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  • 6 - Citogenética Geral

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    6 - Citogenética geral

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    Fundamentos de Citogenética A citogenética clinica & 0 estudo dos cromossomos, de sua es- ‘rutura e sua heranga aplicado & prética da genética médica Ha ais de 40 anos sabfamos que as mudangas microscopicamente visiveis no mimero ou na estrutura dos cromossomos poderiam responder por virias condigdes elinicas. Hoje em dia, a andlise cromoss6mica, com uma resoluglo uma preciso muitissimo ‘melhoradas, 6 um provedimento diagnéstico cada vez mais im- portante em varias éreas da medicina clinica 0s distirbios eromossdmicos formam uma importante cate- goriade doengas genétces Eles contribuem para uma graide ro- porsio de todas as perdas reprodutivas, malformagées congeni tas e etardo mental, tendo um importante papel na patogenia da tmalignidade As anomalias cromossOmicas especificas sio res- ponsdveis por mais de 100 sindsomes identificaveis que, em ter- 10S coletivos, sio mais comuns que todos os distirbios mende- lianos menogénicos juntos. Os distirbios citogenéticos esto presentes em quase 1% dos nativivos, em cerca de 2% das ges- tagdes de mulheres com mais de 35 anos que tiverarn diagn6sti- co pré-natal e em metade de todos os abortos espontineos de primeiro trimestr. Neste capitulo, discutiremos os prinefpios gorais da citoge- nética clinica ¢ os varios tipos de anomalias naméricas e estru- turais observadas em cariétipos humanos Algumas das mais comuns e mais bem conhecidas anomalias dos autossomos ¢ cro- mossomos sexuais serdo deseritas no préximo capitulo INTRODUGAO A CITOGENETICA A morfologia geral e @ organizagio dos cromossomos huma ‘nos, bem como sua composigio molecular, foram introduzi- das nos Caps. 2¢ 3. Para fazer uma andlise cromoss6mica para fins clinicos rotineiros, as células devem sercapazes de eres- cer ese dividir rapidamente em cultura, As células mais pron- tamente acessiveis que atendem a estes requisitos sio of leu- céticos, especificamente os linfécitos T. Para preparar uma ccultura a curto prazo destas células adequadas para andlise, uma amostra de sangue periférico é obtida, em geral por ‘enipungio, e misturada com heparina para evitar a coagula- go. Os leneécitos sio coletados, colocados no meio de cul- tura e estimulados a se dividir Apés alguns dias, as células em divisao séo bloqueadas na metiifase com substancias qui- micas que inibem a formagao do fuso mit6tico, coletadas © Clinica tratadas com uma solugZo hipot6nica para liberar os cromos- somos. Os eromossomos sio entio fixados, espalhados em laminas e corados por uma de vérias técnicas, dependendo do procedimento diagnéstico que estiver sendo feito. Elas entio esto prontas para anélise. Indicagées Clinicas para a Andlise Cromossémica ‘A andlise cromossOmica € indicada como um procedimento diagnéstico rotineiro para varios fendtipos espectficos encon- trados em clinica médica, como descrito neste capitulo ¢ no Cap, 10, Além cisso, também existem situagoes clinicas ge- rai inespecificas ¢ achados que indicam uma necessidade de andlise citogenética: 1. Problemas de crescimento e desenvolvimento iniciais Falta ou retardo do desenvolvimento, face dismérfica, malforma- bes miltiplas, baixa estatura, genitélia ambigua e retardo ‘mental so achados freqlientes em criangas com anomalias ctomoss®micas, embora nfo sejam restritos a este grupo. A menos que exista um diegnéstico ndo-cromoss6mico defini- tivo, aandlise cromossOmics deve ser feitapara pacientes que apresentam uma combinagao de tas problemas, 2, Natimorto e morte neonatal. incidéncia de anomaliascro- mossSmicas é muito maior entre os natimortos (até aproxi- madamente 10%) que entre os nativivos (cerca de 0,7%). E também elevada entre criangas que morrem no perfodo neo natal (cerca de 10%). A andlise cromoss6mica deve ser feita tn todos os natimortose morte neonatais que possam ter uma base citogenética para identificar uma causa possivel espec- fica ou, altemativamente, para excluir anomalias cromoss8- ‘micas como motivo da perdz. Em tais casos, acariotipagem é essencial para uma consulta genética apurada e pode dar in- formagées importantes para 0 diagndstico pré-natal de furu- ras gestagies, 3. Problemas de fertilidade Os estudos cromossémicos fo, indicados para mulheres que apresentam amenorréia e para casais com ums histéria de infertilidade ou abortos recarren- tes, Uma anomalia cromossémica € vista em um oa outro genitor em uma proporcao significativa (de 3% a 6%) dos casos nos quais hi infertlidade ou dois ov mais abortos. 4, Histéria familiar: Uma anomalia cromossémica suspeita ou conhecida em um parente em primeiro grau é uma indicago para a andlise cromossOmica em algumas circunstincias 4. Neoplasia Absolutamente todos os cfnceres estio associa- dos a uma ou mais anomalias eromossémicas (ver Cap. 16) ‘A avaliagio cromossémica na amostra apropriada de tecido (© proprio tumor ou a medula 6ssea no caso de malignidades hematolégicas) pode nos dar um diagndstico dtil ov uma in- Formagio prognéstica 6. Gestago em uma mulher com idade avangada. Hé um ‘aumento de risco de enomalia cromoss6mica nos fetos con- cebidos por mulheres com mais de 30 035 anos de idade (ver Cap. 18). A andlise cromossémica fetal deve ser oferecida como uma parte rotineira dos cuidados pré-natais em tais agestagies Embora ideal para a anslise clinica répida, as culturas de células preparadas de sangue periférico tim a desvantagem de ter vida curta (de 3.0 4 dias), Culturas de longo termo podem ser feitas a partir de uma variedade de outros tecidos (ver Cap. 8). A bidpsia de pele, um pequeno procedimento cittirgico, pode fornecer amostras de tecido que em cultura produzem fibroblastos, os quais podem ser usados para uma variedade dc estudos bioquimicos e moleculares, bem como para a and- lise eromossdmica Os leucécitos também podem ser trans- formados em cultura para formar linhagens celulares linfo- blastéides que sfo potencialmente imoriais A medula éssea pode ser obtida apenas por procedimentos relativamente in- vasivos de bidpsia de medula dssea, mas tem a vantagem de conter uma alta proporgdo de células em divisio, de modo que quase no é necesséria uma cultura. Seu principal uso é no diagndstico de malignidades hematoldgicas suspeitas. Sua desvantagem é que as preparagGes cromossomicas obtidas da medula sao relativamente pobres, com cromossomos pouco resolvidos que sio mais dificeis de analisar que os do sangue periférico. As eélulas fetais derivadas do liquide amnidtico (amnidcitos) ou obtidas por bi6psia das vilosidades coriéni- cas também podem ser cultivadas de forma bem-sucedida para a andlise citogenética, bioqu{mica ou molecular. As células das vilosidades coridnicas também podem ser analisadas di retamente, sem a necessidade de cultura (ver Cap. 18 para maior discussao) Identificagdo Cromossémica (0s 24 tipos de cromossomos humanos podem ser prontamente identificados por varios procedimentos especificos de colora- ‘edo, Existem trés métodos de coloragzo comumente usados que podem ser distintos entre os cromossomos humanos, No Cap. 2, examinamos os cromossomos corados por bandeamento Gi- ‘emsa (bandeamento G), 0 método usado com mais freqlén- cia em laboratérios clinicos. Outros procedimentos usados em alguns laboratérios ou para fins especificos, ou ambos, inclu- em os seguintes: Bandeamento Q. Este métado requer acoloragao com qui- nacrina mustarda ou compostos cortelatos ¢ 0 exame por mi- croscopia de fluorescéncia. Os eromossomos coram-se em um padrio especifico de bandas claras ¢ escuras (bandas Q), sen- do que as bandas Q claras correspondem quase exatamente as ‘bandas G escuras O bandeamento Q, bem comoo bandeamento C (ver segto seguinte), 6 particularmente til para detectarv ‘antes ocasionais na morfologia cromossémica ou coloragao, FUNDAMENIOS DE CITOGENEHICA CLINICA 1119 cchamadas de heteromortfismos. Estas variantes em geral sto benignas e refletem diferengas na quantidade ou no tipo de se- ‘qUéncias de DNA satélite em um local especifico ao longo do ‘cromossomo Bandeamento R. Se os cromossomos receberem um trata- mento especial (tal como aquecimento) antes da coloragio, as bandas escuras e claras (bandas R) resultantes setfo ¢ reverso das produzidas pelo bandeamento G ou Q.Especialmerte quan- do se examinam regiées que se coram pouco pelo bandeamento GouQ, obandeamento R fornece um padrio que émais fécil de analisar que aquele fornecido pelo bandeamento G ou Q Este ‘© método padrio em alguns laborat6rios, particularmente na Europa ‘Um sistema uniforme de classificagdo cromossémica é inter- nacionalmenteaceito para a identificagao de cromossomos hu- ‘manos corados por qualquer um dos trés procedimentes de co- loragio mencionados, A Fig. 9.1 € um ideograma do padito de bandeamento de um conjunto de cromossomos humanos normais ‘na metéfase,ilustrando 2 altemnancia de padres de bandas escu- ras e claras usadas para a identificagao dos cromossomos. O paulo de bandas de cada cromossomo é numerado em cada brago do centrémero ao telémero, como mostrado em detalhe na Fig. 912 para varios eromossomos Usando este sistema de numera- ‘¢40, a localizagao de cade banda em particular, bem como as seqiiéncias de DNA os genes dentro delas ¢ 0 seu envolvimen- to-em uma anomalia cromossémica, pode ser descrita sem am- bigtidade e com preciséo. ‘Os cromossomos humanos em geral sio classificados pela posigao do centrmero em tes tipos que podem ser facilmente distintos na metafase (ver Fig 9.1): metacéntricos, com um centrémero mais ou menos no meio € bragos aproximedamente cdo mesmo tamanho; submetacéntricas, com um centrémero fora do meio e bragos com tamanhos claramente diferentes; e acro- c@ntricos, com ocentrémero bem proximo uma das pontas. Um quar tipo potencial,telocéntrico, com o centrémero em uma extremidade e um tnico brago, nao ocorre no caristipe humano normal, masé ocasionalmente observade em rearranjos eromos- sémicos ¢ € um tipo comum em outras espécies. Os cromosso- mos acrocéntricos humanos (cromossomas 13, 14, 15, 21 € 22) tm massas pequenas e distintas de cromatina, conhecidas como satélite, igadas a seus bracos curtos por pediculos finos (cons- rigs secundrias). Os pedicutos destes cinco pares de cromas- soos contém centenas de cépins de genes codificantes de RNA. ribossémico. Procepimanros ESPECIAS ara situagies particulares, varias técnicas especializadas podem ser usadas: Bandeamento C. Este método envolve especificamente coloragio da regio centromérica de cada cromossomo e outras regi6es que contém a heterocromatina constitutiva: partes dos cromossomos 1g, 9q € 16q adjacentes 2o centrémero ¢ a parte distal de Yq. A heterocromatina é o tipo de cromatina definida por sua propriedade de permanecer em estado condensado e de se corar fortemente nas células que nao se divider (interfésicas) Bandeamento de Alta Resolucdo (também chamado de bandeamento pré-metafésico) Este tipo de bandeamento € realizado pelas tSenicas de bandeamento G ou R para corar os 120. * FUNDAMENTOS DE CITOGENETICA CLI 3 = 2 P 4a ” 163 baie | aa Sf ae em te ee a sa To zl ee Eo ‘s q a ofl 7H en] 21 fm 2h 26.3 oe * 3B het chy 2 am 4 13, 14 Vy P 2 2 2 3 te = ees igh 3 eh ssh 12 Tf 2B te oa ei wg eRe TB em L 4 aby 3 2” n 2 n = a 4 a a 2a 35 nal 12 102 naa a 2s a Fig. 9.1 Ideograme mostrando o padtéo de bandeamento G para cromossomos humanos na metdfase, com cerca de 400 bandes por ariétipo hapi6ide Como deserhedo. os cromossomos s80 tipicamente representados com as crométides inmas to juntas que elas ‘do so reconhecides como estruturas distintas Os centrémeros sao indicados pelas regides ern cinza-escuro separando os bragos pe Q Por uma questio de conveniéncia e clareza, apenas as bandas G-positivas so numeradas Para exemplos de um esquema totalmente ‘numerado, vera Fig 92 (Redesenhado de ISCN. 1995 } ‘eromossomos que foram obtidos em um estégio inicial da mito- se (pr6fase ou pré-metéfase), quando ainda esido em um estado relativamente descondensado (ver Cap. 2). O bandeamento de alta resolugio é especialmente itil quando se suspeita de uma equena anomalia estrutural de um cromossomo. Alguns labo- rat6cios, enttetanto, usam 0 bandeamento pré-metafisico de ‘modo rotineiro, como mostram as Figs.23 ¢ 2.4. Os cromosso- ‘mos pré-metafésicos revelamn de 550 a 850 bandas ou ainda mais em um conjunto hepléide, enquento as preparecées metafésicas padiéo mostram apenas cerca de 450. Uma comparacto dos pa- Aides de bandeamento do cromossomo X em trés estagios dile- rentes de resolugéo & mostrada na Fig. 93. O aumento na preci- so diagnstics obtida com estes cromossomos mais longos € evidente. Sitios Frageis. Os sitios fr4geis sto espagos ocasionalmente ‘observados em pontos caracteriticos de vétios cromossomos Para demonstrar os sitios frégeis, em geral & necesstio expor 2s células acondigdes de crescimento ou substineias quimicas ue alteram ou inibem a sintese de DNA. Muitos sitios frageis sto conhecidos como variantes herdaveis. O sitio fidgil mos- twado de modo mais claro como sendo clinicamente significa- tivo é visto perto da ponta de Xq tanto em homens com uma forma especffica ecomum de retarto mental ligado a0 X quanto em algumas mulheres portadoras do mesmo defeito genético (ver discussio sobre a sindrome do X frégil, Cap. 12). Em Conjunto com os testes molecilares para detectar @ expansio da repetigio CGG no gene FMRI caracteristico deste distir- bio, a detecgao do sitio frégil no cromossomo X é um procedi: mento diagnéstico especifico para a s{ndrome do X frégil (ver 12.28) Hibridizagao In Situ com Fluorescéncia Como introduzido no Cap. 4, 0 desenvolvimento das técnicas de hibridizagao in siru com fluoresc8ncia (FISH) para exami- nara presenga ou a auséncia de uma determinada seqineia de DNA ou para avaliar 0 nimero ou a organizagio de um cra- Fig. 95 A, Detecco de telémeros nas pontas de cada cromossomo por hi- bridizacdo in sit com fluorescéncia (FISH) usando uma sonda repetida ‘TIAGGG As duas cromatides irmas so evidentes pela sinal amarelo de dupla hibridizagao na ponte da maloria dos bragos cromossOmicos (Cortesia de Stuart Schwartz, Case Western Reserve University and University Hospitals of Cleveland) Fig. 9.5 B Carictipagem especteal (SK) Vinte e quatro sondas de colora 80 cromassémica Individual so marcadas com corantes fluorescentes diferentes e usadas como uma coloragao genémica total Os sinais fluores centes so analisados por um software sofisticado de imagem e armazena- dos em um computador Para gerar a fotografia, o computador atribui uma cor diferente a cada um dos 24 diferentes especttos fluorescentes geradios pelas sondas individuals de coloragao cromossémica (Figura por cortesia da Ora Amalia Dutra. National Human Genome Research Institute | Nesta rmetélace de uma mulher 46.XX apenas 23 cores estdo presentes; a tinice cor getade pela sonda de coloragao do cromossomo Y ndo é vista Fig. 9.5 C. Andlise cariotipica espectral de cromossomos de uma linhagem celular de meduloblastoma Varias anomalias numéticas € estruturais s£o evidentes e podem ser identificadas pela andlise da imagem das 24 sondas de coloragao cromossémica usadas O tipo mostra tanto @ imagem original (membro 4 esquerda de cada par) quanto a imagem falso-colorida [membro a dre de cada par), no qual cada um dos 24 tipos de cromossomos recebe uma cor diferente para ajudar a identificacéo visual {Cortesia de Amalia Dutra. National Human Genome Research Institute } Fig. 9.5 D. Fluorescéncia tricolor de hibridizacdo in situ para anlise de espermateacides humanos usando sondas repetitivas para o Gromossomo 18 (amarel}, o cromassamo ¥ (verle)€ 0 ctamossomo X (urmrlio} Os dois espermatozdides haploides 8 esquerda S80 mo- hossémicos para estes cromossomos (um espermatozside 23 X e um 23 ¥) © espermatozéide do painel do meio € dissémico para o 40%) indica a importincia dos estudos de cromossomos fa- miliares para identificar portadores e oferecer consulta gené- tica e diagndstico pré-natal ‘Outra inversio pericéntrica associada a uma grave sindrome se duplicagtio/deficiéncia na prole recombinante envolve 0 cro- rmossomo 8, inv(8\(p23 1922 1), ¢ é encontrada principalmente entre os hispanicos do sudoeste dos EUA Estudos empiticos ‘mostraram que os portadores da inv(8) tém uma chance de 6% de ter um filho com a sindrome 8 recombinante, um distirbio letal com graves anomalias catdiacas e retardo mental. O cro- ‘mossomo recombinante é duplicado para seqiiéncias distais a 8q22.1 e deletado para sequéncias distais a 8523.1 ‘A inverséo mais comum vista em cromossomos humanos € ‘uma pequena inverstio pericéntrica do cromossomo 9, que esté A Paracéntrica A A 8 © ce ° ° FUNDAMENTOS DE CITOGENENICACLINICA 1 129 a A A o 8 ce e 5 c 8 c c D o A 0 A A A D 8 ‘ 8 st c af} © c D D A . Fig, 9.10 Crossing over dentro das algas de inversto formadas na melose | em portadores de um cromossomo corn o segmento B-C invertido (ordem A-C-B-D), a0 invés de A-B-C-D A, Inversio paracéntrica Os gametas formados apés a segunda meiose em geral con- {@m ou a cépia normal (A-B-C-D} ov uma copia balanceada (A-C-B-D) do ctomossoino. pois os produtos acéatricos e dicéntricos do crossing s30 invidveis B, Inversdo pericénirica Os gametas formados aps a segunda melose podem ser normals, balanceados ou t0- balanceadas Os gametas néo-bslanceados contém uma cSpia do cromossomo com uma duplicagdo ou uma deficiéncia do material flanqueando o segmenta invertido [A-B-C-A ou D-B-C-D} presente em até 1% de todos os individuos testados por labora {érios de citogenética, A inv(9(p11q12) no tem efeitos deleté- ios conhecidos nas portadores e nfo parece estar associada a um risco significativo de abortos ou prole desbalanceada Portanto, considera-se que seja urna variante normal. Translocagdes {As translocagdes envolvem a troca de segmentos cromossOmi- cos entre dois eromossomos, geralmente nflo-homélogos. Exis- tem tés tipos principeis: reciprocas, robertsonianas e insergoes. ‘ Translocagées Reciprocas. Este tipo de reatranjo resulta dda quebra de eromossomos ndo-homdlogos, com troca recipro~ ca dos sogmentos quebrados. Em geral apenas dois eromosso- mos esto envolvidos e, como a troca € reciproca, o mimero to- tal de cromossomos fica inalterado (Fig. 9.12A). (Translocagbes complexas, envolvendo tes Ou mais cromossomos, S20 tares.) As translocagdes reciproces so relativamente comuns e s8o encontradas em cerca de 1 em 600 neonatos, Tais translocagdes em geral nao so prejudiciais, embora sejam mais comuns em pessoas institucfonalizadas com retardo mental do que na popu- Iago em geral, Assim como outros rearranjos estruturais balan- ceados, elas estio associadas a um alto risco de gametas no- balanceados e prole anormal Flas chamam 2 atengio seja du rante o diagnéstico pré-natal seja quando os pais de uma erianca anormal com uma translocagio desbalanceada so cariotipados E mais comum encontrar translocagées balanceadas em casais Fig. 9.11 Uma crianga com um catiétipo anormal, filha de um porta- dor de ume inversao pericéntrica Yer o texto para discussao. (De Allderdice P'W Browne N. Murphy 0 P [1975] Chromosome 3 du- plication q2I-ter deletion p25-pter syndrome in children of carters (ofapericentric inversion inv(3}p25q21) Am | Hum Genet27:699-718 } 130. + FUNDAMENTOS DE CITOGENETICA CLINICA 3 Pareamento CEB? GREED Dasbaarente Dasoinwants No Adjacente-1 Alternada Adjacente-2 Fig. 9.12 A. Diagrama de uma transiocacio balanceada entre 0 cromassomo 3 ¢ o cromossome 1!.t(3:11){ql2pi5 5) B. Formagéo que: Urivalente na melose e segregas#o 2:2 em um portador de t(:11). levando a gametas balanceados ou nio-balanceados Ver texto para discusszo Que jd tiveram dois ou mais abortos esponténeos e em homens inférteis do que ne populagtio em geral Quando os cromossomos de um portador de uma transloca- fo recfproca balaneeada formam pares na meiose, observa-se uma figura quadrivalente (em forma de cruz), como mostra a Fig. 9 12B. Na anafase, os cromossomos em geral se segregam desta configuragio em um dente trés modos, descritos como. segregacio alternada, adjacente-1 e adjacente-2. A segrega- fo altemadk, o tipo usual de segregacio meiética, produz metas que tent um complemento cromossémico normal cu os dois eromossomos reciprocos. Ambos os tipos de gametas sio balan- ‘ceados, Na segregagio adjacenie-1, os centrOmeras homélégos vio para células filhas separades, enquanto na segregecéo adja- cente-2 (que € rara), os centrémeros homdlogos passam para a mesma célula filha. Tanto a segregacao adjacente-1 quanto ¢ adjacente-2 produzem gametes desbalanceados (ver Fig 9.12B). ‘Além dos exemplos mencionados de segregagio 2:2 (dois exomossomos para cada pélo), os cromossomos com transloca- glo balanceada também podem se segregar 3:1, levando a dois gametas com 22 ou 24 cromossomos, Embora a monossomiaem, Um feto resultante seja rare, pode resultar uma trissomia. Tal segregacio 3:1 € observada em 5% a.20% dos espermatozdides, de portadores de translocagao balanceada, dependendo da trans- locagio especifica ‘Translocacées Robertsonianas. Este tipo de rearranjo envolve dois cromossomos actocéntrices que se fundem perto

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