ESTUDO COMPARATIVO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAO DE PROTENAS EM ESGOTOS BRUTOS E TRATADOS

Patrcia Procpio Pontes* Engenheira Qumica, Mestre em Saneamento e Meio Ambiente, Doutoranda em Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hdricos pela UFMG, Professora do Centro Federal de Educao Tecnolgica de Minas Gerais, Coordenao de Qumica Carlos Augusto de Lemos Chernicharo Professor adjunto do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental da Universidade Federal de Minas Gerais Marco Tlio Rocha Porto Mestrando do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental da Universidade Federal de Minas Gerais Endereo (*): Av. do Contorno, 842/701 Belo Horizonte MG Brasil - CEP 30110-060 Tel: (55-31) 32381020 Fax : (55-31) 3238-1879 E-mail: calemos@ desa.ufmg.br RESUMO O presente trabalho objetivou o estudo comparativo de metodologias para a determinao de protenas em esgotos sanitrios. Foram analisadas amostras de esgoto bruto e de efluentes tratados, pelos mtodos do Micro-biureto, de Lowry e de Bradford. Realizou-se, ainda, uma comparao entre esses mtodos e o mtodo Kjeldahl. A anlise dos resultados obtidos indica a obteno de teores de protenas mais elevados atravs do mtodo do Micro-biureto em relao aos outros mtodos. Os resultados do mtodo de Lowry foram os mais prximos do mtodo Kjeldahl, enquanto o mtodo de Bradford pareceu apresentar uma tendncia em subestimar o teor de protenas nas amostras. Atravs do clculo da DQOequivalente da amostra, a partir da sua concentrao em termos de lipdios, carboidratos e protenas, pde-se observar que o mtodo de Lowry e o mtodo Kjeldahl propiciaram uma melhor estimativa da DQOfiltrada das amostras. O mtodo do Micro-biureto apresentou valores muito elevados para a estimativa da DQOfiltrada. Palavras-chave: Determinao de protenas, mtodo de Bradford, mtodo de Lowry, mtodo do Micro-biureto, mtodo Kjeldahl. INTRODUO A determinao de material orgnico em guas residurias realizada atravs de mtodos indiretos, pelas anlises de Demanda qumica de oxignio (DQO) e Demanda Bioqumica de Oxignio (DBO). Quando se deseja um maior conhecimento sobre o tipo de composto orgnico presente, outros mtodos de anlise tornam-se necessrios. O mtodo mais utilizado para anlise de protenas em guas residurias o Mtodo Kjeldahl. Inmeros mtodos so citados na literatura especializada para a anlise de protenas, sendo mais comuns os mtodos do Micro-biureto, de Lowry e de Bradford. Esses mtodos apresentam como vantagens a rapidez e economia na realizao das anlises, entretanto, deve-se ter cuidado em relao presena de compostos que causem interferncias nos resultados. O mtodo de Lowry, ou mtodo do folin-fenol, o mtodo mais utilizado pelos pesquisadores, devido sua simplicidade, preciso e sensibilidade. Entretanto, pode apresentar resultados diferentes para diferentes protenas. O mtodo de Bradford tem apresentado um aumento de popularidade nos ltimos anos, como resultado de sua simplicidade e falta de interferncia de reagentes laboratoriais, que geralmente afetam os outros mtodos, entretanto pode, tambm, apresentar diferentes resultados em funo do tipo de protena presente. Quando se utiliza uma mistura com diferentes protenas, os erros produzidos como conseqncia desse problema so reduzidos. O mtodo do Micro-biureto tem como vantagem, em relao a esses mtodos, o fato de seu resultado ser independente do tipo de protena presente, entretanto tem uma menor sensibilidade em relao aos outros mtodos colorimtricos e a turbidez da amostra pode causar grande interferncia no resultado.

A escolha do mtodo para anlise de protenas e o padro utilizado pode, em casos extremos, provocar inconsistncia entre os resultados. Recomenda-se o uso do mtodo de Lowry como mtodo de escolha para usos gerais para se obter uma maior consistncia entre os laboratrios. Raunjaer et al. (1994) sugere o uso do mtodo de Lowry para a anlise de protenas em guas residurias. De acordo com os pesquisadores, embora o mtodo de Lowry possa fornecer valores mais elevados de protenas quando compostos interferentes estiverem presentes, a presena desse tipo de compostos interferentes no foi observada em guas residurias. Os pesquisadores no avaliaram o uso do mtodo em efluentes tratados. O presente trabalho objetivou o estudo comparativo entre os mtodos do Micro-biureto, de Lowry e de Bradford para a anlise de protenas em esgotos sanitrios. Realizou-se, ainda, uma comparao desses mtodos com o mtodo Kjeldahl e um clculo da DQOequivalente da amostra, a partir da sua concentrao em termos de lipdios, carboidratos e protenas, para comparao com a DQOfiltrada obtida para a amostra. MATERIAL E MTODOS Descrio do aparato experimental Para avaliao do uso dos mtodos de anlise de protenas em esgotos sanitrios e efluentes tratados, foi realizado o monitoramento de um sistema de tratamento de esgotos sanitrios que consistiu de um reator UASB, em escala piloto, seguido de um filtro biolgico percolador (FBP), utilizado para o ps-tratamento do efluente anaerbio. O sistema reator UASB/FBP foi alimentado com esgoto sanitrio retirado diretamente do interceptor da margem direita do ribeiro Arrudas, na cidade de Belo Horizonte - Brasil. Os esgotos passavam, inicialmente, por unidades de tratamento preliminar (cesto perfurado e caixa de areia) e por um tanque de acumulao/distribuio, localizados a montante do reator UASB. Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratrio de Instalaes Piloto LIP do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental da Universidade Federal de Minas Gerais. Monitoramento do sistema Durante o monitoramento das unidades piloto, foram realizadas anlises do esgoto bruto, do efluente do reator UASB e do efluente final do decantador secundrio do FBP. Os parmetros analisados foram: DBO (total e filtrada), DQO (total e filtrada), Slidos Suspensos Totais, alcalinidade, cidos graxos volteis, pH, e temperatura. Foram realizadas amostragens compostas, sendo as anlises desenvolvidas segundo o Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (AWWA/APHA/WEF, 1998). Complementarmente, e para efeito de comparao, foram realizadas anlises de protenas, pelos mtodos de Lowry (Lowry, et al., 1951), de Bradford (Bradford, 1976) e do Micro-biureto modificado (Itzhaki & Gil, 1964). Uma breve descrio desses mtodos apresentada a seguir. Mtodo do Micro-biureto modificado O mtodo consiste na adio de hidrxido de sdio e sulfato de cobre soluo que contm protenas. O excesso de sulfato de cobre removido por centrifugao. Mede-se a absorbncia do sobrenadante, que apresenta cor violeta, em um espectrofotmetro a 310 nm. A intensidade da cor desenvolvida proporcional quantidade de protenas presente na amostra. Determina-se a concentrao de protenas atravs de uma curva padro previamente construda, por exemplo, para a casena. A determinao de protenas realizada em triplicata, sendo considerada para clculo da concentrao a absorbncia mdia (Blundi & Gadelha, 2001). Mtodo de Lowry O mtodo de Lowry se baseia na reao do cobre com a protena, em meio alcalino, e posteriormente reduo do reagente de fosfomolibdato-fosfotungstenato no reagente folin. Quando o reagente folin adicionado protena tratada com o cobre, ocorre a reduo do reagente folin que resulta em uma cor mais intensa, com absoro mxima em 550 nm. A concentrao de protenas determinada atravs de uma curva padro previamente construda para a soroalbumina bovina e a anlise realizada em triplicata.

Mtodo de Bradford O mtodo de Bradford se baseia na ligao do reagente Coomassie Blue com as protenas. Utiliza-se soroalbumina bovina como padro e realiza-se o teste em triplicata. A leitura da absorbncia realizada em espectrofotmetro a 595 nm.

Determinao da DQO equivalente Para a determinao da DQO correspondente a carboidratos, protenas e lipdios (DQOequivalente.), foram realizadas, tambm, anlises de lipdios (Postma & Stroes, 1968) e carboidratos (Dubois et al., 1956). A partir dos resultados destes constituintes especficos, foram utilizados os seguintes fatores de equivalncia para se estimar a concentrao de DQO filtrada equivalente: carboidratos = 1,1; protenas = 1,5; e lipdeos = 2,9, conforme Miron et al. (2000). RESULTADOS E DISCUSSO Caracterizao das amostras Os resultados mdios obtidos para a caracterizao das amostras, em termos de DQO, DBO e SST, so apresentados na TABELA 1. TABELA 1: Valores mdios obtidos para DBO, DQO e SST das amostras analisadas (N=21) Parmetro Esgoto Bruto Efluente do reator Efluente do Filtro anaerbio Biolgico DBO (mg.L-1) 381 50 68 32 33 6 DQO (mg.L-1) 536 72 160 31 102 19 SST (mg.L-1) 233 70 33 16 23 12 Comparao entre os mtodos Kjeldahl, Lowry, Micro-biureto e Bradford Inicialmente, foram realizados experimentos com os mtodos de Bradford, de Lowry e do Micro-biureto, para a determinao de protenas em esgoto bruto e no efluente do reator anaerbio. Os resultados obtidos so apresentados na TABELA 2 e nas Figuras 1 e 2. TABELA 2: Resumo dos resultados mdios obtidos para a anlise pelos mtodos de Lowry, Bradford e Micro biureto (N=9) Mtodo de anlise Esgoto Bruto Efluente do reator anaerbio Lowry (mg.L-1) 104 3,9 51 12 Bradford (mg.L-1) 24 2,8 12 3 Micro biureto (mg.L-1) 213 8 180 20

250 200

250 200 Conc.(mg/L)

Biureto Lowry Bradford

Conc.(mg/L)

150 100 50 0

150 100 50 0

Biureto

Lowry

Bradford

Figura 1: Comparao entre os mtodos do Microbiureto, de Lowry e Bradford para a anlise de esgoto bruto

Figura 2: Comparao entre os mtodos do Microbiureto, de Lowry e Bradford para a anlise de efluente anaerbio

Observaram-se resultados muito diferentes, obtidos a partir de cada mtodo de anlise utilizado. O mtodo de Bradford foi o que apresentou valores mais baixos e uma pior estimativa do teor de protenas. Por esta razo, os experimentos passaram a ser realizados com os mtodos de Lowry, do Micro-biureto e Kjeldahl. Os resultados mdios obtidos atravs dos mtodos de Lowry, Kjeldahl e Micro-biureto, para as amostras estudadas, so apresentados na TABELA 3 e os resultados da DQOequivalente na TABELA 4. TABELA 3: Resumo dos resultados mdios obtidos para a anlise pelos mtodos de Lowry, Kjeldahl e Micro-biureto (N=12) Mtodo de anlise Esgoto Bruto Efluente do reator Efluente do Filtro anaerbio Biolgico Lowry (mg.L-1) 102 9 69 15 43 1,7 Kjeldahl (mg.L-1) 93 27 49 30 69 40 Micro-biureto (mg.L-1) 222 51 209 47 188 35 TABELA 4: Resumo dos resultados mdios obtidos para a DQOequivalente calculada pelos mtodos de Lowry, Kjeldahl e Micro-biureto (N=12) Mtodo de anlise Esgoto Bruto Efluente do reator Efluente do Filtro anaerbio Biolgico DQO Filtrada (mg.L-1) 256 40 105 34 95 21 DQOeqL(1) (mg.L-1) 232 12 139 35 82 2 DQOeqB(2) (mg.L-1) 411 79 334 67 320 84 DQOeqK(3) (mg.L-1) 189 38 94 45 136 90 (1) DQOeqL: DQOequivalente calculada a partir da anlise de protenas pelo mtodo de Lowry (2) DQOeqB: DQOequivalente calculada a partir da anlise de protenas pelo mtodo do Micro-biureto (3) DQOeqK: DQOequivalente calculada a partir da anlise de protenas pelo mtodo Kjeldahl A partir dos resultados obtidos, realizou-se uma anlise comparativa entre os mtodos, para cada tipo de amostra. Para a amostra de esgoto bruto (EB), a comparao entre os mtodos de anlise apresentada na Figura 3, enquanto a comparao entre a DQOfiltrada do esgoto bruto (DQOF EB) e a DQOequivalente determinada a partir dos mtodos de Lowry (DQOeqL), do Micro-biureto (DQOeqB) e Kjeldahl (DQOeqK) apresentada na Figura 4.

350 300 250 Conc.(mg/L) 200 150 100 50 0 Biureto Lowry Kjeldahl

600 500 400 Conc(mg/L) 300 200 100 0 DQOF EB DQOeqB DQOeqL DQOeqK

Figura 3: Comparao entre os mtodos do Microbiureto, de Lowry e Kjeldahl para a anlise de esgoto bruto

Figura 4: Comparao entre os valores de DQO e DQOequivalente. para a anlise de protenas pelos mtodos do Micro-biureto, de Lowry e Kjeldahl, em esgoto bruto

O mtodo com resultados mais prximos do mtodo Kjeldahl foi o mtodo de Lowry (Figura 3). A DQOequivalente calculada para o esgoto bruto pelo mtodo de Lowry foi um pouco inferior ao valor de DQOfiltrada obtida pelas anlises, enquanto que o valor obtido pelo mtodo do Micro-biureto foi acima do valor de DQO obtido na prtica. O mtodo do Micro-biureto pareceu apresentar uma tendncia em superestimar o teor de protenas nas amostras. A comparao entre os mtodos de Lowry, do Micro-biureto e Kjeldahl, para os efluentes anaerbio e aerbio, apresentada nas Figuras 5 e 7, sendo a comparao do clculo da DQOequivalente., para esses efluentes, com o valor da DQOfiltrada (DQOefl. UASB e DQO FB) apresentada nas Figuras 6 e 8.

300 250 200 150 100 50 0 Biureto Lowry Kjeldahl

450 400 350 Conc.(mg/L) 300 250 200 150 100 50 0 DQOefl.UASB DQOeqB DQOeqL DQOeqK

Conc.(mg/L)

Figura 5: Comparao entre os mtodos do Microbiureto, de Lowry e Kjeldahl para a anlise de efluente anaerbio

Figura 6: Comparao entre os valores de DQO e DQOequivalente. para a anlise de protenas pelos mtodos do Micro-biureto, de Lowry e Kjeldahl, em efluente anaerbio

250 200 Conc(mg/L) Conc(mg/L) Biureto Lowry Kjeldahl 150 100 50 0

500 400 300 200 100 0

DQOFB

DQOeqB

DQOeqL

DQOeqK

Figura 7: Comparao entre os mtodos do Microbiureto, de Lowry e Kjeldahl para a anlise de efluente de filtro biolgico percolador

Figura 8: Comparao entre os valores de DQO e DQOequivalente. para a anlise de protenas pelos mtodos do Micro-biureto, de Lowry e Kjeldahl , em efluente de filtro biolgico percolador

Pela anlise das Figuras 4, 6 e 8, pode-se observar que, para as amostras analisadas, os mtodos Kjeldahl e de Lowry so os mtodos que permitem uma melhor estimativa do valor da DQOfiltrada. Os resultados obtidos pelo mtodo de Lowry foram melhores para o esgoto bruto e para o efluente do filtro biolgico percolador, obtendo-se teores de protenas mais prximos do mtodo Kjeldahl e uma melhor estimativa da DQOequivalente. No efluente do reator anaerbio, o mtodo superestimou um pouco tanto a DQO quanto o teor de protenas. A comparao dos mtodos de Lowry, Kjeldahl e Bradford e o clculo da DQOequivalente indicou que o mtodo de Lowry foi o mais adequado para as amostras analisadas. Os resultados obtidos mostraram que o mtodo de Bradford apresentou uma tendncia em subestimar o teor de protenas nas amostras, enquanto que o mtodo do Micro-biureto apresentou um tendncia em superestimar esses valores. Na presente pesquisa, o mtodo de Lowry foi o que apresentou resultados mais prximos do esperado. Esses resultados so semelhantes aos de Sapan et al. (1999), que apresentaram mtodos para a anlise de protenas em diferentes tipos de amostras. Em seu estudo, Sapan et al. (1999) apresentaram a comparao do teor de protenas obtidos pelos mtodos de Lowry, do Biureto e de Bradford com o teor de protenas obtido por anlise quantitativa de aminocidos que foi considerado o mtodo padro, e tambm observaram a tendncia do mtodo do Biureto em superestimar o teor de protenas enquanto o mtodo de Bradford subestimava esse valor. Os resultados obtidos indicaram, ainda, que as protenas, em relao aos demais compostos orgnicos especficos, foram os principais compostos responsveis pela DQO do esgoto bruto e dos efluentes tratados. Em esgotos brutos, a DQOequivalente das protenas correspondeu, em mdia, a aproximadamente 65% da DQOequivalente total das amostras analisadas, enquanto para os efluentes do reator anaerbio e do filtro biolgico a DQOequivalente mdia correspondeu a 82 e 81% da DQOequivalente total, respectivamente. Todos os mtodos de anlise indicaram essa mesma tendncia. Observou-se, portanto, um aumento na proporo de protenas nas amostras de efluentes tratados em relao ao esgoto bruto, que pode ser explicado pelas menores eficincias de remoo de protenas no sistema de tratamento estudado, em relao a lipdios e carboidratos.

CONCLUSES Dentre os mtodos testados, o mtodo de Lowry parece ser o mais indicado para a determinao de protenas em esgotos sanitrios e em efluentes tratados, pois seus resultados foram os mais prximos do Mtodo Kjeldahl, que considerado o mtodo padro para essa anlise. Observou-se, entretanto, uma tendncia do mtodo em superestimar o teor de protenas e a DQOequivalente. no efluente do reator anaerbio. O mtodo do Micro-biureto apresentou uma tendncia em superestimar o teor de protenas e a DQO das amostras estudadas, enquanto o Mtodo de Bradford apresentou uma tendncia em subestimar esses valores. Para o esgoto bruto e para os efluentes tratados, a estimativa da DQO pelos mtodos Kjeldahl e de Lowry permitiu obter resultados bem prximos daqueles obtidos na prtica. Agradecimentos: Os autores agradecem ao CNPq, pelas bolsas concedidas, e FAPEMIG e FINEP, atravs do PROSAB, pelo financiamento da pesquisa. Agradecem, ainda, bolsista de apoio tcnico Lucilaine Santos, pelo auxlio nas anlises de matria orgnica especfica. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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