UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Instituto de Química
QI944/ QI – Técnicas de Microscopia Eletrônica aplicadas a Nanomateriais

MONOGRAFIA: GRUPO 3

Profª. Dra. Daniela Zanchet

Cleber da Silva torres - RA 219567
Dyemi Torikai - RA 233619
João Victor Lemos da Cunha - RA 176301
Lillia Iamar L. M. Gama - RA 230076
Magna da Silva Santos - RA 265974

CAMPINAS, dezembro 2021.

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1. INTRODUÇÃO

O estudo a respeito das estruturas dos materiais desenvolvidos é de extrema

importância para os pesquisadores há muitos anos, com o advento dos nanomateriais
esse interesse se intensificou, pois, os cientistas necessitavam entender as
propriedades desse novo modo de produção, logo, a análise microestrutural se fez
muito importante, pois permite entender as correlações entre as microestruturas,
propriedades dos materiais, tais como estruturas cristalinas, contornos de grãos, fases
e interfaces, defeitos, podendo chegar a predizer as propriedades do material quando
se tem informações estabelecidas1.

É desejável que a caracterização dos nanomateriais envolva a determinação

do tamanho, da composição química, da estrutura cristalina, quantidade, distribuição
das fases e a forma das nanopartículas, bem como determinar a natureza, quantidade
e distribuição de defeitos cristalinos, os quais se tem direta relação com as
propriedades e com o desempenho dos novos materiais1.

Os nanomateriais podem apresentar características diversas dependendo de

sua composição, tamanho, forma, fase, etc, portanto, demanda de várias técnicas
para sua completa caracterização. A determinação da estrutura cristalina
normalmente compreende técnicas de difração, tais como difração de raios-x. A
composição química das fases e microrregiões pode ser estudada utilizando análises
de raios-x por comprimentos de onda ou por dispersão de energia, entre outras. A
quantidade, tamanho, morfologia e distribuição das fases e defeitos cristalinos são
estudados com auxílio de microscopia óptica, eletrônica de varredura, eletrônica de
transmissão e de campo iônico. Daremos destaque a partir desse ponto as técnicas
de Microscopia de varredura e transmissão2.

O Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) se tornou um instrumento

indispensável em diversas áreas como na eletrônica, na geologia, na ciência e na
engenharia dos materiais, etc. Em particular, no estudo e desenvolvimento de novos
materiais, onde se têm exigido um número de informações altamente detalhadas das
características microestruturais, os quais se é possível de ser observado no MEV 3–5.
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Para a análise de materiais normalmente se utiliza um aumento da ordem de

10 000 vezes, magnificação facilmente alcançada pelo MEV. Na microscopia
eletrônica a área a ser analisada é irradiada por um fino feixe de elétrons. Como
resultado da interação do feixe de elétrons com a superfície da amostra, uma série de
radiações são emitidas tais como: elétrons secundários, elétrons retroespalhados,
raios-X característicos, etc. Estas radiações quando captadas corretamente irão
fornecer informações inerentes a amostra como, topografia da superfície, composição,
cristalografia, entre outras. Na microscopia eletrônica de varredura os sinais de maior
interesse para a formação da imagem são os elétrons secundários e os
retroespalhados. À medida que o feixe de elétrons primários varre a amostra estes
sinais vão sofrendo modificações de acordo com as variações da superfície. Os
elétrons secundários fornecem imagem de topografia da superfície da amostra e são
os responsáveis pela obtenção das imagens de alta resolução, já os retroespalhados
fornecem imagem característica de variação de composição6.

O emprego do microscópio eletrônico de transmissão (MET) é bastante

difundido no estudo de materiais biológicos, nanotecnologia, ciência dos materiais,
etc. O MET moderno possui de cinco a seis lentes magnéticas, várias bobinas
eletromagnéticas de deflexão e aberturas localizadas ao longo do caminho do feixe
eletrônico. Os três componentes principais pela sua importância com respeito aos
fenômenos de difração eletrônica são: lente objetiva, abertura objetiva e abertura
seletiva de difração. O intervalo de magnificação do MET varia de 1.000 a cerca de
380.000 vezes1,6.

No microscópio eletrônico de transmissão, a imagem da amostra é formada

sincronicamente à passagem do feixe de luz através dele. Os elétrons saem da
amostra pela superfície inferior com uma distribuição de intensidade e direção
controladas. Em seguida, a lente objetiva cumpre seu papel, formando a primeira
imagem desta distribuição angular dos feixes eletrônicos difratados. Em seguida, as
lentes restantes servem para aumentar a imagem. Vale destacar que a maioria dos
equipamentos utilizados no estudo de materiais (metálicos, cerâmicos e poliméricos)
dispõe de tensão de aceleração de até 200 kV, já os METs utilizados em sistemas
biológicos, comumente, operam na faixa de 60 a 80 kV1,6.
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Com o intuito de estudar os artigos para este projeto, analisamos o artigo

“Synthesis of porous Au–Ag alloy nanorods with tunable plasmonic properties and
intrinsic hotspots for surface-enhanced Raman scattering” onde descreve metodologia
para a produção de nanobastões de prata e ouro altamente poroso, com propriedades
de ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR), sendo posteriormente
utilizada para investigar a detecção por SERS da molécula de fluorescência Rodomina
6G e da molécula de sonda não ressonante 4-Nitrotiofenol após adsorção em P-
AuAgNRs, tais moléculas conhecidas por serem corantes7.

As propriedades LSPR são influenciadas pela forma, tamanho e composição

das nanoestruturas. Portanto, é extremamente importante a utilização de técnicas de
microscopia para verificar cada etapa da produção destas nanopartículas. Logo, Shi
e colaboradores fizeram uso da microscopia eletrônica de transmissão (MET) e
microscopia eletrônica de transmissão de varredura de campo escuro anular de alto
ângulo (HAADF-STEM), para obter imagens dos nanobastões sintetizados a cada
etapa do processo, conseguindo obter informações de forma, porosidade, tamanho e
consequentes mudanças de cristalinidade. Pois, sabe-se que o para um excelente
desempenho de espalhamento Raman com superfície aprimorada (SERS) de P-
AuAgNRs é contribuído por uma alta densidade de pontos de acesso de nanoporos,
cantos e bordas bem definidos e interações químicas entre metal e moléculas
estudadas7.

O outro artigo analisado foi o “Probing pore structure of virus filters using
scanning electron microscopy with gold nanoparticles” tal artigo estuda o desempenho
das membranas de filtração de vírus, que são fortemente influenciadas pelo tamanho
dos poros e morfologia da membrana. O artigo apresenta nova metodologia para
sondar o tamanho dos poros internos e a estrutura de diferentes membranas de
filtração de vírus por visualização direta de nanopartículas de ouro capturadas usando
microscopia eletrônica de varredura (MEV), as imagens foram usadas para identificar
a localização de nanopartículas individuais e para calcular a distribuição das
nanopartículas através da profundidade do filtro, portanto fornece informações
importantes sobre o tamanho e morfologia dos poros e as propriedades de captura de
vírus de diferentes filtros de vírus comerciais8.
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Membranas de filtração de vírus são usadas para remover vírus tanto no

bioprocessamento quanto no tratamento da água. Em aplicações de
bioprocessamento, os filtros de vírus são projetados para remover pelo menos 99,9%
do menor parvovírus (cerca de 20 nm de tamanho), enquanto fornece transmissão
quase completa do produto terapêutico, por exemplo, um anticorpo monoclonal, que
tem aproximadamente 8 nm de tamanho. Isso requer um projeto muito cuidadoso e
controle do tamanho dos poros da membrana e morfologia para obter a seletividade
desejada enquanto também atinge a alta capacidade (grande rendimento volumétrico
antes da incrustação)8–10.

2. Aplicações de MEV e MET

Em um dos sistemas são estudados nanobastões porosos de liga de Au-Ag (P-

AuAgNRs). O artigo traz uma nova técnica de síntese desse material onde é possível
controlar a porosidade e que apresenta nanopartículas com bordas bem definidas.
Esses P-AuAgNRs apresentam propriedades plasmônicas ajustáveis, e sabe-se que
as nanoestruturas plasmônicas contendo nanoporos internos encontram aplicações
crescentes nos campos de sensores e SERS, devido a propriedades ópticas
controláveis e hotspots integrados. Uma aplicação já observada experimentalmente
para as P-AuAgNRs é a alta sensibilidade para rodamina 6G (corante) e 4-nitrotiofenol
na detecção por efeito SERS7.

As P-AuAgNRs apresentam uma cristalinidade cúbica de face centrada (CFC),

onde a microscopia eletrônica foi utilizada nesse estudo para confirmação dessa
estrutura final e para acompanhamento de cada etapa da síntese do material. Essas
etapas foram, inicialmente, a síntese de nanobastões sólidos de liga de Au-Ag (S-
AuAgNRs) por aquecimento de nanobastões Au-core Ag-shell (Au@AgNRs)
encapsulados em sílica mesoporosa a 600°C e remoção completa das conchas de
sílica em ácido fluorídrico. Posteriormente, Fe(NO3)3 foi adicionado à suspensão
coloidal de S-AuAgNRs revestidos com brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB)
para transformar S-AuAgNRs em P-AuAgNRs.

O outro sistema são nanopartículas de ouro que são utilizadas para sondar
estruturas porosas de filtração de vírus. A performance das membranas na filtração
de vírus é altamente influenciada pelo tamanho dos poros subjacentes e pela
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morfologia da membrana, e o estudo demonstra uma nova metodologia para analisar

o tamanho dos poros internos e a estrutura de diferentes membranas de filtração de
vírus. As membranas analisadas são duas de fibra oca (Planova™ 20 N e BioEX), e
duas de folha plana (Viresolve® Pro e Ultipor® DV20). E essas foram testadas com
nanopartículas de ouro de 20 nm, 40 nm e 100 nm. Neste estudo, é realizada a
filtração de diversos tamanhos de nanopartículas de ouro, com intuito de caracterizar
e conhecer as capacidades de cada região de filtração das membranas. As
nanopartículas de ouro capturadas pela membrana foram analisadas por meio de
MEV e as imagens foram estudadas a dispersão das nanopartículas em cada
membrana, bem como a profundidade que diversas nanopartículas de tamanhos
diferentes penetraram nos filtros. Os resultados apontam que membranas com alta
homogeneidade de estrutura porosas apresentam maior capacidade de filtração de
partículas, porém o fluxo de líquido que passa pela membrana será menor. O estudo
dos poros e estrutura das membranas de filtração de vírus por MEV pode ser
fundamental para a construção de filtros cada vez mais eficientes8.

Nanopartículas de ouro tem formatos e tamanhos bem definidos e por isso

apresentam uma grande área de aplicação que depende da concentração, tamanho
e estrutura da nanopartícula, variando entre formatos cúbicos, octaédricos e
dodecaedros. As nanopartículas de ouro apresentam normalmente uma direção de
crescimento axial e podem crescer em formas esféricas dependendo do crescimento
de cada face. Umas das aplicações das nanopartículas de ouro é na parte de catálise,
podendo aumentar ou diminuir a atividade catalítica dependendo das condições
citadas anteriormente, entregando uma grande faixa de possibilidades na área de
catalisadores. As diferenças de estrutura causam oscilações coletivas dos elétrons
em metais excitados por radiação eletromagnética com comprimentos de onda que
superam o comprimento da partícula, causando uma LSPR. Com isso, moléculas que
estão ligadas quimicamente podem ser detectadas, pois a ressonância é sensível a
alterações de densidade eletrônica. Sendo possível construir sensores sensíveis de
nanopartículas de ouro, capazes de estudar a termodinâmica e processos de ligação
de moléculas de interesse biológico e ambiental.

As imagens de microscopia eletrônica neste estudo foram usadas para

identificar a localização de nanopartículas individuais e para calcular a distribuição das
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nanopartículas através da profundidade do filtro, fornecendo informações importantes

sobre as características de desempenho dessas membranas de filtração de vírus.

3. Discussão dos parâmetros de análise por MEV e MET

3.1 Sistema MET

Para o primeiro sistema, síntese de nanobastões de liga de Au-Ag porosos com

propriedades LSPR e hotspot intrínsecos para o SERS, as imagens TEM
apresentadas foram conduzidas em um microscópio JEOL-1010 operado a 80 kV.

Inicialmente, Au@AgNRs uniformes, Figura 1B, foram sintetizados seguido por

encapsulamento de sílica em Au@AgNRs. A espessura das camadas de SiO 2 era de
aproximadamente 30 nm, Figura 1C. Os nanobastões foram posteriormente recozidos
para obter uma liga homogênea de Ag e Au, Figura 1D. Posteriormente, as cascas de
sílica foram removidas por ataque ácido com HF em solução CTAB para produzir S-
AuAgNRs, Figura 1E. S-AuAgNRs foram posteriormente desalojados com Fe(NO 3)3
para fazer o ataque ácido parcialmente instável da liga homogênea de Au-Ag, levando
à formação de redes altamente porosas de P-AuAgNRs, Figura 1F.

Figura 1. Imagens TEM de Au@AgNRs (B), Au@AgNR@mSiO2 (C), AuAgNR@mSiO2 (D), S-AuAgNRs
(E) e P-AuAgNRs (F).

Observa-se nas imagens diferenças de contraste. Este efeito é causado devido

aos números atômicos dos materiais. Assim, como a amostra possui tanto
nanopartículas de prata como de ouro, e o ouro por ter número atômico maior terá um
escurecimento mais forte na imagem.

Na Figura 1C, por exemplo, temos a contraste de massa-espessura, que vai

depender da maior interação do feixe de elétrons dependendo da maior massa ou
espessura na amostra. Assim, quando se tem uma maior massa e maior espessura
ocorrerá um maior espalhamento do feixe, ou seja, em ângulos maiores que ao passar
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pela lente o mesmo é recombinado, logo parte do feixe não vai passar pela abertura
de contraste, com isso o que possui maior massa a parte maior do feixe será barrado
apresentando, portanto, um sinal mais fraco, portanto mais escuro. Assim, uma
energia mais baixa que 80 Kv teria um ouro mais escuro e uma sílica ainda mais
escura.

3.2 Sistema MEV

O artigo referente a Sondagem da estrutura de poros de filtros de vírus usando

microscopia eletrônica de varredura com nanopartículas de ouro, avaliou a estrutura
dos poros internos de diferentes membranas de filtração de vírus por meio da
visualização direta da captura de nanopartículas de ouro de diferentes tamanhos. As
imagens MEV foram obtidas usando membranas de fibra oca (Planova TM 20 N e
BioEX) e de folha plana (Viresolve Pro e Ultipor DV20).

3.2.1 Planova TM BioEX

Imagem de alto contraste da fibra Planova BioEX com a mistura de 100 e 20

nm de nanopartículas de ouro foram avaliadas e estão mostradas na Figura 2A. As
sub-imagens em maior ampliação mostradas na Figura 2B são de partículas de 100
nm com contraste de cor bem mais claro próximo a entrada da fibra cerca de 5 µm e
em 2C partículas de 20 nm presentes mais profundamente na membrana, em torno
de 5 -15 µm.

Figura 2. Imagem MEV de alto contraste de uma fibra Planova TM BioEX.

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3.2.2 Planova TM 20N

As imagens MEV de alto contraste correspondentes a Planova TM 20N após a

filtração de uma mistura de nanopartículas de ouro de 100 nm e 20 nm são mostradas
abaixo.

Figura 3. Imagem MEV de alto contraste de uma fibra Planova TM 20N.

As partículas de 100 nm são facilmente visíveis perto da entrada do filtro. A

maioria das nanopartículas de 20 nm são capturadas dentro de uma banda de
aproximadamente 2-3 µm de espessura e localizadas logo além da região de captura
das nanopartículas de 100 nm. No entanto, as partículas isoladas de ambos os
tamanhos são observados em toda profundidade da membrana.

3.2.3 Membranas Viresolve® Pro

Em contraste com os filtros Planova™, a membrana Viresolve® Pro é uma

membrana de folha plana altamente assimétrica com aproximadamente 140 µm de
espessura. Os experimentos de filtração foram realizados com camadas únicas da
membrana Viresolve® Pro, utilizando misturas das nanopartículas de ouro de 40 e
100nm mostradas na Figura 4A ou de nanopartículas de 20 e 100 nm observadas na
Figura 4B. Na Figura 4C de alta ampliação (100.000x) de uma pequena região mostra
a captura das nanopartículas de ouro de 20 nm próximo a saída da membrana.
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Figura 4. Imagens de MEV de seções transversais da membrana Viresolve ®Pro.

A grande maioria das nanopartículas de ouro de 20 nm foram capturadas em

uma banda estreita de aproximadamente 600 nm de espessura Figura 4C. As
nanopartículas de ouro de 40 e 100 nm foram capturadas um pouco mais dentro do
filtro.

3.2.4 O Ultipor® DV20

Imagens MEV da folha plana Ultipor® DV20 mostram que a maioria das
nanopartículas de ouro de 20 nm são capturadas em uma banda de aproximadamente
de 3 µm de espessura perto da entrada do filtro, embora algumas tenham penetrado
alguns mícrons mais profundamente no filtro. No entanto, as partículas de 100 nm
foram retidas imediatamente na entrada do filtro consistente com um tamanho de poro
que é significativamente menor que 100.

Figura 5. Imagens MEV de uma seção transversal através de um Ultipor ®membrana DV20.
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Assim, nas imagens de Planova TM BioEX, Planova TM 20N, Membranas

Viresolve® Pro e Ultipor® DV20, observa-se informações mais superficiais, que podem
ser devidos a presenças de elétrons secundários.

Através do contraste das imagens nota-se a presença de incrustações, nesse

caso, a presença do ouro, com coloração mais esbranquiçada, observados com a
ampliação das imagens, além disso as imagens apresentam brilho e contraste muito
boas, estão em equilíbrio.

De modo geral, as nanopartículas de ouro são monodispersas e estão

disponíveis em uma variedade de tamanhos. A resolução da imagem foi aumentada
através da adição de uma fina camada de irídio, que evitou o carregamento do material
da membrana e aumentou o contraste, aumentando também a emissão de elétrons
secundários.

O motivo para o recobrimento das amostras, é que as camadas depositadas

podem melhorar o nível de emissão de elétrons, pois emitem mais elétrons que o
material da amostra, facilitando a construção da imagem.

4. Discussão sobre informação obtida e complementaridade com outras

técnicas.

Para a análise referente a síntese de nanobastões de liga de Au-Ag porosos

com propriedades plasmônicas ajustáveis e pontos de acesso intrínsecos para
espalhamento Raman aprimorado por superfície, as técnicas complementares
utilizadas formam microscopia eletrônica de transmissão de varredura de campo
escuro anular de alto ângulo (HAADF-STEM), método de mapear amostras com
elétrons altamente sensível a variações no número atômico (imagens de contraste Z).

As nanoestruturas porosas de P-AuAgNRs foram resolvidas HAADF-STEM e

são mostradas na Figura 6. Os nanoporos são bem distribuídos e interconectados em
todos os nanoporos, montando estruturas bicontínuas. Além disso, os P-AuAgNRs
exibiam ligamentos metálicos sólidos de formato irregular e canais de poros vazios
Figura 6A. O recozimento de alta temperatura permitiu a mistura completa de Au e Ag
em nível atômico e produziu nanobastões totalmente ligados, conforme evidenciado
pela sobreposição completa das distribuições elementares de Ag e Au Figura 6B e
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6C. É importante notar que P-AuAgNRs reteve a cristalinidade FCC Figura 6D e 6E.
As franjas da rede foram alinhadas na mesma direção, cujos espaçamentos (111) e
(200) da rede foram de 0,235 nm e 0,204 nm, respectivamente, que corresponderam
aos cristais FCC de Au e Ag.

Figura 6. Imagem HAADF-STEM de P-AuAgNRs (A). Mapeamentos elementares de P-AuAgNRs para

Ag e Au (B e C). Imagens HRTEM e caracterização de superfície em escala atômica de dois P-
AuAgNRs representativos (D e E).

Para a análise referente a sondagem da estrutura de poros de filtros de vírus

usando microscopia eletrônica de varredura com nanopartículas de ouro, foi utilizada
a técnica de Dynamic Light Scattering (DLS), no intuito de complementar a técnica de
microscopia eletrônica utilizada. Assim, a técnica de DLS serviu para verificar se as
nanopartículas de ouro estavam monodispersas. Amostras das partículas com
tamanhos de 20, 40 e 100 nm foram analisadas, com resultados mostrados abaixo.
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Figura 7. Análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS) de suspensões de nanopartículas de ouro.

Em cada caso, as amostras apresentaram apenas um único pico, com tamanho

médio de 25 ± 8 nm, 42 ± 12 nm e 100 ± 30 nm. As distribuições de tamanho para as
nanopartículas de ouro de 20 e 40 nm mostraram algum grau de sobreposição; assim,
as membranas foram desafiadas com suspensões das nanopartículas individuais ou
das nanopartículas de 100 nm em uma mistura com as nanopartículas de 20 ou 40
nm.

Outra técnica também utilizada como complementaridade a técnica de

microscopia eletrônica ainda para filtração de vírus foi a Espectroscopia de Energia
Dispersiva de Raios-X. Ela que permite a caracterização química/análise elementar
de materiais foi utilizada na membrana Planova™BioEX. O mapeamento EDS mostra
claramente a captura de um grande número de partículas de ouro de 100 nm na
entrada do filtro, consistente com o alto grau de exclusão dessas nanopartículas
relativamente grandes da estrutura dos poros da membrana BioEX. Os espectros de
EDS (Figuras 8C e 8D) mostram claramente o pico de ouro na região contendo as
nanopartículas de ouro (Figura 8C); este pico está ausente no espectro para uma
região profunda dentro da membrana.
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Figura 8. Análise espectral EDS de elementos para toda a região mapeada (C) ou a área selecionada
de toda a região mapeada (D).

5. Conclusão

O levantamento feito neste estudo demonstra claramente a utilidade do uso de

análise MEV de captura de nanopartículas de ouro para estudar o tamanho dos poros
e a assimetria dos poros nas membranas de filtração de vírus de fibra oca e de folha
plana. O estudo dos poros e estrutura das membranas por MEV pode ser
indispensável para a construção de filtros cada vez mais eficientes.

O acompanhamento por TEM durante as etapas de produção das

nanopartículas porosas de ouro e prata se tornaram de fundamental importância.
Acreditamos que a técnica seja aplicável para projetar outras nanoestruturas de metal
porosa adequadas a aplicações baseadas em SERS, como catálise, biossensores,
conversão de energia fototérmica, imagem biológica e entrega de drogas.
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6. Referências

1 Z. L. Wang, Adv. Mater., 2003, 15, 1497–1514.

2 W. Sigle, Annu. Rev. Mater. Res., 2005, 35, 239–314.

3 D. McMullan, Scanning, 2006, 17, 175–185.

4 P. Echlin, J. Microsc., 1978, 112, 47–61.

5 B. M. Fernández-Pérez, J. Izquierdo, S. González and R. M. Souto, J. Solid

State Electrochem., 2014, 18, 2983–2992.

6 T. Klein, E. Buhr and C. Georg Frase, 2012, pp. 297–356.

7 S. Ke, C. Kan, X. Zhu, C. Wang, X. Wang, Y. Chen, X. Zhu, Z. Li and D. Shi,

CrystEngComm, 2021, 23, 3467–3476.

8 H. Nazem-Bokaee, F. Fallahianbijan, D. Chen, S. M. O’Donnell, C. Carbrello,

S. Giglia, D. Bell and A. L. Zydney, J. Memb. Sci., 2018, 552, 144–152.

9 M. E. Verbyla and J. R. Mihelcic, Water Res., 2015, 71, 107–124.

10 G. Bolton, M. Cabatingan, M. Rubino, S. Lute, K. Brorson and M. Bailey,

Biotechnol. Appl. Biochem., 2005, 42, 133.