Escola Superior de Tecnologias da Sade do Porto

Tricrmio de Masson
Citoqumica e Histoqumica Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica
Ano Lectivo: 2011/2012

Vila Nova de Gaia, 21 de Outubro de 2011 Professora Slvia Fernandes Trabalho efectuado por: Isabel Cristina Pinto Silva N10100517

Contedo
Introduo .......................................................................................................... 2 Objectivo ............................................................................................................ 5 Material e Mtodos ............................................................................................. 5 Material Biolgico: ....................................................................................... 5 Material: ....................................................................................................... 5 Reagentes: .................................................................................................. 5 Preparao de reagentes ............................................................................ 5 Protocolo Experimental ................................................................................... 6 Resultados ......................................................................................................... 7 Discusso/Concluso ......................................................................................... 8 Bibliografia.......................................................................................................... 9

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Introduo
O tecido conjuntivo um tecido que existe na maioria dos rgos e sistemas do nosso organismo. Tem origem embrionria no folheto mesodrmico (mesnquima). O tecido conjuntivo constitudo pela matriz extra-celular e por clulas. Dentro da matriz extra-celular possvel distinguir a substncia intersticial amorfa e as fibras (componente estrutural). Existem trs tipos de fibras diferentes e com caractersticas e funes igualmente diferentes: as fibras de colagnio, as fibras elsticas e as fibras de reticulina1. Existem mais de vinte tipos de fibras de colagnio diferentes, no entanto apenas cinco delas apresentam funes conhecidas. Todas elas afiguram caractersticas prprias, no entanto morfologicamente so semelhantes. So compostas por fibrilas que por sua vez so compostas por estruturas mais reduzidas denominadas microfibrilas, que apresentam uma estriao transversal peridica. As fibrilas e as microfibrilas encontram-se separadas entre si por um cimento polissacardeo. Estas fibras pertencem famlia das glicoprotenas e so formadas por grandes quantidades de glicnia, hidroxiprolina e prolina2,3. A nvel estrutural, so constitudas por trs cadeias de polipptidos em forma de hlice. As cadeias encontram-se ligadas entre si por ligaes covalentes, enquanto os grupos peptdicos de cada cadeia se encontram ligados atravs de pontes de hidrognio, permitindo ao colagnio manter a sua conformao.2,3 Devido ao arranjo paralelo dos seus constituintes proteicos e tambm ao arranjo dos hidratos de carbono associados s fibras, estas quando expostas a luz polarizvel, so altamente birrefringentes.2,3 Com o reconhecimento das fibras de colagnio, possvel determinar o estdio em que se encontra uma determinada doena atravs da avaliao da fibrose associada a mesma. Normalmente, estas fibras esto associadas a inflamaes agudas e podem ser encontradas em locais onde haja danificaes recentes no tecido. Evidenciar estas fibras ainda importante para o diagnstico diferencial de sarcomas, patologias hepticas (cirrose) e ainda patologias pulmonares crnicas2. Existem vrias formas de se evidenciarem as fibras de colagnio, dependendo da finalidade e do tipo de estudo que se pretende fazer. Assim sendo, e antes de se aplicar qualquer tipo de colorao numa dada amostra biolgica, importante possuir amostras que sirvam de controlo positivo interno e que, partida, possuem um alto teor de fibras de colagnio. As tcnicas mais utilizadas para esta tcnica so as coloraes tricrmias (com trs corantes).

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Neste tipo de colorao utilizada uma sequncia de solues especfica: a hematoxilina frrica, a fucsina cida (corante vermelho), o cido fosfomolbdico ou o cido fosfotngstico e o azul de anilina (corante azul). A hematoxilina frrica tem como propriedade a capacidade de resistir a solues cidas e cora os ncleos de azul/preto. Trata-se de uma soluo extempornea, e por isso deve ser preparada no momento em que vai ser usada, de forma a prevenir a superoxidao da hematoxilina alcolica pelo cloreto de ferro III, o que levaria a uma colorao nuclear no efectiva 3. O cido fosfomolbdico e o cido fosfotngstico so conhecidos como heteropolicidos. Apresentam um papel muito importante para a ligao da verde luz ou azul de anilina nas fibras de colagnio. O cido fosfomolbdico (ou o cido fosfotngstico) ir remover selectivamente o corante de determinados elementos do tecido consoante a sua permeabilidade. O mtodo original o mtodo de Van Gieson e conhecido por ser um dos mtodos de colorao mais especfico para evidenciar as fibras de colagnio, contudo a durao da colorao no permanente pelo que existem outros mtodos, que demonstram selectivamente as fibras musculares, as fibras de colagnio, a fibrina e os eritrcitos3. O Tricrmio de Masson o mtodo tricrmico mais popular e uma variante do mtodo Tricrmio de Mallory. No mtodo Tricrmio de Masson utilizada a hematoxilina frrica de Weigert. O corante utilizado para corar as fibras de colagnio o azul de anilina (azul de metileno). Este um corante anfotrico, actuando como corante bsico3. Tem a capacidade de evidenciar muito bem o ncleo e o citoplasma, e ajuda ainda a diferenciar o colagnio do msculo liso4. Estes mtodos de evidenciao das fibras de colagnio baseiam-se, essencialmente, na diferena de permeabilidade entre estas e outros elementos tecidulares, na sua acidofilia, nos diferentes tamanhos moleculares dos corantes e no papel assumido pelos cidos (fosfomolbdico ou fosfotngstico) na ligao dos corantes s fibras de colagnio4. Assim, existem vrios factores que afectam as coloraes tricrmias2: Temperatura: Aumenta a taxa de difuso do corante no tecido, devido diminuio de densidade; Aumenta permeabilidade ao corante devido destabilizao da rede tridimensional que envolve os tecidos. pH: Apenas com um pH baixo da amostra possvel a colorao das fibras de colagnio atravs do azul de anilina visto que o aumento da basofilia importante para que este corante tenha um comportamento bsico. Fixao: Aumenta a densidade baixando as taxas de difuso.

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Um maior tempo de fixao leva a resultados menos satisfatrios devido ao facto do fixador criar uma rede tridimensional insolvel em torno das clulas. Tipo de hematoxilina utilizada (hematoxilinas frricas).

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Objectivo
Visualizao, atravs da colorao de Tricrmio de Masson, as fibras de colagnio presentes nos diferentes tecidos.

Material e Mtodos
Material Biolgico:

tero; Apndice.
Material Laboratrio:

Fixados com formol tamponado a 10%

Caixas de colorao de vidro, com ranhuras; Carreto; Esguicho; Gobel; Lamelas; Lminas; Pipetas de Pasteur; Pipetas graduadas; Pompete; Tina de Colorao.

Reagentes:

Soluo de Bouin; Soluo cida de Ponceau-Fucsina; Soluo de Azul de Anilina; Soluo lcool-cido; Soluo aquosa de cido fosfomolbdico a 1%; Soluo aquosa de amnia a 0,5 ou 1%; Soluo de Hematoxilina Frrica de extempornea): Soluo A e soluo Ateste; Soluo B;
Preparao de reagentes

Weigert

(preparao

Soluo de Hematoxilina Frrica de Weigert : Soluo 1: Misturar num gobel de vidro a soluo A e a soluo B em propores iguais. Soluo 2: Misturar num gobel de vidro a soluo Ateste e a soluo B em propores iguais.

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Protocolo Experimental
1. Desparafinar, hidratar e lavar os cortes em gua corrente durante 5 minutos. 2. Lavar os cortes em gua destilada; 3. Colocar os cortes em soluo de Bouin (Mordente) durante 47 minutos a 56C; 4. Preparar a soluo de Hematoxilina Frrica de Weigert A e Ateste; 5. Lavar os cortes em gua corrente at desaparecer a cor amarela dos mesmos; 6. Lavar os cortes em gua destilada; 7. Corar os cortes com a soluo de Hematoxilina frrica de Weigert durante 10 minutos; 8. Lavar os cortes em gua corrente; 9. Lavar os cortes em gua destilada; 10. Diferenciar os cortes na soluo lcool-cido (reaco rpida). 11. Lavar os cortes em gua corrente, durante 3 minutos; 12. Lavar os cortes em gua destilada; 13. Azular os cortes numa soluo aquosa de amnia a 0,5 ou 1% (2 mergulhos rpidos e completos); 14. Lavar os cortes em gua corrente, durante 3 minutos; 15. Lavar os cortes em gua destilada; 16. Corar os cortes na soluo cida de Ponceau-Fucsina durante 5 minutos; 17. Lavar os cortes em gua destilada; 18. Diferenciar os cortes com a soluo aquosa de cido fosfomolbdico a 1%, durante 5 minutos; 19. Tirar o excesso de cido fosfomolbdico, corar os cortes com a soluo de Azul de anilina durante 5 minutos; 20. Lavar os cortes em gua destilada; 21. Diferenciar os cortes em cido fosfomolbdico a 1% durante cerca de 5 minutos; 22. Tirar o excesso de cido fosfomolbdico, colocar os cortes numa soluo aquosa de cido actico a 1%, durante 5 minutos; 23. Desidratar os cortes em lcool a 96% e lcool absoluto, diafanizar em dois recipientes com xilol e montar em entellan (meio de montagem sinttico).

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Resultados
Na figura 1 possvel encontrar fibras de colagnio presentes em apndice humano coradas pelo mtodo de Tricrmio de Masson. Deste modo possvel identificar as fibras de colagnio e de reticulina coradas de azul intenso, os msculos, citoplasma e eritrcitos corados de vermelho, os ncleos corados de azul/preto.

(A)

(B)

Figura. 1 Apndice visto ao microscpio ptico, ampliao 100x. (A) Sem Bouin e com a soluo Ateste; (B) Com Bouin e soluo A.

Na figura 2 possvel encontrar fibras de colagnio presentes em tero humano coradas pelo mtodo de Tricrmio de Masson. Deste modo possvel identificar as fibras de colagnio e de reticulina coradas de azul intenso, os msculos, citoplasma e eritrcitos corados de vermelho, os ncleos corados de azul/preto.

(A)

(B)

Figura. 2 tero visto ao microscpio ptico, ampliao 100x. (A) Com Bouin e soluo Ateste; (B) Sem Bouin e com soluo A.

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Discusso/Concluso
Aps a anlise dos resultados obtidos, foi possvel verificar que a colorao de Tricrmio de Masson foi bem conseguida. Em todas as lminas foi possvel visualizar as fibras de colagnio coradas de azul e bem individualizadas, sendo este o principal objectivo desta actividade experimental, bem como os msculos, citoplasma e eritrcitos corados de vermelho de diferentes tonalidades e ainda os ncleos corados de azul / arroxeado. Apesar de se evidenciar bem as fibras de colagnio e se distinguir bem os outros componentes do tecido, a colorao no apndice no est to intensa e to ntida como a do tero. Este facto pode dever-se a diversos factores, uma vez que as lminas podem ter estado pouco tempo nos corantes utilizados, no havendo tempo suficiente para ocorrem as interaces qumicas necessrias para a boa colorao do tecido. Por outro lado pode ter ocorrido uma fixao excessiva do tecido, o que leva a uma diminuio de permeabilidade da membrana condicionando a penetrao do corante. Um outro factor a ter conta tambm a boa manuteno e acondicionamento do material de laboratrio utilizado, bem como conservao dos corantes, que caso no acontea com as devidas precaues pode levar perda das suas propriedades. Este facto pode ainda ocorrer aquando a utilizao do cido fosfomolbdico, uma vez que este promove a ligao do azul de anilina s fibras de colagnio. Assim sendo, a remoo selectiva do corante utilizado anteriormente (soluo de PonceauFucsina) pode ocorrer de forma incompleta e como resultado, a diferenciao do tecido no ser correcta impedindo a posterior ligao entre as fibras de colagnio soluo de azul de anilina. Foi tambm testada, nesta actividade a eficcia de duas solues A, necessrias para a preparao da Hematoxilina Frrica de Weigert (A e Ateste) No entanto no foi detectada nenhuma alterao na colorao das amostras coradas com as diferentes solues. Dois dos cortes utilizados, foram sujeitos a uma mordaagem em soluo de Bouin (1(B) e 2(A)) aps fixao em formol tamponado a 10%. Devido ao facto da soluo de Bouin aumentar a acidofilia dos componentes do tecido, quando comparamos os cortes sujeitos a mordaagem com os no sujeitos, verifica-se uma colorao mais intensa nos primeiros2. Resumindo, podemos afirmar que esta actividade foi de encontro aos fundamentos tericos abordados na introduo, uma vez que as fibras colagnio no vo sofrer a descolorao do cido fosfomolbdico visto que apresentam uma elevada densidade e consequentemente uma baixa permeabilidade ao corante de tamanho molecular maior. Por outro lado a caracterstica laxa das fibras de colagnio permite fazer com que o cido fosfomolbdico retire a Ponceau-Fucsina e permita posteriormente a ligao destas ao azul de anilina.2

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Bibliografia
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Seeley RR, Stephens DT, Tate P. Anatomia e Fisiologia. 6 ed. p.123

125. Callis GM. Bone, in Bancroft JD, Stevens A, editors. Theory and Practice of Histological Techniques. 3rd edition. New York: Churchill Livingstone; 1990. p.119 40. 3 Kiernan JA. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. 4th ed. London: Scion Publications; 2008. p.190-208. 4 Junqueira L C, Carneiro J. - Histologia Bsica. 10 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2005. p 3 e 103 5 Callis GM. Bone, in Bancroft JD, Stevens A, editors. Theory and Practice of Histological Techniques. 6rd edition. New York: Churchill Livingstone; 2008. p 144 - 153
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