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FUNDAO UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS E TECNOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA RAIMUNDO WAGNER

BIOLOGIA MOLECULAR

Relatrio apresentado ao departamento de cincias agrria e tecnolgicas da Universidade Federal do Tocantins, como partes da exigncia do programa de graduao em Engenharia Biotecnolgica.

Mayara Vieira Santos

GURUPI-TO OUTUBRO DE 2011

EXTRAO DE DNA DE CLULAS BACTERIANAS

INTRODUO
O DNA (cido desoxinucleotdeo) uma molcula orgnica que contem a "informao" que instrui o desenvolvimento e funcionamento de todos os organismos vivos. (Ncleo de difuso biotecnolgica, 2011). O uso de protocolos moleculares tem sido extensivamente aplicado em quase todos os ramos da microbiologia e uma de suas etapas cruciais o isolamento efetivo do DNA bacteriano (Forbes BA,2003). Tal isolamento deve ser simples, rpido, reprodutvel e de baixo custo, especialmente quando a anlise de muitas espcies e linhagens se faz necessria (Kaliaet al, 1999). Um ponto a ser discutido em relao complexidade da extrao do DNA a partir de bactrias, estar nas suas paredes celular e suas diferenas. Para cada tipo deve-se ter um protocolo especfico para melhor quantidade da qualidade anlise.

OBJETIVO
O objetivo desta aula foi extrair o DNA plasmidial das clulas bacterianas PCEM Cry4Bae analisa-lo em gel de agarose por eletroforese no laboratrio de pragas da Universidade Federal do Tocantins , campus Gurupi.

PROCEDIMENTOS
1. Preparou-se o gel de agarose para 100mL de soluo por 30s no micro ondas com seguintes constituintes: I. 0,8g de agar; II. 80mL de TBE (5,4 de tris; 2,75g de acido brico; 2mL de EDTA (USP, 2011)); III. 20 mL de gua. 2. Transferiu 1,5 mL da cultura bacteriana PCEM Cry4Ba para um eppendorf de 1,5 mL e centrifugou 10 mim a 14mil rpm. 3. Descartou se o sobrenadante em um frasco contendo gua sanitria (frasco de descarte!). 4. Adicionou-se a soluo de lise homogeneizando com ponta da piteta, dentro dos seguintes padres: I. 150L de tampo de TE ( Tris HCl pH 8,0 10 mM, EDTA 1Mm); II. 150L de tampo de lise (NaOH 0,2 N:: SDS 1%)(1); III. 150L de soluo de neutralizao (Acetato de potssio 3 M pH 4,8-5,3). 5. Agitou-se no vrtex e colocar para descansar em gelo por 5 mim. 6. Acrescentou-se 100L de fenol clorofrmico e agitou novamente no vrtex. 7. Centrifugou-se por 5 mim h 14mil rpm as amostras. 8. Retirou-se a fase aquosa superior para tubos novos e acrescentou 1x volume de isopropanol absoluto seguindo no vrtex reservando em um recipiente com gelo por 2 a 3 horas.
(1)

Preparar uma soluo nova para cada novo procedimento!Aps o uso descartar. Para preparar 10 mL de tampo de lise adicione em 9,3 mL de H2O200 L de NaOH 10N, homogeneizar a soluo e ento adicionar 500 L de SDS 20%

9. Centrifugou por 20mim e desprezou o sobrenadante. 10. Lavou-se o DNA com 1mL de etanol 80%. 11. Centrifugou por 5mim a 14mil rpm 12. Retirou o sobrenadante e suspendeu em 20L H2O. 13. Para analise, adicionou-se o tampo de corrida mais a soluo padro (marcador) 1kb pares de bases no primeiro poo da cuba de eletroforese e nos dois seguintes poos colocou se o DNA extrado mais o tampo de corrida.(2) 14. Acrescentou-se TBE 5x por toda a cuba e ligou na corrente eltrica (o polo positivo do lado da amostra a ser corrida e o negativo no lado oposto).

ANALISE DOS PROCEDIMENTOS


Ao passo um, observa que foi necessria alta temperatura no pequeno intervalo de tempo para que o agar dissolva-se completamente no meio formando um liquido cristalino. O uso do TBE fornece a soluo ons, favorecendo a corrida do DNA. Seguindo o procedimento 2, quando centrifugou a cultura de bactria houve a separao de clulas bacterianas e meio de cultura cultivadas. No quarto passo, a soluo de lise desnatura as protenas da parede celular das bactrias e aps o agitar no vrtex ocorreu a precipitao das protenas e lipdios Depois de centrifugado a amostra com fenol clorofrmico observa-se trs fases distintas como ilustrado na figura 1.

Figura 1: Trs fases aps adio do fenol clorofrmico.

A funo do iso- propanol nesse procedimento constitui de envolver o DNA e separa lo das outras solues presente. Aps o passo 8 e 9 observa-se o precipitado de DNA no fundo do eppendorf como mostra a figura 2.

Figura 2: Duas fases aps adio do iso-propanol.


(2)

A mistura de tampo de corrida mais DNA foi feito com ajuda de uma placa de petre com papel filme. Foram utilizado 5L e 2L, de DNA extrado e tampo de corrida,respectivamente.

Resumo dos procedimentos

CONCLUSO
A analise de um fragmento de DNA exige muito cuidado e seriedade nos procedimentos. Para obter bons resultados no basta apenas um protocolo de bom embasamento terico, mais tambm de matrias e maquinrio de qualidade, e lgico, profissionais com responsabilidade na sua execuo.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Forbes BA. Introducing a molecular test into the clinical microbiology laboratory development, evaluation, and validation. Arch Pathol Lab Med 2003;127:1106-1111.

Kalia A, Rattan A, Chopra P. A method for extraction of high-quality and high-quantity genomic DNA generally applicable to pathogenic bacteria.AnalyticalBiochem1999,275:15. Nucleo de difuso biotecnolgica. Extrao de dna de morangos. Disponvel em: <http://www.bioinfo.ufpb.br/difusao/pdf/extracaodednademorango.pdf>. Acessado em 02 out 2011. USP, Gel de agarose. Disponvel em :<http://www.imt.usp.br/portal/stories/dmdocuments/gelagarose.pdf>. Acessado em 02 out 2011.