Ent ende-se por enz ima imobiliz ada, aquela fsica ou quimicament e associada a um suport e ou mat riz , usualment

e slida, insolv el em gua e inert e, que no seja essencial a sua at iv idade. Objetivos da imobilizao : 1- Reutizar a enzima 2-Aumento da estabilidade

1- Em 1916, ocorreu a primeira utilizao de enzima imobilizada (inv ert ase em carvo vegetal) por N elson e Griffin. 2- Em 1960 Katchalski introduziu os primeiros suportes teis. 3- Em 1978, os processos com enzimas imobilizadas tambm tm utilizao industrial em larga escala - aminoacilase imobilizada em D EAESephadex para produo L-aminocidos. 4-Maior uso de enzimas imobilizadas na produo de xaropes de frutose atravs da glicose-isomerase imobilizada realizada em grande escala nos Estados Unidos

Vantagens Desenvolvimento de contnuos

Desvantagens sistemas Custo adicional de suportes, reagentes e da operao de imobilizao Maior estabilidade enzimtica Perdas de atividade durante a imobilizao Uso mais eficiente do catalisador Possveis exigncias adicionais de atravs de reutilizaes purificao do catalisador Flexibilidade no projeto de reatores Tcnica pouco adequada a substratos insolveis ou de alto peso molecular Efluentes livres de catalisadores Maiores riscos de contaminao na operao contnua dos reatores Maior versatilidade na etapa de Restries difusionais e separao impedimento estreo Menor custo de mo de obra Facilidade de Automao e controle Possibilidade de utilizao das enzimas in-natura

D epender das caractersticas da enzima e das condies de uso da enzima imobilizada. Para uma escolha econmica do mtodo de imobilizao necessrio o conheciment o da reao desejada, o processo de aplicao da enz ima imobiliz ada, condies do meio, modificaes causadas na est abilidade, at iv idade, pH e demais fat ores. O binmio suportemtodo mais adequado ser aquele que propiciar uma maior atividade aps imobilizao.

SUPORTE Acetato de celulose Poliacrilamida Prolas de vidro DEAE-Sephadex A25 Dowex 1X1 DEAE- Celulose

MTODO Microencapsulamento Microencapsulamento Ligao covalente Adsoro Adsoro Adsoro

POROS ( A) 0,02 2,5 0,2-1,0 0,1 0,4 0,06

UI/g 45 50 200 650 820 4200

Os su p ortes p od em ser orgnicos ou inorgnicos, sintticos ou natu rais. Su p ortes necessitam d e m u d anas ou inclu so d e gru p os reativos at iv ao do suport e. Classificao d os su p ortes u tilizad os na Im obilizao d e Enzim as
TIPO DE SUPORTE No poroso Microencapsulado Entrelaado Macroporoso MATERIAIS POROSIDADE ESTABILIDADE

Vidro, slica, ao Triacetato de celulose Poliacrilamida, PVP Alumina, slica

35 A Variada 200-1000 A

Alta Moderada Baixa alta

slica Vidro

Alumina

Poliacrilamida

Fibra de casca de coco

tela de nylon

processos que promovem pequenas alteraes conformacionais da molcula enzimtica (ligaes por pontes de hidrognio, foras de Van der Waals e interaes hidrofbicas) retm uma atividade maior - a dessoro indesejvel da enzima por variaes de pH ou fora inica do meio. os polmeros naturais (quitina) e seus derivados vantajosos para a imobilizao de enzimas caracterstica hidroflica e a uma conformao favorvel atividade das enzimas,. Em 1993 foi desenvolvido em So Paulo, um mtodo de produo de slica de porosidade controlada e foi avaliada sua utilizao na imobilizao de enzimas. lactases e lipases aplicadas industrialmente.

Est abilidade de fixao fixa ao suporte.

a enzima deve estar bem

Est abilidade enz imt ica a enzima no deve sofrer modificaes como desnaturao. Resist ncia mecnica o suporte deve resistir a vrias condies desfavorveis como, o peso do suporte dentro do reator. Capacidade de carga o suporte deve fixar um nmero elevado de unidades enzimticas por unidade de rea - um pequeno reator uma grande capacidade cataltica.

Ocluso em matrizes: Podem ser gis (amido, borracha, nylon, poliacrilamida, slica, alginato de clcio, agarose, polietileno glicol) ou fibras. Nos gis ocorre o aprisionamento da enzima nos espaos intersticiais da rede polimrica (enzima confinada no interior de micelas), enquanto que nas fibras o aprisionamento se d nas micro-cavidades.

Mtodos de Imobilizao da enzima por encapsulamento em gel de gar

Onde a enzima oclusa em membranas polimricas de porosidade de 300 m (celulose, policarbonato, colgeno, politereftalato, polmeros em geral), semipermeveis esfricas de pequeno dimetro.

Microencapsulamento de enzima em material polimrico

Mtodo que envolve o uso de agentes bifuncionais ou multifuncionais, em geral diaminas alifticas (di-isocianato) ou glutaraldedo, que induzem a auto-reticulao das enzimas, resultando assim na formao de uma rede tridimensional de molculas de enzima

Ligao Covalente
Tipo de mtodo mais empregado na imobilizao de biocomponentes, em especial enzimas. Envolve a ligao do biocomposto a matriz de imobilizao por meio de grupos funcionais nuclefilos presentes em cadeias laterais de aminocidos que formam a enzima e que no so essenciais a sua atividade cataltica. A ligao covalente se d pela reao de grupos reativos do suporte, matrizes como vidro, cermica, polmeros sintticos, celulose, nylon e alumina, ativado ou no, com os grupos funcionais da enzima ligao de grupos - NH2, -COOH, -OH, -SH, entre outros, preferencialmente em condies fisiolgicas brandas, baixa temperatura, baixa fora inica, pH timo e muitas vezes na presena do substrato, a fim de proteger o stio ativo da enzima evitando que haja diminuio da atividade da mesma

Adsoro Fsica
Utiliza fora de Van der Waals; mtodo simples que se baseia na adsoro fsica em superfcies slidas, como alumina, carvo, argila, slica gel, colgeno, vidro, por ligaes inicas, polares ou de Van der Waals.

Ligao Inica
Ligao de grupos com cargas opostas atravs de foras eletrostticas. Processo simples, suave e no deletrio para a maioria das enzimas, sendo inclusive desprezveis os efeitos difusionais.

Ligao Metlica
Forma quelatos pela ativao da superfcie do suporte por meio do metal ou por seu xido. Nos dois primeiros mtodos por adsoro, as foras so fracas levando a pequenas modificaes conformacionais na enzima e, conseqente, possibilidade de dissoluo da mesma (perda). De uma forma geral, os processos de imobilizao por ligao so preferidos quando se confront a eficincia, apesar da incluso em gis ou matrizes ser mais barato. A maioria dos processos de imobilizao usa enzimas intracelulares imobilizadas pelo processo de fixao da enzima no exterior do suporte.

Imobilizao de -amilase por adsoro fsica em carvo de casca de coco

Construo e aplicao de biossensores usando diferentes procedimentos de imobilizao da peroxidase de vegetal em matriz de quitosana, Qumica Nova , 2006

Reteno da Atividade Enzimtica algumas molculas enzimticas podem estar imobilizadas em uma configurao que impede completamente o acesso do substrato ao centro ativo; o grupo reativo do centro ativo pode estar envolvido a ligao ao suporte (a proteo do stio ativo da enzima atravs de um inibidor reversvel durante a ligao pode resultar em aumento na reteno da atividade; molculas da enzima podem ter se ligado em uma configurao que as torne inativas; as condies de reao no processo de imobilizao podem causar desnaturao ou inativao.

PARMETRO Km

INVERTASE SOLVEL 26,0 mM

INVERTASE IMOBILIZADA 8,1 mM 52,2 mM 32,2 mM 0,25 U 0,74 U 0,32 U 4,6 4,0 4,6 4,5 6,5 5,0 6,0 4,6 60 C 60 C 70 C 45-50 C 25-40 C 25-40 C 24,4 kJ/mol 51,9 kJ/mol 37,5 kJ/mol 21,9 kJ/mol 49,3 kJ/mol 34,9 kJ/mol -13,9 kJ/mol -11,5 kJ/mol -14,7 kJ/mol 0,115 kJ/mol 0,196 kJ/mol 0,160 kJ/mol

Vmx

1,10 U

pH (para atividade mxima) pH (maior estabilidade) T (para atividade mxima) T (maior estabilidade) Ea (energia de ativao a 37 C) H (variao de entalpia a 37 C) G (variao de energia livre de Gibs a 37 C) S (variao de entropia a 37 C)

4,6

4,0-4,6

55-60 C

25-37 C

27,8 kJ/mol

25,2 kJ/mol

-13,6 kJ/mol

0,125 kJ/mol

Qu and o a enzim a im obilizad a, o su bstrato tem qu e d ifu nd ir na solu o atravs d e u m film e lqu id o estacionrio p resente nas su p erfcies d o su p orte e, se este p oroso, atravs d os p oros at alcanar o sitio ativo d as enzim as - p od e restringir a taxa d e reao velocid ad e d e d ifu so d o su bstrato < velocid ad e d e transform ao p ela enzim a - Vm x m ais baixa -no se atinge a satu rao. efetivid ad e (f) = (v) / (v), f fu no d e [S]
f v 1 v' v' v V mx S K M S K fV
M mx

(1) v' 1 S 1 fV
mx

V mx S K M S (2)

Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio da soluo at a superfcie de catalise, devendo, por conseguinte atravessar uma camada lquida, assim o consumo de substrato atravs da membrana lquida pode ser imaginado como resultado de um gradiente. A difuso do subst rat o e produt os dos cent ros at iv os para a soluo (ou v ice-v ersa) ocorre at rav s de mecanismos de difuso molecular e conv ect iv a. Os efeitos de difuso externa afetaro o transporte de massa e podem ser minimizados tanto pelo aumento da agitao, caso de reatores continuamente agitados (CSTR), quanto pelo aumento do fluxo de substrato, caso do reator pistonado (PFR).

Efeitos D ifusionais Internos

Su rgem d evid o m ovim entao d o su bstrato no interior d o m eio cataltico. - d ifu so e reao ocorre sim u ltaneam ente

Efeitos Microambientais
A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um ambiente diferente do que quando estava livre, especialmente se a matriz ou suporte possui carga. Os efeitos de circunvizinhana, que dependem da natureza fsica e qumica do suporte, podem acarretar uma distribuio desigual do substrato, produtos e cofatores entre a regio vizinha ao sistema imobilizado e o resto da soluo.

Efeitos Estereoespecficos
Existem situaes onde a atividade da enzima frente a um substrato com elevado peso molecular reduzida durante o processo de imobilizao, de uma forma mais extensa que frente a um substrato com menor peso molecular - resultado de impedimento estreo, formado pelo suporte, ao acesso de molculas grandes ao cent ro at iv o da enz ima (impediment o est rico).

Efeitos na Estabilidade
enzimas durante a imobilizao apresentem mudanas na estabilidade t rmica.

1- Resoluo de Misturas Racmicas de Aminocidos enzima aminoacilase - tanto L como D-aminocidos so completamente convertidos a L-aminocidos. 2- Produo de cido 6-Aminopenicilmico (6-APA) peniclina amidase e suporte bentonita entrecruzada . 3- Produo de leites e soros deslactosados lactase imobilizada em fibras de acetato de celulose ou vidro poroso ativado. 4- Produo de xaropes de frutose a partir de glicose -glicose isomerase utilizando como suporte protenas entrecruzadas ou vidro poroso ativado. 5- Eletrodos enzimticos e sensores enzimticos

Aplicaes analticas:
Facilita automatizao das cadeias de dosagem e simplifica as manipulaes.

Reatores para anlise cromatogrfica; Kits para titulaes e imunoensaios.

Lipases imobilizadas:
Imobilizadas em organo-gel utilizadas na esterificao do cido olico com npentanol; Imobilizadas em carvo de coco, bauxita e gel de gar utilizadas na transformao de leo de soja em biodiesel.

Em desenvolvimento: Estudos de filtros que utilizam enzimas imobilizadas na superfcie do meio filtrante para o tratamento do ar dos ambientes. Recentes avanos na imobilizao de enzimas por argilas, utilizadas em bioremediao. Estudos em desenvolvimento: imobilizao, estabilizao e aplicao da enzima esterase, de rim de porco, na sntese de produtos de interesse farmacutico.

Os processos que utilizam enzimas imobilizadas podem ser conduzidos de forma contnua ou em batelada. O sistema mais comum o de tanque agitado em batelada (STR). Em alguns casos, estes reatores vm sendo operados de forma semi-contnua atravs da retirada intermitente de parte do meio reacional e adio de nova soluo de substrato. Quando a enzima encontra-se na forma livre e solvel o nico reator utilizvel o reator em Batelada

1- CSTR tanque mecanicamente agitado (com ou sem ultrafiltrao)

Batelada enzim a pod e ser sep arad a d a m istura final com facilidade Contnuo entrada e sada do fludo. Como certa quantidade de enzima pode ser arrastada, sistemas de recuperao de enzimas devem ser usados.

2- Fluxo Pistonado - PFR (Plug-Flow React or)

Tres= L/u onde u = velocidade = F/A

1- Leito Fixo (Coluna empacotada mdulo fibrilar) - Enzim a em p acotad a estacionria.

2 Leito Fluidizado -Velocid ad e d o flu d o p rom ove m ovim entao d as p artcu las d e enzim a im obilizad as d entro d o reator.

Quanto conduo do processo

Batelada - mais indicados para processos de pequena escala (utilizados em carter multi-propsito - menor ociosidade.

Contnuo Elevado custo do investimento. Custo de mo-de-obra reduzido Possibilita automao. Apresentam maior produtividade. Constncia na Qualidade dos Produtos

Quanto ao tipo de reator a ser utilizado- Requisitos operacionais e custo

Requisitos operacionais podem limitar a escolha do reator.

Reator CSTR quando controles de pH e temperatura so necessrios- homogeneidade Reator Tubular substrato fornecido de modo intermitente - casos em que substratos em elevada concentrao inibem a enzima. Reatores de Leito Fixo no usados para fluidos de alimentao que contenha slidos insolveis.

Quanto a Reutilizao da Enzima Maior p arte d as enzim as so instveis p ara u so p rolongad o em reatores, p od end o a im obilizao ser atrativa (exceto enzim as extracelu lares -am ilases e p roteases). Econom icid ad e d o p rocesso d ep end er cu sto d o catalisad or (enzim a) cu sto d o p rocesso.

Quanto a Caracterstica da corrente de alimentaoMeios Viscosos ou com material particulado - Tanque de agitao e Leito fluidizado Meios de Baixa Viscosidade ou sem material particulado Leito fixo

Processo com Enzimas Imobilizadas - as caractersticas fsicas do suporte. Suportes frgeis - no devem ser usados em reatores CSTR e leito fluidizado. Suportes Compressveis ou pequenos no devem ser usados em leito fixo

Quanto as Caractersticas Cinticas

Reaes que obedecem a cintica de Michaeliana maior rendimento nos reatores de leito fixo e fluidizado. Reaes em ocorre inibio pelo substrato - mais adequado CSTR [S] no reator =[S}sada- baixa Reatores Contnuos - Enzima retirada necessrio a adio de enzima nova, devido a perda na atividade durante uma operao prolongada. Facilmente realizado em reator CSTR, a qualquer instante sem interrupes.

Tipo de Reator

Regime de Fluxo

Eficincia de Converso Menor que em coluna (exceto para casos de inibio) Maior que o tanque agitado (exceto para casos de inibio) Idem tanque agitado contnuo Intermediria entre o tanque agitado e a coluna Idem coluna

Razo Enzima / Volume do Reator Baixa

Controle de Parmetros

Caractersticas Hidro-dinmicas

Custos de Operao

Tanque Agitado Contnuo

Mistura Perfeita

Fcil

Boas

Baixos

Coluna Empacotada

Pisto

Alta

Difcil

Regulares (problemas de compactao e canalizao)

Intermedirios

Reator Contnuo de Ultrafiltrao (UF) Reator de Leito Fluidizado

Mistura Perfeita

Interme diria

Fcil

Regulares (problemas de concentrao na membrana) Boas

Altos

Interme dirio

Interme diria

Interme dirio

Altos

Mdulo Fibrilar

Pisto

Alta

Difcil

Idem reator contnuo de UF

Altos

Batelada - balano de massa substrato

Ra Rs Rc Re
Re= razo variao S no reator, Rc- razo consumo S no reator

Processo batelada

Ra
dx ' M dt

Rs
t

0
x'

Rc
dx ' M vVb 0

Re
t x'

Rc Re

vVb M dx ' dt
vVb

dt
0

dt
0 0

dx ' v
x

Vb= volume mistura reao, v= massa S cosumida/tempo unidade volume, R= vazo mssica, M= massa do sistema de reao, m= massa inicial S Sabendo que, e considerando a densidade constante

mdx

Mdx '

S0
0

dx v

Assumindo condies ideais de escoamento, a cintica de Michaelis-Menten para reao irreversvel, sem inibio e com um nico substrato, substituindo na equao anterior e resolvendo as integrais chega-se a equao do processo em batelada.

VmxS KM S

t= (x So /Vmax) (Km/Vmax) Ln (1-x)

ou ainda integrando eq. Michaelli Menten em relao a t e r = taxa de reao e V = volume r= -dS/dt = 1/V (Vmax. S/Km + S) = (So-S) Km Ln (So/S) =(Vmax/V).t

S S0 (1 x )

So - Km Ln (1 x) = (Vmax/V) t onde converso enzimtica reator em batelada

subst convertido= So-S/So

Baixos valores de So/Km - taxa de reao essencialmente de ordem zero Tempo t para um dado em particular - independente de So/Km.

Elevados valores de So/Km - taxa de reao essencialmente de 1a. ordem O tempo dispendido (t) para atingir um determinado valor de a relao So/Km. proporcional

Da m esm a form a, p ara u m CSTR e u m PFR, a equ ao d e Michaelis-Menten p od e ser integrad a resu ltand o em equ aes id nticas a converso enzim tica em u m reator batelad a, u sand o Q com o a alim entao volu m trica d e su bstrato ao reator (em [L/ s]).

Reator CSTR
So Km Vmax Q

Reator PFR
So K m ln 1 Vmax Q

Contribuies relativas do primeiro termo (reao de 1a ordem) e do segundo termo (reao de ordem zero) em t , para atingir dado valor de , dependem dos valores de So e Km.

Desempenho dos reatores contnuos PFR e CSTR Valores elevados de So = So/Km > 10 e baixos valores de As curvas para ambos os reatores so praticamente idnticas Valores baixos de So/Km e altos valores de Somente podem ser alcanados em vazes mais lentas no CSTR, que em sistema PFR - converses para reatores PFR em um dado valor de Q.

As referid as equ aes d em onstram qu e:

Quantidade de enzima no reator u m im p ortante p arm etro - d eterm ina a velocid ad e d e reao. Reator em Batelad a qu antid ad e enzim a m aior qu e o contnu o Processo Reacional teoricam ente ind ep end ente d o tam anho d o reator e estes d evem ser com p arad os com base na qu antid ad e d e enzim a requ erid a.

1- Efeitos inibitrios por Substrato ou Produto Inibio por Substrato - Mais efetiva em reator tu bu lar d o qu e no contnu o agitad o. Pod e ser m inim izad o em reator em batelad a introd u zind o su bstrato d e form a interm itente em u m reator tu bu lar (p istonad o).Em reator agitad o contnu o u sand o vrios reatores d ispostos em srie. Equao que descreve a inibio da enzima pelo substrato
r dS dt 1 V Vmax S S Km S2 K is

CSTR
So Km 1
2 So K is 2

PFR
Vmax Q
So K m ln 1 S o2 2 K is
2

Vmax Q

Inibio pelo substrato mais evidenciada em sistemas PFR. Efeito menor em reator CSTR - Enzim a op era em cond ies ond e a [S] id ntica a d a corrente d o eflu ente d o reator.

Competitiva (altera o valor de Km):

dS dt

1 V

Vmax S S Km 1 I K ip

Converso enzimtica com inibio competitiva pelo produto em um CSTR

2

So

Km

So

Km K ip

Vmax Q

Converso enzimtica com inibio competitiva pelo produto em um PFR

1 Km K ip So 1 So K m ln 1 K ip Vmax Q

Relao So/Kip pequena - a inibio pelo produto desprezvel. Reator PFR desprezvel , mais pronunciada reatores CSTR elevada [P].

N o - competitiva (altera o valor d e Vmax):

dS dt

1 V

Vmax 1 I K ip

S S Km

Converso enzimtica com inibio no - competitiva pelo produto em um CSTR

So Km 1
2 So Km 1 K ip So 1 2

Vmax Q

Converso enzimtica com inibio no - competitiva pelo produto em um PFR

So Km
2 So Km 1 K ip So 1 2

Vmax Q

Para os mesmos valores de So, Km, Kip e - inibio no competitiva ocasiona maior efeito no progresso da reao que a inibio competitiva.

Efeito da inibio competitiva e no-competitiva na converso ( ) em funo do tempo de reao (t) para razo So/Km = 10 e diferentes relaes de Kip/Km.

A influncia da limitao transferncia de massa externa em reatores de leito fixo.

Maior em vazes lineares menores que 1 2 cm/min Vazes maiores problema de queda de presso atravs do leito

Limitao difusional interna da taxa de reao de uma enzima imobilizada pode ser reduzida por:

Diminuio da razo atividade / volume do suporte Menor concentrao de sada por unidade de volume do reator;

Aumento da concentrao de substrato;

Diminuio da espessura ou do dimetro do suporte da enzima imobilizada.

CSTR maiores limitaes difusionais no poro.

Temperat ura e Transferncia de calor Boa em reatores de leito fluidizado e batelada e problemtica em reatores de leito fixo.

Queda de Presso Maior em Reatores de Leito fixo Quanto menores as partculas, maior ser a queda de presso. Partcu las m enores que 50 m esh no d evero ser u sad as.

Regies localiz adas de alt o ou baixo pH - inativao enzimtica ou hidrlise de substratos e produtos Agitao muit o sev era em Reat ores Enz imas imobiliz adas - promove atrito entre as mesmas Substratos e/ou produtos instveis sob as condies reacionais - uma alta concentrao de enzima reduzir o tempo de residncia destas substncias no reator, menor perdas. Enzimas Imobilizadas alta atividade por unidade de volume - aumento da atividade por peso do suporte ou aumento da quantidade de suporte com a mesma carga da enzima. Maior porosidade do suporte ou reduo do tamanho da partcula no porosa Enzimas Livres no so reutilizadas - exceto nos casos de reatores com ultrafiltrao. Separao mais facilitada da enzima ao final do processo pela elevao da temperatura de operao.

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