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Universidade do Vale do Paraíba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento – IP&D

NELLY CRISTINA DE SOUZA LEITE

PRODUÇÃO E ESTUDO BIOLÓGICO DE NANOCOMPÓSITOS À BASE DE

NANOHIDROXIAPATITA E NANOTUBOS DE CARBONO PARA REGENERAÇÃO
ÓSSEA

São José dos Campos - SP

2015
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Nelly Cristina de Souza Leite

PRODUÇÃO E ESTUDO BIOLÓGICO DE NANOCOMPÓSITOS À BASE DE

NANOHIDROXIAPATITA E NANOTUBOS DE CARBONO PARA REGENERAÇÃO
ÓSSEA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, como
complementação de créditos necessários para a
obtenção do título de Mestre em Engenharia
Biomédica.

Orientador: Prof. Dr. Anderson de Oliveira Lobo

Coorientadora: Profª. Drª. Fernanda Roberta Marciano.

São José dos Campos - SP

2015
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Dedicatória

Ao amor da minha vida Julio Lemos, que me inspira constantemente pela busca do
conhecimento.

À minha família, por todo o apoio e compreensão.

 6

Agradeço:

A Deus em primeiro lugar por me dar os desafios que me fazem crescer em todos os sentidos.
Ao meu esposo Julio Lemos, pelo amor e carinho, por me incentivar e ser meu guia em tudo
que faço.
Aos meus pais Joao e Tereza por terem feito todo o possível para eu chegar até essa etapa da
minha jornada e aos meus irmãos Fabio e Suzan e minha sobrinha Ana Julia, por me
lembrarem sempre que a Família é o mais importante.
Ao meu orientador e amigo prof. Dr. Anderson de Oliveira Lobo, por acreditar no meu
potencial em desenvolver este trabalho.
À profa. Dra. Fernanda Roberta Marciano, pela coorientação, amizade e concelhos preciosos.
À minha amiga e colaboradora Idália Siqueira, por me ensinar e ajudar com toda a paciência
nos experimentos em que podia e pelas boas risadas que demos.
Aos amigos conquistados durante o mestrado Beatriz Ramos, Felipe Lopes, Rani Alves,
Tamires e Bruno Prianti e aos amigos de mais tempo Isabela Mendes, Marcele Neves e Carol
Borges, por tornar esta caminhada mais leve.
Aos colaboradores prof. Bruno Cavalcanti, pelo suporte e conhecimentos biológicos para o
desenvolvimento dos ensaios com osteoblastos e prof. Dr. Newton Soares da Silva, pelo suporte
e conhecimentos biológicos para o desenvolvimento dos testes bactericida.
Aos professores das disciplinas que cursei durante o período de Mestrado na UniVap, que me
passaram conceitos fundamentais para minha formação acadêmica.
À profa. Dra. Fernanda Pupio Silva Lima pela supervisão no estágio docência, pela amizade
e compreensão.
Ao prof. Hudson Zanin, pela produção dos nanotubos de carbono.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE) pela utilização dos laboratórios
essenciais para a produção das amostras de nanotubos de carbono.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP: 2011/17877-7 e 2011/20345-7),
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq: 474090/2013-2),
Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP: 01-13-0428-00 / ref. nº 1259/13) pelo suporte
financeiro, fundamental para o desenvolvimento deste trabalho.

Muito obrigada a todos

 87

“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original.”

Albert Einstein
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RESUMO

Para a sociedade em geral, implantes são de grande importância em relação a pessoas que,
por motivos de doença e/ou acidente, precisam recuperar ou aumentar sua produtividade.
Devido à falta de um material perfeito para fabricação de implantes adequados, unem-se
diferentes classes de materiais com o intuito de melhorar as propriedades físicas, químicas e a
biocompatibilidade do novo material a ser implantado diminuindo o índice de rejeição. A
Hidroxiapatita (HAp), é um tipo de biocerâmico que apresenta cálcio e fósforo próximo à fração
mineral presente na composição do osso. Com isso, apresenta várias vantagens como matrizes
para um material compósito com características de alta biocompatibilidade. Os nanotubos de
carbono (CNTs), com suas características de resistência e natureza fibrosa, podem conferir a
um compósito aumento na resistência mecânica, principalmente o módulo de elasticidade. Usa-
se irradiação ultrassônica (IU) para superar dificuldades relacionadas à dispersão de CNTs em
meio aquoso, meio usado para a precipitação da HAp pela síntese química. Baseando-se no
nanocompósito de HAp/CNT, produzido pela síntese química assistida pela técnica de
ultrassom desenvolvido e patenteado pelo Laboratório de Nanotecnologia Biomédica do
Instituto de pesquisa e desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), a
proposta desse trabalho foi a produção de pós de nanocompósitos com variadas concentrações
de CNTs, caracterização da morfologia e estrutura pelos métodos de microscopia eletrônica de
varredura (MEV); microscopia eletrônica de transmissão (MET), espectroscopia por reflexão
total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier; análise de microfluorescência
de raio X por dispersão de energia, ; adsorção de gases pelo método Brunauer Emmett Teller
(BET); porosimetria por intrusão de mercúrio. Também avaliou-se a bioatividade, com imersão
em fluido corporal simulado, citotoxicidade utilizando células de osteoblastos humanos, com
análise colorimétrica de sulforrodamina B, e a atividade antibacteriana pela análise de
densidade óptica utilizando bactérias comumente encontradas após implante de próteses ósseas
sendo a gram positiva Staphylococcus aureus e gram negativa Escherichia coli. Os resultados
indicam que os compósitos possuem bioatividade não são citotóxicos e possuem efeito
bactericida em ambas as bactérias estudas.

Palavras chave: Nanohidroxiapatita. Nanotubos de carbono. Compósito. Bioatividade.

Citotoxicidade. Efeito bactericida,
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ABSTRACT

In general, for society, implants are important for people who need to recover or increase
their productivity due to illness and/ or accident. The absence of a perfect material suitable for
the manufacture of implants, join different classes of materials to improve the physical and
chemical properties, and biocompatibility of the new material implanted reducing the rejection
rate. The hydroxyapatite (HAp) is a bioceramic showing calcium and phosphorus fraction near
of mineral phase in the bone composition. With this, have several advantages as matrices for
composite material with high biocompatibility characteristics. Carbon nanotubes (CNTs)
presents strength characteristics, fibrous nature; besides this a composite using CNTs can confer
increased mechanical strength, especially the elastic modulus. It uses ultrasonic irradiation (UI)
to overcome difficulties related to CNTs dispersion in water medium, medium used for
precipitation of HAp by chemical synthesis. Based on the nanocomposite of HAp / CNT
produced by chemical synthesis assisted by ultrasound technique developed and patented by
the Laboratory of Biomedical Nanotechnology at Research Institute and development of
University of Vale do Paraiba (UNIVAP), the purpose of this work was to produce
nanocomposite powder with varying CNTs contents. We used several characterization
techniques for morphology, chemical and superficial area analyses, such as: scanning electron
microscopy, transmission electron microscopy, attenuated total reflectance Fourier transformed
infrared spectroscopy, energy dispersive X-ray microfluorescence analysis, gas adsorption by
the BET method, mercury intrusion porosimetry. In addition, we evaluated the bioactivity using
simulated body fluid. We evaluated the cytotoxicity using colorimetric analysis of
sulforhodamine B, using human osteoblast cells. Also, we analyzed the bactericide effect using
optical density measured. For these, we used the gram-positive (Staphylococcus aureus) and
Gram-negative (Escherichia coli) bacteria, commonly found after implantation of bone
prostheses. The results suggest the compounds own bioactivity are not cytotoxic and have a
bactericidal effect on both studied bacteria.

Keywords: Nanohydroxyapatite. Carbon nanotubes. Composite. Bioactivity. Cytotoxicity.

Bactericidal effect.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Estrutura da hidroxiapatita ao longo do eixo c. ....................................................... 22

Figura 2-Estrutura dos CNTs: (a) SWCNT, (b) MWCNT. ...................................................... 23
Figura 3- Esquema do crescimento de nHAp sobre a superfície de CNT. ............................... 26
Figura 4- MET de alta resolução do compósito de nHAp/ MWCNT. ..................................... 27
Figura 5 - Esquema do uso da placa Transwell com o scaffolds dos nanocompósitos. ........... 35
Figura 6- Micrografia eletrônica de varredura com emissão de campo, com aumento de x 30000
das amostras (a)MWCNT-GO, (b) nHAp, (c) nHAp/1%MWCNT-GO, (d) nHAp/2%MWCNT-
GO e (e) nHAp/3%MWCNT-GO. ........................................................................................... 39
Figura 7-Micrografia eletrônica de transmissão com escala de 50 nm das amostras (a)MWCNT-
GO, (b) nHAp, (c) nHAp/1%MWCNT-GO, (d) nHAp/2%MWCNT-GO, (e)
nHAp/3%MWCNT-GO.e (f) nHAp/3%MWCNT-GO com escala de 20 nm.......................... 41
Figura 8- Difratograma de raio X das amostras. Utilizado fichas cristalográfica JCPDS 024-
0033 (Hidroxiapatita), JCPDS 00-026-1077 e 00-001-0640(Carbono) e JCPDS 01-085-
0871(Fe). .................................................................................................................................. 45
Figura 9- Difratograma de raios X das amostras após imersão por 21 dias em 1,5 x SBF.
Utilizado fichas cristalográfica JCPDS 024-0033 (Hidroxiapatita), JCPDS 00-026-1077 e 00-
001-0640(Carbono), JCPDS 01-085-0871(Fe) e JCPDS 00-019-0272 (HAp carbonatada). ... 47
Figura 10- ATR-FTIR das amostras nHAp, nHAp1% MWCNT, nHAp2% MWCNT e nHAp3%
MWCNT após 14 dias imersas em 1,5 SBF. ............................................................................ 49
Figura 11- ATR-FTIR das amostras nHAp, nHAp1% MWCNT, nHAp2% MWCNT e nHAp3%
MWCNT após 21 dias imersas em 1,5 SBF. ............................................................................ 50
Figura 12- ATR-FTIR da amostra MWCNT-GO após 14 e 21 dias imersas em 1,5 SBF. ...... 51
Figura 13- Análise dos elementos Ca e P das amostras após 0, 14 e 21 dias imersos em 1,5xSBF,
obtido pela técnica de uEDX. ................................................................................................... 53
Figura 14- Micrografia eletrônica de varredura das amostras antes e após 21 dias imersas em
1.5 x SBF, com aumento de 15000 vezes.Fig 14(a1-a2) MWCNT-GO; Fig 14(b1-b2) nHAp; Fig
14(c1-c2) nHAp/1%MWCNT-GO; Fig 14(d1-d2) nHAp/2%MWCNT-GO e Fig 14(e1-e2)
nHAp/3%MWCNT-GO. .......................................................................................................... 55
Figura 15- Avaliação da citotoxicidade dos compósitos sob osteoblastos humanos utilizando
teste colorimétrico SRB. Valores expressos da média e desvio padrão. N=3. ......................... 57
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Figura 16- Efeito Bactericida das amostras sob cepa bacterina S. aureus. Valores expressos da
média e desvio padrão. N=3. .................................................................................................... 59
Figura 17- Efeito Bactericida das amostras sob cepa bacterina E. Coli. Valores expressos da
média e desvio padrão. N=3. .................................................................................................... 61
Figura 18- Hipótese de mecanismo bactericida dos MWCNT-GO. ......................................... 63
 12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Concentração de íons (mmol) do SBF e do Plasma Sanguíneo................................ 28

Tabela 2 - Concentrações dos reagentes da 1,5×SBF............................................................... 34
Tabela 3- Resultado das análises de BET. ................................................................................ 42
Tabela 4- Resultado das análises porosimetria utilizando 0,1g das amostras. ......................... 43
Tabela 5- Tamanho do cristalito por tempo de imersão em 1,5 x SBF. ................................... 46
Tabela 6- Conteúdo de íons de Carbonato CO32- das amostras após imersão em 1,5 x SBF, dados
obtidos pela análise ATR-FTIR. ............................................................................................... 52
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µ-EDX - Microfluorescência de raio X por energia dispersiva

ALP- do inglês Alkaline phosphatase (Fosfatase alcalina)
ANOVA - do inglês Analysis of variance (Análise de variância)
ATCC - do inglês American type culture collection (Coleções americanas de tipos de cultura
biológicas)
ATR-FTIR - do inglês Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy
(espectroscopia por reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier)
BET - Brunauer, Emmett, Teller
C. albicans - Candida albicans
CNT - do inglês Carbon nanotubes (Nanotubos de carbono)
CVD - do inglês Chemical vapor deposition (Deposição por vapor químico)
DATASUS - Plataforma de dados do Sistema Único de Saúde
DO - Densidade óptica
DRX - Difração de Raios-X
E.coli - Escherichia coli
EDS - Fluorescencia de raio X por dispersão de energia
FEG - do inglês Field emission electron gun (Canhão de emissão de campo)
HAp - Hidroxiapatita
INPE - Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais
IP&D - Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
JCPDS - do inglês Joint committee on powder diffraction standards (Comitê de normas de
difração de pós)
LAS - Laboratório Associado de Sensores e Materiais
LB - meio de cultura Luria-Bertani
LCE - DEMa - Laboratório de Caracterização Estrutural do Departamento de Engenharia de
Materiais
LCP - Laboratório Associado de Combustão
LDH - do inglês Lactate dehydrogenase (Lactato desidrogenase)
MEC - Matriz Extracelular
MET - Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura
MTT - brometo tiazolil azul de tetrazólio
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MWCNTs - do inglês multi-walled carbon nanotube (Nanotubos de carbono de múltiplas

paredes)
MWCNT-GO - do inglês multi-walled carbon nanotube graphene oxide (Nanotubos de
carbono de múltiplas paredes com óxido de grafeno)
nHAp - Nanohidroxiapatita
PBS - do inglês Phosphate buffered saline (Tampão fosfato salino)
S.aureus - Staphylococcus aureus
SBF- do Inglês Simulated body fluid (Fluído corporal simulado)
SRB - Sulforrodamina B
SWCNT - do inglês single wall carbon nanotube (nanotubo de carbono parede simples)
UFSCar - Universidade Federal de São Carlos
UI - do inglês Ultrassonic irradiation (Irradiação ultrassônica)
UNESP - Universidade Estadual Paulista
UNIVAP - Universidade do Vale do Paraíba
VACNTs-O2 - do inglês vertically aligned carbon nanotubes (Nanotubos de carbono
verticalmente alinhados)
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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 17
1.1 Objetivo Geral ....................................................................................................................... 18
1.1.1 Objetivos específicos ..................................................................................................... 18
2. REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................................. 19
2.1. Nanotecnologia e biomimetismo ........................................................................................... 19
2.2. Tecido ósseo .......................................................................................................................... 19
2.3. Hidroxiapatita ....................................................................................................................... 20
2.4. Nanotubos de Carbono.......................................................................................................... 23
2.5. Compósitos de nHAp e CNTs ................................................................................................ 25
2.6. Ensaio de Bioatividade.......................................................................................................... 28
3.1. Produção dos nanocompósitos.............................................................................................. 30
3.1.1. Produção dos nanotubos ............................................................................................... 30
3.1.2. Purificação dos CNTs ................................................................................................... 30
3.1.3. Funcionalização dos CNT. ............................................................................................ 31
3.1.4. Produção dos compósitos de nHap e CNT utilizando síntese química assistida por
Ultrassom ...................................................................................................................................... 31
3.2 Caracterização dos nanocompósito ...................................................................................... 31
3.2.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ................................................................ 32
3.2.2 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ............................................................. 32
3.2.3 Microfluorescência de raio X por energia dispersiva (µ-EDX) .................................... 32
3.2.4 Difração de raios X (DRX)............................................................................................ 33
3.2.5 Porosimetria de mercúrio ............................................................................................. 33
3.2.6 Análise de gases pelo método BET- Brunauer, Emmett, Teller .................................... 33
3.2.7 Espectroscopia por reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de
Fourier (ATR-FTIR) ...................................................................................................................... 34
3.3 Ensaios biológicos................................................................................................................. 34
3.3.1 Testes de Bioatividade .................................................................................................. 34
3.3.2 Análise da viabilidade e proliferação celular ............................................................... 35
3.3.3 Efeito bactericida dos nanocompósitos ......................................................................... 36
3.3.4. Análise Estatística ......................................................................................................... 37
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 38
4.1. Caracterização Morfológica e estrutural dos nanocompósitos .............................................. 38
4.2. Análise da Bioatividade ........................................................................................................ 46
 8
16

4.3. Análise da Viabilidade e proliferação Celular ...................................................................... 56

4.4. Efeito Bactericida dos nanocompósitos ................................................................................ 58
5. CONCLUSÂO ............................................................................................................................. 64
TRABALHOS FUTUROS.................................................................................................................. 65
PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................................... 66
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 68
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1. INTRODUÇÃO

O uso de dispositivos médicos (próteses, cateteres, stent, etc) tem se expandido nos
últimos anos devido à crescente demanda por cuidados médicos da população em
envelhecimento. Atualmente, esses dispositivos apresentam sucesso em termos de
biocompatibilidade associado a um baixo risco de falha em seu uso (CAMPOCCIA;
MONTANARO; ARCIOLA, 2013).
Conforme dados coletados na plataforma de dados do sistema único de saúde DATASUS,
nos últimos dois anos foram realizados 1012 tratamentos cirúrgicos de infecção em artroplastia
de pequenas, médias e grandes articulações, com o custo de R$ 1.212.609,31, tendo 49 óbitos
o que corresponde à 4,84% de taxa de mortalidade de tais procedimentos (SUS, 2014).
O sucesso na incorporação de um implante dentro do corpo depende da integração do
tecido e resistência à infecção, o que é influenciada pela adesão de células e bactérias às
superfícies (CHENG et al., 2012; RANELLA et al., 2010).
Um biomaterial muito utilizado na regeneração óssea é a hidroxiapatita (HAp)
(Ca10(PO4)6(OH)2) por sua semelhança química e cristalográfica com o principal componente
inorgânico do osso (SANOSH et al., 2010). A estreita semelhança química da HAp, tendo como
base o fosfato de cálcio e sua composição, ao osso natural conduziu extensa pesquisa para o
uso da HAp sintética como substituto ósseo (HABRAKEN; WOLKE; JANSEN, 2007;
HUTMACHER et al., 2007). Mimetizando a HAp natural que se apresenta em escala
nanométrica, a nanohidroxiapatita (nHAp) apresenta boa bioatividade, biocompatibilidade,
osteocondutividade e biodegradação. Com essas características ela é extensamente usada em
aplicações biomédicas. A HAp confere osteocondutividade se o cristal for semelhante à apatita
biológica. Por esta razão, a redução do tamanho do cristal de HAp em nanoescala se torna
interessante (THOMAS et al., 2007). No entanto, suas propriedades mecânicas são pobres, tais
como a fragilidade e a baixa resistência ao desgaste, limitando seu uso em aplicações de
implantes (DOOSTMOHAMMADI et al., 2012; FARROKHI-RAD; SHAHRABI, 2014). Para
melhorar tais propriedades Zhao et. al., (2014) adicionaram nanotubos de carbono em sua
composição relatando melhora nas propriedades mecânicas da HAp (ZHAO et al., 2014).
Algumas investigações têm sido realizadas sobre a síntese de nHAp e nanotubos de
carbono de múltiplas paredes (MWCNT) do inglês multi-walled carbon nanotube, usando
vários métodos para obter nanocompósitos de nHAp/MWCNT (LOBO et al., 2013; NAJAFI;
NEMATI; SADEGHIAN, 2009).
 18

Neste trabalho utilizou-se o método de síntese química assistida por ultrassom, após a
modificação da superfície dos MWCNT com grupos carboxílicos e carboxilatos, sendo fácil
sua fabricação e apresentando baixo custo de produção (LOBO et al., 2013), a elaboração de
tal método gerou a patente BR10201300578 para a Universidade do Vale do Paraíba- UNIVAP.

1.1 Objetivo Geral

Diante do exposto, esta dissertação teve como principal objetivo a produção do compósito
de nHAp/MWCNT-GO com diferentes concentrações de MWCNT-GO (nanotubos de carbono
de múltiplas paredes com óxido de grafeno), avaliar a bioatividade, citotoxicidade e atividade
antimicrobiana de pós de nHAp/MWCNT visando aplicações na regeneração óssea.

1.1.1 Objetivos específicos

Para alcançar tal objetivo, foram elaborados os objetivos específicos citados abaixo:
 Produzir os nanocompósitos variando os teores de MWCNT-GO em sua
composição;
 Caracterizar os nanocompósitos quanto a sua morfologia, composição química,
área superficial e porosidade;
 Avaliar a bioatividade dos nanocompósitos;
 Analisar citotoxicidade dos nanocompósitos;
 Avaliar o efeito bactericida dos nanocompósitos.

Este estudo foi realizado no Laboratório de Nanotecnologia Biomédica, com apoio do

Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica, e Laboratório de Biologia Celular e
Tecidual localizados no IP&D – Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da UNIVAP –
Universidade do Vale do Paraíba; Laboratório de Caracterização Estrutural do Departamento
de Engenharia de Materiais da UFSCar – Universidade Federal de São Carlos; Laboratório
Associado de Sensores e Materiais – LAS do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais- INPE
de São José dos Campos; Laboratório Associado de Combustão e Propulsão, situado no
Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais - INPE de Cachoeira Paulista e Laboratório de cultura
de célula da UNESP- Universidade Estadual Paulista de São José dos Campos
Este trabalho será dividido em 5 seções. A revisão bibliográfica, metodologia utilizada,
os resultados discutidos, conclusão e trabalhos futuros.
 19

2. REVISÃO DA LITERATURA
Nesta seção encontra-se a fundamentação teórica para o entendimento da proposta do
trabalho além de informações para interpretações dos resultados.

2.1. Nanotecnologia e biomimetismo

A busca constante pelo biomimetismo insere a nanotecnologia no cenário do

desenvolvimento de biomateriais, pois nanobiomateriais são vistos como promissores pelo fato
de apresentarem analogia aos componentes nanoestruturados da matriz extracelular (MEC).
Suas morfologias e propriedades físico-químicas influenciam nas interações celulares que
conduzem à regeneração tecidual, onde passam a ser vistos como um avanço no tratamento de
superfícies implantáveis. Outro fator que favorece diretamente eventos celulares intrínsecos,
tais como proteínas de adesão, é a hidrofilicidade de nanobiomateriais, sendo que o conjunto
destes fatores torna os nanobiomateriais interessantes para aplicação em medicina regenerativa
(SNIADECKI et al., 2006).
A utilização de nanobiomateriais na medicina regenerativa tem como objetivo o
desenvolvimento de biomateriais em escala nanométrica para implantação que induzam a
cicatrização rápida, controlada e previsível dos tecidos biológicos (BRUNSKI; PULEO;
NANCI, 2000)
Biomateriais ortopédicos são principalmente de dois tipos, primeiramente os implantes
e acessórios, que são geralmente feitos de metais, cerâmicas, polímeros resistentes ou seus
compósitos. Segunda categoria consiste de scaffolds para a regeneração de tecidos, que se
baseiam em polímeros - preferencialmente os biodegradáveis e os seus compósitos (CHLOPEK
et al., 2009; GU et al., 2002; MORAWSKA-CHOCHOL et al., 2011).

2.2.Tecido ósseo

Os ossos são constituídos de partes orgânica e inorgânica. A matriz orgânica é formada

de colágeno, principalmente tipo I, tendo cerca de 1,5 nm de diâmetro e de 200 nm de
comprimento, proteoglicanas e glicoproteínas adesivas como a integrina com sua estrutura de
20-23 nm contendo sítio de ligação de 5 nm na sua extremidade para adesão em outras células.
A matriz inorgânica é formada por íons fosfato, cálcio e em menor quantidade, bicarbonato,
magnésio, potássio, sódio e citrato. A união do fosfato e do cálcio forma cristais com estrutura
 20

de HAp que, associados às fibras colágenas, fornecem a resistência e dureza características do

tecido ósseo (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; NEWMAN, P. et al., 2013)
Quanto à composição química, ossos são tecidos duros, mineralizados ou calcificados,
compostos por HAp (30 a 67%), colágeno (20 a 30%), glicosaminoglicanos (em torno de 0,5%),
outras proteínas, componentes orgânicos e água (7 a 30%). Os ossos apresentam forma e seção
irregular, não axial, não simétrica. O trabeculado tem distribuição espacial específica nas
direções principais das tensões aplicadas. Em função do tipo de osso, idade, localização
anatômica, região, camada, profundidade, posição e/ou direção, os ossos apresentam variações
de suas propriedades mecânicas e biológicas, que decorrem da sua função: estrutural, de
suporte, sustentação de órgãos e sistemas, transmissão de forças, de alavanca, controle de
movimentos, articulações e proteção; bem como, em decorrência ao nível de atividade,
parâmetros de intensidade, direção, frequência e duração das tensões internas. É importante
ainda ressaltar que o tecido ósseo faz sua constante readequação através do equilíbrio dinâmico
entre os processos de remoção (atividade osteoclástica) e de formação (atividade osteoblásticas)
ósseas(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Para a aplicação e desenvolvimento de biomateriais avançados e biomiméticos em
implantes ósseos faz-se necessário conhecer o comportamento do tecido ósseo e sua interface
com o biomaterial. A região de adesão entre o tecido ósseo e a superfície de um biomaterial é
definida como osseointegração (BRANEMARK, 1983; MACHADO, 2008).
O mecanismo de reparação do tecido ósseo pela osteointegração é dividido em três fases:
osteoindução, neoformação e remodelamento. A osteoindução baseia-se na migração para
diferenciação das células na superfície do implante. A neoformação resulta em uma matriz
mineralizada disposta sobre a superfície do implante. A capacidade de ancoragem, ou seja, da
adesão celular depende das propriedades do bioimplante. E a remodelação cria a interface osso-
implante que consiste na formação do novo tecido ósseo, sendo que as características do
bioimplante, textura, composição química, assim como o metabolismo do paciente interferem
no processo de regeneração óssea (DAVIES, 1998; MACHADO, 2008; THELEN;
BARTHELAT; BRINSON, 2004).

2.3.Hidroxiapatita

A HAp, de formula química Ca10(PO4)6(OH)2, é o principal constituinte mineral dos ossos

humanos, é um composto a base de cálcio e fósforo que apresenta excelente biocompatibilidade
com tecidos moles como pele, músculo e gengivas, tornando-se ideal para implantes ou
 21

componentes de implantes ortopédicos ou odontológicos. Apresenta bioatividade e

osteocondutividade (CHLOPEK et al., 2009; GU et al., 2002; MORAWSKA-CHOCHOL et
al., 2011).
Nanocristais de HAp podem ser sintetizados basicamente de duas maneiras, via seca e via
úmida. Alguns estudos apontam o processo de via-seca como vantajosa pela alta produtividade
e baixo custo, mas em contra partida obtém-se cristalitos grandes e irregulares. Já por via úmida
além de produzir pós com cristalitos menores, estudos a defendem por sua simplicidade, baixo
custo, reatividade, estequiometria e material homogêneo (HONDA et al., 1990; SADAT-
SHOJAI et al., 2013).
Os métodos de precipitação podem apresentar variáveis tais como pH, temperatura de
produção, concentração molar dos reagentes, taxa de adição de reagentes, tempo de agitação,
tempo de envelhecimento e temperatura de calcinação. O tempo de envelhecimento e a cinética
de reação são variáveis críticas para a pureza e características cristalográficas do material
obtido. A composição dos reagentes está relacionada à pureza do material, que pode apresentar,
ou não, incorporação de impurezas espúrias em sua estrutura cristalina, além de diferenças nas
características morfológicas e cristalográficas. A taxa na qual os reagentes são adicionados
influencia na taxa de nucleação dos cristais (RIGO; GEHRKE; CARBONARI, 2007).
As fontes de cálcio para a produção da HAp sintética podem ser soluções aquosas de:
CaCl2 (cloreto de cálcio) , Ca(NO3)2 (nitrato de cálcio), CaCO3 (carbonato de cálcio),
Ca(CH3COO)2 (acetato de cálcio). Como fonte de fosfatos pode-se utilizar as soluções aquosas
de: (NH4)2HPO4 (fosfoto de amônio dibásico), NH4H2PO4 (fosfato de amônio monobásico) e o
NaH2PO4 (fosfato monossódico) (SKRTIC; ANTONUCCI; EANES, 2003).
Em geral, apatitas são capazes de formar várias combinações na rede cristalina, em
virtude das substituições de íons. Os átomos da HAp estão arranjados espacialmente numa
célula unitária tipo hexagonal, pertencente ao grupo espacial P63/m, caracterizado por um eixo
c de 6 unidades perpendiculares a 3 eixos equivalentes mantendo um ângulo de 120 o, e
dimensões de célula unitária a=b=9,42 Å e c= 6,88 Å (PRADO DA SILVA, 1999). É possível
identificar que a fase mineral do osso é uma apatita utilizando a da difração de raios-X
(HANDSCHIN; STERN, 1995). A Figura 1 ilustra a estrutura da Hap.
 22

Figura 1 - Estrutura da hidroxiapatita ao longo do eixo c.

Fonte (ELLIOTT, 1994).

Quando as HAp são incorporadas a biomateriais constituem-se nanocompósitos

biomiméticos, possibilitando a adesão e proliferação de células ósseas. A HAp oferece
superfície adequada para novo crescimento ósseo e consequente integração, devido à sua
semelhança, química e cristalográficas, ao principal componente inorgânico do osso natural.
Essa semelhança faz à HAp sintética ser muito estudada no campo da regeneração óssea.
(HABRAKEN et al., 2007; HUTMACHER et al., 2007; MORAWSKA-CHOCHOL et al.,
2011). A HAp confere osteocondutividade se o cristal for semelhante à apatita biológica. Por
esta razão, a redução do tamanho do cristal em nanoescala HAp é necessária (LAHIRI;
GHOSH; AGARWAL, 2012; THOMAS et al., 2007). A produção de nHAp sintética pode ser
um biomaterial ideal, por possui boa biocompatibilidade e melhor capacidade de integração
óssea (ZHOU; LEE, 2011). Biomateriais em nanoescala tem efeitos regulatórios sobre o
comportamento celular, incluindo adesão, migração, proliferação, sinalização, expressão
genética (HOLLANDA et al., 2014; NEWMAN, P. et al., 2013; ZHOU; LEE, 2011).
Entretanto, a HAp possui propriedades mecânicas pobres, tais como a fragilidade e a baixa
resistência ao desgaste, fatores que restringem seu uso e reduzem sua aplicação em implantes
(GOLLER et al., 2003). Para melhorar essas propriedades pesquisadores têm adicionado CNTs
durante a síntese de nHAp (MUKHERJEE et al., 2014; ZHAO et al., 2014).
 23

2.4.Nanotubos de Carbono

Em 1889 uma patente norte-americana relatou que filamentos de carbono podem ser
formados a partir de hidrocarbonetos, em cadinhos de metal em altas temperaturas (HUGHES;
CHAMBERS, 1889). Em 1991, os primeiros CNTs foram sintetizados por Iijima (IIJIMA,
1991) pelo processo de pirólise de grafite em plasma em atmosfera controlada de hélio.
Os CNTs são formados de arranjos hexagonais de carbono que originam pequenos
cilindros. Eles podem ser classificados pelo número de paredes/camadas, comprimentos,
diâmetros e presença de grupos funcionais o qual pode alterar a interação entre células ou
tecidos com os CNT (NEWMAN, P. et al., 2013). Estruturalmente há dois tipos: os CNTs de
paredes simples, do inglês single wall carbon nanotube (SWCNT) e os CNTs de paredes
múltiplas (MWCNT), apresentados na Figura 2. Os SWCNTs são representados por uma
camada simples de grafite enrolada formando um cilindro. Esta camada é composta por átomos
de carbono formando uma rede hexagonal, com ligações simples e duplas e com distância de
0,14 nm entre dois átomos mais próximos. Os MWCNTs são constituídos por duas camadas
simples ou mais de cilindros coaxiais (que tem eixos coincidentes), fechados nos extremos com
“hemisférios” de fulerenos. Podem apresentar defeitos como a presença de pentágonos isolados
e heptágonos e têm a distância de separação entre as camadas em torno de 0,34 nm (LOBO et
al., 2008). Os MWCNTs são produzidos com mais facilidade e com menor custo que os
SWCNTs (HERBST; MACÊDO; ROCCO, 2004).

Figura 2-Estrutura dos CNTs: (a) SWCNT, (b) MWCNT.

Fonte (MARSI, T. C. D. O., 2012)

A morfologia de superfície e ótimas propriedades térmicas, elétricas e mecânicas dos

CNTs são características dos grafenos (FAN, ZENG et al., 2014), porém, distinguem-se dos
 24

mesmos, pela construção tubular, diâmetro nanométrico, e por sua característica como material
poroso e/ou fibroso (ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR, 2006).
Os métodos de preparação mais utilizados na obtenção de CNTs são: descarga por arco,
ablação por laser e CVD do inglês chemical vapor deposition. Métodos de descarga por arco e
ablação por laser são baseados na condensação de átomos de carbonos gerados pela evaporação
(sublimação) de carbono a partir de um precursor sólido, geralmente grafite de alta pureza. As
temperaturas de evaporação envolvidas em tais processos aproximam-se da temperatura de
fusão do grafite, de 3000 a 4000º C (XU, X.; PACEY, 2001).
O método CVD vem sendo largamente aplicado na obtenção de CNT. O processo
envolve a reação de decomposição de um vapor ou gás precursor contendo átomos de carbono,
geralmente um hidrocarboneto na presença de um catalisador metálico, como a cânfora
(C10H16O ) e o ferroceno (Fe (C5H5)2) (ANTUNES et al., 2011).
Durante a produção dos CNTs seu interior armazena partículas de carbono amorfo,
fulerenos e metal catalítico como Co e Fe (YUAN et al., 2008). O uso de CNTs com impurezas
metálicas no seu interior é indesejado em vários campos de aplicação, em especial, no campo
biomédico, trazendo prejuízo a saúde, tornando-se tóxico a células. (FIRME III; BANDARU,
2010).
Há a necessidade de purificação dos CNTs, que consiste na remoção de partículas de
metal, sem degradação da estrutura de grafite, por meio de tratamentos térmicos ou banhos
ácidos (ROSCA et al., 2005). O tratamento térmico deve ser realizado em atmosferas livre de
oxigênio, pois a altas temperaturas o O2 (gás oxigênio) pode reagir com carbono formando CO2
(gás carbônico) ou CO (monóxido de carbono), corroendo as paredes de grafite. O grafite funde-
se em temperaturas de 3500 °C sob atmosfera inerte, enquanto o ferro funde-se a ~1536 ° C,
isso garante o sucesso da purificação por tratamento térmico (ANTUNES et al., 2011). No
tratamento com banho ácido utiliza-se HNO3 (ácido nítrico) (ROSCA et al., 2005) ou a mistura
de HNO3 com H2SO4 (ácido sulfúrico) que remove tanto carbonos amorfos como partículas
catalíticas metálicas de seu interior. A dissolução de ferro por ácidos ocorre pelo contato físico
do ácido com partículas de metal dissolvendo-as (EDWARDS et al., 2011).
Para melhorar a interação dos MWCNT com o meio aquoso e biológico realiza-se o
processo de funcionalização que modifica sua superfície hidrofóbica, por causa da propriedade
apolar das folhas de grafite (DAS et al., 2014), incorporando grupos funcionais durante esse
processo, tornando-o hidrofílico e biocompatível com o meio celular (LOBO, 2011).
Há diversas técnicas para obtenção da hidrofilicidade de CNTs, como a incorporação
do aminoácido lisina altamente hidrofílico (AMIRI et al., 2012), uso de vapor de água (RAN et
 25

al., 2013), banho ácido (GUTIÉRREZ-PRAENA et al., 2011). Um método muito utilizado é a
funcionalização a plasma de O2, por se tratar de um método rápido e eficiente (LOBO, 2011;
LOBO et al., 2012). Utilizando esta técnica, modificam-se as pontas e, parcialmente, as paredes
dos CNTs, além de incorporar grupos carboxílicos e carboxilatos pela incorporação do oxigênio
(LOBO et al., 2012) (POINT et al., 2005; XU, D. et al., 2006).
Torna-se importante destacar que a molhabilidade (propriedade do material em ter
afinidade com fluidos orgânicos, o que depende do ângulo de contato) também tem papel
fundamental e pode afetar a incorporação de grupos funcionais ou as interações (interfaces)
célula-material (LIU, H.; ZHAI; JIANG, 2006). As superfícies hidrofílicas são, geralmente,
favoráveis à fixação das células e biomineralização do tecido ósseo. Os MWCNTs também
despertam o interesse de pesquisadores na área biomédica por causa de sua excepcional
combinação de propriedades mecânicas/química, biocompatibilidade e facilidade de
incorporação de grupos funcionais tornando-os hidrofílicos (SAWASE et al., 2008; YUAN et
al., 2008).
Hollanda et. al., (2014), relataram que após o processo de funcionalização dos MWCNT
com plasma de O2 obtiveram regiões ao longo dos MWCNT com camadas esfoliadas
apresentando estrutura com organização de átomos referente ao óxido de grafeno, observado
com análises de micrografia eletrônica de transmissão (MET), sendo nomeados de MWCNT-
GO (HOLLANDA et al., 2014).
Existem diversas maneiras pelas quais os CNT podem ser utilizados no campo da
engenharia de tecidos. Eles podem melhorar e reforçar as propriedades mecânicas e
biocompatibilidade dos biomateriais compósitos apresentando biocompatibilidade in vivo,
interagir favoravelmente com as proteínas de ligação das células, e regular a diferenciação de
células-tronco (principalmente linhagens osteogênicas e neuronais). Sua forma tipo bastonete
com dimensões em nanoescala podem permitir-lhes atuar como uma estrutura morfológica
biomimetizando as proteínas fibrilares na matriz extracelular (MEC). (NEWMAN, P. et al.,
2013). Servindo como revestimento de superfície ou como arcabouços para o crescimento e a
proliferação de osteoblastos e consequente regeneração óssea (MATSUOKA et al., 2010;
SAITO et al., 2008)

2.5.Compósitos de nHAp e CNTs

Algumas investigações têm sido realizadas sobre a síntese de nHAp e MWCNT usando
vários métodos para obter nanocompósitos nHAp / MWCNT. Baradaran et. al. (2014),
 26

produziram HAp por via úmida gotejando grafeno durante a produção do compósito. Depois,
sinterizaram a amostra e realizaram ensaios mecânicos avaliando o modulo de elasticidade e
resistência a fratura. Conforme as amostras sinterizadas aumentavam seu conteúdo de grafeno,
melhores foram os resultados nos ensaios mecânicos comparados com a HAp sem grafeno
(BARADARAN et al., 2014). Zhao et. al.(2014), sintetizam HAp também por via úmida
adicionando diferentes teores de CNTs mantendo a solução em agitação ultrassônica, os
pesquisadores relataram que a adição de CNTs no composto foi benéfica para aumentar a
resistência ao desgaste dos compósitos de HAp/CNT e para diminuir o seu coeficiente de
atrito.(ZHAO et al., 2014). Estes estudos indicam a melhora das propriedades mecânicas da
HAp ao adicionar CNTs ou grafeno em sua composição.
Núñez et. al., (2014) produziu nHAp/CNT, também por via úmida, com uso do banho
ultrassônico para dispersão dos CNTs, sendo feita análise da união da nHAp com CNTs
utilizando microscopia eletrônica de transmissão. O autor esquematizou o crescimento da
nHAp sobre a superfície do CNTs, Figura 3. Sua micrografia de transmissão de alta resolução
mostra a presença de nHAp na superfície de um MWCNT, sendo possível observar as múltiplas
paredes no CNT e, em sua margem superior, a mudança do plano de cristalográfico da nHAp,
Figura 4 (NÚÑEZ et al., 2014).

Figura 3- Esquema do crescimento de nHAp sobre a superfície de CNT.

nHAp

CNT

Fonte (NÚÑEZ et al., 2014) (adaptado).

 27

Figura 4- MET de alta resolução do compósito de nHAp/ MWCNT.

nHAp

MWCNT

Fonte (NÚÑEZ et al., 2014) (adaptado).

Para o desenvolvimento de compósitos à base de nHAp/MWCNT necessita-se modificar

a superfície dos MWCNT para torna-los hidrofílicos, incorporando grupos carboxílicos (LOBO
et al., 2010; ZHAO et al., 2014).
Recentemente, Lobo e colaboradores (2013) desenvolveram um novo método para a
fabricação de compósitos à base de nHAp/MWCNT-GO após a modificação de superfície com
grupos carboxílicos e carboxilatos e utilização da síntese química assistida por ultrassom
(nHAp/MWCNT-UI), nº do registro: BR10201300578 (LOBO et al., 2013). O diferencial deste
método em relação aos anteriores é a possibilidade de escalonamento.
Investigações recentes revelam que irradiações ultrassônicas (ultrasonic irradiation - UI)
podem estimular a reatividade de espécies químicas em soluções, participando desta forma da
síntese e reações químicas. Foi reconhecido que esse tipo de tratamento causa cavitação em
uma formação indutiva aquosa media, crescimento e colapso de micro bolhas. Este processo de
agitação intensa leva a dissolução-precipitação de sólidos produzindo partículas com tamanho
reduzido ativando a superfície dos materiais (CAMPOS et al., 2007)
A eficiência da síntese depende de muitas variáveis, especialmente considera-se o tipo de
aparelho ultrassônico. O uso de um homogeneizador ultrassônico de ponta é mais eficiente do
que um banho ultrassônico (BARBOSA et al., 2013).
Utilizando MWCNT superhidrofílicos, em torno de 20% de O2, e o uso da irradiação
ultrassônica, é possível incorporar os cristais de nHAp ao longo da estrutura dos MWCNT
(LOBO et al., 2013).
 28

O uso dos CNTs em compósitos biológicos é utilizado por apresentar similaridades a

componentes naturais do tecido (MEC) (NEWMAN, PETER et al., 2013).

2.6. Ensaio de Bioatividade

O fluido corporal simulado (SBF) desenvolvido por Kokubo et al. (1990) é usado para
testes de bioatividade in vitro de biomateriais, por sua semelhança com componentes do plasma
do sangue. A solução SBF é utilizada para demonstrar a bioatividade do material, por imersão
das amostras nesta solução, o que induz processo biomimético promovido pela nucleação de
Ca - P sobre a superfície do biomaterial (KOKUBO, T. et al., 1990; MARSI, T. C. et al., 2012).
A principal diferença entre as apatitas biológicas e a HAp sintética é o conteúdo de carbonato
que é muito menor na segunda. O SBF é considerado uma fonte biomimética viável para o
aumento de conteúdo de carbonato nas HAp sintéticas. Os íons carbonatos substituem parte dos
íons hidroxila e parte dos grupos da estrutura da HAp (BAYRAKTAR; TAS, 1999).
O SBF é ideal para a avaliação in vitro da bioatividade de materiais artificiais e formação
de camada de apatita em vários materiais em condições biomiméticas, processo denominado
biomineralização (OYANE et al., 2003). As concentrações de íons de SBF e do plasma
sanguíneo são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1. Concentração de íons (mmol) do SBF e do Plasma Sanguíneo.

Íons SBF Plasma Sanguíneo
Na + 142,0 142,0
K+ 5,0 5,0
Mg2 + 1,5 1,5
Ca2 + 2,5 2,5
Cl - 147,8 103,0
HCO3 - 4,2 27,0
HPO4 2 - 1,0 1,0
SO4 2 - 0,5 0,5
Fonte (OYANE et al., 2003).

Existem alterações nas concentrações das soluções de SBF, sendo elas 1,5x, 5x mais
concentrada que a solução original (BOHNER; LEMAITRE, 2009; TANAHASHI et al.,
1994).
A biomineralização ocorre em solução aquosa com pH neutro, temperatura e pressão
ambiente (LIN CHUN et al., 2005). A biomineralização em solução de SBF é um procedimento
 29

simples, de baixo custo, reduzido consumo de energia e proporciona a rápida deposição no

material.
Kokubo e Takadama (2006) relataram que a capacidade de ligação de um material ao
osso é frequentemente avaliada pela análise da capacidade de formação de apatitas na sua
superfície em solução de SBF com concentrações de íons quase iguais às do plasma sanguíneo
humano. Concluíram que a análise da formação de apatitas sobre um material em SBF é útil
para predizer a bioatividade in vivo de um material ao osso, de forma que, em ensaios com
animais, o número de indivíduos utilizados e a duração da experimentação podem ser
consideravelmente reduzidos usando este método (KOKUBO, T.; TAKADAMA, 2006).
Lobo et al. (2011) combinaram nanotubos de carbono verticalmente alinhados
funcionalizados com plasma de O2 (VACNTs-O2) (do inglês vertical aligned carbon
nanotubes) e nHAp, dois excelentes materiais para aplicações na engenharia de tecidos ósseos.
No estudo, os nanocompósitos de nHAp/VACNT-O2 foram usados como suportes para cultura
de células de osteoblastos humanos. O processo de bioatividade e biomineralização in vitro de
nHAp/VACNT-O2 foi investigado utilizando SBF, com as amostras incubadas por 21 dias, e
ensaio de fosfatase alcalina- ALP (do inglês Alkaline Phosphatase). Os nanocompósitos de
nHAp/VACNT-O2, além de apresentarem-se como bioativos, mostraram uma maior
calcificação da MEC e excepcional adesão de células osteoblásticas humanas se comparados
ao Ti e filmes de VACNT-O2 (LOBO et al., 2011).
Por se tratar de um novo biomaterial com o intuito de ser analisado futuramente no uso
de próteses in vivo principalmente para regeneração óssea, torna-se necessário o estudo da
bioatividade e citoxicidade com ensaios colorimétricos in vitro (HE et al., 2008; SKEHAN et
al., 1990), bem como os efeitos antimicrobiano destes nanocompósitos. Estudos indicam que
aproximadamente 50% de todas as infecções de próteses são causadas por Estafilococos,
igualmente divididos entre o S.aureus e o S. epidermidis. Os outros 50% das infecções são
causadas por Eschechia coli, Estreptococos, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter e outros
(ERCOLE; CHIANCA, 2002; LICHTENFELS. et al., 2011).
Deste modo a contribuição desta pesquisa vai além de estudar a biocompatibilidade do
novo nanocompósito, mas igualmente avaliar o efeito bactericida deste novo biomaterial
utilizando para isto cepas padrão de Eschechia coli e Staphylococcus aureus.
 30

3. MÉTODOS

A pesquisa foi realizada com os seguintes grupos experimentais de nanocompósitos:

nHap/1%MWCNT-GO, nHap/2%MWCNT-GO e nHap/3%MWCNT-GO. Os grupos controles
serão os pós de nHap e MWCNT-GO. A pesquisa foi dividida em três fases, segue a descrição
de cada fase.

3.1. Produção dos nanocompósitos.

A produção dos nanocompósitos consiste, primeiramente, da produção dos

nanotubos de carbono de múltiplas paredes, seguido de sua funcionalização ao plasma de O2 e
purificação com banho ácido. Com esse material pronto, produz-se o compósito de nHAp com
CNT.

3.1.1. Produção dos nanotubos

Todo o processo de produção dos MWCNT-GO foi realizado no Laboratório Associado

de Sensores e Materiais – LAS do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais- INPE. Os
MWCNTs foram depositados na parede do tubo de quartzo por vapor químico (método CVD
térmico) à pressão atmosférica em 850° C. Fontes de carbono (cânfora, C10H16O, 84% da massa
total), e o catalisador de Fe (ferroceno, Fe (C5H5)2, 16%) foram evaporados a 200 ºC e
transportado para dentro do tubo de quartzo por um fluxo de N2 de 1,5 litros/minuto. Após 5
minutos de reação, os vapores foram cortados e o forno arrefeceu até a temperatura ambiente
sob N2. Os MWCNTs foram produzidos utilizando cânfora/ferroceno e purificados por
recozimento a alta temperatura numa atmosfera livre de oxigênio (N2).

3.1.2. Purificação dos CNTs

O método de purificação dos MWCNTs para retirada de Fe do interior dos nanotubos

foi realizado utilizando banho ácido com solução de H2SO4: HNO3 (3: 1). Os MWCNTs foram
misturados nesta solução e sonicado durante 5 h utilizando aparelho da marca Elmasonic
modelo S 10 H, depois a solução foi filtrada com uma membrana Millipore (0,45 µm poros)
para obtenção dos MWCNTs purificados, estes foram lavados com agua deionizada até atingir
pH neutro, e por fim, o pó de MWCNT foi seco em estufa a 100 ◦C durante 12 h.
 31

3.1.3. Funcionalização dos CNT.

O método de funcionalização dos MWCNTs para a incorporação de grupos contendo

oxigênio foi realizado num reator de plasma pulsado de corrente contínua, com uma taxa de
fluxo de oxigênio de 1 sccm, com uma pressão de 85 mTorr, -700 V e com uma frequência de
pulsos de 20 kHz a 50 % ciclo de trabalho durante 40 minutos (LIU, M. et al., 2005; RAMOS
et al., 2010; XU, T. et al., 2007).

3.1.4. Produção dos compósitos de nHap e CNT utilizando síntese química

assistida por Ultrassom

Para a produção do nanocompósitos de nHAp com as diferentes concentrações de

MWCNT-GO, Ca (NO3)2 4H2O (nitrato de cálcio tetra hidratado) e (NH4)H2PO4 (fosfato de
amônio monobásico) foram dissolvidos em 50 mL de água deionizada separadamente. Para
produção de cada um dos grupos, o pó de MWCNT-GO funcionalizados (1%, 2% e 3% em
peso), foram dissolvidos na solução de (NH4) H2PO4 e Ca (NO3)2 4H2O, utilizando uma sonda
ultrassônica (Vibracell Sonics, 500 W) por 30 minutos. O controle do pH foi realizado
inserindo-se solução de NH4OH (hidróxido de amônio) (25%) gota à gota, visando a
manutenção do pH da mesma em torno de 10 durante todo o processo.
O precipitado foi deixado em repouso durante 120 horas, correspondendo ao tempo de
maturação. O precipitado resultante foi filtrado, lavado com água destilada e colocado em estufa
durante 48 horas a 60 ° C, após seco o material foi triturado utilizando moinho analítico modelo
A11, marca IKA, com velocidade do motor de 28000 rpm, obtendo o grupo de nHAp/MWCNT
- UI, como grupo controle utilizou-se nHAp pura, sem adição de MWCNT e o próprio pó de
MWCNT.

3.2 Caracterização dos nanocompósito

Os grupos foram caracterizados quanto a sua morfologia, utilizando as análises de

microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia eletrônica de transmissão (MET),
adsorção de gases pelo método de BET (Brunauer, Emmett e Teller), Porosimetria de mercurio;
e sua composição quimica e cristalografica utilizando as análises de DRX, microfluorescência
de raio X por energia dispersiva µ-EDX e espectroscopia por reflexão total atenuada no
infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR).
 32

3.2.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

A técnica de caracterização por microscopia eletrônica de varredura tem o objetivo de

analisar a morfologia das amostras. Foram utilizados dois microscópios, um alocado no
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, com ampliação
de 15000 vezes; marca Zeiss/ EVO MA10, operado com voltagem de aceleração de 20 kV.
Outro alocado no LCE DEMa, Laboratório de Caracterização Estrutural do Departamento de
Engenharia de Materiais da UFSCar, utilizado para obter uma micrografia de alta resolução,
com aumento de 30000 vezes utilizando “canhão de emissão de campo” (field emission eléctron
gun – FEG); marca Philips modelo XL30 FEG, operado com voltagem de aceleração de 10 kV.
Para obtenção das imagens, nos dois aparelhos, foi necessário a aplicação de uma fina camada
de ouro (~10 nm) depositada sobre as amostras via a técnica de Sputtering para que a superfície
se torne-se condutora.

3.2.2 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)

A técnica de caracterização por microscopia eletrônica de transmissão tem objetivo de

analisar a estrutura dos nanocompósitos. Esta análise foi realizada no LCE – DEMa –
Laboratório de Caracterização Estrutural do Departamento de Engenharia de Materiais da
UFSCar, e foi utilizado o equipamento da marca FEI TECNAI modelo G² F20; com tensão
aplicada de 200 kV. Os pós de nHAp/MWCNT nas diferentes concentrações foram dispersos
em 50 mL de álcool com auxílio de ultrassom e algumas gotas foram depositadas em grades de
cobre (3 mm de diâmetro e 300 mesh).

3.2.3 Microfluorescência de raio X por energia dispersiva (µ-EDX)

A técnica de caracterização por microfluorescência por energia dispersiva de raios X

tem objetivo determinar a composição química das amostras e a quantidade dos elementos
presentes na amostra. Foi utilizado o aparelho Shimadzu/ μEDX-1300 pertencente ao
Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica do instituto de pesquisa e
desenvolvimento IP&D/UNIVAP. As amostras foram analisadas por dispersão de energia,
tendo um tubo de Rh como fonte da radiação incidente, posicionado a 90 ° e acoplado a um
sistema computadorizado. Foi realizada leitura de 5 pontos em cada amostra, sendo irradiada
 33

por um feixe de raios-X de raio de 50 μm, verificando a porcentagem em peso dos elementos
químicos Ca e P.

3.2.4 Difração de raios X (DRX)

Com esta caracterização é possível identificar as fases dos minerais presentes na amostra
e também permite o estudo das características cristalográficas destes minerais. Foi utilizado um
difratômetro da marca Panalytical, modelo X’Pert Pro, alocado no Laboratório Associado de
Sensores e Materiais do INPE. Os parâmetros da análise foram 2 θ entre 20° e 60°, tempo por
passo de 10 segundos e passo de 0,02°. A identificação das fases foi feita utilizando software
Highscore 3.0a da marca Panalytical, comparando o difratograma das amostras com as fichas
cristalográficas: JCPDS 009-0432 (Hidroxiapatita), JCPDS 019-0272 (Hidroxiapatita
Carbonatada), JCPDS 026-1077 (Carbono presente na ficha do Grafite) e JCPDS 085-0871
(Ferro).

3.2.5 Porosimetria de mercúrio

A técnica de caracterização por porosimetria de mercúrio tem o objetivo de analisar a

área total através da distribuição de tamanhos de poros dos compósitos juntamente com a
técnica de adsorção com condensação de gases BET. A porosimetria de mercúrio determina os
meso e macroporos. Foi utilizado o porosímetro de mercúrio da marca Quantachrome
Instruments, modelo PoreMaster GT, e o software Quantachrome Poremaster v 7.01 para
análises dos dados, este equipamento pertence ao LCP Laboratório Associado de Combustão e
Propulsão situado no INPE de Cachoeira Paulista.

3.2.6 Análise de gases pelo método BET- Brunauer, Emmett, Teller

A técnica de caracterização por adsorção com condensação de gases BET tem o objetivo
de analisarmos a área total através da distribuição de tamanhos de poros dos compósitos
juntamente com a técnica de porosimetria de mercúrio, a análise de BET determina os micro e
mesoporos. Foi utilizado o aparelho Quantachrome NovaWin 2 e o software Quantachrome
Instruments versão 2.2 pertencentes ao LCP Laboratório Associado de Combustão e Propulsão
situado no INPE de Cachoeira Paulista.
 34

3.2.7 Espectroscopia por reflexão total atenuada no infravermelho com

transformada de Fourier (ATR-FTIR)

A reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier é utilizada para

analisar os modos de vibração das ligações moleculares presentes na composição dos
nanocompósitos. Os dados foram coletados no intervalo de 4000-700 cm-1, um ponto para cada
amostra, utilizando um espectrofotômetro equipado com detector MCT operando em
refrigeração por nitrogênio líquido Foi utilizado o espectrômetro Spotlight-400, Perkin Elmer,
pertencente ao Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica do IP&D/UNIVAP.

3.3 Ensaios biológicos

Os ensaios biológicos foram realizados todos na forma in vitro, sendo divididos com o
intuito de avaliar a bioatividade dos compósitos, analisar a citoxicidade dos mesmos utilizando
linhagens de osteoblastos humanos, e o efeito bactericida que possam apresentar, utilizando
bactérias gram negativa e gram positiva.

3.3.1 Testes de Bioatividade

Para o teste de bioatividade os nanocompósitos foram imersos na solução de 1.5 SBF,

pH 7.4 (TANAHASHI et al., 1994) cuja concentração dos componentes é uma vez e meia maior
do que a solução original proposta por Kokubo (1998) (KOKUBO, TADASHI, 1998). A
solução foi regulada com solução tampão TRIS 4.037 g/L,, contendo as concentrações dos
reagentes em mM conforme a Tabela 2 (ZHU; MASUDA; KOUMOTO, 2004).

Tabela 2 - Concentrações dos reagentes da 1,5×SBF

Reagentes NaCl KCl CaCl MgCl2 NaHCO3 K2HPO4 Na2SO4
mM 206 4,5 3,75 2,25 6,71 1,5 0,75
Fonte (CHESNUTT et al., 2007).

As amostras foram incubadas numa relação sólido/liquido de 1 mg/mL sem renovação

do SBF, acondicionada em incubadora refrigerada de bancada, equipamento da marca Cientec,
modelo CT-712-R, agitadas a 75 rpm, em temperatura em torno de 36,5° C nos períodos: 14 e
21 dias. Após imerso pelos períodos determinados, os nanocompósitos foram lavados com água
 35

deionizada à 80º C para remoção dos sais, foram filtrados utilizando papel filtrante de 200 mm,
e secos em temperatura ambiente por 24 h.
As análises da bioatividade das amostras foram realizadas por MEV, espectroscopia por
reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR),
microfluorescência de raio X por energia dispersiva (µ-EDX) e difração de raio-X (DRX).

3.3.2 Análise da viabilidade e proliferação celular

Para análise da viabilidade e proliferação celular foi utilizado a linhagem celular de

osteoblastos humanos obtidas do fornecedor Lonza (CC-2538, Lonza, Walkersville, EUA). As
mesmas foram cultivadas em meios de crescimento específico (OGM, CC-3207, Lonza) e
incubadas em atmosfera de 5% de CO2 a 37º C, em garrafas plásticas de cultivo celular com
área de 75 cm2.
Preparação das amostras - amostras em pó foram misturados numa proporção de 50:50
(massa/massa) com ácido hialurónico (HyStem, HYS020, Sigma, St. Louis, EUA), preparados
em conformidade com as instruções do fabricante formando um scaffold. Uma fina camada
desta mistura foi alocada nas câmaras superiores de placas Transwell (Ref. # 3412, Costar,
Corning, EUA) com poros de 5 µm em sua membrana, para ficar em contato com os
osteoblastos porém sem dispersarem. A Figura 5 esquematiza o uso da placa Transwell com o
scaffolds dos nanocompósitos.

Figura 5 - Esquema do uso da placa Transwell com o scaffolds dos nanocompósitos.

Fonte (autor).
Os grupos de controle foram estabelecidos como se segue: um controle negativo (apenas
meio de cultura de células, sem células), um controlo positivo (células cultivadas em meio de
cultura), e os grupos nHAp, MWCNT-GO, nHAp/1%MWCNT-GO, nHAp/2%MWCNT-GO e
 36

nHAp/3%MWCNT-GO todos já misturados em ácido hialurónico para formação dos scaffolds

como descrito anteriormente.
Citotoxicidade
As células foram semeadas em placas de 6 poços (1x104 células / poço). Os seus níveis
de citotoxicidade foram avaliados utilizando o contato dos scaffolds inseridos nas câmaras
superiores de placas Transwell. Após 7 dias, as câmaras foram removidas, as células foram
lavadas em solução salina fosfato (PBS, Gibco, Carlsbad, EUA) e fixadas com ácido
tricloroacético a 10% (1 hora a 4 ° C). Após lavagem e secagem, as células foram coradas com
uma solução sulforrodamina B 0,4% em ácido acético a 1% (SRB, Sigma) durante 30 minutos
à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente com ácido acético a 1% para
remover o corante não ligado e sendo deixadas para secar. O corante ligado foi solubilizado em
1 mM de base Tris (Sigma), a solução foi agitada e transferida para uma placa de 96 poços, e
levada à um leitor de microplacas (Synergy HT Multi-Detection, marca Bio-Tek, Winooski,
VT) na absorbância de 570 nm. O teste foi realizado em triplicata.
Para a normalização dos dados primeiramente foi subtraído de cada poço o valor médio
da DO do grupo controle negativo, contendo somente meio de cultura sem célula, depois o valor
da DO de cada poço foi dividido pelo valor médio da DO do grupo controle positivo, contendo
somente as células em meio de cultura.

3.3.3 Efeito bactericida dos nanocompósitos

Para avaliar do efeito bactericida das amostras, utilizou-se as cepas de E. coli (ATCC
25922) e S. aureus (ATCC 25923) como modelos de bactérias Gram-negativas e Gram-
positivas, respectivamente. As bactérias foram cultivadas em meio LB (Luria-Bertani que
contém 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, NaCl 10 g / l) a 37° C. Diluiu-se as amostras
em PBS na razão de 1 mg / ml e, esterilizou-se a 120 ° C em autoclave durante 15 minutos.
Foi utilizado, para cada bactéria, placas de 24 poços contendo 1000 μl de meio LB com
5 μl (unidades formadoras de colônias por mililitro ~105 - UFC / ml) de bacteriana. As bactérias
foram expostas a duas concentrações das amostras diluídas em PBS (0,01 mg / ml e 0,1 mg /
ml). O teste foi realizado em triplicata. Para o controle positivo foi utilizado antibiótico
gentamicina de amplo espectro e para o controle negativo poços contendo apenas bactérias em
meio LB. As placas foram incubadas a 37 ° C por 3 h para E. coli e 12 h para S. aureus, conforme
a curva de crescimento das cepas descrita anteriormente por outros autores (SEZONOV;
JOSELEAU-PETIT; D'ARI, 2007; STREKER et al., 2005).
 37

Análise da densidade óptica

Após o período de incubação, foi retirada uma alíquota de 100 μL de cada e levado para
a leitura da densidade óptica (DO), num espectrofotómetro leitor de microplacas, (Synergy HT
multi-Detecção marca Bio-Tek, Winooski, VT), na absorbância de 520 nm. Foi utilizado a
equação a seguir para calcular a ação bactericida(LIU, T. et al., 2007):

R(%)=(B-C) /B x 100 (Equação 1)

Onde: R é a ação bactericida expressa em porcentagem. B é o valor médio da DO no grupo

controle negativo, e C o valor médio da DO nos grupos que foram testados.

3.3.4. Análise Estatística

Para analises estatística foi utilizado o software GraphPad Prisma 6 ®.

 Ensaio celular
Primeiramente os dados da DO foram tabulados e realizado teste de normalidade
D'Agostino & Pearson constatando a distribuição normal das amostras de todos os grupos, em
seguida foi realizado o teste ANOVA one-way e pós teste Tukey com p <0,05. Todos os grupos
foram comparados com o grupo controle célula,
 Ensaio com bactérias
Primeiramente os dados da DO foram tabulados e realizado teste de normalidade
D'Agostino & Pearson constatando a distribuição normal das amostras de todos os grupos, em
seguida foi realizado o teste ANOVA one-way e pós teste Tukey com p <0,05. Todos os grupos
foram comparados com o grupo Gentamicina.
 38

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nesta seção encontra-se os resultados obtidos com a metodologia utilizada e sua

discussão com os trabalhos similares encontrados na literatura.

4.1.Caracterização Morfológica e estrutural dos nanocompósitos

-Microscopia Eletrônica de Varredura

Na Figura 6 observa-se a micrografia eletrônica de varredura com emissão de campo dos

compósitos com aumento de x 30000. Na Figura 6(a) os MWCNT-GO apresentam-se com
comprimentos variados e superfície irregular, observa-se regiões mais esbranquiçadas nas
extremidades e ao longo de seu comprimento, atribui-se nessas regiões a presença de camadas
esfoliadas devido ao processo de funcionalização. Na Figura 6 (b) a nHAp apresentam seus
cristais aglomerados, formando placas em algumas regiões, bem similar a Figura 6 (c),
nHAp/1%MWCNT-GO. Nas Figuras 6 (d-e) é possível observar os MWCNT-GO recobertos
com nHAp (indicados por setas) nos grupos nHAp/2%MWCNT-GO e nHAp/3%MWCNT-GO.
Zhao et. al. (2014) produziram por via úmida, o compósito de HAp com diferentes concentrações
de MWCNT purificados com ácido nítrico, e identificaram a adesão de cristais de HAp na superfície
dos CNTs ao longo de seu comprimento utilizando análise de microscopia eletrônica de transmissão.
Núñez et. al. (2014) produziram nHAp/CNT também por via úmida com uso do banho
ultrassônico para dispersão dos CNTs e, observaram na superfície do MWCNT a presença de
nHAp pela mudança do plano de cristalográfico, utilizando microscopia eletrônica de
transmissão de alta resolução.
Os MWCNT-GO por possuírem grupos funcionais ao longo de seu comprimento
facilitam a nucleação de nHAp ao seu redor. Os modelos da interação da nHAp com CNTs se
baseiam no arranjo dos átomos de cálcio da HAp no plano (3 0 0) com átomos de carbono dos
CNTs, dispostos em rede hexagonal, sem haver interação química, exceto as interações de Van
der Waals. Porém, o crescimento de nHAp, por via úmida, sobre superfícies funcionalizadas
contendo oxigênio é descrita como a interação química entre os íons de Ca2+ com os grupos
funcionais que possuem oxigênio. (ARYAL; BAHADUR; et al., 2006; FAN, ZENGJIE et al.,
2014; LIAO et al., 2007)
 39

Figura 6- Micrografia eletrônica de varredura com emissão de campo, com aumento de x 30000 das amostras (a)MWCNT-GO, (b) nHAp, (c)
nHAp/1%MWCNT-GO, (d) nHAp/2%MWCNT-GO e (e) nHAp/3%MWCNT-GO.

a) b) c)

1 µm 1 µm 1 µm

d) e)

1 µm 1 µm

Fonte (autor).

39
 40

- Microscopia eletrônica de Transmissão

Na Figura 7 observa-se a micrografia eletrônica de transmissão dos compósitos. Observa-

se na Figura 7(a) o grupo MWCNT-GO com diferentes espessuras, em seu interior há regiões
que ainda contem partículas de Fe, observa-se que sua superfície apresenta contorno irregular
devido ao processo de funcionalização com plasma de O2. As figuras 7 (b-e) não diferem umas
das outras, todas apresentam cristais de nHAp com comprimento aproximado de 50 nm. Na
figura 7(f) observa-se no compósito de nHAp/3%MWCNT-GO que a espessura do cristal
apresenta-se com formato hexagonal de aproximadamente 20 nm, conforme a escala.
 41

Figura 7-Micrografia eletrônica de transmissão com escala de 50 nm das amostras (a)MWCNT-GO, (b) nHAp, (c) nHAp/1%MWCNT-GO, (d)
nHAp/2%MWCNT-GO, (e) nHAp/3%MWCNT-GO.e (f) nHAp/3%MWCNT-GO com escala de 20 nm.
a) b) c)

50 nm 50 nm 50 nm

d) e) f)

50 nm 50 nm 20 nm

Fonte (autor)

41
 42

-Análise de adsorção de gases pelo método BET, porosimetria e DRX

A Tabela 3 mostram os resultados obtidos pelas análises de adsorção de gases pelo

método de BET. Conforme o aumento do teor de MWCNT-GO nas amostras de nHAp
aumenta-se o valor da área superficial. Em relação ao diâmetro de poro, os grupos
experimentais apresentam diâmetro similar ao grupo MWCNT-GO.

Tabela 3- Resultado das análises de BET.

Área Média do
Amostra superficial Diâmetro do
(m2 g-1) poro (nm)
MWCNT-GO 39 3,12
nHAp 54,2 6,89
nHAp/1%MWCNT-GO 64,5 3,09
nHAp/2%MWCNT-GO 65,5 3,09
nHAp/3%MWCNT-GO 73,5 3,45
Fonte (autor).

Pesquisas relatam que a HAp possui área superficial de 20–60 m2 /g, seu diâmetro de poro
varia de 5- 15 nm e sua porosidade total varia de 60 a 70% (LI; TJANDRA; TAM, 2008;
PRAMANIK; IMAE, 2012; ZENG et al., 2014; ZHANG et al., 2010).
O tamanho dos poros interfere nas propriedades mecânicas da HAp, Liu (1997) relatou
que as HAp que apresentavam menores poros em sua superfície obtinham melhores resultados
nos testes de resistência à compressão do que as que possuíam poros maiores, também relatou
que o aumento da porosidade total da HAp interfere negativamente na resistência à compressão
(LIU, D. M., 1997).
Sabe-se que as citocinas (que variam de 8 a 10 nm) e as proteínas de adesão presentes
no meio/soro extracelular como a vitronectina, de aproximadamente 1 nm de espessura, se
alocam nos poros pequenos dos materiais e com isso favorecem a adesão das células ao redor
(WEBSTER, 2007; ZHANG et al., 2010).

-Análise de porosimetria por intrusão de mercúrio.

A Tabela 4 mostra os resultados obtidos com análise de porosimetria por intrusão de
mercúrio. O MWCNT-GO é o grupo que apresenta maior porosidade, e a nHAp a menor
porosidade, observa-se nos outros grupos o aumento da porosidade conforme a adição de
MWCNT em sua composição. O Grupo MWCNT-GO tem menor densidade e o grupo nHAp
maior densidade. A adição de MWCNT-GO nas amostras de nHAp aumenta o volume das
 43

amostras dos grupos experimentais diminuindo a densidade, esse resultado revela que a adição
de MWCNT-GO nos grupos experimentais alterou o volume e a densidade dos compósitos para
mesma massa analisada.

Tabela 4- Resultado das análises porosimetria utilizando 0,1g das amostras.

Porosidade Volume Densidade

Amostra
(%) (cm3) (g/cm3)

MWCNT-GO 75,7 0,206 0,486

nHAp 48,7 0,099 1,026
nHAp/1%MWCNT-GO 64,2 0,140 0,715
nHAp/2%MWCNT-GO 69 0,162 0,619
nHAp/3%MWCNT-GO 69,4 0,163 0,612
Fonte (autor).

Outro fator que influencia a biocompatibilidade dos compósitos é sua porosidade,

materiais com grande porosidade dão o aspecto rugoso à superfície, quanto maior área
superficial de um nanocompósito mais área de contato as células vão ter para de aderirem
(ANNAZ et al., 2004; WEBSTER, 2007).
As cerâmicas porosas também são utilizadas para liberação de fármacos, por facilitar a
incorporação do medicamento em seus poros (YU et al., 2014).
Os resultados obtidos nas análises de BET e porosimetria, indicam que os compósitos
apresentam características favoráveis para aplicações biológicas, por possuírem pequenos poros
em sua superfície bem como apresentar boa área superficial e alta porosidade, favorecendo a
adesão celular.

- Difratograma de Raios X

Na Figura 8 observa-se o difratograma de raios X de todas as amostras. Os picos

característicos de HAp hexagonal são encontrados em 2θ: 31,73º, 32,18º, 32,86º e 34,04º de
acordo com a ficha cristalográfica JCPDS 024-0033, e são observados nos grupos nHAp,
nHAp/1%MWCNT-GO, nHAp/2%MWCNT-GO e nHAp/3%MWCNT-GO, confirmando que
a adição de MWCNT-GO não alterou a formação de HAp.
No grupo MWCNT-GO os picos em 2θ -26.6º, 43.2º, 44º e 45.1º são característicos do
carbono de acordo com a fichas cristalográfica JCPDS: 00-026-1077 e 00-001-0640. Os picos
em 2θ – 38° e 49,3º indicam que amostra ainda contem Fe em sua composição de acordo com
a fichas cristalográfica JCPDS: 01-085-0871. Edwards et. al (2011) relatam que após o processo
 44

de purificação para retirada do Fe do interior dos CNTs, o mesmo pode ficar aprisionado se não
for usado banho ácido com auxílio de ultrassom para produzir o efeito de cavitação durante o
banho. O método de produção por pirolise dos MWCNT não apresentam ordenamento em sua
estrutura cristalina, esses defeitos facilitam a permeabilidade dos íons durante cavitação.
(EDWARDS et al., 2011; YUAN et al., 2008). Porém neste trabalho não foi obtido a retirada
total do Fe do interior dos MWCNT.
 45

Figura 8- Difratograma de raio X das amostras. Utilizado fichas cristalográfica JCPDS 024-0033 (Hidroxiapatita), JCPDS 00-026-1077 e 00-001-
0640(Carbono) e JCPDS 01-085-0871(Fe).

HAp Carbono Ferro

112


300
102

202


213
321


221
210

132
111

004
211

230
002

113
131

313
410

322
203

402
301
  
     
       

nHAp/3%MWCNT-GO
 
  
    
Intensidade (u.a)
      
 

nHAp/2%MWCNT-GO
 
 
 
         
  

 nHAp/1%MWCNT-GO
 
  
      
      

101

103
021

122
nHAp
002

 

102
 


MWCNT-GO

20 30 40 50 60
2 Theta
Fonte (autor)

45
 46

4.2. Análise da Bioatividade

- Difração de Raios X após 14 e 21 dias em imersão de 1,5x SBF

A Tabela 5 informa o tamanho do cristalito das amostras após 14 e 21 dias imersos em

1,5 x SBF. O tamanho do cristalito foi obtido utilizando a equação de Scherer no software High
Score. O grupo MWCNT-GO tem seu cristalito aumentado com o tempo de imersão em 1,5x
SBF. Observa-se que nas amostras com diferentes teores de MWCNT- GO o tempo de imersão
em 1,5x SBF influenciou no tamanho do cristalito, diminuindo-os, com isso, a nHAp não segue
um padrão.

Tabela 5- Tamanho do cristalito por tempo de imersão em 1,5 x SBF.

Tamanho Cristalito por dias de imersão
Grupos em 1,5x SBF (nm)
0 14 21
MWCNT-GO --- 12,3 8,9
nHAp 11,6 9,3 12,9
nHAp/1%MWCNT-GO 15 14,6 13,3
nHAp/2%MWCNT-GO 12,9 12,7 11,8
nHAp/3%MWCNT-GO 15,9 13,3 11,7
Fonte (autor).

O tamanho do cristalito de todos os compósitos está em escala nanométrica, o que facilita

a interação do compósito com as células (HE et al., 2008).
Na Figura 9 observam-se os difratogramas de raios X das amostras após imersão em 1,5
SBF por 21 dias. Nos grupos nHAp e os que variam o teor de MWCNT-GO o pico em 2θ:
35,98º foi identificado sendo de HAp carbonatada, utilizando ficha cristalográfica JCPDS: 00-
019-0272. No grupo MWCNT- GO identifica-se pico referente a HAp em 2θ: 45.3º e referente
a HAp Carbonatada em 2θ: 51.19º. Aryal et al. (2006) relatam a bioatividade de sua amostra de
MWCNT após imersão em SBF por 7 dias onde já apresentava cristais referente a HAp
(ARYAL; BHATTARAI; et al., 2006). Este resultado indica a bioatividade das amostras por
interagirem com o SBF precipitando cristais de HAp carbonatada em sua superfície.
 47

Figura 9- Difratograma de raios X das amostras após imersão por 21 dias em 1,5 x SBF. Utilizado fichas cristalográfica JCPDS 024-0033 (Hidroxiapatita),
JCPDS 00-026-1077 e 00-001-0640(Carbono), JCPDS 01-085-0871(Fe) e JCPDS 00-019-0272 (HAp carbonatada).

HAp Carbonatada Carbono

 HAp Ferro
 

301
 
 
       
    

nHAp/3%MWCNT-GO
 
Intensidade (u.a)

  
    
       
 
nHAp/2%MWCNT-GO
 
  
  
       
  

nHAp/1%MWCNT-GO
 
    
 
      
  

nHAp

203

321

    


MWCNT-GO
20 30 40 50 60
2 Theta
Fonte (autor).

47
 48

- Espectroscopia por reflexão total atenuada no infravermelho com transformada

de Fourier - ATR-FTIR

A Figura 10 mostra os espectros da análise de ATR-FTIR coletados à partir das amostras

de nHAp e nHAp com os diferentes teores de MWCNT-GO após 14 dias imersos em 1,5x SBF.
Na Figura 11 são os mesmos grupos citados anteriormente porem após 21 dias imersos. Na
Figura 12 apresenta-se separadamente somente o grupo MWCNT nos dois períodos de imersão,
14 e 21, com o intuito de melhor visualização dos espectros.
O grupo CO32- na HAp é encontrado na região espectral de 870–880 cm-1 (ʋ2, fora do
plano da curva de vibração) e 1400–1640 cm-1 (ʋ3, vibração de estiramento assimétrico)
(DEPLAINE et al., 2013; HOPPE et al., 2013) ou o pico em 1415 cm-1 (GIARDINA;
FANOVICH, 2010). O pico em 1020 cm-1, e a banda em 1200 cm-1 pode ser atribuída ao modo
(ʋ4) de estiramento assimétrico de P-O do grupo PO43- (ARYAL; BHATTARAI; et al., 2006;
HOPPE et al., 2013). Em todas as amostras esses picos foram encontrados.
 49

Figura 10- ATR-FTIR das amostras nHAp, nHAp1% MWCNT, nHAp2% MWCNT e nHAp3% MWCNT após 14 dias imersas em 1,5 SBF.

PO43-
CO32-
CO32-

Absorbancia (u.a) nHAp/3%MWCNT-GO

nHAp/2%MWCNT-GO

nHAp/1%MWCNT-GO

nHAp
800 1000 1200 1400 1600 1800
comprimento de onda (cm-1)

Fonte (autor).

49
 50

Figura 11- ATR-FTIR das amostras nHAp, nHAp1% MWCNT, nHAp2% MWCNT e nHAp3% MWCNT após 21 dias imersas em 1,5 SBF.

PO43-
CO32-
CO32-

Absorbancia (u.a) nHAp/3%MWCNT-GO

nHAp/2%MWCNT-GO

nHAp/1%MWCNT-GO

nHAp
800 1000 1200 1400 1600 1800
comprimento de onda (cm-1)

Fonte (autor)

50
 51

Figura 12- ATR-FTIR da amostra MWCNT-GO após 14 e 21 dias imersas em 1,5 SBF.

PO43-

Absorbancia (u.a)

CO32- CO32-
PO43-

MWCNT-GO (21dias)

MWCNT-GO (14dias)

800 1000 1200 1400 1600 1800

Comprimento de onda (cm-1)

Fonte (autor).

51
 52

De acordo com LeGeros (1991) a relação da intensidade entre a banda de carbonato

(1420 cm-1) e de fosfato (1010 cm-1), IC/IP, pode ser usada para estimar o teor de CO32- na
estrutura da HAp formada, (LEGEROS, 1991). Para esta análise, utiliza-se a equação 2:

𝐼𝐶
𝑦𝐶𝑂 3 = 10,134 ( ) + 0,2134 (Equação 2)
𝐼𝑃

Com esta, identifica-se se houve aumento do carbonato após ensaio de bioatividade.

Na Tabela 6 foi tabulado o teor de CO32- pela análise ATR-FTIR nos tempos 0, ou seja,
as amostras sem terem sido imersas em 1,5 x SBF servindo como controle, 14 e 21 dias após
imersão. Observa-se que o teor de carbonato aumenta com o tempo de imersão, indicando a
deposição de CO32- sobre as amostras, o que já foi identificado na análise de DRX a presença
de HAp carbonatada após a imersão em meio SBF.

. Tabela 6- Conteúdo de íons de Carbonato CO32- das amostras após imersão em 1,5 x SBF,
dados obtidos pela análise ATR-FTIR.
Grupos Controle 14 dias 21 dias
MWCNT-GO 0 1,46 1,99
nHAp 0,44 0,91 1,06
nHAP/1%MWCNT-GO 0,45 0,70 0,77
nHAP/2%MWCNT-GO 0,64 0,79 0,80
nHAP/3%MWCNT-GO 0,74 0,80 0,85
Fonte (autor).

- Microfluorescência de raio X por energia dispersiva (µ-EDX)

Outra forma de analisar a bioatividade das amostras é analisar o comportamento dos

íons de cálcio e fósforo das amostras, antes e após 14 e 21 dias de imersão em 1.5xSBF. A
Figura 13 mostra a porcentagem desses elementos nos diferentes tempos de imersão no fluído
utilizando analise de microfluorescência de raios X por energia dispersiva. Observa-se em todos
os grupos que com o tempo de imersão aumenta-se a porcentagem de cálcio e diminui-se a
porcentagem do fósforo. Com este resultado observa-se interação das amostras com o fluido
corporal simulado indicando a bioatividade dos mesmos.
 53

Figura 13- Análise dos elementos Ca e P das amostras após 0, 14 e 21 dias imersos em 1,5xSBF, obtido pela técnica de uEDX.

R e l a ç ã o d e C a e P d a s a m o s t r a s a p ó s 0 , 1 4 e 2 1 d i a s i m e r s o s e m 1 ,5 x S B F

80

P o r c e n t a g e m d o s e le m e n t o s C a e P

60

40

20

0
4
1

4
1

4
1

4
1

4
1

4
1

4
1

4
1

4
1

4
1
0

0
1
2

1
2

1
2

1
2

1
2

1
2

1
2

1
2

1
2

1
2
M W C N T -G O nH A p n H A p /1 % M W C N T - G O n H A p /2 % M W C N T - G O n H A p /3 % M W C N T - G O

D ia s d e im e r s ã o e m 1 ,5 x S B F
L egenda:

Ca P

Fonte (autor)

53
 54

- Micrografia eletrônica de varredura

As análises morfológicas das amostras após 21 dias de imersão são mostradas na Figura
14 por micrografias eletrônicas de varredura comparando com as amostras sem terem sido
imersas em SBF. Observa-se no grupo MWCNT-GO 21 dias a presença de placas de apatitas
(indicada por círculos) sobre os CNTs identificando a bioatividade do mesmo. Os grupos com
diferentes teores de MWCNT-GO após 21 dias apresentam morfologia similar ao controle. É
possível observar nos três últimos grupos filamentos de MWCNT-GO recobertos por apatitas
indicados por setas brancas.
Kokubo e Takadama (2006) relatam que a análise da formação de apatitas sobre um
material em SBF é útil para predizer a bioatividade in vivo de um material na regeneração óssea,
reduzindo o número de indivíduos e a duração em ensaios com animais (KOKUBO, T.;
TAKADAMA, 2006).
O grupo mais evidente na alteração de sua morfologia no ensaio de bioatividade foi o
MWCNT-GO, sinalizando o grande potencial deste grupo em aplicações biológicas.
 55

Figura 14- Micrografia eletrônica de varredura das amostras antes e após 21 dias imersas em 1.5 x SBF, com aumento de 15000 vezes.Fig 14(a1-a2)
MWCNT-GO; Fig 14(b1-b2) nHAp; Fig 14(c1-c2) nHAp/1%MWCNT-GO; Fig 14(d1-d2) nHAp/2%MWCNT-GO e Fig 14(e1-e2) nHAp/3%MWCNT-GO.
a1) b1) c1) d1) e1)
Controle

1 µm 1 µm 1 µm 1 µm 1 µm

a2) b2) c2) d2) e2)

21 Dias

1 µm 1 µm 1 µm 1 µm 1 µm

Fonte (autor).

55
 56

4.3.Análise da Viabilidade e proliferação Celular

A Figura 15 mostra a citoxicidade das amostras expostas a osteoblastos humanos,

utilizando teste de coloração SRB. A média de DO de todos os grupos é maior que o grupo
controle célula, indicando a não-citotoxicidade dos nanocompósitos, porém esse aumento não
é estatisticamente diferente.
Para a realização da coloração com SRB e posterior leitura da DO, as amostras têm que
ser retiradas dos poços contendo células, por este motivo foi utilizado à técnica de dissolução
dos pós em ácido hialurónico formando uma gelatina e colocados em transwell com membrana,
para que as células entrassem em contato com os pós dos compósitos cerâmicos e dos MWCNT
sem que estes se espalhassem pelo meio de cultura com células dificultando a leitura da DO.
A citoxicidade dos CNTs foi estudada em alguns trabalhos. Holanda et. al., (2014)
avaliaram a citotoxicidade de MWCNT-GO em fibroblastos de ratos e células neuronais
humanas, utilizando teste de coloração de brometo tiazolil azul de tetrazólio (MTT), e relataram
a não toxicidade do mesmo evidenciando a viabilidade deste material em ambas as células
(HOLLANDA et al., 2014). Mwenifumbo et al.,(2007) mostraram que osteoblasto humanos
têm alta atividade metabólica quando expostos aos MWCNT produzidos pelo método de CVD,
usando ensaios colorimétricos de MTT e lactato desidrogenase (LDH Lactate dehydrogenase),
e também relataram a não-citotoxicidade dos CNTs aos osteoblastos que permaneciam com seu
formato esférico sobre os MWCNT (MWENIFUMBO; SHAFFER; STEVENS, 2007).
Utilizando osteoblastos de ratos e teste colorimétrico de MTT para avaliar a
citotoxicidade, He et al.(2008) produziram, por via úmida, HAp com diferentes tamanhos de
grãos, escala micrométrica e nanométrica e conformaram em cilindros, relataram a
biocompatibilidade de todos os grupos, porém a nHAp se mostrou mais viável a células do que
a HAp com grãos micrométricos. (HE et al., 2008)
Baradaran et. al. (2014), avaliaram a citotoxicidade de compósitos, calcinados em
pastilha, de HAp, nHAp e nHAp com diferentes teores de grafeno, em células de osteoblastos
humanos, utilizando o teste colorimétrico MTT, todos os grupos foram identificados como não
citotóxico aos osteoblastos, identificando que quanto maior o teor de grafeno mais as células se
proliferaram (BARADARAN et al., 2014).
 57

Figura 15- Avaliação da citotoxicidade dos compósitos sob osteoblastos humanos utilizando teste colorimétrico SRB. Valores expressos da média e desvio
padrão. N=3.

C it o t o x ic id a d e - S R B

D e n s i d a d e ó p t ic a ( u .a ) - n o r m a liz a d o
1 .5
1 ,1 7
1 ,0 4
1 ,1 4

p e lo C o n tr o le C é lu la
1
1 ,0 6
1 ,0 6

1 .0

0 .5

0 .0

p
O

O
la

A
-G

-G

-G

-G
u

H
él

T
n
C

N
e

C
ol

W
tr

M
on

%
C

/1

/2

/3
p

p
A

A
H

H
n

n
Fonte (autor).

57
 58

4.4. Efeito Bactericida dos nanocompósitos

A principal diferença entre as bactérias gram-positiva e gram-negativa são a quantidades

de camadas protetoras que possuem, a gram positiva. S. aureus apresenta apenas uma camada
peptidoglicana, a gram negativa E. coli possui uma camada peptidoglicana e também uma
membrana externa, dificultando lesões (AKHAVAN; GHADERI, 2010).
A Figura 16 mostra o efeito bactericida das amostras sobre a bactéria gram positiva S.
aureus após 12 horas de contato. Foram utilizadas duas concentrações de amostra sobre a
bactéria e observa-se que com o aumento da concentração, maior o efeito bactericida. Foi
utilizado o antibiótico Gentamicina de amplo espectro como controle positivo reduzindo 100%
da DO. Realizando a análise estatística, observa-se que as duas concentrações de todos grupos
testados são estatisticamente diferentes do antibiótico, indicando que não possuem o mesmo
efeito que a gentamicina.
 59

.
Figura 16- Efeito Bactericida das amostras sob cepa bacterina S. aureus. Valores expressos da média e desvio padrão. N=3.

E f e it o B a c t e r ic i d a - S ta p h y lo c o c c u s a u r e u s

100

R e d u ç ã o D e n s id a d e Ó p t ic a ( % )
100

50 50
50
45
* * *
37
50 *
32 32
29
*
* *
*

0
L L L L L L L L L
m m m m m m m m m
g/ g/ g/ g/ g/ g/ g/ g/ g/
1m m 1m m 1m m 1m m
5 m 0 ,1 0 ,1 0 ,1 0 ,1
0 0 ,0 0 ,0 0 ,0 0 ,0
0 ,0
C a n ce n tra çõ es d o s G r u p o s
L egen d a
n H A p /1 % M W C N T - G O
A n tib io tic o G e n ta m ic in a
n H A p /2 % M W C N T - G O
M W C N T -G O
n H A p /3 % M W C N T - G O
* Grupos com p <0,05 comparado ao grupo Gentamicina.
Fonte (autor).

59
 60

Todos os grupos analisados têm efeito bactericida bem similares com pouca variação.
A Figura 17 mostra o efeito bactericida das amostras sobre a bactéria gram negativa E.
Coli após 3 horas de contato com os nanocompósitos. Foram utilizadas duas concentrações de
amostra sobre a bactéria e também observa-se que com o aumento da concentração maior o
efeito bactericida. Na análise estatística nenhum grupo experimental se assemelha à
gentamicina, sendo todos estatisticamente diferentes.
Os grupos que tiveram maior efeito bactericida neste experimento foram os que contém
nHAp, o que é um dado controverso com a literatura, pois apesar de todas as vantagens que
HAp apresenta, ela possui pouca atividade bactericida (SHANMUGAM; GOPAL, 2014;
SINGH et al., 2011). Estudos relatam que para melhorar essa propriedade adiciona-se na
composição da HAp elementos que possuem efeito bactericida, os mais comuns são Ag+, Cu2+,
Zn2+. Estes elementos são incorporados na molécula de HAp substituindo o Ca2+,
potencializando a atividade antimicrobiana da HAp (KIM et al., 1998; MA et al., 2009).
No estudo realizado por Shanmugam e Gopal (2014) são avaliados o efeito bactericida de
amostras de HAp dopadas com bismuto e prata, bismuto e potássio, bismuto e sódio e avaliam
também somente a HAp, sobre cepas de S. aureus, E. coli e C. albicans. O grupo que apresenta
melhor efeito bactericida contém bismuto e prata em sua composição com efeito bactericida de
96,9% sobre S. aureus, 99,7% sobre E. coli e 97,8% sobre C. albicans. O grupo somente com
HAp também apresenta efeito bactericida porém menor, 48,5% sobre S. aureus, 82,6% sobre
E. coli e 62,4% sobre C. albicans, os autores não elucidam o possível mecanismo bactericida
que a HAp possa ter sobre essas cepas. Neste trabalho também observa-se maior efeito
bactericida das amostras contento nHAp sobre a cepa E. coli do que a S. aureus.
Uma hipótese para o efeito bactericida na nHAp é a presença dos íons Ca 2+ em sua
composição, tornando sua carga superficial positiva em condições fisiológicas com pH neutro
(HARDING; RASHID; HING, 2005). Rosa et. al., (2014) realizaram a incorporação do
compósito de nHAp/1%MWCNT-GO em matriz polimérica, e avaliaram a carga superficial do
compósito identificando sua positividade (ROSA et al., 2014).
 61

Figura 17- Efeito Bactericida das amostras sob cepa bacterina E. Coli. Valores expressos da média e desvio padrão. N=3.

E f e it o B a c t e r ic i d a - E s c h e r ic h ia c o li

R e d u ç ã o D e n s id a d e Ó p t ic a ( % )
100

68 69
62 * *
* 51
45 44
41 *
50 * * *
3 1 .1
*

0
L L L L L L L L L
m m m m m m m m m
g/ g/ g/ g/ g/ g/ g/ g/ g/
m 1m m 1m m
1 m ,1 m 1m m
, 0 05 0 ,0 0 ,1 0 ,0 0 ,1 0 ,0
0 0 ,0 0 ,1
0
C o n c en tra çõ e s d o s G r u p o s
L egen d a

n H A p /1 % M W C N T - G O
A n tib io tic o G e n ta m ic in a
n H A p /2 % M W C N T - G O
M W C N T -G O
n H A p /3 % M W C N T - G O
* Grupos com p <0,05 comparado ao grupo Gentamicina.
Fonte (autor)

61
 62

Como foi mencionado anteriormente, os MWCNT-GO utilizados neste trabalho contém

carga superficial negativa e possui folhas de óxido de grafeno expostas ao longo de seu
comprimento obtidos pelo o processo de funcionalização (HOLLANDA et al., 2014). Akhavan
et al. (2010) relata que as arestas das folhas de óxido de grafeno apresentam carga positiva, o
que consequentemente atrai elétrons negativos da membrana bacteriana, lesionando-as
(AKHAVAN; GHADERI, 2010). O mesmo mecanismo bactericida é atribuído no estudo
realizado por Amiri et. al., (2012) que incorpora o aminoácido lisina ao longo dos MWCNT,
tornando o material hidrofílico e alterando a carga superficial tornando-a positiva com isso seu
efeito bactericida é potencializado por danificar a membrana das bactérias com cargas negativas
(AMIRI et al., 2012). A Figura 18 esquematiza o possível mecanismo bactericida dos MWCNT-
GO.
Os resultados apresentados sobre o efeito bactericida dos compósitos utilizados
mostram que há redução na quantidade de bactérias analisada após exposição da mesma aos
nanocompósitos. No entanto, não foram realizados ensaios para identificar qual a concentração
ideal das amostras apresenta o mesmo efeito que o antibiótico.
 63

Figura 18- Hipótese de mecanismo bactericida dos MWCNT-GO.

Membrana da bactéria com carga

superficial negativa

Folhas com óxido de grafeno

com carga superficial positiva

MWCNT-GO

Fonte (autor)

63
 64

5. CONCLUSÂO

Com a metodologia utilizada e os resultados apresentados neste trabalho, pode-se

concluir que com o aumento do teor de MWCNT-GO a porosidade e área superficial dos
compósitos são maiores.
Todos os grupos podem ser considerados bioativos, foi observado a presença de HAp
carbonatada após 21 dias em 1,5 SBF pela análise de DRX em todos os grupos, o aumento do
teor dos íons carbonato obtidos pela análise de ATR-FTIR também é um indicativo de
bioatividade, bem como o aumento da razão Ca/P obtidos pela análise de µEDX.
Nos ensaios celulares a adição de MWCNT-GO durante a produção de nHAp não afetou
negativamente os resultados.
Pode-se concluir na análise de citoxicidade com osteoblastos que nenhum dos grupos
são citotóxicos, não havendo muita diferença entre os grupos com diferentes teores de
MWCNT-GO.
Em relação ao efeito bactericida todos os compósitos analisados apresentam redução da
DO das cepas analisadas, e que com o aumento da concentração dos compósitos maior a
redução da DO, porém não sendo tão eficaz quanto ao antibiótico. Na cepa bacterina S. aureus
todos os grupos apresentam resultados bem similares, na cepa bacterina E. Coli. os compósitos
de nHAp com diferentes teores de MWCNT-GO obtiveram melhores resultados que somente o
MWCNT-GO.
Os ensaios mecânicos dos compósitos conformados em scaffolds trarão a resposta de
qual compósito será mais eficiente já que com o exposto neste trabalho conclui-se que o novo
compósito de nHAp com diferentes teores de MWCNT-GO tem potencial para aplicações
biomédicas por ser bioativos, não citotóxico e apresentar efeito bactericida.
Como possíveis aplicações deste novo biomaterial pode-se utiliza-los para melhorar a
biocompatibilidade dos materiais, como por exemplo incorporá-los em matriz polimérica ou
como revestimento de próteses metálicas.
 65

TRABALHOS FUTUROS

Para a continuidade das análises do compósito produzido neste trabalho, com o intuito
de identificarmos suas características e possíveis aplicabilidades no meio biológico, propõem-
se alguns trabalhos futuros.
Para identificarmos se a adição de MWCNT-GO afeta a carga superficial do compósito
propõem-se a análise do potencial zeta das amostras, o resultado desta análise poderá ser
relacionado com o efeito bactericida que o material apresenta, pois foi identificado a interação
entre as cargas superficiais das amostras com a membrana bacteriana.
No ensaio de bioatividade, além dos dados apresentados neste trabalho, propõem-se a
realização de análise de ICP-OES para quantificar os elementos Ca, P, C, O e H após diferentes
tempos de imersão no SBF a fim de identificar as mudanças que ocorrem nos compósitos e se
essas modificações assemelham-se ao encontrado na MEC natural.
Com o intuído da utilização dos compósitos na regeneração óssea, propõem-se a análise
do potencial osteogênico que os compósitos possam apresentam, utilizando ensaio de
calcificação da MEC com osteoblastos humanos por pelo menos 21 dias de exposição.
Em relação ao efeito bactericida dos compósitos, propõem-se identificar qual
concentração dos nanocompósitos apresenta efeito bactericida igual ao antibiótico de amplo
espectro, utilizando diferentes cepas bacterianas e leveduras. Realizando conjuntamente análise
de citoxicidade com osteoblastos humanos das mesmas concentrações dos compósitos expostas
às bactérias e leveduras. Identificando qual concentração apresentará bom efeito bactericida
sem ser tóxico para os osteoblastos humanos.
Realizar após os ensaios bacterianos MEV das bactérias para observar se há lesões em
sua membrana e correlacionar esse resultado com as características eletroestática dos
compósitos.
Outra proposta de trabalhos futuros é o uso dos compósitos produzidos neste trabalho
como matéria prima na conformação de scaffolds porosos tridimensionais, biomimetizando o
osso natural, e então realizar ensaios mecânicos (compressão, tração, deformação e outros)
identificando se há diferença entre os teores de MWCNT-GO. Após a produção desses
scaffolfs, por se tratar de um novo produto, propõem-se a realização de ensaios biológicos como
citotoxicidade, calcificação da MEC e efeito bactericida e ensaios in vivo.
 66

PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA

ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS

LOBO, A. O.; ZANIN, H.; SIQUEIRA, I. A.; LEITE, N. C. S.; MARCIANO, F. R.; CORAT,
E. J. Effect of ultrasound irradiation on the production of nHAp/MWCNT nanocomposites.
Materials Science & Engineering. C, Biomimetic Materials, Sensors and Systems (Print) , v.
33, p. 4305-4312, 2013.

ARTIGO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO

LEITE, N.C.S.; SILVA, N.S.; MARCIANO, F.R.; LOBO, A.O. Bioactivity and bactericidal
effect of exfoliated multiwall carbon nanotube. Enviado para Materials Letters em 19/12/14.

TRABALHOS COMPLETOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS

LEITE, N. C. S.; DA SILVA, N. S.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O. Análise da bioatividade

e efeito bactericida do novo compósito de nHAp/MWCNT FUNCIONALIZADOS. In: XXIV
Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica, 2014, Uberlândia. Anais do XXIV Congresso
Brasileiro de Engenharia Biomédica, 2014.

PEREIRA, F. A. S.; LEITE, N. C. S.; SALLES, G. N.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O.

Análise da bioatividade de compósito a base de nano-hidroxiapatita e nanotubos de carbono
superhidrofilícos. In: XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica, 2014, Uberlândia.
Anais do XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica, 2014.

SILVA, E.; SANTANA-MELO, G. F.; SILVA, A. S.; LEITE, N. C. S.; VASCONCELLOS, L.

M. R.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O. Avaliação da citotoxicidade de nanofibras de poli
(butileno adipato-co-tereftalato) com nanohidroxiapatita e nanotubos de carbono
superhidrofílicos incorporados. In: XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica,
2014, Uberlândia. Anais do XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica, 2014.
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LOPES, F. S.; OLIVEIRA, C. A. G. S.; LEITE, N. C. S.; TRAVA-AIROLD, V.; LOBO, A.

O.; MARCIANO, F. R. Bioatividade de filmes híbridos de carbono tipo-diamante contendo
nanopartículas de tio2. In: XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica, 2014,
Uberlândia. Anais do XXIV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica, 2014.

TRABALHOS PREMIADOS EM CONGRESSOS

LEITE, N. C. S.; DA SILVA, N. S.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O. Efeito bactericida do

novo nanocompósito de nanohidroxiapatita e nanotubos de carbono. In: XIV Encontro Latino
Americano de Pós Graduação, 2014, São José dos Campos. Anais do XIV Encontro Latino
Americano de Pós Graduação, 2014. p. 1-6.

LEITE, N. C. S.; SIQUEIRA, I. A. W. B.; ZANIN, H.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O.

Ensaio de Bioatividade in vitro de nanocompósitos de nHAp/MWCNT-UI utilizando Fluido
Corporal Simulado. In: XVII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, 2013, São
José dos Campos. XVII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, 2013. v. 1.
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