a) t/D = Log ( N0/Nf )
O parâmetro D define a inclinação da curva de so-
brevivência e, quanto menor for o seu valor, mais Se t for igual a 1D temos:
rápida é a destruição do microrganismo testado, ou 1D/D = Log(N0 /Nf) → Log(N0 /Nf) = 1 → N0 /Nf =
seja, menor a sua resistência à temperatura de re- 10 → Nf = N0/10 → uma redução decimal, que é a
ferência. Além de avaliar a resistência térmica de definição do valor D.
um dado microrganismo, o valor D também per-
Se t for igual a 2D temos: 2D/D = Log(N0 /Nf ) →
mite comparar a resistência entre microrganismos.
Log(N0 /Nf ) = 2 → N0 /Nf = 10 2 → Nf = N0 /10 2 →
Exemplo 1: Uma espécie que tenha D121 ºC = 4min é
duas reduções decimais.
muito mais resistente do que uma que tenha D121 ºC
= 0,1min, porque são necessários quatro minutos Então, como regra geral, se um microrganismo
a 121 ºC para destruir 90% da população da pri- for exposto a uma temperatura letal constante,
meira e apenas seis segundos, à mesma tempera- por um intervalo de tempo múltiplo do seu valor
tura, para destruir 90% da população da segunda. D nessa temperatura (nD), o número de sobrevi-
Exemplo 2: Uma espécie que tenha D121 ºC = 0,5min ventes será Nf = N0/10n e o número de reduções
é muito mais resistente do que uma que tenha decimais será n.

Figura 23.2. Curva de destruição térmica e determinação do valor z.
Curva de destruição térmica e coeficiente z = variação de temperatura de redução decimal = coeficien-

de temperatura (valor z) te de temperatura
O valor D permite avaliar e comparar a resistên- O valor z é definido como a variação de tempe-
cia dos microrganismos em uma dada temperatu- ratura necessária para provocar uma variação de
ra, constante, mas não oferece informação sobre dez vezes no valor D, ou seja promover uma re-
a influência da variação da temperatura sobre a dução ou uma elevação decimal no valor D. Por
resistência. Essa informação é dada pela curva exemplo, se um dado microrganismo apresen-
de destruição térmica, que reflete a resistência ta D100 ºC = 10min e z = 10 ºC, uma elevação de
relativa dos microrganismos a diferentes tempe- 10 ºC na temperatura de tratamento reduziria a
raturas. 1/10 o tempo necessário para produzir o mesmo
A curva de destruição térmica, também chamada efeito letal, ou seja, D110 ºC seria igual a 1min,
de curva de tempo de morte térmica, é determina- D120 ºC igual a 0,1min e assim por diante. Assim
da graficamente (Figura 23.2), a partir de vários como o valor D, o valor z é característico de cada
valores D do microrganismo testado, obtidos em espécie microbiana e determinado individual-
diferentes temperaturas. Colocando-se no eixo y o mente para cada microrganismo.
logaritmo do valor D e no eixo x o valor da tem- O valor z permite comparar o efeito da variação
peratura em que esse valor D foi obtido, a curva da temperatura na velocidade de destruição de di-
de destruição térmica é uma reta que segue a se- ferentes microrganismos. Por exemplo, uma espé-
guinte equação: cie que tenha z = 5 ºC é mais sensível à elevação
da temperatura do que uma espécie que tenha z =
Equação (2) Log DT2 – Log DT1 = (T1 – T2)/z 10 ºC, porque uma elevação de 5 ºC acelera em
onde: dez vezes a velocidade de sua destruição, enquan-
DT1 = valor D à temperatura T1. to o segundo exige uma variação de 10 ºC, para
DT2 = valor D à temperatura T2. essa mesma aceleração.

23.1.2. Valores D e z de Esporos de bolores termorresistentes

microrganismos de importância Alguns fungos filamentosos produzem esporos
em alimentos resistentes ao calor. Esses bolores são chamados
Os valores de D e z de diversos microrganismos de termorresistentes, incluindo principalmente
de importância em alimentos encontram-se des- espécies de Byssochlamys, Neosartoria e Tala-
critos no Quadro 23.1. romyces, mas também podem ocorrer nos gêneros
Penicillium, Hamigera e Monascus (Rico-Munoz
Células vegetativas et al., 2015).
As células vegetativas dos microrganismos são Segundo dados relatados por Rico-Munoz et al.,
sensíveis à temperaturas relativamente baixas. 2015), em suco de tomate os esporos de Bysso-
Poucos minutos de permanência a 65,5 ºC são su- chamys fulva têm valor D90 ºC de 8,1min e Bysso-
ficientes para destruir bolores, leveduras e bacté- chlamys nivea valor D90 ºC de 1,5min. A resistência
rias, que apresentam D65,5 ºC não superior a 2-3min, de outros bolores termorresistentes encontra-se na
na maioria dos casos. Quadro 23.1.
Quadro 23.1. Valores D e z de diversos microrganismos de importância em alimentos.

Esporos de bactérias Temperatura (ºC) D z (ºC) Referência a
Bacillus sporothermodurans 140 5 segundos (9)
Bacillus sporothermodurans 121 2,25min (9)
Geobacillus stearothermophilus 140 0,9 segundos (9)
Geobacillus stearothermophilus 121,1 4 a 5min 7,8 a 12,2 (4)
Moorella thermoacetica 121 23 a 111min - (7)
Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 121,1 3 a 4min 8,9 a 12,2 (4)
Desulfotomaculum nigrificans 121,1 2 a 3min 8,9 a 12,2 (4)
Clostridium sporogenes PA 3679 121,1 0,1 a 1,5min 7,8 a 10,0 (4)
Clostridium botulinum tipos A e B 121,1 0,1 a 0,2min 7,8 a 10,0 (4)
Bacillus coagulans 121,1 0,01 a 0,07min 7,8 a 10,0 (4)
Alicyclobacillus acidocaldarius 120 0,1min 7,0 (6)
Clostridium histolyticum 100 1,0min 10,0 (2)
Clostridium pasteurianum 100 0,1 a 0,5min 6,7 a 8,9 (4)
Costridium butyricum 100 0,1 a 0,5min - (2)
Bacillus licheniformis 100 13min 6,0 (2)
Bacillus cereus 100 5,0 10,0 (2)
Paenibacillus macerans 100 0,1 a 0,5min 6,7 a 8,9 (4)
Paenibacillus polymyxa 100 0,1 a 0,5min 6,7 a 8,9 (4)
Alicyclobacillus acidoterrestris 95 2,5 a 8,7min 7,2 a 11,3 (5)
Sporolactobacillus inulinus 90 4 a 7min 10,0 a 16,0 (1)
Bolores termorresistentes Temperatura (ºC) D (min) z (ºC) Referência a
90 1,0 a 12,0 6,0 a 7,0 (3)
Byssochlamys fulva
90 8,1 - (8)
88 0,75 a 0,8 4,0 a 6,1 (3)
Byssochlamys nivea 90 1,5 - (8)
85 1,3 a 4,5 - (8)
Byssochlamys spectabilis 85 45 a 75 (8)
Monascus ruber 80 2,1 (8)
90 4,4 a 4,6 (8)
Neosartoria fischeri 87,8 1,4 5,6 (8)
85 10,1 (8)
90,6 2,2 5,2 (8)
Talaromyces macrosporus
85 30 a 100 (8)
a Referências: (1) Banks (1989) (2) Ingram (1969), (3) Pitt & Hocking (2009), (4) Stumbo (1973), (5) Uboldi Eiroa et al., 1999, (6) Palop et al. (2000), (7) Byrer
et al., 2000, (8) Rico-Munoz (2015), (9) Scheldeman et al. (2006).

Esporos de bactérias tas, crescem também abaixo de 37 ºC. As espécies

Algumas bactérias também são capazes de pro- típicas desse grupo em alimentos são Bacillus co-
duzir esporos, cujas características estão descritas agulans e Alicyclobacillus acidoterrestris, cujos
no capítulo específico de contagem de esporos de esporos são bem menos resistentes do que os das
bactérias. Os esporos bacterianos são diferentes termófilas estritas. B. coagulans é anaeróbio fa-
dos esporos dos bolores termorresistentes, não cultativo e tem D121,1 ºC entre 0,01 a 0,07min. Aci-
sendo estruturas de reprodução, mas sim, estrutu- dúrico, cresce bem em pH neutro ou levemente
ras de resistência. Não são metabolicamente ati- ácido (4,0 ou acima). A. acidoterrestris tem D95 ºC
vos, como as células vegetativas. Permanecem em entre 2,5 e 8,7min e z entre 7,2 e 11,3 ºC. É aeró-
estado de dormência e, em condições favoráveis, bio, embora algumas cepas possam ser anaeróbias
germinam e dão origem a novas células vegetati- facultativas. Acidófilo, tem pH ótimo de 3,5 a 5,0
vas. Sua resistência térmica varia com as espécies, e geralmente não cresce em pH acima de 6,0.
algumas comparando-se aos bolores termorresis- Bactérias esporogênicas aeróbias mesófilas. O
tentes e outras muito acima, não sendo destruídos Compendium (Stevenson & Lembke, 2015) de-
em temperaturas inferiores a 100 ºC. fine esse grupo como bactérias aeróbias que cres-
Bactérias esporogênicas aeróbias termófilas cem melhor a 35 do que a 55 ºC, porque algumas
estritas. São bactérias aeróbias que crescem bem cepas são capazes de crescer em temperaturas aci-
em altas temperaturas (ótima na faixa dos 55 ºC ma de a 50 ºC. As espécies típicas são dos gêneros
ou acima) e não crescem em temperaturas inferio- Bacillus (B. licheniformis, B. cereus) e Paeniba-
res a 37 ºC. A espécie típica desse grupo em ali- cillus (P. macerans, P. polymyxa), cujos esporos
mentos é Geobacillus stearothermophilus, cujos são menos resistentes do que os das bactérias ter-
esporos estão entre os mais resistentes ao calor mófilas. Sporolactobacillus, Brevibacillus e Vir-
(D121,1 ºC = 4-5min). Aeróbio estrito ou anaeróbio gibacillus também se encaixam nessa definição,
facultativo, não cresce em condições ácidas (pH mas sua associação com alimentos esterilizados é
mínimo 5,5). Alicyclobacillus acidocaldarius tam- pouco documentada.
bém é termófilo estrito, mas sua presença em ali- Bactérias esporogênicas mesófilas anaeróbias.
mentos é menos comum. O valor D120 ºC em água, As espécies típicas desse grupo são do gênero
tampão citrato-fosfato e suco de laranja é de Clostridium. Os clostrídios proteolíticos (putrefa-
0,1min. É acidófilo e não cresce em pH neutro ou tivos) (C. sporogenes, C. bifermentans, C. putre-
acima de 6,0. fasciens, C. hystolyticum e C. botulinum tipos
Bactérias esporogênicas anaeróbias termófilas A e B) produzem esporos de maior resistência
estritas. São bactérias anaeróbias que crescem térmica. Os clostrídios não proteolíticos (sacaro-
bem em altas temperaturas (ótima na faixa dos 55 líticos) (C. butyricum, C. pasteurianum, C. tyro-
ºC ou acima) e não crescem em temperaturas infe- butyricum, C. beijerinckii e C. acetobutylicum),
riores a 37 ºC. As espécies típicas desse grupo em capazes de crescer em pH 4,2-4,4, produzem es-
alimentos são Thermoanaerobacterium thermo- poros pouco resistentes ao calor, comparados aos
saccharolyticum (D121,1 ºC = 3 a 4min, pH mínimo dos putrefativos.
4,7) e Desulfotomaculum nigrificans (D121,1 ºC =
2 a 3min, pH mínimo 6,2), cujos esporos estão en- 23.1.3. Dimensionamento de
tre os mais resistentes ao calor e não crescem em processos térmicos
condições ácidas.
As informações abaixo são de NCA (1968), Stum-
Bactérias esporogênicas aeróbias termófilas bo (1973) e Germer et al. (1995).
facultativas. São bactérias aeróbias que crescem Dimensionamento de processos térmicos é o cál-
bem a 55 ºC mas, ao contrário das termófilas estri- culo da letalidade (F), definida como o tempo (em

minutos) necessário para destruir um determinado chamado de tempo equivalente à temperatura de

número de microrganismos, numa determinada referência e, quando a temperatura de referência
temperatura de referência. é 121 ºC e o valor z é de 10 ºC, é chamado de F0.
Esse cálculo seria muito simples se a esterilização
Definição da intensidade do processo
de alimentos fosse feita à temperatura constante, térmico
da mesma forma como é determinado o valor D.
Quanto maior o tempo e a temperatura de um pro-
Nessa situação, a suspensão de microrganismos
cesso térmico, mais intenso (mais letal) é o trata-
atingiria a temperatura letal instantaneamente e,
mento e menor é a chance de sobrevivência dos
finalizado o tempo de exposição, seria resfriada
microrganismos. Entretanto, o tempo e a tempera-
também instantaneamente. Então, a letalidade se-
tura não podem ser elevados indiscriminadamen-
ria o intervalo de tempo necessário para atingir um
te, porque isso comprometeria a qualidade nutri-
número de reduções decimais preestabelecido, na
cional e sensorial do alimento.
população de um microrganismos alvo também
preestabelecido. Usando a Equação (1) da curva Para alimentos de baixa acidez, a temperatura
de sobrevivência, onde t (tempo em minutos) é de referência é 121,1 ºC (aplicação de calor sob
chamado de F temos: pressão) e os microrganismos considerados no di-
mensionamento do processo são C. botulinum e
t = F = D Log (N0/Nf) as outras bactérias esporogênicas.
Para C. botulinum, a intensidade deve ser sufi-
De acordo com essa equação, o tempo necessá-
ciente para promover 12 reduções decimais na
rio para promover n reduções decimais na popu-
população dos esporos mais resistentes da espécie
lação alvo, ou seja, atingir uma população final
(tipos A e B). O valor D121,1 ºC desses esporos é de
Nf= N0/10n seria:
0,21min e o maior valor z determinado é de 10 ºC.
F = D Log(N0/N0/10n) = D Log10n = nD Então, o tempo equivalente à temperatura de refe-
Ou seja, para n reduções decimais, o tempo neces- rência (nesse caso F0) é calculado como:
sário é, simplesmente, F = nD. F0 = nD = 12 x 0,21 = 2,5min
Na prática, tratamentos a temperaturas constantes Isso significa que a letalidade do processo real, à
são raros, devido à inércia térmica dos materiais. temperatura não constante, deve ser equivalente a
Há um tempo de subida, até que o produto atinja 2,5min a 121,1 ºC.
a temperatura de tratamento, bem como um tem- Se considerarmos uma contaminação inicial de
po de descida, até que o produto seja resfriado. um esporo por embalagem (provavelmente segu-
Esse intervalo, em que a temperatura do produ- ra, segundo Stumbo, 1973), a contaminação final
to está abaixo da temperatura de processo, tam- seria Nf = N0/1012 = 1/1012 = 10-12. Esse valor de Nf
bém exerce um efeito letal e é considerado. Nesse é chamado de probabilidade de sobrevivência ou
caso, a letalidade é a soma do efeito letal de cada nível de garantia de esterilidade. O valor de 10-12
combinação tempo/temperatura por que passa o significa uma chance em 1012 (um trilhão) de res-
produto, determinado através do valor z. Os cál- tar uma embalagem com esporos viáveis ou, ain-
culos podem ser feitos de várias formas, descritas da, uma em cada 1012 embalagens poderia conter
pela NCA (1968), Stumbo (1973) e Germer et al. esporos viáveis depois do processamento.
(1995). Para outras bactérias esporogênicas mesófilas
No final, o efeito destrutivo total deve ser equiva- e termófilas facultativas, como não apresentam
lente à letalidade obtida através da curva de sobre- risco do ponto de vista da saúde pública, os fa-
vência, ou seja, equivalente ao tratamento à uma bricantes trabalham com probabilidade de sobre-
determinada temperatura de referência constante, vivência ou nível de garantia de esterilidade de
aplicado para obter um determinado número de 10-5 (cinco reduções decimais) (Stumbo, 1973).
reduções decimais. Por isso, o valor F também é Se considerarmos os maiores valores z e D121,1 ºC

de Clostridium sporogenes (1,5min e 10 ºC), que funcionamento do equipamento; falha no controle

é uma das bactérias deteriorantes mais resisten- do tempo/temperatura de esterilização.
tes termicamente, o tempo equivalente para cinco Nos alimentos de baixa acidez, o subprocessa-
reduções decimais é F0 = nD = 5 x 1,5 = 7,5min. mento é caracterizado pela sobrevivência de espo-
Então, o processamento térmico de alimentos de ros de mesófilos ou termófilos facultativos. A de-
baixa acidez é mais intenso do que o requerido terioração anaeróbia por clostrídios putrefativos
para C. botulinum. é a mais comum, caracterizada por odor pútrido.
No caso de alimentos destinados à estocagem em Esse tipo de deterioração tem sérias implicações,
temperaturas superiores a 40 ºC (“vending mado ponto de vista de saúde pública, devido ao ris-
chines”), as bactérias espororgênicas termófilas co de presença de C. botulinum e suas toxinas.
estritas devem ser consideradas. Segundo Stum- Nos alimentos ácidos, a sobrevivência de esporos
bo (1973), a letalidade de vários processos utili- de bactérias mesófilas não é suficiente para carac-
zados nos Estados Unidos para esses alimentos é terizar subprocessamento, porque o tratamento é
equivalente a 14-16min a 121,1 ºC. Utilizando os mais brando. A sobrevivência de pequeno núme-
maiores valores D121,1 ºC e z de G. stearothermo- ro de esporos de mesófilos não ácido-tolerantes é
philus (5min e 12,2 ºC), que é uma das termófilas aceitável, uma vez que são incapazes de germinar
estritas mais resistentes termicamente, o número e crescer no pH do produto. O subprocessamento,
de reduções decimais desse tratamento, para essa nesse caso, é caracterizado pela sobrevivência de
bactéria, seria n = F/D = 14-16/5 = 2,8 a 3,2 re- esporos de bactérias ácido tolerantes e/ou espo-
duções. ros de bolores termorresistentes. São comuns os
Para alimentos ácidos, a temperatura de referên- anaeróbios mesófilos butíricos, como C. pasteu-
cia é menor do que 100 ºC e a aplicação de calor rianum, que produz ácido butírico (odor butíri-
não é feita sob pressão. Não há, entretanto, uma co), CO2 e H2 (estufamento). Também é comum
temperatura preestabelecida, sendo utilizada, para o termófilo facultativo “flat-sour” B. coagulans
cada produto, aquela considerada letal para os mi- (principalmente em produtos de tomate), que não
crorganismos de maior resistência, dentre os que provoca estufamento das embalagens. Os bolores
podem crescer. termorresistentes mais comuns são Byssochlamys
fulva, Neosartorya fischeri e Talaromyces flavus,
23.1.4. Deterioração microbiana de que provocam descoloração, odor de mofo, pre-
alimentos enlatados sença de micélios e, eventualmente, ligeiro estu-
famento. No caso de subprocessamento grosseiro,
A deterioração microbiana de alimentos enlata- também podem sobreviver células de bactérias
dos não deve ser encarada como um problema não esporogênicas, bolores e leveduras. Nesse se-
comum, pois geralmente só acontece em decor- gundo caso, para caracterizar o subprocessamento
rência de falhas na correta condução do processa- como causa da deterioração, é necessário verificar
mento. As principais causas são: a ausência de vazamento, porque culturas mistas
de bactérias, bolores e leveduras também são ca-
Subprocessamento
racterísticas da deterioração por vazamento.
Subprocessamento é a aplicação de calor em
quantidade insuficiente para atingir a esterilidade Contaminação pós-processamento
comercial. Pode ser provocado por erro no dimen- (vazamento)
sionamento do processo térmico; contaminação O termo vazamento é utilizado para expressar a
excessiva do produto antes da aplicação de calor recontaminação do produto depois do tratamento
(tornando o tratamento térmico insuficiente); al- térmico. É decorrente da entrada de microrganis-
terações na formulação do produto (com conse- mos ou de ar ou água contaminados, através da
quente efeito na transferência de calor); falha no embalagem processada. Pode ocorrer por falha no

sistema de fechamento das embalagens; utilização provocada por T. thermosaccharolyticum, que

de embalagens defeituosas; manuseio inadequado resulta em odor de queijo e pronunciado estu-
das embalagens, com consequente dano nos selos famento das embalagens;
ou costuras; resfriamento em água excessivamen- c) deterioração termófila anaeróbia com produção
te contaminada. Nos alimentos produzidos pelo de H2S, provocada por D. nigrificans, que re-
processo asséptico (produto e embalagem são es- sulta no escurecimento do conteúdo (reação do
terilizados separadamente e o enchimento é fei- H2S com o ferro), sem estufamento das emba-
to em um ambiente asséptico), a recontaminação lagens.
pode ocorrer no resfriamento (que é feito antes
do acondicionamento), na área de enchimento, na Multiplicação microbiana antes do
área de fechamento ou mesmo, no enchimento de tratamento térmico
uma embalagem não estéril. A permanência do produto formulado por pe-
A deterioração por vazamento é caracterizada pela ríodos prolongados, antes da esterilização, pode
presença de uma microbiota mista, que pode con- permitir a multiplicação de microrganismos, re-
ter tanto bactérias esporogênicas como bolores, sultando num processo incipiente de deterioração.
leveduras e bactérias não esporogênicas (bastone- Esse processo será interrompido pelo tratamento
tes, cocos, cocobacilos). Dependendo da micro- térmico, porém, as alterações já introduzidas não
biota predominante, pode haver ou não produção serão revertidas, resultando em produtos altera-
de gás (estufamento). dos, com um grande número de células mortas e,
em alguns casos, com as embalagens sem vácuo
Deterioração por termófilos estritos ou levemente estufadas, pelo acúmulo de CO2.
A deterioração por termófilos estritos ocorre quan-
do o produto permanece por tempo prolongado a Causas não microbianas de deterioração
temperaturas elevadas, permitindo a germinação Nem sempre a deterioração de alimentos enlata-
dos esporos que tenham sobrevivido ao processados tem origem microbiana, podendo ser provo-
mento. Pode ser causada por resfriamento lento cada por outras causas como:
e/ou estocagem em temperaturas superiores a a) Interação química entre o alimento e a embala-
37 ºC. Para caracterizar esse tipo de deterioração gem, que ocorre principalmente entre os ácidos
é necessário verificar se os esporos sobreviventes dos alimentos e o metal das embalagens. Pro-
são de termófilos estritos ou facultativos. Para voca corrosão com produção e acúmulo de gás
tanto deve-se isolar e purificar a cultura e, a partir hidrogênio (estufamento). Em estágios avança-
da cultura pura, promover a produção de esporos, dos podem ser observados microfuros nas latas
submeter a choque térmico e incubar a 35 e 55 ºC, ou nas tampas de embalagens de vidro.
observando a temperatura de germinação. Espo- b) Reações enzimáticas, que ocorrem principal-
ros que germinem exclusivamente a 55 ºC são ter- mente em alimentos produzidos pelo proces-
mófilos estritos, cuja sobrevivência em pequeno so asséptico, tratados com altas temperaturas
número é considerada normal em enlatados, se o por curto tempo (UHT ou HTST). Resultam da
produto não se destinar à estocagem em tempera- não inativação ou da regeneração de enzimas
turas acima de 37 ºC. Esporos que germinem tanto constituintes do alimento, podendo provocar
a 35 quanto a 55 ºC são termófilos facultativos e alterações como liquefação, coagulação, des-
não devem sobreviver ao tratamento térmico. coloração ou odores estranhos. Esse tipo de
As alterações por temófilos mais comuns são: deterioração não apresenta risco de saúde, não
a) deterioração tipo “flat-sour”, provocada por G. provoca alterações na embalagem e geralmen-
stearothermophilus, que resulta em redução do te é caracterizado pela presença de número re-
pH sem estufamento; duzido de células microbianas, na observação
b) deterioração anaeróbia sem produção de H2S, microscópica direta do produto.

23.2. Método APHA:2015 □ Ágar Selo (Ágar 2%) ou Vaspar (vaselina:pa-

rafina 1:1)
para teste de esterilidade □ Reagentes para coloração de Gram
comercial e determinação □ Reagentes para coloração de esporos
da causa da deterioração de □ Álcool iodado
alimentos de baixa acidez □ Abridor de latas bacteriológico esterilizado
□ Tesouras, pinças, espátulas, estiletes esterilizados
Método da American Public Health Association □ Equipamento ou sistema de geração de atmos-
(APHA), descrito nos Capítulos 61 e 62 da 5ª edi- fera anaeróbia
ção do Compendium of Methods for the Microbio- □ Estufa incubadora regulada a 30 ou 35 ºC
logical Examination of Foods (Elliott & Kataoka, □ Estufa incubadora regulada a 55 ºC
2015, Parkinson & Francis, 2015).
Observações 23.2.2. Procedimento
O Compendium diferencia o teste de esterilidade O esquema de análise para o teste de esterilidade
comercial (capítulo 61) do teste de causa da de- comercial ou causa da deterioração de alimentos
terioração (capítulo 62) o que não foi feito nes- de baixa acidez pelo método APHA:2015 encon-
se manual. A utilização do mesmo procedimento tra-se descrito na Figura 23.3.
para os dois testes é baseada em várias outras Advertência
referências, como o Bacteriological Analytical Todas as etapas do ensaio de alimentos de baixa
Manual (BAM Online) da Food and Drug Admi- acidez envolvem o risco de presença de Clostri-
nistration (Landry et al., 2001) e o Compendium dium botulinum e suas toxinas. Em função disso,
of Analytical Methods do Governo do Canada, o teste deve ser conduzido apenas por técnicos
Health Products and Food Branch (MFHPB, bem treinados, particularmente no caso de amos-
2001). Na verdade, embora separando os capítu- tras alteradas (estufadas, com vazamento ou com
los, o Compendium também segue basicamente o perda de vácuo).
mesmo procedimento para os dois testes. a) Cuidados para prevenir a contaminação do
No método descrito abaixo, a inoculação das analista e do laboratório
amostras é feita em tubos com meio de cultura Todas as etapas da análise devem ser realizadas
líquido. O Compendium também coloca possibi- com toucas, luvas, máscara e óculos protetores.
lidade de fazer algumas inoculações diretamente O ensaio deve ser conduzido em capela de flu-
em placas. Neste caso, inocular uma alçada da xo laminar vertical, que protege tanto o analis-
amostra em cada placa, por estrias de esgotamen- ta quanto a amostra contra contaminação.
to ou, se o produto for líquido, fazer o plaquea- Todo o manuseio deve ser feito sobre bandejas
mento em profundidade (1 ml sem diluição). A in- e não diretamente sobre as bancadas.
cubação é feita nas mesmas condições indicadas Nenhuma coleta de líquido com pipeta deve
para os tubos. ser feita com a boca e sim com pipetadores.
a.1. Procedimento de inativação de toxina botu-
23.2.1. Material requerido para a línica em caso de acidente. Se houver contato
análise com a pele, inativar com uma solução satu-
□ Tubos de Meio de Carne Cozida (CMM) ou rada (10%) de carbonato de sódio (Na2CO3).
Meio PE-2 Para inativação em superfícies, usar uma so-
□ Placas de Ágar Tripticase de Soja (TSA) lução 1N de NaOH (HPBL, 1973).
□ Placas de Ágar Fígado de Vitela (LVA) b) Cuidados para evitar a contaminação aci-
□ Tubos de Caldo Dextrose Triptona (DTB) dental da amostra no laboratório
□ Placas de Ágar Nutriente Manganês (ANMn) A contaminação acidental das amostras no la-

Figura 23.3. Esquema de análise para o teste de esterilidade comercial ou causa da deterioração de alimentos de baixa acidez
pelo método APHA:2015 (Elliott & Kataoka, 2015, Parkinson & Francis, 2015).

boratório é particularmente problemática no gem em temperatura superior a 40 ºC (“hot

caso de teste de esterilidade comercial, porque vending”) devem ser incubadas também a
o objetivo primordial do ensaio é demonstrar a 55 ºC por cinco a sete dias. A pré-incubação
ausência de microrganismos viáveis na amos- objetiva verificar a ocorrência de possíveis
tra. Para garantir a confiabilidade dos resulta- alterações, como estufamento e/ou vaza-
dos, devem ser criteriosamente observados os mento e/ou modificação nas características
seguintes cuidados: sensoriais (cor, odor, textura, viscosidade
Além de conduzir o teste em câmara de fluxo etc.). Sendo evidenciada qualquer alteração,
laminar vertical, o equipamento deve ser des- observar os cuidados recomendados ao lon-
contaminado e mantido em operação por uma go do texto para amostras alteradas.
hora, antes do uso. c.2) Amostras normais com mais de 30 dias
A esterilidade dos meios de cultura deve ser de fabricação. Essas amostras não precisam
verificada antes do início das análises. Para ser pré-incubadas, podendo ser analisadas
tanto, incubar uma amostra de cada meio de imediatamente ou estocadas à temperatura
cultura, de cada batelada preparada, nas mes- ambiente até o momento da análise.
mas condições que serão utilizadas na análise. c.3) Amostras alteradas. Amostras estufadas,
Todos os frascos e tubos, vazios ou contendo com vazamento ou com suspeita de mi-
meios de cultura, devem ser de tampa rosque- crorganismos patogênicos não devem ser
ável, que protege a boca contra contaminação pré-incubadas. Acondicionar a embalagem
ambiental. Alternativamente, cobrir os tam- em uma bolsa plástica resistente e manter
pões e a boca dos frascos e tubos com uma fo- sob refrigeração até o momento da análise.
lha dupla de alumínio. Se a embalagem estiver aberta, é recomen-
Todos os utensílios destinados ao teste (espá- dável transferir o conteúdo para um frasco
tulas, colheres, pinças, abridores de lata etc.) estéril. No caso da suspeita de presença de
devem ser previamente esterilizados em em- T. thermosaccharolyticum, entretanto, não é
brulhos individuais, identificando-se a extre- recomendável refrigerar as amostras, por-
midade que deve ser aberta. Em autoclave, a que as células vegetativas dessas bactérias
esterilização deve ser feita a 121 ºC/30min. geralmente morrem sob refrigeração e não
Em estufa de esterilização, deve ser feita a é usual a formação de esporos em enlatados
170-180 ºC/2h. A prática de flambagem com (Enache & Podolak, 2015).
álcool não é recomendada, nesse caso, porque
não elimina esporos. d) Abertura asséptica das embalagens
Antes de iniciar as análises, lavar as mãos d.1) Amostras normais. Lavar as embalagens
com água e sabão e descontaminar com álcool com sabão ou detergente, enxáguar em água
70%. Substituir o avental usado por um aven- corrente e secar com papel toalha. Desin-
tal limpo. Prender os cabelos antes de colocar fetar a parte onde será feita a abertura com
a touca. Se estiver resfriado ou com tosse, não álcool iodado, flambando até a completa
conduzir esse ensaio. combustão. Embalagens que não resistem
c) Manutenção e pré-incubação das amostras à combustão devem permanecer em contato
antes da análise com o álcool iodado por pelo menos 15 mi-
c.1) Amostras normais recém processadas. nutos, para garantir a desinfecção.
Amostras de alimentos recém-processados A abertura de latas deve ser feita pelo fundo,
(com menos de 30 dias desde a fabricação, com o auxílio de um abridor de latas do tipo
segundo MFHPB-01, 2001) devem ser pré- bacteriológico esterilizado (Figura 23.4),
-incubadas a 30-35 ºC por dez dias, antes que não danifica a recravação. Latas do tipo
da análise. Amostras destinadas à estoca- “easy open” também devem ser abertas pelo

Figura 23.4. Abridor de latas bacteriológico para a abertura de latas no teste de esterilidade comercial.
fundo, da mesma forma utilizada para as funil estéril invertido sobre a região da aber-
latas convencionais, garantindo-se a inte- tura e, passando-se um estilete através do fu-
gridade do sistema de abertura. Embalagens nil, furar a embalagem para aliviar a pressão
de vidro podem ser abertas aplicando-se o interna. Alternativamente, em lugar do funil
abridor de latas bacteriológico à tampa, com invertido pode-se utilizar uma toalha ou um
o devido cuidado para não deslocar a tampa chumaço de algodão estéril sobre a região
de sua posição em relação ao corpo. Haven- da abertura. Depois do escape dos gases, a
do necessidade de remover completamente abertura pode ser continuada da mesma for-
a tampa, a remoção pode ser facilitada, se ma recomendada para embalagens normais.
for feito um furo no centro (com o abridor e) Inoculação. Homogeneizar o conteúdo da em-
de latas bacteriológico), para aliviar o vá- balagem e, antes da inoculação, retirar 50g ou
cuo. Embalagens flexíveis podem ser corta- 50 ml da amostra e transferir para frascos esté-
das com uma tesoura estéril, removendo-se reis com tampas rosqueáveis. Conservar essa
uma das extremidades, abaixo do ponto de porção sob refrigeração, como contra-amostra.
selagem, porém, sem danificar o selo, que Inocular aproximadamente 2g ou ml da amos-
deve ser guardado para análises físicas pos- tra nos meios abaixo. Os tubos de CMM ou
teriores, se necessárias. PE-2 devem ser desaerados antes da inocula-
d.2) Amostras alteradas. Antes da abertura, ob- ção e, após a inoculação, cobertos com Ágar
servar e anotar as condições da embalagem, Selo ou Vaspar. Nas placas de Ágar Tripticase
como estufamento leve ou pronunciado, de Soja (TSA) estriar diretamente uma alçada
evidência de vazamento, corrosão, etc. Res- do alimento como controle.
friar as embalagens estufadas, para reduzir Meio de Carne Cozida (CMM) ou meio PE-2
4 tubos
o risco de explosão ou escape descontrolado (com ágar selo)
dos gases durante a abertura. Caldo Dextrose Triptona (DTB) 4 tubos
Lavar as embalagens com escova e detergen-
Ágar Tripticase de Soja (TSA) (controle) 2 placas
te, desinfetar a parte onde será feita a aber-
tura com álcool iodado e manter o contato Nota e.1) O Compendium recomenda inocular um segun-
com o álcool iodado por pelo menos 15 mido grupo de quatro tubos de CMM ou PE-2 e sub-
nutos. Remover o excesso com um chumaço meter a choque térmico, para detecção de esporos.
de algodão estéril ou aguardar a secagem na Entretanto, considerando que o produto já foi tratado
termicamente o choque térmico não é necessário. No
capela de fluxo laminar. Não flambar as em- caso da investigação da causa da deterioração, nem é
balagens estufadas pois há risco de explosão. recomendável, porque a ocorrência de deterioração é
A abertura das embalagens não estufadas uma indicação de que os esporos eventualmente pre-
pode ser feita da mesma forma recomendada sentes, se responsáveis pela alteração, já germinaram
e não serão mais encontrados no produto.
para amostras normais. No caso das emba-
lagens estufadas, são necessários cuidados f) Incubação. Incubar os tubos e placas nas con-
adicionais para evitar o escape descontrola- dições abaixo. Se o produto não se destinar à
do dos gases ou do conteúdo. Uma das for- estocagem em temperatura acima de 37 ºC, os
mas de prevenir esse problema é colocar um tubos incubados 55 ºC podem ser omitidos.

Nº de tubos Temperatura/
Meio Atmosfera Microbiota alvo
ou placas tempo de incubação
CMM/PE-2 com ágar selo 2 tubos 30 ou 35 ºC / até 7 dias normal Bactérias esporogênicas mesófilas anaeróbias
CMM/PE-2 com ágar selo 2 tubos 55 ºC / até 7 dias normal Bactérias esporogênicas termófilas anaeróbias
DTB 2 tubos 30 ou 35 ºC / até 7 dias normal Bactérias esporogênicas mesófilas aeróbias
DTB 2 tubos 55 ºC / até 7 dias normal Bactérias esporogênicas termófilas aeróbias
TSA 1 placa 30 ou 35 ºC / até 7 dias normal Controle - bactérias esporogênicas mesófilas aeróbias
TSA 1 placa 30 ou 35 ºC / até 7 dias anaeróbia Controle - bactérias esporogênicas mesófilas anaeróbias
g) Caracterização dos microrganismos isolados h) Caracterização dos microrganismos isola-

em CMM/PE-2. Havendo crescimento nos tu- dos em DTB. Havendo crescimento nos tubos
bos, submeter as culturas à caracterização. Em de DTB, submeter as culturas à caracterização.
caso de dúvidas sobre o desenvolvimento de Em caso de dúvidas sobre o desenvolvimento
microrganismos (crescimento duvidoso), con- de microrganismos (crescimento duvidoso),
tinuar o ensaio normalmente e, não havendo continuar o ensaio normalmente e, não haven-
crescimento nas subculturas, considerar que do crescimento nas subculturas, considerar
não houve crescimento no tubo original. que não houve crescimento no tubo original.
Para verificar a formação de esporos e a mor-
Cuidado na manipulação dos tubos incubados
fologia das células, inocular cada cultura obti-
a 30 ou 35 ºC, devido à potencial presença de
da nos tubos de DTB em Ágar Nutriente Man-
Clostridium botulinum e suas toxinas. Apenas
ganês (ANMn). Incubar as placas por até dez
técnicos bem treinados devem trabalhar com
dias, na mesma temperatura do tubo original.
essas culturas.
Após a incubação, selecionar uma colônia de
Para verificar se a cultura é anaeróbia estrita cada tipo presente nas placas, para a caracte-
ou facultativa, inocular uma alçada de cada rização morfológica. Submeter as culturas à
tubo em duas placas de Ágar Fígado de Vitela coloração de esporos e à coloração de Gram,
(LVA) por estrias de esgotamento. De cada par conforme procedimentos descritos no Capítu-
de placas, incubar uma sob condições anaeró- lo 5. Havendo formação de esporos nas placas
bias e uma sob condições aeróbias, por quatro incubadas a 55 ºC, verificar se a cultura é ter-
dias, na mesma temperatura do tubo original. mófila estrita ou facultativa.
Crescimento exclusivo na placa anaeróbia in- Para verificar se a cultura é termófila estrita ou
dica cultura anaeróbia estrita. Crescimento nas facultativa, transferir duas alçadas da cultura
duas placas (aeróbia e anaeróbia) indica cultu- obtida nas placas de ANMn a 55 ºC para 1 ml de
ra anaeróbia facultativa ou mistura de anaeró- água peptonada estéril, submeter a choque tér-
bios facultativos e anaeróbios estritos. mico por 10min sob fervura. Resfriar imediata-
Para a caracterização da morfologia das cé- mente em banho de gelo e estriar o material em
lulas, preparar uma montagem úmida da cul- duas novas placas de ANMn. Incubar uma placa
tura obtida em cada placa, para observação a 35 ºC/4 dias e uma placa a 55 ºC/4 dias. Ob-
microscópica a fresco (procedimento descri- servar a temperatura em que ocorre germinação
to no Capítulo 5). Selecionar uma colônia de e crescimento dos esporos. Crescimento a 35
cada tipo presente nas placas, para a caracte- e 55 ºC indica termófilos facultativos. Cresci-
rização. Observar o(s) tipo(s) morfológico(s) mento apenas a 55 ºC indica termófilos estritos.
das células, que podem ser bastonetes, cocos, Para verificar se a cultura é mesófila ou termófi-
cocobacilos, leveduras ou bolores. Havendo la facultativa, transferir duas alçadas da cultura
culturas de bastonetes, anotar se há formação obtida nas placas de ANMn a 30 ou 35 ºC para
de esporos. 1 ml de água peptonada estéril, submeter a cho-

que térmico por 10min a 85 ºC. Resfriar imedia- taminação acidental as seguintes situações:
tamente em banho de gelo e estriar o material a) Crescimento em apenas um tubo da duplica-
em duas novas placas de ANMn. Incubar uma ta. b) Microbiota com características diferen-
placa a 35 ºC/4 dias e uma placa a 55 ºC/4 dias. tes em cada tubo da duplicata. c) Crescimento
Observar a temperatura em que ocorre germi- anaeróbio com produção de gás a 30-35 ºC,
nação e crescimento dos esporos. Crescimen- quando a amostra não apresentou qualquer
to a 35 e 55 ºC indica termófilos facultativos. problema de estufamento ou perda de vácuo
Crescimento apenas a 35 ºC indica mesófilo. na pré-incubação. d) Fazendo uma observação
i) Crescimento de microrganismos nas placas microscópica direta da amostra, encontrar ti-
de TSA. A inoculação nas placas de TSA é re- pos morfológicos diferentes dos encontrados
comendada como controle da inoculação dos nas culturas. Nesses casos, repetir o ensaio
caldos nos tubos. O crescimento de microrga- com a contra-prova armazenada, observando
nismos nas placas de TSA irá confirmar que criteriosamente os cuidados para evitar a con-
qualquer crescimento nos respectivos tubos taminação acidental da amostra no laborató-
deve-se à contaminação do produto e não à rio. Não havendo indicação de contaminação
contaminação laboratorial. acidental, interpretar os resultados conforme
orientação do Quadro 23.2 e itens abaixo:
j) Descarte das amostras e guarda das embala-
gens. Esterilizar o conteúdo restante da amos- Em amostras alteradas, a ocorrência de cres-
tra nas embalagens a 121 ºC/30min e descartar. cimento é esperada. Interpretar os resultados
Lavar e guardar as embalagens, para análises conforme orientação do Quadro 23.2 e itens
físicas posteriores, se necessárias. abaixo:
c) Crescimento em CMM ou PE-2 → LVA a 30-
23.2.3. Interpretação dos 35 ºC. A incubação do CMM ou PE-2 a 30-35 ºC
resultados objetiva verificar a presença de bactérias es-
A interpretação depende da ocorrência ou não de porogênicas anaeróbias mesófilas (clostrídios
crescimento, em que meios e condições de incu- mesófilos, incluindo C. botulinum). Entretan-
bação ocorreu o crescimento e se a amostra apre- to, diversos outros microrganismos podem
sentou ou não evidência de alteração. crescer nessas condições:
a) Ausência de crescimento c.1) Microbiota mista. O crescimento de mi-
Em amostras normais, sem evidência de alte- crobiota mista com diferentes tipos morfo-
ração, a ausência de crescimento em qualquer lógicos (bastonetes, cocos, cocobacilos, le-
dos tubos inoculados indica produto comer- veduras, bolores) revela a presença de um
cialmente estéril. ou mais grupos microbianos não esporogê-
Em amostras alteradas, a ausência de cresci- nicos, que não podem resistir ao processa-
mento em qualquer dos tubos inoculados pode mento térmico de produtos de baixa acidez.
indicar causas não microbianas da alteração Isso indica produto não comercialmente es-
ou perda da viabilidade da cultura depois do téril, causa provável vazamento.
crescimento e alteração do produto. Isso não c.2) Cultura não esporogênica. O crescimento
é incomum, por exemplo, com anaeróbios ter- de apenas um tipo morfológico de microrga-
mófilos ou com bactérias lácticas. nismo não esporogênico (só bolores, só le-
b) Crescimento veduras, só cocos ou só cocobacilos), revela
Em amostras aparentemente normais, sem a presença de microbiota não resistente ao
evidência de alteração, a ocorrência de cres- processamento térmico de produtos de baixa
cimento em um ou mais tubos pode indicar acidez. Isso indica produto não comercial-
contaminação acidental. São suspeitas de con- mente estéril, causa provável vazamento.

c.3) Cultura só de bastonetes. A interpretação produto não comercialmente estéril, causa

depende da produção de esporos e do reque- provável subprocessamento. Potencial pre-
rimento de oxigênio para crescimento (obser- sença de C. botulinum, particularmente se
vada nas placas de LVA incubadas a 30-35 ºC houver odor pútrido. Verificar presença de
em condições aeróbias e anaeróbias). toxinas botulínicas.
c.3.1. Crescimento exclusivamente anaeró- c.3.2. Crescimento exclusivamente anaeró-
bio com formação de esporos. Revela a pre- bio sem formação de esporos. Revela a pre-
sença de bactérias mesófilas anaeróbias es- sença de bactérias anaeróbias não esporogê-
porogênicas (clostrídios), cujos esporos não nicas ou de bactérias mesófilas anaeróbias
devem sobreviver ao processamento térmi- esporogênicas (clostrídios), que não espo-
co de produtos de baixa acidez. Isso indica rulam facilmente em meios de cultura. Isso
Quadro 23.2. Interpretação dos resultados da determinação da causa da deterioração em alimentos de

baixa acidez (Parkinson & Francis, 2015).
Condição Aparência do Gás pH do
Odor Exame microscópico Cultura Diagnóstico
da lata produto (CO2 & H2) produto
Estufada,
usualmente Normal Normal ou H2 Corrosão, estufamento por
Normal Negativo Negativa
com corrosão (metálico) espumosa (> 20%) hidrogênio
interna
Cultura pura ou mista Crescimento aeróbio e/ou Contaminação pós-proces-

Espumosa ou Abaixo do
Estufada Ácido CO2 de bastonete, cocos ou anaeróbio a 30-35ºC e, samento (vazamento) ou
salmoura viscosa normal
leveduras possivelmente, a 55ºC subprocessamento grosseiro
Bastonetes médio
Gás em anaerobiose a
curtos ou médio Resfriamento inadequado
Normal Normal ou 55ºC e, possivelmente, a
longos, usualmente ou estocagem à tempera-
Estufada ou ácido Espumosa H2 e CO2 ligeiramen- 30-35ºC. Cultura negativa,
com aspecto granular, tura elevada (termófilos
“de queijo” te abaixo provavelmente devido à
esporos raramente anaeróbios)
auto-esterilização
presentes
Bastante Bastonetes, coloração Gás em condições Subprocessamento.
Espumosa, com
Estufada Butírico H2 e CO2 abaixo do bipolar, prováveis anaeróbias a 30-35ºC. Anaeróbios do grupo
bastantes gás
normal esporos Odor butírico butírico
Normal, Normal ou Subprocessamento
Estufada ou Normal ou Bastonetes, Gás em condições
ácido espumosa com (mesófilos anaeróbios
não e sem H2 e CO2 ligeiramen- possivelmente com anaeróbias a 30-35ºC.
“de queijo” desintegração de possibilidade de
vácuo te abaixo esporos presente Odor pútrido
ou pútrido partículas sólidas C. botulinum)
Crescimento aeróbio e/ou Subprocessamento

Levemente anaeróbio com gás a ou contaminação pós-
Pouco ou
Estufada ou anormal, Bastonetes, 30-35ºC, e, possivelmente, processamento vazamento,
Normal ou espu- bastante
não e sem possivel- CO2 ocasionalmente com a 55ºC. Película na mesófilos aeróbios ou
mosa abaixo do
vácuo mente esporos presentes superfície do caldo DTB. anaeróbios facultativos
normal
amoniacal Formação de esporos em (Bacillus subtilis ou tipos
ANMn. Catalase (+) relacionados)
Pouco ou Crescimento com Resfriamento inadequado

Normal, com Normal ou sal- bastante Bastonetes, usualmente ácido e sem gás a 55ºC e, ou estocagem à temperatura
Ácido Sem H2
ou sem vácuo moura viscosa abaixo do com aspecto granular possivelmente, a 30-35ºC. elevada
normal Catalase (+) (termófilos “flat sour”)
Pouco ou Contaminação pós-
Cultura pura ou mista Crescimento aeróbio e/ou
Normal, com Normal Normal ou sal- bastante processamento (vazamento)
Sem H2 de bastonetes, cocos ou anaeróbio a 30-35ºC e,
ou sem vácuo ou ácido moura viscosa abaixo do ou subprocessamento
bolores possivelmente, a 55ºC
normal grosseiro.
Vácuo insuficiente causado

por exaustão insuficiente ou
Normal ou Negativo ou
Sem vácuo e/ branqueamento insuficiente
Normal Normal Sem H2 levemente microrganismos Negativa
ou deformada ou resfriamento inadequado
abaixo escassos
ou sobre-enchimento ou
deterioração insipiente.

indica produto não comercialmente estéril, vos, cujos esporos são altamente resistentes
causa provável vazamento ou subprocessa- ao calor e cuja sobrevivência, em pequeno
mento. É recomendável testar outros meios número, também é considerada normal nos
de esporulação e verificar a presença de alimentos enlatados. Pode ainda indicar mis-
pontos de vazamento na embalagem, para tura de termófilos anaeróbios estritos e facul-
confirmação do diagnóstico. tativos. Se o produto não apresentar evidên-
c.3.3. Crescimento aeróbio e anaeróbio. Re- cia de alteração e não se destinar à estocagem
vela a presença de anaeróbios facultativos ou em temperaturas elevadas, pode ser conside-
mistura de anaeróbios estritos e facultativos. rado comercialmente estéril. Se o produto es-
No segundo caso, os anaeróbios facultativos tiver alterado, a presença desse grupo indica
provavelmente também serão detectados no provável deterioração por resfriamento lento
DTB. Indica produto não comercialmente e/ou estocagem em temperaturas elevadas.
estéril, causa provável subprocessamento. e) Crescimento em DTB → ANMn a 30-35 ºC.
Se não houver esporos podem ser lactoba- A incubação do DTB a 30-35 ºC objetiva ve-
cilos, indicando vazamento ou clostrídios rificar a presença de mesófilos aeróbios espo-
que não esporulam facilmente em meios rogênicos. A observação de bastonetes espo-
de cultura, indicando subprocessamento. É rogênicos indica a presença desse grupo, mas
recomendável testar outros meios de espo- outros grupos de microrganismos também po-
rulação e verificar a presença de pontos de dem crescer.
vazamento na embalagem, para confirma-
e.1) Microbiota mista. O crescimento de micro-
ção do diagnóstico.
biota mista com diferentes tipos morfológi-
d) Crescimento em CMM ou PE-2 → LVA a cos (bastonetes, cocos, cocobacilos, levedu-
55 ºC. A incubação do PE-2 ou CMM a 55 ºC ras, bolores) revela a presença de um ou mais
objetiva verificar a presença de bactérias espo- grupos microbianos que não são formadores
rogênicas anaeróbias termófilas. A observação de esporos e não resistem ao processamen-
de bastonetes indica a presença desse grupo de to térmico de produtos de baixa acidez. Isso
microrganismos, que podem ser confirmados indica produto não comercialmente estéril,
pelo teste de requerimento de oxigênio para causa provável vazamento. Verificar a pre-
crescimento, nas placas de LVA incubadas a sença de pontos de vazamento na embala-
55 ºC em condições aeróbias e anaeróbias. gem, para confirmação do diagnóstico.
d.1) Crescimento exclusivamente anaeróbio. e.2) Cultura pura não esporogênica. O cres-
Confirma a presença de termófilos anaeró- cimento de apenas um tipo morfológico de
bios estritos, cujos esporos são altamente microrganismo que não forma esporos (só
resistentes ao calor e cuja sobrevivência, em bolores, só leveduras, só cocos ou só coco-
pequeno número, é considerada normal nos bacilos), revela a presença de microbiota
alimentos enlatados. Se o produto não apre- não resistente ao processamento térmico de
sentar evidência de alteração e não se desti- produtos de baixa acidez. Isso indica pro-
nar à estocagem em temperaturas elevadas, duto não comercialmente estéril, causa pro-
pode ser considerado comercialmente esté- vável vazamento. Verificar a presença de
ril. Se o produto estiver alterado, a presença pontos de vazamento na embalagem, para
desse grupo indica provável deterioração confirmação do diagnóstico.
por resfriamento lento e/ou estocagem em e.3) Cultura pura só de bastonetes. A interpre-
temperaturas elevadas. tação depende da produção de esporos em
d.2) Crescimento aeróbio e anaeróbio. Revela a ANMn a 30-35 ºC.
presença de termófilos anaeróbios facultati- e.3.1. Esporos ausentes. Revela presença de

aeróbios mesófilos não espororgênicos, não 23.3. Método APHA:2015

resistente ao processamento térmico de pro-
dutos de baixa acidez. Isso indica produto
para teste de esterilidade
não comercialmente estéril, causa provável comercial e determinação
vazamento. Verificar a presença de pontos da causa da deterioração de
de vazamento na embalagem, para confir- alimentos ácidos
mação do diagnóstico.
e.3.2. Esporos presentes. Revela presença Método da American Public Health Association
de aeróbios mesófilos esporogênicos, cujos (APHA), descrito nos Capítulos 61 e 62 da 5ª edi-
esporos não devem sobreviver ao processa- ção do Compendium of Methods for the Microbio-
mento térmico de produtos de baixa acidez. logical Examination of Foods (Elliott & Kataoka,
Isso indica produto não comercialmente es- 2015, Parkinson & Francis, 2015).
téril, causa provável subprocessamento.
Observações
f) Crescimento em DTB → ANMn a 55 ºC. A
incubação do DTB a 55 ºC objetiva verificar O Compendium diferencia o teste de esterilidade
a presença de bacilos termófilos estritos. A comercial (capítulo 61) do teste de causa da de-
observação de bastonetes com esporos aponta terioração (capítulo 62) o que não foi feito nes-
para esse grupo, mas a confirmação depende se manual. A utilização do mesmo procedimento
da temperatura de germinação dos esporos e para os dois testes é baseada em várias outras
crescimento da cultura. referências, como o Bacteriological Analytical
f.1) Germinação e crescimento apenas a 55 ºC. Manual (BAM Online) da Food and Drug Admi-
Confirma a presença de aeróbios termófilos nistration (Landry et al., 2001) e o Compendium
estritos. Produção de ácido no tubo original of Analytical Methods do Governo do Canada,
de BCP ou DTB (mudança da coloração do Health Products and Food Branch (MFHPB,
meio para amarelo) indica aeróbios termófi- 2001). Na verdade, embora separando os capítu-
los tipo “flat-sour”. Os esporos aeróbios ter- los, o Compendium também segue basicamente o
mófilos estritos são altamente resistentes ao mesmo procedimento para os dois testes.
calor e sua sobrevivência, em pequeno núme- No método descrito abaixo, a inoculação das
ro, é considerada normal nos alimentos enla- amostras é feita em tubos com meio de cultura
tados. Se o produto não apresentar evidência líquido. O Compendium também coloca possibi-
de alteração e não se destinar à estocagem lidade de fazer algumas inoculações diretamente
em temperaturas elevadas, pode ser conside- em placas. Neste caso, inocular uma alçada da
rado comercialmente estéril. Se o produto es- amostra em cada placa, por estrias de esgotamen-
tiver alterado, a presença desse grupo indica to ou, se o produto for líquido, fazer o plaquea-
provável deterioração por resfriamento lento mento em profundidade (1 ml sem diluição). A in-
e/ou estocagem em temperaturas elevadas. cubação é feita nas mesmas condições indicadas
para os tubos.
f.2) Germinação e crescimento a 55 ºC e
30-35 ºC. Confirma a presença de aeróbios
termófilos facultativos, cujos esporos não 23.3.1. Material requerido para a
devem sobreviver ao processamento térmi- análise
co de produtos de baixa acidez. Isso indica
□ Tubos de Caldo Thermoacidurans (TAB),
produto não comercialmente estéril, causa
também chamado de Caldo Ácido (CA)
provável subprocessamento.
□ Placas de Ágar Thermoacidurans (TAA)
□ Placas de Ágar Batata Dextrose (PDA) acidifi-
cado

□ Tubos de Caldo All Purpose Tween (APT), de baixa acidez (4,6). No caso dos meios que,
Caldo De Man Rogosa & Sharpe (MRS) ou normalmente, já têm o pH abaixo desse valor,
Caldo Soro de Laranja (OSB) (opcional) deve ser mantido o pH original.
□ Placas de Ágar All Purpose Tween (APT), c) Manutenção e pré-incubação das amostras
Ágar De Man Rogosa & Sharpe (MRS) ou antes da análise. Para as amostra de alimen-
Ágar Soro de Laranja (OSA) (opcional) tos recém-processados (com menos de 30
□ Placas de Ágar Dextrose Triptona (DTA) dias desde a fabricação segundo MFHPB-01,
□ Placas de Ágar Batata Dextrose (PDA) acidifi- 2001), pré-incubar a 25-30 ºC por dez dias, an-
cado tes da análise. Para amostras destinadas à esto-
□ Tubos de Caldo ALI (opcional) cagem em temperatura superior a 40 ºC (“hot
□ Placas de Ágar K (opcional) vending”) incubar também a 55 ºC por cinco
□ Ágar Selo ou Vaspar (Vaselina:Parafina 1:1) a sete dias. Para as demais amostras, seguir as
□ Reagentes para coloração de Gram mesmas orientações do teste para alimentos de
□ Solução de álcool iodado baixa acidez.
□ Abridor de latas bacteriológico esterilizado d) Abertura asséptica das embalagens. Seguir
□ Tesouras, pinças, espátulas, estiletes esterilizados as mesmas orientações do teste para alimentos
de baixa acidez.
□ Estufa incubadora regulada a 35 ºC e) Inoculação. Homogeneizar o conteúdo da em-
balagem e, antes da inoculação, retirar 50g ou
50 ml da amostra e transferir para frascos es-
téreis com tampas rosqueáveis. Conservar essa
porção sob refrigeração, como contra-amostra.
O esquema de análise para o teste de esterilidade Inocular 1 a 2g do alimento nos meios líquidos
comercial ou causa da deterioração de alimentos abaixo e, após a inoculação, cobrir a superfície
ácidos encontra-se descrito na Figura 23.5. de dois tubos de TAB (CA) com Ágar Selo ou
a) Cuidados para evitar a contaminação aci- Vaspar.
dental da amostra no laboratório. Seguir as Nas placas de Ágar Thermoacidurans (TAA)
mesmas orientações do teste para alimentos de e Ágar Batata Dextrose acidificado (PDA) es-
baixa acidez. triar diretamente uma alçada do alimento como
b) Preparação dos meios de cultura. O Com- controle.
pendium da APHA (Elliott & Kataoka, 2015) Caldo Thermoacidurans (TAB),
6 tubos
também chamado de Caldo Ácido (CA)
recomenda que todos os meios usados no teste
Agar Batata Dextrose acidificado (PDA) 2 placas
de esterilidade comercial de alimentos ácido
Caldo All Purpose Tween (APT), De Man Rogosa
sejam ácidos, porque apenas microrganismos & Sharpe (MRS) ou Soro de Laranja (OSB) 2 tubos
capazes de crescer em condições ácidas são (opcionais, se houver suspeita de bactérias lácticas)
relevantes nesses produtos. O Compendium Caldo ALI
2 tubos
(opcional, se houver suspeita de Alicyclobacillus)
do Canada (MFHPB, 2001) é mais explicito,
Agar Thermoacidurans (TAA) 2 placas
recomendando que o pH dos meios seja ajus-
tado no valor de pH do produto. Na rotina dos f) Incubação. Incubar os tubos nas condições
laboratórios, em que os meios são preparados abaixo. Se o produto não se destinar à esto-
com antecedência, pode ser difícil aguardar a cagem em temperatura acima de 40 ºC, os tu-
chegada dos produtos, para então ajustar o pH bos incubados 55 ºC podem ser omitidos. Se o
dos meios. Nesse caso, uma alternativa viável, produto apresentar atividade de água inferior
é preparar os meios com o pH ajustado no li- a 0,85, apenas a inoculação em PDA é neces-
mite que separa alimentos ácidos de alimentos sária, os demais meios podendo ser omitidos.

Figura 23.5. Esquema de análise para o teste de esterilidade comercial e causa da deterioração de alimentos ácidos pelo
método APHA:2015 (Elliott & Kataoka, 2015, Parkinson & Francis, 2015).

Nº de tubos Temperatura/
Meio Atmosfera Microbiota alvo
ou placas tempo de incubação
TAB (CA) com ágar selo 2 tubos 30 ou 35 ºC / até 7 dias normal Bactérias acidúricas mesófilas aeróbias e anaeróbias
Bactérias acidúricas mesófilas aeróbias e anaeróbias
TAB (CA) sem ágar selo 2 tubos 30 ou 35 ºC / até 7 dias normal
facultativas
TAB (CA) sem ágar selo 2 tubos 55 ºC / até 7 dias normal Bactérias acidúricas termófilas aeróbias
PDA acidificado ou Ágar
2 tubos 25 ou 30 ºC / até 7 dias normal Bolores e leveduras
Sabouraud
Caldo APT, MRS ou OSB 2 tubos 30 ºC / até 7 dias normal Bactérias lácticas
Caldo ALI 2 tubos 43 ºC / até 7 dias normal Alicyclobacillus
TAA 1 placa 30 ou 35 ºC / 2 a 5 dias normal Bactérias acidúricas mesófilas aeróbias
TAA 1 placa 30 ou 35 ºC / 2 a 5 dias anaeróbia Bactérias acidúricas mesófilas anaeróbias
g) Caracterização dos microrganismos isolados anotar se há formação de esporos.

em TAB (CA) 30/35 ºC com ágar selo. h) Caracterização dos microrganismos isola-
Havendo crescimento nos tubos, submeter as dos em TAB (CA) 55 ºC sem ágar selo
culturas à caracterização. Em caso de dúvidas Havendo crescimento nos tubos, submeter as
sobre o desenvolvimento de microrganismos culturas à caracterização. Em caso de dúvidas
(crescimento duvidoso), continuar o ensaio sobre o desenvolvimento de microrganismos
normalmente e, não havendo crescimento nas (crescimento duvidoso), continuar o ensaio
subculturas, considerar que não houve cresci- normalmente e, não havendo crescimento nas
mento no tubo original. subculturas, considerar que não houve cresci-
Para verificar se a cultura é anaeróbia estrita mento no tubo original.
ou facultativa, inocular uma alçada de cada Para verificar se a cultura é termófila estri-
tubo em duas placas de Ágar Thermoacidu- ta ou facultativa, inocular uma alçada de cada
rans (TAA), por estrias de esgotamento. De tubo em duas placas de Ágar Thermoacidurans
cada par de placas, incubar uma sob condi- (TAA), por estrias de esgotamento. De cada par
ções anaeróbias e uma sob condições aeróbias, de placas, incubar uma a 30 ou 35 ºC por dois a
por dois a cinco dias, na mesma temperatura cinco dias e uma a 55 ºC por dois a cinco dias.
do tubo original. Crescimento exclusivo na Crescimento exclusivo na placa incubada a 55 ºC
placa anaeróbia indica cultura anaeróbia es- indica cultura termófila estrita. Crescimento nas
trita. Crescimento nas duas placas (aeróbia e duas placas indica cultura termófila facultativa
anaeróbia) indica cultura anaeróbia faculta- ou mistura de termófilas estritas e facultativas.
tiva ou mistura de anaeróbios facultativos e Para a caracterização da morfologia das célu-
anaeróbios estritos. Observar se há produção las, preparar um esfregaço ou uma montagem
de gás nos tubos e se há desenvolvimento de úmida da cultura obtida em cada placa, para
odor butírico nos tubos e placas. coloração de Gram ou observação microscópi-
Para a caracterização da morfologia das célu- ca a fresco (procedimentos descritos no Capí-
las, preparar um esfregaço ou uma montagem tulo 5). Selecionar para a caracterização uma
úmida da cultura obtida em cada placa, para colônia de cada tipo presente. Observar o(s)
coloração de Gram ou observação microscópi- tipo(s) morfológico(s) das células, que podem
ca a fresco (procedimentos descritos no Capí- ser bastonetes, cocos, cocobacilos, leveduras
tulo 5). Selecionar para a caracterização uma ou bolores.
colônia de cada tipo presente. Observar o(s) Para confirmar Bacillus coagulans, as culturas
tipo(s) morfológico(s) das células, que podem de bastonetes podem ser inoculadas em duas
ser bastonetes, cocos, cocobacilos, leveduras placas de Ágar Dextrose Triptona (DTA). In-
ou bolores. Havendo culturas de bastonetes, cubar uma placa a 30 ou 35 ºC/72h e uma placa

a 55 ºC/72h. A ocorrência de crescimento nas placa de Ágar APT, MRS ou OSA. Incubar as
duas placas, com viragem ácida do indicador placas a 30 ºC por dois a cinco dias, em atmos-
(halo amarelo em redor das colônias) é confir- fera microaerófila. Submeter pelo menos cinco
mativa da presença de B. coagulans. colônias ao teste de catalase e à coloração de
Gram, conforme procedimentos descritos no
i) Caracterização dos microrganismos isolados
Capítulo 5. Observação de bastonetes, cocos
em PDA acidificado
ou cocobacilos Gram positivos, catalase nega-
Havendo crescimento nas placas, submeter as
tivos, é confirmativa da presença de bactérias
culturas à caracterização.
lácticas.
Para verificar a presença de bolores termorre-
sistentes. Havendo colônias de bolores, sus- k) Caracterização dos microrganismos isola-
pender uma alçada de cada colônia em tubos dos em Caldo ALI
com 10 ml de solução salina estéril. Transfe- Havendo crescimento nos tubos, submeter as
rir os tubos para um banho com temperatura culturas à caracterização. Em caso de dúvidas
controlada entre 75 e 80 ºC e manter no banho sobre o desenvolvimento de microrganismos
por 30min, garantindo que a superfície do lí- (crescimento duvidoso), continuar o ensaio
quido permaneça abaixo da superfície da água normalmente e, não havendo crescimento nas
do banho. Distribuir os 10 ml em cinco placas subculturas, considerar que não houve cresci-
vazias (2 ml/placa) e adicionar a cada placa, mento no tubo original.
15-20 ml de Ágar Batata Dextrose (PDA) aci- Para verificar a formação de esporos e a mor-
dificado. Acondicionar as placas em uma bolsa fologia das células, inocular uma alçada de
plástica estéril, fechar bem a bolsa (para evitar cada tubo em uma placa de Ágar K, por estrias
o ressecamento do meio de cultura) e incubar a de esgotamento. Incubar as placas a 43 ºC por
30 ºC por até 30 dias. Examinar semanalmente dois a cinco dias e preparar um esfregaço ou
se há desenvolvimento de colônias de bolores. uma montagem úmida de cada tipo de colônia
Para a caracterização da morfologia das célu- presente nas placas, para coloração de Gram
las, preparar um esfregaço ou uma montagem ou observação microscópica a fresco (procedi-
úmida da cultura obtida em cada placa, para mentos descritos no Capítulo 5). Observar se
coloração de Gram ou observação microscópi- o(s) tipo(s) morfológico(s) das células corres-
ca a fresco (procedimentos descritos no Capí- pondem a bastonetes formadores de esporos.
tulo 5). Selecionar para a caracterização as co- Nesse caso, observar se há desenvolvimento
lônia presuntivas de leveduras. Observar o(s) de odor estranho no Caldo ALI ou Ágar K.
tipo(s) morfológico(s) das células, que podem Para verificar se a cultura é acidófila estrita,
ser leveduras ou bactérias (bastonetes, cocos, inocular uma alçada de cada tubo de Caldo
cocobacilos). ALI ou placa de Ágar K em uma placa de Ágar
j) Caracterização dos microrganismos isolados Dextrose Triptona (DTA). Incubar as placas de
em APT/MRS/OSB DTA a 43 ºC por dois a sete dias. As culturas de
Havendo crescimento nos tubos, submeter as Alicyclobacillus não devem crescer no DTA,
culturas à caracterização. Em caso de dúvidas cujo pH é 6,7. A ocorrência de crescimento é
sobre o desenvolvimento de microrganismos indicativa da presença de microrganismos aci-
(crescimento duvidoso), continuar o ensaio dúricos, mas não acidófilos estritos.
normalmente e, não havendo crescimento nas l) Crescimento de microrganismos nas placas
subculturas, considerar que não houve cresci- de TAA
mento no tubo original. A inoculação nas placas de TAA é recomenda-
Para confirmar a presença de bactérias lácti- da como controle da inoculação dos caldos nos
cas, inocular uma alçada de cada tubo em uma tubos. O crescimento de microrganismos nas

placas irá confirmar que qualquer crescimento cimento é esperada. Interpretar os resultados
nos respectivos tubos de TAB (CA) deve-se à conforme orientação do Quadro 23.3 e itens a
contaminação do produto e não à contamina- seguir:
ção laboratorial.
c) Crescimento a 30-35 ºC em TAB (CA) com
ágar selo → TAA anaerobiose
23.3.3. Interpretação dos
A incubação anaeróbia do TAB ou TAA a
resultados 30-35 ºC objetiva verificar a presença de bacté-
A interpretação depende da ocorrência ou não de rias acidúricas esporogênicas mesófilas anaeró-
crescimento, em que meios e condições de incu- bias (clostrídios butíricos). Entretanto, diversos
bação ocorreu o crescimento e se a amostra apre- outros microrganismos deteriorantes de alimen-
sentou ou não evidência de alteração. tos ácidos também podem crescer nos tubos de
TAB com ágar selo. Se na inoculação inicial fo-
a) Ausência de crescimento
rem utilizadas somente placas de TAA, em vez
Em amostras normais, sem evidência de alte- de tubos de TAB, devem ser inoculadas quatro
ração, a ausência de crescimento em qualquer placas, sendo duas para incubação em condi-
dos tubos inoculados indica produto comer- ções de anaerobiose e duas em aerobiose.
cialmente estéril.
c.1) Microbiota mista. O crescimento de mi-
Em amostras alteradas, a ausência de cresci- crobiota mista com diferentes tipos morfo-
mento em qualquer dos tubos inoculados pode lógicos (bastonetes, cocos, cocobacilos, le-
indicar causas não microbianas da alteração ou veduras, bolores) revela a presença de um
perda da viabilidade da cultura depois do cres- ou mais grupos microbianos que não são
cimento e alteração do produto. Isso é comum, formadores de esporos e não resistem ao
por exemplo, com bactérias lácticas. processamento térmico de produtos ácido.
b) Crescimento. Em amostras aparentemente Isso indica produto não comercialmente es-
normais, sem evidência de alteração, a ocor- téril, causa provável vazamento. Verificar a
rência de crescimento em um ou mais tubos presença de pontos de vazamento na emba-
pode indicar contaminação acidental. São sus- lagem, para confirmação do diagnóstico.
peitas de contaminação acidental as seguintes c.2) Cultura não esporogênica. O crescimento
situações: a) Crescimento em apenas um tubo de apenas um tipo morfológico de microrga-
da duplicata. b) Microbiota com caracterís- nismo que não forma esporos (só bolores, só
ticas diferentes em cada tubo da duplicata. leveduras, só cocos ou só cocobacilos), re-
c) Crescimento anaeróbio com produção de gás vela a presença de microbiota não resistente
a 30-35 ºC, quando a amostra não apresentou ao processamento térmico de produtos áci-
qualquer problema de estufamento ou perda dos. Isso indica produto não comercialmente
de vácuo na pré-incubação. d) Fazendo uma estéril, causa provável vazamento. Verificar
observação microscópica direta da amostra, a presença de pontos de vazamento na em-
encontrar tipos morfológicos diferentes dos en- balagem, para confirmação do diagnóstico.
contrados nas culturas. Nesses casos, repetir o c.3) Cultura só de bastonetes. A interpretação
ensaio com a contra-prova armazenada, obser- depende da produção de esporos e do re-
vando criteriosamente os cuidados para evitar a querimento de oxigênio para crescimento
contaminação acidental da amostra no labora- (observados nas placas de TAA incubadas
tório. Não havendo indicação de contaminação a 30-35 ºC em condições aeróbias e anae-
acidental, interpretar os resultados conforme róbias).
orientação do Quadro 23.3 e itens a seguir: c.3.1. Crescimento exclusivamente anaeróbio
Em amostras alteradas, a ocorrência de cres- com formação de esporos. O crescimento de

bastonetes Gram positivos esporogênicos ração por resfriamento lento e/ou estocagem
em condições exclusivamente anaeróbias, em temperaturas elevadas.
com produção de gás (em TAB) e desen- e) Crescimento em PDA
volvimento de odor butírico (em TAB ou
A inoculação do PDA objetiva detectar a pre-
TAA em anaerobiose) confirma a presença
sença de bolores e leveduras, particularmen-
de bactérias acidúricas esporogênicas mesó-
te bolores termorresistentes. O crescimento
filas anaeróbias (clostrídios butíricos). Isso
de bolores termorresistentes indica produto
indica produto não comercialmente estéril,
não comercialmente estéril, causas provável
causa provável subprocessamento.
subprocessamento. O crescimento de bolores
c.3.2) Crescimento aeróbio e anaeróbio. Re-
não termorresistentes ou leveduras indica pro-
vela a presença de anaeróbios facultativos
duto não comercialmente estéril, causa prová-
ou mistura de anaeróbios estritos e facul-
vel vazamento. Verificar a presença de pontos
tativos. Se houver esporos, indica produto
de vazamento na embalagem, para confirma-
não comercialmente estéril, causa provável
ção do diagnóstico.
subprocessamento. Se não houver esporos,
indica vazamento (verificar a presença de f) Crescimento em Caldo APT, MRS, OSB →
pontos de vazamento na embalagem, para Ágar APT, MRS ou OSA
confirmação do diagnóstico). A inoculação do APT, MRS ou OSB objetiva
d) Crescimento em TAB (CA) → TAA a 55 ºC verificar a presença de bactérias lácticas, con-
firmadas pela observação de bastonetes, cocos
A incubação do TAB ou TAA a 55 ºC objeti-
ou cocobacilos Gram positivos, catalase nega-
va verificar a presença de bactérias acidúricas
tivos, não esporogênicos. Isso indica produto
esporogênicas termófilas, particularmente B.
não comercialmente estéril, causas prováveis
coagulans. A ocorrência de crescimento nas
vazamento ou subprocessamento grosseiro. Ve-
placas de DTA a 30-35 e 55 ºC, com viragem
rificar a presença de pontos de vazamento na
ácida do indicador (halo amarelo em redor das
embalagem, para confirmação do diagnóstico.
colônias) confirma a presença de B. coagulans,
indicando produto não comercialmente estéril, g) Crescimento em Caldo ALI → Ágar K
causa provável subprocessamento. Alicycloba- A inoculação do Caldo ALI ou Ágar K objetiva
cillus também pode se desenvolver no TAB verificar a presença de Alicyclobacillus, con-
ou no TAA, mas geralmente não se desenvolve firmada pela observação de bastonetes Gram
no DTA. Crescimento exclusivo de termófilos positivos esporogênicos acidófilos estritos,
estritos em produtos sem evidência de alte- normalmente incapazes de crescer em placas
ração e que não se destinam à estocagem em de DTA ou em outros meios de cultura com pH
temperaturas elevadas, ainda indica esterilida- neutro. Isso pode ser considerado indicativo de
de comercial. Se o produto estiver alterado, a produto não comercialmente estéril, causa pro-
presença desse grupo indica provável deterio- vável subprocessamento térmico.

Quadro 23.3. Interpretação dos resultados da determinação da causa da deterioração em alimentos áci-
dos ou acidificados (Parkinson & Francis, 2015).
Condição Aparência do Gás pH do

Odor Exame microscópico Cultura Diagnóstico
da lata produto (CO2 & H2) produto
Estufada,
usualmente Negativo ou
Normal a Normal ou H2 Corrosão, estufamento
com Normal microrganismo Negativa
metálico espumosa (> 20%) por hidrogênio
corrosão escassos
interna
Contaminaçâo
Espumosa Abaixo Cultura pura ou Crescimento aeróbio pós-processamento
Ácido
Estufada ou salmoura CO2 do mista de bastonete, e/ou anaeróbio a 30 ºC e, (vazamento) ou
(azedo)
viscosa normal cocos ou leveduras possivelmente, a 55 ºC subprocessamento
grosseiro
Bastonetes médio
Estufada Normal
Normal curtos ou médio Gás em condições Resfriamento inade-
(alimentos ou ligei-
ou ácido longos, usualmente anaeróbios a 55 ºC e, quado ou estocagem
com pH Espumosa H2 e CO2 ramente
normal entre
“de com aspecto possivelmente, a 30 ºC à temperatura elevada
abaixo do
4,0-4,6) queijo” granular, esporos (produção lenta) (termófilos anaeróbios)
normal
raramente presentes
Estufada
(alimentos Espumosa Abaixo Bastonetes, Gás em condições
Ácido Subprocessamento
com pH com H2 e CO2 do coloração bipolar, anaeróbicas a 30 ºC.
normal entre
butírico (anaeróbios butíricos)
bastante gás normal prováveis esporos Odor ácido butírico
4,0-4,6)
Gás em condições
anaeróbios, produção de
Abaixo ácido e possível produ- Subprocessamento
Bastonetes curtos e
Estufada Ácido Espumosa CO2 do ção de gás (aeróbia) em grosseiro
longos.
normal tubos com caldo a 30 ºC. (Lactobacillus)
Possível crescimento a
55 ºC
Vácuo insuficiente
Normal causado por exaustão
Sem vácuo ou ligei- Ausência ou insuficiente ou branquea-
e/ou Normal Normal Sem H2 ramente número moderado Negativo mento insuficiente ou
deformada abaixo do de microrganismos resfriamento inadequado
normal ou sobre-enchimento ou
deterioração insipiente.
Crescimento sem gás a

Pouco ou Subprocessamento
Normal, Bastonetes, 55 ºC e, possivelmente, a
Ácido ou bastante (B. coagulans),
com ou sem Normal Sem H2 usualmente com 30-35 ºC.
medicinal abaixo do geralmente em suco de
vácuo aspecto granular Crescimento em caldo
normal tomate
ácido (pH = 5,0)
Crescimento sem gás

a 43-55 ºC e, possi- Resfriamento inade-
Normal, Medicinal
velmente, a 30-35 ºC. quado ou estocagem
com ou sem ou Normal Sem H2 Normal Bastonetes
Crescimento em caldo à temperatura elevada
vácuo fenólico
ácido (pH = 5,0), Caldo (Alicyclobacillus spp.)
ALI e Agar K
Contaminaçâo
Pouco ou Crescimento em
Normal Normal ou Cultura pura ou pós-processamento
Normal bastante condição aeróbia
com ou sem salmoura Sem H2 mista de bastonetes, (vazamento) ou
ou ácido abaixo do e/ou anaeróbia a 30 ºC
vácuo turva cocos ou bolores subprocessamento
normal e, possivelmente, a 55 ºC
grosseiro.

23.4. Referências
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24 Pseudomonas spp
Item 24.3 (novo) Incluído método de filtração em membrana ISO 16266:2006 para contagem de Pseudomonas
aeruginosa em água.
Item 24.4 (revisado) Substituída a versão de 1995 da ISO 13720 pela versão de 2010, com as seguintes alterações:
Item 24.4.2.a Alterado meio de plaqueamento e condição de incubação.
Item 24.4.2.b Alterado procedimento de confirmação.
Item 24.4.2.c Alterado cálculo dos resultados segundo a ISO 7218:2007/Amd 1:2013
24.1. Introdução para o novo gênero Burkholderia. Posteriormente

P. pickettii e P. solonacearum foram realocadas no
As informações abaixo são da 1ª e 2ª edições novo gênero Ralstonia.
do Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology
Grupo III. As espécies do grupo III foram subdi-
(Krieg & Holt, 1984, Garrity et al., 2005) e de
vididas em cinco gêneros: P. delafieldi e P. facilis
Euzéby (2016).
foram transferidas para o novo gênero Acidovo-
Pseudomonas são bactérias cuja principal caracte-
rax. P. flava, P. pseudoflava e P. palleronii foram
rística é a extrema versatilidade metabólica e nu-
transferidas para o novo gênero Hydrogenophaga.
tricional, que permite a utilização de uma enorme
P saccharofila foi transferida para o novo gênero
variedade de compostos orgânicos como fonte de
Pelomonas. P. testosteroni e P. acidovorans foram
carbono e energia. Em função dessa versatilidade,
transferidas para o novo gênero Comamonas, mas
ocupam nichos ecológicos muito diversos, sendo
posteriormente P. acidovorans foi realocada no
amplamente distribuídas na natureza, na água e
novo gênero Delftia.
nos alimentos.
Esse gênero tem passado por grandes mudanças Grupo IV. As espécies do grupo IV (P. diminuta
taxonômicas, que começaram já na 1ª edição e P. vesiculares) foram transferidas para o novo
do Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology gênero Brevundimonas.
(Krieg & Holt, 1984). Nessa edição as espécies Grupo V. A única espécie do grupo V (P. mal-
foram divididas em cinco grupos, com base na si- tophilia) foi inicialmente transferida para o gêne-
milaridade do rRNA. Esses cinco grupos serviram ro Xanthomonas, mas posteriormente foi realoca-
de base para os estudos posteriores, que levaram à da no novo gênero Stenotrophomonas.
criação de vários novos gêneros, apresentados no Outras espécies. Além das espécies dos cinco gru-
Quadro 24.1. pos, muitas outras espécies estavam descritas na
Grupo I. No grupo I se encontrava o maior núme- 1ª edição do Bergey’s Manual of Systematic Bac-
ro de espécies e, em função disso, para esse grupo teriology, mas com afiliação e/ou nomenclatura
foi mantido o nome genérico de Pseudomonas. incerta. Muitas dessas espécies também foram
Grupo II. As espécies do grupo II (P. cepacia, P. transferidas para novos gêneros ou para outros
mallei, P. pseudomallei, P. caryophylli, P. gladioli, gêneros já existentes (Quadro 24.1).
P. pickettii e P. solonacearum) foram transferidas Dentre as espécies realocadas em novos gêneros,

Quadro 24.1. Alterações na nomenclatura das espécies de Pseudomonas. (continua)

Espécie* Alterações**
P. acidovorans Delftia acidovorans (den Dooren de Jong 1926) Wen et al. 1999, comb. nov
P. aminovorans Aminobacter aminovorans (den Dooren de Jong 1926) Urakami et al. 1992, comb. nov.
P. andropogonis Burkholderia andropogonis (Smith 1911) Gillis et al. 1995, comb. nov.
P. antimicrobica Burkholderia gladioli (Severini 1913) Yabuuchi et al. 1993, comb. nov.
P. avenae Acidovorax avenae (Manns 1909) Willems et al. 1992, comb. nov.
P. beijerinckii Chromohalobacter beijerinckii (Hof 1935) Peçonek et al. 2006, comb. nov.
“P. carboxydovorans” Oligotropha carboxidovorans (ex Meyer & Schlegel 1978) Meyer et al. 1994, nom. rev., comb. nov.
P. caryophylli Burkholderia caryophylli (Burkholder 1942) Yabuuchi et al. 1993, comb. nov.
P. cattleyae Acidovorax cattleyae (Pavarino 1911) Schaad et al. 2009, comb. nov.
P. cepacia Burkholderia cepacia (Palleroni & Holmes 1981) Yabuuchi et al. 1993, comb. nov.
P. cocovenenans Burkholderia gladioli (Severini 1913) Yabuuchi et al. 1993
“P. compransoris” Zavarzinia compransoris (ex Nozhevnikova & Zavarzin 1974) Meyer et al. 1994, nom. rev., comb. nov.
P. delafieldii Acidovorax delafieldii (Davis 1970) Willems et al. 1990, comb. nov.
P. diminuta Brevundimonas diminuta (Leifson & Hugh 1954) Segers et al. 1994, comb. nov.
P. doudoroffii Oceanimonas doudoroffii corrig. (Baumann et al. 1972) Brown et al. 2001, comb. nov.
P. echinoides Sphingomonas echinoides (Heumann 1962) Denner et al. 1999, comb. nov.
P. elongata Microbulbifer elongatus (Humm 1946) Yoon et al. 2003, comb. nov.
“P. extorquens” Methylobacterium extorquens (Urakami & Komagata 1984) Bousfield & Green 1985 emend. Kato et al. 2008
P. facilis Acidovorax facilis (Schatz & Bovell 1952) Willems et al. 1990, comb. nov.
P. flava Hydrogenophaga flava (Niklewski 1910) Willems et al. 1989, comb. nov.
P. gladioli Burkholderia gladioli (Severini 1913) Yabuuchi et al. 1993, comb. nov.
P. glathei Burkholderia glathei (Zolg & Ottow 1975) Vandamme et al. 1997, comb. nov.
P. glumae Burkholderia glumae (Kurita & Tabei 1967) Urakami et al. 1994, comb. nov.
P. huttiensis Herbaspirillum huttiense (Leifson 1962) Ding & Yokota 2004, comb. nov.
P. indigofera Vogesella indigofera (Voges 1893) Grimes et al. 1997, comb. nov.
P. iners Marinobacterium georgiense González et al. 1997 emend. Satomi et al. 2002.
P. lanceolata Curvibacter lanceolatus (Leifson 1962) Ding and Yokota 2004, comb. nov.
P. lemoignei Paucimonas lemoignei (Delafield et al. 1965) Jendrossek 2001, comb. nov.
P. luteola Chryseomonas luteola (Kodama et al. 1985) Holmes et al. 1987, comb. nov.
P. mallei Burkholderia mallei (Zopf 1885) Yabuuchi et al. 1993, comb. nov.
P. maltophilia Stenotrophomonas maltophilia (Hugh 1981) Palleroni & Bradbury 1993, comb. nov.
P. marina Cobetia marina (Cobet et al. 1970) Arahal et al. 2002, comb. nov.
P. mephitica Janthinobacterium lividum (Eisenberg 1891) De Ley et al. 1978 (Approved Lists 1980)
P.mesophilica Methylobacterium mesophilicum (Austin & Goodfellow 1979) Green & Bousfield 1983, comb. nov.
P. mixta Telluria mixta (Bowman et al. 1989) Bowman et al. 1993, comb. nov.
P. nautica Marinobacter hydrocarbonoclasticus Gauthier et al. 1992.
P. palleronii Hydrogenophaga palleronii (Davis 1970) Willems et al. 1989, comb. nov.
P. paucimobilis Sphingomonas paucimobilis (Holmes et al. 1977) Yabuuchi et al. 1990, comb. nov.
P. phenazinium Burkholderia phenazinium (Bell & Turner 1973) Viallard et al. 1998, comb. nov.
P. pickettii Ralstonia pickettii (Ralston et al. 1973) Yabuuchi et al. 1996, comb. nov.
P. plantarii Burkholderia plantarii (Azegami et al. 1987) Urakami et al. 1994, comb. nov.
P. pseudoflava Hydrogenophaga pseudoflava (Auling et al. 1978) Willems et al. 1989, comb. nov.
P. pseudomallei Burkholderia pseudomallei (Whitmore 1913) Yabuuchi et al. 1993, comb. nov.
P. putrefasciens Shewanella putrefaciens (Lee et al. 1981) MacDonell & Colwell 1986, comb. nov.
P. pyrrocinia Burkholderia pyrrocinia (Imanaka et al. 1965) Vandamme et al. 1997, comb. nov.
P. radiora Methylobacterium radiotolerans corrig. (Ito & Iizuka 1971) Green & Bousfield 1983, comb. nov.
* Os nomes entre aspas não eram oficiais.

Fontes: Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Ed. (Garrity et al., 2005), Euzéby (2016).

Pseudomonas spp □ 429
Quadro 24.1. Alterações na nomenclatura das espécies de Pseudomonas. (continuação)

Espécie* Alterações**
P. rhodos Methylobacterium rhodinum corrig. (Heumann 1962) Green & Bousfield 1983, comb. nov.
P. riboflavina Devosia riboflavina (ex Foster 1944) Nakagawa et al. 1996, nom. rev., comb. nov.
Methylobacterium zatmanii Green et al. 1988 (algumas cepas)
“P. rosea”
Methylobacterium rhodesianum Green et al. 1988, sp. nov. (algumas cepas)
P. rubrilineans Acidovorax avenae (Manns 1909) Willems et al. 1992, comb. nov.
P. rubrisubalbicans Herbaspirillum rubrisubalbicans (Christopher & Edgerton 1930) Baldani et al. 1996, comb. nov.
P. saccharophila Pelomonas saccharophila (Doudoroff 1940) Xie & Yokota 2005, comb. nov.
P. solanacearum Ralstonia solanacearum (Smith 1896) Yabuuchi et al. 1996, comb. nov.
P. spinosa Malikia spinosa (Leifson 1962) Spring et al. 2005, comb. nov.
P. stanieri Marinobacterium stanieri (Baumann et al. 1983) Satomi et al. 2002, comb. nov.
P. syzygii Ralstonia syzygii (Roberts et al. 1990) Vaneechoutte et al. 2004, comb. nov.
P. taeniospiralis Hydrogenophaga taeniospiralis (Lalucat et al. 1982) Willems et al. 1989, comb. nov.
P. testosteroni Comamonas testosteroni (Marcus & Talalay 1956) Tamaoka et al. 1987, comb. nov.
P. vesicularis Brevundimonas vesicularis (Büsing et al. 1953) Segers et al. 1994, comb. nov.
P. woodsii Burkholderia andropogonis (Smith 1911) Gillis et al. 1995.
* Os nomes entre aspas não eram oficiais.
Fontes: Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Ed. (Garrity et al., 2005), Euzéby (2016).
algumas são comuns em alimentos, incluindo ou negativas. Várias espécies formam pigmentos
Shewanella putrefaciens, Janthinobacterium livi- fluorescentes (fenazinas verdes, azuis ou laranja
dum e Stenotrophomonas maltophilia. ou pioverdinas verde amareladas), não fluorescen-
tes (verdes, laranja, amarelos ou azuis) ou ambos.
Várias espécies de Pseudomonas são patógenos
Pseudomonas Migula 1894 de plantas e várias são patógenos oportunistas
As espécies de Pseudomonas são bastonetes retos para humanos, associadas com infecções em indi-
ou ligeiramente curvos, Gram negativos, móveis víduos com o sistema imunológico debilitado. No
em sua maioria, apresentando um ou mais flagelos homem a espécie mais importante é Pseudomo-
polares, algumas espécies podendo também for- nas aeruginosa, mas Pseudomonas alcaligenes,
mar flagelos laterais. Não formam esporos. Qui- Pseudomonas balearica, Pseudomonas chloro-
miorganotróficas, não exigem fatores nutricionais raphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
de crescimento, podendo crescer em meios míni- mendocina, Pseudomonas monteilii, Pseudomo-
mos quimicamente definidos, usando um único nas mosselii, Pseudomonas putida, Pseudomonas
composto como fonte de carbono e amônia ou ni- stutzeri e Pseudomonas pseudoalcaligenes tam-
trato como fonte de nitrogênio. O metabolismo é bém são isoladas de espécimes clínicos. Depois
estritamente respiratório, usando oxigênio como de P. aeruginosa, as espécies mais freqüentes são
aceptor final de elétrons e exigindo condições ae- P. fluorescens, P. putida e P. stutzeri, embora essas
róbias. Algumas espécies, entretanto, podem usar espécies apresentem um grau de virulência menor
o nitrato como aceptor de elétrons, o que permite e um poder invasivo mais limitado.
o crescimento em condições anaeróbias (reduzem Pseudomonas podem ser encontradas na água
o nitrato a nitrito ou nitrogênio, fenômeno cha- (doce, salobra ou do mar), no solo, na poeira em
mado de denitrificação). A temperatura ótima da suspensão, no ar e nos vegetais. Muitas cepas são
maioria das espécies é por volta de 28 ºC, algumas psicrotróficas e podem alterar gêneros alimentí-
espécies crescem a 45 ºC e várias crescem bem a cios, reagentes biológicos, solutos injetáveis, san-
4 ºC (psicrotróficas). Não toleram condições áci- gue e derivados sanguíneos conservados sob refri-
das e nenhuma espécie cresce em pH menor ou geração. Também em função da riqueza das suas
igual a 4,5. Catalase positivas, oxidase positivas vias metabólicas, frequentemente conseguem

resistir a numerosos antissépticos e antibióticos. Depois de engarrafada, a multiplicação dessa mi-

Isso explica sua presença cada vez mais freqüente crobiota na água é normal, caracterizada por uma
no ambiente hospitalar, sendo isoladas de locais alternância entre aumento e redução na contagem.
úmidos como pias, sifões, roupas e objetos de la- Imediatamente após o envase a população au-
vabo, recipientes que contêm água etc. Raramente menta, utilizando a matéria orgânica da superfície
são encontradas na pele ou nos músculos de hu- das embalagens e o oxigênio dissolvido durante
manos e animais, mas são comuns na flora intesti- a operação de envase. Doze horas após o envase
nal (Euzéby, 2006). a contagem geralmente atinge valores dez vezes
Pseudomonas em água tratada para consumo maiores do que o normal no ponto de emergência,
humano. Pseudomonas são extremamente co- mas pode chegar a 104-105 UFC/ml (em placas in-
muns em água bruta e também são encontradas em cubadas a 20-22 ºC/72h). As contagens mais altas
água tratada. O tratamento da água bruta objetiva são mais comuns na água engarrafada em emba-
a destruição de patógenos, sendo normal e aceitá- lagens plásticas, provavelmente porque o plástico
vel a presença de microrganismos viáveis depois é uma superfície mais favorável ao crescimento
do tratamento, em contagens de até 500 UFC/ml microbiano (ICMSF, 2000). Depois disso a po-
(Portaria 2914/2011). Contagens mais elevadas pulação declina, devido ao esgotamento dos nu-
no ponto de consumo refletem crescimento ou trientes, mas volta a crescer, utilizando a matéria
recontaminação no sistema de distribuição, isto orgânica das células mortas e assim por diante.
é, nos reservatórios e tubulações. O crescimento Várias espécies de Pseudomonas têm sido isoladas
pode ocorrer devido à sobrevivência e recupera- de água mineral, incluindo P. mandelii, P. migulae,
ção de células injuriadas de microrganismos na- P. rhodesiae e P. veronii, mas a principal preocu-
tivos, incluindo Pseudomonas, Flavobacterium, pação é a presença de P. aeruginosa, por ser a mais
Arthrobacter e Aeromonas (ICMSF, 2000). comum como patógeno oportunista para humanos.
Pseudomonas em água mineral e água natural. Pseudomonas em alimentos. A ocorrência de
Água mineral é definida como a água obtida di- Pseudomonas em alimentos é extremamente co-
retamente de fontes naturais ou por extração de mum, associadas com a deterioração de carne e
fontes subterrâneas. Caracteriza-se pelo conteúdo derivados, leite e derivados, peixes e frutos do
definido e constante de determinados sais mine- mar, ovos e vegetais.
rais, oligoelementos e outros constituintes, consi- Em carne de aves cruas, mantida em temperatura
derando-se as flutuações naturais. A água natural de 2 ºC negativos a 5 ºC, as pseudomonas são os
também é obtida diretamente de fontes naturais principais deteriorantes, porque têm o menor tem-
ou por extração de fontes subterrâneas, mas com po de geração nessas baixas temperaturas. Den-
conteúdo de sais minerais, oligoelementos e ou- tre as espécies presentes encontram-se P. fragi,
tros constituintes em níveis inferiores aos míni- P. fluorescens e P. putida (ICMSF, 2000).
mos estabelecidos para água mineral (Resolução Em carne bovina não processada e mantida sob
RDC 274, 2005). refrigeração, as pseudomonas representam mais
No ponto de emergência a água mineral e a água de 50% da microbiota deteriorante, sendo P. fragi,
natural apresentam uma microbiota normal entre P. lundensis e P. fluorescens as espécies mais fre-
10 e 100 UFC/ml, composta primordialmente de qüentes . No início da deterioração as pseudomo-
Pseudomonas, Flavobacterium, Moraxella, Aci- nas provocam um odor adocicado de fruta, devido
netobacter e Xanthomonas. Essa microbiota natu- à formação de ésteres etílicos. Nos estágios mais
ral geralmente é aeróbia, apresenta requerimento avançados, a produção de compostos sulfurosos
de nitrogênio muito baixo e é capaz de crescer em causam odor pútrido (ICMSF, 2000). Em carne
baixas temperaturas, com pequenas quantidades cozida não curada, embalada em atmosfera nor-
de compostos de carbono (ICMSF, 2000). mal e refrigerada, as bactérias Gram negativas, in-

cluindo Pseudomonas, também são os principais S. gelidimarina, que fermenta N-acetilglicosami-

deteriorantes (ICMSF, 2000). na. A maioria das espécies cresce a 4 ºC e forma
Em leite pasteurizado mantido sob refrigeração, H2S a partir do tiossulfato. Várias espécies exigem
as pseudomonas fazem parte da microbiota dete- NaCl para crescimento. Duas espécies estão entre
riorante, porque embora não sobrevivam à pas- os principais deteriorantes de alimentos, S. putre-
teurização, são recontaminantes normais no pós faciens e S. baltica, encontradas em produtos lác-
processamento. Também não sobrevivem no leite teos, produtos cárneos, pescados e frutos do mar.
esterilizado, mas suas enzimas lipolíticas e pro-
Shewanella putrefaciens (sinônimo Pseudo-
teolíticas podem permanecer e causar alterações.
monas putrefaciens) foi primeiramente descrita
No creme de leite termoprocessado, a recontami-
em 1931, como Achromobacter putrefaciens. Em
nação pós processo por pseudomonas tem forte
1941 foi transferida para o gênero Pseudomonas,
impacto na qualidade (ICMSF, 2000). As espécies
em função da morfologia de bastonete, motilida-
mais comuns são P. fragi, P. fluorescens e P. tae-
de e metabolismo estritamente respiratório, não
trolens, além de P. synxantha em creme de leite,
fermentativo. Com base no valor do mol% G+C,
onde produz um pigmento amarelo forte a laranja,
menor do que o das pseudomonas, em 1971 foi
(Krieg & Holt, 1984, Garrity et al., 2005).
transferida para o gênero Alteromonas. Finalmen-
Em ovos crus inteiros, as pseudomonas são a prin- te, com base na seqüência do rRNA 5S, em 1986
cipal causa de deterioração, porque geralmente foi transferida para o novo gênero Shewanella. A
são os primeiros microrganismos a penetrar a cas- nomenclatura dessa espécie, continua em evolu-
ca e são resistentes aos agentes antimicrobianos ção, porque é composta de uma variedade de cepas
naturais da clara. Dentre as espécies encontradas heterogêneas, que inclui pelo menos quatro grupos
estão P. putida (provoca fluorescência na clara), de hibridização de DNA. As cepas dos grupos IV
P. fluorescens (provoca coloração rosa na clara), foram transferidas para a nova espécie S. algae (em
P. mucidolens e P. taetrolens (ICMSF, 2000, Krieg 1990) e as cepas do grupo II para a nova espécie
& Holt, 1984, Garrity et al., 2005). S. baltica (em 1998). As cepas do grupo I são consi-
deradas S. putrefaciens “senso stricto” e as do gru-
Shewanella po III ainda não têm uma nova posição taxonômica
MacDonell & Colwell 1986 definida. As principais características desses quatro
grupos encontram-se descritas no Quadro 24.2.
As espécies do gênero Shewanella são Gram ne-
gativas, na forma de bastonetes, móveis, oxidase Forma colônias opacas, circulares, convexas,
e catalase positivas. As colônias freqüentemen- com margens perfeitas, consistência de borracha
te são róseas alaranjadas, salmão ou levemente e coloração levemente bronzeadas, salmão ou ró-
bronzeadas, devido ao acúmulo de citocromo. seas em Ágar Nutriente. Não exige NaCl ou fa-
O metabolismo é respiratório, usando oxigênio tores de crescimento. Mesófila, cresce entre 10 e
como aceptor final de elétrons, mas podem crescer 40 ºC, com ótimo entre 30 e 35 ºC, mas há cepas
em condições anaeróbias, usando nitrato, nitrito, psicrotolerantes que crescem a 4 ºC. Ocasional-
Fe3+, Mn3+, fumarato e vários compostos sulfuro- mente implicada em bacteremia, septicemia, in-
sos como aceptores finais de elétrons (respiração fecções oculares, pneumonia, artrite e peritonite.
anaeróbia). Trimetilamina N-óxido (TMAO) tam- Shewanella putrefaciens é um deteriorante co-
bém pode ser usado como aceptor final de elétrons mum em carne de aves cruas, onde provoca odor
e a sua redução à trimetilamina é geralmente res- sulfídrico. Atinge principalmente carnes com pH
ponsável pelo odor associado à deterioração de acima de seis, como os cortes da coxa e sobreco-
alimentos por Shewanella. Três espécies também xa, que têm um pH mais alto do que a carne do
apresentam metabolismo fermentativo, S. frigi- peito (ICMSF, 2000).
dimarina e S. benthica, que fermentam glicose, e

Quadro 24.2. Características que diferenciam as cepas de S. putrefaciens “senso stricto”, S. algae, S.
baltica e S. putrefaciens Grupo III (Garrity et al., 2005).
S. putrefaciens “senso stricto” S. algae S. baltica S. putrefaciens
Característica
(Grupo I) (Grupo IV) (Grupo II) (Grupo III)
Crescimento a 4 ºC + - + d
Crescimento a 37 ºC + + - +
Crescimento a 42 ºC - - - d
Tolerância a 6% de NaCl - + - -
Redução do sulfito a H2S + d - -
Ácido a partir de glicose - d (fraco) + +
Ácido a partir de maltose e sacarose - - + +
Crescimento em Ágar Salmonella-Shigella (SS) + + - -
Teste de citrato (Christensen) - - + -
Urease - d d -
Símbolos: + = 90% ou mais cepas positivas, - = 90% ou mais cepas negativas, d = 11 a 89% das cepas positivas.
Em carne bovina crua embalada a vácuo, Shewa- pelo cangambá (Mephitis mephitis), um mamífero
nella putrefaciens é forte produtora de H2S e de- semelhante ao gambá (Didelphis marsupialis) e
teriora rapidamente os produtos com pH mais alto à jaritataca (Conepatus semistriatu). Anzai et al.
(ICMSF, 2000). (2000) relataram uma estreita relação filogenética
entre P. mephitica e Janthinobacterium lividum,
Janthinobacterium espécie descoberta em 1891 (como Bacillus livi-
De Ley et al. 1978 dus) e também já chamada de Chromobacterium
emend. Lincoln et al. 1999 lividum. A maioria das cepas de J. lividum produz
o pigmento violeta violeceína, mas há cepas que,
As espécies do gênero Janthinobacterium são
assim como P. mephitica, não são pigmentadas.
Gram negativas, na forma de bastonetes, móveis,
Em 2008, com base na comparação da seqüência
oxidase e catalase positivas. Quimiorganotróficas,
do rRNA 16S e inúmeras características fenotípi-
aeróbias estritas, apresentam metabolismo respi-
cas, P. mephitica foi reconhecida como sinônimo
ratório, usando oxigênio como aceptor final de
de J. lividum (Kämpfer et al., 2008).
elétrons. Crescem bem em meios comuns à base
de peptonas e podem usar citrato e amônia como A descrição original de Claydon & Hammer
únicas fontes carbono e energia, respectivamente. (1939) para P. mephitica destaca as seguintes
Produzem pouco ácido a partir de glicose e ou- características: morfologia de bastonetes, Gram
tros carboidratos, sem formação de gás. A faixa negativa, móvel, não esporogênica. Temperatura
de temperatura de crescimento é de 4 a 30 ºC, com ótima por volta de 21 ºC, cresce lentamente a 5 ºC
ótimo em 25 ºC. Não crescem a 37 ºC. O pH ótimo e a 30 ºC, não cresce a 37 ºC. Cresce em pH 5,0
é de 7,0 a 8,0 e não crescem abaixo de 5,0. Várias e em 7,5. Não produz ácido a partir de lactose e
cepas produzem o pigmento violeta violeceína e produz lentamente a partir de maltose e glicose,
outras não são pigmentadas ou são parcialmente com tendência à reversão. Não pigmentada.
pigmentadas (uma mesma cultura forma tanto co- As descrições da 2ª edição do Bergey`s Manual
lônias pigmentadas como não pigmentadas). of Systematic Bacteriology (Garrity et al., 2005) e
de Euzéby (2004) para J. lividum destacam as se-
Janthinobacterium lividum (sinônimo Pseudo- guintes características, além das que são comuns
monas mephitica). Pseudomonas mephitica foi o a todas as espécies do gênero: Estritamente aeró-
nome inicialmente proposto por Claydon & Ham- bio, não cresce em condições anaeróbias. Mais de
mer (1939) para uma nova espécie de bactéria 90% das cepas produz violeceína (as cepas ante-
isolada de manteiga deteriorada. A deterioração é riormente chamadas de P. mephitica não produ-
caracterizada por um odor fétido, como o exalado

zem). A maioria das cepas cresce a 4 ºC, nenhuma 41 ºC, com temperatura ótima por volta de 35 ºC.
cresce a 37 ºC. A maioria não cresce em 2% de Apresentam forte atividade lipolítica, caracteriza-
NaCl ou acima. A maioria cresce em pH 5,0 mas da pela hidrólise de Tween 80. Exigem fatores de
poucas crescem em pH 4,0. As colônias têm as- crescimento, principalmente metionina.
pecto gelatinoso ou de borracha e, em caldo, as Stenotrophomonas maltophilia (sinônimo Pseu-
cepas pigmentadas provocam a formação de um domonas maltophilia). S. maltophilia não é nu-
anel violeta na superfície. Em ágar a pigmentação tricionalmente tão versátil como as pseudomonas,
violeta das colônias geralmente é pouco intensa e fato que serviu de base para a denominação do
aparece lentamente. Cerca de 50% das cepas cres- novo gênero Stenotrophomonas (do grego, signi-
ce em ágar MacConkey. fica unidade que consegue utilizar poucos subs-
Janthinobacterium lividum é isolado do solo, da tratos). Caracteristicamente capaz de utilizar
água doce, do ambiente marinho e das águas re- dissacarídeos (maltose, lactose, celobiose) como
siduais. A contaminação de gêneros alimentícios únicas fontes de carbono e energia, o que também
por cepas pigmentadas pode provocar a formação é raro entre as pseudomonas. O crescimento em
de manchas azuis. Assim como as pseudomonas, lactose é mais pobre, provavelmente porque não
é um dos principais deteriorantes de carne de aves utiliza a galactose. Produz ácido a partir de mal-
cruas mantidas sob refrigeração (ICMSF, 2000). tose, mas não a partir de glicose. As colônias são
Em carne bovina crua, pode provocar a produção amareladas em vários meios de cultura, produzin-
de H2S, às vezes acompanhado de descoloração do pigmentos que não se difundem, provavelmen-
esverdeada (Tompkin et al., 2015). Em leite e prote flavinas. Várias cepas desenvolvem uma colo-
dutos lácteos provoca odor fétido (Euzéby, 2004). ração castanha em meios sólidos.
Patógeno oportunista, tem sido associada a vários
Stenotrophomonas tipos de infecções em humanos e isolada de cul-
Palleroni & Bradbury 1993 turas de tecidos, soluções de streptomicina, água
destilada, respiradores, nebulizadores e tubos de
Esse gênero foi criado para acomodar Pseudomo- coleta de sangue (Garrity et al., 2005). Comum na
nas maltophilia, espécie que havia sido transferi- risosfera de várias plantas cultivadas como cou-
da para o gênero Xanthomonas, mas sem a aceita- ves, uva, mostarda, milho e beterraba (Garrity et
ção de muitos taxonomistas. Durante vários anos al., 2005). Encontrada em água doce e em alimen-
S. maltophilia foi a única espécie do gênero, que tos como leite cru e pasteurizado, produtos lácte-
posteriormente recebeu duas novas espécies. São os, peixes congelados (Garrity et al., 2005) e ovos
bactérias Gram negativas, na forma de bastonetes, deteriorados, onde produz sulfeto férrico, forman-
não esporogênicas, móveis, catalase e gelatina- do riscos escuros na gema) (ICMSF, 2000).
se positivas. Não dispõem de citocromo c, apre-
sentando reação de oxidase negativa. Na descri-
Comentários sobre
ção original do novo gênero Stenotrophomonas,
os métodos de análise
entretanto, foram erradamente descritas como
oxidase positivas (Palleroni & Bradbury 1993). Na análise de alimentos a contagem é feita para o
Aeróbias, apresentam metabolismo estritamente gênero Pseudomonas como um todo, sem diferen-
respiratório, usando oxigênio como aceptor final ciação das espécies. A legislação brasileira não es-
de elétrons. Reduzem o nitrato mas, ao contrário tabelece padrão para esses microrganismos, cuja
das pseudomonas, não conseguem utilizá-lo como presença é importante do ponto de vista do con-
única fonte de nitrogênio para o crescimento. For- trole de deteriorantes. Dois métodos padroniza-
mam colônias amarelas, esverdeadas ou cinzas, dos estão disponíveis: o método ISO 13720:2010
que podem adquirir uma coloração castanha com para carnes e produtos cárneos e o método
o tempo de incubação. Não crescem a quatro ou a ISO 11059:2009 para leite e produtos lácteos. Os

dois métodos são de contagem padrão em pla- de 5 tubos para cada diluição. O teste presunti-
cas, usando meios seletivos e incubação a 25 ºC. vo é feito em Caldo Asparagina, meio seletivo
Todas as colônias são consideradas suspeitas e a no qual a asparagina é a única fonte de carbono
confirmação é feita verificando se há podução de e nitrogênio disponível para crescimento. O teste
citocromo oxidase. presuntivo é considerado positivo quando ocorre
Para o plaqueamento, a ISO 13720:2010 reco- crescimento (turvação do meio) e produção de um
menda o Ágar Cefalotina Fusidato Cetrimida pigmento esverdeado, fluorescente sob luz ultra-
(CFC), cuja base contém cloreto de magnésio e violeta (365nm, luz negra). Para a confirmação é
sulfato de potássio, para estimular a produção do utilizado o Ágar ou Caldo Acetamida, meio dife-
pigmento piocianina. Os agentes seletivos são a rencial para P. aeruginosa, no qual a acetamida é
cefalotina (antibiótico do grupo das cefalospori- a única fonte de carbono e nitrogênio. A utilização
nas) para inibir bactérias em geral, o fusidato (ou da acetamida resulta numa alcalinização do meio,
fucidina, da família dos antibióticos fusidanos), visualizada através da viragem do indicador ver-
para inibir Acinetobacter e Moraxella e a cetrimi- melho de fenol, de vermelho para “pink”.
da, para inibir leveduras. A ISO 11059:2009 reco-
menda o Ágar Penicilina Pimaricina (PPA), cuja
base, idêntica à do CFC, também contém cloreto 24.2. Método do NMP
de magnésio e sulfato de potássio, para estimular APHA/AWWA/WEF 9213:2012
a produção do pigmento piocianina. Os agentes para contagem de
seletivos são a penicilina, para inibir bactérias em
Pseudomonas aeruginosa
geral, e a pimaricina, também chamada natamici-
na, que é um antibiótico antifúngico. em água
São raros os trabalhos que relatam se as cepas Método da 22ª Edição do Standard Methods for
transferidas para os novos gêneros crescem nas the Examination of Water and Wastewater (Hunt,
condições dos métodos ISO 13720 e 11059. Se- 2012).
gundo Jeppesen & Jeppesen (2003), S. putrefa-
ciens é parcialmente inibida no Ágar CFC. Tryfi-
nopoulou et al. (2001), entretanto, relatam cresci-
mento dessa espécie em CFC.
microrganismos pelo NMP, da seleção das dilui-
Na análise de água, a legislação brasileira só es-
tabelece padrão para P. aeruginosa em água mi-
neral e água natural engarrafada (Resolução RDC
275/2005), não sendo comum a contagem de Pseu-
O procedimento para contagem de P. aerugino-
domonas sp em outros tipos de água de consumo
sa pelo método do NMP APHA/AWWA/WEF
humano. Para a contagem de P. aeruginosa, a téc-
9213:2012 encontra-se descrito na Figura 24.1.
nica mais simples é a dos tubos múltiplos, para
determinação do número mais provável (NMP).
Nas amostras em que se espera ausência ou bai- 24.2.1. Material requerido para a
xas contagens (menor do que 10/ml), recomenda- análise
-se distribuir 10 porções de 10 ml da amostra, em □ Pipetas de 10 ml para transferência dos volumes
10 tubos contendo 10 ml do caldo de cultura, em □ Tubos com 10 ml Caldo Asparagina em con-
concentração dupla, totalizando 100 ml de amos- centração dupla para inoculação de 10 ml da
tra, como é requerido pela legislação brasileira. amostra
Para amostras em que seja esperada uma concen- □ Tubos com Ágar ou Caldo Acetamida para
tração maior dos microrganismos, recomenda-se confirmação
trabalhar com diluições, inoculando-se uma série □ Estufa incubadora regulada a 35-37 ºC

Figura 24.1. Esquema de análise para contagem de P. aeruginosa pelo método do

NMP APHA/AWWA/WEF 9213:2012 (Hunt, 2012).

24.2.2. Procedimento dor, mudando a cor do meio de vermelho para

“pink”. Em caso negativo, reincubar os tubos e
a) Preparação da amostra. Homogeneizar a repetir a leitura com 36h.
amostra por agitação, invertendo o frasco 25
d) Cálculo dos resultados. Considerar como
vezes em ângulo de 45º.
P. aeruginosa todas as culturas com viragem
b) Teste presuntivo. Com uma pipeta de 10 ou 25 alcalina no Agar Acetamida. Determinar o Nú-
ml, adicionar 10 porções de 10 ml da amostra mero Mais Provável (NMP) de acordo com as
em 10 tubos contendo 10 ml de Caldo Aspara- orientações do capítulo 4.
gina, em concentração dupla. Incubar os tubos
a 35-37 ºC/24h e observar se há ocorrência de
crescimento e produção de um pigmento ver- 24.3. Método de filtração em
de fluorescente sob luz ultravioleta (365nm, membrana ISO 16266:2006
luz negra). Em caso positivo passar aos itens
subseqüentes. Em caso negativo, reincubar
para contagem de
até completar 48 horas e repetir a leitura, pas- Pseudomonas aeruginosa
sando para os itens subseqüentes em caso de em água
crescimento com produção do pigmento. A
não ocorrência de crescimento e/ou produção Método da International Organization for Stan-
de pigmento após 48 horas de incubação indi- dardization (ISO 16266:2006) para contagem
ca ausência de Pseudomonas aeruginosa nos de Pseudomonas aeruginosa em água.
100 ml da amostra.
Nota b.1) A inoculação de 10 porções de 10 ml da amos-
tra é o procedimento padrão para análise de amostras análise
de água destinada ao consumo humano, nas quais se
□ Água purificada (para diluição, se necessária)
espera ausência. No caso da análise de outros tipos de
água, nas quais a população possa atingir contagens
□ Sistema de filtração em membrana
superiores, recomenda-se trabalhar com diluições, □ Filtros membrana com poro de 0.45μm
inoculando-se uma série de cinco tubos para cada □ Ágar Pseudomonas CN
diluição. Nesse caso, as diluições devem ser prepa- □ Caldo Acetamida ISO 16266
radas utilizando-se como diluente a água de diluição
□ Meio de King B
(Tampão Fosfato com cloreto de magnésio) e a sele-
ção das diluições depende da contagem estimada na □ Ágar Nutriente (NA)
amostra. Por exemplo, para amostras com contagem □ Reagente de Kovacs para Teste de Oxidase
estimada na faixa de 3 a 1.000/ml, as diluições reco- □ Reagente de Nessler
mendadas são 10-1, 10-2 e 10-3. Havendo suspeita de
contagens acima dessa faixa, deve-se inocular dilui-
ções maiores e, nos casos em que não seja possível
□ Lâmpada ultra violeta (360±20nm)
fazer uma estimativa prévia da concentração, reco-
menda-se inocular um número maior de diluições, 24.3.2. Procedimento
cobrindo uma faixa mais ampla. Na preparação das
diluições e inoculação dos tubos, utilizar pipetas com O procedimento para contagem de Pseudomonas
capacidade de, no máximo, 10% dos volumes a se- aeruginosa em água pelo método de filtração em
rem transferidos.
membrana ISO 16266:2006 encontra-se descrito
c) Teste confirmativo. A partir de cada tubo posi- na Figura 24.2.
tivo de Caldo Asparagina, transferir 0,1 ml da Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
cultura para tubos com Caldo ou Ágar Aceta- orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os
mida inclinado e incubar os tubos a 35-37 ºC/ detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
24-36h. Observar com 24h se há ocorrência de microrganismos por filtração em membrana. O
crescimento com viragem alcalina do indica- procedimento descrito abaixo não apresenta esses

Figura 24.2. Esquema de análise para contagem de Pseudomonas aeruginosa em água pelo
método de filtração em membrana ISO 16266:2006.

detalhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo confirmadas pelo teste de acetamida (item c.2
analista. abaixo) e formação de pigmento fluorescente
no Meio de King B (item c.3 abaixo).
a) Filtração
Seguindo os procedimentos descritos no Capí- c) Confirmação
tulo 3, filtrar um volume adequado da amostra Selecionar o maior número de colônias pos-
em filtro membrana de 0,45μm. O volume de- sível para confirmação, de preferência todas.
pende do tipo de amostra. A filtração de 100 ml Estriar (estrias de esgotamento) cada cultura
é o procedimento padrão para análise de água em Ágar Nutriente (NA) e incubar as placas
mineral, na qual se espera ausência, sendo a 36±2 ºC/22±2h. Selecionar uma colônia
esse o volume mínimo exigido pela legislação bem isolada de cada placa de NA para a rea-
brasileira. No caso da análise de águas não lização dos testes de confirmação. Verificar a
destinadas ao consumo humano, nas quais a pureza da cultura antes dos testes, através da
população possa atingir contagens superiores, coloração de Gram (procedimento descrito no
selecionar o volume em função da contamina- Capítulo 5).
ção estimada na amostra, de forma a resultar c.1) Teste de oxidase: A partir da colônia em
em placas com contagens na faixa de 10 a 200 NA, usar uma alça de platina ou de plástico
colônias. Pode ser feito o fracionamento dos para estriar uma porção do material em um
100 ml em duas porções de 50 ml, 4 porções de pedaço de papel de filtro umedecido com o
25 ml ou 3 porções de 70, 25 e 5 ml, respecti- Reagente de Kovacs para Teste de Oxidase.
vamente, ou, se necessário, ser feita a filtração O desenvolvimento de uma cor roxa ou azul
de diluições. escura em 10 segundos indica teste positivo.
b) Incubação e contagem das colônias Se for usado um kit comercial de teste de
Transferir a membrana para uma placa de Ágar oxidase, seguir as instruções do fabricante.
Pseudomonas CN e incubar 36±2 ºC/44±4h. c.2) Teste de Acetamida: A partir da colônia
Contar após 22±2h e após 44±4h. em NA inocular um tubo de Caldo Acetami-
Nota b.1) A leitura após 22h pode ser usada no cálculo da ISO 16266 e incubar a 36±2 ºC/22±2h.
dos resultados caso as membranas se apresentem in- Adicionar uma gota do Reagente de Nes-
contáveis após 44h.
sler e observar. Mudança de cor variando
Contar apenas as colônias típicas, que podem de amarelo a vermelho indica produção de
ser de três tipos: amônia (reação alcalina) e teste confirmado
Tipo 1: Colônias com coloração verde azulada para P. aeruginosa.
(produção do pigmento piocianina). Essas são c.3) Teste de fluorescência em Meio de King B:
consideradas P. aeruginosa e não necessitam A partir da colônia em NA inocular um tubo
de confirmação. de Meio de King B e incubar a 36±2 ºC por
Tipo 2: Colônias sem coloração verde azulada cinco dias. Examine diariamente a ocorrên-
(sem produção de piocianina), mas fluorescen- cia de crescimento e de fluorescência sob luz
tes sob luz ultra violeta (360±20nm). Essas são ultravioleta (360±20nm). Considerar a ocor-
consideradas presuntivas e devem ser confirma- rência de qualquer evidência de fluorescência
das pelo teste de acetamida (item c.2 abaixo). como teste confirmado para P. aeruginosa.
Tipo 3: Colônias sem coloração verde azulada d) Cálculo dos resultados
(sem produção de piocianina) e não fluores- Interpretar os resultados de acordo com o Qua-
centes sob luz UV, mas apresentando colora- dro 24.3.
ção castanha avermelhada sob luz normal. Es-
sas são consideradas presuntivas e devem ser

Quadro 24.3: Interpretação dos testes de confirmação de Pseudomonas aeruginosa no método ISO
16266:2006.
Tipo de colônias no Teste de Teste de Fluorescência no Confirmada como
Ágar Pseudomonas CN acetamida oxidase Meio de King B P. aeruginosa
Verde azuladas não requerido não requerido não requerido Sim
Não verde azuladas, fluorescentes sob luz UV + não requerido não requerido Sim
Castanho avermelhadas, não verde azuladas,
+ + + Sim
não fluorescentes sob luz UV
Outros tipos não testado não testado não testado Não
Calcular o número de UFC de P. aeruginosa por Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
volume filtrado usando a fórmula abaixo: orientações do Capítulo 3, que apresenta todos
os detalhes e cuidados envolvidos na contagem
UFC/volume = P + F(cF/nF) + R(cR/nR)
de microrganismos em placas, da seleção das di-
onde: luições ao cálculo dos resultados. O procedimen-
P = Número de colônias tipo 1 no Ágar Pseudomonas CN to descrito abaixo não apresenta esses detalhes,
F = Número de colônias tipo 2 no Ágar Pseudomonas CN pressupondo que sejam conhecidos pelo analista.
nF = Número de colônias tipo 2 submetidas à confirmação
CF = Número de colônias tipo 2 confirmadas como 24.4.1. Material requerido para a
P. aeruginosa
R = Número de colônias tipo 3 no Ágar Pseudomonas CN análise
nR = Número de colônias tipo 3 submetidas à confirmação
CR = Número de colônias tipo 3 confirmadas como
Preparação da amostra e diluições
P. aeruginosa □ Diluente: Água Peptonada Tamponada (BPW)
□ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptona-
Exemplo
da Tamponada (BPW)
Volume filtrado = 100 ml
Número de colônias tipo 1 no Ágar Pseudomonas
CN (P) = 20
Número de colônias tipo 2 no Ágar Pseudomonas
CN (F) = 12, cinco submetidas à confirmação
(nF=5), duas confirmadas (cF=2). Contagem de Pseudomonas spp
Número de colônias tipo 3 no Ágar Pseudomonas □ Placas de Ágar Cefalotina Fusidato Cetrimida
CN (R) = 10, cinco submetidas à confirmação (CFC)
(nR=5), uma confirmada (cR=1). □ Placas de Ágar Nutriente
UFC/100 ml = 20 + 12x(2/5) + 10x(1/5) = 27 □ Reagente de Kovacs para teste de oxidase
Ou expressar o resultado como presença ou ausên- □ Tubos de Ágar Kligler Ferro (KIA)
cia de P. aeruginosa no volume analisado. □ Estufa incubadora regulada a 25±1 ºC
24.4. Método de plaqueamento 24.4.2. Procedimento

ISO 13720:2010 para O esquema geral de análise para contagem pre-
suntiva de Pseudomonas spp em carne e produtos
contagem presuntiva de
cárneos encontra-se descrito na Figura 24.3.
Pseudomonas spp em a) Preparação das amostras, inoculação e in-
carne e produtos cárneos cubação
Para a preparação das amostras e diluições
Método de contagem em placas da International
decimais seriadas, seguir as recomendações
Organization for Standardization (ISO 13720,
do Capítulo 2. Selecionar pelo menos duas
2010) para contagem de Pseudomonas spp em
diluições adequadas da amostra e inocular
carne e produtos cárneos.

Figura 24.3. Esquema de análise para contagem de Pseudomonas spp em carne e produtos cárneos,
pelo método ISO 13720 (2010).
em placas de Ágar Cefalotina Fusidato Ce- observando se ocorre o desenvolvimento de

trimida (CFC), plaqueamento em superfície. uma cor azul intensa, em aproximadamente
Aguardar que as placas sequem e incubar a dez segundos (teste positivo). O não-desenvol-
25±1 ºC/44±4h. vimento da cor azul no intervalo de dez segun-
dos indica teste negativo.
b) Confirmação das colônias
c) Cálculo dos resultados
Selecionar placas com menos de 150 colônias
Considerar como .confirmadas (Pseudomonas
e, de cada placa, escolher cinco colônias, ao
spp presuntiva) todas as culturas oxidase posi-
acaso, para a confirmação. Se houver menos
tivas. Seguir as orientações abaixo para o cál-
de cinco em alguma placa, selecionar todas.
culo dos resultados.
b.1) Teste de oxidase. Colocar um disco ou fita de Nota c1) Na descrição do gênero Pseudomonas o teste de
papel de filtro no interior de uma placa de Petri oxidase pode ser positivo ou negativo. O método des-
e embeber o centro do papel com o reagente de crito acima não considera as cepas oxidase negativas
Kovacs para teste de oxidase (solução aquosa no cálculo dos resultados.
1% de cloridrato de N,N,N,N-tetrametil-p-fe- Segundo a ISO 7218:2007/Amd 1:2013, calcular
nilenodiamina). Com uma alça de platina ou usando a fórmula:
palitos estéreis (não utilizar alça de níquel- UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
cromo), remover uma pequena quantidade da
colônia e espalhar sobre o reagente no papel, onde:
a = (b.C /A) sendo C = número de colônias típicas presentes


A = número de colônias típicas submetidas à confirmação
(geralmente cinco) e ISO 11059:2009 para contagem
b = número de colônias típicas confirmadas, dentre as que
de Pseudomonas spp em
v = volume inoculado em cada placa. leite e produtos lácteos
n1 = número de placas contadas da primeira diluição sele-
cionada Método de contagem em placas da International Or-
ganization for Standardization (ISO 11059, 2009)
cionada
d = primeira diluição retida para contagem e da International Dairy Federation (IDF/RM 225,
(100=1, 10-1= 0,1, 10-2= 0,01 e assim por diante). 2009) para contagem de Pseudomonas spp em
leite e produtos lácteos. Também é aplicável ao
Exemplo 1) Inoculados 0,1 ml das diluições 10-1 ambiente de fabricação de produtos lácteos.
e 10-2, uma placa por diluição (n1 = 1 e n2 = 1). Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as
Os resultados obtidos foram: orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os
Diluição 10-1 Diluição 10-2 detalhes e cuidados envolvidos na contagem de
Colônias típicas na placa (C) 150 17 microrganismos em placas, da seleção das dilui-
5 5
confirmação (A)
4 3 supondo que sejam conhecidos pelo analista.
Número de colônias consideradas (4x150/5)
(3x17/5) = 10
confirmadas nas placas [a = (b.C/A)] = 120
Primeira diluição retida para análise
10-1 = 0,1
contagem (d)
Preparação da amostra e diluições
120+10 = 130 □ Diluente: Água Peptonada Tamponada (BPW)
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
130 / [0,1 x (1+0,1 x 1) x 0,1] □ Tubos de diluição com 9 ml de Água Peptona-
= 130/0,011 = 1,2x104
da Tamponada (BPW)
Exemplo 2) Inoculados 0,1 ml da diluição 10-1, tulo 2 para verificar casos especiais em que o
em duplicata (n1 =2 e n2 = 0). Os resultados ob- tipo ou volume de diluente variam em função
tidos foram: da amostra analisada.
Placa 1 Placa 2 Contagem de Pseudomonas spp
□ Ágar Penicilina Pimaricina (PPA)
confirmação (A)
5 5 □ Placas de Ágar Nutriente
Colônias típicas confirmadas dentre □ Reagente de Kovacs para teste de oxidase
4 5
as submetidas à confirmação (b) □ Tubos de Ágar Glicose (não inclinados)
(4x18/5) = 14 (5x20/5) = 20 □ Estufa incubadora regulada a 25±1 ºC
Primeira diluição retida para
10-1 = 0,1 24.5.2. Procedimento
contagem (d)
Somatória das colônias consideradas O esquema geral de análise para contagem de
14+20 = 34
confirmadas nas placas (∑a) Pseudomonas spp em leite e produtos lácteos pelo
34 / [0,1x(2+0,1x0)x0,1] =
UFC/g = ∑a / [v . (n1 + 0,1 n2 ). d]
34/0,02 = 1,7x103
método ISO/TS 11059:2009 encontra-se descrito
na Figura 24.4.
a) Preparação das amostras, inoculação e in-
cubação
Para a preparação das amostras e diluições

Figura 24.4. Esquema de análise para contagem de Pseudomonas spp em leite e produtos lácteos,
pelo método ISO 11059:2009.

decimais seriadas, seguir as recomendações cultura em um tubo de Ágar Glicose (não

do Capítulo 2. Selecionar pelo menos duas inclinado), por picada. Incubar os tubos a
diluições adequadas da amostra e inocular em 25±1 ºC/24±3h, com as tampas ligeiramen-
placas de Ágar Penicilina Pimaricina (PPA), te afrouxadas, para manter condições aeró-
plaqueamento em superfície. Aguardar que bicas. Crescimento sem alteração da cor do
as placas sequem e incubar, sem inverter, a meio para amarelo (sem viragem ácida do
25±1 ºC/48±2h. indicador) é indicativo de não fermentação
b) Confirmação das colônias da glicose. Algumas cepas podem desenvol-
Selecionar placas com até 150 colônias e, de ver cor amarela na superfície do meio de
cada placa, escolher cinco colônias, ao acaso, cultura, mas isso não indica fermentação, é
para a confirmação. Se houver menos de cinco causado pela oxidação da glicose.
em alguma placa, selecionar todas.
c) Cálculo dos resultados
A partir de cada colônia selecionada, inocular
uma alçada da cultura (estrias de esgotamento) Considerar como confirmadas todas as culturas
em uma placa de Agar Nutriente (NA) e in- oxidase positivas que não fermentam a glicose.
cubar as placas a 25±1 ºC/24-48h. Selecionar Nota c1) Na descrição do gênero Pseudomonas o teste de
uma colônia bem isolada para os testes de con- oxidase pode ser positivo ou negativo. O método des-
firmação descritos abaixo. crito acima não considera as cepas oxidase negativas
no cálculo dos resultados.
b.1) Teste de oxidase. Da mesma forma descri-
ta no item 24.4.2.b.1. Calcular os resultados da mesma forma des-
b.2) Teste de fermentação da glicose. Com crita para o método ISO 13720:2010 (item
uma agulha de inoculação, inocular cada 24.4.2.c)

24.6. Referências
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Organization for Standardization, 2009. crobiological Methods, 47(2):243-247.

25 Preparação de material de
laboratório para análises
microbiológicas
Item 25.1 (revisado) Atualizado procedimento de descontaminação de resíduos contaminados conforme a ISO
7218:2007/Amd.1:2013.
Item 25.4 (revisado) Atualizado procedimento de esterilização conforme a ISO 7218:2007/Amd.1:2013.
Item 25.6.1 (revisado) Atualizado procedimento de verificação de limpeza da vidraria conforme a ISO 7218:2007/
Amd.1:2013.
Item 25.6.2.b (revisado) Indicadores biológicos - o ideal é que sejam utilizados em cada batelada.
A preparação do material de laboratório para utili- Procedimento para a

zação em análises microbiológicas envolve todas descontaminação
as atividades necessárias para garantir que os fras-
cos, utensílios, instrumentos e vidraria destinados Submeter todo o material à esterilização em
ao contato com as amostras se encontrem total- autoclave, a 121±3 ºC por pelo menos 30min
mente limpos, estéreis e isentos de resíduos quí- (ISO 7218:2007/Amd.1:2013), observando-se os
micos e orgânicos no momento das análises. Esse seguintes cuidados:
trabalho envolve as atividades de descontamina- □ afrouxar as tampas de todos os frascos e a boca
ção, descarte de resíduos contaminados, lavagem, dos sacos de esterilização, para que haja livre
acondicionamento e esterilização. acesso do vapor;
□ adicionar solução desinfetante aos estojos de
descarte de pipetas, para amolecer os resíduos
25.1. Descontaminação e facilitar a posterior remoção.
e descarte de resíduos
contaminados
25.2. Lavagem
Todo o material resultante das análises microbio-
lógicas é altamente contaminado, uma vez que A lavagem da vidraria e demais utensílios é uma
os métodos analíticos promovem a multiplicação etapa fundamental no preparo do material de labo-
dos microrganismos presentes, elevando o seu nú- ratório, principalmente quanto à escolha dos de-
mero em vários milhares de vezes, em compara- tergentes e aos métodos de enxágue, para remover
ção com as contagens normalmente encontradas os resíduos desses agentes.
nas amostras. Esse material inclui não apenas os Os detergentes mais utilizados são os aniônicos,
meios de cultura, onde foi obtido crescimento mi- principalmente aqueles que contêm compostos
crobiano, mas também toda a vidraria e demais alcalinos como os silicatos, carbonatos ou fosfa-
utensílios que tenham entrado em contato com os tos. Eventualmente, pode ser necessária a aplica-
microrganismos. ção de um agente mais forte, principalmente para

a limpeza de utensílios que não permitem a intro- te, deve-se seguir as recomendações do fabri-
dução de escovas (como pipetas, por exemplo), cante do detergente aplicado.
ou para a remoção de resíduos mais resistentes c) Com o auxílio de escovas e esponjas, esfregar
à ação dos detergentes. Nesses casos, pode ser os frascos e demais utensílios, lembrando de
utilizada a solução alcoólica 1N de hidróxido de remover também as anotações de lápis e cane-
sódio. tas dermatográficas e vidrográficas. Não con-
O enxágue dos utensílios deve ser feito de forma seguindo uma boa limpeza (principalmente
a garantir a completa remoção dos resíduos de do material que não pode ser esfregado com
detergente ou solução alcoólica de hidróxido de escovas), mergulhar em solução alcoólica 1N
sódio utilizados. Os resíduos desses compostos de NaOH e deixar de molho por alguns minu-
podem interferir com os resultados das análises, tos a algumas horas, dependendo da aderência
tanto por alteração das características dos meios do material a ser removido. Proteger as mãos
de cultura, como por inibição do crescimento dos com luvas de borracha e utilizar pinças de aço
microrganismos. Como detergentes e soluções inoxidável para manusear o material de molho
de limpeza apresentam uma forte afinidade pelas em solução de NaOH.
superfícies da vidraria e demais utensílios (razão c.1) Preparo da solução alcoólica 1N de hi-
pela qual são eficientes no deslocamento da sujei- dróxido de sódio. Adicionar e dissolver, aos
ra), sua completa remoção exige seis a doze en- poucos e cuidadosamente, 40g de NaOH em
xágues sucessivos em água corrente, seguidos de um béquer com 100 ml de água destilada,
um a vários enxágues em água destilada. colocado dentro de um banho de água fria.
Cuidado: A dissolução da soda libera uma
Procedimento para a lavagem quantidade significativa de calor e a solução
a) Remover todo o material descontaminado pre- obtida é extremamente caústica. Aguardar o
sente nos frascos e utensílios, antes de iniciar resfriamento e completar o volume para um
a lavagem. Meios de cultura sólidos devem litro com etanol 96%.
ser removidos das placas com uma espátula e, d) Enxaguar todo o material em água corrente,
quando contidos em tubos e outros frascos de por seis a 12 vezes sucessivas, enchendo e
boca estreita, devem ser aquecidos, fundidos e esvaziando totalmente os frascos. Enxaguar
vertidos na pia. em seguida com água destilada ou deionizada
b) Mergulhar todo o material em solução deter- várias vezes (Taylor & Perez, 2015). No caso
gente e deixar de molho por duas horas ou um de pipetas, recomenda-se recorrer ao auxílio
pouco mais, dependendo do grau de aderência de um lavador de pipetas, mantendo cada ba-
do material a ser removido. Fazer uma pré-la- telada sob enxágue contínuo, por pelo menos
vagem dos frascos e utensílios em água cor- uma hora.
rente, para evitar a introdução de excesso de
matéria orgânica nas bacias de lavagem (esse
material pode deteriorar-se e desenvolver odor 25.3. Acondicionamento
desagradável na água do molho). Os tubos de
Durham devem ser colocados de molho em Atenção: as recomendações deste item, bem
frasco separado, resistente ao calor, e subme- como as do 25.4 (esterilização), referem-se aos
tidos à ação do vapor fluente por 15 minutos, frascos e utensílios vazios. Material com meios
para remoção dos resíduos de meio de cultura. de cultura, diluentes e reagentes devem ser prepa-
As pipetas devem ter o algodão do bocal re- rados, acondicionados e esterilizados seguindo as
movido antes do período de permanência de orientações do Capítulo 26 e Anexo 1.
molho. Para a preparação da solução detergen-

Preparação de material de laboratório para análises microbiológicas □ 447
Procedimentos para o esterilização em autoclave, a 121±3 ºC por pelo

acondicionamento menos 15min (ISO 7218:2007/Amd.1:2013).
Não trabalhar com as estufas ou autoclaves muito
a) Placas de Petri. Devem ser acondicionadas cheias, para facilitar a transferência de calor.
em estojos porta-placas de alumínio ou aço
Observações práticas:
inoxidável, em grupos de mesma dimensão, ou
embrulhadas em grupos de até 10 placas. a) A esterilização de vidraria em estufas é preferi-
da, nos laboratórios de microbiologia, porque,
b) Pipetas. Preencher o bocal com o algodão e
ao final da esterilização, o material encontra-se
acondicionar em estojos porta-pipetas de alu-
completamente seco, pronto para uso, dispen-
mínio ou aço inoxidável, em grupos de mesma
sando a permanência em estufas de secagem.
capacidade, com as pontas para baixo, na ex-
Entretanto, atenção: pipetas com capacidade
tremidade oposta à da tampa do estojo. Prote-
menor do que 1,0 ml não devem ser esteriliza-
ger o fundo dos estojos com um chumaço de
das em estufas, pois as altas temperaturas pro-
gaze ou algodão, para evitar danos às pontas
vocam alterações significativas nas medidas de
das pipetas. Alternativamente, embrulhar in-
volume. O procedimento correto é esterilizar
dividualmente, lembrando-se de identificar a
em autoclaves a 121 ºC, por não mais do que
extremidade do embrulho que deve ser aberta
15 minutos.
no momento da análise.
b) Todos os tubos de ensaio, frascos e estojos de-
c) Tubos de ensaio vazios. Tampar com tampão
vem ser esterilizados com as tampas afrouxa-
de algodão ou com as respectivas tampas, no
das ou ligeiramente abertas, para que haja livre
caso de tubos rosqueáveis. Acondicionar em
acesso do vapor ou ar quente no interior (ISO
grupos, em cestas apropriadas para esse fim,
7218:2007/Amd.1:2013). Após o término da
lembrando-se de afrouxar as tampas dos tubos
esterilização essas tampas devem, então, ser
de rosca. Cobrir a parte superior dos tubos e
completamente fechadas.
amarrar com barbante.
c) Na esterilização de vidraria vazia em autocla-
d) Frascos de homogeneização e outros frascos
ve, é recomendável liberar o vapor imediata-
vazios tampados com tampão de algodão.
mente após o término do tempo de esteriliza-
Cobrir a tampa ou o tampão e amarrar com
ção, através da válvula de descarga de vapor.
barbante, individualmente.
Esse cuidado diminui o acúmulo de conden-
e) Espátulas, pinças, tesouras e demais utensí- sado e facilita a secagem do material, porém,
lios. Embrulhar individualmente, lembrando- atenção: essa prática é recomendada para fras-
se de identificar a extremidade do embrulho cos vazios. No caso de meios de cultura, di-
que deve ser aberta no momento da análise. luentes e reagentes, é necessário aguardar que
a pressão baixe até zero, antes de descarregar o
vapor, pois, em caso contrário, poderá ocorrer
25.4. Esterilização perda de líquido por evaporação.
d) Na esterilização de placas de Petri em autocla-
Todo o material de laboratório vazio (placas, pipe-
ve, não é recomendável o acondicionamento
tas, tubos de ensaio, frascos, pinças, tesouras etc.)
em estojos, porque o acúmulo de condensado
pode ser esterilizado tanto em autoclave quanto
vai exigir, posteriormente, um período prolon-
em estufa de esterilização.
gado de permanência em estufas de secagem.
Para diminuir esse problema as placas podem
Procedimentos para a esterilização ser embrulhadas em papel adequado para este-
Na esterilização em estufa, o material deve per- rilização, que além de absorver o condensado,
manecer a 170±10 ºC por pelo menos 1h e, na seca rapidamente em estufas de secagem.

25.5. Preparo de vidraria nova em balão volumétrico, completar o volume

para 250 ml com água destilada.
Antes de ser colocada em uso, toda a vidraria nova
deve ser preparada da seguinte forma: 25.6.2. Verificação da esterilização
a) Mergulhar e manter por 24 horas em água des- Deve ser realizada através de indicadores quími-
tilada. cos e biológicos, conforme recomendado pelo
b) Enxaguar em nova batelada de água destilada Compendium (Taylor & Perez, 2015).
e submeter a um teste de pH, antes de ser uti- a) Indicadores químicos. Comprovam a exposi-
lizada. ção do artigo ao calor, embora não garantam
c) Tampas de plástico ou borracha, de tubos de que o mesmo esteja esterilizado. O ideal é que
rosca ou outros frascos, devem passar por um sejam utilizados em cada batelada, na forma
tratamento para remoção de resíduos tóxicos. de fitas ou selos adesivos indicadores, obser-
Para tanto, mergulhar em água destilada, au- vando-se, a cada uso, se a fita ou selo indica a
toclavar a 121 ºC/15 minutos e enxaguar em aplicação do calor.
água destilada. Repetir este procedimento b) Indicadores biológicos. Avaliam a eficácia da
mais uma vez. esterilização e o ideal é que sejam utilizados
em cada batelada. No procedimento por calor
25.6. Controle de qualidade úmido (autoclaves) deve-se utilizar fitas de pa-
pel impregnadas com esporos viáveis de Geo-
do material bacillus sthearothermophilus ATCC 7953, na
O material preparado deve ser inspecionado, para quantidade de 5x105 a 5x106 esporos por fita
verificar se atende às exigências para uso em aná- (ou em ampolas com a suspensão). Na este-
lises microbiológicas. Isso inclui a verificação da rilização por calor seco deve-se utilizar fitas
limpeza, a verificação da esterilização e a verifi- impregnadas com esporos viáveis de Bacillus
cação da presença de resíduos tóxicos para os mi- subtilis ATTC 9372, na quantidade de 5x106
crorganismos. esporos por fita (ou em ampolas com a suspen-
são). Após a esterilização, incubar nas seguin-
tes condições: Geobacillus stearothermophilus
25.6.1. Verificação da limpeza
a 55 ºC/24-48h, Bacillus subtilis a 35º a 37 ºC,
a) Fazer uma inspeção visual a cada uso. leitura diária por até sete dias.
b) Verificar diariamente o pH da vidraria, selecio-
nando alguns frascos de material limpo e seco 25.6.3. Verificação da presença de
antes do uso. O pH deve permanecer entre 6,5 resíduos tóxicos
e 7,3 (ISO 7218:2007/Amd.1:2013). Para a
Deve ser feita periodicamente, principalmente
verificação, adicionar ao frasco seco algumas
quando se inicia o uso de uma nova marca de de-
gotas de solução 0,04% de azul de bromoti-
tergente para a lavagem. Para testar placas de Pe-
mol, observando a cor. Em pH neutro, a so-
tri não descartáveis, preparar três grupos de placas
lução mantém-se verde, em condições ácidas
da seguinte forma (Hunt, 2012):
(pH 6,5 ou menor) ocorre viragem para amare-
lo e em condições alcalinas (pH 7,3 ou maior) Grupo A: Lavar seis placas da forma usualmente
ocorre viragem para azul. Alternativamente, utilizada no laboratório.
pode-se utilizar tiras de papel indicador de pH. Grupo B: Lavar seis placas da maneira usualmen-
b.1) Preparo da solução 0,04% de azul de bro- te utilizada no laboratório e depois submeter a
motimol. Dissolver 0,1g de azul de bromoti- doze enxágues adicionais, com doze porções
mol em 16 ml de solução 0,01N de NaOH e, diferentes de água destilada.

Preparação de material de laboratório para análises microbiológicas □ 449
Grupo C: Lavar seis placas de Petri e deixar secar Se a média do grupo A for 15% maior do que a
sem enxaguar a solução detergente. média do grupo C, significa que o detergente
Usar cada um destes grupos de placas para con- apresenta efeito tóxico contra os microrganismos.
tar uma suspensão de E. aerogenes, por plaquea- Se a média do grupo A for 15% menor do que a
mento em profundidade, usando Ágar Padrão para média do grupo B, significa que o método de en-
Contagem (PCA) como meio de contagem. Prepa- xágue utilizado pelo laboratório não foi eficiente
rar as diluições e inocular, a cada uma das placas para remover completamente esses resíduos. Se,
dos três grupos, 1 ml da diluição adequada para por outro lado, a diferença entre as médias A e B
obtenção de 50 a 150 colônias nas placas. Para for menor do que 15%, significa que o método de
orientação, lembrar que uma suspensão de E. coli, lavagem e enxágue utilizado pelo laboratório foi
com 48 horas em caldo nutriente, apresenta con- eficiente para remover os resíduos.
tagem entre 108 e 109/ml, de forma que o plaque- Para avaliar a presença de resíduos em tubos ou
amento de 1 ml das diluições 10-5, 10-6 e 10-7 pro- frascos, cultivar por 48 horas a 35 ºC uma cultura
vavelmente resultará em placas com um número de E. coli ou E. aerogenes, inoculando a cultu-
adequado de colônias para contagem. Calcular a ra em Caldo Nutriente (NB) ou Caldo Tripticase
média do número de colônias desenvolvidas nas de Soja (TSB) acondicionado em três grupos de
seis placas de cada grupo e comparar as médias tubos ou frascos, lavados da mesma forma reco-
obtidas: mendada para os grupos A, B e C de placas de
Se a diferença entre as médias dos grupos A, B e Petri. Verificar a contagem das suspensões obtidas
C for menor do que 15%, significa que o deter- após a incubação, por contagem padrão em pla-
gente utilizado não apresenta ação tóxica contra cas, e comparar os resultados de forma análoga à
os microrganismos. utilizada para as placas.
25.7. Referências
HUNT, M.E.. Microbiological examination. In: RICE, E.W., gical examination. 3 rd edition, 2007, Amendment 1,
BAIRD, R.B., EATON, A.D. & CLESCERI, L.S. 2013. The International Organization for Standardi-
(Eds), Standard Methods for the Examination of Water zation.
& Wastewater, 22 nd Ed. Washington, D.C.: American TAYLOR, T.M. & PÉREZ, K.L., 2015. Microbiological me-
Public Health Association (APHA), American Water dia,reagents and stains. In: SALFINGER, Y. & TOR-
Works Association (AWWA) & Water Environment TORELLO, M.L. (eds.), Compendium of Methods
Federation (WEF), 2012. Part 9000, pp.9.1 - 9.224. for the Microbiological Examination of Foods, 5 th
ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs ed. Washington: American Public Health Association
–General requirements and guidance for microbiolo- (APHA). Chapter 67, pp.885-950.

26 Cuidados na preparação de
meios de cultura e reagentes
para análises microbiológicas
Item 26.1.1.1 (revisado) A condutividade máxima recomendada pela ISO 11133:2014 para água purificada de
preparo de meios e reagentes continua 25μS/cm, mas recomenda-se, preferencialmente, que seja menor que
5μS/cm.
Quadro 26.1 (revisado) Denominação padrão para peptonas atualizada segundo ISO 11133:2014 (incluído hidro-
lizado ácido de caseína
Item 26.1.2 (revisado) Revisada a classificação de meios de cultura segundo a ISO 11133:2014, com as seguintes
alterações:
Item 26.1.2.1 Inserido meios cromogênicos ou fluorogênicos.
Item 26.1.2.3 Inserido meios prontos para uso.
Item 26.2.10 (revisado) Atualizadas recomendações sobre estocagem dos meios esterilizados até o momento do
uso
26.1. Introdução cialmente na forma desidratada, incluem fontes de

nutrientes, agentes seletivos, agentes diferenciais,
A maioria das orientações e informações desse ca- agentes redutores, agentes tamponantes, substra-
pítulo são da ISO 11133:2014 e do Compendium tos cromogênicos e fluorogênicos e ágar (agente
of Methods for Microbiological Examination of gelificante). Os ingredientes da formulação são
Foods (Taylor & Pérez, 2015). dissolvidos em água, cuja qualidade é crítica para
As orientações são gerais e devem ser comple- o bom desempenho dos meios preparados.
mentadas com as do Anexo 1, que apresenta a for-
26.1.1.1. Água para o preparo de meios e
mulação e as orientações específicas de preparo
reagentes
de cada meio e reagente citado no Manual.
Os ensaios microbiológicos utilizam uma varie- A água usada no preparo de meios e regentes deve
dade enorme de meios de cultura, cuja formula- ser purificada (destilada, deionizada ou de qua-
ção varia em função do(s) microrganismo(s) que lidade equivalente). A estocagem deve ser feita
serão cultivados e dos ensaios a que se destinam. em frascos de material inerte, como vidro neu-
A formulação é o conjunto de ingredientes que, tro ou polietileno. Para avaliação da qualidade, a
balanceados em proporções adequadas, conferem ISO 11133:2014 estabelece dois parâmetros, a
ao meio de cultura as características que o distin- resistividade e a contagem total de aeróbios me-
guem. Esses ingredientes podem ser de vários ti- sófilos a 22 ºC. A resistividade deve ser maior ou
pos, apresentados a seguir. igual a 0,04MΩcm. Na prática esse parâmetro é
controlado pela determinação da condutividade
(inverso da resistividade), que deve ser menor ou
26.1.1. Ingredientes utilizados na
igual a 25μS/cm, preferencialmente menor que
formulação de meios de cultura
5μS/cm. A contagem total de aeróbios mesófilos
Os ingredientes utilizados na formulação de (a 22±1 ºC/68±4h) não deve ultrapassar 103 UFC/ml,
meios de cultura, geralmente disponíveis comer- preferencialmente 102 UFC/ml.

26.1.1.2. Fontes de nutrientes em meios deos de baixo peso molecular. A hidrólise com
de cultura tripsina é chamada digestão tríptica.
Os nutrientes necessários ao crescimento variam b) Pepsina – enzima de origem animal, ataca as
com o tipo de microrganismo. Alguns são muito as ligações peptídicas envolvendo fenilalanina
versáteis e exigem poucos constituintes nutritivos ou leucina, liberando predominantemente pep-
(basicamente, uma fonte de carbono e uma fonte tídeos. A hidrólise com pepsina é chamada di-
de nitrogênio) e outros são extremamente depen- gestão péptica e resulta em peptídeos de peso
dentes (chamados de fastidiosos), exigindo vita- molecular relativamente alto.
minas, peptídeos ou aminoácidos específicos. As c) Papaína – enzima de origem vegetal, ataca
principais fontes de nutrientes usadas na formula- as as ligações peptídicas envolvendo arginina,
ção de meios de cultura são as peptonas, os extra- lisina e fenilalanina, liberando predominante-
tos de carne, levedura ou malte, os carboidratos, mente peptídeos.
os minerais e os metais essenciais. As peptonas são comercializadas com várias de-
Peptonas. Peptona é o nome genérico dos produ- nominações, dependendo da fonte da proteína, da
tos da hidrólise ácida ou enzimática de proteínas forma de hidrólise e da marca do fabricante. Es-
de origem animal (carne, fígado, cérebro, coração, sas denominações comerciais foram utilizadas na
caseína, gelatina), vegetal (soja) ou microbiana descrição da formulação original de muitos meios
(extrato de levedura). São ingredientes comple- de cultura, mas gradativamente têm sido substitu-
xos, o que significa que sua exata composição não ídas pela denominação padrão estabelecida pela
é conhecida. São fontes de nitrogênio, contendo ISO 11133-1:2014, apresentada no Quadro 26.1.
peptídeos, aminoácidos e vitaminas, cujos tipos e A seguir estão descritos os equivalentes comerciais
quantidades variam em função da proteína utiliza- mais comuns dos diversos tipos de peptonas usadas
da e da forma como foi feita a hidrólise. na formulação de meios de cultura. Os produtos de
A hidrólise ácida ataca todas as ligações peptídi- um mesmo grupo não são, necessariamente, equi-
cas das proteínas, liberando os aminoácidos. Al- valentes na composição final, que depende da ma-
guns aminoácidos são totalmente perdidos, como téria prima usada e do grau de hidrólise aplicado.
o triptofano, outros são parcialmente quebrados, Peptonas de tecido animal obtidas por digestão
como a cistina, a serina e a treonina, e outros são enzimática
convertidos à sua forma ácida, como a asparagina ○ Peptone A (Peptic Digest of Animal Tissue)
e a glutamina. As vitaminas podem ser total ou (ACUMEDIA 7181)
parcialmente destruídas, dependendo do grau de ○ Peptone (BACTO™ 211677)
hidrólise. ○ Peptone Bacteriological (OXOID LP37)
A hidrólise enzimática é mais branda e ataca ape- ○ Peptone Bacteriological Neutralized
nas ligações peptdícas específicas da proteína, (OXOID LP34)
sendo mais utilizadas as seguintes enzimas: ○ Peptone from meat (pancreatic)
a) Enzimas do pâncreas – atacam as ligações (MERCK 1.07214)
peptídicas envolvendo arginina, lisina, tirosi- ○ Peptone from meat (peptic)
na, triptofano, fenilalanina e leucina. Incluem (MERCK 1.07224)
principalmente a tripsina e a quimiotripsina, ○ Peptona P (peptic) (OXOID LP49)
que quebram as proteínas em peptídeos e, em ○ Thiotone™ E Peptone (BBL™ 212302)
menor quantidade, as carboxipeptidases A e B, Peptonas de caseína obtidas por hidrólise ácida
que produzem uma pequena fração de amino- ○ Acidicase™ Peptone (BBL™ 211843)
ácidos livres. A hidrólise com as enzimas do ○ Casamino Acids (BACTO™ 223050)
pâncreas é chamada digestão pancreática e re- ○ Casamino Acids Technical
sulta em uma mistura de aminoácidos e peptí- (BACTO™ 223120)

Cuidados na preparação de meios de cultura e reagentes para análises microbiológicas □ 453
Quadro 26.1. Denominação padrão da ISO 11133:2014 para peptonas.
ISO 11133:2014 Denominação em português Produtos
Acid hydrolisate of casein Hidrolizado ácido de caseína Peptonas de caseína obtidas por hidrólise ácida.
Peptonas de caseína obtidas por digestão enzimática, incluindo,
Enzymatic digest of casein Hidrolizado (enzimático) de caseína tríptica (tryptic digest of casein), péptica (peptic digest of casein) ou
pancreática (pancreatic digest of casein) e triptona.
Enzymatic digest of soybean Peptonas de soja obtidas por digestão enzimática incluindo hidrólise
Hidrolizado (enzimático) de soja
meal com enzima de origem animal ou com papaína.
Peptonas de tecido animal (carne) obtidas por digestão enzimática,
Enzymatic digest of animal Hidrolizado (enzimático) de tecido
incluindo péptica (peptic digest of meat) ou pancreática (pancreatic
tissues animal
digest of meat).
Peptonas mistas de tecido animal e vegetal, obtidas por digestão
Enzymatic digest of animal Hidrolizado (enzimático) de tecido
enzimática, incluindo tríptica (tryptic digest of animal and plant
and plant tissues animal e vegetal
tissues) e triptose.
Enzymatic digest of heart Hidrolizado (enzimático) de coração Peptonas de coração obtidas por digestão enzimática.
Enzymatic digest of gelatin Hidrolizado (enzimático) de gelatina Peptonas de gelatina obtidas por digestão enzimática.
○ Casamino Acids Vitamin Assay ○ Phytone™ Peptone (BBL™ 211906)

(DIFCO™ 228830) ○ Peptone S Ultrafiltered (ACUMEDIA 7680)
○ Casein hydrolysate (acid) (MERCK 1.02245) ○ Soya peptone (peptone from soyameal, papai-
○ Casein hydrolysate (acid) (OXOID LP41) nic) (MERCK 1.07212)
○ Casein Acid Hydrolysate (ACUMEDIA 7229) ○ Soya Peptone (OXOID LP44)
Peptonas de caseína obtidas por digestão pan- Peptona de soja obtida por digestão com enzi-
creática ma de origem animal
○ Casitone (BACTO™ 225930) ○ Soytone (BACTO™ 243620)
○ Pancreatic Digest of Casein (Peptone C) Peptonas com teor elevado de peptídeos de alto
(ACUMEDIA 7179) peso molecular (proteoses)
○ Trypticase™ Peptone (BBL™ 211921) ○ Proteose Peptone (BACTO™ 211684)
○ Tryptone (BACTO™ 211705) ○ Proteose Peptone (OXOID LP85)
○ Tryptone (OXOID LP42) ○ Proteose Peptone (MERCK 1.07229)
○ Tryptone (peptone from casein, pancreatic) ○ Peptonas mistas com elevada proporção de
(MERCK 1.07213) proteínas digeridas com tripsina
○ Tryptone (peptone from casein, pancreatic ○ Tryptose™ (BACTO™ 211713)
free from sulfonamides antagonists) (MERCK ○ Tryptose (OXOID LP47)
1.02239) ○ Tryptose (triptic) (MERCK 1.10213)
Peptonas de gelatina obtidas por digestão pan- Peptonas mistas
creática ○ Dipeptone (ACUMEDIA 7183)
○ Gelysate™ Peptone (BBL™ 211870) ○ Neopeptone (BACTO™ 211681)
○ Pancreatic Digest of Gelatin (Peptone G) ○ Polypeptone™ (BBL™ 211910)
(ACUMEDIA 7182) ○ Special Peptone (OXOID LP72)
○ Peptone from gelatin (pancreatic) ○ Universal Peptone M 66 (MERCK 1.07043)
(MERCK 1.07284) Segundo o Merck Microbiology Manual (2005),
Peptonas de soja obtidas por digestão com pa- dessa lista os seguintes produtos são equivalentes:
paína ○ Acidicase™ Peptone (BBL™ 211843) e Ca-
○ Papaic Digest of Soybean Meal (Peptone S) sein Hydrolysate (acid) (MERCK 1.02245 e
(ACUMEDIA 7180) OXOID LP41)

○ Casamino Acids (BACTO™ 223050) e Carboidratos. Os carboidratos, particularmente

Casein Hydrolysate (acid) (MERCK 1.02245 a glicose, são a fonte de carbono e energia uti-
e OXOID LP41) lizadas pela maioria dos microrganismos. Alguns
○ Gelysate™ Peptone (BBL™ 211870) e grupos ou gêneros de bactérias não crescem na
Peptone from gelatin (pancreatic) ausência desses componentes e a capacidade de
(MERCK 1.07284) utilizar um determinado tipo de carboidrato é ca-
○ Peptone (BACTO™ 211677), Peptone from racterística de cada espécie microbiana. Essa di-
meat (peptic) (MERCK 1.07224) e Peptone P ferença é explorada nas formulações, para favore-
(OXOID LP49) cer ou diferenciar microrganismos específicos. Os
○ Peptone from meat (pancreatic) carboidratos mais usados em meios de cultura são
(MERCK 1.07214) e Peptone Bacteriological as pentoses (arabinose, xilose), as hexoses (glico-
(OXOID LP37) se, frutose, galactose, manose), os dissacarídeos
○ Phytone™ Peptone (BBL™ 211906), Soya (sacarose, lactose, maltose), os polissacarídeos
peptone (MERCK 1.07212) e Soya peptone (amido), os glicosídeos (esculina, salicina) e os
(OXOID LP44) açúcar-alcoóis (sorbitol, dulcitol, manitol, adoni-
○ Thiotone™ E Peptone (BBL™ 212302) e tol, glicerol). As características mais verificadas a
Peptone from meat (peptic) partir de carboidratos são a produção de ácido e a
(MERCK 1.07224) produção de gás.
○ Trypticase™ Peptone (BBL™ 211921) e Minerais e metais essenciais. Há muitos compo-
Tryptone (peptone from casein, pancreatic) nentes inorgânicos essenciais ao crescimento mi-
(MERCK 1.07213) crobiano, classificados, como macro componentes
○ Tryptone (peptone from casein, pancrea- (macronutrientes) típicos (Na, K, Cl, P, S, Ca, mg,
tic) (MERCK 1.07213) e Tryptone (OXOID Fe) e micro componentes (micronutrientes) típicos
LP42) (Zn, Mn, Br, B, Cu, Co, Mo, V, Sr). Muitos deles
○ Tryptose (triptic) (MERCK 1.10213) e Tryp- estão presentes nas peptonas e extratos, não sendo
tose (OXOID LP47) necessariamente adicionados na formulação.
Extrato de carne, extrato de levedura e extra- 26.1.1.3. Agentes seletivos

to de malte. Assim como as peptonas, os extratos
Agentes seletivos são compostos inibidores do
também são ingredientes complexos, cuja exata
crescimento de microrganismos, adicionados aos
composição não é conhecida. O extrato de carne
meios de cultura para inibir as espécies sensíveis e
(meat extract) é a infusão (caldo) obtido no cozi-
favorecer (selecionar) as resistentes. Os mais uti-
mento da carne, concentrado ou desidratado. Con-
lizados são os antibióticos, os sais biliares e com-
tém frações hidrossolúveis de proteínas (aminoá-
postos químicos diversos.
cidos, pequenos peptídeos), vitaminas, minerais,
elementos traço e carboidratos (glicogênio). O ex- Antibióticos. Os antibióticos mais amplamen-
trato de levedura (yeast extract) é um autolisado te utilizados são a polimixina B, a ampicilina, a
das leveduras produzidas na fabricação de cerveja novobiocina, a D-cicloserina, a oxitetraciclina, a
ou das leveduras de panificação. É considerado vancomicina, a trimetoprima, a cicloheximida e o
uma fonte rica em aminoácidos e vitaminas do moxalactam.
complexo B, contendo ainda proteínas, carboi- Bile e sais biliares. A bile é um produto do fígado,
dratos e micronutrientes. O extrato de malte (malt composto por ácidos graxos, ácidos biliares, sais
extract) é preparado através da extração de consti- inorgânicos, sulfatos, pigmentos biliares, coleste-
tuintes solúveis de grãos germinados, evaporados rol, mucina, lecitina, ácido glicurônico, porfirinas
em baixa temperatura até a secagem. Conserva os e uréia. No fígado, os ácidos biliares são conjuga-
componentes nitrogenados e os carboidratos. dos com glicina ou taurina, para destoxificação,

passando para a forma de sais biliares. Os ácidos e Os indicadores de pH mudam de cor em determi-
os sais biliares têm ação sobre bactérias Gram po- nadas faixas de pH e os mais utilizados em meios
sitivas e a bile ou esses derivados são usados em de cultura são os descritos a seguir:
meios seletivos, para o isolamento de bactérias
Indicador pH de viragem
Gram negativas. Os produtos mais usados como
ingredientes são: Azul de bromotimol 6,1 = amarelo, 7,7 = azul
▪ Bile desidratada, Oxbile, Oxgall. A bile desi- Azul de timol 8,0 = amarelo, 9,6 = azul
dratada é preparada a partir da bile recém obti-
Púrpura bromocresol 5,4 = amarelo, 7,0 = púrpura (roxo)
da de boi ou carneiro, evaporada e desidratada.
O produto preparado a partir de bile de boi é Vermelho de cresol 7,4 = amarelo, 9,0 = vermelho
comumente chamado de oxbile ou oxgall.
Vermelho de fenol 6,9 = amarelo, 8,5 = vermelho
▪ Sais biliares. Um refinamento no uso da bile é
a extração dos sais biliares, separando-os dos Vermelho Neutro 6,8 = vermelho, 8,0 = amarelo
demais constituintes da bile. A mistura em pó é

composta principalmente de glicolato de sódio Indicadores de sulfeto de hidrogênio (H2S). Os
e taurocolato de sódio. indicadores de H2S são compostos de ferro (citra-
to férrico, citrato férrico amoniacal e sulfato férri-
▪ Sais biliares Nº 3. São uma fração modificada
co amoniacal), utilizados para diferenciar micror-
dos sais biliares, com ação inibitória em con-
ganismos que produzem dos que não produzem
centrações bem menores (menos de um terço
H2S, no metabolismo de aminoácido sulfurados.
da concentração dos sais biliares).
Quando esses compostos reagem com o H2S, é
▪ Desoxicolato de sódio. Sal do ácido desoxi-
produzido sulfeto de ferro, um composto preto e
cólico, que é o ácido biliar com maior efeito
solúvel, que se difunde e provoca o escurecimento
antibacteriano. É obtido por um processo de
do meio de cultura.
separação dos demais sais biliares, sendo utili-
Outros agentes diferenciais. Outros agentes di-
zado com um sal relativamente puro.
ferenciais bastante utilizados são a gema de ovo,
Compostos químicos. Os compostos químicos
para diferenciar os microrganismos que produzem
incluem iodo, tetrationato de sódio, azida de só-
dos que não produzem enzimas lipolíticas, a escu-
dio, corantes (verde brilhante, verde de malaqui-
lina, para diferenciar os microrganismos que hi-
ta), metais (selenito de sódio, telurito de potássio)
drolizam dos que não hidrolizam esse composto e
e surfactantes (lauril sulfato de sódio).
o sangue, para diferenciar os microrganismos que
26.1.1.4. Agentes diferenciais causam dos que não causam hemólise.
Os agentes diferenciais são compostos utilizados 26.1.1.5. Agentes redutores

para verificar características típicas de espécies Agentes redutores podem ser adicionados aos
de microrganismos, permitindo diferenciá-las de meios de cultura com duas finalidades. A primei-
outras espécies. Os mais utilizados são os indica- ra é produzir um ambiente reduzido (anaeróbio),
dores de pH e os indicadores de sulfeto de hidro- com potencial de óxido redução (redox) favorável
gênio (H2S). ao crescimento de microrganismos estritamente
Indicadores de pH. Os indicadores de pH são anaeróbios. Para essa finalidade, a cisteína e o tio-
utilizados para diferenciar os microrganismos que glicolato são os agentes redutores mais usados no
produzem dos que não produzem ácido ou base preparo de meios de cultura. A segunda é indicar
durante o crescimento. A produção de ácidos é visualmente (por mudança de cor) o potencial de
resultante da fermentação de carboidratos e a pro- óxido redução do meio de cultura. Para essa fina-
dução de base (amônia) é resultante da descarbo- lidade os indicadores redox mais utilizados são a
xilação de aminoácidos ou da hidrólise da ureia. resazurina e o azul de metileno.

26.1.1.6. Agentes tamponantes cocos. O produto formado na reação é intensa-

Os agentes tamponantes são utilizados para man- mente azul.
ter o pH dos meios de cultura nas faixas ideais ▪ X-Alfa-Glicosídeo (5-bromo-4-cloro-3-in-
de crescimento dos microrganismos a que se des- dolil-α-D-glucopiranosideo). Substrato cro-
tinam. O pH pode sofrer variações significativas mogênico para a enzima α-glicosidase, carac-
após a adição de uma amostra ácida ou básica ou terística de Cronobacter. O produto formado
após a produção de ácidos ou bases no crescimen- na reação é verde ou verde azulado.
to. Os agentes tamponantes mais usados são os
26.1.1.8. Ágar
fosfatos, os citratos e os acetatos.
O ágar-ágar é o agente gelificante mais usado em
26.1.1.7. Substratos cromogênicos e
meios de cultura, embora alguns meios ainda uti-
fluorogênicos
lizem a gelatina. É obtido de algas marinhas aga-
São compostos adicionados aos meios de cultura rofíticas, principalmente Gelidium, Gracilaria e
para verificar a produção de enzimas caracterís- Pterocladia. É extraído como uma solução aquo-
ticas de certos grupos ou espécies de microrga- sa em temperaturas superiores a 100 ºC, filtrado,
nismos. Quando utilizados como substrato por desidratado e moído até a forma de pó. É inerte à
essas enzimas, são formados produtos de reação ação microbiana, solúvel em água quente mas não
coloridos ou fluorescentes, que permitem detectar em água fria, solidifica entre 32 e 39 ºC, funde a
a ocorrência da reação. Os mais utilizados são: mais de 84 ºC e forma géis fortes e reversíveis, em
▪ X-β-D-Glicuronídeo (5-bromo-4-cloro-3-in- concentrações baixas (1,2 a 1,5%). O produto pro-
dolil-β-D-glicuronídeo). Também chamado cessado para fins microbiológicos tem alta pureza
de BCIG, é um substrato cromogênico para e não é tóxico. É hidrolizado com calor em pH
a enzima β-glicuronidase, característica de ácido, perdendo a capacidade gelificante se aque-
E. coli. O produto formado na reação é azul. cido em meios com pH inferior a 5,0.
▪ MUG (4-metilumbeliferil-β-D-glicuroní-
deo). Substrato fluorogênico para a enzima β- 26.1.2. Classificação dos meios de
glicuronidase, característica de E. coli. O pro- cultura
duto formado na reação é azul fluorescente sob
luz UV (336nm). A ISO 11133:2014 classifica os meios de cultura
▪ ONPG (Orto-nitrofenil-β-D-galactopirano- em função da composição, da consistência, da for-
sídeo). Substrato cromogênico para a enzima ma de preparação e da função.
β-gactosidase, característica dos coliformes
totais. O produto formado na reação é amarelo. 26.1.2.1. Classificação pela composição
▪ Salmon-Gal (6-cloro-3-indolil-β-D-galac- Meios quimicamente definidos. São meios for-
topiranosídeo). Substrato cromogênico para a mulados com ingredientes de composição quí-
enzima β-galactosidase, característica dos co- mica definida, cuja estrutura molecular e grau
liformes totais. O produto formado na reação é de pureza são conhecidos.
salmão a vermelho. Meios complexos. Chamados de meios quimi-
▪ X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-ga- camente indefinidos na ISO 11133:2014, são
lactopiranosídeo). Substrato cromogênico aqueles que contêm em sua formulação ingre-
para a enzima β-galactosidase, característica dientes complexos (peptonas, extratos de car-
dos coliformes totais. O produto formado na ne, extrato de levedura, extrato de malte, san-
reação é intensamente azul. gue, bile desidratada, sais biliares, ágar), cuja
▪ X-Glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-gli- composição exata não é conhecida.
copiranosídeo). Substrato cromogênico para a Meios cromogênicos ou fluorogênicos. São
enzima β-glicosidase, característica de entero- meios contendo substratos cromogênicos e/ou

fluorogênicos, para verificar a produção de en- então adicionados às bases estéreis. Vários
zimas características de certos grupos ou espé- suplementos encontram-se disponíveis comer-
cies de microrganismos. cialmente na forma desidratada, já estéreis, re-
querendo apenas a hidratação para adição nos
26.1.2.2. Classificação pela consistência
meios de cultura.
Meios líquidos. Também chamados de caldos, Meios formulados. São meios de cultura total-
são meios constituídos de uma solução aquo- mente preparados no Laboratório, a partir dos
sa dos ingredientes da formulação. Em alguns ingredientes individuais de sua formulação.
caldos são adicionadas partículas sólidas,
como no PE-2 (contém ervilhas) e no Meio 26.1.2.4. Classificação pela função
de Carne Cozida (contém partículas de carne). Meios de transporte. Meios cuja função é man-
São acondicionados em tubos ou frascos. ter a viabilidade dos microrganismos durante o
Meios sólidos. Também chamados de ágar, por- intervalo de tempo entre a coleta e a análise da
que contém ágar como agente gelificante, em amostra. Geralmente contém componentes que
concentração de 1,5% ou em redor. A con- impedem a multiplicação dos microrganismos,
sistência é firme e não apresenta fluidez. São mas garantem a sua preservação.
acondicionados em placas de Petri ou em tu-
Meios de manutenção. Meios para manutenção
bos, estes últimos podendo ou não ser inclina-
de culturas em estoque por longos períodos de
dos durante a fase de solidificação, formando
tempo, preservando a viabilidade.
uma rampa. Em alguns meios é usada gelatina
Meios de ressuscitação. Meios para reparação de
em lugar do ágar.
células injuriadas, permitindo a recuperação
Meios semissólidos. Contém ágar em concentra-
de sua capacidade normal de crescimento, sem
ção de 0,3% ou em redor, com consistência
necessariamente promover a multiplicação.
fluída. São acondicionados em tubos, não in-
clinados. Meios de enriquecimento. Meios predominan-
temente líquidos, com composição particular-
26.1.2.3. Classificação pela forma de mente favorável à multiplicação dos micror-
preparação ganismos a que se destinam. Podem ser não
Meios prontos para uso. São meios de cultura seletivos, seletivos ou seletivos diferenciais.
disponíveis comercialmente já preparados e ▪ Meios de enriquecimento não seletivo. Des-
estéreis. Podem vir distribuídos em placas ou tinam-se ao enriquecimento de microrganis-
tubos, não exigindo qualquer manipulação no mos em geral, favorecendo a multiplicação
laboratório, ou exigindo apenas a posterior fu- da maioria. Nos ensaios com duas fases de
são e/ou suplementação antes do uso. enriquecimento, o meio usado na primeira
Meios desidratados. São formulações completas fase geralmente é chamado de meio de pré-
ou semi completas (bases) de meios de cultu- -enriquecimento.
ra, disponíveis comercialmente na forma de- ▪ Meios de enriquecimento seletivo. Desti-
sidratada. As formulações completas exigem nam-se ao enriquecimento de microrganis-
a hidratação, a esterilização e a distribuição mos específicos, contendo agentes seletivos
em placas, tubos ou frascos no laboratório. As para inibir a maioria dos outros.
bases exigem ainda a preparação individual ▪ Meios de enriquecimento seletivo dife-
de alguns componentes da formulação (su- rencial. Destinam-se ao enriquecimento e
plementos), que são sensíveis ao calor e não diferenciação de microrganismos específi-
fazem parte da formulação comercial. Os sucos. Contém agentes seletivos, para inibir
plementos são preparados e esterilizados se- a maioria da microbiota acompanhante, e
paradamente, geralmente por filtração, sendo agentes diferenciais, para verificar uma ou

mais características típicas do microrganis- utilizados na análise de alimentos. Há, entretanto,

mo alvo. vários outros que seguem procedimentos diferen-
Meios de isolamento/plaqueamento. Podem ser ciados, descritos no Anexo 1. Antes de preparar
meios sólidos em placas, que objetivam favore- qualquer meio de cultura pela primeira vez, con-
cer a multiplicação dos microrganismos e isolar sultar o Anexo 1, para familiarizar-se com essas
uns dos outros, através da formação de colônias variações.
separadas. Nessa forma são comumente cha- Sempre que disponíveis, meios desidratados são
mados de meios de plaqueamento e usados na mais recomendados do que meios formulados no
contagem padrão em placas ou na inoculação laboratório. Qualquer exceção a essa regra é cita-
por estrias de esgotamento. Também podem ser da nos capítulos específicos dos ensaios em que o
meios sólidos ou semi sólidos em tubos, para meio seja utilizado.
onde são normalmente transferidas (repicadas) Os meios desidratados devem ser preparados e es-
as culturas (puras) obtidas em colônias isola- tocados de acordo com a orientação do fabrican-
das. Assim como os meios de enriquecimento, te, mesmo quando diferentes das recomendações
os meios de isolamento podem ser não seleti- apresentadas neste Capítulo. Qualquer exceção a
vos, seletivos ou seletivos diferenciais. essa regra é citada no Anexo 1 ou nos capítulos es-
▪ Meios de isolamento/plaqueamento não se- pecíficos dos ensaios em que o meio seja utilizado.
letivo. Destinam-se ao isolamento e/ou con-
tagem de microrganismos em geral, favore- 26.2.1. Armazenamento dos
cendo a multiplicação da maioria. insumos para preparo de meios
▪ Meios de isolamento/plaqueamento seleti- de cultura
vo. Destinam-se ao isolamento e/ou conta-
gem de microrganismos específicos, con- Até o momento do uso, todos os insumos adqui-
tendo agentes seletivos para inibir a maioria ridos para o preparo de meios de cultura devem
dos outros. ser estocados sob condições que garantam sua
▪ Meios de isolamento/plaqueamento seletivo integridade. A maioria dos produtos traz no rótu-
diferencial. Destinam-se ao isolamento e/ lo orientações sobre a forma de estocagem, bem
ou contagem de microrganismos específi- como a data de validade. Essas orientações devem
cos, contendo agentes seletivo, para inibir a ser seguidas, sempre que disponíveis. Além disso,
maioria dos outros, e agentes diferenciais, alguns outros cuidados devem ser observados:
para verificar características típicas que di- ▪ As embalagens não devem ser abertas até o
ferenciem o alvo dos outros. momento do uso, mantendo-se os selos e lacres
Meios de identificação. São meios para inocu- originais, enquanto permanecerem no estoque.
lação de culturas puras e verificação de carac- ▪ Ao colocar em uso, sempre retirar do estoque
terísticas típicas para identificação. Alguns são o frasco mais antigo primeiro e verificar a va-
usados também como meio de isolamento, no lidade e as características do material. Frascos
repique direto de colônias isoladas em meios vencidos e/ou com absorção de umidade (en-
de plaqueamento. durecimento e perda da fluidez do pó) e/ou al-
teração de cor devem ser descartados.
▪ Registrar a data em que o frasco foi aberto e
26.2. Procedimento colocado em uso.
para preparação de ▪ Depois de abertos, estocar os frascos em lo-
cal seco, protegidos da umidade, mantendo as
meios de cultura
tampas sempre bem fechadas. Material alta-
Os procedimentos apresentados a seguir são ge- mente higroscópico, com advertência em rótu-
rais e aplicam-se a uma grande parte dos meios lo, deve ser mantido em dessecador.

▪ Corantes e meios que contenham corantes devem 26.2.4. Verificação e ajuste do pH

ser protegidos da luz. De maneira geral, as emba- antes da esterilização
lagens originais são adequadas para esse fim.
▪ Nunca transferir meios e reagentes para emba- Segundo a ISO 11133:2014, os meios desidrata-
lagens diferentes da original. dos podem sofrer variação de pH depois da este-
rilização, sendo necessária uma verificação poste-
26.2.2. Pesagem e reidratação rior (item 26.2.8.abaixo). Desde que preparados
com água de boa qualidade, a verificação e o ajus-
Nessa etapa é recomendável o uso de máscaras, te antes da esterilização não é necessária.
para evitar a inalação dos pós, geralmente muito
Utilizar um pHmetro acertado previamente com
finos. Vários meios de cultura contém substâncias
soluções tampão à temperatura ambiente. No
tóxicas.
momento da leitura, o meio deve estar à mesma
Em um frasco de material inerte, de tamanho ade-
temperatura das soluções tampão, porque leituras
quado, colocar parte da água necessária para a
errôneas podem ser obtidas se esse cuidado não
rehidratação do material. Usar água de qualidade
for observado. Os pHmetros são designados para
adequada para o preparo de meios de cultura, con-
determinar diferenças de pH entre duas soluções
forme especificação do item 26.1.1.1.
à mesma temperatura. O sistema de ajuste do apa-
Pesar cuidadosamente a quantidade adequada do
relho, para leitura em diferentes temperaturas, não
meio desidratado ou dos ingredientes individuais,
permite corrigir diferenças de temperatura entre
transferindo cada componente para o frasco de
os tampões e o meio de cultura. Para ajustar o pH
água. Agitar com uma bagueta, desfazendo qual-
do meio, adicionar uma solução de hidróxido de
quer grumo que venha a se formar. Adicionar o
sódio (NaOH) ou de ácido clorídrico (HCl), pre-
restante da água necessária para completar o vo-
paradas em concentração adequada. Essa concen-
lume final, agitando novamente.
tração deve ser tal que o volume de NaOH ou HCl
adicionado não seja superior a 10% do volume de
26.2.3. Dissolução e dispersão meio de cultura.
Se o meio for líquido, agitar o material até a com-
pleta dissolução, aquecendo, se necessário. Se o 26.2.5. Distribuição
meio for sólido contendo ágar, deixar de molho
por alguns minutos e então aquecer em banho Distribuir o meio em tubos ou frascos apropria-
fervente, agitando frequentemente até a fusão do dos ao uso nos ensaios, garantindo um espaço
ágar. O aquecimento também pode ser feito em livre suficiente para que não ocorra transborda-
chapa aquecida, magnética ou não, ou em cha- mento de material durante a esterilização (ISO
ma de bico de Bunsen, usando uma chapa entre 11133:2014). Como orientação, garantir que o
a chama e o frasco. Nesses casos, deve-se tomar ponto central no interior do volume de meio não
cuidado para não queimar o material no fundo do fique a mais de 2,5cm da superfície do líquido ou
frasco, agitando constantemente. das paredes do frasco. Isso assegura um rápido
Alguns meios sólidos não podem ser esterilizados equilíbrio da temperatura, quando o meio é colo-
em autoclave, sendo apenas fervidos nessa etapa cado em banho maria (Taylor & Pérez, 2015).
de dissolução e dispersão. Se for necessária a dis- Os meios utilizados em placas não são distribuí-
tribuição em placas, fazer a verificação e o ajuste dos nas placas nessa etapa, mas sim, depois da es-
do pH logo depois da fervura (seguir a orienta- terilização. Nesse caso, acondicionar em frascos
ção do item 26.2.8) e distribuir imediatamente nas que permitam a posterior transferência do fluído
placas. Não permitir que esses meios solidifiquem fundido para as placas.
antes do plaqueamento, porque não podem ser re- Os meios utilizados em tubos são distribuídos
aquecidos. nos tubos nessa etapa, antes da esterilização. Os

meios sólidos devem ser fundidos e bem homoge- saturado, operando com o binômio temperatura/
neizados antes da distribuição, para que todas as tempo de 121 ºC/15min. A temperatura deve subir
alíquotas transferidas para os tubos contenham a lentamente, até atingir 121 ºC, mas o tempo de
mesma quantidade de ágar. Se a homogeneização subida não deve ultrapassar dez minutos, a partir
não for cuidadosa, o meio pode não solidificar em do início da exaustão de ar. Terminada a esterili-
alguns tubos. zação, a pressão deve ser reduzida gradualmente
Nos tubos de meios líquidos em que é recomen- (em não menos do que 15min) porque os líquidos
dado o uso de tubos de Durham para a coleta de estão a uma temperatura acima do seu ponto de
gases, o Durham deve ser colocado nessa etapa, ebulição, podendo ferver e vazar.
antes da esterilização. Colocar os Durham nos tu- Há meios de cultura que são esterilizados sob ou-
bos vazios e depois distribuir o meio de cultura. tras condições, especificadas no Anexo 1, princi-
Não é necessario que os Durham sejam preenchi- palmente aqueles que contém carboidratos sensí-
dos pelo líquido na distribuição, isso vai ocorrer veis, esterilizados a 116 ou 118 ºC. Para frascos
naturalmente durante a esterilização. com volume maior do que um litro recomenda-se
Nos tubos de meios sólidos que são inclinados, a que o ciclo de esterilização seja adaptado, se ne-
inclinação não é feita nessa etapa, mas sim, depois cessário, seguindo a instrução do fabricante do
da esterilização, durante a solidificação. equipamento.
Monitoramento do processo de esterilização.
26.2.6. Esterilização pelo calor Recomenda-se o uso de indicadores químicos e
úmido biológicos.
▪ Indicadores químicos comprovam a exposição
A maioria dos meios de cultura são esterilizados
do material ao calor, embora não garantam que
pelo calor úmido, porém, há meios sensíveis ao
o mesmo esteja esterilizado. Devem ser utili-
calor que são esterilizados por filtração ou sim-
zados em cada batelada, na forma de fitas ou
plesmente fervidos. A forma de esterilização re-
selos adesivos, observando-se, a cada uso, se a
comendada para cada meio citado no manual é
fita ou selo indica a aplicação do calor. Equiva-
especificada no Anexo 1.
lentes comerciais: Fita de Autoclave 3M 1222
Preparação do material para esterilização. Es- (cor creme claro com listras intermitentes dia-
terilizar o material no máximo uma hora depois da gonais brancas, impregnadas de substância
preparação. Fundir os meios contendo ágar antes química indicadoras de processo que, após o
da esterilização. Cobrir as tampas dos frascos com ciclo, mudam para cor cinza a grafite).
papel alumínio ou papal kraft amarrado, para pro- ▪ Indicadores biológicos avaliam a eficácia da
teção contra recontaminação e evaporação duran- esterilização, podendo ser utilizadas fitas de
te a estocagem posterior. Afrouxar as tampas dos papel impregnadas com esporos viáveis de
frascos e tubos com tampa de rosca, para permitir Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953,
a entrada do vapor. na quantidade de 5x105 a 5x106 esporos por
Carregamento da autoclave. Não encher de- fita, ou ampolas com a suspensão de esporos.
masiadamente a autoclave, para não interferir na Colocar uma ou mais fitas ou ampolas no cen-
exaustão de ar e entrada de vapor. Manter entre tro da carga, preferencialmente dentro de um
os frascos uma distância mínima de aproximada- frasco similar aos que estiverem sendo proces-
mente 1cm, em todas as direções. Não esterilizar sados. Após a esterilização, incubar as fitas ou
frascos com volume de meio maior do que 3 a 4% ampolas a 55 ºC por 48 horas, não devendo ser
da capacidade da autoclave. observado crescimento. Equivalentes comer-
Ciclo de esterilização. A esterilização pelo ca- ciais: 3M Attest™ 1262, Merck Sterikon Plus
lor úmido deve ser feita em autoclaves a vapor Bioindicator 1.10274.

Os indicadores químicos e biológicos não detec- clave (121 ºC/30min). Na saída do kitasato para
tam superaquecimento, que pode ocorrer princi- a bomba de vácuo deve ser colocado um tampão
palmente quando frascos de volume maior que um de algodão. Os copos de filtração devem ser em-
litro são submetidos à esterilização. As principais brulhados separadamente e também esterilizados
indicações de superaquecimento são: perda do em autoclave (121 ºC/30min). Alternativamente
poder gelificante do ágar, alteração significativa podem ser utilizados copos descartáveis estéreis.
do pH do meio, alteração da cor do meio, escu- No momento do uso, desembrulhar as duas partes
recimento de meios contendo açúcar (reação de em uma câmara de fluxo laminar. Preparar o con-
Maillard), formação de precipitados, perda do junto ajustando a membrana no porta filtro (com a
poder seletivo e perda de produtividade (cresci- face quadriculada para cima) e o copo de filtração
mento pobre). Recomenda-se que a temperatura sobre a membrana. Conectar o kitasato à bomba
do processo de esterilização seja monitorada com de vácuo, para proceder à filtração. Após a passa-
termopares, para assegurar-se de que o valor espe- gem do líquido, retirar o copo, desconectar o porta
cificado foi atingido e não ultrapassado. filtro e, com uma pinça flambada, retirar o tubo e
fechar imediatamente.
26.2.7. Esterilização por filtração
Esterilização por filtração sob pressão usando
A esterilização por filtração é utilizada para alguns seringas. As seringas permitem a filtração de me-
poucos meios de cultura sensíveis ao calor e, mais nores volumes. As membranas são adquiridas já
frequentemente, para a esterilização de suplemen- esterilizadas, em um aparato de filtração também
tos, que serão adicionados à bases de meios de estéril, que pode ser acoplado às seringas de vidro
cultura, previamente esterilizadas por calor úmi- ou plástico, como as vendidas em farmácias. No
do. Consiste na passagem do material por um fil- momento do uso, coletar o líquido na seringa, pu-
tro membrana estéril, com poro de 0,2 ou 0,45µm, xando o embolo para fora. Em uma capela de flu-
que retém os microrganismos. Só é aplicável a lí- xo laminar, abrir o aparato de filtração, acoplar à
quidos límpidos e sem sólidos em suspensão. As seringa e forçar o embolo para baixo, recolhendo
membranas podem ser feitas de éster de celulose, o líquido filtrado em um tubo estéril.
nylon ou politetrafluoroetileno. São comercializa-
das já estéreis ou não, no segundo caso devendo 26.2.8. Verificação depois da
ser esterilizadas em autoclave (121 ºC/15min).
esterilização
A esterilização por filtração pode ser feita de duas
formas: filtração à vácuo, utilizando um conjunto de Depois da esterilização, todos os meios devem ser
filtração, ou filtração sob pressão, utilizando seringas. verificados quanto à cor, consistência, pH e este-
rilidade.
Esterilização por filtração à vácuo em conjun-
tos de filtração. O conjunto de filtração é com- Verificação do pH. Para a verificação do pH re-
posto de um porta filtro, um tubo acomodado no comenda-se que seja utilizado um pHmetro, ajus-
interior de um kitasato e um copo de filtração. O tado previamente, com soluções tampão à tempe-
porta filtro é um tipo de funil cuja parte superior é ratura ambiente. No momento da leitura, o meio
plana, para acomodar o filtro membrana e, sobre deve estar à mesma temperatura das soluções tam-
essa, o copo de filtração, preso por uma presilha. A pão, porque leituras errôneas podem ser obtidas se
parte inferior do porta filtro é acoplada ao tubo, no esse cuidado não for observado. Os pHmetros são
interior do kitasato que, conectado à uma bomba designados para determinar diferenças de pH en-
de vácuo, força a passagem do líquido pela mem- tre duas soluções à mesma temperatura. O sistema
brana, sendo recolhido no tubo. Antes do início da de ajuste do aparelho, para leitura em diferentes
filtração, o porta filtro deve ser acoplado ao tubo temperaturas, não permite corrigir diferenças de
no kitasato, embrulhado e esterilizado em auto- temperatura entre os tampões e o meio de cultura.

Para meios líquidos, retirar assepticamente uma descontaminado periodicamente, para prevenir a
alíquota de volume conhecido, resfriar à tempe- perda de esterilidade.
ratura ambiente e verificar o pH. O valor obtido
26.2.10.1. Recomendações da
deve ser o especificado para aquele meio de cul-
ISO 11133:2014
tura, com uma variação de ±0,2 unidades de pH,
a menos que outra orientação seja apresentada no Registrar sempre a data da preparação e a data de
Anexo 1. validade.
Para meios contendo ágar, retirar uma alíquota No caso de meios basais (em frascos ou tubos),
assepticamente, resfriar à temperatura ambiente, antes da adição dos suplementos, estocar por três
macerar o material sólido e verificar o pH. a seis meses sob refrigeração (5±3 ºC). Depois da
adição dos suplementos, usar no mesmo dia (ex-
No caso de meios que não podem ser esterilizados
ceto se houver outra recomendação no capítulo
em autoclave, sendo apenas fervidos, a verifica-
especifico) e não fundir novamente.
ção do pH deve ser feita logo depois da fervura
Meios completos que não contém ingredien-
(resfriando antes).
tes sensíveis ao calor, embora não citados pela
Verificação da esterilidade. Para a verificação da ISO 11133:2014, geralmente são estocados como
esterilidade recomenda-se duas alternativas. Uma os meios basais, enquanto não distribuídos em
é incubar, antes do uso, uma amostra representa- placas.
tiva de cada batelada de material esterilizado, na No caso de meios distribuídos em placas, esto-
mesma condição em que os meios serão utilizados car por duas a quatro semanas sob refrigeração
nos ensaios. Outra é incubar, junto com os meios (5±3 ºC). A quantidade de meio deve ser maior
inoculados nos ensaios, amostras não inoculadas do que os 15 mlnormalmente adicionada às placas
dos meios da mesma batelada. de 90mm que serão utilizadas no mesmo dia. Os
meios contendo corantes ou outros ingredientes
sensíveis devem ser protegidos da luz. É recomen-
26.2.9. Preparação dos
dável que as placas sejam envolvidas por filme ou
suplementos para bolsas plásticas, prevenindo a desidratação e a
meios de cultura contaminação acidental. Para evitar condensação,
A preparação de suplementos varia caso a caso, as placas devem ser resfriadas antes de embrulhar
devendo ser seguidas as orientações do Anexo 1. com filme plástico.
O principal cuidado deve ser a manipulação de Em qualquer caso, se for verificada perda de umi-
produtos em pó contendo agentes tóxicos, parti- dade, mudança de cor, crescimento microbiano ou
cularmente antibióticos. Utilizar máscaras e evitar qualquer outra alteração, descartar.
a dispersão dos pós, que podem provocar reações
26.2.10.2. Recomendações do Standard
alérgicas.
Methods for the Examination of Water
and Wastewater (Hunt, 2012)
26.2.10. Estocagem dos meios
A parte 9020B (Tabela 9020:V) do Standard Me-
esterilizados até o
thods for the Examination of Water and Wastewa-
momento do uso
ter (Hunt, 2012) traz as recomendações apresen-
Estocar os meios de cultura estéreis em local lim- tadas no Quadro 26.2 abaixo, para estocagem de
po, livre de poeira, não exposto à luz solar direta e meios de cultura.

Quadro 26.2. Condição de estocagem de meios e manter a essa temperatura até o momento do
de cultura recomendados na 22ª edição do uso, em banho ou estufa com temperatura contro-
Standard Methods for the Examination of lada. Usar em quatro horas, no máximo.
Water and Wastewater (Hunt, 2012), na parte Adição de suplementos a meios basais.
9020B, Tabela 9020:V. A ISO 11133:2014 recomenda que os suplemen-
Tempo e condição tos sejam adicionados ao meio resfriado a cerca de
Meio
de estocagem 50 ºC. Se retirados do refrigerador, aguardar que
Caldo em frasco com tampa de rosca
Até 96h sob refrigeração atinjam a temperatura ambiente antes de adicionar
(2-8 ºC).
a meios sólidos, para que não ocorra solidificação
Meios sólidos (agar) ou caldo em Até duas semanas sob do ágar. Misturar delicadamente e distribuir em
tubos com tampa não rosqueada refrigeração (2-8 ºC).
placas imediatamente, porque esse tipo de meio
Meios sólidos (agar) distribuído em Até duas semanas sob
placas refrigeração (2-8 ºC). não pode ser reaquecido.
Meios sólidos (agar) ou caldo em Até três meses à tempera- Distribuição de meios sólidos em placas.
tubos com tampa rosqueada tura ambiente (<30 ºC). A ISO 11133:2014 recomenda que seja adiciona-
Grandes volumes de meio sólido Até três meses sob da às placas uma quantidade de meio suficiente
(agar) em frasco com tampa rosqueda refrigeração (2-8 ºC).
para formar uma camada de 3mm. Para placas de
90mm de diâmetro, normalmente são requeridos
26.2.11. Preparação dos meios no 18 a 20 mlde meio. No caso de placas que serão
momento do uso estocadas, incubadas por mais de 48h ou incuba-
A preparação dos meios de cultura no momento das em temperatura acima de 40 ºC, é necessária
do uso varia caso a caso, podendo envolver as uma quantidade maior de meio. Colocar as placas
seguintes etapas: fusão do ágar em meios sóli- em uma superfície plana e fria, para solidificação.
dos, adição de suplementos a meios basais, dis- Secagem de meios em placas para inoculação
tribuição de meios de plaqueamento em placas, em superfície. Pode ser feita de três formas: a) em
secagem de meios em placas para inoculação em capela de fluxo laminar, mantendo as tampas par-
superfície e desaeração de meios para microrga- cialmente abertas por meia a uma hora, b) em estu-
nismos anaeróbios. fa a 50 ºC, mantendo as placas viradas para baixo,
Fusão do ágar em meios sólidos. sem as tampas, por duas horas (descontaminar a
A ISO 11133:2014 recomenda que a fusão seja feita superfície de contato antes de colocar as placas) ou
em banho maria, sob fervura, ou por outro proces- c) em estufa a 25-30 ºC por 18 a 24 horas.
so que dê o mesmo resultado. O tempo de aqueci- Desaeração de meios para microrganismos
mento deve ser o mínimo necessário para a fusão, anaeróbios. Afrouxar as tampas dos tubos ou fras-
para evitar super aquecimento. Retirar do banho cos e ferver em banho por 15 minutos. Apertar as
imediatamente após a fusão, resfriar a 47-50 ºC tampas e resfriar imediatamente em banho de gelo.
26.3. Referências
ISO/TS 11133. Microbiology of food, animal feed and water Works Association (AWWA) & Water Environment
–Preparation, production, storage and performance Federation (WEF), 2012. Part 9000.
testing of culture media. 1 st ed., 2014. The International TAYLOR, T.M. & PÉREZ, K.L., 2015. Microbiological me-
Organization for Standardization. dia, reagents, and stains. In: SALFINGER, Y & TOR-
HUNT, M.E.. Microbiological examination. In: RICE, E.W., TORELLO, M.L. (eds.), Compendium of Methods for
BAIRD, R.B., EATON, A.D. & CLESCERI, L.S. the Microbiological Examination of Foods, 5 th ed.
(Eds), Standard Methods for the Examination of Water American Public Health Association, Washington, D.
& Wastewater, 22 nd Ed. Washington, D.C.: American C. Chapter 67, pp. 885-950.
Public Health Association (APHA), American Water

1
ANEXO
Preparo de meios e reagentes
para as análises
Ágar/Caldo Acetamida (correção): Vermelho de fenol = 1 ml da solução 1,2%; pH = 7,0±0,2.
Ágar Azul de Toluidina DNA (correção): Cloreto de cálcio anidro = 1,1 mg.
Ágar Baird-Parker (alteração): preparação da solução de telurito de potássio e da emulsão de gema de ovo.
Caldo Dextrose Púrpura de Bromocresol (alteração): preparação e concentração da solução de púrpura de bro-
mocresol e quantidade adicionada ao meio.
Ágar Gentamicina Tálio Carbonato Fluorogênico (alteração) na formulação e preparação.
Ágar Lisina Arginina Ferro (correção) esterilizar 12min a 121 ºC.
Ágar Lisina Ferro (correção) esterilizar 12min a 121 ºC.
Ágar Lisina Ferro Duplamente Modificado (alteração) introduzidos equivalentes comerciais da base completa
e do suplemento.
Ágar Manitol Gema de Ovo Polimixina (correção) esterilizar 15min a 121 ºC e estocar a solução de polimixina
B no escuro a 4 ºC.
Ágar Triptose Sulfito Cicloserina (alteração) usar 80 ml de solução D-Cicloserina 0,5% para 900 ml de base.
Ágar Vermelho Violeta Bile (complementação) na forma de preparação do meio.
Ágar Vermelho Violeta Bile com Glicose (complementação) na forma de preparação do meio.
Reagentes para Coloração de Gram (substituído) pela formulação de Hucker.
Ágar/Caldo Acetamida Preparação. Dissolver os ingredientes e ajustar o

pH em 7,1 a 7,3 antes da esterilização. Distribuir
Referência(s). SMEWW (Hunt, 2012) section 9213F. em tubos de 16x150mm (10 ml/tubo) e esterilizar
Aplicação. Meio para teste confirmativo no mé- em autoclave (121 ºC/15min). Inclinar com rampa
todo APHA/AWWA/WEF 9213:2012 para longa até a solidificação do ágar. O pH final deve
Pseudomonas aeruginosa em água. ser 7.0±0.2. Para preparação do caldo, omitir as
Composição 15g de ágar. Solução 1,2% de vermelho de fenol:
Sulfato de magnésio ( dissolver 1,2g em 100 ml de NaOH 0,01N e usar
Acetamida* 10g 0,5g
mgSO4.7H2O) no prazo de um ano.
Vermelho de fenol
Cloreto de sódio
5g (1 ml da solução 0,012g
(NaCl)
1,2%) Ágar/Caldo APT
Fosfato dipotássico (All Purpose Tween)
1,39g Ágar (opcional) 15g
anidro (K2HPO4)
Fosfato monopotássico Referência(s). MLG (USDA, 2013), Difco &
0,73g Água purificada 1 litro
anidro (KH2PO4) BBL Manual (Zimbro & Power, 2003).
121 ºC/15min, pH final 7,0±0,2
Aplicação. Meio para isolamento de bactérias lá-
*Cuidado: A acetamida é carcinogênica e irritante, requerendo precauções
quando pesar, preparar e descartar (ISO 16266:2006). ticas, método APHA 19.52:2015.
Anexo1 MICROBIOL_PROD.indd 465 08/06/2017 20:53:16

Composição Ágar APT 1,5% Glicose

Peptona de caseína Polisorbato
12,5g 0,2g Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
digestão pancreática (Tween) 80
Extrato de levedura 7,5g

Sulfato de magnésio (
0,8g rello, 2015), p. 894.
mgSO4.7H2O)
Cloreto de manganês Aplicação. Meio para isolamento de bactérias
Dextrose 10g 0,14g
(MnCl2.4H2O) láticas, métodos APHA 19.52:2015, é usado
Fosfato dipotássico Sulfato ferroso
5g 0,04g para contar bactérias lácticas deteriorantes em
(K2HPO4) (FeSO4.7H2O)
Cloreto de sódio Carbonato de sódio pescados e frutos do mar.
5g 1,25g
(NaCl) (Na2CO3)* Preparação. Preparar o meio adicionando mais
Citrato de sódio 5g Ágar (opcional) 15g 5g de glicose a um litro de APT (que já contém
Cloridrato de tiamina 0,001g Água purificada 1 litro 10g/l), antes da esterilização.
*Não incluído na formulação do Difco & BBL Manual. Ágar Azul de Toluidina DNA
Preparação. Dissolver os ingredientes, fundir o
ágar (se presente) e esterilizar a 121 ºC/15min. Referência(s): BAM (FDA, 2015a).
Equivalentes comerciais. APT Agar (ACUME- Aplicação. Meio para confirmação de S. aureus
DIA 7302), APT Agar (DIFCO 265430), APT (teste de DNase termoestável), método APHA
Agar (MERCK 1.10453), APT Broth (DIFCO 39.61/62/63:2015.
265510). Composição
Cloreto de
Cloreto de sódio (NaCl) 10g 1,1 mg
cálcio anidro
Ágar APT Acidificado TRIS (hidroximetil-
6,1g Ágar 10g
aminometano)
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- Ácido deoxirribonucléico
rello, 2015), p. 894. (DNA)
Azul de o-toluidina 0,083g pH 9,0±0,2
Aplicação. Meio para isolamento de bactérias lá-
ticas, método APHA 19.52:2015, é usado como Preparação do meio. Dissolver 6,1g do Tris em
sobrecamada do MRS para a contagem de bacté- um litro de água purificada e ajustar o pH em 9,0.
rias lácticas deteriorantes em molhos para saladas. Adicionar os demais ingredientes, exceto o azul de
Preparação. Preparar o meio adicionando ácido o-toluidina, aos 1.000 ml de Tris, dissolver e aque-
tartárico (solução aquosa 10%, esterilizada a 121 cer até a completa fusão do ágar. Dissolver o azul
ºC/15min) ao Ágar APT estéril, fundido e resfria- de o-toluidina no meio. Distribuir em frascos com
do, até que o pH chegue a 4,0±0,2. as tampas bem rosqueada, para evitar a evapora-
ção. Não é necessário esterilizar se for usado ime-
diatamente. Estéril (121 ºC/15min) pode ser esto-
Ágar APT BCP 2% Sacarose cado por até quatro meses à temperatura ambiente
e utilizado mesmo após várias etapas de fusão.
Referência(s). Compendium (Salfinger & Torto- Preparação das lâminas ou placas para o teste
rello, 2015), p. 894. de DNAse. Fundir o meio e verter 3 ml sobre uma
Aplicação. Meio para isolamento de bactérias lá- lâmina de vidro limpa e seca, distribuindo bem
ticas, método APHA 19.52:2015, é usado para para recobrir toda a superfície. Aguardar a solidi-
contar bactérias lácticas deteriorantes em carnes. ficação e, com o auxílio de pipetas de Pasteur ou
Preparação. Preparar o meio adicionando 20g de tubos capilares, fazer até 12 cavidades de aproxi-
sacarose e 0,032g de BCP (púrpura de bromocre- madamente 2mm de diâmetro no meio, removen-
sol, 2 ml da solução aquosa 1,6%) a um litro de do o ágar das cavidades por aspiração. Alternati-
APT, antes da esterilização. vamente, o meio pode ser distribuído e perfurado

Preparo de meios e reagentes para as análises □ 467
em placas de Petri (10 ml de meio para cada placa Equivalentes comerciais. BAT Agar (MERCK
de 15x100mm). 1.07994).
Ágar/Caldo Ágar Baird-Parker (BP)

Bacillus acidoterrestris (BAT)
Referência(s): BAM (FDA, 2015a), ISO 6888-1
Referência(s): IFU 12:2007. (1999), SMEWW (Hunt, 2012).
Aplicação. Meio para detecção e contagem de Aplicação. Meio para isolamento de S. aureus pe-
Alicyclobacillus, método IFU 12:2007. los métodos APHA 39.61/62/63:2015 ou esta-
Composição do caldo filococos coagulase positivos pelo método ISO
Sulfato de amônia
6888-1:1999/Amd.1:2003.
Extrato de levedura 2g 0,20g
(NH4)2SO4 Composição da base
Fosfato de potássio dihi-
Glicose 5g 3g Triptona (peptona de caseí-
drogenado (KH2PO4) 10g Glicina 12g
na digestão pancreática)
Cloreto de cálcio dihi-
0,25g Solução mineral traço* 1 ml Cloreto de lítio
dratado (CaCl2.2H2O) Extrato de carne 5g 5g
(LiCl.6H2O)
Sulfato de magnésio
1000 Extrato de levedura 1g Ágar 20g
heptahidratado 0,5g Água purificada
ml
( mgSO4.7H2O) Piruvato de sódio 10g Água purificada 1 litro
121 ºC/15min - pH final 4,0±0,2 121 ºC/15min – pH final 7,0±0,2a
*Solução mineral traço a A ISO 6888-1 especifica pH final 7,2±0,2.
CaCl2.2H2O 0,66g CoCl2.6H2O 0,18g

Suplementos b
ZnSO4.7H2O 0,18g H3BO3 0,10g
Solução aquosa de telurito de potássio 1% 1 ml/100 ml base
CuSO4.5H2O 0,16g Na2MoO4.2H2O 0,30g
Emulsão de gema de ovo 5 ml/100 ml base
1000
MnSO4.H2O 0,15g Água purificada b O BAM e o SMEWW adicionam 5 ml do equivalente comercial EY
ml
tellurite enrichment a 95 ml de base. A ISO 6888-1 adiciona o volume
121 ºC/15min (estocar em refrigerador)
dos suplementos a 100 ml de base, recomendando também o uso de
equivalentes comerciais, se disponíveis.
Preparação do caldo. Misturar os ingredien-
tes, ajustar o pH com H2SO4 1N e esterilizar a Preparação. Preparar a base, esterilizar a 121 ºC
121 ºC/15min. por 15min, resfriar a 48-50 ºC e adicionar assepti-
Preparação do ágar (adicionado ao caldo). Fun- camente os suplementos previamente preparados.
dir 15 a 20g de ágar em 500 ml de água purifi- A base pode ser estocada por até um mês sob re-
cada e esterilizar a 121 ºC/15min. Separadamente frigeração e fundida para adição dos suplementos,
preparar 500 ml do caldo em concentração dupla, porem, o meio completo deve ser plaqueado ime-
ajustar o pH para 3,7 com solução 1N de H2SO4 e diatamente, pois não pode ser reaquecido. O BAM
esterilizar a 121 ºC/15min. Resfriar a 45-50 ºC, recomenda estocar as placas a 20-25 ºC por até
juntar os 500 ml de caldo com os 500 ml de Agar. cinco dias. Solução aquosa de telurito de potássio
Checar o pH e ajustar para 4,0 com solução 1N de 1%. Dissolver 1g de telurito de potássio (K2TeO3)
H2SO4 estéril, se necessário e plaquear imediata- em 100 ml de água destilada, com um mínimo de
mente, o meio completo não pode ser reaquecido. aquecimento. O pó deve dissolver rapidamente
e, se houver precipitação, deve ser descartado.
Preparação do ágar (a partir do equivalente co-
Esterilizar por filtração em filtro membrana de
mercial desidratado). Suspender o meio desidrata-
0,22µm e estocar sob refrigeração (3±2 ºC) por
do na água, aquecer até a fusão do ágar e esterilizar
até um mês (descartar se for observada precipi-
a 121 ºC/15min. Resfriar a 45-50 ºC e ajustar o pH
tação). Emulsão de gema de ovo. Lavar a casca
em 4,0 com solução 1N de H2SO4 estéril (a Mer-
dos ovos com escova e detergente. Mergulhar em
ck recomenda 1,7 ml por litro para o preparo do
etanol 70% por 30 segundos ou flambar com álco-
equivalente número 1.07994). Plaquear imediata-
ol. Abrir assepticamente e transferir as gemas para
mente, o meio completo não pode ser reaquecido.

um frasco estéril tarado. Adicionar às gemas uma estéril, para obter pH final de 3,5. Geralmente, a
quantidade de água purificada estéril equivalente adição de 1 ml de solução de ácido tartárico para
a quatro vezes o seu volume. Misturar o conteúdo cada 100 ml de meio é suficiente para a obtenção
e aquecer a 47 ºC por duas horas em banho maria. do pH requerido, porém, recomenda-se que seja
Em seguida manter na geladeira (3±2 ºC) por 18 verificada, a cada novo frasco de meio colocado
horas, para precipitação do material sólido. Cole- em uso, a quantidade exata de ácido consumida
tar o sobrenadante em um frasco estéril para uso e na redução do pH. O meio acidificado deve ser
usar em até 72h, mantendo na geladeira. utilizado imediatamente, não podendo ser reaque-
Equivalentes comerciais da base. Baird-Parker cido. Solução de ácido tartárico 10%. Dissolver
Agar (ACUMEDIA 7112), Baird-Parker Agar Base 10g do ácido em água purificada e completar o
(DIFCO 276840), Baird-Parker Agar (MERCK volume para 100 ml. Esterilizar por filtração ou a
1.05406), Baird-Parker Medium (OXOID CM 275). 121 ºC/10min.
Equivalentes comerciais dos suplementos. Egg Equivalentes comerciais. Potato Dextrose Agar
Yolk Emulsion (MERCK 1.03784), Egg Yolk (DIFCO 213400), Potato Dextrose Agar (ACU-
Emulsion (OXOID SR 47), Egg Yolk Enrichment MEDIA 7149), Potato Dextrose Agar (MERCK
50% (DIFCO 233472), Egg Yolk sem Telurito 1.10130), Potato Dextrose Agar (OXOID CM
(LABORCLIN 520088), Egg Yolk com Teluri- 139), Potato Dextrose Broth (DIFCO 254920).
to (LABORCLIN 520089) Egg Yolk Tellurite
Emulsion (MERCK 1.03785), Egg Yolk Telluri- Ágar Batata Dextrose com
te Emulsion (OXOID SR 54), EY Tellurite Enri- Antibióticos (PDA-ANT)
chment (DIFCO 277910), Tellurite Solution 1%
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
(BBL 211917).
rello, 2015) p. 924, SMEDP (Wehr & Frank,
Equivalentes comerciais do meio completo (pla-
2004) seção 8.112, Difco & BBL Manual
cas prontas). Baird-Parker Agar (LABORCLIN
(Zimbro & Power, 2003) p. 452, Oxoid Manu-
540170 – 10 placas).
al (Bridson, 2006) p. 2-284, Merck Microbio-
logy Manual 12 th Ed. (MERCK, 2005) p. 389.
Ágar Batata Dextrose Acidificado
Aplicação. Meio seletivo para isolamento de bo-
(PDA-AC) lores e leveduras.
Concentração
Concentração
Concentração
rello, 2015) p. 924, SMEDP (Wehr & Frank,

normal
dupla
Composição da base
1,5
2004) seção 8.112, Difco & BBL Manual (Zim-

bro & Power, 2003) p. 452, Oxoid Manual
Amido de batata ou infusão de
(Bridson, 2006) p. 2-284, Merck Microbiology 200g de batatas
4g 4g 4g
Manual 12 th Ed. (MERCK, 2005) p. 389. Dextrose 20g 20g 20g

Aplicação. Meio seletivo para bolores e leveduras. Ágar 15g 15g 15g
Composição Água purificada 1 litro 750 ml 500 ml
Amido de batata ou infusão
4g Ágar 15g 121 ºC/15min, pH final 5,6±0,2
de 200g de batatas
Dextrose 20g Água purificada 1 litro Suplemento
121 ºC/15min 2 ml/100 3 ml/100 4 ml/100
Solução 5 mg/ml de antibióticos ml base ml base ml base
Preparação. Preparar o meio e esterilizar a 121 ºC (clorotetraciclina + cloranfenicol) (final 100
mg/l)
(final 150
mg/l)
(final 200
mg/l)
por 15min. No momento do uso, fundir o ágar,
resfriar a 45-50 ºC e adicionar uma quantidade su- Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121 ºC
ficiente de solução aquosa de ácido tartárico 10% por 15min. No momento do uso, fundir o ágar,

resfriar a 45-50 ºC e adicionar a solução de anti- Ágar Bile Esculina Azida

bióticos previamente preparada. O meio comple-
to deve ser utilizado imediatamente, não podendo Referência(s): ISO 7899-2:2000.
ser reaquecido. Solução de antibióticos 5 mg/ml. Aplicação: Teste confirmativo para enterococos,
Dissolver assepticamente 500 mg de clorotetraci- método de filtração ISO 7899-2:2000.
clina-HCl e 500 mg de cloranfenicol em 100 ml de Composição
tampão fosfato pH 7,2 estéril, estocando em frasco Triptona 17g Esculina 1g
escuro, sob refrigeração. Uma parte do material só- Citrato de ferro III
Peptona 3g 0,5g
lido permanece em suspensão, devendo ser agitado amoniacal
no momento do uso. Cuidado. O cloranfenicol é Extrato de levedura 5g Azida de sódio (NaN3) 0,15g
tóxico e o contato com a pele deve ser evitado. Bile de boi (Ox Bile)
10g Ágar 8 to 18g*
desidratada
Equivalentes comerciais da base. Potato Dextro- Cloreto de sódio
5g Água purificada 1 litro
se Agar (ACUMEDIA 7149), Potato Dextrose Agar (NaCl)
(DIFCO 213400), Potato Dextrose Agar (MERCK 121±3 ºC/15min, final pH 7,1±0,1
1.10130), Potato Dextrose Agar (OXOID CM * Dependendo da força do gel do ágar
139), Potato Dextrose Broth (DIFCO 254920). Preparação: Suspender os ingredientes, aquecer
até a fusão do ágar e esterilizar a 121±3 ºC/15min.
Ágar Bile Esculina Resfriar a 50-60 ºC e plaquear. As placas podem
ser estocadas em geladeira (5±3 ºC) por até duas
Referência(s): ISO 10273:2003.
semanas.
Aplicação. Meio para teste confirmativo para Yer-
Equivalentes comerciais: Bile Esculin Azide
sinia enterocolítica, método ISO 10273:2003 e
Agar (MERCK 1.00072).
APHA 41:2015.
Composição
Ágar Bismuto Sulfito (BS)
Extrato de carne 3g Citrato férrico (III) 0,50g
Peptona de carne 5g Referência(s): BAM (FDA, 2015a).
Ágar 9 a 18g*
Sais biliares 40g Aplicação. Meio seletivo diferencial para detec-
Esculina 1g Água purificada 1000 ml ção presuntiva de Salmonella, método BAM/
121 ºC /15min - pH final 6,6±0,2 FDA.
* Dependendo da força do gel do ágar
Composição
Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o Sulfato ferroso anidro
Polipeptona 10g 0,3g
pH e aquecer até a completa fusão do ágar. Dis- (FeSO4)
Verde brilhante (2,5
tribuir em tubos, esterilizar a 121 ºC/15min e in- Extrato de carne 5g
ml da solução aquosa 0,025g
clinar. Opcionalmente, o meio pode ser utilizado Dextrose 5g 1%)
em placas, porém, nesse caso, recomenda-se que Fosfato dissódico
4g Ágar 20g
anidro (Na2HPO4)
o plaqueamento seja feito imediatamente após a
Sulfito de bismuto 8g Água purificada 1 litro
esterilização, pois o reaquecimento pode provocar
Ferver por 1 min, pH final 7,7±0,2
o escurecimento do ágar.
Equivalentes comerciais. O Compedium não Preparação. Suspender os ingredientes e agitar
descreve os meios, indicando o uso comercial com aquecimento. Ferver por 1min para obter uma
equivalente. Bile Esculin Agar (ACUMEDIA suspensão uniforme (precipitado não dissolverá).
7249), Bile Esculin Agar (BBL 299068), Bile Não autoclavar. Resfriar entre 45-50 ºC. Distribuir
Aesculin Agar (OXOID CM 888). A composição em placas imediatamente, agitando continuamen-
desses equivalentes comerciais não é exatamente te para suspender o precipitado que normalmente
a mesma descrita pela ISO 10273:2003. permanece após o aquecimento. Deixar as placas

secarem com as tampas parcialmente abertas por 100 ml de água e esterilizar por filtração. Estocar
2h, depois fechar as placas. Observação. Os fa- a 5±3 ºC por não mais do que sete dias. Solução
bricantes recomendam que as placas de BS sejam aquosa de fusidato de sódio 0,1%: Dissolver
preparadas no dia do uso, porém, diversos estudos 0,1g de fusidato de sódio em 100 ml de água e
têm demonstrado que o meio recém-preparado é esterilizar por filtração. Estocar a 5±3 ºC por não
tóxico para várias cepas de Salmonella. O BAM/ mais do que sete dias. Solução aquosa de cefalo-
FDA recomenda preparar um dia antes do uso e tina 0,1%: Dissolver 0,1g de cefalotina (sal sódi-
estocar à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. co) em 100 ml de água e esterilizar por filtração.
Estocar a 5±3 ºC por não mais do que sete dias
Equivalentes comerciais. Bismuth Sulfite Agar
(ACUMEDIA 7113), Bismuth Sulfite Agar (DIFCO Equivalentes comerciais da base: Pseudomonas
273300), Bismuth Sulfite Agar (MERCK 1.05418), Selective Agar Base (MERCK 1.07620), Pseudo-
Bismuth Sulfite Agar (OXOID CM 201). monas Agar Base (OXOID CM 559).
Equivalentes comerciais dos suplementos: Pseu-
Ágar Cefalotina Fusidato Cetrimida domonas CFC Selective Supplement (MERCK
(CFC) 1.07627) (contém fucidina em lugar do fusidato de
Referência(s): ISO 13720:2010. sódio), CFC Selective Agar Supplement (OXOID
SR 103) (contém fucidina em lugar do fusidato de
Aplicação: Contagem de Pseudomonas spp
sódio e não especifica a cefalosporina presente).
em carnes e produtos cárneos, método ISO
13720:2010.
Composição da base Ágar Cefsulodina
Peptona de gelatina Cloreto de magnésio Irgasan Novobiocina (CIN)
16g 1.4g
(digestão enzimática) (MgCl2)
Peptona de caseína
10g Ágar
12 a Referência(s): ISO 10273:2003.
(digestão enzimática) 18g*
Sulfato de potássio
Aplicação. Meio seletivo diferencial para isola-
(K2SO4)
mento de Yersinia entercolitica, método ISO
10273:2003
* Depende da força de gel do ágar.
Suplemento
Peptona de gelatina Sulfato de magnésio (
Solução aquosa de cetrimida Concentração 17g 0,01g
10 ml/l base (digestão enzimática) mgSO4.7H2O)
0,1%* final 10 mg/l Peptona de caseína e
Desoxicolato de
Solução aquosa de fusidato de Concentração tecido animal 3g 0,5g
10 ml/l base sódio
sódio 0,1% final 10 mg/l (digestão enzimática)
Solução aquosa de cefalotina Concentração Extrato de levedura 2g Vermelho neutro 0,03g
50 ml/l base
(sal sódico) 0,1%** final 50 mg/l
Manitol 20g Cristal violeta 0,001g
* Cetrimida é uma mistura composta predominantemente de brometo de
tetradeciltrimetilamonium e pequenas quantidades de brometo de dode- Piruvato de sódio 2g Ágar 9 a 18g*
ciltrimetilamonium e brometo de cetrimonium (brometo de hexadeciltri-
metilammonium.
Cloreto de sódio (NaCl) 1g Água purificada 997 ml
** Cefalotina é um antibiótico semissintético da classe das cefalosporinas. 121 ºC/15min, pH final 7,4±0,2
* Depende da força de gel do ágar.

Preparação: Suspender os componentes da base,
aquecer até a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC Suplemento
por 15min. Resfriar a base (47±2 ºC) e adicio- Solução alcoólica 0,4% de irgasan 1 ml/997 ml base
(esterilizada por filtração) (final 4 mg/l)
nar os suplementos, misturando cuidadosamente.
Solução aquosa 1,5% de cefsulodina 1 ml/997 ml base
Plaquear imediatamente porque o meio completo (esterilizada por filtração) (final 15 mg/l)
não pode ser reaquecido. Solução aquosa de ce- Solução aquosa 0,25% de novobiocina 1 ml/997 ml base
trimida 0,1%: Dissolver 0,1g de cetrimida em (esterilizada por filtração) (final 2,5 mg/l)

Preparação: Suspender os ingredientes da base, tive Agar Base (OXOID CM 653), Yersinia Se-
aquecer até a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC lective Agar Base Schiemann (MERCK 1.16434).
por 15min. Resfriar a cerca de 47 ºC e adicionar as Suplementos: Yersinia Antimicrobic Supplement
soluções de suplemento. Plaquear imediatamente, CN (DIFCO 231961), Yersinia Selective Supple-
o meio não pode ser reaquecido. ment CIN (MERCK 1.16466), Yersinia Selective
Supplement (OXOID SR 109).
ACUME-
DIA 7257
Formulação dos
MERCK
CM 653
OXOID
1.16434
DIFCO
212309
218172
BBL
equivalentes
comerciais Ágar Celobiose Colistina (CC)
Peptona - - 17g - -
Proteose peptona - - 3g - -
rello, 2015) p. 900
Peptona de gelatina
17g 10g - - -
(digestão enzimática) Aplicação. Meio seletivo diferencial para aná-
Peptona de caseína
1,5g - - 10g - lise de Vibrio em alimentos, método APHA
(digestão enzimática)***
Peptona de tecido animal
40.61/62/63:2015.
1,5g 5g - 10g -
(digestão enzimática)*** Composição. Idêntico ao Ágar Celobiose Polimi-
Peptona especial - - - - 20g
xina Colistina Modificado (m-CPC), sem a poli-
Extrato de carne - 5g - - -
mixina.
Extrato de levedura 2g 2g 2g 2g 2g
Manitol 20g 20g 20g 20g 20g
Ágar Celobiose Polimixina
Piruvato de sódio 2g 2g 2g 2g 2g
Colistina Modificado (m-CPC)
Cloreto de sódio (NaCl) 1g 1g 1g 1g 1g
Sulfato de magnésio Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
heptahidratado 0,01g - 0,01g 0,01g 0,01g
( mgSO4.7H2O) rello, 2015) p. 900, BAM (FDA, 2015a) M98.
- 0,001g - - - Aplicação. Meio seletivo diferencial para aná-
mgSO4)
lise de Vibrio em alimentos, método APHA
Desoxicolato de sódio 0,5g 0,5g 0,5g - 0,5g
40.61/62/63:2015.
Colato de sódio 0,5g - 0,5g - -
Mistura de sais biliares - - - 1g Composição da base
Vermelho neutro 0,03g 0,03g 0,03g 0,03g 0,03g Solução de corantes
Peptona 10g 1 ml
(1000x)*
Cristal violeta 0,001g 0,001g 0,001g 0,001g 0,001g
Extrato de carne 5g Ágar 15g
Irgasan 0,004g 0,004g 0,004g * *
Ágar 13,5g 12g 13,5g 12,5 12,5g NaCl 20g Água purificada 900 ml
Água destilada 1 litro 1 litro 1 litro 1 litro 1 litro Ferver até a fusão do ágar - pH final 7,6±0,2
Suplemento * Solução de corantes (1000x): Dissolver 4g de azul de bromotimol e 4g de
15 vermelho de cresol em 100 ml de etanol 95%. A concentração final de
Cefsulodina 4 mg/l 4 mg/l 4 mg/l 15 mg/l cada corante no meio de cultura é de 40 mg/l.
mg/l
2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Suplementos
Novobiocina
mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l
Irgasan ** ** ** 4 mg/l 4 mg/l 100.000
Celobiose 10g Polimixina B
unidades
* Acrescentado como suplemento. 400.000
** Incluído na base. Colistina Água purificada 100 ml
unidades
*** MERCK não especifica a forma de hidrólise. Dissolver a celobiose em água purificada quente (evite ferver).
**** Segundo o Compendium (Salfinger & Tortorello, 2015) as formulações dispo- Resfriar à temperatura ambiente e adicionar os antibióticos.
níveis comercialmente são comparáveis. Estas formulações podem variar entre
os fabricantes e não são exatamente as mesmas descritas pela ISO 10273:2003.
As instruções do fabricante devem ser seguidas para preparar o meio. Preparação: Suspender os ingredientes da base
e ferver até a completa fusão do ágar. Não auto-
Base: CIN Agar Base (BBL 212309), Yersinia Se-
clavar. Resfriar a 48-55 ºC e adicionar 100 ml da
lective Agar (ACUMEDIA 7257), Yersinia Selec-
solução do suplemento para cada 900 ml de base.
tive Agar Base (DIFCO 218172), Yersinia Selec-

Plaquear imediatamente pois o meio completo Equivalentes comerciais dos suplementos.

não pode ser reaquecido. A cor final do meio de CCDA Selective Supplement (MERCK 1.00071),
cultura é verde escuro a castanho esverdeado. O CCDA Selective Supplement (OXOID SR 155).
meio pode ser armazenado por duas semanas em
refrigeração. Ágar Chromagar Listeria
Equivalentes comerciais. Não disponível.
Referência(s): BAM (FDA, 2015a).
Composição: CHROMagar™ é uma marca re
Ágar Charcoal Cefoperazona
gistrada de meios seletivos diferenciais para di
Desoxicolato Modificado
versos microrganismos, incluindo espécies de Vi-
(m-CCDA) brio e Listeria. As formulações são confidenciais
(também chamado de Ágar Campylobacter
Charcoal Diferencial Modificado) (propriedade dos fabricantes). Os meios são produ-
zidos pela CHROMagar (http://www.chromagar.
Referência(s): ISO 10272-1:2006, ISO 10272- com) e pela Becton, Dickinson & Company (ht-
2:2006. tps://www.bd.com/ds/technicalCenter/brochures/
Aplicação. Meio seletivo diferencial para isola- br_3_2645.pdf), como BBL™ CHROMagar™.
mento de Campylobacter, método ISO 10272-
1:2006, ISO 10272-2:2006. Ágar Chromagar Vibrio
Extrato de carne 10g Desoxicolato de sódio 1g
Peptona de carne Composição: CHROMagar™ é uma marca re
10g Sulfato ferroso 0,25g
(digestão enzimática) gistrada de meios seletivos diferenciais para di
Peptona de caseína versos microrganismos, incluindo espécies de Vi-
3g Piruvato de sódio 0,25g
(digestão enzimática)
Cloreto de sódio 8a brio e Listeria. As formulações são confidenciais
5g Ágar
(NaCl) 18g* (propriedade dos fabricantes). Os meios são produ-
Charcoal (carvão) zidos pela CHROMagar (http://www.chromagar.
bacteriológico
com) e pela Becton, Dickinson & Company (ht-
121 ºC/15min - pH final 7,4±0,2
tps://www.bd.com/ds/technicalCenter/brochures/
*Depende da força de gel do ágar
br_3_2645.pdf), como BBL™ CHROMagar™.
Solução de antibióticos
Cefoperazona 32 mg Ágar Citrato Azida
Anfotericina B 10 mg
Água purificada 5 ml Referência(s): SMEDP (Wehr & Frank, 2004)
Esterilizar por filtração section 8.080.
Aplicação. Meio seletivo diferencial para conta-
Preparação. Suspender os ingredientes da
gem de enterococos em produtos lácteos.
base e aquecer até a fusão do ágar. Esterilizar a
121 ºC/15min. Resfriar a 47-50 ºC e adicionar Composição da base
assepticamente, a cada litro de base, 5 ml da so- Extrato de levedura 10g Citrato de sódio 20g
Hidrolisado de caseína Ágar 15g
lução de antibióticos. Plaquear imediatamente, o 10g
(digestão pancreática) Água purificada 1 litro
meio completo não pode ser reaquecido. Estocar pH 7,0±0,2 - 121 ºC/20min
no escuro a 3±2 ºC por até sete dias.
Suplementos
Equivalentes comerciais da base. Campylobac-
Solução aquosa 0,1% de azul de tetrazólio 10 ml por litro base
ter Blood Free Selective Agar Base (MERCK
Solução aquosa 4% de azida sódica 10 ml por litro base
1.00070), Campylobacter Blood Free Selective
Agar Base (OXOID CM 739), Campy Blood Free Preparação. Dissolver os ingredientes da base,
Selective Medium (ACUMEDIA 7527). fundir o ágar e esterilizar a 121 ºC/20min. Resfriar

a base a 48 ºC e adicionar, a cada litro de base, 10 Suplemento

ml da solução aquosa 0,1% de azul de tetrazólio e Solução de moxalactam 1% em tampão 2 ml por litro de base
10 ml da solução aquosa 4% de azida sódica. So- fosfato pH 6,0 (final 20 mg/l)
lução aquosa 0,1% de azul de tetrazólio. Dissol-
ver em água e esterilizar a 121 ºC/20min. Solução Preparação. Dissolver os ingredientes da base,
aquosa 4% de azida sódica. Dissolver em água e fundir o ágar e esterilizar a 121 ºC/15min. Res-
esterilizar a 121 ºC/20min. friar a base a 48-50 ºC e adicionar, a cada litro de
base, 2 ml da solução de moxalactam 1% estéril.
Plaquear imediatamente porque o meio completo
não pode ser reaquecido. Solução de moxalac-
Ágar Citrato de Simmons
tam 1%. Dissolver 1g de moxalactam de sódio
Referência(s): BAM (FDA, 2015a), ISO 10273: ou amônia (Sigma) em 100 ml de tampão fosfato
2003 0,1M pH 6,0. Esterilizar por filtração e congelar
Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de em alíquotas de 2 ml. Tampão fosfato 0,1M pH
citrato. 6,0: adicionar uma solução 0,1M de KH2PO4 a
Composição uma solução 0,1M de K2HPO4 até que o pH che-
Sulfato de magnésio ( Cloreto de sódio gue a 6,0.
0,2g 5g
mgSO4) (NaCl) Equivalentes comerciais. LPM Ágar Base (DIFCO
Fosfato de amônia Citrato de sódio 2g
1g 222120) com Listeria Selective Supplement (BBL
(NH4H2PO4) Ágar 15g
Fosfato dipotássico Azul de bromotimol 0,08g 212402).
1g
(K2HPO4) Água purificada 1 litro A esculina e o citrato férrico não fazem parte da
pH 6,8±0,2 - 121 ºC/15min formulação comercial, devendo ser adicionados
Preparação. Suspender os ingredientes e aque- antes da esterilização.
cer até a fusão do ágar. Distribuir em tubos de
13x100 ou 16x150mm (4-5 ml/tubo), esterilizar a Ágar Coliformes Cromogênico
121 ºC/15min e inclinar. (CCA)
Equivalentes comerciais. Simmons Citrate Agar
(ACUMEDIA 7156), Simmons Citrate Agar (BBL Referência(s). ISO 9308-1:2014
211620), Simmons Citrate Agar (MERCK 1.02501), Aplicação. Meio para contagem de coliformes to-
Simmons Citrate Agar (OXOID CM 155). tais e E. coli em água, método de filtração ISO
9308-1:2014.
Ágar Cloreto de Lítio Composição
Feniletanol Moxalactan (LPM) Peptona de caseína
1g Triptofano 1g
Suplementado com Esculina e Fe3+ Tergitol-7
(CAS Nº 68131–40–8)
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) 6-chloro-3-indoxyl-β-D-
Cloreto de sódio
Aplicação: Meio seletivo diferencial para isola- (NaCl)
5g galactopyranoside 0,2g
(CAS Nº 138182-21-5)
mento de Listeria monocytogenes. 5-Bromo-4-chloro-3-
Composição (base) Fosfato monossódico
indoxyl-β-D-glucuronic
2,2g acid, cyclohexylammo- 0,1g
Peptona de caseína 5g Cloreto de lítio 5g (NaH2PO4.2H20)
nium salt monohydrate
Proteose peptona Nº 3 5g Ágar 15g (CAS Nº 114162-64-0)
Isopropyl-β-D-thiogalac-
Extrato de carne 3g Esculina 1g Fosfato dissódico
2,7g topyranoside (IPTG) 0,1g
Cloreto de sódio Citrato férrico amoniacal 0,5 (Na2HPO4)
5g (CAS Nº 367-93-1)
(NaCl) Feniletanol 2g
Piruvato de sódio 1g Ágar 9 a 18g
Glicina anidrido 10g Água purificada 1 litro
Sorbitol 1g Água purificada 1 litro
121 ºC/15min- pH final 7,3±0,2
Aquecer até a fusão do ágar - pH final 6,8±0,2

Preparação. Suspender os ingredientes e aquecer Ágar (Caldo)

em banho-maria até a fusão do ágar. Não autocla- Dextrose Triptona (DTA/DTB)
var. Plaquear imediatamente porque o meio não
pode ser reaquecido. Estocar as placas em gela- Referência(s): AOAC (Latimer, 2012) Capítulo
deira (5±3 ºC) por até um mês, protegidas da luz e 17 p.113 (Glicose Tryptone Agar).
da perda de umidade. Aplicação. Meio utilizado no teste de esterilida-
Equivalentes comerciais. Chromocult Coliform de comercial para alimentos de baixa acidez
Agar (MERCK 1.10426). e para detectar esporos de bactérias termófilas
aeróbias (totais e flat sour).
Composição do caldo
Ágar Columbia Sangue (CBA)
Triptona 10g Púrpura de bromocre- 0,04g
sol (2 ml da solução
Referência(s). ISO 10272-1:2006, ISO 10272-
alcoólica 2%)
2:2006.
Dextrose 5g Água purificada 1 litro
Aplicação. Meio de manutenção para Campylo- 121 ºC/30min - pH final 6,7±0,1
bacter. Também usado para cultivo de Clos-
tridium perfringens no teste de fosfatase áci- Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o
da, método de filtração em membrana ISO pH e esterilizar a 121 ºC/30min. Para a preparação
14189:2013 para água. do ágar, adicionar 15g de ágar para cada litro de
Composição caldo, ferver até fundir o ágar e esterilizar a 121
Ágar Columbia (Base) 1 litro
ºC/30min.
Sangue de carneiro desfibrinado 50 ml Equivalentes comerciais. Dextrose Casein Pep-
* Formulação do Ágar Columbia Base (g/l): peptona de carne (digestão tone Agar (MERCK 1.10860), Dextrose Trypto-
enzimática) 23g, amido 1g, NaCl 5g, ágar 8 a 18g dependendo da força ne Agar (ACUMEDIA 7340), Dextrose Tryptone
de gel do ágar usado.
Agar (DIFCO 280100), Dextrose Tryptone Agar
Preparação. Preparar o Ágar Columbia confor- (OXOID CM 75).
me a orientação do fabricante. Resfriar a 47-50
ºC, adicionar o sangue de carneiro e misturar. Pla- Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG18)
quear imediatamente, o meio completo não pode
ser reaquecido. Estocar as placas a 3±2 ºC por Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
não mais que sete dias. Não deixar as placas por rello, 2015) p. 903.
mais de 4 horas em temperatura ambiente durante Aplicação. Meio seletivo para isolamento de bo-
o uso. lores e leveduras em alimentos com atividade
Equivalentes comerciais da base. Columbia de água menor ou igual a 0,95.
Agar Base (BBL 211124), Columbia Agar Base Composição
(MERCK 1.10455), Columbia Blood Agar Base Peptona 5g Cloranfenicol 0,1g
(ACUMEDIA 7125), Columbia Blood Agar Base Glicose 10g Glicerol 220g
(DIFCO 279240), Columbia Blood Agar Base Fosfato monopotássico
1g Ágar 20g
(OXOID CM 331). (KH2PO4)
Sulfato de magnésio ( Dicloran 0,002g
Equivalentes comerciais sangue carneiro desfi- 0,5g
mgSO4.7H2O) Água purificada 1 litro
brinado. Sangue carneiro desfibrinado (LABOR-
121 ºC/15min – pH final 5,6 e aw final 0,955
CLIN 520209, 521521 ou 520246) (frasco com
15, 20 ou 100 ml). Preparação. Suspender os ingredientes, exceto o
glicerol, em 800 ml de água purificada, aquecer
até a fusão do ágar e depois adicionar água até
completar um litro. Adicionar o glicerol misturar

bem e esterilizar a 121 ºC/15min. Distribuir em Ágar (Caldo) Elliker

placas e estocar em geladeira, protegidas contra a
luz, para evitar a fotodegradação do rosa de ben- Referência(s): Bergey’s Manual of Systematic
gala, com formação de compostos inibidores para Bacteriology (Teuber, 2009), Difco & BBL
os bolores e leveduras. Cuidado. O cloranfenicol Manual (Zimbro & Power, 2003).
é tóxico e o contato com a pele deve ser evitado. Aplicação. Meio para contagem de bactérias lác-
Equivalentes comerciais (sem glicerol). DG18 tica em produtos lácteos.
Agar (MERCK1.00465), DG18 Agar Base Composição do caldo
(OXOID CM 729) (sem cloranfenicol) + Chlo- Hidrolisado de caseína
20g Sacarose 5g
(digestão pancreática)
ramphenicol Selective Supplement (OXOID SR
Cloreto de Sódio
78) (50 mg). Extrato de levedura 5g 4g
(NaCl)
Gelatina 2,5g Acetato de sódio 1,5g
Dextrose 5g Ácido ascórbico 0,5g
Ágar Dicloran Rosa de Bengala Lactose 5g Água purificada 1 litro
Cloranfenicol (DRBC) pH 6,8±0,2 - 121 ºC/15min
Referência(s): SMEDP (Wehr & Frank, 2004) Preparação. Suspender os ingredientes e aque-
section 8.114. cer em banho sob fervura por um minuto, para a
Aplicação. Meio seletivo para isolamento de bo- completa dissolução e fusão da gelatina. Esterili-
lores e leveduras em alimentos com atividade zar em autoclave a 121 ºC/15min. Para preparar o
de água maior que 0,95%. meio sólido, adicionar 1,5% de ágar e preparar da
Composição mesma forma.
Peptona 5g Rosa de bengala 0,025g Equivalentes comerciais do caldo. Elliker Broth
Glicose 10g Cloranfenicol 0,1g (DIFCO 212183).
Fosfato monopotássico
1g Dicloran 0,002g
(KH2PO4) Ágar Entérico de Hecktoen (HE)
Sulfato de magnésio ( Ágar 15g
0,5g
mgSO4.7H2O) Água purificada 1 litro Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M61.
pH 5,6±0,2 - 121 ºC/15min Aplicação. Meio seletivo diferencial para detec-
ção presuntiva de Salmonella, método BAM/
Preparação. Dissolver os ingredientes e esterili- FDA.
zar a 121 ºC/15min. Estocar as placas em gela-
Composição
deira, protegidas contra a luz, para evitar a foto-
Peptona 12g Tiossulfato de sódio 5g
degradação do rosa de bengala, com formação de
Extrato de levedura 3g Citrato férrico
compostos inibidores para os bolores e leveduras. amoniacal
1,5g
Sais biliares Nº 3 9g
Cuidado. O cloranfenicol é tóxico e o contato
Lactose 12g Azul de bromotimol 0,065g
com a pele deve ser evitado.
Sacarose 12g Fucsina ácida 0,1g
Equivalentes comerciais. DRBC Agar (ACU- Salicina 2g Ágar 14g
MEDIA 7591), DRBC Agar (DIFCO 258710), Di- Cloreto de sódio (NaCl) 5g Água purificada 1 litro
chloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) Aquecer até a fusão do ágar - pH final 7,5±0,2
Agar (MERCK 1.00466), DRBC Agar Base
(OXOID CM 727) (sem cloranfenicol) + Chlo- Preparação. Suspender os ingredientes e aquecer
ramphenicol Selective Supplement (OXOID SR sob constante agitação, até a completa dissolução
78) (50 mg), DRBC Ágar Fungos (LABORCLIN do ágar. Ferver por não mais de um minuto. Não
540169 placas prontas). autoclavar. Plaquear imediatamente, não deve ser
reaquecido. Deixar as placas com as tampas par-
cialmente abertas por duas horas para secar. O

meio pode ser estocado por até 30 dias sob refrige- Ágar Extrato de Levedura Glicose
ração (4±2 ºC). Cloranfenicol (YEGC)
Equivalentes comerciais. Hecktoen Enteric Agar
(DIFCO 285340), Hecktoen Enteric Agar (BBL Referência(s): SMEDP (Wehr & Frank, 2004).
212211), Hecktoen Enteric Agar (OXOID CM Aplicação. Meio para contagem de bolores e le-
419), Hecktoen Enteric Agar (MERCK 1.11681), veduras, recomendado no Capítulo 8 do Stan-
Hecktoen Enteric Agar (ACUMEDIA 7138). dard Methods for the Examination of Dairy
Products (Wehr & Frank, 2004) para amostras
Ágar Extrato de Levedura (YEA) com predomínio de leveduras ou com levedu-
ras injuriadas pelo processamento.
Composição
Aplicação. Meio para contagem total de aeróbios
Extrato de levedura 5g Ágar 15g
mesófilos em água, método ISO 6222:1999.
Glicose 20g
Composição Água destilada 1 litro
Solução de cloranfenicol* 1 ml
Triptona 6g Ágar 10 a 20g*
120±1 ºC/15min - pH final 6,6±0,2
Extrato de levedura 3g Água purificada 1 litro
* Solução de cloranfenicol. Dissolver assepticamente 500 mg de cloranfe-
nicol em 100 ml de tampão fosfato pH 7,2 estéril, estocando a 5 ºC por
121 ºC/15min – pH final 7,2±0,2
até dois meses. Cuidado. O cloranfenicol é altamente tóxico e o contato
*Dependendo da força de gel do material. com a pele deve ser evitado.
Preparação. Suspender os ingredientes na água, Preparação. Suspender os ingredientes na água,

ferver até a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC ferver até a fusão do ágar e esterilizar a 120±1 ºC
por 15min. por 15min.
Equivalentes comerciais. Yeast Extract Agar Equivalentes comerciais. Não disponível.
acc. to ISO 6222 (MERCK 1.13116).
Ágar Extrato de Malte com

Ágar (Caldo) Extrato de Levedura Antibióticos (MEA ANT)
Amido Glicose (YSG) Referência(s): Pitt & Hocking (2009) (p. 425 = base),
Referência(s): IFU 12:2007. Compendium (Salfinger & Tortorello, 2015)
Aplicação. Meio para detecção e contagem de (p. 924 – solução de antibióticos).
Alicyclobacillus, método IFU 12/07. Aplicação. Meio para bolores e leveduras, usado
Composição na contagem de bolores termorresistentes pelo
método APHA 22.4:2015 e no teste de esteri-
Extrato de levedura 2g Ágar (opcional) 15g
lidade comercial para alimentos ácidos pelo
Glicose 1g Água purificada 1 litro
método APHA:2015.
Amido solúvel 2g 121 ºC/15min
Concentração
Concentração
Concentração
normal
dupla
Preparação. Suspender os ingredientes na água, Composição da base

1,5
ferver até a fusão do ágar (quando presente) e es-

terilizar a 121 ºC/15min. Resfriar a 50 ºC e ajustar Extrato de malte 20g 20g 20g
o pH em 3,7 com uma solução estéril de HCl 1N. Dextrose 20g 20g 20g
Para preparar o caldo, omitir o ágar e ajustar o pH Peptona 1g 1g 1g
em 3,7 antes da esterilização.
Ágar 20g 20g 20g
Equivalentes comerciais. YSG Agar (MERCK Água destilada 1 litro 750 ml 500 ml
1.07207). 121 ºC/15min, pH final 5,6

Suplemento Ágar Extrato de Malte Extrato de

2 ml/100 3 ml/100 4 ml/100 Levedura 40% Glicose (MY40G)
Solução 5 mg/ml de
ml base ml base ml base
antibióticos (clorotetraci- Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
(final 100 (final 150 (final 200
clina + cloranfenicol)
mg/l) mg/l) mg/l) rello, 2015) p.915.
Aplicação. Meio para contagem de leveduras os-
Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121 mofílicas, método APHA 17.3:2015.
ºC por 15min. No momento do uso, fundir o ágar,
Composição
resfriar a 45-50 ºC e adicionar a solução de anti-
Extrato de malte 12g Ágar 12g
bióticos previamente preparada. O meio completo
Extrato de levedura 3g
deve ser utilizado imediatamente, não podendo Água purificada 600 ml
Glicose 400g
ser reaquecido. Solução de antibióticos 5 mg/ml.
Fervura/30min - pH final aproximadamente 5,5
É a mesma do Ágar Batata Dextrose: dissolver
assepticamente 500 mg de clorotetraciclina-HCl Preparação. Suspender os ingredientes, exceto
e 500 mg de cloranfenicol em 100 ml de tampão a glicose, em 550 ml de água purificada e aque-
fosfato pH 7,2 estéril, estocando em frasco escu- cer até a fusão do agar. Imediatamente, adicionar
ro, sob refrigeração. Uma parte do material sólido água até completar 600 ml. Com a solução ainda
permanece em suspensão, devendo ser agitado no quente, adicionar a glicose com agitação, evitan-
momento do uso. Cuidado. O cloranfenicol é tó- do a formação de grumos (caso se formem, aque-
xico e o contato com a pele deve ser evitado. cer a solução para dissolver). Ferver por 30min.
Equivalentes comerciais. A formulação dos Não é necessário autoclavar.
equivalentes comerciais da base (Malt Extract Equivalentes comerciais. Não disponível.
Agar) da DIFCO, MERCK e OXOID não é igual
à descrita acima, mas esses equivalentes também Ágar Fenilalanina Deaminase
são recomendados. Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M123
Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de
fenilalanina deaminase.
Ágar Extrato de Malte 0,5% Ácido
Composição
Acético (MAA)
Extrato de levedura 3g Ágar 12g
Referência(s): Pitt & Hocking (2009) p. 425. DL-fenilalanina Cloreto de sódio
2g 5g
(ou L-fenilalanina 1g) (NaCl)
Aplicação. Meio para isolamento ou contagem de
Fosfato dipotássico
leveduras resistentes aos conservantes, método (Na2HPO4)
1g Água destilada 1 litro
Pitt & Hocking (2009). 121 ºC/10min - pH final 7,3±0,2
Composição da base. A mesma do Ágar Extrato Preparação. Suspender os ingredientes, ajustar o

de Malte com antibióticos. pH, aquecer até a fusão do ágar e distribuir em
Suplemento. Ácido acético glacial = 5 ml por li- tubos. Esterilizar a 121 ºC/10min e inclinar com
tro de base. rampa longa.
Equivalentes comerciais. Phenyalanine Agar (BBL
Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121
211537), Phenyalanine Agar (DIFCO 274520).
ºC por 15min. No momento do uso, fundir o ágar,
resfriar a 45-50 ºC e adicionar o ácido acético gla-
Ágar Fígado de Vitela (LVA)
cial, que não precisa ser esterilizado (concentra-
ção final 0,5%). O meio completo deve ser utiliza- Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M83.
do ou plaqueado imediatamente, não podendo ser Aplicação. Meio para cultivo de bactérias anaeró-
reaquecido. O pH final é de aproximadamente 3,2 bias, usado no teste de esterilidade comercial
(não é necessário ajustar). para alimentos de baixa acidez.

Composição Ágar Gentamicina Tálio Carbonato

Infusão de fígado bovino 50g Caseína isoelétrica 2g Fluorogênico (FGTC)
Infusão de carne de vitela 500g Cloreto de sódio
Proteose peptona 20g (NaCl)
5g Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
Neopeptona 1,3g Nitrato de sódio 2g
rello, 2015) p.906.
Triptona 1,3g Gelatina 20g Aplicação. Meio seletivo/diferencial para con-
Dextrose 5g Ágar 15g tagem de enterococos em alimentos, método
Amido solúvel 10g Água purificada 1 litro APHA 10.5:2015.
pH 7,3±0,2 - 121 ºC/15min Composição da base
Ágar Tripticase de Soja
40g Acetato de tálio 0,5g
Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o (TSA)
pH, fundir o ágar e esterilizar a 121 ºC/15min. Fosfato monopotássico
5g
4-metilumbeliferona- 100
(KH2PO4) -α-D-glicuronídeo mg
Equivalentes comerciais. Liver Veal Agar (DIF- 0,75
Amilose azure 3g Tween 80
CO 259100). ml
Galactose 1g Água destilada 1 litro
Ágar Gema de Ovo Anaeróbico
Suplemento
(AEY)
Solução aquosa de sulfato de gentamicina 0,1% 2,5 ml/litro base
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- Solução aquosa 10% de carbonato de sódio 20 ml/litro base
rello, 2015) p.894. Preparação. Suspender os ingredientes da base,
Aplicação. Meio diferencial para confirmação de aquecer até a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC
Yersinia enterocolitica. por 15 minutos. Após a esterilização, resfriar o
Composição da base meio a 55-50 ºC e adicionar assepticamente, para
Cloreto de sódio cada litro de meio, 20 ml de uma solução aquosa
Triptona 5g 5g
(NaCl) 10% de carbonato de sódio e 2,5 ml da solução
Proteose peptona 20g Ágar 20g de gentamicina previamente preparadas. Plaquear
Extrato de levedura 5g Água destilada 1 litro imediatamente, o meio completo não pode ser re-
121 ºC/15min - pH final 7,0±0,2 aquecido. Solução aquosa de sulfato de gentami-
cina 0,1%. Dissolver assepticamente 0,1g em 100
Suplemento
ml de água destilada estéril e estocar sob refrige-
Emulsão gema de ovo: salina (1:1 peso/peso) 80 ml/litro base
ração. Solução aquosa 10% de carbonato de sódio.
Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121 Preparar no dia do uso e pasteurizar aquecendo até
ºC/15min. Resfriar a 45-50 ºC e adicionar, assep- a fervura, antes de usar.
ticamente, a emulsão de gema de ovo previamente Equivalentes comerciais. Não disponível.
preparada. Plaquear imediatamente, o meio com-
pleto não pode ser reaquecido. Emulsão de gema Ágar Glicose
de ovo. Mergulhar os ovos em etanol 70% por 10
Referência(s): ISO 11059:2009, ISO 21528-2:2004.
minutos, flambar, abrir assepticamente e transferir
Aplicação. Meio para confirmação de Pseudomo-
as gemas para um frasco estéril tarado. Adicionar
nas spp, método ISO 11059:2009.
às gemas uma quantidade de solução salina 0,85%
estéril, suficiente para diluição 1:1 (peso/peso). Composição
Misturar o conteúdo por agitação ou com o auxí- Peptona de caseína Púrpura de
10g 0,015g
(digestão enzimática) bromocresol
lio de baguetas estéreis, até obter uma suspensão Extrato de levedura 1,5g Ágar 12 a 18g*
homogênea. Cloreto de sódio Água purificada 1 litro
5g
Equivalentes comerciais. Não disponível. (NaCl) Glicose 10g
121 ºC/15min – pH final 7,0±0,2
* A quantidade de ágar depende da capacidade gelificante do material usado.

Preparação. Suspender os ingredientes ou o meio lamento de Cronobacter, método ISO 22964

completo desidratado e aquecer até a completa fu- (2006).
são do Agar (se necessário). Ajustar o pH, se ne- Composição da base
cessário, distribuir em tubos (10 ml/tubo) e esteri- Peptona de caseína 5-bromo-4-cloro-3indolil-
7g 0,15g
lizar em autoclave (121 ºC/15min). Resfriar sem (digestão pancreática) -β-D-glicopiranosídeo
inclinar. Antes da utilização, desaerar (ferver por Extrato de levedura 3g Cristal violeta 2 mg
15min e resfriar em água fria). Cloreto de Sódio
5g Ágar 12 a 18g*
(NaCl)
Equivalentes comerciais. Não disponível (o Ágar Desoxicolato de sódio 0,6g Água purificada 1 litro
Púrpura Base para Carboidratos é similar mas não pH 7,0±0,2 - 121 ºC/15min
idêntico). * Depende da capacidade gelificante do ágar.
Preparação. Dissolver os ingredientes e aque-

Ágar (Caldo) Infusão Cérebro
cer até completa fusão do ágar. Ajustar o pH, se
Coração (BHIA/BHI) necessário. Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos e
Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) section plaquear. O meio pode ser mantida de 0 a 5 ºC
9230C, BAM (FDA, 2015a). durante até 14 dias.
Aplicação. Meio de enriquecimento e manuten- Equivalentes comerciais. ESIA (Enterobacter
ção geral para bactérias. sakazakii Isolation Agar) (AES Laboratoire).
Composição do caldo
Infusão de 200g de Dextrose 2g
Ágar K
cérebro de bezerro 7,7g
(sólidos) Cloreto de sódio 5g Referência(s). IFU 12:2007.
Infusão de 250g de Fosfato dissódico
9,8g 2,5g Aplicação. Meio para contagem e isolamento de
coração de boi (sólidos) (Na2HPO4)
Proteose peptona 10g Água purificada 1 litro
Alicyclobacillus, método IFU 12:2007
121 ºC/15min - pH final 7,4±0,2 Composição
Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o pH Extrato de levedura 2,5g Tween 80 1g
e esterilizar a 121 ºC/15min. Para a preparação do Peptona 5g Ágar 15g
ágar, adicionar 15g de ágar para cada litro de caldo. Glicose 1g Água purificada 990 ml
121 ºC/15min, pH final 3,7
Equivalentes comerciais do caldo. Brain Heart Bro-
th (MERCK 1.10493), Brain Heart Infusion (BAC- Preparação. Suspender os ingredientes, fundir o
TO 237500), Brain Heart Infusion (BBL 211059), ágar e esterilizar a 121 ºC/15min. Resfriar a apro-
Brain Heart Infusion (OXOID CM 225), Brain Heart ximadamente 50 ºC e ajustar o pH em 3,7 com
Infusion Broth (ACUMEDIA 7116), BHI CALDO uma solução aquosa 25% de ácido málico esterili-
meio pronto (LABORCLIN 510057 10 tubos 5 ml). zada por filtração (1 ml de ácido/100 ml do meio).
Equivalentes comerciais do ágar. Brain Heart Após acidificação distribuir imediatamente em
Agar (MERCK 1.13825), Brain Heart Infusion placas de petri. O meio não pode ser reaquecido.
Agar (ACUMEDIA 7115), Brain Heart Infusion Equivalentes comerciais: K Agar (3M™ BP0234500)
Agar (BBL 211065), Brain Heart Infusion Agar (anteriormente Biotrace™ BioPro Premium K
(DIFCO 241830), Brain Heart Infusion Agar Agar BP-0234-500 citado pela IFU 12:2007).
(OXOID CM 375).
Ágar KF Streptococcus (KF)
Ágar de Isolamento de
Referência(s): Difco & BBL Manual (Zimbro &
Enterobacter sakazakii (ESIA)
Power, 2003), Oxoid Manual (Bridson, 2006),
Referência(s): ISO 22964:2006. Merck Microbiology Manual 12 th Ed. (MERCK,
Aplicação. Meio seletivo diferencial para iso- 2005).

Aplicação. Meio seletivo diferencial para conta- Preparação. Suspender os ingredientes da base,
gem de enterococos e estreptococos fecais em ferver até a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC
alimentos, método APHA 10.5:2015. por 20min. Resfriar a 45-50 ºC, adicionar assepti-
Composição da base camente os suplementos previamente preparados
Proteose peptona 10g Lactose 1g
e plaquear imediatamente, pois o meio completo
Extrato de levedura 10g Azida de sódio 0,4g
não pode ser reaquecido. Solução de sulfato de
Cloreto de sódio polimixina B 10.000IU/ml. Dissolver 500.000
5g Púrpura de bromocresol 0,015g
(NaCl) unidades do sulfato de polimixina em 50 ml de
Glicerofosfato de sódio 10g Ágar 15-20g água purificada, esterilizar por filtração e estocar
Maltose 20g Água purificada 1 litro sob refrigeração. Para determinar o peso de po-
Fervura/5min - pH final 7,2±0,2 limixina necessário para 500.000 unidades, veri-
Suplemento estéril ficar no frasco a potência da polimixina adquiri-
Solução de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio 10 ml/litro de base
da (varia entre as marcas e lotes). Por exemplo,
(TTC) 1% (esterilizada por filtração) (final 0,1g/litro) se a potência for 7.900U/ mg, significa que cada
miligrama tem 7.900 unidades e que são necessá-
Preparação. Suspender os ingredientes da base,
rias 63,29 mg para 500.000 unidades. Emulsão de
ajustar o pH, aquecer até a fusão do ágar. Não au-
gema de ovo. Mergulhar os ovos em etanol 70%
toclavar. Resfriar a 45-50 ºC e adicionar, para cada
por 10 minutos, flambar, abrir assepticamente e
100 ml de meio base, 10 ml de solução aquosa 1% de
transferir as gemas para um frasco estéril tarado.
cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio. Plaquear imediata-
Adicionar às gemas uma quantidade de solução
mente, o meio não deve ser reaquecido. Solução de
salina 0,85% estéril, suficiente para diluição 1:1.
cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio: Dissolver 1g em
Misturar o conteúdo por agitação ou com o auxí-
100 ml de água purificada e esterilizar por filtração.
lio de baguetas estéreis, até obter uma suspensão
Equivalentes comerciais da base. KF Strepto- homogênea.
coccus Agar (DIFCO 249610), KF Streptococ-
Equivalentes comerciais da base. KG Agar Base
cus Agar (OXOID CM 701), KF Streptococcus
(HiMedia M658).
Agar (MERCK 1.10707), KF Streptococcus Agar
Equivalentes comerciais dos suplementos.
(ACUMEDIA 7610).
Polymyxin B Selective Supplement (HiMedia
FD003), Antimicrobic Vial P (Polymyxin B)
Ágar Kim-Goepfert (KG) (DIFCO 232681), Bacillus cereus Selective Su-
pplement (MERCK 1.09875), Bacillus cereus
Referência(s): Compendium 4ª edição (Downes
Selective Supplement (OXOID SR99), Egg Yolk
& Ito, 2001) p. 619.
Emulsion (HiMedia FD045), Egg Yolk Emulsion
Aplicação. Meio seletivo diferencial para a conta- (MERCK 1.03784), Egg Yolk Emulsion (OXOID
gem de B. cereus, método APHA 31.61:2015. SR 47), Egg Yolk Enrichment 50% (DIFCO
Composição da base 233472), Egg Yolk s/Telurito (LABORCLIN
Peptona 1g Ágar 18g 520088).
Água purificada 900 ml
Vermelho de fenol 0,025g
pH 6,8±0,2 - 121 ºC/20min
Ágar Kligler Ferro (KIA)
Suplementos Referência(s): ISO 10273:2003.

Solução de sulfato de polimixina B Aplicação. Meio para prova bioquímica, testes de
10 ml/900 ml base
(10.000IU/ml) utilização da lactose e produção de H2S.
100 ml/900 ml
Emulsão gema de ovo
base

Composição Ágar Levine Eosina Azul de

Extrato de carne 3g Sulfato de ferro (II) 0,2g Metileno (L-EMB)
Extrato de levedura 3g Cloreto de sódio (NaCl) 5g
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M80.
Tiossulfato de sódio
Peptona 15g pentahidratado 0,3g Aplicação. Meio seletivo e diferencial para detec-
(Na2S2O3.5H2O)
ção presuntiva e confirmação de E. coli.
Proteose peptona 5g Vermelho de fenol 0,025g
Composição
Lactose 10g Ágar 9-18g*
Peptona 10g Azul de metileno 0,065g
Dextrose 1g Água purificada 1 litro
Lactose 10g Ágar 15g
pH 7,4±0,2 - 121 ºC/15min
Fosfato dipotássico Água purificada 1 litro
*Depende da força do gel do agar. 2g
(K2HPO4) Eosina amarela (Y) 0,4g
Preparação. Suspender os ingredientes, ajustar 121 ºC/15min – pH final 7,1±0,2
o pH em 7,4 e aquecer até a completa fusão do Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o

ágar. Distribuir em tubos de 10x100mm (5 ml/ pH e esterilizar a 121 ºC/15min. Distribuir em pla-
tubo) e esterilizar a 121 ºC/15min. Inclinar de cas imediatamente, pois não pode ser reaquecido.
forma a obter fundo com no mínimo 2,5cm de
Equivalentes comerciais. Eosin Methylene Blue
comprimento.
Agar Levine (ACUMEDIA 7103), Eosin Me-
Equivalentes Comerciais. Kligler Iron Agar thylene Blue Agar Levine (OXOID CM 69), Le-
(MERCK 1.03913), Kligler Iron Agar (OXOID vine Eosin Methylene Blue Agar (BBL 211221).
CM 33), Kligler Iron Agar (BBL 211317), Kligler
Iron Agar (ACUMEDIA 7140). Ágar Lipovitelenina Sal Manitol
(LSM)
Ágar Leveduras Resistentes aos
Conservantes (PRY) Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) seção
(Preservative Resistant Yeasts Medium) 9213.B.6.c.
Aplicação. Meio seletivo para detecção presun-
tiva de Staphylococcus aureus em água pelo
rello, 2015) p. 924
método de NMP APHA/AWWA/WEF:2012.
Aplicação. Meio para isolamento ou contagem de
Composição
leveduras resistentes aos conservantes.
Polipeptona 10g Vermelho de fenol 0,025g
Extrato de carne 1g Gema de ovo 20g
Manitol 10g Ágar 15g
D-Manitol 10g Ágar 15g
Cloreto de sódio (NaCl) 75g Água purificada 1 litro
121 ºC/15min (não é necessário ajustar o pH)
Suplemento Preparação. Não descrita.
Ácido acético glacial 10 ml por litro de base Equivalentes comerciais (sem a gema de ovo).
Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121 Manitol Salt Agar (OXOID CM 85).
ºC por 15min. Após a esterilização completar o
volume perdido (se necessário). No momento do Ágar Lisina Arginina Ferro (LAIA)
uso, fundir o ágar, resfriar a 45-50 ºC e adicionar Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
o ácido acético, que não precisa ser esterilizado rello, 2015) p. 913.
(concentração final 1%). Plaquear imediatamente,
Aplicação. Meio para provas bioquímicas, teste
o meio não podendo ser reaquecido.
de descarboxilação da lisina/arginina e teste de

produção de H2S. Usado na confirmação de Yer- Ágar Lisina Ferro Duplamente

sinia enterocolitica, método APHA 41:2015. Modificado (DM-LIA)
Composição
Referência(s): MLG (USDA, 2011, 2013).
L-Arginina 10g
Ágar Lisina Ferro (LIA) 1 litro
Aplicação. Meio seletivo diferencial recomenda-
pH 6,8±0,2 - 121 ºC/12min do para isolamento presuntivo de Salmonella,
método MLG/FSIS/USDA 2017.
Preparação. Suspender o LIA na água, conforme
orientação do fabricante, suplementar com o ami- Composição da base
noácido L-arginina, fundir o ágar e distribuir em Ágar Lisina Ferro
34g Tiosulfato de sódio 6,76g
tubos de 13x100mm (5 ml/tubo). Esterilizar a 121 (LIA)
ºC/12min e inclinar. Sais biliares Nº 3 1,5g Citrato férrico

0,3g
Lactose 10g amoniacal
Equivalentes comerciais (LIA): Lysine Iron
Agar (ACUMEDIA 7211), Lysine Iron Agar (BBL Sacarose 10g Água purificada 1 litro
211363), Lysine Iron Agar (DIFCO 284920), Ly- Aquecer até a fervura/10min - pH final 6,7±0,2
sine Iron Agar (MERCK 1.11640), Lysine Iron
Agar (OXOID CM 381). Suplemento
Completo não disponível. Sem a arginina vide Novobiocina 0,015g/l base
Ágar Lisina Ferro (LIA).
Preparação. Suspender os ingredientes da base,
aquecer até a fusão do ágar e ferver por 10min.
Ágar Lisina Ferro (LIA)
Não aquecer acima de 100 ºC. Não autoclavar.
Referência(s): BAM (FDA, 2015a), M89, MLG Resfriar a base a aproximadamente 50 ºC e adi-
(USDA, 2013). cionar a novobiocina a partir de uma solução es-
Aplicação. Meio para provas bioquímicas, teste terilizada por filtração. Plaquear imediatamente, o
de descarboxilação da lisina e teste de produ- meio completo não pode ser reaquecido. Estocar
ção de H2S. por até três semanas.
Composição Equivalentes comerciais da base completa.
Peptona 5g
Double Modified Lysine Iron Agar Base (HiMe-
0,04g dia M1909), Modified Lysine Iron Agar (Hemel).
Extrato de levedura 3g (anidro)
Dextrose 1g
Púrpura de
0,02g
Equivalentes comerciais do LIA. Lysine Iron
bromocresol
Agar (DIFCO 284920), Lysine Iron Agar (BBL
Cloridrato de L-Lisina 10g Ágar 15g
211363), Lysine Iron Agar (MERCK 1.11640),
Citrato férrico amoniacal 0,5g Água purificada 1 litro
Lysine Iron Agar (OXOID CM 381), Lysine Iron
121 ºC/12min - pH final 6,7±0,2
Agar (ACUMEDIA 7211).
Preparação. Suspender os ingredientes, fundir
Equivalentes comerciais do suplemento. Novo-
o ágar, distribuir em tubos de 13x100mm (4 ml/
biocin supplement (HiMedia FD101).
tubo), esterilizar a 121 ºC/12min e inclinar, man-
tendo rampa de 2,5cm e fundo de 4cm, no míni-
mo, porque a reação de descarboxilação da lisina Ágar Listeria
é mais eficiente em condições anaeróbias. Ottaviani & Agosti (ALOA)
Equivalentes comerciais. Lysine Iron Agar
(ACUMEDIA 7211), Lysine Iron Agar (BBL Referência(s): ISO 11290-1:1996 Amd.1:2004,
211363), Lysine Iron Agar (DIFCO 284920), Ly- ISO 11290-2:1998 Amd.1:2004.
sine Iron Agar (MERCK 1.11640), Lysine Iron Aplicação. Meio seletivo diferencial para conta-
Agar (OXOID CM 381). gem ou detecção de Listeria monocytogenes.

Composição da base xina adquirida (varia entre as marcas e lotes). Por

Peptona de tecido exemplo, se a potência for 7.900 IU/ mg, significa
Cloreto de sódio
animal digestão 18g
(NaCl)
5g que cada miligrama tem 7.900 unidades e que são
enzimática
Peptona de caseína
necessárias 9,71 mg para 76.700 unidades.
6g Cloreto de lítio (LiCl) 10g
digestão enzimática Equivalentes comerciais da base. Chromogenic
Fosfato dissódico
anidro (Na2HPO4)
2,5g Listeria Agar (ISO) (OXOID CM1084), Chromo-
Piruvato de sódio 2g X-Glu (5-bromo-4- cult® Listeria Selective Agar Base acc. to Agosti
cloro-3-indolil-β-D- 0,05g & Ottaviani (ALOA) (MERCK 1.00427).
Glicose 2g glicopiranosídeo)
Glicerofosfato de Equivalentes comerciais dos suplementos.
1g Ágar 12-18g*
magnésio OCLA (ISO) Differential Supplement (OXOID
Sulfato de magnésio
0,5g Água purificada 930 ml SR0244 = L-α-phosphatidylinositol), OCLA (ISO)
anidro
121 ºC/15min – pH final 7,2±0,2
Selective Supplement (OXOID SR0226 = anti-
bióticos: ácido nalidixico, ceftazidima, sulfato de
polimixina B, cicloeximida), Listeria Agar En-
Suplementos seletivos estéreis
richment Supplement (MERCK 1.00439.0010 =
L-α-fosfatidilinositol (Sigma P 6636 ou
equivalente) (50 ml da solução aquosa 4%)
2g/l L-α-phosphatidylinositol), Listeria Agar Selecti-
Ácido nalidíxico (sal sódico) ve Supplement (MERCK 1.00432 = antibióticos:
0,02g/l
(5 ml da solução 0,4% em NaOH 0,05 mol/L) ácido nalidixico, ceftazidima, sulfato de polimixi-
Ceftazidima (5 ml da solução aquosa 0,4%) 0,02g/l
na B, cicloeximida).
Sulfato de polimixina B 76.700
(7,67 ml da solução aquosa 10.000 IU) unidades
Cicloeximida (5 ml da solução 1%) 0,02g/l
Ágar MacConkey
Preparação. Preparar a base dissolvendo os in-
Referência(s): SMEWW (Eaton et al., 2005) se-
gredientes com aquecimento, até a completa fusão
ção 9221B.
do ágar. Esterilizar em autoclave (121 ºC/15min).
Resfriar a 50 ºC e adicionar os suplementos. Pla- Aplicação. Meios seletivo diferencial para ente-
quear imediatamente, o meio completo não pode robactérias, é usado no isolamento de Yersinia
ser reaquecido. A aparência deve ser opaca. Es- enterocolitica, método APHA 41:2015.
tocar sob refrigeração por não mais de um mês. Composição
Solução aquosa 4% de L-α-fosfatidilinositol. Dis- Peptona 17g Sais biliares 1,5g
solver 2g em 50 ml de água fria e agitar em agi-
Proteose peptona 3g Vermelho neutro 0,03g
tador magnético por 30min, de forma a obter uma
Lactose 10g Cristal violeta 0,001g
suspensão homogênea. Esterilizar a 121 ºC/15min
e resfriar. Solução 0,4% de ácido nalidíxico. Dis- Cloreto de sódio Ágar 13,5g
5g
solver 0,02g do ácido nalidíxico (sal sódico) em 5 (NaCl) Água purificada 1 litro
ml de NaOH 0,05 mol/L e esterilizar por filtração. 121 ºC/15min – pH final 7,1±0,2
Solução aquosa 0,4% de ceftazidima. Dissolver
0,02g em 5 ml de água e esterilizar por filtração. Preparação: Suspender os ingredientes e aquecer
Solução 1% de cicloeximida. Dissolver 0,05g em até a fusão do ágar. Esterilizar a 121 ºC/15min,
2,5 ml de etanol, adicionar 2,5 ml de água e esteri- resfriar a 45-50 ºC e plaquear imediatamente. O
lizar por filtração. Solução de sulfato de polimixi- pH final deve ser 7,1±0,2.
na B 10.000IU/ml. Dissolver 76.700 unidades do Equivalentes comerciais. MacConkeyAgar (ACU-
sulfato de polimixina em 5 ml de água, esterilizar MEDIA 7102), MacConkey Agar (BBL 211387),
por filtração e estocar sob refrigeração. Para deter- MacConkey Agar (DIFCO 212123), MacConkey
minar o peso de polimixina necessário para 76.700 Agar (MERCK 1.05465), MacConkey Agar Nº 3
unidades, verificar no frasco a potência da polimi- (OXOID CM 115).

Ágar MacConkey Sorbitol Telurito Composição da base

Cefixima (TC-SMAC) Extrato de carne 1g Manitol 10g
Peptona 10g Vermelho de fenol 0,025g
Cloreto de sódio Agar 15g
Aplicação. Meio de plaqueamento seletivo dife- (NaCl)
10g
rencial para a detecção de E. coli O157:H7 em
121 ºC/15min - pH final 7,2±0,2
alimentos, método BAM/FDA.
Composição da base Suplemento
(Agar MacConkey Sorbitol) Solução de sulfato de polimixina B
10 ml/900 ml base
(10.000IU/ml)
Peptona 17g Sais biliares 1,5g
Emulsão gema de ovo 1:1 50 ml/900 ml base
Proteose peptona Nº 3
3g Vermelho neutro 0,03g
ou polipeptona
D-Sorbitol 10g Cristal violeta 0,001g Preparação. Misturar os ingredientes da base,
Cloreto de sódio Ágar 13,5g aquecer até a fusão do ágar e esterilizar 121 ºC por
5g
(NaCl) Água purificada 1 litro 20min. Resfriar a 50 ºC, adicionar assepticamente
121 ºC/15min – pH final 7,1±0,2 os suplementos previamente preparados e plaque-
ar imediatamente, pois o meio completo não pode
Suplementos esterilizados por filtração
ser reaquecido. Secar as placas por 24h à tempe-
Solução alcoólica de cefixima 1 ml/litro base ratura ambiente antes de usar. Solução de sulfato
(50 mg/l em etanol 95%) (final 0,05 mg/l)
0,25 ml/litro base de polimixina B 10.000IU/ml. Dissolver 500.000
Solução aquosa de telurito de potássio 1%
(final 2,5 mg/l) unidades do sulfato de polimixina em 50 ml de
Preparação. Suspender os ingredientes da base, água destilada, esterilizar por filtração e estocar
fundir o ágar e esterilizar a 121 ºC/15min. Resfriar no escuro sob refrigeração (4 ºC). Para determi-
a 45-50 ºC e adicionar os suplementos pré-esteri- nar o peso de polimixina necessário para 500.000
lizados por filtração. Plaquear imediatamente, o unidades, verificar no frasco a potência da polimi-
meio completo não pode ser reaquecido. Solução xina adquirida (varia entre as marcas e lotes). Por
de cefixima. Dissolver o antibiótico em etanol exemplo, se a potência for 7.900U/ mg, signifi-
95% e estocar congelada (-20 ºC) por até um ano. ca que cada miligrama tem 7.900 unidades e que
Solução aquosa de telurito de potássio 1%. Prepa- são necessárias 63,29 mg para 500.000 unidades.
rar da mesma forma descrita no Ágar Baird-Parker Emulsão de gema de ovo. Mergulhar os ovos em
e estocar em geladeira (4 ºC) por até um mês. etanol 70% por 10 minutos, flambar, abrir assepti-
camente e transferir as gemas para um frasco esté-
Equivalentes comerciais da base. MacConkey
ril tarado. Adicionar às gemas uma quantidade de
II Agar with Sorbitol (BBL 299769), MacConkey
solução salina 0,85% estéril, suficiente para dilui-
Sorbitol Agar (DIFCO 279100), MacConkey
ção 1:1. Misturar o conteúdo por agitação ou com
w/ Sorbitol (ACUMEDIA 7320), Sorbitol Mac-
o auxílio de baguetas estéreis, até obter uma sus-
Conkey Agar (OXOID CM 813).
pensão homogênea. Estocar em geladeira (4 ºC).
Equivalentes comerciais dos suplementos. Ce-
fixime-Tellurite Selective Supplement (OXOID Equivalentes comerciais da base. MYP Agar
SR0172), CT-Supplement (MERCK 1.09202). (DIFCO 281010), MYP Agar (MERCK 1.05267),
MYP Agar (OXOID CM 0929).
Ágar Manitol Gema de Ovo Equivalentes comerciais dos suplementos. Anti-
Polimixina (MYP) microbic Vial P (Polymyxin B) (DIFCO 232681),
Bacillus cereus Selective Supplement (MERCK
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M95. 1.09875), Bacillus cereus Selective Supplement
Aplicação. Meio seletivo/diferencial para isola- (OXOID SR99), Egg Yolk Emulsion (MERCK
mento presuntivo de Bacillus cereus. 1.03784), Egg Yolk Emulsion (OXOID SR 47),

Egg Yolk Enrichment 50% (DIFCO 233472), Egg tal de aeróbios mesófilos (heterotróficos) em
Yolk s/Telurito (LABORCLIN 520088). água pelo método de filtração.
Equivalentes comerciais do meio completo (pla- Composição
cas prontas). MYP Ágar B. cereus (LABORCLIN Peptona 20g Ágar 15g
540168 – 10 placas). Gelatina 25g
Água purificada 1 litro
Glicerol 10 ml
Ágar m-Enterococos 121 ºC/5min, pH final pH 7,1±0,2
(Slanetz & Bartley Medium)
Preparação. Misturar os ingredientes, exceto o
Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) section glicerol, aquecer até fusão do ágar, adicionar o
9230C.2.d, ISO 7899-2:2000. glicerol, esterilizar em autoclave a 121 ºC/5min e
Aplicação. Meio para contagem de enterococos distribuir em placas.
e estreptococos fecais em água, método de fil- Equivalentes comerciais. m-HPC Agar (ACU-
tração APHA/AWWA/WEF 9230.C.3.c:2012, MEDIA 7690), m-HPC Agar (DIFCO 275220)
ISO 7899-2:2000. (sem glicerol), Glycerol (DIFCO 228210/228220).
Composição
Triptose 20g Azida sódica (NaN3) a 0,4g
Ágar Motilidade para
Cloreto 2,3,5-trifenilte-
trazólio (TTC) b
0,1g Bacillus cereus
Glicose 2g Ágar 10g Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
Fosfato dipotássico rello, 2015) p.896.
(K2HPO4)
pH 7,2±0,1 - Não autoclavar Aplicação. Meio para teste de motilidade para ce-
pas de B. cereus.
a Cuidado, a azida sódica é tóxica, mutagênica e pode formar compostos
explosivos em contato com metal, devendo ser manuseada com cuidado Composição
(SMEWW).
Fosfato dissódico
b Na formulação descrita pela ISO 7899-2:2000 o TTC é adicionado como Tripticase 10g 2,5g
(Na2HPO4)
suplemento (10 ml/l de uma solução aquosa a 1% esterilizada por
filtração). Extrato de levedura 2,5g Ágar 3g
Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o
121 ºC/15min - pH final 7,4±0,2
pH, adicionar o ágar e aquecer até a completa fu-
são. Não autoclavar. Distribuir em placas imedia- Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o
tamente, pois não pode ser reaquecido. pH, aquecer até a completa fusão do ágar, distri-
Equivalentes Comerciais. Membrane Filter En- buir em tubos de 13x100mm (2 ml/tubo) e esteri-
terococcus Selective Agar Base Slanetz & Bartley lizar a 121 ºC/15min. Não inclinar, o meio deve
(MERCK 1.05289 – não contém TTC, adicionado solidificar na posição vertical. Estocar à tempera-
como suplemento), m-Enterococcus Agar (DIFCO tura ambiente por 2-3 dias antes do uso para me-
274620 – já contém TTC), Slanetz & Bartley Agar lhores resultados.
(OXOID CM 377 – já contém TTC), m-Enterococ- Equivalentes comerciais. Motilidade B. cereus
cus Agar (ACUMEDIA 7544 – já contém TTC). (LABORCLIN 910077) (meio pronto em tubos).
Ágar m-HPC Ágar/Caldo MRS

Referência(s): SMEWW (Hunt et al., 2012) se- (De Man Rogosa & Sharpe)
ção 9215A. Referência(s): Canned Foods Thermal Process-
Aplicação. Recomendado pelo SMEWW (Hunt ing and Microbiology (Hersom & Hulland
et al., 2012) seção 9215D para a contagem to- (1980), ISO 15214:1998.

Aplicação. Meio para cultivo e contagem de bac- Ágar MRS Acidificado Frutose 1%
térias láticas.
Composição
rello, 2015) Cap. 19 e 67.
Peptona de caseína 10g Acetato de sódio 5g
(digestão enzimática) (CH3COONa) Aplicação. A adição de 1% de frutose ao MRS
Extrato de carne 10g Citrato de triamônia 2g acidificado, incubado a 30 ºC, favorece o cres-
Extrato de levedura 4g [(NH4)3C6H5O7] cimento de Lactobaccilus fructivorans e Lac-
Fosfato dipotássico 2g Sulfato de magnésio 0,2g tobacillus plantarum deteriorantes de produtos
(K2HPO4) ( mgSO4.7H2O) vegetais.
Glicose 20g Sulfato de manganês 0,05g
(MnSO4.4H2O)
Preparação. Preparar o meio adicionando 10 ml
Tween 80 1,08g
de uma solução aquosa 10% de frutose (esterili-
Água purificada 1 litro Agar (opcional) 12-18g a
zada por filtração) a 100 ml do ágar MRS (estéril,
121 ºC/15min - pH final 6,2±0,2 b
fundido e resfriado) e ácido acético glacial estéril
a Depende da força de gel do material.
até que o pH chegue a 5,4±0,2.
b Na descrição de Hersom & Hulland (1980) o pH é de 6,2±0,2, mas na
descrição da ISO 15214:1998 é de 5,7±0,1.
Ágar MRS Ácido Sórbico 0,1%
pH e esterilizar a 121 ºC/15min. Para a preparação Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
do meio sólido, fundir o ágar com aquecimento rello, 2015) Cap. 19, ISO 15214:1998.
antes de esterilizar. O pH varia entre os equivalen- Aplicação. A adição de ácido sórbico ao MRS é
tes comerciais, devendo ser ajustado para o valor feita para inibir leveduras. É particularmente
desejado. útil para a contagem de bactérias lácticas de-
Equivalentes comerciais. Lactobacilli MRS Agar teriorantes em produtos cárneos fermentados.
(ACUMEDIA 7543), Lactobacilli MRS Agar Preparação. Para a preparação do meio, ajustar
(DIFCO 288210), Lactobacilli MRS Broth (ACU- o pH do MRS (estéril, fundido e resfriado) em
MEDIA 7406), Lactobacilli MRS Broth (DIFCO 5,7±0,1, com ácido clorídrico 5N. Adicionar então
288130), MRS Agar (MERCK 1.10660), MRS o ácido sórbico (dissolvido em NaOH), na quan-
Broth (MERCK 1.10661), MRS Agar (OXOID tidade necessária para concentração final 0,1%. A
CM 361), MRS Broth (OXOID CM 359), MRS ISO 15214:1998 recomenda a concentração final
(ISO) Agar (OXOID CM1153), MRS Agar (LA- de 0,14% de ácido sórbico para esta finalidade.
BORCLIN 900083) (meio pronto em frasco com
250 ml). Ágar MRS Ácido Sórbico Cisteína
Ágar MRS Acidificado Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-

rello, 2015) Cap. 19.
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- Aplicação. Essa modificação objetiva inibir leve-
rello, 2015) Cap. 19 e 67. duras e bactérias Gram negativas, na contagem
Aplicação. A acidificação do MRS é feita para de bactérias lácticas deteriorantes em produtos
inibir bactérias esporogênicas. Usado no pla- cárneos fermentados.
queamento em profundidade, tem-se mostrado Preparação. Para a preparação do meio, suple-
útil na enumeração de bactérias lácticas dete- mentar o MRS com 0,1% de cloridrato de cisteína
riorantes totais em produtos vegetais. (cisteína-HCl) e esterilizar. Após a esterilização,
Preparação. A acidificação é feita adicionado-se ajustar o pH do meio (fundido e resfriado) em
ácido acético glacial estéril ao ágar MRS já este- 5,7±0,1, com ácido clorídrico. Adicionar então o
rilizado, fundido e resfriado, até que o pH chegue ácido sórbico (dissolvido em NaOH), na quanti-
a 5,5±0,1. dade necessária para concentração final 0,02%.

Ágar MRS Frutose 0,5% Equivalentes comerciais da base. Mueller Hinton

Agar (ACUMEDIA 7101), Mueller Hinton Agar
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- (BBL 211438), Mueller Hinton Agar (DIFCO
rello, 2015) Cap. 53 e 67. 225250), Mueller Hinton Agar (MERCK 1.05435),
Aplicação. A adição de 0,5% de frutose ao MRS, Mueller Hinton Agar (OXOID CM 337).
incubado a 20-28 ºC, favorece o crescimento Equivalentes comerciais sangue carneiro desfi-
de Lactobaccilus fructivorans e Lactobacillus brinado. Sangue carneiro desfibrinado (LABOR-
brevis deteriorantes de maionese e outros mo- CLIN 520209, 521521 ou 520246) (frasco com
lhos para saladas. 15, 20 ou 100 ml).
Preparação. A suplementação é feita adicionan-
do-se 5 ml de uma solução aquosa 10% de frutose Ágar Nitrato Motilidade
(esterilizada por filtração) a 100 ml do ágar MRS
estéril, fundido e resfriado. Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
rello, 2015), p.920.
Aplicação. Confirmação de Clostridium perfrin-
Ágar MRS Modificado
gens (teste de redução do nitrato e teste de mo-
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- tilidade), método de contagem APHA 2001.
rello, 2015) Cap. 19 e 67. Composição
Aplicação. A adição de TTC (cloreto de 2,3,5-tri- Extrato de carne 3g Galactose 5g
feniltetrazólium) ao Ágar MRS facilita a visu- Peptona 5g Glicerol 5g
alização de colônias, que adquirem uma colo- Nitrato de potássio
1g Ágar 3g
(KNO3)
ração vermelha. Fosfato dissódico
Preparação. A preparação é feira adicionando-se (Na2HPO4)
pH 7,4±0,2 - 121 ºC/15min
0,01% de TTC ao Ágar MRS antes da esterilização.
Preparação. Dissolver os ingredientes, exceto o
Ágar Mueller Hinton 5% Sangue ágar, e ajustar o pH em 7,4±0,2.Adicionar o ágar, fun-
dir, distribuir em tubos de 16x125mm (11 ml/tubo),
Referência(s): ISO 10272-1:2006, ISO 10272- esterilizar a 121 ºC/15min e resfriar sem inclinar.
2:2006. Se não for utilizado dentro de quatro horas, desae-
Aplicação. Ágar sangue usado na confirmação de rar antes do uso, fervendo em banho por 10min
Campylobacter, métodos ISO 10272-1:2006, com as tampas desrosqueadas e resfriando ime-
ISO 10272-2:2006. diatamente em banho de gelo.
Composição Equivalentes comerciais. Motilidade Nitrato
Base = Ágar Mueller Hinton* (LABORCLIN 910401) (meio pronto em tubos).
1 litro
(121 ºC/15min, pH final 7,3 ± 0,2)
Suplemento = Sangue de carneiro desfibrinado estéril 50 ml Ágar/Caldo Nutriente (NA/NB)
* Composição do Ágar Mueller Hinton(g/l): Referência(s): Manual da Difco & BBL (Zimbro
peptona de tecido de animal (digestão enzimática) = 6g,
peptona de caseína (digestão enzimática) = 17,5g, & Power, 2003).
amido solúvel = 1,5g, ágar = 8 a 18g (dependendo da força do gel).
Aplicação. Meio de uso geral para manutenção
Preparação. Suspender o Ágar Mueller Hinton de bactérias.
na água, aquecer até a fusão do ágar e esterilizar Composição do caldo
a 121 ºC/15min. O pH final deve ser 7,3 ± 0,2. Extrato de carne 3g
Resfriar a 47-50 ºC, adicionar o sangue de car- Peptona 5g
neiro e misturar. Plaquear imediatamente, o meio Água purificada 1 litro
completo não pode ser reaquecido. 121 ºC/15min – pH final 6,8±0,2

Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o Composição

pH e esterilizar a 121 ºC/15min. Para a preparação Peptona 3g Caseína solúvel 0,5g
do ágar, adicionar 15g de ágar para cada litro de Fosfato dipotássico
0,2g
Cloreto férrico (FeCl3) 0,001g
(K2HPO4) Ágar 15g
meio e aquecer até a completa fusão do ágar antes
da esterilização. mgSO4)
Equivalentes comerciais. Lab-Lemco Agar 121 ºC/15min, pH final 7,2±0,2

(OXOID CM 17), Lab-Lemco Broth (OXOID Preparação. Misturar os ingredientes e ajustar o
CM 15), Nutrient Agar (ACUMEDIA 7145), pH. Aquecer até fusão do ágar, esterilizar em au-
Nutrient Agar (DIFCO 213000), Nutrient Agar toclave a 121 ºC/15min.
(MERCK 1.05450), Nutrient Broth (ACUMEDIA
7146), Nutrient Broth (DIFCO 234000), Nutrient
Broth (MERCK 1.05443), Nutrient Agar (LA-
BORCLIN 912006) (placas prontas).
Ágar Oxford (OXA)
Ágar Oxford Modificado (MOX)
Ágar Nutriente Azul de Tripano Referência(s): ISO 11290-1:1996, MLG (USDA,

2013).
Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) seção 9218B.
Aplicação. Meios seletivos diferenciais para iso-
Aplicação. Contagem de esporos de aeróbios me- lamento de L. monocytogenes.
sófilos em água, método 9218 da 22ª edição
do Standard Methods for the Examination of Composição da base (OXA e MOX)
Water and Wastewater (Hunt, 2012). Citrato férrico
Peptona 23g 0,5g
Ágar Columbia
amoniacal
Sangue (Base)
Preparação. É preparado suplementando o Ágar Amido 1g Cloreto de lítio 15g

Nutriente com 0,015g/l de azul de tripano, antes Cloreto de sódio
5,0 Esculina 1g
da esterilização. O pH final deve ser 6,8±0,2 e (NaCl)
Ágar 9-18g* Água purificada 1 litro
pode ser estocado em geladeira por 20 dias.
121 ºC/15min - pH final 7,0±0,2
*Depende da força de gel do ágar.
Ágar Nutriente Manganês (ANMn)
Suplemento estéril OXA
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- Cicloeximida 400 mg/l base
rello, 2015) p.921. Sulfato de colistina 20 mg/l base
Aplicação. Meio para esporulação de bactérias Cloridrato de acriflavina 5 mg/l base
esporogênicas aeróbias, usado no teste de es- Cefotetan 2 mg/l base
terilidade comercial. Fosfomicina 10 mg/l base
Preparação. Dissolver 3,08g de sulfato de man- Suplemento estéril MOX

ganês (MnSO4) em 100 ml de água purificada e Sulfato de colistina 10 mg/l base
adicionar 1 ml desta solução a um litro de Ágar Moxalactam 20 mg/l base
Nutriente, antes da esterilização. O pH final deve
Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121 ºC
ser 6,8±0,2.
por 15min. Resfriar a 50-60 ºC e adicionar assep-
ticamente o suplemento estéril, disponível comer-
Ágar NWRI (HPCA) cialmente na forma liofilizada. Plaquear imediata-
Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) seção 9215A. mente, o meio completo não pode ser reaquecido.
Aplicação. Método de plaqueamento APHA/ Equivalentes comerciais da base. Listeria Selec-
AWWA/WEF:2012 para contagem de bacté- tive Agar (Oxford Formulation OXOID CM 856),
rias heterotróficas (contagem total de aeróbios Oxford Listeria Agar Base (ACUMEDIA 7428),
mesófilos) em água. Oxford Listeria Selective Agar Base (MERCK

1.07004), Oxford Medium Base (DIFCO 222530), Ágar Padrão para Contagem (PCA)
Oxford Ágar p/ Listeria Base (LABORCLIN Standard Methods Agar (SMA)
Tryptone Glucose Yeast Extract Agar
900086) (base pronta em frasco de 200 ml).
Equivalentes comerciais dos suplementos do Referência(s): Manual Difco & BBL (Zimbro &
OXA. Listeria Selective Supplement (Oxford Power, 2003).
Formulation OXOID SR 140), Oxford Antimicro- Aplicação. Meio de enriquecimento, manutenção
bic Supplement (DIFCO 211755), Oxford Liste- e contagem total de bactérias.
ria Selective Supplement (MERCK 1.07006).
Composição
Equivalentes comerciais dos suplementos do
Triptona 5g Ágar 15g
MOX. Modified Oxford Antimicrobic Supple-
ment (DIFCO 211763). Água purificada 1 litro
Dextrose 1g
Equivalentes comerciais do MOX completo em
placas prontas. MOX Ágar p/ Listeria (LABOR- 121 ºC/15min, pH final 7,0±0,2
CLIN 910014).
Equivalentes comerciais. Plate Count Agar
(DIFCO 247940), Plate Count Agar (MERCK
Ágar Oxoid Listeria Cromogênico 1.05463), Plate Count Agar (OXOID CM 325),
(OCLA) Standard Methods Agar (BBL 211638), Standard
Referência(s): BAM/FDA (Hitchins et al., 2016). Methods Agar (ACUMEDIA 7157), Plate Count
Agar (LABORCLIN 542566) (placas prontas),
Aplicação. Meio seletivo diferencial cromogêni-
Plate Count Agar (LABORCLIN 910107) (meio
co para Listeria monocytogenes.
pronto em frasco com 100 ml).
Composição. OCLA é um meio de cultura cro-
mogênico cuja exata formulação é confidencial Ágar Padrão para Contagem (PCA)
(propriedade dos fabricantes). É produzido pela
Suplementado com Amido Solúvel
Thermo Scientific e a descrição encontra-se no
site http://www.rf-labs.com/index.ht ml [acesso Referência(s): SMEDP (Wher & Frank, 2004).
em 21/10/2016]. Aplicação: Recomendado para a contagem de es-
Peptona de tecido animal Glicerofosfato de poros de bactérias mesófilas aeróbias, método
18g 1g
(digestão enzimática) magnésio descrito no item 8.090 do Capítulo 8 do Stan-
Peptona de caseína Sulfato de magnésio
6g
anidro
0,5g dard Methods for the Examination of Dairy
Extrato de levedura 10g Fosfato dissódico anidro 2,5g
Products (Wehr & Frank, 2004).
Mistura de cromógenos Preparação. Adicionar 1g de amido solúvel a um
Cloreto de sódio (NaCl) 5g 0,05g
X-glicosideos a litro de PCA, antes da esterilização.
Piruvato de sódio 2g Ágar 12g
Glicose 2g Água purificada 1 litro Ágar Padrão para Contagem (PCA)

121 ºC/15min - pH final 7,2±0,2 Suplementado com Cloranfenicol
a A composição da mistura de substratos cromogênicos é confidencial (pro-
priedade dos fabricantes).
rello, 2015) p.
Equivalente comercial. Ágar OXOID Listeria
Aplicação: Recomendado no Compendium para a
Cromogênico (OCLA OXOID CM 1084).
contagem de fungos psicrotróficos em alimentos.
Preparação. Para a preparação do meio, adicio-
nar 100 mg de cloranfenicol a um litro de PCA,
antes da esterilização.

Ágar Palcam domonas spp em leite e produtos lácteos, mé-

todo ISO 11059:2009.
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M118a, ISO
11290-1:1996.
Peptona de gelatina Cloreto de magnésio
Aplicação. Meio seletivo diferencial para isola- 16g 1,4g
(digestão enzimática) (MgCl2)
mento de L. monocytogenes. Peptona de caseína
10g Ágar
12 a
(digestão enzimática) 18g*
Composição da base* Sulfato de potássio
Peptona 23g Citrato férrico amoniacal 0,5g (K2SO4)
121 ºC/15min - pH final 7,2±0,2
Amido 1g Cloreto de lítio 15g
Cloreto de sódio Vermelho de fenol 0,08g
(NaCl)
5g
Ágar 13g Suplementos
Manitol 10g Esculina 0,8g Solução aquosa 105 IU/ml de 1 ml por litro de base
penicilina G (sal potássico) (final 100.000 IU por litro)
Dextrose 0,5g Água purificada 1 litro
Solução de aquosa 1% de 1 ml por litro de base
121 ºC/15min - pH final 7,2±0,2 pimaricina (natamicina) (final 0,01g por litro)
*Na formulação descrita pela ISO 11290-1:1996 consta ainda 3g de extrato
de levedura.
Preparação. Preparar a base dissolvendo os in-
gredientes com aquecimento, até a completa fusão
Suplemento estéril
do ágar. Esterilizar em autoclave (121 ºC/15min),
Sulfato de polimixina 10 mg/l base
resfriar entre 44 e 47 ºC e adicionar os suplemen-
Acriflavina 5 mg/l base
tos, cuja concentração final no meio é de 100.000
Ceftazidima 20 mg/l base
IU/l (penicilina G) e 0,01g/l (pimaricina). Plaque-
Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121 ºC ar imediatamente, o meio completo não pode ser
por 15min. Resfriar a 50-60 ºC e adicionar assep- reaquecido. Estocar as placas sob refrigeração
ticamente o suplemento estéril, disponível comer- (5±3 ºC), ao abrigo da luz, por não mais de um
cialmente na forma liofilizada. Plaquear imediata- dia. Solução aquosa de penicilina G. Dissolver 106
mente, o meio completo não pode ser reaquecido. unidades em 10 ml de água destilada e esterilizar
Equivalentes comerciais da base. Palcam Agar por filtração. Estocar sob refrigeração (5±3 ºC)
Base (OXOID CM 877), Palcam Agar Base por até uma semana ou em alíquotas congeladas
(ACUMEDIA 7669), Palcam Listeria Selective (-20 ºC) por até seis meses. Solução aquosa 1%
Agar Base acc Van Netten (MERCK 1.11755), de pimaricina. Dissolver 0,1g em 10 ml de água
Palcam Medium Base (DIFCO 263620), Oxford destilada e esterilizar a 110 ºC/20min. A solução
Ágar p/ Listeria Base (LABORCLIN 900086) não é estável e deve ser mantida ao abrigo da luz.
(base pronta em frasco de 200 ml). Usar no mesmo dia da preparação ou estocar em
alíquotas congeladas (-20 ºC) por até seis meses.
Equivalentes comerciais dos suplementos. PAL-
Equivalentes comerciais da base. Pseudomonas Se-
CAM Selective Supplement (OXOID SR 150), PAL-
lective Agar Base (MERCK 1.07620), Pseudomonas
CAM Antimicrobic Supplement (DIFCO 263710),
Agar Base (OXOID CM 559), Penicillin and Pimari-
PALCAM Listeria Selective Supplement ACC
cin Pseudomonas Agar Base (HiMedia M1788)
VAN NETTEN (MERCK 1.12122), PALCAM
Equivalentes comerciais dos suplementos. PP
Supplement (ACUMEDIA 7987).
Pseudomonas Selective Supplement (penicillin) e
Equivalentes comerciais em placas prontas.
PP Pseudomonas Selective Supplement II (pima-
Palcam Agar (LABORCLIN 540176).
ricin) (HiMedia).
Ágar Penicilina Pimaricina (PPA) Ágar Pirazinamidase

Referência(s): ISO 11059:2009. Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
Aplicação. Meio seletivo para contagem de Pseu- rello, 2015) p.925, ISO 10273:2003.

Aplicação. Meio para teste de atividade da enzi- Suplemento CN

ma pirazinamidase, usado na confirmação de Cetrimida (brometo de
0,2g por litro de base
Y. enterocolitica, métodos ISO 10273:2003 e hexadeciltrimetil amônio)
APHA 41:2015. Ácido nalidíxico 0,015g por litro de base
Composição Preparação: Suspender os ingrediente da base,

Ágar Tripticase de
*
Pirazina carboxamida
1g fundir o ágar e esterilizar a 121±3 ºC/15min. Res-
Soja (TSA) (C5H5N3O)
Tampão tris maleato
friar a 45-50 ºC e adicionar o suplemento, disponí-
Extrato de levedura a 3g 1 litro vel comercialmente na forma liofilizada. Plaquear
0,2M pH 6,0
121 ºC/15min – pH final 6,6±0,2 a imediatamente porque o meio completo não pode
* Quantidade necessária para preparar um litro, conforme orientação do ser reaquecido. Estocar em geladeira (5±3 ºC) ao
fabricante do meio.
a Na formulação da ISO 10273 não há extrato de levedura e o pH final é
abrigo da luz por até um mês.
7,3±0,2. Equivalentes comerciais (base): Pseudomonas
Preparação. Suspender os ingredientes no tam- Agar Base (OXOID CM 559), Pseudomonas Se-
pão tris maleato e aquecer atá a fusão do agar. lective Agar Base (MERCK 1.07620)
Distribuir em tubos (o Compendium recomenda 5 Equivalentes comerciais (suplemento CN):
ml em tubos 16x125mm e a ISO 10273 recomen- Pseudomonas CN Selective Supplement (OXOID
da 10 ml/tubo). Esterilizar a 121 ºC/15min e incli- SR 0102), Pseudomonas CN Selective Supple-
nar com rampa longa. Tampão tris maleato 0,2M ment (MERCK 1.07624.0001)
pH 6.0. Preparar solução estoque a 0,2M dissol-
vendo 24,2g do tris (hidroximetilaminometano) e Ágar R2A
23,2g de ácido maleico (HO2CCH:CHCO2H, peso
molecular 116,07) em água purificada, usando o Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) seção 9215A.
volume de água requerido para o preparo de um Aplicação. Método de plaqueamento para con-
litro. Preparar o tampão de trabalho ajustando 50 tagem de bactérias heterotróficas (contagem
ml da solução estoque para pH 6,0 com NaOH total de aeróbios mesófilos) em água, método
0,2M (aproximadamente 26 ml) e diluir para APHA/AWWA/WEF:2012.
200 ml com água. NaOH 0,2M. Dissolver 8g de Composição
NaOH em água usando o volume requerido para Fosfato dipotássico
Extrato de levedura 0,5g 0,3g
preparar um litro. (K2HPO4)
Proteose peptona Nº 3 Sulfato de magnésio (
Equivalentes comerciais. Completo não dispo- ou polipeptona
0,5g
mgSO4.7H2O)
0,05g
nível. Casaminoácidos 0,5g Piruvato de sódio 0,3g
Glicose 0,5g Ágar 15g

Ágar Pseudomonas CN Amido solúvel 0,5g Água purificada 1 litro
Referências(s): ISO 16266:2006. 121 ºC/15min, pH final pH 7,2±0,2
Aplicação: Meio para contagem de Pseudomonas Preparação. Misturar os ingredientes, aquecer

aeruginosa em água, método ISO 16266:2006. até fusão do ágar, esterilizar em autoclave a 121
Composição (base) ºC/15min.
Peptona de gelatina 16g Glicerol 10 ml Equivalentes comerciais. R2A Agar (ACUME-
Sulfato dipotássico
10g Peptona de caseína 10g DIA 7390), R2A Agar (DIFCO 218263), R2A
anidro (K2SO4)
Cloreto de magnésio Ágar 11 a 18g*
Agar MERCK 1.00416), R2A Agar (OXOID CM
1,4g 906).
anidro (MgCl2) Água purificada 1 litro
121 ºC/15min, pH final 7,1±0.2
* Depende da força de gel do material usado.

Ágar Rainbow O157 Composição

Referência(s): BAM/FDA (Feng et al., 2016). Triptona 10g 6g
(KH2PO4)
Aplicação. Meio seletivo diferencial cromogêni- Extrato de levedura 5g Sulfato de magnésio 0,57g
co para E. coli O157. Dextrose 10g Sulfato de manganês 0,12g

Arabinose 5g Sulfato ferroso 0,03g
Composição: Rainbow® é uma marca registrada
Sacarose 5g Sorbitano monooleato 1g
de vários meios de cultura cromogênicos, cujas
Acetato de sódio 15g Ágar (opcional) 15g
formulações são confidenciais (propriedade dos
Citrato de amônia 2g Água purificada 1 litro
fabricantes). São produzidos pela Biolog (http://
pH 5,4±0,2 - fervura 2-3 minutos
www.biolog.com/index.php).
Preparação. Dissolver os ingredientes e ferver por
um minuto com frequente agitação para dissolver
Ágar Rapid’L.mono
o ágar. Adicionar 1,32 ml de ácido acético glacial
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M131a para cada litro de meio e continuar a fervura por
Aplicação. Meio seletivo diferencial cromogêni- mais dois a três minutos. Não autoclavar. Utilizar
co para Listeria monocytogenes. imediatamente, o meio acidificado não pode ser
reaquecido. O pH final deve ser 5,4±0,2 a 25 ºC.
Composição: Rapid’L.mono é uma marca regis-
trada de meio de cultura cromogênico, cuja exata Equivalentes comerciais. Rogosa SL Agar (DIF-
formulação é confidencial (propriedade dos fabri- CO 248020), Rogosa SL Broth (DIFCO 247810),
cantes). É produzido pela BioRad (http://www.bio- Rogosa Agar (OXOID CM 627), Rogosa Agar
-rad.com/pt-br/product/rapidl-mono-medium/). (MERCK 1.05413).
Peptona 30g Vermelho de fenol 0,12g
Extrato de carne 5g Suplemento seletivo a 20 ml
Ágar Salmonella Shigella
Substrato Desoxicolato (SSDC)
Extrato de levedura 1g 1 ml
cromogênico a
Cloreto de lítio 9g Ágar B a 13g Referência(s): ISO 10273:2003.
D-xilose 10g Água purificada 1 litro Aplicação. Meio seletivo diferencial para isola-
121 ºC/15min, pH final pH 7,3±0,1 mento de Yersinia enterocolitica em alimen-
a A composição é confidencial (propriedade dos fabricantes). tos, método ISO 10273:2003.
Composição
Ágar R&F O157 Ágar Salmonella 1 litro Desoxicolato de sódio 10g
Shigella (SS) a
Referência(s): BAM/FDA (Feng et al., 2016). Extrato de levedura 5g Cloreto de cálcio 1g
Aplicação. Meio seletivo diferencial cromogêni- Fervura - pH final 7,4±0,2 b
co para E. coli O157. a Formulação do Ágar Salmonella Shigella (SS) (g/l): Extrato de carne = 5g,
Peptona de carne (digestão enzimática) = 5g, Lactose = 10g, Sais bilia-
Composição: R&F® é uma marca registrada de vá- res = 8,5g, Citrato de sódio = 10g, Tiossulfato de sódio (Na2S2O3.5H2O)
rios meios de cultura cromogênicos, cujas formula- = 8,5g, Citrato férrico = 1g, Verde brilhante = 0,3 mg, Vermelho neutro
= 25 mg, Ágar = 9 a 18g (depende da firmeza do gel).
ções são confidenciais (propriedade dos fabricantes). b O pH dos equivalentes comerciais do SS é 7,0±0,2.
São produzidos pela R&F Laboratories, Downers
Grove, IL (http://www.rf-labs.com/index.html).
pH, ferver até a completa fusão do ágar e plaquear
imediatamente. Não autoclavar.
Ágar/Caldo Rogosa SL
Equivalentes Comerciais (completo). Yersinia
Referência(s): Manual Difco & BBL (Zimbro & Selective Agar Wauters (MERCK 11443)
Power, 2003) Equivalentes Comerciais (SS). Salmonella Shi-
Aplicação. Meio para cultivo de bactérias láticas. gella (SS) Agar (DIFCO 274500), Salmonella

Shigella (SS) Agar (MERCK 1.07667), Salmo- Preparação. Preparar a base, esterilizar a 121 ºC
nella Shigella (SS) Agar (OXOID CM 99). por 15min e distribuir em placas. Reservar uma
porção da base, para a preparação da sobrecama-
Ágar Sangue Nº 2 da. A essa porção reservada (fundida e resfriada a
46 ºC), adicionar 4% de sangue de cavalo e distri-
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M22, ISO
buir 5-6 ml sobre as placas da base previamente
11290-1:1996, ISO 11290-2:1998.
preparadas, em sobrecamada. O pH final deve ser
Aplicação. Ágar sangue para verificação de he- 7,2±0,2. Estocar as placas em geladeira por até 2
mólise, usado na confirmação de Bacillus ce- semanas.
reus e Listeria monocytogenes.
Equivalentes comerciais da base. Columbia
Agar Base (BBL 211124), Columbia Agar Base
Proteose peptona a 15g Cloreto de sódio (NaCl) 5g
(MERCK 1.10455), Columbia Blood Agar Base
Fígado digerido 2,5g Ágar 12g
(ACUMEDIA 7125), Columbia Blood Agar Base
(DIFCO 279240), Columbia Blood Agar Base
121 ºC/15min - pH 7,4±0,2 b
(OXOID CM 331).
a A ISO 11290-1:1996 especifica peptone de carne (15g) e a ISO 11290-
2:1998 especifica digestão enzimática de tecido animal (15g).
b ISO 11290-1:1996 e ISO 11290-2:1998 especificam final pH 7,2±0,2 Ágar Selo
Suplemento Referencias(s). Compendium (Salfinger & Torto-
Sangue de carneiro desfibrinado 5 ml/100 ml base rello, 2015).
Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121 ºC Aplicação. Ágar para selar tubos de cultura de
por 15min. Resfriar a 45-50 ºC e adicionar, para microrganismos anaeróbios.
cada 100 ml de base, 5 ml de sangue de carneiro Composição
desfibrinado. Plaquear imediatamente. Ágar 2g
Equivalentes comerciais da base. Blood Agar Água purificada 100 ml
Base Nº 2 (DIFCO 269620), Blood Agar Base 121 ºC/15min
Nº 2 (OXOID CM 271), Blood Agar Base Nº 2 Preparação. Aquecer até a fusão do ágar e esteri-
(ACUMEDIA 7266), Blood Ágar Base (Infusion lizar a 121 ºC/15 min.
Ágar) (BBL 211037).
Equivalentes comerciais sangue carneiro desfi- Ágar Selo Tioglicolato
brinado. Sangue carneiro desfibrinado (LABOR-
CLIN 520209, 521521 ou 520246) (frasco com Referência(s): SMEDP (Wehr & Frank, 2004) se-
15, 20 ou 100 ml). ção 8.100.
Aplicação. Usado para selar tubos de cultura na
Ágar Sangue de Cavalo análise de esporos de mesófilos anaeróbios em
em Sobrecamada (HL) leite fluído e queijos, segundo o método 8.100
do Standard Methods for the Examination of
Referência(s): MLG (USDA, 2013). Dairy Products (Wehr & Frank, 2004).
Aplicação: Utilizado para confirmação de L. mo- Composição
nocytogenes, método MLG/FSIS/USDA. Ágar 2g
Composição Tioglicolato de sódio 0,1g
Ágar Sangue Columbia (Base)* 1 litro Água purificada 100 ml
Sangue de cavalo 4% 120±1 ºC/15min
* Formulação do Ágar Sangue Columbia (Base): Peptona de caseína = 10g,

Proteose peptona = 5g, Extrato de levedura = 5g, Peptona de carne = 3g,
Preparação. Suspender os ingredientes, aquecer
Amido = 1g, NaCl = 5g, Ágar = 15g. até a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC/15 min.

Ágar (Caldo) Soro de Laranja 1.05470), SIM Medium (OXOID CM 435), SIM
(OSA/OSB) Medium (BBL 211578), SIM Medium (ACUME-
DIA 7221), SIM Medium (LABORCLIN 910059)
Referência(s): Canned Foods Thermal Processing (meio pronto em tubos).
and Microbiology (Hersom & Hulland (1980).
Aplicação. Meio para isolamento e contagem de
Ágar Sulfito
bactérias láticas e contagem total de aeróbios me-
sófilos em frutas cítricas, métodos APHA 2015. Referência(s): OMA/AOAC (Latimer, 2012) Ca-
Composição pítulo 17 p. 113.
Soro de laranja 200 ml Fosfato dipotássico Aplicação. Meio para cultivo de bactérias anaeró-
3g
Triptona 10g (K2HPO4) bias, usado na detecção de esporos de bactérias
Extrato de levedura 3g Ágar (opcional) 15g anaeróbias termófilas produtoras de H2S, mé-
Glicose 4g Água purificada 800 ml todo APHA 28:2015.
121 ºC/15min - pH 5,5±0,2 Composição
Preparação. Dissolver os ingredientes em 800 Triptona 10g Ágar 20g
ml de água (ou meio completo desidratado em um Sulfito de sódio anidro
litro de água), ajustar o pH, aquecer até a fusão (Na2SO3)
121 ºC/20min
do ágar (se presente) e esterilizar a 121 ºC/15min.
Plaquear imediatamente, o meio não deve ser rea- Preparação. Dissolver os ingredientes, aquecer
quecido. Para preparar o caldo, omitir o ágar. Suco até a completa fusão do ágar e distribuir em tubos
de laranja: Extrair um litro de suco de laranja a 93 de 20x180mm (15 ml/tubo) contendo um prego de
ºC. Filtrar com o auxilio de um funil de Buchner ferro limpo no fundo. Não é necessário ajustar o
Equivalentes comerciais. Orange Serum Agar pH. Esterilizar a 121 ºC/20min. Alternativamente,
(ACUMEDIA 7587), Orange Serum Agar (BBL no lugar do prego, adicionar 0,5g de citrato férrico
211486), Orange Serum Agar (MERCK 1.10673), por litro de meio, antes da esterilização. As formu-
Orange Serum Agar (OXOID CM 657), Orange lações dos equivalentes comerciais não são exata-
Serum Broth 10x concentrado (DIFCO 251810). mente iguais e, para a preparação, deve ser seguida
a orientação dos fabricantes. O meio da OXOID
Ágar Sulfeto Indol Motilidade (SIM) (CM 79) já contém citrato férrico, não exigindo a
presença do prego. Os meios da DIFCO (297210)
Referência(s): BAM (FDA, 2015a), M137. e MERCK (1.10864) não contêm ferro.
Aplicação. Meio para provas bioquímicas, testes Equivalentes comerciais. Iron Sulfite Agar
de motilidade, indol e produção de H2S. (OXOID CM 79) (já contem citrato férrico), Sul-
Composição fite Agar (DIFCO 297210) (não contem citrato
Peptona de caseína férrico), Sulfite Iron Agar (MERCK 1.10864)
20g Tiossulfato de sódio 0,2g
(digestão pancreática) (não contem citrato férrico).
Peptona de tecido animal
6,1g Ágar 3,5g
(digestão péptica)
Sulfato ferroso
0,2g Água purificada 1 litro Ágar Sulfito Ferro
amoniacal
121 ºC/15min - pH final 7,3±0,2 Referência(s). ISO 6461-2:1986.
Preparação. Dissolver os ingredientes, aquecer Aplicação. Meio para cultivo de bactérias anaeró-
até a completa fusão do ágar, distribuir em tubos bias, usado na contagem de esporos de clos-
de 10x100mm (6 ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC trídios sulfito redutores em água, método ISO
por 15min. Não inclinar. 6461-2:1986.
Equivalentes comerciais. SIM Medium (MERCK Composição da base

Extrato de carne 3g Ágar 15g Proteose peptona 5g Fosfato dipotássico

4g
Extrato de levedura 5g (K2HPO4)
Peptona 10g
Água purificada 1 litro Dextrose 5g Água purificada 1 litro
Cloreto de sódio 5g
121 ºC/15min - pH final 5,0±0,2
120±1 ºC/20min - pH final 7,6±0,1
Suplemento pH e distribuir 10 ml em tubos de 20x150mm e
Solução aquosa 10% de sulfito de sódio esterilizar a 121 ºC/15min. Para a preparação do
1 ml para cada
(Na2SO3) (usar no máximo por duas semanas e
18 ml de base* ágar, adicionar 20g de ágar para cada litro de cal-
então descartar)
do e esterilizar.
5 gotas para cada
Solução aquosa 8% de sulfato ferroso (FeSO4)
18 ml de base* Equivalentes comerciais do ágar. Thermoacidu-
*Na descrição da norma o meio é distribuído em tubos (18 ml/tubo) para de- rans Agar (DIFCO 230310).
pois ser vertido nas placas, um tubo por placa. Entretanto, nada impede
que seja preparado em porções maiores.
Preparação. Dissolver os ingredientes, aquecer

Ágar Tiossulfato Citrato
até a completa fusão do ágar e esterilizar a 120±1 Bile Sacarose (TCBS)
ºC/20min. Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M147, ISO
21872-1:2007.
Ágar (Caldo) T1N0 - T1N1 - T1N3 Aplicação. Meio seletivo diferencial para isola-
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- mento de V. cholerae e V. parahaemolyticus.
rello, 2015) p.928. Composição
Aplicação. Meio para manutenção de V. cholerae, Peptona 10g Cloreto de sódio
10g
método APHA 40.61/62:2015. Extrato de levedura 5g (NaCl)
Sacarose 20g Citrato férrico 1g
Composição
Tiossulfato de
Tripticase 10g Azul de bromotimol 0,04g
Ágar (não incluir no sódio 5H2O
(hidrolisado de caseína, 10g 15g Citrato de sódio.2H2O 10g Azul de timol 0,04g
preparo do caldo)
digestão pancreática)
Colato de sódio* 3g Ágar 15g
Cloreto de sódio (NaCl) * Água purificada 1 litro
Bile de boi
121 ºC/15min - pH final 7,1±0,2 (Oxgall ou Oxbile)*
Fervura (não autoclavar) - pH final 8,6±0,2
* Para o T1N3 use 30g de NaCl; para o T1N1 use 10g de NaCl e para o T1N0
não adicione NaCl. * A ISO 21872-1:2007 recomenda 8g de bile de bois e não inclui o colato
de sódio.
Preparação. Suspender os ingredientes ou o meio
pH e ferver até a completa fusão do ágar. Distri-
completo desidratado em água purificada. Aque-
buir em tubos, esterilizar a 121 ºC/15min e incli-
cer até a fervura para completa fusão do ágar.
nar. Para a preparação do caldo, omitir o agar.
Não autoclavar. Plaquear imediatamente porque o
Equivalentes comerciais. Não disponível. meio não pode ser reaquecido.
Equivalentes comerciais. Cholera Medium
Ágar/Caldo Thermoacidurans TCBS (OXOID CM 333), TCBS Agar (ACUME-
(TAA/TAB) DIA 7210), TCBS Agar (DIFCO 265020), TCBS
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- Agar (MERCK 1.10263).
rello, 2015) p.928.
Ágar Tirosina
Aplicação. Meio para detecção de Bacillus coa-
gulans e outras bactérias esporogênicas acidú- Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
ricas. rello, 2015) p. 932.
Composição do caldo Aplicação. Confirmação de Bacillus cereus.

Composição Ágar Tripticase de Soja (TSA)

Agar Nutriente (NA) estéril
(121º C/15min - pH 7,0±0,2)
100 ml Referência(s): MLG (USDA, 2013), BAM (FDA,
Suspensão aquosa 5% de L-tirosina estéril 2015a), ISO 22964:2006, ISO 10273:2003,
10 ml
(121º C/15min) ISO 11290-1:1996, ISO 11290-2:1998.
Preparação. Esterilizar separadamente o Ágar Aplicação. Meio de enriquecimento e manuten-
Nutriente e a suspensão de tirosina, a 121 ºC por ção para uso geral.
15min. Juntar assepticamente, distribuir em tubos Composição
estéreis de 10x100mm (3,5 ml/tubo) e inclinar. Cloreto de sódio (NaCl) 5g
Peptona de caseína
15g
Equivalentes comerciais. Tirosina Agar (LA- (digestão enzimática) Ágar 15g*
BORCLIN 910400) (meio pronto em tubos). Peptona de soja
121 ºC/15min - pH 7,3±0,2
Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)
*De acordo com ISO a quantidade de agar varia entre 9 e 18g dependendo da
força do gel.
Referência(s): BAM (FDA, 2015a), MLG (USDA,
2013), ISO 6579:2002. Preparação. Suspender os ingredientes, fundir o
ágar e esterilizar a 121 ºC/15min.
Aplicação. Meio para prova bioquímica, confir-
mação de Salmonella, métodos BAM/FDA, Equivalentes comerciais. Trypticase Soy Agar
MLG/FSIS/USDA, ISO 6579. (BBL 211043), Tryptic Soy Agar (ACUMEDIA
7100), Tryptic Soy Agar (DIFCO 236950), Tryp-
Composição
tic Soy Agar (Caso Agar) (MERCK 1.05458),
Extrato de carne 3g Sulfato ferroso Tryptone Soya Agar (OXOID CM 131).
0,2g
Extrato de levedura 3g (FeSO4)**
Modificações
Peptona* 15g Cloreto de sódio
5g
Proteose peptona* 5g (NaCl) Ágar Tripticase de Soja com 2-3% de NaCl. Usa-
do na análise de V. parahaemolyticus, é preparado
Glicose 1g Tiossulfato de sódio
0,3g aumentando a concentração de sal para 20 a 30g/l,
Lactose 10g (Na2S2O3)
antes da esterilização do meio. O TSA já contém
Sacarose 10g Vermelho de fenol 0,024g 5g/l de NaCl.
Água purificada 1 litro Ágar 12g Ágar Tripticase de Soja Extrato de Levedura
121 ºC/15min - pH final 7,4±0,2 (TSA-YE). Usado na análise de L. monocytogenes
*ISO 6579:2002 usa somente peptona (20g).
e E. coli O157:H7, é preparado adicionando 6g/l
**ISO 6579:2002 especifica citrato férrico (0,3g). (0,6%) de extrato de levedura ao meio, antes da
esterilização. Equivalente comercial: Trypitic Soy
Preparação. Suspender os ingredientes em água, Agar YE (LABORCLIN 910015) (placas prontas).
aquecer até a fusão do ágar e distribuir em tubos
Ágar Tripticase de Soja Sangue de Carneiro
de 10x100mm (4-5 ml/tubo). Esterilizar a 121
(TSA-SANGUE). Usado para verificação de he-
ºC/15 min e inclinar, mantendo fundo de no mí-
mólise na análise de B. cereus. Preparar porções
nimo 2,5cm.
de 100 ml de Ágar Tripticase de Soja (TSA) e es-
Equivalentes comerciais. Triple Sugar Iron Agar terilizar a 121 ºC/15min. Resfriar a 50 ºC e adicio-
(DIFCO 226540), Triple Sugar Iron Agar (BBL nar assepticamente, a cada 100 ml de meio, 5 ml
211749), Triple Sugar Iron Agar (OXOID CM de sangue de carneiro desfibrinado, plaqueando
277), Triple Sugar Iron Agar (MERCK 1.03915), imediatamente.
Triple Sugar Iron Agar (ACUMEDIA 7162).

Ágar Tripticase de Soja (TSA) com cose Extract Agar (MERCK 1.10128), Tryptone
Magnésio e Oxalato Glucose Extract Agar (ACUMEDIA 7242).
Referência(s): ISO 10273:2003. Ágar (Caldo) Triptona Glicose

Aplicação: Teste confirmativo para Yersinia en- Extrato de Levedura 0,5% Ácido
terocolitica (requerimento de cálcio), método Acético (TGYA – TGYB)
ISO 10273:2003.
Composição Referência(s): Pitt & Hocking (2009).
Ágar Tripticase de Solução de cloreto Aplicação. Meio para isolamento ou contagem de
Soja estéril 830 ml de magnésio estéril 80 ml leveduras resistentes aos conservantes, método
(121 ºC/15min) (filtração)
Pitt & Hocking (2009).
Solução de glicose Solução de oxalato de
10 ml 80 ml
estéril (filtração) sódio estéril (filtração) Composição (Base)
Glicose 100g Ágar (opcional) 15g
Preparação: Preparar o TSA, esterilizar e 121
Triptona 5g
ºC por 15min. Resfriar a cerca de 47 ºC e adicio- Água purificada 1 litro
nar assepticamente as soluções estéreis. Plaquear
121 ºC/10min (não é necessário ajustar o pH)
imediatamente porque o meio completo não pode
ser reaquecido. Solução de cloreto de magnésio: Suplemento
Dissolve 5,09g de cloreto de magnésio hexahi- Ácido acético glacial 5 ml por litro de base
dratado (MgCl2.6H2O) (0,25 mol/l) em 100 ml de
água purificada e esterilizar por filtração. Solução Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121 ºC
de oxalato de sódio: Dissolver 3,35g em 100 ml por 10min (prolongamento da esterilização pode
de água purificada e esterilizar por filtração. Solu- causar reação de Maillard). No momento do uso,
ção de glicose: Dissolver 18g em 100 ml de água fundir o ágar (se presente), resfriar a 45-50 ºC e
purificada e esterilizar por filtração. adicionar o ácido acético, que não precisa ser este-
rilizado (concentração final 0,5%). O meio sólido
Ágar Triptona Glicose Extrato de completo deve ser utilizado ou plaqueado imedia-
tamente, não podendo ser reaquecido. O pH final
Carne (TGE)
é de 3,8.
Referência(s): Manual Difco & BBL (Zimbro &
Power, 2003). Ágar Triptose Sulfito Cicloserina
Aplicação: Contagem de esporos mesófilos aeró- (TSC)
bios, método APHA 23:2015.
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M169, Com-
Composição pendium (Salfinger & Tortorello, 2015) p. 932.
Triptona 5g Ágar 15g
Aplicação. Meio seletivo/diferencial para isola-
Extrato de carne 3g
Água purificada 1 litro mento de Clostridium perfringens em alimen-
Glicose 1g tos. A base também é usada para a contagem
121 ºC/15min - pH 7,0±0,2 de clostrídios sulfito redutores em água, méto-
Preparação. Suspender os ingredientes em água, do de filtração ISO 6461-2:1986.
aquecer até a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC Composição da base
por 15min. Preparar porções de 100 ml para a Triptose 15g Citrato férrico
1g
contagem de esporos em alimentos. Peptona de soja 5g amoniacal
Equivalentes comerciais. Tryptone Glucose Ex- Extrato de levedura 5g Agar 20g
tract Agar (DIFCO 223000), Tryptone Glucose Metabissulfito de sódio 1g Água purificada 900 ml
Extract Agar (OXOID CM 127), Tryptone Glu- 121 ºC/15min - pH 7,6±0,2

Suplemento Composição da base

Solução 0,5% de D-Cicloserina esterilizada por 80 ml/l base Peptona de carne Cloreto de cálcio
10g 0,1g
filtração (final 0,4g/l) (digestão péptica) (CaCl2)
Suspensão gema de ovo: salina (1:1) (opcional) 80 ml/l base Cloreto de sódio Ágar 9 a 18g*
5g
(NaCl) Água purificada 1 litro
Preparação. Suspender os ingredientes da base
ou o meio completo desidratado e aquecer até a
fusão do ágar. Esterilizar a 121 ºC/15min, resfriar * A quantidade depende da força de gel do material usado.
a 45-50 ºC e adicionar assepticamente a solução Suplemento

de cicloserina previamente preparada. Plaquear
Tween 80 10 ml/990 ml base
imediatamente. Para a preparação do TSC com
gema de ovo, adicionar também a suspensão de Preparação: Suspender os ingredientes da base,
gema de ovo/salina, antes do plaqueamento. So- aquecer para a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC
lução aquosa de D-cicloserina 0,5%: Dissolver 1g por 30min. Adicionar à 990 ml da base os 10 ml
de D-cicloserina (pó cristalino, branco) em 200 de tween 80, homogeneizar e esterilizar a 110 ºC
ml de água purificada. Esterilizar por filtração e por 30min. Assepticamente, distribuir em tubos
estocar a 4º C até o uso. Emulsão de gema de ovo estéreis (2,5 ml/tubo) e inclinar com rampa bem
(BAM-M51). Lavar os ovos com escova, drenar e longa e fundo bem curto.
mergulhar em etanol 70% por uma hora. Abrir as-
septicamente e transferir as gemas para um frasco
estéril tarado. Adicionar às gemas uma quantida- Ágar Ureia de Christensen
de de solução salina 0,85% estéril, suficiente para
diluição 1:1. Misturar o conteúdo por agitação ou
com o auxílio de baguetas estéreis, até obter uma Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de
suspensão homogênea. urease.
Equivalentes comerciais da base. Shahidi Fer-
guson Perfringens (SFP) Agar Base (DIFCO Peptona 1g Vermelho de fenol 0,012g
281110), Perfringens Agar Base (OXOID CM Cloreto de sódio

5g Ágar 9 a 18g*
(NaCl)
587), TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine) Agar
Fosfato monopotássico Água grau reagente 950 ml
Base (MERCK 1.11972). (KH2PO4)
2g
Glicose 1g
Equivalentes comerciais dos suplementos. D- 121º C/15min - pH 6,8±0,2
cycloserine Power (Sigma Chemical Co), Per-
*Depende da força de gel do ágar
fringens TSC Selective Supplement (OXOID SR
88), D-Cycloserine (MERCK 1.08097), Egg Yolk Suplemento
Emulsion (MERCK 1.03784), Egg Yolk Emul- Solução aquosa de uréia esterilizada por filtração
50 ml/950 ml
de base
sion (OXOID SR 47), Egg Yolk Enrichment 50%
(DIFCO 233472), Egg Yolk s/Telurito (LABOR- Preparação. Dissolver os ingredientes da base e
CLIN 520088). esterilizar a 121 ºC/15min. Resfriar a 44-47 ºC e
Equivalentes comerciais do meio completo (pla- adicionar assepticamente 50 ml da solução aquosa
cas prontas). TSC Agar (LABORCLIN 910036). de uréia em 950 ml de base. Distribuir em tubos
estéreis (10 ml/tubo) e inclinar os tubos antes de
solidificar. Solução de uréia. Dissolver 40g da
Ágar Tween Esterase
uréia em 100 ml de água grau reagente e esterili-
Referência(s): ISO 10273:2003 zar por filtração.
Aplicação. Meio para confirmação de Yersinia Equivalentes comerciais. Urea Agar Base (MERCK
enterocolitica, método ISO 10273:2003. 1.08492), Urea Agar Base (OXOID CM 53).

Ágar Verde Brilhante (BG) Composição

Extrato de levedura 3g Vermelho neutro 0,03g
Referência(s). Edwards and Ewing’s Identification Peptona 7g Cristal violeta 0,002g
of Enterobacteriaceae (Ewing, 1986) p.512. Lactose 10g
Cloreto de sódio
5g
Aplicação. Meio seletivo diferencial para iso- (NaCl) Ágar 15g
lamento de Salmonella, recomendado como Sais biliares ou sais
meio opcional no método ISO 6579:2002. biliares No 3
Fervura 2min, pH final 7,4±0,2
Composição
Proteose peptona 10g Vermelho de fenol 0,08g
Preparação. Suspender os ingredientes, aquecer
Extrato de levedura 3g Verde brilhante 0,0125g até a fusão do ágar e ferver por 2min, no máximo,
Lactose 10g Sacarose 10g com agitação. Não autoclavar. O pH final deve ser
Cloreto de sódio Ágar 12 a 20g* de 7,4±0,2 e o capítulo 9 do Compendium (Korna-
5g
(NaCl) Água purificada 1 litro cki et al., 2015) ressalta que qualquer bateladas com
121 ºC/15min, final pH 6.9±0.2 pH 6,9 ou menor deve ser descartadas, porque esses
*Depende da força gelificante do ágar usado. valores são indicativos de falha na preparação. Pre-
Preparação. Suspender os ingredientes, aquecer parar no máximo quatro horas antes do uso e manter
até a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC/15min.. fundido até usar, não devendo ser reaquecido.
Equivalentes comerciais. Brilliant Green Agar Equivalentes comerciais: Violet Red Bile Agar
(DIFCO 228530), BPLS Agar USP (MERCK (DIFCO 211695), Violet Red Bile Lactose Agar
1.07232), Brilliant Green Agar (OXOID CM 263). (OXOID CM 107), Violet Red Bile Agar (MERCK
1.01406), Violet Red Bile Agar (ACUMEDIA 7165).
Ágar Verde Brilhante Sulfa (BGS)
Referência(s): MLG (USDA, 2013).
Ágar Vermelho Violeta Bile com
Glicose (VRBG)
mento de Salmonella, método do MLG/FSIS/ Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
USDA. rello, 2015) p.635.
Composição Aplicação: Meio seletivo e diferencial para En-
Extrato de levedura 3g Vermelho de fenol 0,08g terobacteriaceae, método de plaqueamento
Polipeptona 10g Verde brilhante 0,0125g APHA 9.62:2015.
Cloreto de sódio (NaCl) 5g Sulfapiridina 1g Composição: A mesma composição do Agar VRB,
Lactose 10g Ágar 20g só que substituindo a lactose por glicose. O Ágar
Sacarose 10g Água purificada 1 litro VRB suplementado com glicose também pode ser
121 ºC/15min - pH final 6,9±0,2
usado.
Preparação. Suspender os ingredientes, aquecer Preparação. Suspender os ingredientes, aquecer
até a fusão do ágar e esterilizar a 121 ºC/15min. até a fusão do ágar e ferver por 2min, no máximo,
Resfriar aproximadamente a 50 ºC e plaquear com agitação. Não autoclavar. O pH final deve ser
imediatamente, o meio não pode ser reaquecido. de 7,4±0,2 e o capítulo 9 do Compendium (Kor-
Equivalentes comerciais. BG Sulfa Agar (DIF- nacki et al., 2015) ressalta que qualquer batela-
CO 271710). das com pH 6,9 ou menor deve ser descartadas,
porque esses valores são indicativos de falha na
Ágar Vermelho Violeta Bile (VRB) preparação. A ISO 21528-2:2004 recomenda pre-
parar no máximo quatro horas antes do uso e man-
Referência(s). BAM (FDA, 2015a) M174. ter fundido até usar, não devendo ser reaquecido.
Aplicação. Meio seletivo/diferencial para conta- Equivalentes comerciais: Violet Red Bile Gluco-
gem de coliformes totais em alimentos. se Agar (DIFCO 218661), Violet Red Bile Glu-

cose Agar (ACUMEDIA 7425), Violet Red Bile Composição*

Glucose Agar (OXOID CM 485), VRBD (Violet Proteose peptona Nº 3 1,6g Tissulfato de sódio 6,8g
Red Bile Dextrose Agar (MERCK 1.10275). Extrato de levedura 3g Cloreto de sódio 5g
L-Lisina 5g Vermelho de fenol 0,08g
Xilose 3,75g Sacarose 7,5g
Ágar Xilose Lisina Desoxicolato
4,6
(XLD) Lactose 7,5g Niaproof 4
ml
Citrato férrico Ágar 18g
0,8g
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M179, ISO amoniacal Água purificada 1 litro
6579:2002. Ferver para dissolver o ágar - pH 7,5±0,2
Aplicação. Meio seletivo diferencial para isola- * A descrição fornecida pelo MLG (USDA, 2013) usa o XL Agar Base DIFCO
0555 suplementado com os outros ingredientes para se obter a formulação
mento de Salmonella. final. A Becton, Dickinson e Company (BD) interrompeu a fabricação do XL
Agar Base DIFCO 0555, cuja formulação original era: extrato de levedura =
Composição 3g, NaCl = 5g, xilose = 3,75g, lactose = 7,5g, sacarose = 7,5g, L-lisina = 5g,
vermelho de fenol = 0,08g, ágar = 15g, água purificada = 1 litro.
Extrato de levedura 3g Citrato férrico
0,8g Preparação: Dissolver o Niaproof 4 (Tergitol 4)
L-Lisina 5g amoniacal
(7-etil-2-metil-4-sulfato de hidrogênio undeca-
Xilose 3,75g Tissulfato de sódio 6,8g
nol) na água purificada sob agitação com uma bar-
Lactose 7,5g Cloreto de sódio ra magnética. Adicionar os demais ingredientes
5g
(NaCl)
Sacarose 7,5g (ou meio base completo desidratado) e aquecer,
Desoxicolato de sódio 2,5g Agar 15g mantendo a agitação até a completa fusão do ágar.
Vermelho de fenol 0,08g Água purificada 1 litro
Resfriar a 45-50 ºC em banho-maria misturando
delicadamente. Plaquear imediatamente (placas
Aquecer até ferver - pH final 7,4±0,2
com cerca de 5mm de profundidade). Inicialmen-
Preparação. Suspender os ingredientes na água e te os meio pode apresentar uma coloração escura,
aquecer com suave agitação até atingir a fervura. mas deve clarear com o tempo. Secar as placas à
Não autoclavar. Plaquear imediatamente porque temperatura ambiente por 18-24h e, em seguida
não pode ser reaquecido. Deixar que as placas se- estocar sob refrigeração (3-8 ºC dentro de saco
quem por cerca de 2h com as tampas parcialmente plástico) por até 3 meses.
removidas. Fechar as placas e armazenar por até Equivalentes comerciais do meio (sem tergitol
30 dias sob refrigeração (4±2 ºC). 4). XLT4 Agar (ACUMEDIA 7517), XLT4 Agar
Equivalentes comerciais. XLD Agar (ACUME- Base (DIFCO 223420), XLT4 Agar Base (MERCK
DIA 7166), XLD Agar (BBL 211838), XLD Agar 1.13919). Equivalentes comerciais do Tergitol 4.
(DIFCO 278850), XLD Agar (MERCK 1.05287), XLT4 Agar Supplement (DIFCO 235310), XLT4
XLD Agar (OXOID CM 469), XLD Agar (LA- Agar Supplement (MERCK 1.08981).
BORCLIN 540104) (placas prontas).
Ágar Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4) Água Peptonada 0,1% (H2Op)

Referência(s): Difco & BBL Manual (Zimbro &
rello, 2015) p.943, SMEWW (Hunt, 2012) se-
Power, 2003), MLG (USDA, 2013).
ção 9050C1b.
Aplicação. Diluente para homogeneização e di-
mento de Salmonella.
luição de amostras para a análise.
Composição
Peptona 1g

Equivalentes comerciais. Água Peptonada 0,1% Água Peptonada Tamponada com

(LABORCLIN 530168) (diluente pronto em fras- Cristal Violeta
co 225 ml), Água Peptonada 0,1% (LABORCLIN
510150) (diluente pronto em tubos com 9 ml). Referência(s): MLG/FSIS/USDA (2017).
Aplicação. Meio de pré-enriquecimento para Sal-
Água Peptonada Alcalina (APA) monella em produtos fermentados, método:
MLG/FSIS/USDA.
Composição/Preparação. Para preparar, adicio-
Aplicação. Meio para enriquecimento de V. cho-
nar 1 ml da solução aquosa 1% de cristal violeta
lerae e V. parahaemolyticus.
para cada litro de BPW, ajustar o pH em 7,2±0,2
Composição esterilizar em autoclave a 121 ºC/15min.
Peptona 10g
Cloreto de sódio (NaCl) 10g
Água Peptonada Tamponada
121 ºC/10min - pH 8,5±0,2
Modificada com Piruvato
(mBPWp)
Preparação. Dissolver os ingredientes em água
purificada, ajustar o pH e distribuir em tubos ou Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M192a.
frascos, na quantidade requerida. Esterilizar a 121 Aplicação. Meio de pré-enriquecimento para de-
ºC/10min. tecção de E. coli O157:H7, método BAM/FDA.
Água Peptonada Tamponada Peptona 10g Cloreto de sódio
(BPW) Casamino ácidos 5g (NaCl)
5g
Referência(s): ISO 6579:2002, MLG (USDA, Extrato de levedura 6g Fosfato dissódico

3,6g
2013), BAM (FDA, 2015a). Lactose 10g (Na2HPO4)
Aplicação. Diluente e meio de pré-enriquecimen- Piruvato de sódio 1g Fosfato monopotássico

1,5g
to para detecção de Salmonella. Água purificada 1 litro (KH2PO4)
Composição
Peptona a 10g Fosfato monopotássico
Suplemento ACV
1,5g
Cloreto de sódio (NaCl) 5g (KH2PO4) 1 ml/225 ml base
Acriflavina - Solução aquosa 1,125g/500 ml
Fosfato dissódico (final 10 mg/
3,5g Água purificada 1 litro esterilizada por filtração
(Na2HPO4) a litro)
1 ml/225 ml base
121 ºC/15min, pH final 7,2±0,2 a Cefsulodina - Solução aquosa 1,125g/500 ml
(final 10 mg/
a A ISO 6579:2002 especifica peptona de caseína digestão enzimática (10g), esterilizada por filtração
litro)
Na2HPO4.12H2O (9g) e pH 7,0±0,2.
Vancomicina - Solução aquosa 0,90g/500 ml 1 ml/225 ml base
Preparação. Dissolver os ingredientes em água esterilizada por filtração (final 8 mg/litro)
purificada, ajustar o pH (se necessário) e distribuir Preparação. Dissolver os ingredientes da base e

em tubos ou frascos, na quantidade requerida. Es- esterilizar a 121 ºC/30min. Resfriar a cerca de 50
terilizar a 121 ºC/15min. ºC e adicionar 1 ml de cada suplemento estéril a
Equivalentes comerciais. Buffered Peptone Water 225 ml da base.
(ACUMEDIA 7418), Buffered Peptone Water (BBL
212367), Buffered Peptone Water (DIFCO 218105), Água Salina Peptonada (H2Osp)
Buffered Peptone Water (OXOID CM 509), Pepto-
ne Water Buffered (MERCK 1.07228), Água Pep- Referência(s): ISO 6887-1:1999, ISO 6887-5:2010.
tonada Tamponada (LABORCLIN 530167) (meio Aplicação. Diluente para homogeneização e di-
pronto em frasco com 225 ml). luição de amostras para a análise.

Composição Álcool Iodado

Peptona ou peptona Cloreto de sódio (NaCl) 8,5g
de caseína digestão 1g Referência(s): BAM (FDA, 2015b) R18.
enzimática Água purificada 1 litro
Aplicação. Desinfetante para uso geral no labo-
121 ºC/15min - pH final 7,0±0,2 ratório.
Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o Composição
pH e distribuir em tubos ou frascos, na quantidade Iodo 10g
requerida. Esterilizar a 121 ºC/15min. Iodeto de potássio 10g
Etanol 70% 500 ml
Água Verde Brilhante (H2Ovb)
Referência(s): BAM (FDA, 2016). Álcool Iodado 3:1
Aplicação. Pré-enriquecimento de Salmonella em
leite, método BAM/FDA 2016. Referência(s): BAM (Andrews et al., 2016).
Composição Aplicação. Desinfetante para uso geral no labo-
ratório.
Solução aquosa de verde brilhante a 1% 2 ml
Água destilada 1 litro Composição
121 ºC/15min - pH 7,0±0,2 Solução de iodo/iodeto de potássio 250 ml
Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o Álcool 70% 750 ml
pH e distribuir em tubos ou frascos, na quantidade Preparação da solução de iodo/iodeto de po-

requerida. Esterilizar a 121 ºC/15min. tássio. Dissolver 100g de iodeto de potássio em
200-300 ml de água purificada. Adicionar 50g de
Álcool 70% iodo e aquecer levemente, com agitação, até a dis-
Referência(s): BAM (FDA, 2015b), reagente R23. solução do iodo. Completar o volume para um li-
tro com água purificada. Estocar em frasco escuro
Aplicação. Também chamado de etanol 70%, é
com rolha de vidro, ao abrigo da luz.
um desinfetante para uso geral no laboratório.
Preparação do etanol 70%. Vide etanol 70%.
Preparação. Para preparar um litro da solução de
etanol 70% utilizar a equação Preparação da solução de álcool iodado 3:1.
Adicionar 250 ml da solução de iodo/iodeto de
V2 = C1xV1/C2
potássio a 750 ml de etanol 70% e misturar bem.
onde:
V1 é a quantidade de álcool que deve ser misturada com
água (aqui fixado em 700 ml)
C1 é a concentração inicial do álcool usado
Caldo Acetamida
(absoluto = 100% ou 96º ou 95º).
C2 é a concentração final desejada, de 70%.
Vide Ágar/Caldo Acetamida.
V2 é o volume final de álcool 70% a ser preparado, de 1000
ml.
Caldo Acetamida ISO 16266
Preparação a partir do etanol absoluto:
V2 = 100x700/70 = 1000 ml → Misturar 700 ml Referência(s): ISO 16266:2006.
de etanol absoluto com água purificada, comple- Aplicação. Meio para confirmação de Pseudomo-
tando o volume para um litro. nas aeruginosa, método ISO 16266:2006 para
Preparação a partir do etanol 96º: análise de água.
V2 = 96x700/70 = 960 ml → Misturar 700 ml de
etanol absoluto com água purificada, completan-
do o volume para 960 ml.

Composição Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o

Solução A pH em 3,5 (com H2SO4 1N) e esterilizar a 121 ºC
Acetamida 2g por 15min.
Cloreto de sódio (NaCl) 0,2g Equivalentes comerciais. Não disponível
Fosfato monopotássico (KH2PO4) 1g
Sulfato de magnésio anidro ( mgSO4) 0,2g
Água purificada (isenta de amônia) 900 ml Caldo APT
Dissolver os ingredientes e ajustar o pH em 7,0±0,5.
Cuidado: a acetamida é carcinogênica e irritante, requerendo Vide Ágar/Caldo All Purpose Tween.
precauções quando pesar, preparar e descartar.
Solução B
Molibdato de sódio (Na2MoO4.2H2O) 0,5g Caldo Asparagina
Sulfato de ferro heptahidratado 0,05g
(FeSO4.7H2O)
Referência(s): SMEWW (Rice et al., 2012) seção
Água purificada 100 ml 9213F.
Meio completo Aplicação. Teste presuntivo para Pseudomonas
Solução A 900 ml aeruginosa, método NMP APHA/AWWA/
Solução B 1 ml WEF 2012.
Água purificada Completar para 1 litro Composição
121 ºC/15min, final pH 7,0±0,5 Sulfato de magnésio (
Asparagina (DL) 3g 0,5g
mgSO4.7H2O)
Preparação. Adicionar 1 ml da solução B a 900 Fosfato dipotássico
ml da solução A recém preparada. Adicionar água anidro (K2HPO4)
com constante agitação até completar 1 litro. Dis- 121 ºC/15min - pH 6,9-7,2
tribuir em tubos (5 ml/tubo) e esterilizar a 121±3 Preparação: Para a análise de 10 porções de 10
ºC/15min. Estocar no escuro a 5±3 ºC e usar no ml da amostra, preparar o caldo em concentração
prazo de um mês. dupla. Para a analise de diluições, preparar em
concentração simples. Dissolver os ingredientes
Caldo Ácido (CA) e ajustar o pH. Distribuir o meio em concentra-
ção dupla em tubos de 18x180mm (10 ml/tubo)
Vide Caldo Thermoacidurans (mesma formula-
e o meio em concentração simples em tubos de
ção).
16x150mm (10 ml/tubo). Esterilizar em autoclave
(121 ºC/15min).
Caldo Ali
rello, 2015) p.894.
Caldo Bacillus acidoterrestris
Aplicação. Meio para isolamento de Alicycloba-
(BAT)
cillus.
Composição Vide Ágar/Caldo Bacillus acidoterrestris.
Extrato de levedura 2g Sulfato de magnésio
heptahidratado 0,5g Caldo Bolton
Glicose 1g ( mgSO4.7H2O
Amido solúvel 2g
Sulfato de amônia
0,2g Referências(s): ISO 10272-1:2006, ISO 10272-
(NH4)2SO4
2:2006.
Cloreto de cálcio Fosfato monopotássico
3g
dihidratado 0,25g (KH2PO4) Aplicação. Meio de enriquecimento para Cam-
(CaCl2.2H2O) Água purificada 1 litro pylobacter, métodos ISO 10272-1:2006, ISO
121 ºC/15min - pH final 3,5 10272-2:2006.

Composição da base Composição

Peptona de carne Piruvato de sódio 0,5g Peptona de caseína Cloreto de sódio
10g 10g 5g
(digestão enzimática) Metabissulfito de sódio 0,5g (digestão enzimática) (NaCl)
Hidrolisado de Carbonato de sódio 0,6g Peptona de carne Bissulfito de sódio 0,1g
5g 10g
lactoalbumina Ácido alfa cetoglutárico 1g (digestão enzimática) Glicose 1g
Heme (dissolvido em hi-
dróxido de sódio 0,1%) Extrato de levedura 2g Água purificada 1 litro
Cloreto de sódio (NaCl) 5g Água purificada 1 litro 121 ºC/15min - pH final 7,0±0,2
121 ºC/15min – pH final 7,4±0,2
Preparação: Dissolver os componentes da base
Solução de antibióticos ou o meio completo desidratado, sob aquecimento
Cefoperazona 20 mg se necessário. Ajustar o pH e distribuir em tubos
Vancomicina 20 mg (10 ml/tubo) e esterilizar a 121º C/15min.
Lactato de trimetroprima 20 mg Equivalentes comerciais. Brucella Broth (ACU-
Anfotericina B 10 mg MEDIA 7121), Brucella Broth (BBL 211088).
Mistura 50/50 água destilada/etanol estéril 5 ml
Meio completo Caldo Cianeto de Potássio (KCN)

(CUIDADO, VENENO)
Base 1 litro
Sangue de cavalo lisado desfibrinado* 50 ml Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M126.
Solução de antibióticos 5 ml
Aplicação. Meio para confirmação de Salmo-
* Usar sangue de cavalo lisado com saponina ou lisado por congelamento e
descongelamento.
nella, método BAM/FDA.
Preparação. Dissolver os ingredientes da base ou o
Polipeptona ou proteose Fosfato dissódico
meio base completo desidratado, aquecendo se ne- peptona Nº 3
3g
(Na2HPO4)
5,64g
cessário. Ajustar o pH em 7,4±0,2 e esterilizar a 121 Cloreto de sódio (NaCl) 5g
ºC/15min. Separadamente, dissolver os antibióticos Fosfato monopotássico Água purificada 1 litro
0,225g
na mistura 50/50 água destilada/etanol esterilizada (KH2PO4)
por filtração. Resfriar a base à 47-50 ºC, adicionar 121 ºC/15min - pH final 7,6±0,2
o sangue de cavalo e depois os antibióticos. Estocar Suplemento

protegido da luz, a 3±2 ºC, por não mais de sete Solução estoque de cianeto de potássio (KCN) 15 ml/litro base
dias. No dia do uso, não pode ser mantido à tempe- (refrigerada) (refrigerada)
ratura ambiente por mais de quatro horas. Preparação. Dissolver os ingredientes da base,
Equivalentes comerciais da base. Bolton Selec- ajustar o pH em 7,6±0,2 e esterilizar a 121 ºC por
tive Enrichment Broth Base (MERCK 1.00068), 15min. Resfriar e refrigerar a 5-8 ºC. Preparar
Bolton Broth (OXOID CM 983). a solução estoque de KCN dissolvendo 0,5g de
Equivalentes comerciais dos suplementos. Bolton KCN em 100 ml de água purificada esterilizada e
Broth Selective Supplement (MERCK 1.00079), refrigerada a 5-8 ºC. Adicionar 15 ml da solução
Modified Bolton Broth Selective Supplement estoque refrigerada em um litro da base. Misturar
(OXOID SR 208). bem e assepticamente distribuir o meio comple-
to em tubos estéreis de 13x100mm (1,0 a 1,5 ml/
Caldo Brucella tubo). Usar tubos com tampas de rolha, parafinan-
do as rolhas da seguinte forma: ferver as rolhas
Referência(s): ISO 10272-1:2006, ISO 10272- em parafina por 5min e selar então os tubos, de
2:2006. forma que a parafina não escorra para o meio de
Aplicação. Meio para confirmação de Cam- cultura, mas sim, forme um selo entre a rolha e a
pylobacter, método ISO 10272-1:2006, ISO boca do tubo. Estocar os tubos sob refrigeração
10272-2:2006. (5-8 ºC) por não mais de duas semanas.

Cuidado, o KCN é venenoso. Trabalhar com lu- descrito. O meio base Descarboxilase (DIFCO
vas e máscara, sobre bandejas, não diretamente 287220) é muito próximo, com duas diferenças:
sobre a bancada, não pipetar com a boca, mas sim, contém 0,02g/l de púrpura de bromocresol e 5g/l
com pipetador. de peptona.
Caldo Citrato de Koser Caldo Descarboxilase de Falkow

Referência(s): Manual Difco & BBL (Zimbro & Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M87.
Power, 2003) Aplicação. Meio para prova bioquímica, testes de
Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de lisina/ornitina descarboxilase e arginina dehi-
citrato. drolase.
Composição Composição da base
Fosfato de sódio Aminoácido* 5g Glicose 1g
1,5g Citrato de sódio 3g
amoniacal (NaNH5PO4)
Púrpura de
Fosfato monopotássico Sulfato de magnésio 0,2g Peptona 5g 0,02g
1g bromocresol
(KH2PO4) Água purificada 1 litro
121 ºC/15min - pH 6,7±0,2 Extrato de levedura 3g Água purificada 1 litro
Preparação. Dissolver os ingredientes, acertar o 121 ºC/15min - pH final 6,8±0,2
pH em 6,7, distribuir em tubos de 10x100mm (4 *Cloridrato de L-Lisina (Lisina-HCl), L-ornitina (Ornitina-HCl) ou L-argini-
na (Arginina-HCl).
ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC/15min.
Equivalentes comerciais. Koser Citrate Medium Preparação. Aquecer os ingredientes até a disso-
(DIFCO 215100), Koser Citrate Medium (OXOID lução. Distribuir em tubos (5 ml/tubo) e esterili-
CM 65). zar a 121 ºC/15min. Apertar bem as tampas para
a estocagem.
Caldo Descarboxilase Equivalentes comerciais. Decarboxylase Medium
Base (DIFCO 287220) (base sem aminoácido),
Referência(s): ISO 6579, ISO 22964, ISO 10273: Lysine Decarboxylase Broth (DIFCO 211759)
2003. (mesma base com lisina adicionada).
Aplicação. Meio para prova bioquímica usado
nos métodos ISO para os testes de lisina/orni- Caldo Dextrose
tina descarboxilase e arginina dehidrolase.
Púrpura de Bromocresol (BCP)
Composição
Aminoácido* 5g Púrpura de bromocresol 0,015g
Extrato de levedura 3g (1,5 ml da solução 1%) Aplicação. Detecção de bactérias esporogênicas
Glicose 1g Água purificada 1 litro termófilas e mesófilas aeróbicas no teste de
121 ºC/15min - pH final 6,8±0,2 esterilidade comercial para alimentos de baixa
* Cloridrato de L-Lisina (Lisina-HCl), L-ornitina (Ornitina-HCl) ou L-argini-
acidez.
na (Arginina-HCl).
Composição
Preparação. Dissolver os ingredientes , ajustar o Dextrose 10g Púrpura de bromocresol
pH e distribuir em tubos (2 a 5 ml/tubo). Esteri- (2 ml da solução 0,032g
Extrato de carne 3g alcoólica 1,6%)
lizar a 121 ºC/15min. Solução 1% de púrpura de
Peptona 5g Água purificada 1 litro
bromocresol. Dissolver 0,1g em 2 ml de NaOH
121 ºC/15min - pH 7,0±0,2
0,1N e completar o volume para 10 ml com água
destilada. Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o pH
Equivalentes comerciais. Não há equivalentes e distribuir em tubos de 20x180mm (12-15 ml/tubo)
comerciais com a exata composição do meio e esterilizar a 121 ºC/15 min. Solução alcoólica de

púrpura de bromocresol 1,6%. Dissolver 1,6g em juntar essas duas soluções na proporção 1:1 em
100 ml de etanol 95%. volume.
Equivalentes comerciais. Não disponível. Equivalentes comerciais. Differential Reinforced
Clostridial Broth (DRCM) (MERCK 1.11699).
Caldo Dextrose Triptona (DTB)
Caldo E. coli (EC)
Vide Ágar (Caldo) Dextrose Triptona.
Referências(s): SMEWW (Hunt, 2012) seção
9221E (EC Medium), ISO 7251:2005.
Caldo Diferencial Reforçado para
Aplicação. Teste confirmativo para coliformes ter-
Clostrídios (DRCM) motolerantes (fecais) nos métodos NMP APHA
Referência(s): ISO 6461-1:1986. 9:2015, APHA/AWWA/WEF 9221:2012, ISO
Aplicação. Meio diferencial para contagem de 7251:2005.
clostrídios sulfito redutores em água pelo mé- Composição
todo dos tubos múltiplos ISO 6461-1:1986. Triptose* 20g Cloreto de sódio
5g
Lactose 5g (NaCl)
Fosfato monopotássico Lauril sulfato de sódio
Peptona de carne 2,75g 0,1g
10g Amido solúvel 1g (KH2PO4) [CH3(CH2)11OSO3Na]
(digestão tríptica) Fosfato dipotássico
Extrato de carne 10g Glicose 1g (K2HPO4)
Extrato de levedura 1,5g Cloridrato de L-cisteína 0,5g 121 ºC/15min - pH final 6,8±0,2
Acetato de sódio 5g Água destilada 1 litro * ISO 7251 especifica peptona de tecido animal e vegetal (digestão enzimá-
tica) (20g).
121 ºC/15min - pH final 7,1-7,2
Preparação. Dissolver os ingredientes, acertar o
Suplemento estéril
pH, distribuir em tubos de 16x150mm com tubo
Solução de citrato férrico (C6H5O7Fe) (7%) 0,2 ml/tubo com
e sulfito de sódio (Na2SO3) (4%) 10 ml
de Durham (aproximadamente 6 ml/tubo ou o
volume suficiente para cobrir o tubo de Durham
Preparação. Para a análise de 10 porções de 10
após a esterilização). Esterilizar a 121 ºC/15min.
ml da amostra, preparar o caldo em concentração
dupla. Para a analise de diluições, preparar em Equivalentes comerciais. EC Medium (DIFCO
concentração simples. Dissolver o amido em 200 231430), EC Broth (MERCK 1.10765), EC Me-
ml de água e aquecer com agitação até gelatini- dium (ACUMEDIA 7206), EC Broth (OXOID
zar. Dissolver os demais ingredientes em 800 ml CM 0853).
de água, aquecer sem atingir fervura e juntar ao
Caldo E. coli com
amido. Resfriar, ajustar o pH e distribuir em tu-
4-metilumbeliferil-β-D-glicuronídeo
bos de 18x180mm (10 ml do caldo concentração
dupla) ou 16x150mm (10 ml do caldo em concen-
(EC-MUG)
tração simples). Esterilizar a 121 ºC/15min e, no Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) section
momento do uso, adicionar a cada tubo com 10 9221F.
ml da base em concentração simples, 0,2 ml da Aplicação. Teste confirmativo para E. coli em água,
solução de citrato férrico e sulfito de sódio. Para método NMP APHA/AWWA/WEF9221:2012.
o caldo em concentração dupla, adicionar 0,4 ml Composição
para cada 10 ml da base. Solução de citrato fér-
Caldo E. coli (EC) 1 litro
rico (7%) e sulfito de sódio (4%). Preparar uma
4-metilumbeliferil-β-D-glicuronídeo (EC-MUG) 0,05g
solução aquosa de sulfito de sódio a 4% e uma
121 ºC/15min - pH final 6,9±0,2
solução aquosa de citrato férrico a 7% (aquecendo
para dissolver). Esterilizar por filtração e estocar Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o
em geladeira por até 14 dias. No momento do uso, pH e distribuir em tubos com Durham e esterili-
zar a 121 ºC/15min. Observação: selecionar para

este meio tubos de ensaio cujo vidro não apresen- Volume da Concentração
te fluorescência natural sob a luz ultravioleta de Suplementos solução em 225 final no meio
ml da base completo
comprimento de onda longa (366 nm).
Acrifavina HCl - solução aquosa
Equivalentes comerciais. EC Medium w/ MUG 0,45 ml 10 mg/l
0,5% (p/v)
(DIFCO 222200), EC Medium w/ MUG (ACU- Ácido nalidíxico sal sódico -
1,8 ml 40 mg/l
MEDIA 7361). solução aquosa 0,5% (p/v)
Cicloeximida - solução 1%
preparada em uma mistura com 1,15 ml 50 mg/l
Caldo de Enriquecimento de 40% (v/v) de etanol em água
Enterobacteriaceae (EEB) Esterilizar por filtração e estocar sob refrigeração (4 ºC)
(acriflavina protegida da luz)
Referência(s): Oxoid Manual 9 th Ed. (Bridson, Preparação. Dissolver os ingredientes da base,
2006), Merck Microbiology Manual 12 th Ed. ajustar o pH e esterilizar a 121 ºC/15min. Sepa-
(MERCK, 2005). radamente preparar as soluções dos suplementos
Aplicação. Meio seletivo para enriquecimento de e esterilizar por filtração. Os suplementos devem
Enterobacteriaceae em alimentos, método do ser adicionados durante o ensaio, após um perío-
NMP APHA 9.61:2015. do de quatro horas de incubação do caldo com a
Composição amostra a 30 ºC.
Peptona 10g Equivalentes comerciais da base. Buffered Liste-
Fosfato dissódico
6,45g ria Enrichment Broth Base (DIFCO 290720), Bu-
(Na2HPO4)* Glicose 5g
ffered Listeria Enrichment Broth Base (MERCK
Fosfato monopotássico Verde brilhante 0,0135g
(KH2PO4)
2g 1.09628), Buffered Listeria Enrichment Broth
(OXOID CM 897) (não contém piruvato de sódio).
Banho-maria 100 ºC/30min - pH final 7,2±0,2
* MERCK 1.05394 usa fosfato de sódio (8g).

Caldo de Enriquecimento de
Preparação. Dissolver os ingredientes deixar em Listeria Tamponado com Ácido
banho-maria 100 ºC/30min. Oxoid recomenda não Morfolinopropanosulfônico
autoclavar. Merck indica banho-maria 100 ºC/30min
(MOPS-BLEB)
ou autoclavar 121 ºC/5min.
Equivalentes comerciais. EE Broth (OXOID Referência(s). MLG (USDA, 2013).
CM 317), EE Broth Mossel (MERCK 1.05394). Aplicação. Meio de enriquecimento de Listeria
monocytogenes, método MLG/FSIS/USDA.
Caldo de Enriquecimento para Composição
Listeria Tamponado (BLEB) Peptona de caseína
17g
Cicloeximida* 0,05g
(digestão pancreática) Acriflavina HCl 0,015g
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M52. Peptona de soja 3g Ácido nalidíxico 0,04g
Aplicação. Meio de enriquecimento para Listeria Extrato de levedura 6g

MOPS ácido livre ** 6,7g
Dextrose 2,5g
monocytogenes, método BAM/FDA.
Cloreto de sódio (NaCl) 5g MOPS sal de sódio *** 10,5g
Composição da base Fosfato dipotássico
(K2HPO4)
Caldo Tripticase de 1 Fosfato dissódico
9,6g 121 ºC/15min - pH 7,3±,2
Soja (TSB) litro anidro (Na2HPO4)
* Cuidado. O contato com os olhos pode causar irritação. O contato com a
Fosfato monopotássico Piruvato de sódio* 1,1g
1,35g pele é irritante e a absorção através da pele é prejudicial e pode causar
anidro (KH2PO4) Extrato de levedura 6g dermatite. A inalação pode provocar irritação das mucosas, com possí-
veis efeitos irreversíveis. A ingestão pode causar envenenamento letal
121 ºC/15min - pH final 7,3±0,2 (Fisher Scientific Safety Data Sheet, 2006).
* Alguns equivalentes comerciais da base não contém piruvato de sódio ** MOPS ácido livre (MOPS = 3-[N-Morpholino] propanesulfonic acid)
que deve ser adicionado após a autoclavagem (11,1 ml de uma solução *** MOPS sal de sódio (MOPS = 3-[N-Morpholino] propanesulfonic acid
aquosa 10% por litro de base). sodium salt)

Preparação. Dissolver todos os ingredientes e es- É preparado sem a adição dos agentes seletivos do
terilizar a 121 ºC/15min. Caldo Fraser (sem cloreto de lítio, ácido nalidíxi-
Equivalentes comerciais: MOPS-BLEB Broth co e acriflavina HCl).
Base (OXOID CM1071) and Listeria Selective Half
Half-
Composição Fraser Fraser
Supplement for MOPS-BLEB (OXOID SR0141) Fraser
Base
Triptona (hidrolisado de caseína
5g 5g 5g
Caldo Extrato de Levedura Amido digestão péptica)
Peptona de carne (hidrolisado de
Glicose (YSG) tecido animal digestão péptica)
5g 5g 5g
Extrato de carne 5g 5g 5g
Vide Ágar/Caldo Extrato de Levedura Amido
Extrato de levedura 5g 5g 5g
Glicose. Cloreto de sódio (NaCl) 20g 20g 20g
Fosfato dissódico (Na2PO4) 12g 12g 12g
Caldo Extrato de Malte (EM) Fosfato monopotássico (KH2PO4) 1,35g 1,35g 1,35g
Esculina 1g 1g 1g
Água purificada 1 litro 1 litro 1 litro
Aplicação. Meio para isolamento de bolores e Cloreto de lítio 3g 3g -
leveduras, usado no teste de esterilidade co- Ácido nalidíxico (sal sódico) 0,02g 0,01g -
mercial. 121 ºC/15min - pH final 7,2±0,2
Composição Suplemento
Extrato de malte 6g Extrato de levedura 1,2g 0,1 ml/10
Acriflavina HCl 5 ml/litro
ml base
Dextrose 6g (solução aquosa 0,25% base (final -
(final 25
Água purificada 1 litro esterilizada por filtração) 12,5 mg/l)
Maltose 1,8g mg/litro)
0,1 ml/10
121 ºC/15min - pH final 4,7±0,2 Citrato férrico amoniacal 10 ml/litro
ml base
(solução aquosa 5% esterilizada base (final -
(final 0,5g/
Preparação. Dissolver os ingredientes, distri- por filtração) litro)
0,5g/litro)
buir em tubos (10 ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC/

Preparação. Dissolver os componentes da base
15min.
ou a base completa desidratada em água, aquecer
Equivalentes comerciais. Malt Extract Broth
se necessário. Ajustar o pH e esterilizar a 121 ºC
(DIFCO 211320).
por 15min. Preparar separadamente as seguintes
soluções, esterilizadas por filtração: solução aquo-
Caldo Fraser – Half-Fraser – sa 0,25% da acriflavina HCl e solução aquosa 5%
Half-Fraser Base do citrato férrico amoniacal. Estocar em frasco es-
Referência(s): MLG (USDA, 2013), ISO 11290- curo, sob refrigeração. No momento do uso, adi-
1:1996, ISO 11290-2:1998. cionar a cada litro de base, 5 ml da solução de acri-
flavina HCl e 10 ml da solução de citrato férrico.
Aplicação Caldo Fraser. Meio de enriquecimen-
to seletivo secundário para L. monocytogenes nos Equivalentes comerciais da base. Fraser Broth
métodos USDA/MLG e ISO 11290-1. Base (ACUMEDIA 7626), Fraser Broth Base (ACU-
MEDIA 7502) Fraser Broth Base (DIFCO 211767),
Aplicação Caldo Half-Fraser. Meios de enrique-
Fraser Broth (OXOID CM 895), Fraser Listeria Se-
cimento primário para L. monocytogenes no méto-
lective Enrichment Broth Base (MERCK 1.10398).
do ISO 11290-1:1996. É preparado adicionando-
se apenas a metade da concentração de ácido nali- Equivalentes comerciais dos suplementos. Fra-
díxico e acriflavina HCl presente no Caldo Fraser. ser Broth Supplement (DIFCO 211742) (citrato
férrico amoniacal 0,5g), Fraser Listeria Supple-
Aplicação Caldo Half-Fraser Base. Meio para
ment (MERCK 1.10399) (citrato férrico amonia-
recuperação de injúria na contagem de L. mono-
cal 2x0,25g, acriflavina 2x12,5 mg, ácido nalidi-
cytogenes em placas, método ISO 11290-2:1998.

xico 2x10 mg), Fraser Supplement (OXOID SR completo, descongelar o caldo, suplementar com
156) (citrato férrico amoniacal 2x0,25g, acriflavi- os ingredientes descritos na composição, ajustar
na 2x12,5 mg, ácido nalidixico 2x10 mg), Fraser o pH 7,6±0,2 e distribuir em tubos de 20x180mm
Broth Supplement (ACUMEDIA 7984) (citrato (15 ml/tubo). Antes de distribuir o caldo nos tu-
férrico amoniacal 2x0,25g). bos, adicionar a cada tubo, uma pequena quan-
Atenção: Alguns equivalentes comerciais da base tidade da carne moída armazenada. Esterilizar a
já contem a acriflavina e outras não contem o áci- 121 ºC/15min.
do nalidixico (adicionado como suplemento). Equivalentes comerciais. Liver Broth (OXOID
ACUME- ACUME- DIFCO OXOID MERCK CM 77) (não tem amido).
Base
DIA 7626 DIA 7502 211767 CM 895 1.10398
Ácido Não Não Não
nalidíxico incluído
0.02g/l 0.02g/l
incluído incluído Caldo Half-Fraser
Acriflavina Não Não Não
0.024g/l 0.024g/l
HCl incluída incluída incluída Vide Caldo Fraser – Caldo Half-Fraser – Caldo
ACUME- ACUME- DIFCO OXOID MERCK
Suplemento
DIA 7984 DIA 7984 211742 SR 156 1.10399 Fraser Base.
Ácido
- 0.02g/l - 2x10 mg 2x10 mg
nalidíxico
Acriflavina Caldo Infusão Cérebro Coração
- 0.024g/l - 2x12,5 mg 2x12,5 mg
HCl
Citrato
(BHI)
2x0,25g 2x0,25g 0,5g 2x0,25g 2x0,25g
férrico
Vide Ágar/Caldo Infusão Cérebro Coração.
Caldo de Fígado (CF) Caldo Infusão de Vitela (VIB)

Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- Referência: ISO 10273:2003.
rello, 2015) p. 912.
Aplicação. Meio para preservação de cepas de Y.
Aplicação. Meio para cultivo de clostrídios, usado enterocolitica sob congelamento, método ISO
no teste de esterilidade comercial para alimentos 10273:2003 e APHA 41:2015.
de baixa acidez, na detecção de esporos termófi-
Composição
los e mesófilos anaeróbicos e pode ser usado em
Infusão de vitela
teste de presença/ausência para C. perfringens. (desidratado)
500g Cloreto de sódio (NaCl) 5g
Composição Peptona de caseína

Caldo de 500g de fígado
1 litro Amido solúvel 1g 121 ºC/15min pH final 7,4±0,2
cozido em um litro de água
Triptona 10g
(K2HPO4)
1g Preparação. O Compendium não descreve a forma
121 ºC/15min - pH 7,6±0,2 de preparação do meio formulado no laboratório. Para
a preparação do equivalente comercial, dissolver os
Preparação. Para preparar a partir do equivalen-
ingredientes, ajustar o pH em 7,4±0,2, distribuir em
te comercial seguir as instruções dos fabricantes.
tubos (10 ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC/15min.
Para preparar a partir dos ingredientes individuais,
moer 500g de fígado bovino cru (retirar a gordura Equivalentes comerciais. Veal Infusion Broth
antes) e cozinhar uma hora sob fervura, em um li- (DIFCO 234420).
tro de água purificada. Reponha a água evaporada
até completar um litro. Filtrar em duas camadas Caldo Irgasan Ticarcilina Clorato
de gaze, pressionando bem para recolher todo o (ITC)
caldo. Espalhar a carne em uma bandeja e secar
por algumas horas em estufa de secagem a 35-57 Referência: ISO 10273:2003.
ºC. Armazenar o caldo e a carne separadamente, Aplicação. Meio seletivo para enriquecimento de
sob congelamento. Para a preparação do meio Y. enterocolitica, método ISO 10273:2003.

Composição da Base Preparação. Suspender os ingredientes da base ou

Peptona de caseína (digestão enzimática) 10g meio completo desidratado em água. Distribuir em
Extrato de levedura 1g tubos (10 ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC/10min.
Cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O) 60g Equivalentes comerciais da base. KF Strepto-
Cloreto de sódio (NaCl) 5g coccus Broth (DIFCO 212226).
Verde de malaquita 0,01g
Água destilada 988 ml Caldo Lactosado (CL)
121 ºC/15min – pH final 6,9±0,2
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M74
Suplementos
Aplicação. Meio de pré-enriquecimento para Sal-
Ticarcilina 1 ml
(solução aquosa a 1 mg/ml esterilizada por (final 1 mg por monella, método BAM/FDA.
filtração) litro de base)
Composição
1 ml
Irgasan [5-cloro-2-(2,4-diclorofenoxi)fenol] Extrato de carne 3g Lactose 5g
(final 1 mg por
(solução 1 mg/ml em etanol 95%)
litro de base) Peptona 5g Água destilada 1 litro
10 ml 121 ºC/15min - pH 6,9±0,2
Clorato de potássio (KClO3)
(final 1g por
(solução aquosa 10% esterilizada por filtração)
litro de base) Preparação. Dissolver os ingredientes e esterili-
Preparação. Preparar a base e esterilizar a 121 ºC zar a 121 ºC/15min.
por 15min. Resfriar a base a 45-50 ºC e adicionar Equivalentes comerciais. Lactose Broth (DIFCO
assepticamente os suplementos. A solução de ir- 211835), Lactose Broth (MERCK 1.07661), Lac-
gasan deve ser preparada no momento do uso ou tose Broth (BBL 211333), Lactose Broth (OXOID
estocada a 20 ºC negativos por até quatro semanas. CM 137), Lactose Broth (ACUMEDIA 7141).
Equivalentes comerciais. ITC Broth Base (Sig-
Modificações
ma-Aldrich 17156) com Ticarcillin Supplement
(Sigma-Aldrich 17778) e Potassium Chlorate Caldo Lactosado (CL) suplementado com so-
Supplement (Sigma-Aldrich 17777), ITC Broth lução de celulase 1%. Usado no pré-enriqueci-
Base (TTC Broth Base) (HiMedia M1220) com mento de goma guar. Dissolver 1g de celulase em
Ticarcillin Supplement (HiMedia FD102) e Po- 99 ml de água purificada, esterilizar por filtração
tassium Chlorate Supplement (HiMedia FD103). (filtro de 0,45µm) e estocar em geladeira (2-5 ºC)
por até duas semanas. No momento do uso, suple-
mentar o Caldo Lactosado (225 ml) com 2,25 ml
Caldo KF Streptococcus (KFB)
da solução de celulase.
Referência(s): Difco & BBL Manual (Zimbro & Caldo Lactosado (CL) suplementado com solu-
Power, 2003). ção de papaína 5%. Usado no pré-enriquecimen-
Aplicação. Meio seletivo para contagem de en- to de gelatina. Adicionar 5g de papaína a 95 ml de
terococos e estreptococos fecais em alimentos água purificada estéril e dissolver completamente.
pelo método do NMP APHA 10.2:2015. No momento do uso, suplementar o Caldo Lac-
Composição da base tosado (225 ml) com 5 ml da solução de papaína.
Proteose peptona 10g Lactose 1g Caldo Lactosado suplementado com Tergitol
Extrato de levedura 10g Maltose 20g 7 aniônico ou Triton X-100. Usado no pré-en-
Cloreto de sódio Púrpura de bromocresol riquecimento de carne, subprodutos de carne,
5g 0,015g
(NaCl) (1,5 ml da solução 1%) substâncias animais e produtos glandulares em
Glicerofosfato de Azida de sódio 0,4g pedaços. Esterilizar o Tergitol 7 ou o Triton X-100
10g
sódio Água purificada 1 litro separadamente. Para cada 225 ml de Caldo Lacto-
121 ºC/10min pH 7,2±0,2 sado, adicionar 2,25 ml Tergitol 7 aniônico ou 2-3
gotas de Triton X-100, depois da homogeneização

da amostra, descanso de 60min e ajuste do pH. Composição

Triptose* 20g Fosfato monopotássico
Caldo Lactose Sulfito (LS) Cloreto de sódio (NaCl) 5g (KH2PO4)
2,75g
Lactose 5g Lauril sulfato de sódio

Referência(s). ISO 7937:2004. 0,1g
Fosfato dipotássico [CH3(CH2)11OSO3Na]
Aplicação. Meio para Clostridium perfringens, (K2HPO4)
2,75g
usado na etapa de confirmação do método ISO 121 ºC/15min - pH 6,8±0,2
7937:2004. * ISO 7251 especifica peptona de tecido animal e vegetal (digestão enzimá-
tica) (20g). ISO 4831 especifica peptona de proteína do leite e proteína
Composição da base animal (digestão enzimática) (20g).
Peptona de caseína 5g Extrato de levedura 2,5g Preparação. Dissolver os ingredientes ou o meio

Lactose 10g Cloreto de sódio (NaCl) 2,5g completo desidratado, acertar o pH, distribuir
Cloridrato de L-cisteína 0,3g Água purificada 1 litro em tubos de 16x150mm com tubo de Durham
121 ºC/15min - pH final 7,1±0,2 (10 ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC/15min. Em
Suplemento caso do meio em concentração dupla, distribuir
Solução 1,2% de bissulfito de sódio 0,5 ml/tubo com
em tubos de 20x200mm.
(Na2S2O5 anidro) 8 ml Equivalentes comerciais. Lauryl Tryptose Broth
0,5 ml/tubo com
Solução 1% de citrato férrico amoniacal
8 ml
(DIFCO 224150), Lauryl Tryptose Broth (OXOID
CM 451), Lauryl Sulfate Broth (BBL 211338),
Preparação. Dissolver os ingredientes da base, Lauryl Sulfate Broth (MERCK 1.10266), Lauryl
ajustar o pH e distribuir em tubos (8 ml/tubo) com Sulfate Broth (ACUMEDIA 7142), Lauryl Tryptose
tubinhos de Durham. Esterilizar a 121 ºC/15min Concentração Dupla (LABORCLIN 910183) (meio
e estocar sob refrigeração (3±2 ºC) por até quatro pronto em tubos de 10 ml com Durham), Lauryl Tryp-
semanas. No momento do uso, adicionar a cada tose Concentração Simples (LABORCLIN 911169)
tubo com 8 ml da base, 0,5 ml de cada suplemen- (meio pronto em tubos de 10 ml com Durham).
to. Solução 1,2% de bissulfito de sódio: dissolver
1,2g de bissulfito de sódio (Na2S2O5) anidro em Caldo Lauril Sulfato Triptose
100 ml de água e esterilizar por filtração. Usar no Modificado Vancomicina (m-LST-V)
mesmo dia. Solução 1% de citrato férrico amonia-
cal: dissolver 1g de citrato férrico amoniacal em Referência(s): ISO 22964:2006.
100 ml de água e esterilizar por filtração. Usar no Aplicação. Meio seletivo para enriquecimento de
mesmo dia. Cronobacter pelo método ISO 22964:2006.
Equivalentes comerciais da base. Lactose Sul- Composição da base
phite Broth Base (HiMedia M1287). Caldo Lauril Sulfato Cloreto de sódio
1 litro 29g
Triptose (LST) (NaCl)
121 ºC/15min - pH 6,8±0,2
Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)
Suplemento
Referências(s): SMEWW (Hunt, 2012) se- 0,1 ml para 10 ml de
Solução aquosa de vancomicina base
ção 9221B (Lauryl Tryptose Broth), ISO
(final 10 mg/l)
7251:2005, ISO 4831:2006.
Preparação. Dissolver os ingredientes da base em
Aplicação. Teste presuntivo para coliformes totais, água, ajustar o pH, se necessário, para pH 6,8±0,2 a 25
coliformes termotolerantes e E. coli pelos mé- ºC. Distribuir em tubos de 18x160mm (10 ml/tubo)
todos do NMP APHA 9:2015, APHA/AWWA/ e esterilizar a 121 ºC/15min. Aguardar resfriar e
WEF 9221:2012, ISO 7251:2005, ISO 4831:2006, adicionar, a cada 10 ml da base, 0,1 ml da solução
AOAC 992.30. de vancomicina (concentração final de 10 mg/l).
O meio completo pode ser mantido sob refrigera-

ção (0 a 5 ºC) por um dia. Solução de vancomicina Composição

1 mg/ml. Dissolver 10 mg de vancomicina em 10 Triptona 10g
5g
(KH2PO4)
ml de água purificada, esterilizar por filtração e
Cloreto de sódio
manter sob refrigeração (0 a 5 ºC) por até 15 dias. Extrato de levedura 2g
(NaCl)
75g
Equivalentes comerciais do caldo LST. Lauryl Lactose 2g Azida de sódio (NaN3) 0,049g
Manitol 10g Água purificada 1 litro
Tryptose Broth (DIFCO 224150), Lauryl Trypto-
Fervura/4min, pH final 7,0±0,2
se Broth (OXOID CM 451), Lauryl Sulfate Broth
(BBL 211338), Lauryl Sulfate Broth (MERCK Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar
1.10266), Lauryl Sulfate Broth (ACUMEDIA o pH, distribuir em tubos (10 ml/tubo) e ferver/
7142). 4min. Para a inoculação de 10 ml de água, prepa-
rar em concentração dupla.
Caldo Malonato Modificado Equivalentes comerciais (sem a azida de sódio).
M-Staphylococcus Broth (DIFCO 264920).
Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de Caldo Nitrato
utilização do malonato. Usado na confirmação de
Salmonella, método BAM/FDA. Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
Composição rello, 2015), p.921, BAM (FDA, 2015a) M108.
Sulfato de amônia
(NH4)2SO4
2g
Malonato de sódio 3g
redução do nitrato. Usado na confirmação de
Fosfato dipotássico B. cereus pelo método APHA e L. monocyto-
0,6g Glicose 0,25g
(K2HPO4) genes pelo método BAM/FDA
(KH2PO4)
0,4g Azul de bromotimol 0,025g Composição
Cloreto de sódio (NaCl) 2g Água purificada 1 litro Nitrato de potássio
Peptona 5g 1g
(KNO3)
121 ºC/15min - pH 6,7±0,2
Extrato de carne 3g Água purificada 1 litro
Preparação. Dissolver os ingredientes, acertar o 121 ºC/15min - pH 7,0±0,2
pH em 6,7±0,2, distribuir em tubos de 13x100mm
(3 ml/tubo) e esterilizar a121 ºC/15min.
pH, distribuir em tubos de 10x100mm (5 ml/tubo)
Equivalentes comerciais. Malonate Broth Mo- e esterilizar a 121 ºC/15min.
dified (DIFCO 256910), Malonate Broth Ewing
Equivalentes comerciais. Nitrate Broth (DIFCO
Modified (BBL 211399).
226810) (também contém 1g/l de proteose pep-
tona Nº3), Nitrato Caldo (LABORCLIN 910026)
Caldo MRS (meio pronto em tubos).
(De Man, Rogosa & Sharpe)
Caldo Nutriente (NB)
Vide Ágar/Caldo MRS.
Vide Ágar/Caldo Nutriente.
Caldo M-Staphylococcus
Caldo Nutriente Lisozima
Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) seção
9213.B.6.c. Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
Aplicação. Meio seletivo para detecção presun- rello, 2015) p.913.
tiva de Staphylococcus aureus em água pelo Aplicação. Meio para verificação da capacidade de
método de NMP APHA/AWWA/WEF:2012. crescimento na presença de lisozima, na confir-
mação de Bacillus cereus, métodos APHA:2015.

Preparação. Preparar o caldo nutriente e esterilizar Preparação. Dissolver os ingredientes com leve
a 121 ºC/15min. Resfriar e adicionar assepticamen- aquecimento, ajustar o pH em 6,3±0,2 e esterilizar
te, para cada 99 ml de caldo, 1 ml de solução de liso- a 121 ºC/15min.
zima 0,1%, distribuindo em tubos estéreis. Solução Equivalentes comerciais. Universal Preenrich-
0,1% de lisozima. Dissolver 0,1g de lisozima em 65 ment Broth (DIFCO 223510), Universal Preen-
ml de HCl 0,01N, ferver por 20 minutos e comple- richment Broth (ACUMEDIA 7510).
tar assepticamente o volume para 100 ml, com HCl
0,01N estéril. Alternativamente, dissolver a lisozima Caldo Púrpura Base Carboidratos
em 100 ml de água purificada e esterilizar por filtra-
ção em filtro membrana de 0,2 µm. Referência(s): ISO 11290-1(1996), BAM (FDA,
2015a) M130.
Caldo Peptona Sorbitol Bile (PSBB) Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de
fermentação de carboidratos.
rello, 2015), p.922, ISO 10273:2003. Composição da base
Proteose peptona 10g Púrpura de bromocresol 0,02g
Aplicação. Meio seletivo para enriquecimento de
Extrato de carne 1g
Yersinia enterocolitica. Cloreto de sódio (NaCl) 5g
Composição 121 ºC/15min - pH final 6,8±0,2
Peptona 5g Fosfato monossódico Suplemento

1,2g
Sorbitol 10g (NaH2PO4.H2O) Solução aquosa do a quantidade necessária para a
Cloreto de sódio (NaCl) 5g Sais biliares Nº 3 1,5g carboidrato a 10% concentração final desejada
(esterilizada por filtração) (0,5 ou 1%)
Fosfato dissódico
(Na2HPO4) Preparação. Dissolver os ingredientes da base,
121 ºC/15min - pH 7,6±0,2 ajustar o pH em 6,8, distribuir em tubos de
Preparação. Dissolver os ingredientes ou meio 10x100mm com tubinhos de Durham (4 ml/tubo)
completo desidratado em água e esterilizar a 121 e esterilizar a 121 ºC/15min. Separadamente, pre-
ºC/15min. parar uma solução 10% do carboidrato a ser testa-
Equivalentes comerciais. Peptone Sorbitol Bile do e esterilizar por filtração. Adicionar asseptica-
Broth (Sigma-Aldrich 17192), Peptone Sorbitol mente aos tubos de base a quantidade de solução
Bile Broth (HiMedia M1231). necessária para atingir a concentração final dese-
jada (para concentração final de 0,5%, adicionar
Caldo de Pré-Enriquecimento 0,2 ml de solução/4 ml de base).
Universal Equivalentes comerciais. Purple Broth Base
(BBL 211558).
Aplicação. Meio de pré-enriquecimento para Sal- Caldo Rappaport-Vassiliadis
monella em amostras de caseína, frutas e sucos Modificado (RV = R10)
de frutas, método BAM/FDA.
Caldo Rappaport-Vassiliadis Soja
Composição
(RVS)
Triptona 5g Dextrose 0,5g
Proteose peptona 5g
0,25g Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M132 (RV =
mgSO4)
Fosfato monopotássico Citrato férrico
R10), ISO 6579:2002.
15g 0,1g
(KH2PO4) amoniacal Aplicação. Meio seletivo para enriquecimento de
Fosfato dissódico
7g Piruvato de sódio 0,2g Salmonella.
(Na2HPO4)
Cloreto de sódio (NaCl) 5g Água purificada 1 litro Composição do meio formulado no laboratório.
121 ºC/15min - pH, 6,3±0,2 Há duas formulações do Caldo Rappaport-Vassi-

liadis recomendadas para a análise de Salmonella. Preparação do meio completo. Para preparar o
O Caldo Rappaport-Vassiliadis Modificado (RV), meio completo, juntar 1 litro da solução A, 100 ml
também chamado de R10 e o Caldo Rappaport- da solução B e 10 ml da solução C, ajustando o pH
-Vassiliadis Soja (RVS). A principal diferença en- em 5,2±0,2. Distribuir em tubos de 16x150mm
tre eles é a fonte da peptona usada. O método do (10 ml/tubo) ou em frascos com a quantidade re-
BAM/FDA recomenda o RV. A ISO 6785 e a ISO querida para o uso. Esterilizar a 115 ºC/15min. A
6579 recomendam o RVS. O método do MLG/FSIS ISO 6579 (2002) recomenda estocar sob refrige-
recomenda ambos. Para a formulação no laborató- ração (3±2 ºC) até o momento do uso e usar no
rio, preparar separadamente as seguintes soluções: mesmo dia. O BAM/FDA recomenda estocar sob
Solução A para a formulação do RV (R10) refrigeração por até um mês.
Triptona 5g Equivalentes comerciais da formulação RVS.
NaCl 8g Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone Broth (RVS)
Fosfato monopotássico (KH2PO4) 1,6g (OXOID CM 866), Rappaport-Vassiliadis Broth
Água destilada 1 litro (RVS) (MERCK 1.07700).
Dissolver os ingredientes, aquecendo se necessário. Essa solução
Equivalentes comerciais da formulação RV*.
deve ser preparada no dia em que for preparado o meio completo.
Rappaport-Vassiliadis R10 Broth (DIFCO 218581)
Solução A para a formulação do RVS
(peptona de caseína), Rappaport-Vassiliadis R10
Peptona de Soja 5g
Broth (ACUMEDIA 7512) (peptona de caseína),
NaCl 8g
Rappaport Caldo (LABORCLIN 910080) (meio
Fosfato monopotássico (KH2PO4) 1,4g
pronto em tubos com 9 ml).
Fosfato dipotássico (K2HPO4) 0,2g
Água destilada 1 litro
* O BAM/FDA não recomenda o uso dos equivalentes co-
merciais, mas sim, a preparação no laboratório, a partir
Dissolver os ingredientes, aquecendo se necessário. Essa solução
deve ser preparada no dia em que for preparado o meio completo. dos ingredientes da formulação.
Solução B
MgCl2.6 H2O 400g
Caldo Rogosa SL
Água destilada 1 litro Vide Ágar/Caldo Rogosa SL.
Mantendo a proporção, dissolver todo o conteúdo de um novo frasco
de cloreto de magnésio na água, porque o sal é muito higroscópico.
Por exemplo, adicionar 250g do sal à 625 ml de água, o que vai Caldo Selenito Cistina (SC)
resultar em um volume total de 788 ml de solução. Acondicionar em
frasco escuro, com a tampa bem apertada. Segundo a ISO 6785:2001 Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M134.
e ISO 6579 (2002), a solução pode ser estocada à temperatura am-
biente por até dois anos. O BAM/FDA recomenda um ano. Aplicação. Caldo para enriquecimento seletivo
Solução C de Salmonella, métodos BAM/FDA (análise
de goma guar).
Verde de malaquita oxalato (MERCK) 0,4g
Água destilada 100 ml Composição
Dissolver o corante na água e estocar em frasco escuro. Segundo a Triptona ou polipeptona 5g Selenito ácido de sódio
ISO 6785:2001 e a ISO 6579:2002 a solução pode ser estocada à 4g
Lactose 4g (NaHSeO3)
temperatura ambiente por até oito meses. O BAM/FDA recomen-
da seis meses. O BAM/FDA recomenda ainda que seja utilizado Fosfato dissódico L-Cistina 0,01g
10g
o verde de malaquita oxalato da MERCK, porque outras marcas (Na2HPO4) Água purificada 1 litro
podem não ser tão efetivas. Aquecer 10min em vapor fluente, pH final 7,0±0,2
Meio completo (formulado no laboratório)* Preparação. Dissolver os ingredientes na água,

Solução A 1000 ml distribuir em tubos de 16x150mm (10 ml/tubo) e
Solução B 100 ml aquecer por 10min em vapor fluente. Não autocla-
Solução C 10 ml
var. O meio não é estéril, usar no mesmo dia.
115 ºC/15min, pH final 5,2±0,2 (5,5±0,2 no BAM)
Equivalentes comerciais. Selenite Cystine Broth
* A preparação dos equivalentes comerciais é diferente, devendo ser seguida
a orientação do fabricante.

(DIFCO 268740), Selenite Cystine Broth (MERCK th Base (MERCK 1.05285), Tetrathionate Broth
1.07709), Selenite Cystine Broth (ACUMEDIA 7283). USA (OXOID CM 671), Tetrathionate Broth Base
(ACUMEDIA 7241), Tetrationato Caldo (LA-
Caldo Soro de Laranja (OSB) BORCLIN 510162) (meio pronto em tubos com
10 ml, já contem verde brilhante).
Vide Ágar/Caldo Soro de Laranja.
Caldo T1N0 e T1N3 Caldo Tetrationato Hajna (TTH)
Vide Ágar/Caldo T1N0 - T1N1 - T1N3. Referência(s): MLG (USDA, 2013).

Aplicação. Meio de enriquecimento seletivo para
Caldo Tetrationato (TT) Salmonella, método MLG/FSIS/USDA.
Extrato de levedura 2g Cloreto de sódio (NaCl) 5g
Aplicação. Meio de enriquecimento seletivo para Triptose 18g Tiossulfato de sódio 38g
Salmonella, método BAM/FDA. Carbonato de cálcio
Dextrose 0,5g 25g
(CaCO3)
D-manitol 2,5g Verde brilhante 0,01g
Polipeptona 5g Carbonato de cálcio
10g Desoxicolato de sódio 0,5g Água purificada 1 litro
Sais biliares 1g (CaCO3)
Aquecer até a fervura – pH final 7,6±0,2
pentahidratado 30g Água purificada 1 litro Suplemento
(Na 2S2O3.5H2O) Solução de iodo 40 ml/litro base
Aquecer até a fervura - pH final 8,4±0,2
Preparação. Dissolver os ingredientes da base
Suplemento
aquecendo até a fervura. Não autoclavar. Estocar
20 ml/litro de
Solução de iodo sob refrigeração (2-8 ºC) por até seis meses. No
base
Solução 0,1% de verde brilhante

10 ml/litro de momento do uso adicionar a cada litro de base 40
base
ml de solução de iodo e ajustar o pH em 7,6±0,2,
Preparação. Suspender os ingredientes da base e se necessário. Misturar bem e distribuir em tu-
aquecer até a fervura. Não autoclavar. O precipi- bos ou frascos, na quantidade necessária para o
tado não vai dissolver completamente. Estocar a uso. Utilizar imediatamente, o meio completo não
sob refrigeração (5-8 ºC). No momento do uso, deve ser estocado.
adicionar a cada litro de base, 20 ml de solução de
Preparo da solução de iodo
iodo e 10 ml de solução 0,1% de verde brilhante.
Iodo cristais 5g
Distribuir assepticamente em tubos ou frascos, na
Iodeto de potássio (KI) 8g
quantidade necessária para o uso. Utilizar imedia- Água purificada estéril Completar para 40 ml
tamente, o meio completo não deve ser estocado. Dissolver o iodeto de potássio em 20 ml de água purificada esté-
Preparação da solução de iodo ril, adicionar o iodo e agitar a té a completa dissolução. Completar
o volume para 40 ml com água purificada estéril. Acondicionar
Iodo 6g em frasco escuro (protegido da luz) e estocar sob refrigeração ou
Água purificada estéril 20 ml
Iodeto de potássio (KI) 5g à temperatura ambiente.
Dissolver o iodeto de potássio em 5 ml de água purificada estéril.
Equivalentes comerciais da base. TT Broth Base
Adicionar o iodo e agitar para dissolver. Completar o volume para
20 ml com a água estéril. Hajna (DIFCO 249120).
Preparação da solução 0,1% de verde brilhante
100 Caldo Tetrationato Muller
Verde brilhante 0,1g Água purificada
ml Kauffmann Novobiocina (MKTTn)
Dissolver o verde brilhante em 100 ml de água purificada estéril.
Equivalentes comerciais da base. Tetrathionate
Broth Base (DIFCO 210430), Tetrathionate Bro- Aplicação. Meio de enriquecimento seletivo para
Salmonella, método ISO 6579.

Composição da base Caldo Tripticase de Soja (TSB)

Extrato de carne 4,3g Tiossulfato de sódio
pentahidratado 47,8g Referência(s): MLG (USDA, 2013), BAM (FDA,
Triptona 8,6g
(Na2S2O3.5H2O)* 2015a), ISO 22964:2006, ISO 10273:2003,
Cloreto de sódio Ox bile para uso
2,6g 4,78g ISO 11290-1:1996, ISO 11290-2:1998.
(NaCl) bacteriológico
9,6 Aplicação. Meio de enriquecimento e manuten-
Carbonato de cálcio Verde brilhante
38,7g mg ção para uso geral.
(CaCO3)
Composição
Fervura/5min - pH final 8,0±0,2 Peptona de caseína Fosfato dipotássico
17g 2,5g
(digestão enzimática) (K2HPO4)
* Tiossulfato de sódio anidro usar 30,5g.
Peptona de soja
3g Dextrose 2,5g
Suplemento (digestão enzimática)
Cloreto de sódio (NaCl) 5g Água purificada 1 litro
Solução de iodo 20 ml/l base
121 ºC/15min - pH 7,3±0,2
Solução 0,8% de novobiocina 5 ml/l base
Preparação. Dissolver os ingredientes e esterili-
Preparação. Dissolver os ingredientes da base e zar a 121 ºC/15min.
ferver por 5 minutos. Não autoclavar. Ajustar o Equivalentes comerciais (com dextrose). Tryp-
pH em 8,0±0,2, se necessário. Estocar sob refri- tone Soya Broth (OXOID CM 129), Tryptic Soy
geração (3±2 ºC) por até 4 semanas. O precipita- Broth (Caso Broth) (MERCK 1.05459), Tryp-
do que se forma é normal. No momento do uso, tic Soy Broth (BACTO 211825), Trypticase Soy
adicionar a cada litro de base, 5 ml da solução de Broth (BBL 211768), Tryptic Soy Broth (ACU-
novobiocina, misturar bem e adicionar 20 ml da MEDIA 7164), Tryptic Soy Caldo (LABORCLIN
solução de iodo. Misturar bem e distribuir em tu- 910040) (meio pronto em frascos com 225 ml).
bos de 16x150mm (10 ml/tubo) ou em frascos, na Equivalentes comerciais (sem dextrose). Tryp-
quantidade necessária para o uso. Utilizar imedia- tic Soy Broth/without dextrose (BACTO 286220).
tamente, o meio completo não deve ser estocado.
Modificações
Preparo da solução de iodo
Caldo Tripticase de Soja com 2-3% de NaCl.
Iodo 20g
Usado na análise de V. parahaemolyticus, é pre-
Iodeto de potássio (KI) 25g parado aumentando a concentração de sal para 20
Água purificada estéril 100 ml a 30g/l, antes da esterilização do meio. O TSB já
Dissolver completamente o iodeto de potássio em 10 ml de água contém 5g/l de NaCl.
purificada estéril, adicionar o iodo e diluir a 100 ml com água
purificada estéril. Não aquecer. Acondicionar em frasco escuro Caldo Tripticase de Soja com 10% de NaCl e
(protegido da luz) com tampa bem apertada e estocar à tempera- 1% de piruvato de sódio. Usado na contagem
tura ambiente.
de S. aureus pelo NMP, é preparado aumentando
Preparo da solução 0,8% de novobiocina a concentração de sal para 100g/l e adicionando
Novobiocina (sal sódico) 0,04g 10g/l de piruvato de sódio ao TSB, antes da este-
Água destilada 5 ml rilização do meio. O TSB já contém 5g/l de NaCl.
Dissolver a novobiocina na água destilada e esterilizar por filtra- Caldo Tripticase de Soja com 20% de NaCl.
ção. Estocar sob refrigeração (3+2 ºC) por até 4 semanas.
Usado no teste de presença/ausência de S. au-
Equivalentes comerciais da base. Muller-Kauf- reus, é preparado aumentando a concentração de
fmann Tetrathionate Novobiocin Broth (MERCK sal para 200g/l, antes da esterilização do meio. O
1.05878) (já tem novobiocina). TSB já contém 5g/l de NaCl.
Caldo Tripticase de Soja com polimixina. Usado
na contagem de B. cereus pelo NMP, é preparado
Caldo Thermoacidurans (TAB) adicionando 10 ml/l uma solução 10.000IU/ml de
Vide Ágar/Caldo Thermoacidurans. sulfato de polimixina B ao TSB, depois da esterili-

zação do meio. Solução de sulfato de polimixina B Preparação. Dissolver os ingredientes em água

10.000IU/ml. Dissolver 500.000 unidades do sulfa- purificada, distribuir em tubos de 10x100mm (5
to de polimixina em 50 ml de água destilada, este- ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC/15min.
rilizar por filtração e estocar sob refrigeração. Para Equivalentes comerciais. Tryptone Water (MERCK
determinar o peso de polimixina necessário para 1.10859) (sem triptofano, pH 7,3), Tryptone Water
500.000 unidades, verificar no frasco a potência da (OXOID CM 87) (sem triptofano, pH 7,5), Tryp-
polimixina adquirida (varia entre as marcas e lotes). tone Water (DIFCO 264410) (sem triptofano, pH
Por exemplo, se a potência for 7.900U/ mg, signi- 7,3), Triptone Caldo (LABORCLIN 910012) (meio
fica que cada miligrama tem 7.900 unidades e que pronto em tubos, inclui 1g/l de L-Triptofano).
são necessárias 63,29 mg para 500.000 unidades.
Caldo Tripticase de Soja com K2SO3. Usado na
análise de Salmonella para amostras de condi-
Caldo Triptona Glicose Extrato
mentos, é preparado adicionando 5g/l de sulfito de Levedura 0,5% Ácido Acético
de potássio (K2SO3) ao TSB, antes da esteriliza- (TGYB)
ção do meio. Vide Ágar/Caldo Triptona Glicose Extrato de
Caldo Tripticase de Soja com sulfato ferroso. Levedura 0,5% Ácido Acético.
Usado na análise de Salmonella para amostras de
ovos, é preparado adicionando 35 mg/l de sulfato
ferroso ao TSB, antes da esterilização do meio. Caldo Universidade de Vermont
Caldo Tripticase de Soja Extrato de Levedura Modificado (UVM)
(TSB-YE). Usado na análise de L. monocytoge-
Referência(s): MLG (USDA, 2013).
nes e E. coli O157:H7, é preparado adicionando
6g/l (0,6%) de extrato de levedura ao meio, antes Aplicação. Meio de enriquecimento seletivo pri-
da esterilização. mário para L. monocytogenes, método MLG/
FSIS/USDA.
Caldo Tripticase de Soja (TSB) em concentra-
ção dupla. Usado no teste de presença/ausência Composição
de S. aureus, é preparado adicionado-se o dobro Proteose peptona 5g Fosfato dissódico
12g
da quantidade dos ingredientes por litro de água. Triptona 5g (Na2HPO4)
Extrato de levedura 5g Esculina 1g
Caldo Triptona 1% Extrato de carne - Lab

5g
Ácido nalidíxico (solu-
1 ml
Lemco Powder (Oxoid) ção 2% em NaOH 0,1M)
Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) section 12
Cloreto de sódio (NaCl) 20g Acriflavina
mg
9221F (Tryptone Water), BAM (FDA, 2015a), Fosfato monopotássico
ISO 6579:2002, ISO 7251:2005 (Peptone Water). (KH2PO4)
Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de 121 ºC/15min - pH final 7,2±0,2
indol. Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o

Composição a pH e esterilizar a 121 ºC/15min. Estocar sob re-
Triptona b 10g frigeração.
Cloreto de sódio (NaCl) c 5g
Equivalentes comerciais. UVM Modified Listeria
Enrichment Broth (DIFCO 222330, UVM Modified
121 ºC/15min - pH 7,3+0,2 d
a A formulação descrita pela ISO 6579:2002 para a análise de Salmonella
Listeria Enrichment Broth (ACUMEDIA 7409),
inclui ainda 1g/l de DL-Triptofano. Listeria Enrichment Broth Base UVM Formulation
b A formulação descrita pela ISO 7251:2005 especifica 10g de peptona de
(OXOID CM 863) (sem ácido nalidíxico e acrifla-
caseína (digestão enzimática).
c A formulação descrita pelo BAM não inclui cloreto de sódio (NaCl). vina) + Listeria Primary Selective Enrichment Su-
d A formulação descrita pelo BAM especifica pH 6.9±0.2 e a ISO 7251:2005
pplement UVM I Formulation (OXOID SR 142).
especifica pH 7.3±0.2.

Caldo Ureia Rápido pelos métodos do NMP APHA 9:2015, APHA/

AWWA/WEF 9221:2012, ISO 4831: 2006.
Composição
Peptona* 10g Verde brilhante 0,0133g
urease, usado na confirmação de Salmonella
Lactose 10g
no método BAM/FDA. Água purificada 1 litro
Bile de boi (“oxgall”) 20g
Composição 121 ºC/15min - pH 7,2±0,2
Fosfato monopotássico * A ISO 4831 especifica peptona de proteína do leite e proteína animal
Uréia 20g 0,091g
(KH2PO4) (digestão enzimática) (20g).
Extrato de levedura 0,1g Vermelho de fenol 0,01g
Preparação. Dissolver os ingredientes, acertar o
Fosfato dissódico
(Na2HPO4)
0,095g Água purificada 1 litro pH, distribuir em tubos de 16x150mm com tubo
Esterilizar por filtração - pH final 6,8±0,2 de Durham (aproximadamente 6 ml/tubo ou o vo-
Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o lume suficiente para cobrir os tubos de Durham
pH e esterilizar for filtração com filtro membra- após a esterilização). Esterilizar a 121 ºC/15min.
na de 0,45µm. Distribuir em tubos estéreis de Equivalentes comerciais. Brilliant Green Bile
10x100mm (1,5 a 3 ml/tubo). Broth 2% (DIFCO 274000), Brilliant Green Bile
Equivalentes comerciais. Não disponível. Broth 2% (OXOID CM 31), Brilliant Green 2%
Bile Broth (MERCK 1.05454), Brilliant Gre-
Caldo Ureia de Rustigian & Stuart en Bile Broth 2% (ACUMEDIA 7119), Brilliant
Green Bile 2% (LABORCLIN 910168) (meio
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M171, ISO pronto em tubos com Durham).
10273:2003.
Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de Caldo Vermelho de
urease, usado na confirmação de Salmonella Fenol-Carboidratos
no método BAM/FDA e de Yersinia enteroco-
Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M121, ISO
litica no método ISO 10273.
10273:2003
Composição
Uréia 20g Fosfato monopotássico
Extrato de levedura 0,1g (KH2PO4)
9,1g fermentação de carboidratos.
Fosfato dipotássico Vermelho de fenol 0,01g Composição da base
(K2HPO4) ou dissódico 9,5g
(Na2HPO4) Água purificada 1 litro Vermelho de fenol
Tripticase ou Proteose
10g (9 ml da solução 0,018g c
Esterilizar por filtração – pH final pH 6.8±0.2 peptona no 3 a
0,2%)
Preparação. Dissolver os ingredientes e esterili- Extrato de carne b 1g
zar for filtração com filtro membrana de 0,45µm. Cloreto de sódio (NaCl) 5g
Distribuir em tubos estéreis de 10x100mm (1,5 a 121 ºC/15min - pH 7,4±0,2 d
3 ml/tubo). a ISO 10273:2003 especifica peptona (10g).
b Opcional na formulação do BAM e não utilizado na ISO 10273:2003.
Equivalentes comerciais. Urea Broth (DIFCO c 0.02g na formulação da ISO 10273:2003.
227210), Urea Broth (MERCK 1.08483). d 121 ºC/10min, pH final 6.8±0.2 na ISO 10273:2003.
Suplemento
Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB)
Solução aquosa do a quantidade necessária para
carboidrato a 10% a concentração final desejada
Referências(s): SMEWW (Hunt, 2012) seção
(esterilizada por filtração) (0,5 ou 1%)
9221B (Brilliant Green Lactose Bile Broth),
ISO 4831:2006. Preparação. Dissolver os ingredientes da base, ajus-
Aplicação. Teste confirmativo para coliformes totais tar o pH, distribuir em tubos de 10x100mm com tu-

binhos de Durham (4 ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC/ pH, distribuir em tubos de 10x100mm (5 ml/tubo)
15min. Separadamente, preparar uma solução 10% e esterilizar a 121 ºC/15min.
do carboidrato a ser testado e esterilizar por filtração. Equivalentes comerciais. Não disponível.
Adicionar assepticamente aos tubos de base a quan-
tidade de solução necessária para atingir a concentra- Discos de Indoxil Acetato
ção final desejada (para concentração final de 0,5%,
adicionar 0,2 ml de solução/4 ml de base). Referência(s). ISO 10272-1:2006, ISO 10272-
2:2006.
Equivalentes comerciais da base. Phenol Red
Broth Base (ACUMEDIA 7148), Phenol Red Aplicação. Reagente para prova bioquímica, teste
Broth Base (BBL 211506), Phenol Red Broth de hidrólise do indoxil acetato. Usado na análi-
Base (MERCK 1.10987). se de Campylobacter pelo método ISO 10272-
1:2006, ISO 10272-2:2006.
Caldo VM VP Preparação. Dissolver 0,1g de indoxil acetato
(sinônimos: 3-acetoxindol ou ácido acético 3-in-
Referência(s): ISO 6579:2002. dolil ester) em 1 ml de acetona. Distribuir porções
Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de de 25 a 50µl dessa solução em discos de papel
vermelho de metila e Voges Proskauer. Usado na de filtro branco, com diâmetro de 0,6 a 1,2cm.
confirmação de E. coli e Salmonella. Aguardar que os discos sequem à temperatura am-
Composição biente e estocar sob refrigeração (4 ºC), em frasco
escuro, na presença de sílica gel.
Peptona 7g 5g
(K2HPO4) Equivalentes comerciais. Indoxyl Strips (Aceto-
xyindol Strips) (Fluka 04739).
121 ºC/15min - pH final 6,9±02
Preparação. Dissolver os ingredientes na água Escala de McFarland

purificada, acertar o pH em 6,9±02 e distribuir em
Referência(s). Compendium (Salfinger & Torto-
tubos de 10x100mm (método APHA 2001 usa 6
rello, 2015) p.940.
ml/tubo, método ISO 6579 usa 3 ml/tubo). Esteri-
Preparação. Preparar uma solução 1% (volume/
lizar a 121 ºC/15min.
volume) de ácido sulfúrico e uma solução 1% (vo-
Equivalentes comerciais. MR-VP Broth (ACU- lume/volume) de cloreto de bário. Misturar, em
MEDIA 7237), MR-VP Broth (BBL 211383), tubos separados, as seguintes quantidades de cada
MR-VP Broth (MERCK 1.05712), MR-VP uma das soluções, para obter os padrões da escala:
Medium (DIFCO 216300), MR-VP Medium
(OXOID CM 43). Padrão da Escala Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Volume de solução
1% de cloreto de 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Caldo VP Modificado para Bacillus bário ( ml)
Volume de solução
1% de ácido 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Referência(s). Compendium (Salfinger & Torto- sulfúrico ( ml)
rello, 2015) p.919. Concentração
aproximada de
Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de microrganismos
300 600 900 1.200 1.500 1.800 2.100 2.400 2.700 3.000
VP, usado na confirmação de Bacillus cereus. (x106/ml)

Distribuir as soluções padrão da escala em tubos pequenos
Composição (3 ml/tubo), selecionando tubos com as paredes bem transparentes,
uniformes e livres de riscos e defeitos, para leitura de absorbância.
Proteose peptona 7g Cloreto de sódio (NaCl) 5g
Glicose 5g Água purificada 1 litro Equivalentes comerciais.API McFarland Kit (Bio-
121 ºC/15min - pH final 6,5±0,2 Mérieux 70900), McFarland Equivalence Turbi-
Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o dity Standard Set (REMEL R20421).

Etanol 70% Composição

Tornassol (litmus) 0,75g
Vide Álcool 70%. Leite em pó desnatado 100g
121 ºC/15min - pH final 6,8±0,2
Formalina
Preparação. Dissolver os ingredientes na água,
Vide Solução Salina Formalinizada.
acertar o pH e distribuir em tubos (6-7 ml/tubo).
Esterilizar a 121 ºC/15minutos.
Leite em Pó Desnatado Equivalentes Comerciais. Litmus Milk (BBL
Reconstituído 211343).
Referência(s). BAM (FDA, 2015a) M111 Meio de Carne Cozida (CMM)
Aplicação. Pré-enriquecimento na análise de Sal-
monella em chocolate, balas, confeitos e co- Referência(s). BAM (FDA, 2015a) M42.
berturas para confeitos, método BAM FDA. Aplicação. Meio para cultivo de bactérias anaeró-
Composição bias.
Leite desnatado em pó 100g

Composição
Água purificada 1 litro Coração de boi 454g Cloreto de sódio (NaCl) 5g
121 ºC/15min Proteose peptona 20g

Dextrose 2g
Preparação. Suspender 100g do leite desnatado 121 ºC/15min - pH final 7,2±0,2
em pó em 1 litro de água purificada. Agitar até Preparação. Para preparar a partir do equivalen-
dissolver. Esterilizar a 121 ºC/15min. Após a ino- te comercial, distribuir 1,25g das partículas do
culação da amostra, descanso por 60min e ajuste meio sólido em tubos de 20x150mm e adicionar
do pH, suplementar cada 225 ml de leite com 4,5 10 ml de água purificada a cada tubo. Manter em
ml de solução aquosa 0,1% de verde brilhante es- repouso por 15 minutos, para a reidratação das
téril (ou 0,45 ml da solução 1%). Solução 0,1% de partículas, e esterilizar a 121 ºC/15min. Para pre-
verde brilhante. Dissolver 0,1g de verde brilhante parar a partir dos ingredientes individuais, moer
em 100 ml de água destilada e esterilizar por fil- a carne e cozinhar em um litro de água purificada
tração. Estocar em frasco escuro, sob refrigeração. por uma hora. Esfriar, ajustar o pH em 7,2 e fer-
ver por mais 10 minutos. Filtrar em duas camadas
Modificações
de gaze, pressionando bem para recolher todo o
Leite em pó desnatado dissolvido em Tampão caldo. Adicionar os outros ingredientes ao caldo,
Fosfato (0,1g/100 ml). Recomendado no Capítu- repor a água evaporada até completar um litro e
lo 9 do Standard Methods for the Examination of ajustar o pH. Armazenar o caldo e a carne sepa-
Dairy Products (Wher & Frank, 2004), para a pre- radamente, sob congelamento. Para a preparação
paração de amostras de iogurtes e outros produtos do meio completo, descongelar o caldo e distri-
fermentados ou acidificados. Para a formulação, buir em tubos de 20x180mm (15 ml/tubo). Antes
adicionar 1g de leite em pó desnatado em um litro de distribuir o caldo nos tubos, adicionar a cada
de tampão fosfato e esterilizar a 121 ºC/15min. tubo, uma pequena quantidade da carne moída ar-
mazenada, formando uma camada de pelo menos
Leite Tornassolado (Litmus Milk) 1,2cm. Esterilizar a 121 ºC/15min.
Equivalentes comerciais. Cooked Meat Broth
Referência(s). Cetesb (1993).
(MERCK 1.10928), Cooked Meat Medium (ACU-
Aplicação. Meio para verificar fermentação tem- MEDIA 7110), Cooked Meat Medium (DIFCO
pestuosa do leite por Clostridium perfringens. 226730), Cooked Meat Medium (OXOID CM 81).

Modificações Pseudomonas, usado na confirmação de Pseu-

CMM suplementado com amido solúvel e glico- domonas aeruginosa em água, método ISO
se. Usado preferencialmente na detecção de clostrí- 16266:2006.
dios não proteolíticos. Prepare o CMM comercial- Composição
mente disponível como descrito acima, mas incluir Peptona 20g Glicerol 10 ml
0,1% de amido e 0,1% de glicose na água purificada (K2HPO4)
1,5g Ágar 15g
utilizada para suspender as partículas de carne. Sulfato de magnésio
heptahidratado 1,5g Água purificada 1 litro
( mgSO4.7H2O)
Meio de Fermentação de 121 ºC/15min – pH final 7.2±0.2
Carboidratos para
Preparação. Suspender os ingredientes na água
Clostridium perfringens
purificada, acertar o pH e aquecer até a fusão do
Referência(s). Compendium (Salfinger & Torto- ágar. Distribuir em tubos (5 ml/tubo) e esterilizar
rello, 2015) p.905. a 121 ºC/15min. Inclinar e estocar sob refrigera-
Aplicação. Meio para teste de fermentação de car- ção (5±3 ºC) protegido da luz por até três meses.
boidrato, usado na confirmação de Clostridium Equivalentes comerciais. Pseudomonas Agar F
perfringens, métodos APHA 33.71/72:2015. (DIFCO 244820), Pseudomonas Agar F (MERCK
Composição 1.10989) (Não contém o glicerol, que deve ser ad-
Tripticase 10g Tioglicolato de sódio 0,25g
cionado separadamente).
Neopeptona 10g
Ágar 2g
Água destilada 1 litro Meio de Lactose Gelatina (MLG)
pH 7,4±0,2 - 121 ºC/15min Referência(s). Compendium (Salfinger & Torto-
Suplemento estéril rello, 2015), p.911.
Carboidrato (Solução 10%) 1 ml/9 ml de meio Aplicação. Meio para prova bioquímica, teste de
base fermentação da lactose e hidrólise da gelatina
Preparação. Preparar a base, aquecendo até a fu- para Clostridium perfringens.
são do ágar. Distribuir em tubos de 16x150mm (9 Composição
ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC/15min. Preparar se- Vermelho de fenol (5
Triptose 15g ml da solução 0,05g
paradamente uma solução aquosa a 10% do carboi-
alcoólica 1%)
drato a ser testado, esterilizar por filtração e estocar Extrato de levedura 10g Gelatina 120g
sob refrigeração. No momento do uso, ferver os tu- Lactose 10g Água destilada
completar
para 1 litro
bos com a base por 15 minutos em banho, para de-
121 ºC/10min - pH 7,5±0,2
saeração, resfriando imediatamente a 55-50 ºC, em
banho de gelo. Adicionar assepticamente, a cada 9 Preparação. Dissolver a triptose, o extrato de le-
ml de base, 1 ml da solução de carboidrato. Não in- vedura e a lactose em 400 ml de água destilada,
clinar. Solução 0,04% de azul de bromotimol para aquecendo se necessário. Suspender a gelatina em
teste de fermentação. Dissolver 0,1g do azul de 600 ml de água destilada e aquecer até a fusão.
bromotimol em 16 ml de NaOH 0,01N e completar Juntar as duas soluções e ajustar o pH em 7,5±0,2.
o volume para 250 ml com água destilada. Adicionar os 5 ml da solução de vermelho de fenol
Equivalentes comerciais. Não disponível. e misturar bem. Distribuir em tubos de 16x150mm
(10 ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC/10min. Se o meio
Meio de King B não for usado no intervalo de oito horas depois de
preparado, desaerar antes do uso, aquecendo em
Referência(s). ISO 16266:2006. banho a 50-70 ºC/2-3h. Solução 1% de vermelho
Aplicação. Meio para estimular fluorescência em de fenol. Dissolver 1g em 100 ml de etanol 95%.

Equivalentes comerciais. Lactose Gelatina (LA- dividuais, suspender os ingredientes, ferver até a
BORCLIN 910010) (meio pronto em tubos). fusão do ágar, filtrar com papel de filtro, ajustar o
pH e esterilizar a 121 ºC/15min.
Meio PE-2 Equivalentes comerciais. Reinforced Clostridial
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- Medium (DIFCO 218081), Reinforced Clostridial
rello, 2015) p.922. Medium (MERCK 1.05411), Reinforced Clostri-
dial Medium (OXOID CM 149).
Aplicação. Meio para cultivo de bactérias anaeró-
bias, é usado no teste de esterilidade comercial
para alimentos de baixa acidez e na detecção Meio Reforçado para Clostrídios
de esporos termófilos anaeróbios. com Lactato (RCML)
Composição Referência(s): SMEDP (Wehr & Frank, 2004)
Púrpura de bromocresol section 8.100.
Peptona 20g 2 ml
(solução de etanol 2%)
Extrato de levedura 3g Água purificada 1 litro Aplicação. Meio para contagem de esporos de
121 ºC/15min - pH final 7,2±0,2 Clostridium tyrobutyricum em leite fluído e
Preparação. Dissolver os ingredientes e distri- queijos, método do NMP 8.100 do SMEDP.
buir em tubos de 20x180mm (19 ml/tubo) com Composição
tampas rosqueadas. Adicionar a cada tubo 8 a 10 Extrato de carne 10g Acetato de sódio 5g
ervilhas naturais frescas ou secas, isentas de agro- Extrato de levedura 3g Cloridrato de cisteína 0,5g
tóxicos, e deixar em repouso por uma hora, para a
Triptona 10g Amido solúvel 1g
completa reidratação das ervilhas. Após o período
Lactato de sódio Ágar 1g
de repouso, esterilizar a 121 ºC/15min. Solução 28g
(solução 72%) Água purificada 1 litro
2% de púrpura de bromocresol. Dissolver 2g em
120±1 ºC/15min pH final 5,5 a 5,7
10 ml de etanol e completar o volume para 100 ml
com água destilada. Preparação. Suspender os ingredientes, ajustar o
Equivalentes comerciais. Não disponível. pH em 5,5 a 5,7 com uma solução aquosa 20% de
ácido láctico e esterilizar a 120±1 ºC/15min.
Meio Reforçado para Clostrídios
(RCM) Meio Teste de Motilidade
Referência(s). Canned Foods Thermal Processing Referência(s): BAM (FDA, 2015a) M103.
and Microbiology (Hersom & Hulland (1980). Aplicação: Meio para teste de motilidade.
Aplicação. Meio para cultivo de bactérias anaeró- Composição
bias, usado na contagem de esporos de mesófi- Extrato de carne 3g Cloreto de sódio (NaCl)* 5g
los anaeróbios em leite fluído e queijos, méto- Peptona de caseína Ágar 4g
do do NMP 8.100 do SMEDP. ou gelatina (digestão 10g
enzimática)
Composição
121 ºC/15min – pH final 7,4±0,2
Peptona 10g Acetato de sódio anidro 3g
*Quando utilizado na confirmação de V. parahaemolyticus, a concentração de
Extrato de carne 10g Cloridrato de cisteína 0,5g
NaCl deve ser elevada para 2-3% (20-30g/l).
Extrato de levedura 3g Amido solúvel 1g
Dextrose 5g Ágar 0,5g Preparação. Suspender os ingredientes na água
Cloreto de sódio (NaCl) 5g Água purificada 1 litro purificada e ajustar o pH. Aquecer sob agitação
121 ºC/15min - pH final 7,4±0,2 até a completa fusão do ágar. Distribuir em tubos
Preparação. Para preparar a partir dos equiva- de 16x150mm (8 ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC
lentes comerciais, seguir as instruções do fabri- por 15min. Não inclinar, o meio deve solidificar
cantes. Para preparar a partir dos ingredientes in- na posição vertical.

Equivalentes comerciais. Motility Test Agar (LABORCLIN 510055) (meio pronto em tubos).
(ACUMEDIA 7247), Motility Test Mediun (BBL
211436). Reagente de Beta-Galactosidase
(orto-nitrofenil-β-d-galactopiranosídeo – ONPG)
Meio Teste de Motilidade ISO Referência(s): ISO 6579:2002, ISO 21872-1:2007.
Referência(s): ISO 11290-1:1996, ISO 11290- Aplicação. Verificação da atividade da enzima
2:1998. β-galactosidase, usado na confirmação de Sal-
monella método ISO 6579:2002 e confirmação
Aplicação. Meio para teste de motilidade usado
de V. cholerae / V. parahaemolyticus método
nos métodos ISO.
ISO 21872-1:2007.
Composição
Solução tampão
Peptona de caseína
20g Ágar 3,5g Fosfato monossódico (NaH2PO4) 6,9g
Peptona de tecido animal Hidróxido de sódio (NaOH) (solução 0,1mol/l)
6,1g Água purificada 1 litro cerca de 3 ml
(digestão enzimática) (para ajustar o pH)
121 ºC/15min - pH final 7,3±0,2 completar
Água purificada
para 50 ml
Preparação. Suspender os ingredientes na água Preparação: Dissolver o fosfato monossódico em cerca de 45
purificada e ajustar o pH em 7,3±0,2. Aquecer até ml de água purificada, em balão volumétrico. Ajustar o pH em
7,0±0,2 com a solução de hidróxido de sódio (aproximadamente
a completa fusão do ágar, distribuir em tubos de de 3 ml). Completar o volume para 50 ml com água.
10x100mm (5 ml/tubo) e esterilizar a 121 ºC por
Solução ONPG
15min. Não inclinar, o meio deve solidificar na
O-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo (ONPG) 0,08g
posição vertical.
Equivalentes comerciais. Não disponível. Preparação: Dissolver o ONPG na água a aproximadamente 50
ºC e resfriar.
Meio de Tioglicolato (TGM) Reagente completo
Solução tampão 5 ml
Solução ONPG 15 ml
Aplicação. Meio pré-reduzido para manutenção Preparação: Misturar o tampão e a solução de ONPG. Estocar
de clostrídios. entre 0 e 5 ºC.
Composição Equivalentes comerciais. Os equivalentes co-

Triptona 15g Tioglicolato de sódio 0,5g merciais são discos impregnados com o reagente,
Extrato de levedura 5g Ágar 0,75g devendo ser obedecida a orientação do fabrican-
Dextrose 5g Rezarzurina (0,01 ml da
0,001g te para a preparação e para o teste. ONPG Discs
Cloreto de sódio (NaCl) 2,5g solução aquosa 0,1%)
(OXOID DD013), ONPG Discs (Fluka 49940),
L-cistina 0,5g Água purificada 1 litro
Taxo ONPG Discs (BBL 231249).
121 ºC/15min – pH final 7,1±0,2
Preparação. Dissolver os ingredientes, ajustar o Reagente de Beta-Glicosidase

pH, aquecer até a completa fusão do ágar, distri-
buir em tubos de 16x150mm (10 ml/tubo) e este- Aplicação. Reagente para prova bioquímica, tes-
rilizar a 121 ºC/15min. te de atividade da enzima beta-D-glicosidase.
Equivalentes comerciais. Fluid Thioglycollate Usado na confirmação de Y. enterocolitica.
Medium (ACUMEDIA 7137), Fluid Thioglycolla- Preparação. Preparar o reagente adicionando 0,1g
te Medium (BBL 211260), Fluid Thioglycollate de 4-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo em 100 ml
Medium (DIFCO 225650), Fluid Thioglycollate de solução aquosa 0,666M de fosfato monossódi-
Medium (MERCK 1.08191), Thioglycollate Me- co (NaH2PO4) pH 6,0. Dissolver e esterilizar por
dium USP (OXOID CM 173), Tioglicolato Caldo filtração.

Reagente de Catalase Oxalato de amônio monohidratado

2g
(Peróxido de Hidrogênio 3%) Solução B [(NH4)2C2O4.H2O]
Referência(s): OMA/AOAC (Latimer, 2012) ca- Misturar as soluções A e B.
pítulo 17 p. 221.
Solução de iodo (Lugol)
Aplicação. Reagente para prova bioquímica, teste
Iodo 1g
de catalase.
Composição
Peróxido de hidrogênio 30% 10 ml Colocar o iodeto de potássio num almofariz, adicionar o iodo e
Água purificada 90 ml homogeneizar com o pistilo. Adicionar a água aos poucos, homo-
geneizando a solução continuamente. Armazenar em frasco escuro.
Preparação. Dissolver 10 ml de água oxigenada
30% em 90 ml de água destilada. Cuidado. O pe- Solução de safranina (contra-corante)
róxido de hidrogênio a 30% pode provocar quei- Dissolver 2,5g de safranina O em 100 ml de eta-
maduras dolorosas, devendo ser manuseado com nol 95% e adicionar 10 ml dessa solução em 100
luvas e óculos protetores. Em caso de respingos ml de água purificada.
na pele, lavar com etanol 70% em abundância. Equivalentes comerciais. Gram Stain Kit (BD
Não lavar com água. 212524) (Conjunto completo), Gram Crystal
Equivalentes comerciais. Catalase Reagent Dro- Violet (BD 212525), Gram Iodine (BD 212529),
pper (BBL 261203), Bactident Catalase (MERCK Gram Decolorizer (BD 212527), Gram Safranin
1.11351). (BD 212531), Gram Color Staining Set (MERCK
1.11885) (Conjunto completo), Gram’s Crystal
Reagentes para Coloração de Violet Solution (MERCK 1.09218), Gram’s Lu-
Esporos (Ashby) gol Solution (MERCK 1.09261), Gram’s Safrani-
ne Solution (MERCK 1.09217), Conjunto Colora-
Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto- ção Gram (LABORCLIN 620521).
rello, 2015) p.949.
Verde de malaquita Reagente de Fosfatase Ácida
Verde de malaquita 5.0g
Referência(s). ISO 14189:2013.
Suspender 5g de verde malaquita em 100 ml de água e filtrar para
Aplicação. Teste de fosfatase ácida para confir-
remover o corante não dissolvido. mação de Clostridium perfringens.
Safranina O Composição
Safranina O 0,5g 1-naphthylphosphate disodium salt
0,4g
(CAS Nº 2183-17-7)*
Fast Blue B Salt (o-Dianisidine bis(diazotized) zinc
0,8g
Dissolver os reagentes de cada solução em água double salt) (CAS Nº 14263-94-6)**
purificada e estocar em frasco escuro. Tampão acetato (pH 4,6±0,2) 20 ml

*Alternativamente pode ser usado o 1-naphthylphosphate monosodium salt
(CAS Nº81012-89-7).
Reagentes para Coloração de ** Cuidado. O Fast Blue B Salt é tóxico e pode causar câncer, requerendo
Gram (Hucker) precauções no manuseio e descarte.
Preparação. Preparar o tampão acetato dissolven-

do 0,3 ml de ácido acético glacial (CAS Nº 64-19-7)
rello, 2015) p.947.
e 0,4g de acetato de sódio (CAS Nº 127-09-3) em
Solução de cristal violeta
água purificada, levando o volume para um litro
Cristal violeta (85% de corante) 2g (alternativamente usar o tampão disponível co-
Solução A
Etanol 95% 200 ml mercialmente). Dissolver os ingredientes no tam-

pão acetato e manter em repouso por 60±5min a ser utilizada uma pera ou um pipetador.
5±3 ºC, para que ocorra precipitação. Filtrar em Equivalentes comerciais. Indole Reagent Dropper
filtro de papel e estocar a 5±3 ºC por até duas se- (BBL 261185), DrySlide Indole (BBL 231748),
manas. Se ocorrer precipitação nesse período, fil- Bactident Indole (MERCK 1.11350), Kovacs In-
trar novamente antes do uso. dole Reagent (MERCK 1.09293).
Reagente de Kovacs Reagente de Kovacs

para Teste de Indol para Teste de Oxidase
(Solução alcoólica 5% p-dimetilaminobenzaldeído)
(Solução 1% de cloridrato de
Referência(s): SMEDP (Wehr & Frank, 2004) sec- N,N,N,N-tetrametil-p-fenilenodiamina)
tion 7.050, ISO 6579:2002, ISO 10273:2003, Referência(s): SMEWW (Eaton et al., 2005)
ISO 7251:2005, ISO 21872-1:2007, BAM seção 9225D, ISO 10273:2003, ISO 21872-
(FDA, 2015b) R38. 1:2007, BAM (FDA, 2015b) R54.
de indol.
de oxidase. Não confundir com o reagente de
Composição Kovacs para teste de indol.
p-dimetilaminobenzaldeído
(sinônimo 4-dimetilaminobenzaldeído)
5g Composição
Álcool amílico (sinônimos 2-metilbutano-2-ol) Cloridrato de N,N,N,N-tetrametil-p-fenilenodiamina 1g
75 ml
(grau analítico)
Ácido clorídrico concentrado 25 ml Água purificada 100 ml
Preparação. Em uma capela de exaustão, dissol- Preparação. Dissolver o reagente em 100 ml

ver completamente o p-dimetilaminobenzaldeído de água purificada, aquecendo levemente para a
no álcool amílico, aquecendo levemente em ba- completa dissolução. A ISO 21872-1: 2007 re-
nho-maria (50-60 ºC), se necessário. Adicionar comenda utilizar imediatamente. O BAM reco-
lenta e cuidadosamente o ácido clorídrico con- menda usar em até sete dias, armazenando em um
centrado à solução, deixando o líquido escorrer frasco de vidro escuro, sob refrigeração. Havendo
lentamente pela parede do frasco, sem provocar interesse em estocar, deve-se distribuir porções de
respingos. Descartar a pipeta em um frasco com 1-2 ml em pequenos frascos escuros e congelar
água, lavando todo o ácido das paredes. Estocar a -20 ºC. Descongelar 3 a 4 horas antes do uso
o reagente sob refrigeração, em frasco de vidro e descartar todo o volume descongelado que não
escuro com tampa de vidro. Recomenda-se que, for utilizado. Utilizar preferencialmente os equi-
sempre que possível, seja preparado no momento valentes comerciais.
do uso ou estocado por não mais de uma semana, Equivalentes comerciais. Dry Slide Oxidase
porque a estabilidade pode variar de alguns dias (BBL 231746), Oxidase Reagent Dropper (BBL
a semanas. A cor deve ser amarela e o pH infe- 261181), Bactident Oxidase (MERCK 1.13300),
rior a 6,0. Recomenda-se álcool amílico Merck ou Oxidase Identification Sticks (OXOID BR 0064),
de qualidade equivalente, porque, dependendo da Tiras para Teste de Oxidase (LABORCLIN
marca, o reagente pode apresentar cor verde ou 570661).
esverdeada. Nesse caso, descartar e substituir o
álcool. Cuidado. O ácido clorídrico concentrado Reagente de Nessler
é extremamente corrosivo, podendo causar danos
Referência(s). ISO 16266:2006.
muito graves e dolorosos à pele e aos olhos. Em
Aplicação. Reagente para teste de acetamida,
caso de acidente, lavar com água em abundância.
usado na confirmação de Pseudomonas aerugino-
Nenhum dos componentes, bem como o reagente
sa, método ISO 16266:2006.
pronto, devem ser pipetados com a boca, devendo

Composição Composição
Cloreto de mercúrio (HgCl2) 10g Solução de ácido 5-amino-2-naftalenosulfônico
100 ml
(5-2-ANSA)
Solução de ácido sulfanílico 100 ml
Hidróxido de sódio (NaOH) 16g
Água purificada (livre de amônia)

Completar 100 Preparação. Preparar separadamente as seguin-
ml
tes soluções: a) Solução de ácido 5-amino-2-naf-
Preparação. Dissolver 10g de cloreto de mercú- talenosulfônico (5-2-ANSA): dissolver 0,1g do
rio (HgCl2) e 7g de iodeto de potássio (KI) em um 5-2-ANSA em 100 ml de solução de ácido acé-
pouco de água. Resfriar a mistura e adicionar, aos tico 15% (fração volumétrica) e filtrar em papel
poucos e com constante agitação, 16g de hidróxi- de filtro). Estocar a 5±3 ºC. b) Solução de ácido
do de sódio (NaOH) dissolvido em 50 ml de água. sulfanílico: dissolver 0,4g do ácido sulfanílico em
Completar o volume para 100 ml com água e es- 100 ml de solução de ácido acético 15% (fração
tocar em frasco de vidro borosilicato com tampa volumétrica) e filtrar em papel de filtro). Estocar
de borracha por até um ano. a 5±3 ºC. No momento do uso preparar o reagente
ISO 7937 para teste de nitrato misturando quanti-
Reagentes de Nitrato dades iguais de cada uma das soluções a e b. Usar
(Solução 0,8% ácido sulfanílico e imediatamente e descartar o que não for utilizado.
solução 0,5% alfa-naftol)
Referência(s): BAM (FDA, 2015b) R48 Reagente de VM para

Aplicação. Reagentes para prova bioquímica, tes-
Teste de Vermelho de Metila
te de redução do nitrato. Referência(s): BAM (FDA, 2015b) R44, SMEDP
Reagente A (solução 0,8% de ácido sulfanílico) (Wehr & Frank, 2004) seção 7.050 (Methyl
Ácido sulfanílico 1g Red Indicator).
Ácido acético (5N) 125 ml Aplicação. Reagente para prova bioquímica, teste
Dissolver o ácido sulfanílico no ácido acético 5N e estocar em de vermelho de metila (VM).
frasco de vidro escuro com tampa de vidro. Ácido acético 5N.
Adicionar 28,75 ml de ácido acético glacial a 71,25 ml de água Composição
purificada.
Vermelho de metila* 0,1g
Reagente B (solução 0,5% de alfa-naftol) Álcool etílico 95% (Etanol) 300 ml
completar para 500
alfa-naftol 1g Água purificada
ml
Ácido acético (5N) 200 ml
*O SMEDP especifica 0.19g de vermelho de metila em 300 ml de etanol 95%.
Dissolver o α-naftol em 200 ml de ácido acético 5N e estocar em
frasco de vidro escuro com tampa de vidro. Preparação. Dissolver o vermelho de metila em
Equivalentes comerciais: Reagentes de Nitrato 300 ml de álcool etílico 95% e completar o volu-
Soluções A e B (LABORCLIN 910199) (reagen- me para 500 ml de água purificada. Estocar em
tes prontos em frascos com 10 ml). frasco escuro, sob refrigeração.
Reagente de Nitrato ISO 7937 Reagentes de VP para

(Mistura da solução de ácido
5-amino-2-naftalenosulfônico com Teste de Voges Proskauer
solução de ácido sulfanílico) (Solução 40% de hidróxido de potássio ou
sódio e solução 5% de alfa-naftol)
Referência(s). BAM (FDA, 2015a) R89, Com-
Aplicação. Reagentes para teste de redução do pendium (Salfinger & Tortorello, 2015) p. 946.
nitrato, confirmação de C. perfringens no método
ISO 7937:2004.

Aplicação. Reagentes para prova bioquímica, tes- Dissolver a creatina em 100 ml de água purificada.
te de Voges-Proskauer (VP).
Solução alcoólica 5% de alfa-naftol* Soluções de Ácido Clorídrico (HCl)
Alfa-naftol 5g
Referência(s). BAM (FDA, 2015b) R36
Álcool etílico absoluto 100 ml
* O reagente recomendado pela ISO 6579:2002 é preparado com 6g de
HCl 1N. Dissolver 89 ml de ácido clorídrico con-
1-naftol dissolvido em 100 ml de etanol 96%. centrado em menos de um litro de água destilada
Solução 40% de hidróxido de potássio ou sódio e completar o volume para um litro.
Hidróxido de potássio (KOH) ou
40g HCl 0,1N. Dissolver 8,9 ml do ácido clorídrico
hidróxido de sódio (NaOH)
completar
concentrado em menos de um litro de água desti-
Água purificada lada e completar o volume para um litro.
para 100 ml
Pesar o KOH rapidamente (é altamente higroscópico) e dissolver
em menos de 100 ml de água purificada, em um bequer colocado
HCl 0,02N. Dissolver 20 ml do HCl 1N em me-
em banho de água fria, para controlar a elevação da temperatura nos de um litro de água destilada e completar o
durante a dissolução. Aguardar resfriar e completar o volume para volume para um litro.
100 ml com água purificada. Estocar sob refrigeração, em frasco
de polietileno ou em frasco de vidro com a boca e a tampa para- Equivalentes comerciais. Ácido clorídrico 1N
finadas. Cuidado. A solução é extremamente cáustica, podendo
(LABORCLIN 560247) (frasco com 1.000 ml),
causar queimaduras dolorosas à pele. Manusear com cuidado e,
em caso de acidente, lavar com água em abundância. Ácido clorídrico 0,1N (LABORCLIN 560250)
(frasco com 1.000 ml).
Equivalentes comerciais. Voges-Proskauer A Rea-
gent Dropper (5% Alpha Naphthol) (BBL 261192),
Barrit’s Reagent A (5% Alpha Naphthol) (Fluka Solução de Azul Brilhante de
29333), Voges-Proskauer B Reagent Dropper (40% Coomassie
Potassium Hydroxide) (BBL 261193), Barrit’s Rea- Referência(s). Sharif & Alaeddinoglu (1988).
gent B (40% Potassium Hydroxide) (Fluka 39442).
Aplicação. Coloração de esporos e glóbulos de
lipídios intracelulares, usado na confirmação
Reagentes de VP ISO para Teste de B. cereus.
Voges-Proskauer
(Solução 1-naftol, solução aquosa Preparação. Dissolver 0,25g de azul brilhante de
40% hidróxido de potássio, solução de creatina) coomassie em uma mistura de 50 ml de etanol ab-
Referência(s): ISO 6579:2002. soluto, 7 ml de ácido acético glacial e 43 ml de
água purificada.
Aplicação: Reagentes para prova bioquímica, tes-
te de Voges-Proskauer (VP), usado na confir-
mação de Salmonella, método ISO 6579. Solução de Azul de
Solução 1-naftol Bromotimol 0,04%
1-Naftol 6g Referência(s). BAM (FDA, 2015b) R10.
Etanol 96% (fração volume) 100 ml
Aplicação. Usado no teste de fermentação de car-
Dissolver o 1-naftol em 100 ml de etanol 96%
boidratos para C. perfringens e também para
Solução 40% Hidróxido de potássio verificar o pH de vidraria de laboratório.
Hidróxido de potássio (KOH) 40g
Composição
Azul de bromotimol 0,2g
Dissolver o KOH em 100 ml de água purificada.
Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,01N 32 ml
Solução de Creatina Completar
Água purificada
Creatina monohidratada 0,5g para 500 ml

Preparação. Dissolver 0,2g de azul de bromoti-
NaOH 0,1N para
Volume de água
final da solução
Concentração
dissolver 0,1g
para diluição
mol em 32 ml de solução 0,01N de NaOH. Diluir
Volume de
pH de
para 500 ml com água purificada. Indicador pK
viragem
Solução de Citrato de Sódio 2% Azul de 6,1 = amarelo

7,1 2,5 ml 47,5 ml 0,2%
bromotimol 7,7 = azul
Referência(s). ISO 6887-5:2010. Azul de 8,0 = amarelo
8,9 2,2 ml 7,8 ml 1%
Aplicação. Diluente recomendado pela ISO 6887- timol 9,6 = azul
Púrpura 5,4 = amarelo
5:2010 para analises de amostras de leite em bromocresol
6,2
7,0 = púrpura
1,9 ml 8,1 ml 1%
pó e queijo e recomendado pela Standard Me- Vermelho de 7,4 = amarelo
8,3 2,6 ml 47,4 ml 0,2%
thods for the Examination of Dairy Products cresol 9,0 = vermelho
Vermelho de 6,9 = amarelo
(Laird et al., 2004) para analises de queijo e fenol
7,8
8,5 = vermelho
4 ml 46 ml 0,2%
produtos lácteos em pó. Vermelho 6,8 = vermelho
7,5 * * 1%
Neutro 8,0 = amarelo
Composição
* No caso do vermelho neutro, dissolver 1g em 100 ml de solvente composto
Citrato de sódio (Na3C6H5O7.2H2O) 20g de 90% de etanol e 10% de água.
Azul de metileno: solução aquosa, solubilidade 4%
121 ºC/15min - pH final 7,5±0,2
em água, 1,5% em etanol.
Preparação. Dissolver o citrato de sódio na água, Azul de toluidina: solução aquosa, solubilidade
aquecendo a 45-50 ºC. Ajustar o pH em 7,5±0,2 a 3,8% em água, 0,5% em etanol.
25 ºC, se necessário, após esterilização. A concen-
Cristal violeta: solução aquosa até 1,5% ou alcoó-
tração das soluções NaOH ou HCl utilizadas no
lica, solubilidade 13% em etanol, 1,6% em água.
ajuste do pH deve ser tal que o volume adicionado
não seja superior a 10% do volume de solução de Eosina amarela: solução aquosa, solubilidade 44%
citrato de sódio. Esterilizar a 121 ºC/15min. em água, 2% em etanol.
Fucsina básica: solução alcoólica, solubilidade 8%
em etanol, 0,4% em água.
Solução de Cloreto Férrico 10% Safranina I: solúvel em água e etanol.
Referência(s). BAM (FDA, 2015a) R25. Verde brilhante: solúvel em água e etanol.
Aplicação. Reagente para prova bioquímica, teste Verde de malaquita: solução aquosa, solubilida-
de fenilalanina desaminase. de 3% em água, 2% em etanol.
Composição
Cloreto férrico (FeCl3) 10g Solução de Desoxicolato
Água destilada 90 ml de Sódio 0,5%
Referência(s). BAM (FDA, 2015b) R91.
Soluções de Corantes Aplicação. Reagente para confirmação de Vibrio
e Indicadores de pH para cholerae (teste do fio).
Adição em Meios de Cultura Composição
Desoxicolato de sódio 0.5g
Indicadores ácidos. Devem ser preparados dis- Água purificada esterilizada 100 ml
solvendo-se 0,1g na quantidade de NaOH 0,1N
especificada na tabela abaixo. Após a dissolução, Preparação. Dissolver 0,5g de desoxicolato de só-
a diluição final da solução é feita com água desti- dio em 100 ml de água purificada esterilizada. Não
lada, na quantidade especificada a seguir: é necessário ajustar o pH e pode ser estocado em
frasco de tampa de rosca, à temperatura ambiente.

Solução de Fosfato de Potássio Composição

(K2HPO4) 2% Hidróxido de potássio (KOH) 0,5g
Solução aquosa 0,5% de cloreto de sódio (NaCl) 100 ml
Referência(s): ISO 6887-5:2010. 121 ºC/15min
Aplicação. Diluente recomendado pela ISO
Preparação. Dissolver o hidróxido de potássio na
6887-5: 2010 para homogeneização e diluição
solução de NaCl e esterilizar a 121 ºC/15min.
de produtos lácteos.
Composição
Soluções de Hidróxido de Sódio
Fosfato de potássio (K2HPO4) 20g
Água purificada 1 litro Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
121 ºC/15min - pH final 7,5±0,2 ou 8,4±0,2 rello, 2015), p. 945
Solução Hidróxido de sódio 40g
Preparação. Dissolver o fosfato de potássio na
1N Água purificada Completar para 1 litro
água, aquecendo a 45-50 ºC. Ajustar o pH no va-
Solução Hidróxido de sódio 4g
lor desejado usando soluções NaOH ou HCl em
0,1N Água purificada Completar para 1 litro
concentração tal que o volume adicionado não
Solução Hidróxido de sódio 0,8g
seja superior a 10% do volume de solução. Esteri-
0,02N Água purificada Completar para 1 litro
lizar a 121 ºC/15min.
Quando necessário esterilizar 121 ºC/15min
Solução de Fosfato de Potássio Equivalentes comerciais. Solução de hidróxido

(K2HPO4) 2% com Antiespumante de sódio 1N (LABORCLIN 560261) (frasco com
1.000 ml), Solução de hidróxido de sódio 0,1N
Referência(s). ISO 6887-5:2010. (LABORCLIN 560263) (frasco com 1.000 ml),
Aplicação. Diluente recomendado pela ISO Solução de hidróxido de sódio 0,01N (LABOR-
6887-5:2010 para homogeneização e diluição CLIN 905269) (frasco com 1.000 ml).
de amostras de caseína,
Composição Solução Hipoclorito de Sódio
Fosfato de potássio (K2HPO4) 20g
100 ou 200 mg/l (100 ou 200ppm)
Solução antiespumante (1g de polietileno glicol 2000
em 100 ml de água purificada)
1 ml Aplicação. Desinfetante para uso geral no labo-
Água purificada 1 litro ratório.
121 ºC/15min - pH final 7,5±0,2 ou 8,4±0,2 Preparação. Utilizar a equação:
V2 = V1xC2/C1x10
Preparação. Dissolver os ingredientes na água,
onde:
aquecendo a 45-50 ºC. Ajustar o pH no valor de- C1 é a concentração de cloro ativo no hipoclorito comercial
sejado usando soluções NaOH ou HCl em con- concentrado que vai ser usado para a preparação da solu-
centração tal que o volume adicionado não seja ção de trabalho (em porcentagem). Pode ser 20% ou 5%
superior a 10% do volume de solução. Esterilizar ou, no caso da água sanitária comum, cerca de 2,5%.
C2 é a concentração da solução de trabalho que se deseja
a 121 ºC/15min.
preparar (em ppm).
V1 é o volume da solução de trabalho se deseja preparar
Solução de Hidróxido de Potássio (em litros).
V2 é a quantidade de hipoclorito comercial concentrado que
Salina 0,5%
deve ser usada (em ml).
Referência(s): ISO 10273:2003. Preparação de um litro de solução a 100ppm
Aplicação. Usada para o tratamento com KOH, a partir do hipoclorito comercial concentrado
na detecção de Y. enterocolitica, método ISO 2,5% de cloro ativo: V2 = 1x100/2,5x10 = 4 ml
10273:2003. → Misturar 4 ml de hipoclorito comercial com

2,5% de cloro ativo com água purificada, comple- Composição

tando o volume para um litro. Ninidrina 1,75g
Preparação de dois litros de solução a 200ppm Acetona 25 ml
a partir do hipoclorito comercial concentrado Butanol 25 ml
5% de cloro ativo: V2 = 2x200/5x10 = 8 ml →
Preparação. Dissolver a ninidrina na mistura ace-
Misturar 8 ml de hipoclorito comercial 5% de clo-
tona/butanol e estocar sob refrigeração em frasco
ro ativo com água purificada, completando o vo-
escuro e/ou ao abrigo da luz, por até uma semana.
lume para dois litros.
Solução de Ringer ¼ de
Solução de Hipurato de Sódio
Concentração
Referência(s). ISO 10272-1:2006.
Referência(s): ISO 6887-5:2010
Aplicação. Teste de hidrólise do hipurato, usado
Aplicação. Diluente recomendado pela ISO
na identificação de Campylobacter método
6887-5:2010 para uso geral na preparação de
ISO 10272-1:2006.
amostras de leite e produtos lácteos.
Composição
Composição
Hipurato de sódio 10g
Cloreto de sódio (NaCl) 2,25g
Cloreto de sódio 8,5g
Fosfato dissódico dihidratado (Na2HPO4.2H2O) 8,98g Cloreto de potássio (KCl) 0,105g
Fosfato monossódico monohidratado Cloreto de cálcio (CaCl2) anidro* 0,6g
2,71g
(NaH2PO4.H2O) Bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,05g
Completar
Água destilada Água purificada 1 litro
para 1000 ml
Esterilizar por filtração 121 ºC/15min - pH final 6,9±0,2
*Alternativamente pode-se usar 0,12g de CaCl2·6H2O.
Preparação. Dissolver os ingredientes na água
destilada e esterilizar por filtração. Distribuir as- Preparação. Dissolver os componentes, ajustar o
septicamente porções de 0,4 ml em tubos estéreis pH, se necessário. Esterilizar a 121 ºC/15min.
e estocar sob congelamento (20 ºC negativos). Equivalentes comerciais: Ringer’s Solution ¼
Strength em tabletes (OXOID BR52), Ringer’s
Solução Iodo Desinfetante Tablets (MERCK 1.15525).
rello, 2015) p.939. Solução de Safranina 0,5%
Aplicação. Desinfetante para uso geral no labo- Referência(s). Compendium (Salfinger & Torto-
ratório. rello, 2015) p.949.
Composição Aplicação. Corante, usado no teste confirmatório
Iodo 50g rápido de Holbrook & Anderson para B. cereus.
Iodeto de potássio (KI) 100g Composição
Água purificada 200 a 300 ml
Safranina O 0,5g
Dissolver o iodeto de potássio na água e adicionar o iodo, agitan-
do com leve aquecimento para dissolver. Água destilada 100 ml
Solução de Ninidrina Solução Salina 0,85%

Referência(s). ISO 10272-1:2006. Referência(s): Compendium (Salfinger & Torto-
Aplicação. Teste de hidrólise do hipurato, usado rello, 2015) p. 944.
na identificação de Campylobacter método Aplicação. Diluente usado para diversas finalida-
ISO 10272-1:2006. des no laboratório, incluindo a suspensão de

microrganismos em líquido para observação Composição

ao microscópio, preparação de esfregaços, tes- Sulfato de ferro amoniacal (III) 1g
tes de aglutinação e outras.
Composição
Cloreto de sódio (NaCl) 8,5g Água destilada 1 litro
Preparação. Dissolver o Sulfato ferroso amonia-
121 ºC/15min
cal (III) na água. Preparar no momento do uso.
Solução Salina Formalinizada Solução Tamponada Glicerol Sal

(Formalina)
Referência(s): BAM (FDA (2015b), reagente R31.
Referência(s): BAM (FDA, 2015b) R27. Aplicação: Crioprotetor para estocagem congela-
Aplicação. Usada no teste de sorologia flagelar da de Clostridium perfringens.
para Salmonella. Composição
Composição Glicerol (glicerina) (purificada) 100 ml
Formaldeído (solução 36-38%) 6 ml Fosfato dipotássico anidro (K2HPO4) 12.4g
Cloreto de sódio (NaCl) 8,5g Fosfato monopotássico anidro (KH2PO4) 4g
Água purificada 1 litro Cloreto de sódio (NaCl) 4.2g
Preparação. Dissolver 8,5g de NaCl em 1 litro Água purificada 900 ml

de água e autoclavar a 121 ºC/15min. Resfriar à 121 ºC/15min, pH final 7.2±0.2
temperatura ambiente e adicionar 6 ml da solução
Preparação. Dissolver o NaCl e completar o volume
de formaldeído. Não autoclavar nem aquecer após
para 900 ml com água purificada. Adicionar o glicerol
a adição do formaldeído.
e os fosfatos, ajustar o pH em 7,2 e esterilizar a 121
ºC/15min. Para preparar a solução em concentração
Solução de Sudan Black 0,3%
dupla (20%), usar 200 ml de glicerol e 800 ml de água.
rello, 2015) p.949. Solução Tiossulfato de
Aplicação. Corante, usado no teste confirmatório Sódio 3% ou 10%
rápido de Holbrook & Anderson para B. cereus.
Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012), parte
Composição 9060A, p.9.33.
Sudan Black B 0,3g Etanol 70% 100 ml
Aplicação. Usado para neutralização do cloro em
Preparação. Dissolver 0,3g do corante Sudan amostras de água.
Black B em 100 ml de etanol 70%. Após a dis- Composição
solução da maior parte do corante, agitar perio- Quantidade adicionada a
Concentração Forma do
dicamente durante o dia e deixar descansar uma da solução reagente usado
100 ml de água purifi-
cada
noite. Filtrar para remover o excesso de corante
3% Anidro (Na2S2O3) 3g
não dissolvido. Estocar em frasco bem fechado.
Pentahidratado
3% 4,6g
(Na2S2O3.5H2O)
Solução de Sulfato Ferroso 10% Anidro (Na2S2O3) 10g
Amoniacal 1% 10%
Pentahidratado
15,21g
(Na2S2O3.5H2O)
Referência(s): ISO 10273:2003. 121 ºC/15min
Aplicação. Teste confirmativo para Yersinia en-
terocolitica (teste de pirazinamidade), método Preparação. Dissolver a quantidade requerida de
ISO 10273:2003. tiossulfato em 100 ml de água purificada e esteri-

lizar a 121 ºC/15min. Descartar qualquer solução Preparação. A partir de 1,25 ml da solução esto-
que apresente turbidez com o tempo (crescimento que, preparar um litro com água purificada. Dis-
microbiano). tribuir em frasco e esterilizar por 15min a 121 ºC.
Solução de Tripolifosfato 2% Tampão Fosfato

Conforme ISO 6887-4:2003
Referência(s): ISO 6887-5:2010.
Aplicação. Diluente alternativo recomendado Referência(s): ISO 6887-4:2003.
pela ISO 6887-5:2010 para amostras de caseí- Aplicação: Diluente recomendando pela ISO
na com problemas de solubilidade. 6887-4:2003.
Composição Composição
Tripolifosfato de sódio (Na3O10P3) 20g Fosfato monopotássico (KH2PO4) 1,5g
Água purificada 1 litro Fosfato dissódico dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) 9g
121 ºC/15min Água purificada 1 litro
Preparação. Dissolver o tripolifosfato de sódio pH 7,0±0.2 - 121 ºC/15min

na água purificada, aquecendo se necessário. Es-
Preparação: Dissolver os componentes em água,
terilizar a 121 ºC/15min e manter sob refrigeração
aquecendo se necessário. Ajustar o pH e esteri
(0-5 ºC) por até um mês.
lizar a 121 ºC por 15min. Se necessário ajustar o
pH depois da esterilização.
Solução de Verde Malaquita
(Aquosa 5%)
Tampão Fosfato
Vide Reagentes para coloração de esporos. Conforme ISO 6887-5:2010
Referência(s): ISO 6887-5:2010.

Tampão Fosfato pH 7,2 (PB) Aplicação: Diluente recomendado pela ISO
(Tampão Butterfield = Água de Diluição Fosfato)
6887-5:2010.
Referência(s): SMEDP (Wehr & Frank, 2004) sec- Solução estoque
tion 4.030 (Phosphate Dilution Water), Com-
Fosfato monopotássico (KH2PO4) 42,5g
pendium (Salfinger & Tortorello, 2015) p. 943.
Água purificada Completar para 1 litro
Aplicação. Diluente para uso geral no laboratório.
pH 7,0±0.2 - 121 ºC/15min
Solução estoque
Preparação: Dissolver o sal em 500 ml de água
Fosfato monopotássico (KH2PO4) 34g
e completar o volume para um litro. Esterilizar a
completar para 1 litro
Água purificada
depois de ajustar o pH 121 ºC por 15min. Se necessário ajustar o pH de-
pH f 7,2±0,2 - 121 ºC/15min pois da esterilização e estocar sob refrigeração.
Preparação: Dissolver o fosfato monopotássico Solução tampão de uso

em 500 ml de água e ajustar o pH em 7,2 com Solução estoque 1 ml
NaOH 1N (aproximadamente 175 ml). Comple- Água purificada Para preparar 1 litro
tar o volume para um litro com água destilada e 121 ºC/15min
esterilizar a 121 ºC/15min. Estocar em geladeira.
Preparação: A partir de 1 ml da solução estoque
Solução tampão de uso (Butterfield)
preparar um litro com água purificada. Distribuir
Solução estoque 1,25 ml em frasco e esterilizar por 15min a 121 ºC.
Água purificada completar para 1 litro
121 ºC/15min

Tampão Fosfato com Cloreto de Tampão Fosfato Salina 0,02M para

Magnésio (PB-MgCl2 ) Teste de Lisostafina
Referência(s): SMEWW (Hunt, 2012) seção Referência(s): BAM (FDA, 2015b) R61
9050C (Buffered Water), SMEDP (Wehr & Aplicação. Confirmação de S. aureus, teste de
Frank, 2004) seção 4.030 (Phosphate and sensibilidade à lisostafina.
Magnesium Chloride Dilution Water). Solução estoque 1
Aplicação. Diluente para amostras de água. Fosfato dissódico (Na2HPO4) anidro 28,4g
Composição Cloreto de sódio (NaCl) 85g
Água purificada Completar para 1 litro
Solução estoque do tampão fosfato pH 7,2 1,25 ml
Solução de cloreto de magnésio Solução estoque 2
(81,1g de MgCl2.6H2O em 1 litro água 5 ml
Fosfato monossódico monohidratado
purificada) 27,6g
(NaH2PO4.H2O)
Água purificada completar para 1 litro Cloreto de sódio (NaCl) 85g
121 ºC/15min Água purificada Completar para 1 litro
Preparação: Misturar os ingredientes e comple- Preparação. Diluir 1:10 a solução estoque 1, vo-
tar para um litro com água purificada. Esterilizar lume final 500 ml (50 ml da solução estoque 1 em
a 121 ºC/15min. 450 ml de água purificada). Diluir 1:10 a solução
estoque 2, volume final 100 ml (10 ml da solução
estoque 2 em 90 ml de água purificada).). Usando
Tampão Fosfato Salina (PBS) o pHmetro, titular a solução diluída 1 com a so-
lução diluída 2, até o pH chegar a 7,3-7,4 (adição
Referência(s): BAM (FDA, 2015b) R59.
de aproximadamente 65 ml da solução diluída 2 à
Aplicação. Diluente para a análise de Vibrio sp.
solução diluída 1). A solução resultante é o tam-
Composição pão fosfato salina 0,02M para ser usado no teste
Cloreto de sódio (NaCl) 7,650g de sensibilidade à lisostafina em S. aureus.
Fosfato dissódico (Na2HPO4) anidro 0,724g
Fosfato monopotássico(KH2PO4) 0,210g Vaspar
121 ºC/15min - pH final 7,4±0,2 rello, 2015) p. 946
Preparação. Dissolver os ingredientes na água Aplicação. Usado para selar tubos para cultivo de
purificada e ajustar o pH em 7,4±0,2 com solução bactérias anaeróbias.
de hidróxido de sódio (NaOH) 1N. Autoclavar a Preparação. Combinar uma parte de óleo mineral
121 ºC/15min. com duas partes de vaselina e esterilizar em forno
a 191 ºC/3h.

Referências
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Valéria Christina Amstalden Junqueira

Neliane Ferraz de Arruda Silveira

Marta Hiromi Taniwaki

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mento e inovação (P&D&I). Expert em micologia de alimentos, membro

Margarete Midori Okazaki

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Capítulo 1. 2.3.1. Procedimento para a homogeneização

00 iniciais MICROBIOL_PROD.indd 9 08/06/2017 20:39:51

2.5. (revisado) Diluição decimal seriada da o) Produtos lácteos fermentados. . . . . . . . . . . 27

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Anexo 3.1. (novo) Limite de concordância Teste de malonato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

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6.2.1. Material requerido para a análise. . . . . . . . 77 7.2.b. (novo) Métodos de plaqueamento

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8.3.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 9.6.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

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10.5.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 12.1.3. (revisado) Comentários sobre os

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13.3. (revisado) Método do NMP APHA 10.2:2015 14.4.2. Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225

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Capítulo 18. Os sorotipos mais comuns. . . . . . . . . . . . . . . . 295

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Capítulo 21. Brevibacillus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 366

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22.3.5. Procedimento para a análise Capítulo 23.

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23.2.3. Interpretação dos resultados. . . . . . . . . . . 415 Capítulo 25.

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26.2.5. Distribuição. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459 Ágar Coliformes Cromogênico (CCA) . . . . . . . . 473

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Ágar m-HPC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 485 Ágar Tripticase de Soja (TSA) com Magnésio e

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Caldo de Enriquecimento de Caldo Tripticase de Soja (TSB) . . . . . . . . . . . . . . 516

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to de mesma composição e características físicas,

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2.1. Introdução and Wastewater (Rice et al., 2012) (específicas

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ISO 7218:2007/Amd.1:2013 (recomendadas para utensílios em bandejas de descarte, não direta-

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□ Tampão Fosfato Cloreto de Magnésio □ Bandejas de descarte

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