UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

NCLEO DE PS-GRADUAO EM FSICA

DISSERTAO DE MESTRADO

Produo de Hidroxiapatita Pura e Dopada para Aplicao em Biosensores

TATIANA SANTOS DE ARAUJO

Universidade Federal de Sergipe Cidade Universitria Prof. Jos Alosio de Campos So Cristvo Sergipe Brasil

Produo de Hidroxiapatita Pura e Dopada para Aplicao em Biosensores

TATIANA SANTOS DE ARAUJO

Dissertao de Mestrado apresentada como requisito parcial obteno do grau de mestre, pelo curso de Ps-Graduao em Fsica rea Fsica da Matria Condensada, do Departamento de Fsica da Universidade Federal de Sergipe.

Orientador: Prof. Dr. Mrio Ernesto Giroldo Valerio

So Cristvo 2006

Dedico esse trabalho principalmente a Deus.

Dedico tambm a minha me Rosngela e as minhas irms: Michely, Natlia Keli e Edjane.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador e mestre, Dr. Prof. Mrio Ernesto G. Valrio, pelo incentivo, dedicao e acompanhamento competente desde a minha iniciao cientfica. A todos os professores do DFI UFS que de alguma forma fizeram parte desse trabalho, acompanhando o meu desenvolvimento e aguando minha curiosidade. Ao professor Dr. Petrus dAmorim e ao tcnico Francisco Rangel por tornarem possvel a interao UFS UFPE. Ao DQI UFS por ter possibilitado a realizao das medidas de anlise trmica e absoro molecular. A amiga Patrcia pelo carinho e amizade com que sempre me recebeu durante os trabalhos na UFPE. Aos tcnicos e secretrias do DFI UFS pela cooperao. Aos amigos Paula, Rodrigo, Elaine e Alane pela convivncia e amizade. A Alysson por sempre ter acreditado em mim. Aos meus amigos Francisco, Jomar e Jlio por terem torcido por mim e me incentivado. A Jos Leite (in memria) por ter sido um pai durante toda a minha jornada. A minha me Rosngela e irms Michely, Natlia Keli e Edjane, pelo amor e apoio manifestado em todos os momentos. A Deus e a Virgem Maria por me guiarem com amor e pacincia, dando-me fora para vencer os obstculos.

A inteligncia humana s tem sentido quando somada sabedoria de Deus.

Tatiana Santos de Araujo

Porque o Senhor d a sabedoria, e da sua boca vem inteligncia e o entendimento.

Provrbios 2:6

SUMRIO
Resumo ......................................................................................................................IX Abstract ......................................................................................................................X Lista de figuras .........................................................................................................XI Lista de tabelas ....................................................................................................... XV

Captulo I Introduo............................................................................................... 1 1.1 Apresentao e objetivos ............................................................................... 2

Captulo II A Hidroxiapatita e o Cromo III ............................................................. 5 2.1 Fosfatos de clcio em sistemas biolgicos .................................................. 6 2.2 Estrutura da hidroxiapatita ............................................................................ 7 2.3 Deposio nos tecidos humanos ................................................................ 12 2.4 Fatores que interferem na produo de hidroxiapatita ............................... 14 2.5 Caractersticas, toxidade e toxicocintica do cromo (III) ............................. 17 2.6 Espectroscopia de materiais dopados com cromo (III) ............................... 18 2.6.1 Teoria do Campo Cristalino ............................................................. 19 2.6.2 Parmetros de Racah ..................................................................... 21 2.7 Influncia do cromo (III) na estrutura, morfologia e estabilidade trmica da hidroxiapatita ................................................................................................ 24

Captulo III Mtodos Experimentais ..................................................................... 27 3.1 Sntese de HAP .......................................................................................... 28 3.2 Caracterizao dos materiais ..................................................................... 29 3.2.1 Difrao de raios-X ............................................................................ 30 3.2.2 Microscopia eletrnica de varredura e espectrometria de energia dispersiva de raios-X .................................................................................... 32 3.2.3 Anlise trmica ................................................................................. 33 3.2.4 Espectroscopia de absoro ptica no ultravioleta/visvel................. 34 3.2.5 Espectroscopia de fluorescncia molecular....................................... 37

Captulo IV Resultados e Discusso ................................................................... 40 4.1 Estudo dos fatores que dirigem a precipitao da HAP .............................. 41 4.2 Difrao de raios-X ..................................................................................... 41

4.3 Morfologia do material e determinao da composio de Ca e P ....................................................................................................................... 48 4.4 Estabilidade trmica da HAP ...................................................................... 55 4.5 Absoro ptica da HAP dopada com Cr3+ ................................................ 59 4.6 Fluorescncia da HAP dopada com Cr3+ .................................................... 68

Captulo V Concluses ......................................................................................... 72 5.1 Concluses ................................................................................................ 73 5.2 Sugestes para futuros trabalhos ............................................................... 75

Referncias Bibliogrficas ..................................................................................... 77

Anexos....................................................................................................................... 86

IX

RESUMO
A hidroxiapatita (HAP), Ca10(PO4)6(OH)2 tem sido amplamente investigada para substituio ssea devido sua semelhana qumica com a fase mineral dos ossos e dentes. Em implantes sseos a HAP estimula o crescimento de tecido sseo sem complicaes, apresentando ausncia de toxidade e ausncia de respostas inflamatrias ao tecido hospedeiro. Este trabalho teve como alvo a produo de nanocristais de Ca10(PO4)6(OH)2 e Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 usando o mtodo de precipitao qumica. O Cr3+ foi incorporado como dopante no material para o desenvolvimento de um biosensor baseado nas propriedades fluorescentes do on de Cr3+. O dopante foi escolhido devido a sua baixa toxidade e ao seu carter fluorescente. Resultados de difrao de raios-X revelaram a formao da HAP e permitiram conhecer o tamanho dos nanocristais. As imagens de microscopia eletrnica de varredura mostraram que o p formado principalmente de aglomerados heterogneos de tamanho micromtrico. As anlises por energia dispersiva de raios-X forneceram a razo das concentraes Ca e P. A mdia dos valores da relao Ca/P foi de 1,94 para as amostras puras e de 2,02 para as amostras dopadas. Resultados de anlise trmica somados aos estudos de difrao de raios-X mostraram a influncia da temperatura sob a cristalinidade e a decomposio da hidroxiapatita em temperaturas acima de 750C. Acima desta temperatura h formao de HAP/CaO para as amostras puras e HAP/TCP para as amostras dopadas. As propriedades fluorescentes de Cr3+ foram avaliadas pela espectroscopia de absoro ptica e espectroscopia de fluorescncia. A resposta luminescente do material provou a incorporao do on em seu estado trivalente na matriz da hidroxiapatita. As transies tpicas do Cr3+ foram identificadas e discutidas. Com base nos espectros, o parmetro de campo cristalino Dq e os parmetros de Racah, B e C foram avaliados. Os resultados apontam a um uso potencial da hidroxiapatita dopada com Cr3+ como uma sonda fluorescente em potencial para a aplicao in vivo.

ABSTRACT
Hydroxyapatite (HAP), Ca10(PO4)6(OH)2 has been widely investigated aiming the bone implants due to its chemical similarity with the mineral phase of the bones and teeth. In bone implants HAP stimulates bone growth without undesirable side effects, it has no toxicity and no inflammatory answers was detected in the host tissue. In this work nano-sized powders of Ca10(PO4)6(OH)2 and Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 was produced using the chemical precipitation method. Cr3+ was incorporated as dopant in the material aiming the development of a biosensor based on the fluorescent properties of the Cr3+ ion. The dopant was chosen due to its low toxicity and well known emission and excitation spectra. Powder X-ray diffraction measurements revealed that only the XRD pattern of HAP was obtained and from the width of the XRD peaks, it was possible to obtain the size of the nano-crystals. Scanning electron microscopy shows that the powers are mainly formed by heterogeneous micrometer-sized agglomerate of the nanoparticles. Energy dispersive x-ray analysis was used to determine the Ca and P concentrations. The average values for the Ca/P ratio is 1,94 for the pure samples and 2,02 for the doped samples. Results of thermal analysis combined to of x-ray diffraction showed the influence of the temperature in the crystallinity and revealed that the decomposition of the hydroxyapatite started in temperatures above of 750C. Above of this temperature the formation of HAP and CaO was observed, for the pure samples, while, for the doped ones, and HAP and TCP were formed. The optical properties of Cr3+ were evaluated by the optical absorption spectroscopy and fluorescence spectroscopy. The absorption and the emission spectra showed that the Cr ions were incorporated in the hydroxyapatite matrix in its trivalent state. Typical transitions of the Cr3+ were identified. The crystal field parameter, Dq, and the Racah parameters, B and C were evaluated. The results point to a potential use of the Cr3+-doped HAP as a fluorescent probe for in vivo application.

XI

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 2.1 Clula unitria da hidroxiapatita ............................................................ 9

FIGURA 2.2 Estrutura da hidroxiapatita ao longo do eixo c ..................................... 9

FIGURA 2.3 Esfera de coordenao do CaI ............................................................ 10 FIGURA 2.4 Esfera de coordenao do CaII-O ...................................................... 10 FIGURA 2.5 Esfera de coordenao P-O ............................................................... 11

FIGURA 2.6 Esquema de deposio da hidroxiapatita nos tecidos humanos......... 13

FIGURA 2.7 Distribuio de densidade eletrnica nos cinco orbitais d .................. 20

FIGURA 2.8 Desdobramento dos orbitais d do tomo central em uma simetria octadrica ..................................................................................................... 20

FIGURA 2.9 Distribuio dos ligantes e conjunto de orbitais d do tomo central numa simetria octadrica................................................................................ 21 FIGURA 2.10 Diagrama de Tanabe-Sugano para um on 3d3 ................................ 23

FIGURA 2.11 XRD de hidroxiapatita pura e dopada com diferentes concentraes de Cr3+.................................................................................................................................................. 24 FIGURA 2.12 TEM de amostras de HAP pura e dopada com Cr3+ ........................ 25

FIGURA 2.13 Curvas de TG dos materiais com diferentes XCr ............................... 26 FIGURA 3.1 Aparelhagem utilizada na reao de precipitao da HAP ................. 29

XII FIGURA 3.2 Tcnicas utilizadas para a caracterizao das amostras de HAP pura e dopada ................................................................................................... 30 FIGURA 3.3 Espectros de absoro dos ons de Cr3+ e Cr2+ em complexos .......... 36

FIGURA 3.4 Diagrama da fluorescncia de uma espcie ao absorver um fton ........................................................................................................................... 38

FIGURA 4.1 Difratogramas de raios-X de amostra de HAP sinttica com tempo de maturao de 150 h e do osso humano em comparao com o padro de referncia da HAP (PDF#09-0432)............................................................ 42

FIGURA 4.2 Difratogramas de raios-X de Ca10(PO4)6(OH)2 em diferentes tempos de maturao em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432)................................................................................ 43

FIGURA 4.3 Difratogramas de raios-X de Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 em diferentes tempos de maturao em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432).......................................................... 44

FIGURA

4.4

Difratogramas

de

raios-X

da

Ca10(PO4)6(OH)2

Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 com tempo de maturao de 100 h em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432) ........................... 45

FIGURA 4.5 Difratogramas de raios-X de Ca10(PO4)6(OH)2 tratada em estufa a 100 C, calcinada a 500 C e 800 C em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432) e do CaO (PDF#48-1467) ........... 47

FIGURA 4.6 Difratogramas de raios-X de Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 tratada em estufa a 100 C, calcinada a 500 C e 800 C em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432) e do TCP (PDF#32-0176) ........... 47

FIGURA 4.7 (a) MEV da HAP sinttica calcinada a 500 C (b) MEV do osso humano ...................................................................................................................... 49

XIII FIGURA 4.8 MEV da Ca10(PO4)6(OH)2 no tempo de maturao de 100 h com diferentes aumentos ........................................................................................... 50

FIGURA 4.9 MEV da Ca10(PO4)6(OH)2 nos diferentes tempos de maturao (a) 50 h, (b) 100 h, (c) 150 h....................................................................................... 51

FIGURA 4.10 Micrografia com tamanho estimado de nanopartculas da HAP entre 40-100 nm................................................................................................. 52

FIGURA 4.11 Micrografias da HAP em tempo de maturao de 100 h (a) Pura (b) Dopada com Cr3+
...............................................................................................................................

52

FIGURA 4.12 Curvas de DTA, TG e DTG da Ca10(PO4)6(OH)2 calcinada a 500 C......................................................................................................................... 56

FIGURA 4.13 Curvas de DTA, TG e DTG da Ca10(PO4)6(OH)2 tratada em estufa a 100 C .......................................................................................................... 57

FIGURA 4.14 Curvas de DTA, TG e DTG da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 calcinada a 500 C ..................................................................................................... 58

FIGURA 4.15 Curvas de DTA, TG e DTG da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 tratada em estufa a 100 C .................................................................................................... 59

FIGURA 4.16 Espectros de absoro ptica da Ca10(PO4)6(OH)2 e Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 feitas com uma suspenso dos nanops em gua ultrapura ............................................................................................................................ 61

FIGURA 4.17 Espectro de absoro ptica da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 em funo da Ca10(PO4)6(OH)2 ...................................................................................................................................... 62 FIGURA 4.18 Espectro de absoro ptica da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 em funo da energia do fton. As linhas tracejadas indicam as bandas que compe o espectro formado pela linha contnua em vermelho .................................. 63

XIV FIGURA 4.19 Diagramas de Tanabe-Sugano para o CrI(a) e CrII (b) obtidos a partir dos dados da tabela 4.7. As linhas cheias verticais indicam a posio de cada um dos tipos de Cr3+ de acordo com a razo /B ......................................... 67

FIGURA 4.20 Espectro de emisso-excitao da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 na regio espectral de emisso da transio 4T2(F) 4A2 ............................................ 69

FIGURA 4.21 Curvas de nvel do espectro de emisso-excitao da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2

4

na

regio

espectral

de

emisso

da

transio

T2(F) 4A2 ......................................................................................................................................................................... 69

FIGURA

4.22

Espectro

de

emisso

da

Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2

correspondente a transio 4T1(F) 4A2 ...................................................................................................... 70

XV

LISTA DE TABELAS

TABELA 2.1 Ocorrncias de fosfatos de clcio em sistemas biolgicos e suas relaes Ca/P ...................................................................................................... 6 TABELA 2.2 Desdobramento dos nveis de energia dos estados d3 em coordenao octadrica em funo dos parmetros de Racah e do parmetro de campo cristalino..................................................................................................... 24

TABELA 4.1 Tamanho mdio do cristalito de Ca10(PO4)6(OH)2 e Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 .................................................................................................. 46 TABELA 4.2 Tamanho mdio dos cristalitos de Ca10(PO4)6(OH)2 e Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 produzida em diferentes temperaturas de calcinao.............. 48 TABELA 4.3 Composio de Ca e P em termos de tomos % na Ca10(PO4)6(OH)2 ........................................................................................................ 53 TABELA 4.4 Composio de Ca, P e Cr em termos de tomos % na Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 ................................................................................................. 53 TABELA 4.5 Razo molar Ca/P e (Ca+Cr)/P ......................................................... 54

TABELA 4.6 Resultados obtidos para os parmetros ajustados com perfil Gaussiano referente s bandas de absoro ptica mostradas na figura 4.17 ......... 63

TABELA 4.7 Valores dos parmetros do campo cristalino e da primeira e segunda transies permitidas por spin para ambos os stios do Cr3+ na HAP .......... 65

TABELA 4.8 Posio em comprimento de onda das transies permitidas e proibidas por spin para os dois stios possveis de Cr3+ na HAP, comparadas com os valores obtidos dos espectros de AO da amostra dopada............................. 66

CAPTULO I

INTRODUO
Neste captulo abordada a importncia dos biomateriais, bem como o seu avano no Brasil e no mundo. So apontadas as potenciais aplicaes dos biosensores e a possibilidade do uso de hidroxiapatita com esta funo, de modo que estas inovaes possam elucidar os mecanismos que regem a interao dinmica entre as substncias presentes na interface tecido vivo/implante. Os objetivos gerais e especficos do trabalho so descritos e de forma sucinta mostrado em que se baseia a escolha do Cr3+ como dopante.

2 CAPTULO I - INTRODUO

1.1 Apresentao e objetivos

A conscincia sobre os problemas de estrutura ssea, decorrentes de processos inflamatrios, acidentes ou osteoporose, vem crescendo nos ltimos anos e com ela a preocupao dos pesquisadores em procurar materiais que possam substituir de forma apropriada os ossos danificados. Para tal, utilizam-se matriasprimas de elevada pureza qumica e que no produzam reaes txicas quando colocadas em contato com tecidos vivos. Os materiais utilizados na substituio de ossos enquadram-se em uma classe denominada de biomateriais e devem apresentar propriedades fsicas e biolgicas compatveis com os tecidos vivos hospedeiros, de modo a estimular uma resposta adequada dos mesmos. Tais propriedades caracterizam a biocompatibilidade[1]. Os materiais sintticos utilizados para estes fins podem ser metais, polmeros, compsitos, cermicas e vidros. Diversos tipos de biomateriais, especialmente as biocermicas de fosfato de clcio (destaque para a hidroxiapatita), continuam sendo pesquisados e cada vez mais so utilizadas para a remodelao e reconstruo de defeitos sseos. A importncia dos biomateriais no mundo pode ser estimada atravs dos nmeros apresentados pelos Estados Unidos, um dos pases lderes nesta rea. Estima-se que em 1996, 11 milhes de americanos portaram algum tipo de implante mdico[2]. At a dcada de 90 o uso de hidroxiapatita no Brasil era bem reduzido, pois seu custo de importao muito alto. Um grama importado saa em torno de 200 dlares. Em 1991 a professora Jane Alves e seus colaboradores da UFMG resolveram desenvolver um novo processo de sntese. Com os resultados animadores conseguidos na pesquisa do novo produto, viram ali uma boa oportunidade de negcio. Atualmente o pas j conta com vrios grupos de pesquisa nessa rea em Universidades e Institutos. E, com isso, vem se dotando de tecnologia prpria, bem como de pessoal capacitado para a produo e pesquisa de biocermicas[3].

3 Estudos indicam que as propriedades da hidroxiapatita e a reatividade de sua superfcie so fortemente dependentes das condies de sntese empregadas, o que determina sua estequiometria, estrutura cristalina e seu comportamento biolgico. Um dos fatores que determina o sucesso de um implante a estabilidade da interface tecido vivo/implante por um longo perodo de tempo[4]. Contudo, os mecanismos que regem a interao dinmica entre as substncias presentes nessa interface ainda representam um campo obscuro que necessita ser desvendado, para que a vida til dos biomateriais possa ser prolongada. Assim, a utilidade da hidroxiapatita somada sua efetividade e simplicidade, torna necessrio desenvolver maneiras de monitorar o seu comportamento no sistema biolgico. O exemplo mais conhecido e mais bem sucedido de se medir de modo seletivo uma determinada substncia no corpo humano o uso de biosensores. Dentro do nosso conhecimento no h relatos de trabalhos envolvendo as aplicaes de hidroxiapatita dopada como um biosensor. Mas a investigao sobre dispositivos iniciou-se a cerca de cinco anos atrs, e atualmente encontra-se em plena etapa de expanso comercial, com investimentos milionrios no setor. As potenciais aplicaes desta nova tecnologia nas reas de sade, de alimentos e no controle do meio ambiente so excepcionais[5,6]. O objetivo desse trabalho de mestrado foi avaliar e adaptar uma metodologia para produo de nano-partculas de hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2). As sondas fluorescentes de cromo (III) foram incorporadas como dopantes no material (Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2) para aplicaes mdicas visando um possvel biosensor. O cromo um mineral essencial presente em concentraes aproximadamente constantes nos tecidos sadios dos animais (pequenas variaes entre espcies). Atualmente sabe-se que o cromo no estado de oxidao 3+ tem baixa toxicidade, desde que se exera um controle sob as quantidades utilizadas[7]. Alm disso, este on tem carter fluorescente, o que constitui um fator muito importante para as aplicaes de um biosensor. A fluorescncia do Cr3+ est sujeita a efeitos do campo cristalino no qual ele est inserido. Por esta razo, identificar as transies eletrnicas deste on na matriz de hidroxiapatita constitui um trabalho inovador e importante no uso deste biomaterial. A partir das diversas abordagens e empregando uma srie de tcnicas, este trabalho tambm buscou fornecer informaes sobre questes mais especficas. Desta forma os objetivos especficos deste trabalho foram:

4 Produzir e caracterizar estruturalmente amostras puras e dopadas para assegurar a formao de hidroxiapatita; Verificar a morfologia e tamanho das partculas; Determinar a relao Ca/P, a fim de conhecer a estequiometria do material; Estudar a estabilidade trmica da hidroxiapatita, identificando as condies timas de temperatura para calcinao das amostras; Correlacionar a influncia da temperatura e tempo de maturao com a cristalinidade e tamanho dos cristalitos; Avaliar a interao entre o Cr3+ e a matriz da hidroxiapatita, atravs das tcnicas de fluorescncia e absoro ptica.

CAPTULO II

A HIDROXIAPATITA E O CROMO (III)

Neste captulo so mostradas as ocorrncias dos fosfatos de clcio no sistema biolgico e suas relaes Ca/P. Fala-se da importncia de hidroxiapatita na medicina, devido a sua composio qumica similar a dos ossos e dentes. descrita a frmula qumica da hidroxiapatita e questes relacionadas ao arranjo dos tomos em sua estrutura so debatidas. So apresentados os esquemas de deposio do material, isto , uma compreenso sobre as etapas que envolvem o implante, desde a sua acomodao nos tecidos humanos at a formao do novo osso. Tendo em vista que o enfoque do trabalho a produo de hidroxiapatita por precipitao qumica em solues de Ca(NO3)2.4H2O e (NH4)2HPO4, alguns fatores que interferem na produo de hidroxiapatita sob estas condies de sntese so esclarecidos, tais como relao Ca/P, temperatura, tempo de reao, tempo de maturao e estabilidade trmica. Para o Cr3+ so abordadas caractersticas, toxidade, toxicocintica, com enfoque principal nos aspectos espectroscpicos e na sua influncia sobre a estrutura, morfologia e estabilidade trmica da hidroxiapatita.

6 CAPTULO II A HIDROXIAPATITA E O CROMO(III)

2.1 Fosfatos de clcio em sistemas biolgicos Em geral, os fosfatos de clcio ocorrem em calcificaes normais e patolgicas, o que tm despertado um interesse significativo no uso destes compostos como materiais de partida para obteno de biomateriais. Costuma-se classificar os diversos fosfatos de clcio pela sua razo molar Ca/P. Desta forma, os fosfatos de clcio que possuem uma razo variando de 0,5 a 2,0 podem ser sintetizados pela precipitao a partir de solues contendo ons clcio e fosfato, sob condies alcalinas ou cidas[8]. A tabela 2.1 relaciona os principais fosfatos de clcio, suas ocorrncias no sistema biolgico e suas relaes Ca/P.

TABELA 2.1- Ocorrncias de fosfatos de clcio em sistemas biolgicos e suas relaes Ca/P [9-10]
Nome do composto Monohidrogeno fosfato de clcio dihidratado (DCPD) Pirofosfato de clcio dihidratado (CPPD) Fosfato de octaclcio (OCP) Fosfato de clcio (TCP) Hidroxiapatita (HAP) Frmula qumica CaHPO4.2H2O Ca2P2O7 . 2H2O Ca8H2(PO4)6.5H2O Ca3(PO4)2 Ca10(PO4)6(OH)2 Ocorrncias clculo dentrio, ossos decompostos depsitos de pseudo-gotas de fluidos clculo dentrio e urinrio clculo dentrio e urinrio, pedras salivares, cries dentrias, calcificao tecidos moles esmalte, dentina, osso, clculo dentrio, pedras, clculo urinrio, calcificao de tecido mole Ca/P 1.0 1.0 1.33 1.5 1.67

A hidroxiapatita (HAP) ocupa posio de destaque entre os biomateriais, por sua larga aplicao no campo da medicina e da odontologia, como um substituto sseo e dentrio em implantes. Sua frmula estequiomtrica Ca10(PO4)6(OH)2, com razo Ca/P igual a 1,67. Entretanto, composies estveis de HAP podem ter esta razo estendida para aproximadamente 1,5. Seu uso para finalidades clnicas se deve primeiramente alta compatibilidade e osteointegrao do material, cuja composio qumica similar dos ossos e dentes. Apresenta ausncia de toxidade local ou sistmica, ausncia de resposta a corpos estranhos ou inflamatria e aparente

7 habilidade em se ligar ao tecido hospedeiro[10]. Estas caractersticas somadas sua alta capacidade de adsorver e/ou absorver molculas, fazem da hidroxiapatita um excelente suporte para a ao prolongada de drogas anticancergenas no tratamento de tumores sseos. A introduo de drogas anticancergenas em blocos de hidroxiapatita porosa permite que o tratamento da doena seja realizado com a liberao gradual da droga no organismo[11-12]. Sob este aspecto essa tcnica atrativa, pois combina o tratamento do tumor com a substituio do osso doente[13]. Estas peculiaridades podem ser explicadas pela natureza qumica deste material, ou seja, por ser formado basicamente por ons clcio e fosfato, os quais participam do equilbrio inico entre o fluido biolgico e a cermica[8]. Pelos resultados obtidos e avaliados desde 1985, quando de seu uso, mesmo em situaes mais crticas como graves pseudo-artroses, fraturas com significantes perdas de substncias, sujeitas a esforos mecnicos, artrodeses, tumores, cistos, osteotomias, fixao de prtese e outras patologias na rea mdica, odontolgica, na presena ou no de processos infecciosos, essa biocermica tem demonstrado ser capaz de propiciar resultados importantes em relao a outras alternativas, mesmo porque, comprovadamente o material incorporado estrutura dos tecidos, mantendo as caractersticas fisiolgicas desejveis[14]. importante salientar que o potencial de aplicao tecnolgica da HAP no se restringe medicina. Na rea de controle ambiental, o material proposto como absorvente de metais pesados em rejeitos industriais e em guas poludas, e como catalisador na decomposio de compostos organo-clorados poluentes, provenientes da indstria metalrgica e da incinerao de lixo industrial[15]. Na catlise industrial, a HAP cermica aparece como uma base slida capaz de catalisar a decomposio de lcoois, assim como a oxidao do metano[16].

2.2 Estrutura da hidroxiapatita Na hidroxiapatita o fsforo forma com o oxignio o grupo fosfato, sendo chamado de grupo hidroxila a ligao entre o oxignio e o hidrognio. Esses grupos, juntamente com o clcio, distribuem-se espacialmente segundo um arranjo em forma hexagonal, pertencente ao grupo espacial P63/m e dimenses de clula unitria a=b=9,42 e c= 6,88 . (FIG 2.1)

8 A clula unitria hexagonal da hidroxiapatita contm 10 ons clcio localizados em 2 stios no equivalentes, quatro no stio I (CaI) e seis no stio II (CaII). Os ons clcio no stio I esto alinhados em colunas, enquanto os ons clcio do stio II esto em tringulos eqilteros perpendiculares direo c da estrutura (FIG 2.2). Os ctions do stio I esto coordenados a 6 tomos de oxignio pertencentes a diferentes tetraedros de PO4 e tambm a 3 outros tomos de oxignio relativamente distantes. Os ons de CaI possuem 6 oxignios a distncia de 2.4 , enquanto que o stio do CaII mais distorcido, possuindo 3 oxignios a distncia de 2.3 , 2 oxignios com distncia de 2.5 e 1 oxignio a 2.2 . As esferas de coordenao dos ons de clcio nos stios I e II so mostrados nas FIG 2.3 e 2.4. A existncia de dois stios de ons clcio traz conseqncias importantes para as hidroxiapatitas que contm impurezas catinicas, pois suas propriedades estruturais podem ser afetadas dependendo do stio ocupado pelo ction da impureza. Os tomos de clcio e fsforo formam um arranjo hexagonal no plano perpendicular ao eixo cristalino de mais alta simetria. Colunas constitudas pelo empilhamento de tringulos eqilteros de ons xidos (O2-) e de ons clcio (Ca2+) esto ligados entre si por ons fosfato. Os tomos de oxignio dos ons hidroxila esto situados a 0.9 abaixo do plano formado pelos tringulos de clcio e a ligao O-H forma um ngulo de aproximadamente 30 com a direo c. Dos quatro tomos de oxignio que constituem os grupos fosfatos, dois esto situados em planos perpendiculares direo c e os outros dois so paralelos a esta direo. Os tetraedros dos grupos PO4 esto arranjados de tal forma que possibilitam a formao de dois tipos de canais perpendiculares ao plano basal. O primeiro canal com dimetro de 2 paralelo aos eixos ternrios e so ocupados por tomos de Ca(I). Em cada clula unitria, encontram-se 2 canais ocupados por ons Ca(I) que esto localizados em z=0 e z= do parmetro cristalino. O segundo canal que tem dimetro de 3,0 a 3,5 , constitudo por ons Ca(II) e esto localizados em z= e z= . No interior desses canais d-se a distino entre a forma hexagonal e a monoclnica. Na estrutura hexagonal o grupo hidroxila ocupa apenas 50% das posies estatisticamente possveis. Deformaes na rede causadas pelo deslocamento das hidroxilas tornam a estrutura monoclnica, um arranjo mais fechado, com grupo espacial P21/b[17-19]. A esfera de coordenao P-O (tetradro distorcido) mostrada na FIG 2.5.

Ca O OH P FIGURA 2.1 Clula unitria da hidroxiapatita[17]

FIGURA 2.2 Estrutura da hidroxiapatita ao longo do eixo c[17]

10

Ca O P H

FIGURA 2.3 Esfera de coordenao do CaI-O [18]

Ca O P H FIGURA 2.4 Esfera de coordenao do CaII-O [18]

11

Ca O P H FIGURA 2.5 Esfera de coordenao P-O [18]

Uma das caractersticas estruturais interessantes da HAP, que ela permite que os grupos hidroxila (OH-) sejam retirados com relativa facilidade, gerando canais vazios entre os hexgonos, formados pelos ons de clcio, por onde podem ser conduzidos, para dentro da estrutura do material cermico, outros ons e molculas. Os ons de clcio podem ser substitudos por uma grande variedade de metais, como chumbo (Pb+2), cdmio (Cd+2), cobre (Cu+2), zinco (Zn+2), estrncio (Sr+2), cobalto (Co+2), ferro (Fe+2)[1]. Essas substituies podem alterar a cristalinidade, os parmetros de rede, as dimenses dos cristais, a textura superficial, a estabilidade e a solubilidade da estrutura da hidroxiapatita[20-22]. A seletividade da HAP por ctions metlicos foi explicada considerando-se o raio inico e a eletronegatividade dos ons. Conforme LEGEROS e LEGEROS[23], ctions com raio inico maior que o do clcio, poderiam ser incorporados na estrutura da apatita mais facilmente dos que os de menor raio inico. Isto resulta em uma expanso dos parmetros de rede a e c e num maior volume da clula unitria. A substituio do clcio (raio inico igual a 0.99 ) por um ction menor, por exemplo, o

12 cromo (raio inico igual a 0.63 ), resulta na contrao dos parmetros a e c e reduo no volume da clula unitria (Vc).

2.3 Deposio nos tecidos humanos O corpo humano adulto tem entre 1 a 2 quilogramas de clcio, dos quais 90% esto localizados no esqueleto e dentes, na forma de hidroxiapatita. Alm da hidroxiapatita, outros fosfatos de clcio tambm esto presentes durante as diferentes etapas do desenvolvimento sseo, como por exemplo, o fosfato octaclcio [Ca8H2(PO4)6.5H2O], a monetita (CaHPO4), a brushita (CaHPO4.2H2O) e fosfato de clcio amorfo, uma substncia com composio mal definida, que provavelmente apresenta uma frmula que se aproxima do fosfato de clcio [Ca3(PO4)2] e pirofosfato de clcio (Ca2P2O7)[24]. A forma estequiomtrica da hidroxiapatita apresenta 39,9% em peso de Ca, 18,5% de P e 3,38% de OH. O mineral de tecidos duros contm no s estes compostos como tambm apresenta traos de CO32-. A hidroxiapatita apresentando stios de fosfato substitudo por carbonatos biologicamente mais reativa que o mesmo composto estequiomtrico. Isto explica a razo pela qual os ossos naturais so constitudos por hidroxiapatita contendo carbonatos ao invs de serem constitudos apenas pelo composto estequiomtrico[25]. Os cristais de HAP depositados nos tecidos humanos so similares a hidroxiapatita do osso. A deposio ocorre em duas etapas: iniciao (ou nucleao) e proliferao (ou crescimento). A nucleao a acomodao de hexgonos de hidroxiapatita na intimidade da molcula de colgeno ou osteonectina. A fase intracelular da nucleao ocorre nas mitocndrias de clulas mortas ou lesadas. A fase extracelular ocorre em estruturas denominadas vesculas da matriz (organelas extracelulares que tm composio e atividade enzimtica distinta das membranas plasmticas que lhes deram origem). Possuem 25 a 250 nm de dimetro e so originadas de clulas degeneradas ou necrticas, na vizinhana da rea de calcificao. Fosfolipdios cidos presentes nessas vesculas, principalmente a fosfatidilserina, agem como captadores e precipitadores de clcio. Alm disso, fosfatases tambm presentes nessas vesculas parecem reprimir os mecanismos inibitrios da precipitao dos sais, representados pelos pirofosfatos e proteoglicanos.

13 A protelise destes aumenta a formao da hidroxiapatita por permitir maior mobilidade de ons, facilitando a saturao dos fluidos extracelulares. A etapa de proliferao do ncleo a progresso autocataltica da deposio dos sais e influenciada por mltiplos fatores extracelulares, tais como: clcio, fsforo e fosfatase alcalina, anlogos da osteocalcina, osteopontina, pH do tecido, vitamina D, balano hormonal, suprimento sangneo, e soluo de continuidade de tecidos moles[26-29] (FIG 2.6).

FIGURA 2.6 - Esquema de deposio da hidroxiapatita nos tecidos humanos[26]

14 2.4 Fatores que interferem na produo de hidroxiapatita O grande nmero de publicaes a respeito da produo e sinterizao da hidroxiapatita relata variaes no comportamento e propriedades do material de acordo com o mtodo utilizado. Os ps-cermicos podem ser obtidos por via seca ou mida. Alguns pesquisadores chamam ateno para o processo por via-seca, apontando como grande vantagem a alta reprodutividade e o baixo custo[30-31]. Outros destacam a viamida pela sua relativa simplicidade e defendem que a tcnica tem baixo custo, alm de permitir a obteno de biomaterial homogneo, reativo e de composio estequiomtrica melhor definida e possibilitando controle nas condies sntese[32-33]. Os processos por via-seca, tais como spray-drying, reao de estado slido resultam em ps-cermicos muito finos e homogneos. Os processos por via-mida envolvem a preparao de uma soluo homognea de sais contendo um dos ons de interesse e a sua mistura com um agente precipitante, geralmente uma soluo contendo o outro on de interesse, de modo a se exceder o produto de solubilidade de algumas espcies qumicas, resultando em um precipitado que separado da soluo por filtrao. Este p pode no ser necessariamente o material desejado, mas um intermedirio que, aps tratamento trmico, ser convertido ao produto esperado[34]. As partculas obtidas encontram-se aglomeradas, devido tenso superficial da gua. Estes aglomerados so considerados os principais responsveis pelos defeitos estruturais e de empacotamento que ocorrem nos materiais cermicos. Alguns mtodos de sntese tm sido desenvolvidos substituindo a gua por outro solvente menos polar, de modo a diminuir a tenso superficial e evitar a aglomerao das partculas[35]. Devem ser considerados dois tipos de hidroxiapatita: as sintetizadas em altas temperaturas e que apresentam boa cristalinidade e cristais grandes, e as hidroxiapatitas sintetizadas em baixas temperaturas que apresentam baixa cristalinidade e cristais pequenos. A hidroxiapatita precipitada por via mida possui caractersticas similares s do tecido sseo e dentrio, diferente da hidroxiapatita sintetizada a altas temperaturas. As complicaes com a maioria dos mtodos convencionais de precipitao devem-se a dificuldade em controlar os fatores que governam a precipitao: relao de

15 de Ca/P dos reagentes, pH, temperatura, tempo de reao e tempo de maturao. Estes fatores podem conduzir a ligeiras diferenas na estequiometria, cristalinidade e morfologia do material. Hidroxiapatita com razo Ca/P equivalente a 1,67, ou seja, com composio estequiomtrica, tem sido a mais estudada para finalidades clnicas, por ser o principal componente presente na fase mineral dos ossos[36-38]. RODRGUEZ et al.[39] estudaram as reaes de precipitao da HAP em soluo de Ca(NO3)2.4H2O e (NH4)2HPO4, utilizando-se de NH4OH para controlar o pH. Os ps obtidos foram lavados diversas vezes com gua destilada e secos a 104 C. Devido recristalizao de (NH4)2HPO4 considerou impossvel conduzir experincias em pH > 10. Em pH abaixo de 4 os precipitados obtidos foram identificados como apatitas na forma de brushite, monetite, entre outros fosfatos. Os estudos tambm mostraram a influncia do pH nas relaes de Ca/P. Em pH prximo de 10,4 obteve-se hidroxiapatita com relao Ca/P de 1,67. Tempos de reao muito longos produziram aumento na relao Ca/P, tendo por resultado uma diminuio da deficincia de clcio da amostra e um aumento no tamanho dos cristalitos. Quando as reaes foram realizadas a 90 C por 2 horas obteve-se um produto com relao de 1,67. O aumento de temperatura aumentou o tamanho das partculas. As temperaturas de 25-37 C so necessrias para obter HAP na escala do osso humano, enquanto que sinterizaes a 90 C so similares ao esmalte do dente. Tempos de maturao de 11 dias foram favorveis as formaes de HAP com Ca/P equivalente a 1,67. Aps 15 dias, essa relao mais elevada que 1,67. Tambm uma diminuio na rea de superficial pode ser observada para um perodo de tempo de 11 dias. Em conseqncia de modificaes sofridas na produo e sinterizao da HAP, propriedades tais como dissoluo e reabsoro so afetadas. No entanto, mesmo que se consiga controlar todos os parmetros que governam a precipitao, o uso clnico de cermicas de hidroxiapatita pode ser limitado por sua lenta biodegradao[40]. Estudos por longos perodos de tempo tm mostrado que a hidroxiapatita comea a ser reabsorvida graduamente apenas aps 4 ou 5 anos de implante. A reabsoro uma caracterstica desejada para um biomaterial em alguns tipos de implantes, de modo que ele possa ser degradado lentamente, enquanto reposto por osso em formao, evitando a presena de material estranho ao organismo durante longos perodos de tempo[25].

16 A degradao das biocermicas de fosfato de clcio ocorre em diferentes nveis, segundo a ordem: CaHPO4.2H2O > CaHPO4 > Ca8H2(PO4)6.5H2O > Ca3(PO4)2 > Ca10(PO4)6(OH)2. Esta reabsoro causada por dissoluo fsico-qumica, que depende do produto de solubilidade do material e do pH local no meio fisiolgico por desintegrao fsica em partculas menores e por fatores biolgicos, como a fagocitose, os leuccitos e os mediadores qumicos que causam a reduo do pH local. A velocidade de reabsoro pode aumentar com o aumento da rea superficial (p > slido poroso > slido denso), com o decrscimo da cristalinidade, com a diminuio do tamanho dos gros e, pela substituio de CO32- nos stios de fosfato e por outros ons metlicos nos stios de clcio[25,41,42]. MOREIRA et al.[43] observaram em seus estudos que o preenchimento de falhas sseas com HAP ocorre em menor perodo de tempo com a utilizao de grnulos menores. SHAPOFF et al.[44] tambm consideram que as partculas com tamanho menor apresentam reabsoro mais rpida, atuando como material osteocondutor. A estabilidade trmica da variedade de amostras de HAP preparadas por diferentes mtodos mido-qumicos tem sido estudada. Os resultados mostram que a estabilidade qumica da hidroxiapatita depende intrinsecamente da estequiometria e estrutura do cristal, sendo que a elevada temperatura de decomposio implica na boa estabilidade trmica da HAP Decomposio de HAP em temperaturas acima de 700 C freqentemente encontrada durante a fabricao de HAP cermica. Isto provoca sua decomposio em uma mistura de fosfato triclcio (TCP), Ca3(PO4)2[18,37,45]. FANG et al.[46] relatam que o processo ocorre conforme a seguinte reao:
< 700 C Ca10-x (HPO4 )x (PO4 )2-x .nH 2O Ca10 x ( P2O7 ) x ( PO4 )6 x (OH ) 2 + nH 2O(g) 700 800 C ( 1 - x)Ca10 (PO4 )6 (OH)2 + 3Ca3 (PO4 )2 + xH 2O(g)

(2.1)

Em temperaturas acima de 900 C, a decomposio da HAP pode ser esquematizada pela seguinte reao:
>900 C Ca10 ( PO4 )6 (OH ) 2 Ca10 ( PO4 )6 (OH )2 2 y Oy + yH 2O( g )

(2.2)

2.5 Caractersticas, toxidade e toxicocintica do cromo (III)

17

Os metais apresentam uma longa e remota intimidade com a histria da humanidade. Presentes nas ferramentas que permitiram grandes saltos evolutivos, em processos de arte, e depois nas cincias, eles so indubitavelmente, parceiros na grande escalada humana. Mas apesar de tanta e to extensa convivncia, nem todos os registros so positivos, uma vez que seu uso pode trazer riscos. confivel e no represente ameaa. O cromo um metal cinza ao, com forma cristalina cbica, sem odor e muito resistente corroso. o stimo mais abundante metal na terra como um todo. Os estados de oxidao mais comuns do cromo so: +2, +3, +6. So mais estveis na forma tri e hexavalente, alm da forma elementar, aparecendo na composio de xidos, sulfatos, cromatos, dicromatos, sais bsicos e na forma elementar recobrindo peas metlicas e plsticas nos processos de tratamento de superfcie. No homem e em animais o cromo trivalente um nutriente essencial que desempenha papel importante no metabolismo de glicose, gorduras e protenas. Acredita-se que a forma biologicamente ativa do complexo de cromo (III) orgnico facilite a interao da insulina com seus receptores celulares. A molcula biologicamente ativa do cromo (III), comumente referida como GTF, parece ser um complexo do tipo dinicotinato de cromo (III)-glutationa. Esta molcula no foi ainda totalmente caracterizada mais se sabe que ela facilita a interao da insulina com seu receptor, influenciando assim, o metabolismo de glicose, protenas e lipdeos. Compostos inorgnicos de cromo (III) no apresentam esta atividade. Entretanto, o homem e os animais so capazes de converter os compostos de cromo inativos a formas biologicamente ativas. O mecanismo exato desta interao desconhecido[7,47-48]. O cromo (III) apresenta baixa toxidade, enquanto que o cromo (VI) pode provocar efeitos nocivos na pele, no trato respiratrio e nos rins. A baixa toxidade do cromo (III) se deve, em parte, a dificuldade de penetrao celular, pois seus compostos formam complexos octadricos, que por serem pouco solveis em pH fisiolgico no podem penetrar facilmente atravs da membrana celular. Portanto, os efeitos txicos do cromo trivalente so pouco provveis[7,48]. Dentre os fatores que devem ser considerados na avaliao da toxidade dos compostos de cromo, destaca-se a pureza desses compostos; os compostos de cromo Por isso necessrio se ter conhecimento de suas caractersticas para que sua utilizao seja

18 (III) podem estar contaminados com pequenas quantidades de cromo (VI), o que dificultaria a interpretao dos estudos com animais de experimentao e a avaliao da exposio no ambiente ocupacional. Como o cromo (VI) rapidamente reduzido a cromo (III) no organismo, torna-se difcil distinguir os efeitos nocivos de cada espcie em separado[7]. A ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry) e o FDA (Food and Drug Administration) dos Estados Unidos estabelecem como limite de cromo em ingesto diria o valor de 120 g[7]. Os compostos de cromo (III) so pouco absorvidos e esta absoro se d por difuso passiva ou fagocitose. A velocidade de absoro depende do dimetro aerodinmico da partcula, da solubilidade do composto nas membranas celulares, dentre outros fatores. Uma vez absorvido, o composto transportado pelo sangue para vrios rgos e tecidos atravs da transferrina, a mesma protena envolvida no transporte do ferro. Concentrando-se, especialmente, no fgado, rim, bao e pulmo; sendo excretado preferencialmente pelos rins, com uma pequena porcentagem pela bile e pelas fezes. O Cr(III) possui um t de 5-21 horas e a eliminao se d pela urina[49-50]. A ATSDR (2000)[7] relata estudos utilizando a via intravenosa como meio de introduo, demonstrado que 40% da dose injetada de cromo (III) excretada na urina e 5% nas fezes. O cabelo, as unhas e o suor so vias de excreo de menor importncia.

2.6 Espectroscopia de materiais dopados com cromo (III) O Cr3+ apresenta atividade ptica em diversos meios e em especial, como dopante em slidos cristalinos. O estado fundamental do Cr3+ sempre 4A2g. Os estados excitados, entretanto depende fortemente das interaes com a matriz cristalina. Em um meio octaedral os nveis de energia do Cr3+ so explicados usando a teoria do campo cristalino (Dq) e parmetros Racah (B, C). Muitos sistemas dopados com Cr3+ podem ser encontrados na literatura sendo os mais importantes o rubi[51-53] e LiSrAlF3
[54-55]

, lasers de estado slido com propriedades bem conhecidas nos quais a

emisso luminescente principal devida a presena do Cr3+[56-58].

19 RAVIKUMAR et al.[59], estudando as propriedades pticas do Cr3+ em ZnNH4PO4.6H2O, foram capazes de identificar as principais transies associadas aos ons de Cr3+. No se tem conhecimento de estudos na literatura relativos identificao de transies de Cr3+ em HAP e esta informao crucial para o uso deste material como biosensor, entretanto os resultados para outros sistemas, tais como o Al2O3, abrem a possibilidade para um estudo similar na identificao destas transies.

2.6.1 Teoria do Campo Cristalino A idia original da Teoria de Campo Cristalino parece ser atribuda a Becquerel. Entretanto a sua formulao inicial se deu como Teoria do Campo Cristalino (TCC) por Bethe em 1929[60] e desenvolvida por Van Vleck[60] para explicar as propriedades de ons de metais de transio em cristais. Foi na dcada de 50 com Ilse, Hartman, Orgel Moffitt[60], dentre outros que a TCC foi utilizada com sucesso para explicar a cor, propriedades magnticas, espectro eletrnico (UV-Vis) e de ressonncia paramagntica eletrnica (RPE) de compostos de coordenao de metais de transio. A Teoria do Campo Cristalino esta baseado na premissa de que as energias dos orbitais d dos ons de metais de transio em soluo no so idnticas e que a absoro envolve a transio de um eltron d de menor energia para um orbital de energia maior. A presena de um campo eltrico ou magntico ocasiona a quebra da degenerescncia dos nveis eletrnicos. A distribuio de densidade eletrnica nos cinco orbitais d ao redor do ncleo mostrada na FIG 2.7.

20

FIGURA 2.7 - Distribuio de densidade eletrnica nos cinco orbitais d[61]

A perda parcial da degenerescncia resulta em dois nveis de energia, como ilustrado na FIG 2.8. A energia dos orbitais d(z2) e d(x2 y2), ou eg, aumentada, enquanto que a energia dos orbitais dxy, dxz e dyz, ou t2g, diminuda. Os orbitais eg esto na mesma direo dos grupos ligantes (FIG 2.9), gerando uma pequena repulso entre os eltrons do metal e do ligante. Por esta razo a energia dos orbitais eg aumenta. As probabilidades de ocupao dos orbitais d, que so as mesmas quando um elemento est isolado, deixa de ser quando o elemento est imerso no slido[60].

FIGURA 2.8 Desdobramento dos orbitais d do tomo central em uma simetria octadrica[60]

21

FIGURA 2.9 Distribuio dos ligantes e conjunto de orbitais d do tomo central numa simetria octadrica[60]

A energia aumentada em 6Dq para o nvel eg e sofre um decrscimo de 4Dq para o nvel t2g, de forma que a diferena total entre os dois nveis agora 10Dq. Dq definido como: Dq = (1/6)Ze2(r e
4

/ a 5)

(2.3)

= 10 Dq

(2.4)

onde Z a carga do ligante, e a carga do eltron, r raio do orbital 3d, a a distncia de ligao metal-ligante e separao entre os nveis d provocada pela ao do campo cristalino.

2.6.2 Parmetros de Racah Para predizer ou interpretar um espectro associado s transies eletrnicas dos constituintes de um slido precisamos conhecer as energias dos vrios estados excitados relativos ao estado fundamental. Para isso aplicamos os princpios abaixo[53]:

22 Termos de ons livres so expressos em trs parmetros (chamados de parmetros de Racah) A, B e C, estes parmetros so integrais de repulso dos eltrons e seus valores podem ser obtidos da espectroscopia atmica. Termos resultantes da mesma configurao eletrnica (isto d3) envolve a mesma contribuio do parmetro A, ento diferenas de energias com a mesma configurao no envolvem A. Termos com a mesma multiplicidade de spin como o estado fundamental do on livre no envolvem C. A razo C/B aproximadamente constante para uma dada espcie qumica. Quando a substncia est em um campo cristalino, o termo de energia envolve o parmetro D. A energia dos termos em um campo cristalino envolve, na maioria, B, C e D e j que C/B assumido ser uma constante, eles envolvem somente B e D. Devido estrutura energtica, o Cr3+ com coordenao octadrica pode ser considerado como um sensor efetivo, que permite a determinao da simetria e da fora do campo cristalino do material hospedeiro. O padro hamiltoniano do sistema so parametizados pelos parmetros B e C de Racah que representam a repulso e a troca dos eltrons d, e pelo parmetro Dq que representa a interao dos eltrons d com o campo eletrosttico dos ligantes[51]. Como resultado obtm-se o diagrama de Tanabe-Sugano, como ilustrado na FIG 2.10. Os trs parmetros de Racah so associados com a interao coulombiana entre os mesmos eltrons da configurao. Atravs da tabela 2.2 podemos conhecer os nveis de energia para o estado fundamental 4A2 e calcular os parmetros de Racah de materiais dopados com Cr3+. Para um on de Cr3+, B = 918cm-1. Para um on livre em um ambiente octaedral do campo cristalino isto se reduz a 765 cm-1. Esta diferena esta associada com a mudana na parte radial da funo de onda entre o on livre e o on no cristal e especialmente sensvel aos efeitos das ligaes covalentes. Em geral C = 4B uma boa aproximao para ons metal-transio. O efeito de A deve reduzir o campo cristalino 10Dq. Para o rubi, por exemplo Dq/B = 2.25[53].

23 Dependendo da fora do campo cristalino, Dq, o primeiro estado excitado do Cr3+ 4T2 para Dq/B < 2.2 e 2E para Dq/B > 2.2. O caso anterior considerado como ligante fraco, o ltimo como ligante forte. Desde que Dq Z/a5, onde a est a uma distncia do on ligante e Z a carga do ligante, a quantidade destes parmetros fornece a informao sobre a distribuio do ligante no stio de Cr3+. Existe uma forte diferena no tempo de decaimento da luminescncia dependendo de se tratar de um campo fraco (transio permitida
2 4

T2

A2) ou campo forte (transio proibida

E 4A2). Alm disso a transio 2E 4A2 somente possvel devido ao acoplamento

do spin-rbita entre os estados 2E-4T2[51].

FIGURA 2.10 Diagrama de Tanabe-Sugano para um on 3d3[53]

24 TABELA 2.2 Desdobramento dos nveis de energia dos estados d3 em coordenao octadrica em funo dos parmetros de Racah e do parmetro de campo cristalino
Configurao t23 E (4A2) = 3A 15B 12Dq E (2E) = 3A 6B + 3C 12Dq E (2T1) = 3A 6B + 3C 12Dq E (2T2) = 3A + 5C 12Dq Configurao t22e E (2A1) = 3A 11B + 3C 2Dq E (4T1) = 3A 3B 2Dq E (4T2) = 3A 15B 2Dq -

2.7 Influncia do cromo (III) na estrutura, morfologia e estabilidade trmica da hidroxiapatita WAKAMURA et al.[62] estudaram a estrutura, morfologia e estabilidade trmica da HAP com diferentes concentraes de Cr3+ usando uma rota diferente de precipitao em pH = 9. Para estes a substituio de ons Ca+2 por ons trivalentes um mtodo apropriado para controlar a estequiometria da HAP. Por difratometria de raio-X caracterizaram a HAP na presena de quantidades diferentes dos ons de Cr. A FIG 2.11 mostra a influencia do on na cristalinidade do material. Os materiais com XCr = 0.015 e 0.041 apresentam picos com largura a meia altura elevados, significando que estes tm cristalitos menores e/ou mais cristais distorcidos. As anlises revelaram que o aumento na concentrao de Cr aumenta o tamanho dos cristalitos.

FIGURA 2.11 - XRD de hidroxiapatita pura e dopada com diferentes concentraes de Cr3+[62]

25 As anlises de microscopia eletrnica de transmisso (TEM) feita por WAKAMURA et al.[62] mostraram que as partculas da HAP sem dopante so agulhas curtas e pequenas, enquanto que as dopadas com Cr3+ so longas, irregulares e finas (FIG 2.12). A relao Ca/P cresce de 1.66 a 3.25 com o aumento da XCr.de 0 a 1. Isso explicado pela formao de um outro composto com relao (Ca + Cr)/P.

FIGURA 2.12 TEM de amostras de HAP pura e dopada com Cr3+[62]

26 Para examinar a estabilidade trmica da HAP dopada foram realizadas medidas de TG. As curvas de TG so mostradas na FIG 2.13. O material com XCr 0.13 mostra reduzida perda de massa aps 550 C . Essa perda de peso foi justificada devido liberao de on OH- como H2O nas partculas irregulares. A perda de massa aumenta com o aumento da concentrao de Cr+3, mostrando que os materiais com maior XCr contm mais on OH-.

FIGURA 2.13 Curvas de TG dos materiais com diferentes XCr[62]

CAPTULO III

MTODOS EXPERIMENTAIS
O trabalho baseia-se na obteno de hidroxiapatita pura e dopada com Cr3+ utilizando na produo a reao de precipitao do Ca(NO3)2.4H2O com (NH4)2HPO4. Para obteno da hidroxiapatita dopada utiliza-se Cr(NO3)3.9H2O. Todas as amostras utilizadas neste trabalho foram produzidas no Laboratrio de Preparao e Caracterizao de Materiais (LPCM) do Departamento de Fsica da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Os procedimentos experimentais utilizados na preparao da hidroxiapatita, bem como as tcnicas usadas para a caracterizao e estudo de suas propriedades sero descritos nesse captulo.

28 CAPTULO I MTODOS EXPERIMENTAIS

3.1 Sntese de HAP No estudo de hidroxiapatita para aplicaes biomdicas como biosensor foram produzidas hidroxiapatita pura e dopada com Cr3+. O material foi precipitado por via mida a partir de 50 mL de uma soluo de Ca(NO3)2.4H2O a 0,167 mol/L, adicionada lentamente a 50 mL de uma soluo de (NH4)2HPO4 0,1mol/L, a uma velocidade de aproximadamente 1,2 mL/min. A precipitao da HAP ocorre segundo descrito pela equao 3.1[33,39]:
10Ca ( NO3 ) 2 .4 H 2 O + 6( NH 4 ) 2 HPO4 + 8 NH 4 OH Ca10 ( PO4 ) 6 (OH ) 2 + 20 NH 4 NO3 + 6 H 2 O

(3.1)

A reao foi conduzida temperatura de 27 C sob agitao magntica constante, tendo mantido o pH em 10.4 com adio de NH4OH (FIG 3.1). Terminada a reao, que durou cerca de 45 min por amostra, a suspenso foi mantida em repouso por um perodo de 50, 100 ou 150 horas, que corresponde ao tempo de maturao. O precipitado resultante foi filtrado, lavado com gua destilada e calcinado a 500 C por 1 hora. Ao final da calcinao, obteve-se cerca de 0,76158 g das cermicas na forma de p, constitudas por um aglomerado de partculas em simples justaposio, mantidas unidas por ligaes muito fracas. Aps uma leve triturao estas ligaes so rompidas e temos hidroxiapatita na forma de um p fino. Com o propsito de estudar a estabilidade trmica do material obtido produziu-se HAP em outras diferentes condies de temperatura: tratada em estufa a 100 C e calcinada a 800 C. Todas as amostras permaneceram nestas temperaturas por uma hora. As amostras dopadas tambm foram produzidas segundo a equao 3.1, adicionando soluo de Ca(NO3)2.4H2O 50 mL de uma soluo de Cr(NO3)3.9H2O 0,01 mol/L (6 mol%).

29

FIGURA 3.1 Aparelhagem utilizada na reao de precipitao da HAP

3.2 Caracterizao dos materiais Inmeras estratgias tm sido empregadas na caracterizao de amostras de hidroxiapatita. Da mesma forma diferentes informaes podem ser obtidas a partir do emprego destas estratgias. A FIG 3.2 apresenta as tcnicas empregadas neste trabalho para a caracterizao das amostras de hidroxiapatita pura e dopada.

30

Produo de HAP pura e dopada via reao de precipitao

Caracterizao

Difrao de Raios-X (XRD)

Microscpia Eletrnica de Varredura (MEV)

Espectrometria de Energia Dispersiva de Raios-X (EDX)

Anlise Trmica

Luminescncia

TG / DTG

DTA

Espectroscopia de Absoro ptica no Ultravioleta/ Visvel

Espectroscopia de Fluorescncia

FIGURA 3.2 Tcnicas utilizadas para a caracterizao das amostras de HAP pura e dopada

3.2.1 Difrao de raios-X Desde a sua descoberta em 1912, por Von Laue, a difrao de raios-X tem sido uma importante fonte de informao para a cincia e a indstria. A difrao de raios-X fornece um meio conveniente e prtico para a identificao qualitativa de compostos cristalinos. O mtodo de difrao de raios-X usando amostra policristalina, ou mtodo de p, nico, porque somente este mtodo analtico capaz de fornecer informaes qualitativa e quantitativa sobre os compostos presentes em uma amostra slida [61]. Quando uma substncia cristalina sujeita a um feixe de raios-X incidindo segundo um determinado ngulo, os diferentes planos ou camadas de tomos ou ons dos cristais refletem parte da radiao, sendo o ngulo de reflexo igual ao ngulo de

31 incidncia. Para que as ondas refletidas pelos diferentes planos cristalinos estejam em fase, isto , para que seja mxima a intensidade da radiao refletida, necessrio que se verifique certa relao entre o comprimento de onda da radiao, a distncia entre os planos dos cristais ou distncia interplanar e o ngulo de incidncia, relao esta que dada pela lei de Bragg:

2dsen = n

(3.2)

Assim, submetendo uma amostra cristalina a raios-X de um determinado comprimento de onda e traando um diagrama (difratograma) com a intensidade da radiao difratada em funo do ngulo de incidncia, obtm-se, atravs dos mximos de difrao, um conjunto de distncias entre planos cristalinos, que caracterstico da substncia cristalina que lhe deu origem. Por comparao destes valores com os de tabelas possvel identificar as substncias cristalinas presentes na amostra[63]. Alm disso a estimativa do tamanho do cristalito pode ser calculado pela frmula de Scherrer a partir da largura a meia altura dos picos. A equao de Scherrer representada da seguinte maneira:

= ( k . ) /( . cos )

(3.3)

onde e o tamanho do cristalito, o comprimento de onda dos raios- X, a largura a meia altura (em rad), k e a contante e o ngulo de Bragg dos picos. Na identificao do composto cristalino por difrao, a amostra cristalina moda na forma de um p fino e homogneo. A identificao dos materiais foi feita em difratmetro de raios-X Rigaku modelo DMAX2000, com radiao CuK (=1,5418 ), 40kV/40mA. Os difratogramas foram obtidos no modo stepscan, no intervalo angular de 10 a 80 em 2 e de passo 0,02. Para identificao das fases cristalinas utilizou-se como referncia primria o software JADE e o banco de dados PC-PDFWin.

32 3.2.2 Microscopia eletrnica de varredura e espectrometria de energia dispersiva de raios-X Em muitos campos das cincias dos materiais, qumica, geologia e biologia, um conhecimento detalhado da natureza fsica das superfcies de slidos de grande importncia. O mtodo clssico para se obter tal informao era por microscopia ptica, que ainda uma tcnica importante para a caracterizao das superfcies. A resoluo da microscopia ptica , no entanto, limitada por efeitos de difrao ordem de grandeza do comprimento de onda da luz[61]. O microscpio eletrnico de varredura (MEV) um equipamento capaz de produzir imagens de alta resoluo (at 300.000 x). O princpio de funcionamento do MEV consiste na emisso de feixes de eltrons por um filamento capilar de tungstnio (eletrodo negativo), mediante a aplicao de uma diferena de potencial que pode variar de 0,5 a 30 kV. Essa variao de voltagem permite a variao da acelerao dos eltrons. A parte positiva em relao ao filamento do microscpio (eletrodo positivo) atrai fortemente os eltrons gerados, resultando numa acelerao em direo ao eletrodo positivo. A correo do percurso dos feixes realizada pelas lentes condensadoras que alinham os feixes em direo abertura da objetiva. A objetiva ajusta o foco dos feixes de eltrons antes dos eltrons atingirem a amostra analisada. A microscopia eletrnica fornece informao morfolgica e topogrfica sobre as superfcies de slidos, necessria para se entender o comportamento de superfcies. A Energia dispersiva de raio-X (EDX) um acessrio essencial no estudo de caracterizao microscpica de materiais. Quando o feixe de eltrons incide sobre um mineral, os eltrons internos dos tomos e dos ons constituintes do material so excitados, mudando de nveis energticos. Ao retornarem para sua posio inicial, liberam a energia adquirida na forma de radiao eletromagntica de comprimento de onda no espectro de raios-X. Um detector instalado na cmara de vcuo do MEV ao qual o EDX est acoplado mede a energia associada a esse eltron. Como os nveis de energia dos eltrons internos de um determinado tomo possuem energias distintas, possvel, no ponto de incidncia do feixe, determinar quais os elementos qumicos esto presentes naquele local e assim identificar quantitativamente os elementos presentes. O dimetro reduzido do feixe permite a determinao da composio em

33 amostras de tamanhos muito reduzidos (< 5 m), permitindo uma anlise quase que pontual do material[64]. As tcnicas de MEV e EDX foram utilizadas respectivamente para anlises microscpicas da superfcie dos materiais e para determinao dos teores de clcio e fsforo dos mesmos. As amostras de HAP foram fixadas em um suporte metlico sobre uma fita de carbono e metalizadas com uma camada de ouro. As anlises foram realizadas em um microscpio eletrnico de varredura, utilizando equipamento de marca JEOL modelo JSM-5900EDX acoplado a sistema de deteco EDX Noran Instruments modelo 695A-1SPS. As medidas foram realizadas na Universidade Federal de Pernambuco, atravs do projeto da Rede Nacional de Nanotecnologia Molecular e Interfaces (RENAMI) financiada pelo CNPq.

3.2.3 Anlise trmica A anlise trmica definida como um grupo de mtodos pelos quais as propriedades fsicas ou qumicas de uma substncia, uma mistura so medidas como funes de temperatura ou tempo, enquanto a amostra est sujeita a um programa de temperatura controlada. O programa trmico pode consistir em aquecer ou resfriar (dinmico), ou manter a temperatura constante (isotrmica), ou qualquer seqncia destes. Os mtodos trmicos so tcnicas de multicomponentes e incluem termogravimetria (TG), anlise trmica diferencial (DTA), calorimetria exploratria diferencial (DSC) e termogravimetria derivativa (DTG). A anlise trmica possibilita uma ampla faixa de aplicao para medidas de propriedades fsicas, estudo de reaes qumicas, avaliao da estabilidade trmica e desenvolvimento de metodologia analtica. Na termogravimetria (TG) a anlise da massa da amostra em uma atmosfera controlada medida como uma funo de temperatura ou de tempo. A TG pode ser usada para monitorar qualquer reao que envolve uma fase de gs como a oxidao ou desidratao. O tamanho da amostra varia de uns poucos mg a 10 mg dependendo do equipamento usado. Os estudos podem ser realizados a temperaturas de at 1550 C Este mtodo til para determinar a presena de gua na amostra, por exemplo. O termograma tpico traa a massa da amostra versus a temperatura ou o

34 tempo, gerando assim informao sobre a estabilidade trmica da amostra, velocidades de reao e composio. Os sistemas de aquisio de dados dos instrumentos mais modernos de TG so capazes de fornecer a derivada da curva termogravimtrica (DTG). A derivada pode revelar informaes que no so diretamente detectveis no termograma normal. A anlise trmica diferencial (DTA) uma tcnica em que a temperatura da amostra comparada com um material de referencia inerte durante uma variao de temperatura programada. Medidas trmicas diferenciais tm sido usadas em estudos do comportamento trmico de compostos inorgnicos puros, bem como em substncias inorgnicas, como silicatos, cermicas, xidos e vidros. uma tcnica especialmente adaptada ao estudo de transformaes estruturais no interior de um slido a temperaturas elevadas, onde so disponveis poucos outros mtodos. Pela curva de DTA possvel acompanhar as transies de fase ou reaes qumicas por observao do calor absorvido ou liberado. costume representar graficamente eventos exotrmicos para cima no eixo vertical de uma curva tpica de DTA, enquanto que os eventos endotrmicos apontam para baixo, mas essa conveno no seguida universalmente. Transies de fases, desidratao e reaes de reduo produzem efeitos endotrmicos, enquanto que cristalizao, oxidao, e algumas reaes de decomposio produzem efeitos exotrmicos Como o modo usual de operao fornecer calor s amostras, os eventos endotrmicos so de ocorrncia mais provvel que os exotrmicos e estes, quando observados freqentemente originam-se por processos secundrios[61,66]. As curvas de TG e DTA foram obtidas em um mdulo simultneo DSC-TGA da TA Instruments modelo SDT 2960 numa faixa de temperatura de 10 a 900 C, com razo de aquecimento de 10 C min-1, atmosfera de ar sinttico com vazo de 100 mL min-1 e cadinho de alumina com massa de amostra de 9 a 13 mg aproximadamente.

3.2.4 Espectroscopia de absoro ptica no ultravioleta/visvel Transies eletrnicas que ocorrem dentro das molculas ou entre as bandas de energia em um slido so geralmente estudadas pela absoro seletiva da

35 radiao que as atravessa e, menos freqentemente, pelos processos de emisso como fluorescncia e fosforescncia[67]. A absoro de radiao utravioleta ou visvel por uma espcie atmica ou molecular M pode ser considerada um processo de duas etapas, a primeira das quais envolve excitao eletrnica, como mostrado pela equao M+h M* O produto da reao entre M e o fton h uma espcie excitada eletronicamente, simbolizada por M*. O tempo de vida da espcie excitada breve (10-8 a 10-9 s), sendo sua excitao terminada por um dos vrios processos de relaxao. O tipo mais comum de relaxao envolve converso de energia de excitao em calor, isto , M* M + calor A relaxao pode tambm ocorrer por decomposio de M* para formar novas espcies; esse processo chamado reao fotoqumica ou processos fotolticos Alternativamente, a relaxao pode envolver re-emisso de ftons causando fluorescncia ou fosforescncia (vide seo 3.2.5). importante observar que o tempo de vida de M* normalmente pequeno, a ponto de sua concentrao em qualquer instante ser geralmente desprezvel. Mas ainda, a quantidade de energia trmica desprendida pela relaxao usualmente no detectvel. Assim, medidas de absoro criam uma perturbao mnima no sistema em estudo, exceto quando ocorrem decomposies fotoqumicas. A absoro de radiao ultravioleta ou visvel geralmente resulta da excitao de eltrons de ligao; como conseqncia, os comprimentos de onda dos picos de absoro podem ser correlacionados com os tipos de ligao nas espcies em estudo[61]. Em materiais no metlicos, defeitos e impurezas podem ser considerados como centros localizados de eltrons ou buracos, que podem ter nveis eletrnicos, vibracionais e rotacionais, situados dentro do gap de energia do material. A transio entre esses nveis caracterizada por um ou mais picos na regio do espectro de absoro onde o material seria transparente. Conseqentemente, cada impureza ou centro de defeito caracterizado por seu espectro de absoro contendo uma ou algumas bandas[68]. A espectroscopia de absoro ptica , portanto, valiosa para identificar grupos funcionais em uma molcula. Mais importantes, no entanto, so as aplicaes

36 da espectroscopia de absoro ultravioleta e visvel na determinao quantitativa de compostos contendo grupos absorvedores. Muitos ons de metais de transio absorvem na regio ultravioleta ou visvel do espectro. Para os 18 elementos das duas primeiras sries de transio o processo de absoro resulta de transies eletrnicas de eltrons 3d e 4d. Estes ons tendem a absorver radiao visvel em um (se no em todos) de seus estados de oxidao e suas bandas so freqentemente largas. Os ons de cromo so caracterizados por terem cinco orbitais 3d parcialmente ocupados, cada um capaz de acomodar um par de eltrons. As caractersticas espectrais destes ons envolvem transies eletrnicas entre os vrios nveis de energia destes orbitais d. Na FIG 3.3 possvel ver os espectros tpicos para os ons de Cr3+ e Cr2+ em complexos.[61]

FIGURA 3.3 Espectros de absoro dos ons de Cr3+ e Cr2+ em complexos

As medidas de absoro ptica realizadas neste trabalho foram conduzidas temperatura ambiente. Para verificar as melhores condies de medida, inicialmente as amostras foram postas em suspenso em lcool etlico e gua ultra-pura. Foram realizadas algumas medidas como testes, e com base nos resultados se optou por conduzir as anlises em suspenso de gua ultra-pura. A seguir, foram realizadas diversas medidas considerando dois padres de referncia (branco) distintos, HAP sem dopagem e a gua ultra-pura. Estas duas situaes foram analisadas e discutidas. Os espectros de absoro na regio de 200-1000 nm foram obtidos em um espectrofotmetro UV/VIS Perkin Elmer modelo Lambda 45.

37 3.2.5 Espectroscopia de fluorescncia molecular Na fluorescncia as espcies atmicas ou moleculares do material so excitadas por radiaes eletromagnticas nas regies do UV ou do visvel e, quando retornam ao estado fundamental, fornecem um espectro de radiaes que so emitidas em comprimentos de onda superiores ao fixado para a excitao. A fluorescncia provocada pela absoro de energia radiante e emisso de parte desta energia sob a forma de luz. A luz emitida tem quase sempre comprimento de onda maior que o da luz absorvida (lei de Stokes). Na fluorescncia propriamente dita, a absoro e a emisso ocorrem dentro de um intervalo de tempo curto, porm mensurvel, da ordem de 10-12 10-9s. Se a luz for emitida com um retardo de tempo maior que 10-8s, o fenmeno conhecido como fosforescncia. Este retardo de tempo pode ser o de uma frao de segundo at vrias semanas, de modo que a diferena entre os dois fenmenos pode ser encarada como apenas uma diferena de grau. A fluorescncia e a fosforescncia so designadas em conjunto como fotoluminescncia; esta designao , portanto, o termo geral aplicvel a processos de absoro e de emisso de energia luminosa[69]. Um dos aspectos mais atraentes dos mtodos de luminescncia a sua sensibilidade intrnseca, com limites de deteco freqentemente de uma a trs ordens de grandeza menores que os encontrados em espectroscopia de absoro ptica. Este aumento de sensibilidade devido principalmente seletividade da tcnica, j que, na fotoluminescncia, a luz de excitao que incide na amostra seleciona a espcie que ser excitada de acordo com os nveis de energia disponveis no material. Outra vantagem dos mtodos fotoluminescentes a sua extensa faixa de concentrao linear, que, com freqncia, significativamente maior que as encontradas em mtodos de absoro. Devido sua alta sensibilidade, os mtodos de luminescncia quantitativos esto sujeitos a efeitos de interferncia das matrizes da amostra. A fluorescncia constitui de um mecanismo possvel atravs do quais espcies excitadas podem perder energia. Durante o processo de excitao, a maior parte das espcies excitadas ocupa nveis de energia vibracional de maior ordem no estado excitado. Sua principal tendncia passar para estados vibracionais inferiores atravs de colises e acoplamentos com a rede cristalina. Se essa perda de energia cessar em um nvel eletrnico excitado, as molculas estaro aptas a voltarem

38 diretamente a seu estado fundamental pela emisso de um quantum de energia. O diagrama da FIG 3.4 ilustra todo este processo[61].

FIGURA 3.4 Diagrama da fluorescncia de uma espcie ao absorver um fton

O experimentos

equipamento envolvendo

mais

comumente

empregado denominado

para

realizao

de de

fluorescncia

espectrofotmetro

fluorescncia ou espectrofluormetro. Consiste, basicamente, de uma fonte de excitao que emite radiaes de modo contnuo, filtros ou monocromadores localizados antes e aps o espao reservado para comportar a amostra, tubos fotomultiplicadores que recebem a radiao emergente e a radiao de referncia. A radiao emergente colhida em ngulo em relao radiao incidente, diferentemente do que ocorre nos espectrofotmetros de absoro ptica, onde a luz que atravessa amostra que deve ser colhida. Vrios tipos totalmente distintos de espectros podem ser obtidos atravs deste equipamento. Dentre este, os espectros de emisso e a matriz emisso-excitao.

39 Modalidade emisso Para se obter um espectro de emisso de fluorescncia costuma-se definir um comprimento de onda especfico para excitao dos componentes da amostra. A radiao incidente estabelecida como aquela na qual a amostra absorve com maior intensidade em seu espectro de absoro. Mantendo-se fixo este comprimento de onda de excitao, so registrados os comprimentos de onda e as intensidades das emisses provenientes da relaxao dos componentes da amostra. importante distinguir que os espectros de excitao so obtidos pela medida da intensidade da fluorescncia num comprimento de onda fixo, enquanto o comprimento de onda da radiao excitadora varivel. A radiao emitida apresenta menor energia por fton que a radiao excitante e, portanto, possui um maior comprimento de onda[67,69]. Modalidade matriz excitao-emisso (MEE) Esta modalidade baseia-se na obteno de um espectro tridimensional a partir de vrios espectros individuais de emisso. Esta tcnica tem sido largamente utilizada, pois permite uma varredura mais ampla empregando vrios comprimentos de onda de excitao. Pode-se obter um espectro MEE a partir do processamento dos dados espectrais por meio de um programa grfico, embora alguns equipamentos mais modernos j incluam esta modalidade. Os ps-precipitados de HAP contendo on de Cr3+ foram pastilhados e as medidas de fluorescncia foram realizadas temperatura ambiente utilizando-se um espectrofluorimetro ISS modelo PC1, equipado com lmpada de Xe e monocromador. Todos os espectros foram obtidos com largura de fenda dos monocromadores de 0,5 nm e com resoluo de 8.0 nm no comprimento de onda de excitao e 4.0 nm na emisso.

CAPTULO IV

RESULTADOS E DISCUSSO
Neste captulo sero apresentados os resultados obtidos durante o trabalho focados principalmente na otimizao de uma metodologia capaz de produzir nanocristais de HAP pura e dopada de forma controlada. A parte inicial do trabalho consistiu em determinar os fatores experimentais que afetam a qualidade final dos nanocristais. A maior nfase deste trabalho est na produo de hidroxiapatita que possa incorporar marcadores de fluorescncia. Dentro deste contexto foram produzidas amostras de hidroxiapatita dopada com Cr3+. Neste captulo sero mostradas e discutidas as medidas realizadas utilizando as diversas tcnicas apresentadas anteriormente.

41 CAPTULO IV RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 Estudo dos fatores que governam a precipitao da HAP

Como visto no captulo II, o comportamento biolgico da hidroxiapatita dependente de vrios fatores, dentre eles a composio qumica e as caractersticas fsicas finais do produto, justificando a necessidade de se investigar a influncia de vrias etapas no processo de fabricao da HAP sobre o produto final. Pela necessidade de se obter HAP na escala do osso humano as amostras foram preparadas temperatura de 27C. A fim de se evitar a formao de outros fosfatos intermedirios e HAP no estequiomtrica escolheu-se o pH em torno de 10.4, embora a formao de outro material, a principio, no interferisse nos resultados. De acordo com KANNAN et al.[73] a obteno de HAP numa mistura bifsica de HAP/TCP pode ser usada para aplicaes biomdicas. A reao produzida em atmosfera aberta propcia substituio do dixido de carbono na estrutura do cristal. ons carbonatos (CO32-) podem substituir stios de hidroxilas ou fosfatos[39,74]. Sabendo que o osso humano apresenta em sua composio carbonatos, no houve problemas ao conduzir as reaes em atmosfera aberta.

4.2 Difrao de raios-X

Para iniciar o estudo da aplicabilidade de hidroxiapatita como um biosensor, necessrio identificar as fases cristalogrficas presentes no material, para verificar se houve obteno da HAP. Assim, a identificao do material obtido, bem como as modificaes estruturais provocadas pelas variaes no tempo de maturao e temperatura foi estudada a partir das medidas de difratometria de raios-X (XRD). DE JONG foi o primeiro a observar a semelhana entre os padres de difrao de raios-X da fase mineral dos ossos e da hidroxiapatita, em 1926[76]. A fase mineral dos ossos no possui uma composio muito bem definida, alm de mostrar variaes durante os estgios de maturao e envelhecimento dos tecidos duros. Sua estrutura cristalina e razo Ca/P, no entanto, assemelham-se as da hidroxiapatita, apresentando, ainda, a presena dos ons Na+, Mg2+, CO32-, citratos e, em menores

42 quantidades, K+, Cl- e F-8. Considerando apenas os elementos principais, a composio da fase mineral pode ser representada pela frmula da apatita contendo vacncias inicas[76]:

Ca8,3

1,7(PO4)4,3(CO3)(HPO4)0,7(OH,CO3)0,3

1,7

onde

representa uma vacncia.

Para observar a semelhana entre a fase mineral dos ossos e a hidroxiapatita sinttica foi feita uma comparao entre as difratometrias de raios-X de uma amostra produzida neste trabalho com a de um osso humano, como pode ser visto na FIG 4.1. A amostra foi produzida com tempo de maturao de 150 h e calcinada a 500 C. Os difratogramas dos materiais foram comparados com o padro de XRD de referncia obtido do banco de dados JCPDS, ficha nmero PDF#09-0432.

HAP Sinttica Osso Humano

Padro de HAP
20 40 60

2 theta

FIGURA 4.1 Difratogramas de raios-X de amostra de HAP sinttica com tempo de maturao de 150 h e do osso humano em comparao com o padro de referncia da HAP (PDF#09-0432)

43 A cristalinidade da HAP pode ser avaliada qualitativamente pelos picos de difrao de raios-X, pois amostras contendo picos acentuados e agudos tem maior cristalinidade do que amostras que apresentem picos de difrao largos e de baixa intensidade. As amostras puras e dopadas da HAP nos diferentes tempos de maturao (50, 100 e 150 horas) apresentaram estrutura tpica de hidroxiapatita pouco cristalina com picos de maior intensidade em 31,77, 32,19, 32,90, relativos aos planos [211], [112] e [300], da rede cristalina de HAP, respectivamente, de acordo com as FIG 4.2 e 4.3. Os resultados de difratometria de raios-X das amostras foram comparados com o padro de XRD de referncia obtido do banco de dados JCPDS, ficha nmero PDF#09-0432. Nas amostras dopadas, o Cr3+ foi dissolvido com sucesso na matriz da HAP. Como a concentrao de Cr3+ utilizada pequena (6 mol%) no possvel identifica-lo pela difrao de raios-X. Contudo, podemos observar na parte ampliada do grfico da FIG 4.3 um pequeno pico em 36,24, que no concorda com nenhum pico de difrao do padro da HAP.
HAP pura

150 h

100 h

50 h

Padro de HAP

20

40

60

80

2 theta

FIGURA 4.2 Difratogramas de raios-X de Ca10(PO4)6(OH)2 em diferentes tempos de maturao em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432)

44

HAP dopada

150 h

100 h

50 h

Padro da HAP

20

40

60

80

2 theta

33

36

FIGURA 4.3 Difratogramas de raios-X de Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 em diferentes tempos de maturao em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432)

A FIG 4.4 compara Ca10(PO4)6(OH)2 e Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 produzidas nas mesmas condies, isto , com tempo de maturao de 100 h e calcinao a 500 C, mostrando que a cristalinidade do material diminui com a incorporao do dopante. Uma indicao de que o grau de cristalinidade melhor na amostra pura que os

45 picos de menor intensidade so mais visveis nesta amostra do que na dopada. Estes resultados de XRD so compatveis com os resultados de WAKAMURA et al.[62]

HAP:Cr

3+

HAP pura

20

40

60

80

2 theta

FIGURA 4.4 Difratogramas de raios-X de Ca10(PO4)6(OH)2 e Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 com tempo de maturao de 100 h em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432)

Os diferentes tempos de maturao no influenciaram significantemente a cristalinidade e o tamanho dos cristalitos. O tamanho do cristalito foi determinado via equao de Scherrer. Os picos correspondentes aos planos [002], [310], [222] e [004] foram usados no clculo dos tamanhos de cristalito feitos atravs do software JADE. O clculo foi feito para cada plano e em seguida foi calculada a mdia entre eles. Os resultados em mdia do tamanho dos cristalitos esto apresentados na tabela 4.1. A correlao entre o tamanho dos cristalitos e tempo de maturao ocorre de acordo com a seguinte ordem: 150h < 50h < 100h mas a diferena esta praticamente dentro do erro experimental.

46

TABELA 4.1- Tamanho mdio do cristalito de Ca10(PO4)6(OH)2 e Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 Ca10(PO4)6(OH)2 Tempo de 50 25 1 100 27 1 150 23 1

maturao (h) Tamanho do

cristalito (nm) Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 Tempo de 50 26 1 100 28 1 150 26 1

maturao (h) Tamanho do

cristalito (nm)

A estabilidade trmica da HAP pode tambm ser investigada por anlises de XRD, visto que a temperatura um fator importante na obteno do material e no estudo da cristalinidade e tamanho dos cristalitos. A FIG 4.5 mostra que um tratamento trmico de 100 C suficiente para se obter o precipitado de HAP, produzindo estrutura pouco cristalina (picos largos e pouco intensos). Contudo, no interessante a obteno de HAP nesta temperatura, pois esta no exibe propriedades biolgicas/mdicas[46]. Como pode ser observado pelo difratograma, o material calcinado a 800 C apresentou uma mistura de estruturas cristalinas de hidroxiapatita e de xido de clcio (CaO). Este resultado no condiz com a literatura, que ao relatar sobre amostras calcinadas acima de 700 C falam da formao de uma mistura de HAP/TCP. Entretanto, como pode ser visto pela FIG 4.6, quando a Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 calcinada a 800 C h formao do fosfato de clcio (TCP). Alm disso, a HAP dopada no mostra uma correlao significativa entre a cristalinidade e a temperatura.

47
HAP pura
Estufa a 100C

Calcinada a 500C

Calcinada a 800C

Padro de HAP Padro de CaO

20

40

60

80

2 theta

FIGURA 4.5 Difratogramas de raios-X de Ca10(PO4)6(OH)2 tratada em estufa a 100 C, calcinada a 500 C e 800 C em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432) e do CaO (PDF#48-1467)

HAP dopada

Estufa a 100C

Calcinada a 500C

Calcinada a 800C

Padro de HAP Padro de TCP

20

40

60

80

2 theta

FIGURA 4.6 Difratogramas de raios-X de Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 tratada em estufa a 100 C, calcinada a 500 C e 800 C em comparao com o padro de referncia da Ca10(PO4)6(OH)2 (PDF#09-0432) e do TCP (PDF# 32-0176)

48 A melhor definio nos picos do difratograma de raios-X em funo da temperatura de calcinao est tambm relacionada com o aumento no tamanho dos cristalitos. A tabela 4.2 apresenta os tamanhos mdios determinados pela frmula de Scherrer para cada uma das amostras. Os resultados indicam que, como era esperado, um aumento de temperatura favorece o crescimento dos cristalitos. No caso da amostra de Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 calcinada a 500 C quando comparada a amostra tratada a 100 C o tamanho dos cristalitos aparentemente menor mas como a diferena encontra-se dentro do erro experimental, pode-se concluir que no houve mudana significativa de tamanho neste caso.

TABELA 4.2 - Tamanho mdio dos cristalitos de Ca10(PO4)6(OH)2 e Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 produzida em diferentes temperaturas de calcinao Ca10(PO4)6(OH)2 Temperatura (C) Tamanho dos cristalitos (nm) 100 500 800 201 271 341 Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 Temperatura (C) Tamanho dos cristalitos (nm) 100 500 800 251 241 351

4.3 Morfologia do material e determinao da composio de Ca e P

A estrutura e a superfcie das partculas de HAP pura e dopada foram investigadas usando a microscopia eletrnica de varredura (MEV). Atravs das imagens foi possvel perceber a forma e tamanho das partculas. As micrografias da FIG 4.7 mostram com detalhes que a estrutura microscpica da superfcie da HAP assemelha-se com a superfcie do osso humano.

49

(a)

(b)

FIGURA 4.7 (a) MEV da HAP sinttica calcinada a 500 C (b) MEV do osso humano

Para realizao das medidas foi colocada em ultra-som uma suspenso dos nanops em lcool isoproplico com o objetivo de separar os aglomerados. A FIG 4.8 mostra que a morfologia da HAP pura so aglomerados de partculas na escala nanomtrica. Estas micrografias com diferentes aumentos revelam que cada gro micromtrico na verdade um aglomerado. As micrografias da FIG 4.9 esto de acordo com os resultados de XRD, isto , no existe significativa correlao entre o tamanho das nanopartculas e os tempos de maturao. Dos resultados de microscopia eletrnica de varredura foi possvel estimar o tamanho das nanopartculas entre 40-100 nm, como exemplo mostrada a FIG 4.10. Levando em conta os tamanhos dos cristalitos determinados por XRD, podese afirmar que, em mdia, cada nanopartcula composta por um nmero de cristalitos variando entre 2 a 4.

50

FIGURA 4.8 - MEV da Ca10(PO4)6(OH)2 no tempo de maturao de 100 h com diferentes aumentos

51

(a)

(b)

(c)

FIGURA 4.9 MEV da Ca10(PO4)6(OH)2 nos diferentes tempos de maturao: (a) 50 h, (b) 100 h, (c) 150 h

52

FIGURA 4.10 Micrografia com tamanho estimado de nanopartculas da HAP entre 40-100 nm

Observao microscpica revelou que o Cr3+ interfere no crescimento das partculas da HAP tornando-as longas, irregulares e finas, como pode ser visto na FIG 4.11. WAKAMURA et al.[62] obtiveram resultados semelhantes e observaram que um aumento nas concentraes de Cr3+ torna as partculas mais longas e retangulares.

(a) (a) Pura (b) Dopada com Cr3+

(b)

FIGURA 4.11 Micrografias da HAP em tempo de maturao de 100 h

53 Como relatado no captulo II a razo molar Ca/P uma das formas utilizadas para caracterizar a composio dos diferentes fosfatos de clcio, principalmente as apatitas que podem apresentar diferentes composies. A determinao da composio de Ca e P das amostras de HAP pura e dopada resultaram todos em valores superiores para os de Ca e inferiores para os de P, o que fez com que os nmeros calculados para a razo Ca/P fossem maiores que os tericos. Os resultados em termos de razo Ca/P, (Ca+Cr)/P e tambm em termos do percentual de tomos nas amostras, so apresentados nas Tabelas 4.3, 4.4 e 4.5.

TABELA 4.3 - Composio de Ca e P em termos de tomos % na Ca10(PO4)6(OH)2 Tempo de maturao da HAP pura (h) 50 100 150 62,5 62,5 62,5 65,850,43 66,120,39 65,890,39 37,5 37,5 37,5 34,150,24 33,880,21 34,110,21 %Ca terico %Ca experimental %P terico %P experimental

TABELA 4.4 - Composio de Ca, P e Cr em termos de tomos % na Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 Tempo de maturao da HAP dopada (h) 50 100 150 56,5 56,5 56,5 63,300,40 62,870,39 63,610,43 37,5 37,5 37,5 33,130,23 32,850,21 33,270,24 6,00 6,00 6,00 3,570,21 4,280,20 3,110,40 %Ca terico %Ca exp. %P terico %P exp. %Cr terico %Cr exp.

54 Tabela 4.5 - Razo molar Ca/P e (Ca+Cr)/P

Ca10(PO4)6(OH)2 Tempo de maturao (h) 50 100 150 Ca/P terico 1,67 1,67 1,67 Ca/P experimental 1,930,02 1,950,02 1,930,02

Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 Tempo de maturao (h) 50 100 150 (Ca+Cr)/P terico 1,67 1,67 1,67 (Ca+Cr)/P experimental 2,020,12 2,040,10 2,000,26

Os estudos de MIYAKE, et al.[77] mostram que nas hidroxiapatitas sintticas, similares a ossos e dentes, os ons carbonato localizam-se em canais e ocupam os mesmos stios dos ons fosfato numa razo de 10:1. A substituio de um grupo fosfato da clula unitria da HAP por um grupo carbonato, faz com que a razo molar Ca/P suba de 1,67 para 2,00. Como o material foi produzido em atmosfera aberta e em soluo aquosa, provvel que tenha havido a incorporao de CO32- proveniente do ar e isto explicaria o desvio da estequiometria da amostra sem no entanto haver modificaes estruturais perceptveis no padro de difrao. O CO2 do ar pode ser incorporado a qualquer soluo aquosa atravs da reao com ons hidroxila OH- livres na soluo formando o cido carbnico H2CO3. Os grupos carbonatos no alteram a cristalinidade da hidroxiapatita, mas pode acelerar processos de dissoluo da estrutura, o que verificado nos processos de reabsoro ssea[7]. Valores entre 1,67 e 2,00 tambm podem ser encontrados caso ocorra deficincia de clcio, seja por vacncia ou por substituio de Ca2+ por outro on[78]. Como visto no captulo II, a substituio de Ca2+ por Cr3+ leva a um aumento da relao (Ca+Cr)/P e isto tambm pode estar ocorrendo simultaneamente incorporao do on carbonato nas amostras dopadas produzidas neste trabalho.

55 4.4 Estabilidade trmica da HAP

O objetivo das anlises de DTA e TG foi determinar as condies timas de temperatura para calcinao dos ps precipitados obtidos, bem como conhecer o comportamento trmico da HAP pura e dopada. A FIG 4.12 apresenta as curvas de TG, DTG e DTA de amostra pura calcinada a 500 C. Na seo 4.2 as anlises de difratometria de raios-X mostraram que na temperatura de 100 C h formao de HAP pouco cristalina. Estes resultados conferem com a curva de DTA, pois entre 177 C e 212 C pode-se ver uma pequena banda exotrmica, atribuda a HAP de baixa cristalinidade. O grfico da derivada da curva termogravimtrica em funo da temperatura (DTG) mostra que a partir de 100 C a taxa de perda de massa praticamente se matem constante, o que equivale perda de cerca de 95,5% da massa inicial da HAP. Desta faixa de temperatura at cerca de 750 C a perda de massa ocorre devido eliminao de gua. Como j era esperado no se obteve picos relativos mudana de fase do material na temperatura de 500 C. Os estudos de XRD mostraram que em 800 C h formao de uma mistura de HAP/CaO. Portanto, a perda de massa a partir de 770 C refere-se decomposio da HAP, que acreditamos ter ocorrido conforme a seguinte reao: Ca10 ( PO4 ) 6 (OH ) 2 Ca10 x ( PO4 ) 6 (OH ) 2 2 x + xCaO + xH 2 O

(4.1)

Na FIG 4.13 podemos observar o comportamento trmico da HAP tratada em estufa a 100 C. Os resultados mostram um aumento na perda de massa em torno de 248 C com relao amostra calcinada. A existncia do processo exotrmico em aproximadamente 230 C indica uma cristalizao da HAP provavelmente a partir de fases amorfas presentes na amostra. Este resultado esta de acordo com os resultados de XRD que demonstraram um melhor grau de cristalinidade de amostras que foram calcinadas a 500 C em relao quelas que s foram mantidas em estufa a 100 C, portanto, abaixo da temperatura do pico exotrmico.

56

100

0,07 0,06

99

98

0,04 0,03

m (%)

97 0,02 96 0,01 0,00 95 200 400 600 800

Temperatura (C)
1,0

EXO

0,8

0,6

T ( C)

0,4

ENDO

0,2

0,0

-0,2 200 400 600 800

Temperatura (C)

FIGURA 4.12 Curvas de DTA, TG e DTG da Ca10(PO4)6(OH)2 calcinada a 500 C

dm/dt (%)

Temperatura da calcinao

0,05

57

100

0,10

98 0,08 96 0,06

m (%)

94

92

0,04

90 0,02 88

86 200 400 600 800

0,00

Temperatura (C)

1,0

EXO

0,8

0,6

T (C)

0,4

ENDO

0,2

0,0

-0,2 200 400 600 800

Temperatura (C)

FIGURA 4.13 Curvas de DTA, TG e DTG da Ca10(PO4)6(OH)2 tratada em estufa a 100 C

HAP dopada com Cr3+ e calcinada a 500 C tem boa estabilidade trmica, de acordo com a FIG 4.14. A cristalinidade do material no alterada em funo da temperatura, considerando-se a ausncia do pico exotrmico. A perda de massa a partir de 750 C decorre da formao de uma nova fase. Os resultados de XRD mostraram que as amostras dopadas com Cr3+ calcinada a 800 C so constitudas de HAP/TCP. A transformao da HAP em TCP pode se dar de acordo com a reao abaixo: Ca10 x Crx ( PO4 ) 6 (OH ) 2 (1 x)Ca10 Cr ( PO4 ) 6 (OH ) 2 + yCa3 ( PO4 ) 2 + xH 2 O

dm/dt (%)

(4.2)

58

100 99

0,10

0,08 98 97 0,06

m (%)

96 0,04 95 94 93 92 200 400 600 800 0,02

0,00

Temperatura (C)

EXO

T ( C)

-1

ENDO

-2

-3

200

400

600

800

Temperatura (C)

FIGURA 4.14 Curvas de DTA, TG e DTG da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 calcinada a 500 C

A FIG 4.15 mostra o comportamento trmico da HAP dopada e tratada em estufa a 100 C. Na Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 tratada a 100 C aparentemente a eliminao de molculas de gua maior do que a Ca10(PO4)6(OH)2 nas mesmas condies de preparao. Tambm possvel notar que o pico exotrmico que est associado com a cristalizao da HAP menor neste caso do que no caso da amostra pura tratada nas mesmas condies. Este resultado est de acordo com os resultados de difrao de raios-X que demonstraram que nas amostras dopadas os picos so mais estreitos e intensos que das amostras puras, indicando um maior grau de cristalinidade.

dm/dt (%)

59

100

0,25

96

0,20

92

m (%)

88 0,10 84 0,05

80

76

0,00

200

400

600

800

Temperatura (C)

EXO

T (C)

-1

ENDO

-2

-3

200

400

600

800

Temperatura (C)

FIGURA 4.15 Curvas de DTA, TG e DTG da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 tratada em estufa a 100 C

Com estes resultados foi possvel concluir que a melhor temperatura para calcinao da HAP em fase nica est entre 400 C e 530 C.

4.5 Absoro ptica da HAP dopada com Cr3+

A incorporao de ons de metais de transio que possam apresentar alguma atividade ptica tanto na HAP quanto em outros biomateriais interessante tendo em vista a aplicao potencial como marcadores fluorescentes e biosensores. Uma aplicao possvel na odontologia, onde a HAP marcada com um on

dm/dt (%)

0,15

60 fluorescente pode ser usado para acompanhar a re-incorporao ou integrao do biomaterial. Dopantes catinicos como o Cr3+ tendem a substituir o Ca2+ nos cristais de HAP. Como a estrutura da HAP possui dois stios octadricos no equivalentes e distorcidos para o Ca2+, espera-se que o espectro de absoro e de emisso do Cr3+ apresente pelo menos dois conjuntos de sinais associados a este dois stios possveis. A relao da substituio de Ca2+ por ons trivalentes deve ser de 3:2, isto , de 1.5[79]. A FIG 4.16 apresenta os espectros de absoro ptica da HAP pura (Ca10(PO4)6(OH)2) e da HAP dopada (Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2). As medidas foram feitas com uma suspenso dos nanops em gua ultra-pura dentro e cubetas especiais de quartzo, para que fosse possvel observar as transies na regio do UV prximo. O etanol tambm foi testado como veculo mas as bandas de absoro ptica, apesar de equivalentes foram mais pronunciadas em gua ultra-pura. Por este motivo sero apresentadas apenas as medidas feitas neste ltimo lquido. Pode-se observar nitidamente no espectro da amostra pura uma absoro praticamente plana em toda regio do espectro visvel com um forte aumento da absoro na regio do UV devido borda de absoro ptica da HAP. Para ter certeza de que tal efeito no devido cubeta ou ao lquido usado na suspenso, espectros de AO foram medidos nas mesmas condies tanto para as cubetas quanto para a gua ultra-pura e para o etanol. Desta forma foi possvel confirmar que realmente a forte absoro acima de aproximadamente 230 nm devido as nanopartculas de HAP. Usando este valor possvel estimar para a energia de gap das nanopartculas o valor de cerca de 5.3 - 5.4 eV, valor este que concorda com o valor de 5.4 eV obtido por CALDERN e colaboradores via clculos ab initio[80].

61

Ca10(PO4)6(OH)2 Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2

Absorbncia

300

600

900

Comprimento de Onda(nm)

FIGURA 4.16 Espectros de absoro ptica da Ca10(PO4)6(OH)2 e Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 feitas com uma suspenso dos nanops em gua ultra-pura

A FIG 4.16 indica tambm que a amostra de HAP dopada com Cr3+ apresenta bandas de absoro caractersticas do dopante. Estas bandas ficaram mais evidentes ao medir o espectro absoro ptica da HAP dopada em funo da HAP pura, isto , tomando como referncia padro (branco) a amostra pura. Este resultado pode ser visto na FIG 4.17. As caractersticas principais do espectro de absoro ptica da amostra dopada (Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2) so trs bandas largas observadas em 262, 363 e 436 nm. As duas primeiras so bem mais intensas do que a ltima. Alm destas, na regio de 540 at cerca de 1000 nm, aparentemente existe uma banda muito larga e com intensidade muito baixa. Esta regio do espectro no ser analisa em maiores detalhes exatamente porque a intensidade do sinal to fraco que se confunde com o rudo das medidas. J a regio de destaque entre 240 a 550 nm, onde esto presentes as principais absores da amostra dopada, ser analisada a seguir.

62

Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 x Ca10(PO4)6(OH)2
4

Absorbncia

300

400

500

600

700

800

900

1000

Comprimento de Onda(nm)

FIGURA 4.17 Espectro de absoro ptica da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 em funo da Ca10(PO4)6(OH)2

Inicialmente os espectros de absoro ptica em funo do comprimento de onda foram convertidos para absoro em funo da energia ou nmero de onda. Este procedimento foi adotado para que fosse possvel a decomposio do sinal experimental nas bandas de absoro individuais visando determinar a posio exata das absores devidas ao dopante Cr3+. Este procedimento foi adotado para todas as medidas realizadas e na FIG 4.18, apresentado uma curva tpica da HAP dopada com Cr3+. Nota-se na FIG 4.18 que a curva experimental na verdade composta por 6 bandas de absoro. Cada uma das trs bandas principais na verdade composta por duas absores. Vrias tentativas foram feitas em ajustar de 3 a 6 bandas com perfil Gaussiano aos dados experimentais e o ajuste que melhor reproduz os resultados o representado na deconvoluo da FIG 4.18. Este procedimento foi repetido para todas as medidas e em todos os casos, o ajuste com 6 bandas foi o que produziu o melhor ajuste. Na tabela 4.6 so apresentados os resultados obtidos para os parmetros ajustados, quais sejam, posio de cada uma das bandas em energia ou nmero de onda (Ei ou i), largura a meia altura das bandas (wi) e rea sob cada uma das bandas (Ai). Para o caso apresentado na tabela, a qualidade do ajuste pode ser avaliada olhando o valor do 2red e o coeficiente de correlao cujos valores so 1x10-4 e

63 0.99976, respectivamente, indicando que o ajuste do modelo aos dados experimentais muito bom.

TABELA 4.6 - Resultados obtidos para os parmetros ajustados com perfil Gaussiano referente s bandas de absoro ptica mostradas na figura 4.17 Banda 1 2 3 4 5 6 Ei (eV) 2.750.14 2.900.02 3.350.02 3.610.03 4.580.24 5.040.83 i (x103cm-1) 221 231 271 291 371 411 wi (eV) 0.290.13 0.180.07 0.340.01 0.350.02 0.650.24 0.820.37 Ai (u.a.) 0.050.05 0.020.04 0.720.10 0.500.11 1.440.52 1.390.55

20000

25000

30000

/ cm 35000

-1

40000

2,5

Densidade ptica / Unidades Arbitrrias

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

E / eV

FIGURA 4.18 Espectro de absoro ptica da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 em funo da energia do fton. As linhas tracejadas indicam as bandas que compe o espectro formando pela linha contnua em vermelho.

64 Na estrutura da HAP existem 2 stios de Ca2+ no equivalentes, CaI e CaII. Desta forma, devero existir dois tipos simetricamente no equivalentes de ons de Cr3+ na HAP dopada, CrI e CrII. Ambos os stios tem coordenao 6, e formando octaedros distorcidos, mas, em cada um deles, as distncias e os ngulos do on central de Cr com os ligantes O2-, so diferentes. Desta forma, o campo cristalino em cada um destes stios diferente o que ocasionar diferentes deslocamentos e desdobramentos dos nveis atmicos do Cr3+. Este efeito explica a existncia de duas bandas superpostas e prximas em cada uma das 2 absores principais associadas ao Cr3+ na HAP. Usando o diagrama de Tanabe-Sugano para ons d3 em coordenao octadrica, conforme descrito no captulo II, possvel identificar os nveis de energia correspondentes a cada uma das transies principais observadas no espectro da AO da HAP dopada com Cr3+. O nvel fundamental de ons d3 sempre o estado 4A2(F). O espectro em coordenao octadrica perfeita normalmente composto por trs transies principais permitidas pela regra do spin, dadas por: 4A2g 4T2g(F), 4A2g(F)
4

T1g(F) e 4A2g(F) 4T1g(P), correspondendo s absores centradas em 1, 2 e 3,

respectivamente. Numa coordenao octadrica distorcida o g deve ser removido da nomenclatura do nvel. A posio em nmero de onda da absoro de menor energia 1 define o parmetro de campo cristalino (ou 10Dq) e da combinao de 1 e 2, pode-se obter o valor de B atravs da relao:[51,53]

( 2 B=

2 1

+ 2 31 2 2

(15 2 271 )

(4.3)

No caso da HAP:Cr3+, as bandas associadas s transies permitidas por spin devem ser as de maior intensidade, portanto, as bandas em 262 e 363 nm. Estas bandas so na verdade compostas por duas bandas associadas com os dois stios possveis para o Cr3+. Os valores de =10Dq e B para cada um dos dois stios possveis para o Cr3+ e os valores de 1 e 2, esto na tabela 4.7.

65 TABELA 4.7 - Valores dos parmetros de campo cristalino e da primeira e segunda transies permitidas por spin para ambos os stios do Cr3+ na HAP Parmetros (cm-1) 1 2 Dq B Dq/B CrI 26970 36878 2697 974.3 2.8 CrII 29098 40661 2910 1163 2.5

A associao das bandas com as transies permitidas pela regra do spin mostrada na tabela 4.8. Os valores experimentais foram obtidos usando os valores obtidos na tabela 4.7 e o diagrama de Tanabe-Sugano apresentado na FIG 4.19. A transio 4A2g(F) 4T1g(P) no observada no espectro pois, conforme previsto pela simulao, ela se localiza na regio de energias maior do que a energia de gap do material para ambos os stios de Cr3+. O mesmo fenmeno ocorre com as transies proibidas pela regra de spin com comprimentos de onda acima de 230 nm, ou seja, as transies do estado fundamental para os estados 2A1(G), 2T2(H), 2E(H), 2T1(H) e
2

T2(D). As simulaes indicam que a transio

4

A2g(F)

T2(G) deve estar

localizada em 322 nm, para o CrI, e em 273 nm, para o CrII. Estas bandas no so observadas nos espectros de AO pois estariam superpostas s bandas principais e, portanto, muito mais intensas, das transies permitidas por spin. As simulaes tambm indicam que as transies proibidas para os nveis
2 2

T1(G) e E(G) tanto para o CrI quanto para o CrII devem estar separadas por uma

distncia da ordem de 20 nm. Observa-se no espectro de AO da amostra dopada a existncia de uma banda larga em cerca de 436 nm que, como mostrado na FIG 4.17, tambm composta por duas bandas localizadas em aproximadamente 451 e 429 nm. Estas bandas so relativamente largas, com largura a meia altura de 97 e 53 nm, respectivamente. Considerando a intensidade cerca de 10 vezes menor destas bandas em relao s absores principais, estas duas bandas so atribudas s transies proibidas por spin do estado fundamental para os nveis 2T1(G) e 2E(G). Como elas so mais largas do que a diferena prevista para as transies destes dois nveis, no

66 possvel separ-las experimentalmente. Desta forma, na tabela 4.8, elas so indicadas para as duas transies em questo. Observa-se uma diferena para menor da ordem de 30 nm dos valores experimentais em ambos os stios de Cr3+, em relao ao que seria esperado pela posio das bandas obtidas pela simulao. Esta diferena da ordem de 7% aceitvel levando em conta que as bandas experimentais so bem menos intensas do que as duas absores principais da HAP:Cr3+. Devido a esta relao de intensidades, a determinao experimental destas bandas das transies proibidas por spin menos precisa.

TABELA 4.8 - Posio em comprimento de onda das transies permitidas e proibidas por spin para os dois stios possveis de Cr3+ na HAP, comparadas com os valores obtidos dos espectros de AO da amostra dopada. Transio Exp
4 4 4

CrI Calc Exp

CrII Calc

Transies permitidas por spin T2(F) T1(F) 371 271 371 271 171 344 246 344 246 156

T1(P)

Transies proibidas por spin

2

T1(G) E(G)

2 2 2

451 -

471 490 322 227 212 200 183 162

429 -

396 413 273 202 188 177 161 142

T2(G)

A1(G) T2(H) E(H)

2 2 2

T1(H) T2(D)

67

(a)

(b) FIGURA 4.19 - Diagramas de Tanabe-Sugano para o CrI (a) e CrII (b) obtidos a partir dos dados da tabela 4.7. As linhas cheias verticais indicam a posio de cada um dos tipos de Cr3+ de acordo com a razo /B[81] CHANDRASEKHAR et al.[82] estudaram o espectro de absoro nos vidros de fosfato de sdio dopados com Cr3+ encontraram as 3 absores principais em 288, 450 e 660 nm. Neste sistema os autores obtiveram uma valor de B=755 cm-1 com uma razo Dq/B2. No sistema ZnNH4PO4.6H2O RAVIKUMAR et al.[59] identificaram as duas primeiras absores principais permitidas por spin, a primeira em 597 e 426 nm, obtendo um valor de B=675 cm-1 e razo Dq/B=2.48. Neste caso, a distncia esperada entre o on central de Cr3+ e os ligantes O2- de aproximadamente 2.1[83], 12% inferior

68 a distncia mdia Cr3+-O2- na HAP (vide captulo II). Neste caso, RAVIKUMAR e colaboradores tambm encontraram que o stio octadrico do Cr3+ apresenta distoro.

4.6- Fluorescncia da HAP dopada com Cr3+

A possibilidade de uso da HAP dopada como sonda fluorescente ou biosensor esta intimamente ligada com as propriedades fluorescentes que o material apresente. sempre possvel fazer uma correlao entre os espectros de fluorescncia com os espectros de absoro ptica. A fluorescncia ocorre quando a luz aplicada gera espcies qumicas no estado excitado. Quando o on de Cr3+ presente na hidroxiapatita excitado, toda a rede sente a mudana e uma nova posio de equilbrio para o sistema atingida. A rede sente a modificao devido s interaes do Cr3+ excitado com os seus vizinhos via o campo cristalino. Por outro lado, o campo cristalino modifica os estados eletrnicos do Cr3+ na HAP em relao ao on livre. Na FIG 4.20 apresentado e espectro de fluorescncia simultneo de emisso e excitao e na FIG 4.21 o grfico de curvas de nvel associado. Podemos verificar um mximo na fluorescncia em torno de 455 nm quando a excitao em torno de 280 nm, mudando continuamente para um mximo de emisso em torno de 465 nm, quando a excitao varia para 290 nm. As excitaes em 280 e 290 nm so correspondentes s absores correspondentes a transio 4A2(F) 4T1(F). Quando a excitao em 280 nm, tanto os CrI quanto os CrII so excitados (correspondendo as bandas de absoro em 271 e 246 nm). Quando a excitao se desloca para 290 nm, a excitao dos ons de CrI passa a ser mais intensa. A fluorescncia que ocorre em na regio de 460 nm pode ser interpretada ento como a emisso do nvel 4T2(F) e o deslocamento de 455 para 465 nm est relacionado com o fato de termos dois tipos de Cr3+ na estrutura da HAP que esto sendo excitados diferentemente quando a excitao varia de 280 para 290 nm. Desta forma, os resultados indicam um deslocamento de Stokes da ordem de 100 nm para os dois tipos de Cr3+.

69

FIGURA 4.20 Espectro de emisso-excitao da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 na regio espectral de emisso da transio 4T2(F) 4A2

FIGURA 4.21 Curvas de nvel do espectro de emisso-excitao da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 na regio espectral de emisso da transio 4T2(F) 4A2

70 A maior emisso fluorescente da HAP dopada com Cr3+, no entanto, est localizado em cerca de 320 nm, quando a amostra excitada com luz UV em 242 nm, bem prximo da energia de gap do material. Na FIG 4.22 apresentado o espectro de fluorescncia nesta regio. Nota-se, primeiramente que a intensidade do sinal pelo menos 10 vezes maior do que a fluorescncia da amostra na regio da transio
4

T2(F) 4A2. A emisso mais larga na regio de altos comprimentos de onda,

indicando a existncia de mais de uma banda superposta. De fato, a anlise cuidadosa dos dados indicou a existncia de duas bandas centradas em 319 e 345 nm que compatvel com a existncia de dois tipos de Cr3+ na estrutura da HAP. A excitao em 242 nm bem prxima do mximo de absoro do CrII em 246 nm o que permite afirmar que a maior parte dos ftons da luz incidente deve ter excitado os nveis 4T1(F) do CrII gerando a emisso deste nvel em 319 nm quando decai de volta para o estado fundamental. Uma pequena parte da luz incidente pode excitar tambm o nvel 4T1(F) do CrI, j que o feixe de excitao possui uma largura de feixe definida pela combinao monocromador mais fenda de excitao. O decaimento do nvel 4T1(F) dos ons de CrI para o estado fundamental gerou ento a fluorescncia com mximo em 345 nm. Comparando os mximos das bandas de absoro ptica para este nvel e os mximos de emisso fluorescente pode-se concluir que o nvel 4T1(F) apresenta um deslocamento Stokes de cerca de 74 nm para ambos os stios de Cr3+.

Intensidade da Emisso(counts)

50000
Excitao=242nm

40000

30000

20000

10000 300 320 340 360 380

Comprimento de Onda de Emisso(nm)

FIGURA 4.22 Espectro de emisso da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 correspondente a transio 4T1(F) 4A2

71 Os resultados de fluorescncia combinados com o de absoro ptica permitem afirmar que a HAP dopada com Cr3+ tem aplicao potencial como sonda ou marcador fluorescente em aplicao mdicas e biolgicas e a fluorescncia caracterstica dos ons de Cr3+ na matriz da HAP suficientemente diferente da emisso em outros ambientes (soluo ou outras matrizes cristalinas) de forma a permitir uma distino clara da origem do sinal fluorescente.

CAPTULO V

CONCLUSES
Neste captulo so apresentadas as concluses, abordando as contribuies do presente trabalho dentro dos objetivos propostos. No final do captulo discutida a continuidade do estudo com propostas de futuros trabalhos.

73 CAPTULO V CONCLUSES

5.1 Concluses

A metodologia proposta para a produo de hidroxiapatita nanomtrica mostrou-se simples, de baixo custo e eficiente tanto na produo de hidroxiapatita pura (Ca10(PO4)6(OH)2) quanto dopada (Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2). Os materiais obtidos foram caracterizados por difrao de raios-X, anlise trmica, energia dispersiva de raios-X, microscopia eletrnica de varredura, absoro ptica e espectroscopia de fluorescncia. Pelas curvas de anlise trmica foi possvel descobrir que a melhor temperatura para calcinao da HAP est entre 400 C e 530 C. Amostras tratadas a 100 C possuem mais molculas de gua na sua estrutura que o material calcinado a 500 C, portanto no primeiro caso ocorre maior perda de massa. Acima de 770 C ocorre a formao de CaO na amostra pura. A HAP contendo ons de Cr3+ tambm estvel, isto , a perda de massa proveniente da eliminao de gua at cerca de 750 C quando ocorre a formao da fase TCP. Como j era previsto, observou-se coerncia entre os resultados de XRD e anlise trmica, quanto formao de nova fase para amostras puras e dopadas quando receberam tratamento trmico acima de 750 C. A difratometria de raios-X revelou a formao de HAP pouco cristalina com tratamentos trmicos a 100 C. Aps calcinao a 800 C, o padro de difrao de raios-X resultou em uma mistura de HAP/CaO para as amostras puras e HAP/TCP para as amostras dopadas. J a calcinao feita a 500 C produziu amostras de boa qualidade cristalogrfica ausentes de fases adicionais alm da HAP tanto para a amostra pura quanto para a amostra dopada com Cr3+. Os resultados mostram que variaes no tempo de maturao na preparao das amostras, ou seja, o tempo no qual o material j reagido fica armazenado a temperatura ambiente, no alterou o grau de cristalinidade das amostras, ao menos pelo mtodo utilizado nesse estudo. O aumento no tamanho dos cristalitos com relao ao tempo de maturao pequeno e ocorre de acordo com a seguinte ordem: 150h < 50h < 100h. Sendo que os

74 tamanhos dos cristalitos das amostras puras variam (23 251)nm e os dopados de (26 281)nm. O aumento na temperatura de calcinao, por sua vez, favoreceu o crescimento dos cristalitos nas amostras de Ca10(PO4)6(OH)2, chegando a (341)nm, enquanto para a Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 um aumento de 100 C para 500 C provocou uma pequena reduo no tamanho do cristalito. As amostras dopadas calcinadas a 800 C atingiram (351)nm. Os aspectos morfolgicos da HAP foram estudados atravs da microscopia eletrnica de varredura. Os resultados apontam para a formao de aglomerados micromtrico e heterogneos constitudos de nanopartculas. As micrografias tambm mostram que as partculas formadas nas amostras puras so ligeiramente menores e esfricas que as de HAP com Cr3+. O tamanho das nanopartculas produzidas foi estimado em 40 100 nm. Considerando os tamanhos dos cristalitos determinados por XRD, pode-se afirmar que, em mdia, cada nanopartcula composta por um nmero de cristalitos variando entre 2 a 4. A relao Ca/P da Ca10(PO4)6(OH)2 em mdia foi de 1,94, sugerindo um desvio de estequiometria que pode ter origem na incorporao de grupos carbonatos proveniente do ar. A Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 mostrou uma relao (Ca+Cr)/P em mdia de 2,02. Isto porque a substituio de Ca2+ por Cr3+ leva a um aumento da relao (Ca+Cr)/P e tambm pode estar ocorrendo simultaneamente a incorporao do on carbonato. O sucesso deste trabalho depende fortemente da incorporao de Cr3+ na matriz da HAP, por esta razo utilizou-se das tcnicas de fluorescncia e absoro ptica para identificar as transies eletrnicas do material. O primeiro resultado satisfatrio encontrado foi a garantia da incorporao dos ons de cromo na forma trivalente (transies tpicas de ons d3), pois a incorporao do cromo hexavalente impossibilitaria a aplicao do material in vivo, visto que o cromo na forma hexavalente altamente txico. Num segundo momento identificou-se todas as transies da amostra dopada (Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2). As caractersticas principais do espectro de absoro ptica da Ca10-xCrx(PO4)6(OH)2 so trs bandas largas observadas em 262, 363 e 436 nm. As duas primeiras so bem mais intensas do que a ltima e cada uma delas composta por duas absores. As duas bandas superpostas e prximas em cada uma das duas absores principais associadas ao Cr3+ na HAP so devido existncia de

75 dois tipos simetricamente no equivalentes de ons de Cr3+ (CrI e CrII), que faz com que o campo cristalino em cada um destes stios seja diferente, ocasionando deslocamentos e desdobramentos dos nveis atmicos do Cr3+. Observou-se no espectro de absoro ptica duas das transies principais permitidas pela regra do spin, dadas por:
4

A2

T2(F) e

A2(F)

T1(F)

correspondendo s absores do CrI centradas em 371 e 271 nm respectivamente e as do CrII em 344 e 246 nm respectivamente. A transio 4A2(F) 4T1(P) no observada no espectro, pois conforme previsto pela simulao, ela se localiza na regio de energias maior do que a energia de gap do material para ambos os stios de Cr3+. O mesmo fenmeno ocorre com as transies proibidas do estado fundamental para os estados 2A1(G), 2T2(H), 2E(H), 2T1(H) e 2T2(D). As bandas em 451 e 429 nm so atribudas s transies proibidas por spin do estado fundamental para os nveis 2T1(G) e 2E(G). As anlises de fluorescncia mostraram que excitaes em 280 e 290 nm correspondem s absores correspondentes a transio 4A2(F) 4T1(F). Quando a excitao em 280 nm, tanto os CrI quanto os CrII so excitados (correspondendo as bandas de absoro em 271 e 246 nm. A fluorescncia que ocorre na regio de 460 nm referente a emisso do nvel 4T2(F). A maior emisso fluorescente da HAP dopada com Cr3+, est localizado em cerca de 320 nm, quando a amostra excitada com luz UV em 242 nm, bem prximo da energia de gap do material, correspondendo a transio 4T1(F) 4A2. Com os resultados obtidos conclumos que a metodologia utilizada eficaz na obteno de nano partculas de HAP pura e dopada com Cr3+. Alm disso, os resultados de fluorescncia combinados com o de absoro ptica permitiram identificar os sinais fluorescentes do Cr3+ na matriz da HAP, fazendo com que o material tenha aplicao potencial como sonda ou marcador fluorescente em aplicao mdicas e biolgicas.

5.2 Sugestes para futuros trabalhos

Produzir hidroxiapatita com a presena intencional de grupos carbonatos e assegurar a sua incorporao atravs da tcnica de espectroscopia de infravermelho talvez seja um passo importante na produo de hidroxiapatita sinttica. Acreditamos

76 que a incorporao de carbonatos favorea o processo de reabsoro da hidroxiapatita sinttica pelo tecido humano, visto que a hidroxiapatita do osso apresenta em sua estrutura grupos carbonatos. interessante testar outros ons como dopante a fim de verificar a eficincia da fluorescncia e adaptar a metodologia de forma que seja possvel produzir outros fosfatos, que tenham aplicaes mdicas. Inmeros fatores devem ser examinados antes que um material possa ser utilizado como implante. Uma das primeiras etapas de avaliao do material biomdico a avaliao biolgica in vitro, afim de se estudar o comportamento do material em uma soluo que simule o fluido biolgico, atravs de medidas eletroqumicas de potencial desenvolvido na interface do material com o fluido. Tambm importante realizar testes de citotoxicidade, onde o biomaterial colocado em contato com clulas de mamferos de uma maneira direta ou indireta. Observa-se o nvel de letalidade das clulas que define se o material ou no citotxico. A seguir, testes in vivo se fazem necessrios, para a avaliao do material em termos de biocompatibilidade, definida como a resposta do meio fisiolgico ao corpo implantado. Uma etapa posterior seria verificar a adequao do material em exercer a funo pr-estabelecida qual o implante foi destinado, determinando sua funcionalidade como um biosensor. Testes mais prolongados podero ainda revelar se h chances de respostas carcinognicas ao longo dos anos.

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