Cromatografica Lquida de Alta Eficincia

A cromatografia a lquido de alta eficincia (CLAE) uma tcnica de separao fundamentada na distribuio dos componentes de uma mistura entre duas fases imiscveis, a fase mvel, lquida, e a fase estacionria slida, contida em uma coluna cilndrica. As separaes so alcanadas por partio, adsoro, troca inica, excluso por tamanho ou interaes estereoqumicas, dependendo do tipo de fase estacionria utilizada. A CLAE apresenta vantagens sobre a cromatografia a gs para as anlises de combinaes orgnicas. Amostras no volteis e termolbeis so, preferencialmente, analisadas por CLAE. A maioria das anlises farmacuticas est baseada no mtodo de separao por partio e devem ocorrer em tempo curto de anlise. Vrios fatores qumicos e fsico-qumicos influenciam na separao cromatogrfica, os quais dependem da natureza qumica das substncias a serem separadas, da composio e vazo da fase mvel, da composio e rea superficial da fase estacionria.

Aparelhagem
O equipamento utilizado consiste em um reservatrio que contm a fase mvel, uma bomba com a finalidade de impelir a fase mvel pelo sistema cromatogrfico, um injetor para introduzir a amostra no sistema, uma coluna cromatogrfica, um detector e um dispositivo de captura de dados, como um software, integrador ou registrador. Alm de receber e enviar informaes para o detector, softwares so utilizados para controlar todo o sistema cromatogrfico, proporcionando maior operacionalidade e logstica de anlise. Os sistemas cromatogrficos modernos consistem de bombas para pressurizar a fase mvel, controladas por software, que podem ser programadas para variar a relao de componentes da fase mvel, como requerido para cromatografia por gradiente de solvente, ou para misturar, de forma isocrtica, a fase mvel (fases mveis com relao fixa de solventes). Aps dissolver a amostra na fase mvel ou em outro solvente adequado, a soluo injetada no sistema cromatogrfico, de forma manual, utilizando seringa apropriada, ou por meio de um injetor ou amostrador automtico. Este consiste em um carrossel ou bandeja, capaz de acomodar diversos frascos contendo as amostras. Alguns amostradores automticos podem ser programados para injetar diferentes volumes de amostra, diversas quantidades de injees, controlar o intervalo entre injees e outras variveis operacionais. Quando se trabalha a altas presses, uma vlvula de injeo sencial. Essa apresenta um sistema calibrado, com volume definido, denominado anel de injeo ou ala de amostragem, que ser preenchido com a soluo a ser analisada e, posteriormente, transferida coluna. Para a maioria das anlises farmacuticas, a separao alcanada por partio dos componentes, presentes na soluo a ser analisada, entre as fases mvel e estacionria. Sistemas que consistem de fases estacionrias polares e fases mveis apolares so definidos como cromatografia em fase normal, enquanto o oposto, fases mveis polares e fases estacionrias apolares, so denominados de cromatografia em fase reversa. A afinidade de uma substncia pela fase estacionria e, consequentemente, seu tempo de reteno na coluna, controlado pela polaridade da fase mvel. As fases estacionrias utilizadas em cromatografia em fase reversa consistem, tipicamente, de uma molcula orgnica quimicamente ligada s partculas de slica ou outros suportes, como

grafita porosa. O dimetro das partculas de, normalmente, 3 m a 10 m. Quanto menores o dimetro da partcula e a pelcula que recobre o suporte, mais rpida e eficiente ser a transferncia das substncias entre as fases estacionrias e mveis. A polaridade da coluna depende dos grupos funcionais presentes, sendo os mais comuns os grupos apolares octil, octadecil, fenil, cianopropil e polar, nitrila. A proporo de grupos silanis no ligados ao grupo funcional influencia, significativamente, na eficincia da separao cromatogrfica e no formato do pico eludo. Comercialmente, esto disponveis colunas cromatogrficas com diferentes qualidades de fases estacionrias, inclusive aquelas com pequena proporo de grupos silanis livres, denominadas capeadas. Geralmente, colunas de slica em fase reversa apresentam vida til na faixa de pH de 2 a 8, entretanto, colunas contendo grafita porosa ou materiais polimricos, como o estirenodivinilbenzeno, so estveis em uma faixa mais ampla de pH. De forma menos comum, podem ser utilizados lquidos, no ligados, como revestimento do suporte de slica e, portanto, devem ser imiscveis com a fase mvel. As colunas normalmente usadas para separaes analticas tm dimetros internos de 1 mm a 5 mm. Essas podem ser aquecidas, proporcionando separaes mais eficientes, mas s raramente so utilizadas temperaturas superiores a 60 C, devido ao potencial de degradao da fase estacionria ou volatilidade da fase mvel. A menos que especificado na monografia da substncia a ser analisada, as colunas so utilizadas em temperatura ambiente. Os detectores mais frequentemente utilizados em cromatografia a lquido de alta eficincia so os espectrofotomtricos (UV/Vis). Os detectores espectrofotomtricos so utilizados para detectar compostos com grupamento cromforo. Tais detectores consistem de uma clula de fluxo localizada no trmino da coluna cromatogrfica. A radiao ultravioleta atravessa, constantemente, pela clula de fluxo e recebida no detector. Com o sistema em funcionamento, as substncias so eludas da coluna, passam pela clula de detector e absorvem a radiao, resultando em alteraes mensurveis no nvel de energia. Atualmente, sistemas de coleta de dados modernos esto disponveis com as funes de receber e armazenar os sinais provenientes do detector e, posteriormente, proporcionar o manejo dessas informaes, gerando os cromatogramas com os dados de rea e altura do pico, identificao da amostra e mtodos. As informaes tambm podem ser coletadas em sistemas simples de gravao de dados, como registradores, para a garantia da integridade dos dados gerados.

Procedimento
O comprimento e o dimetro interno da coluna, o tipo e o tamanho das partculas da fase estacionria, a temperatura da operao, a composio e a vazo da fase mvel e o tipo de deteco so descritos nas monografias individuais. A composio da fase mvel tem influncia significativa na performance cromatogrfica e na separao das substncias presentes na soluo a ser analisada. Para uma anlise quantitativa precisa, reagentes de elevado grau de pureza ou solventes orgnicos de pureza cromatogrfica devem ser utilizados. A gua, de qualidade adequada, deve apresentar baixas condutividade e absoro na faixa do ultravioleta. Na cromatografia de partio, o coeficiente de partio e, consequentemente, a separao podem ser modificados pela adio de outro solvente fase mvel. Na cromatografia de trocainica, a reteno das substncias afetada pelo pH, pela fora inica e por outras modificaes na composio da fase mvel. A tcnica de modificar continuamente a composio dos

solventes da fase mvel durante a corrida cromatogrfica denominada de eluio gradiente, e aplicada para separar misturas complexas de substncias com diferentes fatores de capacidade. Entretanto, detectores que so sensveis a modificaes na composio da fase mvel, como os refratmetros, tm sua utilizao limitada com a tcnica de eluio gradiente. O detector deve apresentar uma ampla faixa de atuao e as substncias a serem analisadas devem estar separadas de qualquer interferente. A faixa linear para uma substncia aquela na qual a resposta do detector diretamente proporcional sua concentrao. Os sistemas de CLAE so calibrados comparando-se as respostas dos picos obtidos com as respectivas concentraes de substncias qumicas de referncia (SQR). Resultados quantitativos confiveis so obtidos por meio de calibrao com padro externo, quando injetores ou amostradores automticos so preferencialmente utilizados. Esse mtodo envolve a comparao direta das respostas obtidas com os picos, separadamente analisados, das solues padro e amostra. Nos casos em que a padronizao externa utilizada, os clculos podem ser realizados segundo a equao:

em que, Ca = concentrao da soluo amostra; Cp = concentrao da soluo padro; Ra = resposta (rea ou altura) do pico da soluo amostra; Rp = resposta (rea ou altura) do pico da soluo padro. Se a injeo realizada por meio de seringa, melhores resultados quantitativos so obtidos por meio de calibrao com padro interno, adicionando-se uma quantidade conhecida de uma substncia qumica de referncia no interferente s solues padro e amostra. A relao das respostas obtidas com a substncia a ser analisada e com o padro interno utilizada para expressar o resultado quantitativo. Nos casos em que a padronizao interna utilizada, os clculos podem ser realizados segundo a equao:

em que, Rai = resposta (rea ou altura) do pico do padro interno na soluo amostra; Rpi = resposta (rea ou altura) do pico do padro interno na soluo padro. Devido a variaes normais entre equipamentos, solventes, reagentes e tcnicas, necessrio um teste de adequao do sistema para assegurar que o mtodo descrito seja aplicado de forma irrestrita. Os principais parmetros da adequao do sistema esto descritos em Interpretao dos cromatogramas e em Adequao do sistema.

Interpretao dos cromatogramas

Na figura abaixo representada uma separao cromatogrfica tpica de duas substncias, sendo t1 e t2 os respectivos tempos de reteno. Os termos h, h/2 e Wh/2 correspondem altura, meia altura e largura a meia altura, respectivamente, e W representa a largura do pico na linha de base, pelo mtodo da triangulao. O sinal relativo ao tempo morto, t0, refere-se a uma substncia no retida na coluna cromatogrfica.

Tempo de reteno (t), fator de reteno (k) e tempo de reteno relativo O tempo de reteno em cromatografia caracterstico da substncia analisada, entretanto no exclusivo. A comparao entre os tempos de reteno da amostra e da substncia qumica de referncia pode ser utilizada como indicativo da identidade da substncia, porm insuficiente para garantir a total caracterizao da amostra. O tempo de reteno absoluto pode variar entre equipamentos e conforme o uso de solventes e reagentes diferentes. Nesse sentido, as comparaes so feitas em termos de fator de reteno, k, calculado segundo a expresso:

Em que: t = tempo de reteno da substncia analisada t0 = tempo morto O fator de reteno k a razo entre a quantidade da substncia com afinidade pela fase estacionria e a quantidade de substncia com afinidade pela fase mvel. Quanto maior a afinidade da substncia pela fase estacionria maior a sua reteno. O conceito de tempo de reteno relativo tambm pode ser aplicado. Para tanto, deve-se definir uma substncia, de uma mistura, como a principal. Essa ter o tempo de reteno relativo de 1.

Todas as outras substncias tero seus tempos de reteno relacionados com o tempo de reteno da substncia principal.

Nmero de pratos tericos (N)

O nmero de pratos tericos, N, indicativo da eficincia da coluna. Pode ser expresso em nmeros de pratos tericos por coluna ou nmero de pratos tericos por metro. Para picos com formato gaussiano, o nmero de pratos tericos por coluna calculado segundo as expresses:

O valor de N depende da substncia a ser analisada e das condies de anlise, como fase mvel, temperatura e fase estacionria. Resoluo (R) A resoluo, R, o parmetro cromatogrfico que indica o grau de separao entre duas substncias em uma mistura, e calculada segundo as expresses,

em que, t2 e t1 = tempos de reteno das duas substncias da mistura; W1 e W2 = respectivas larguras dos picos na linha de base, pelo mtodo da triangulao; W1,h/2 e W2,h/2 = respectivas larguras dos picos meia altura. A rea ou a altura do pico so, usualmente, proporcionais quantidade da substncia eluda. A rea sob o pico, geralmente, mais utilizada, entretanto pode ser menos precisa se houver outros picos interferentes. Para medidas manuais, o grfico deve ser obtido em velocidade maior que a usual, minimizando os erros na obteno da largura e da largura meia altura dos picos. Para a anlise quantitativa, as substncias devem estar totalmente separadas de qualquer substncia interferente.

Fator de cauda (T)

O fator de cauda, T, que indica a simetria do pico, apresenta valor igual a 1 quando o pico perfeitamente simtrico. Esse valor aumenta medida que a assimetria do pico se torna mais pronunciada. Em alguns casos, valores inferiores a 1 podem ser observados. medida que a assimetria do pico aumenta, a integrao e a preciso se tornam menos confiveis. O fator de cauda calculado segundo a expresso:

em que,

W0,05 = largura do pico a 5% da altura;

f = valor da poro anterior do pico, em relao largura a 5% da altura, de acordo com a figura 2.

Adequabilidade do Sistema
Os testes de adequabilidade do sistema so parte integrante dos mtodos de cromatografia lquida. So aplicados com a finalidade de verificar se a resoluo e a reprodutibilidade do sistema cromatogrfico esto adequadas para as anlises a serem realizadas. Os principais parmetros necessrios para a verificao da adequabilidade do sistema so descritos a seguir. A resoluo, R, funo da eficincia da coluna, N, e especificada para garantir que substncias eludas proximamente, apresentem separao satisfatria sem interferncias mtuas. Replicatas de injees da soluo padro so trabalhadas, estatisticamente, para verificar se os requerimentos para a preciso da anlise foram atingidos. A menos que especificado na monografia individual, so utilizados os dados de cinco replicatas de injees para calcular o desvio padro relativo (DPR), se a especificao for igual ou inferior a 2,0%. Se o desvio

padro relativo especificado for superior a 2,0%, os dados de seis replicatas devem ser utilizados. O fator de cauda, T, que indica a simetria do pico, igual a 1 para picos perfeitamente simtricos e maior que 1 para picos que apresentam assimetria. Em alguns casos, valores menores que 1 podem ser observados. Esses testes so realizados aps coletar os resultados de replicatas de injees da soluo padro ou outra soluo especificada na monografia individual. A especificao desses parmetros cromatogrficos, em uma monografia, no impede a modificao das condies de anlise. Ajustes nas condies de trabalho, de forma a atingir os parmetros de adequabilidade do sistema, podem ser necessrios. A menos que especificado na monografia individual, os parmetros de adequabilidade do sistema so determinados a partir dos dados obtidos com o pico da substncia de interesse. A preciso do sistema, demonstrada por meio de replicatas da soluo padro, deve ser alcanada antes das injees das solues amostras. A adequabilidade do sistema deve ser verificada durante toda a anlise cromatogrfica, por injeo de soluo padro em intervalos de tempo apropriados. Quando houver mudana significativa no equipamento ou em um reagente, os testes de adequabilidade do sistema devem ser realizados antes das injees da amostra. A anlise no ser vlida a menos que os requerimentos do teste de adequabilidade do sistema sejam alcanados.

CROMATOGRAFIA A GS
Cromatografia a gs (CG) uma tcnica de separao cromatogrfica baseada na diferena de distribuio de espcies de uma mistura entre duas fases no miscveis, na qual a fase mvel um gs de arraste que se move atravs da fase estacionria contida em uma coluna. CG est baseada no mecanismo de adsoro, distribuio de massa ou excluso por tamanho. aplicada a substncias e seus derivados que se volatilizam sob as temperaturas empregadas, e utilizada para identificao, teste de pureza e determinao quantitativa. Quando um constituinte vaporizado conduzido pelo gs de arraste para dentro da coluna, ele particionado entre a fase mvel gasosa e a fase estacionria por um processo de distribuio contracorrente dinmico, apresentando uma reteno maior ou menor devido a fenmenos de soro e dessoro sobre a fase estacionria.

Equipamento
O equipamento consiste em uma fonte de gs de arraste e um controlador de fluxo, uma cmara de injeo, uma coluna cromatogrfica contida em um forno, um detector e um sistema de aquisio de dados (ou um integrador ou registrador). O gs de arraste circula pela coluna com fluxo e presso controlados e segue diretamente para o detector. O injetor, a coluna e o detector apresentam temperatura controlada. A cromatografia se realiza a temperatura constante ou utilizando um programa de temperatura adequado. Os compostos a serem cromatografados, tanto em soluo como gases, so injetados, entrando em contato com o

gs de arraste na cmara de injeo. Dependendo da configurao do equipamento, a mistura a ser analisada deve ser injetada diretamente na coluna ou deve ser vaporizada na cmara de injeo e misturada no gs de arraste antes de entrar na coluna. Uma vez na coluna, os constituintes da mistura so separados em funo de seus diferentes ndices de reteno linear, os quais so dependentes da presso de vapor e do grau de interao com a fase estacionria. O ndice de reteno, que define a resoluo, o tempo de reteno e a eficincia da coluna em relao aos componentes da mistura, tambm temperaturadependente. O uso de programas de temperatura para o forno onde est a coluna apresenta uma vantagem na eficincia de separao dos compostos que se comportam diferentemente na presso de vapor. Os compostos saem separados da coluna, passando por um detector, que responde a quantidade de cada composto presente. O tipo de detector a ser utilizado depende da natureza dos compostos a serem analisados e especificado em cada monografia. Os detectores so aquecidos para evitar a condensao dos compostos eludos. A sada do detector dada em funo do tempo de reteno, gerando um cromatograma, que consiste de uma srie de picos no eixo do tempo. Cada pico representa um composto da mistura vaporizada, embora alguns picos possam sair sobrepostos. O tempo de eluio caracterstico de um composto individual e a resposta do instrumento, medido como a rea do pico ou a altura do pico, em funo da quantidade presente. Injetores Injees diretas de solues o modo usual de injeo, a menos que seja indicado diferentemente na monografia. A injeo pode se realizar diretamente na cabea da coluna utilizando uma seringa ou uma vlvula de injeo, ou em uma cmara de vaporizao que pode estar equipada com um divisor de fluxo. A quantidade de amostra que pode ser injetada em uma coluna capilar sem saturara menor quando comparada quantidade que pode ser injetada em colunas empacotadas. Colunas capilares, portanto, frequentemente so utilizadas com injetores capazes de dividir a amostra em duas fraes (modo split), uma menor que entra na coluna e outra maior que descartada. Esses injetores podem ser utilizados sem divisor de amostra (modo splitless) para anlises de componentes em menor quantidade ou em traos. As injees da fase de vapor podem ser efetuadas por sistema de injeo em espao confinado (headspace) esttico ou dinmico. Sistema de injeo em espao confinado (headspace) esttico (purge e trap) inclui um dispositivo de concentrao, por onde as substncias volteis da soluo so arrastadas at uma coluna adsorvente, mantida a baixa temperatura onde so adsorvidas. As substncias retidas so ento dessorvidas em uma fase mvel por aquecimento rpido da coluna adsorvente. Sistema de injeo em espao confinado (headspace) dinmico inclui uma cmara de aquecimento das amostras, termostaticamente controlada, na qual se colocam frascos (vials) fechados onde amostras slidas ou lquidas so colocadas por um perodo de tempo determinado, para permitir que os componentes volteis das amostras atinjam o equilbrio entre a fase no gasosa e a fase de vapor. Depois de estabelecido o equilbrio, uma quantidade predeterminada do espao confinado do frasco injetada no cromatgrafo.

Fases estacionrias
As fases estacionrias esto contidas em colunas que podem ser: Uma coluna capilar de slica fundida cuja parede est revestida com a fase estacionria;

 Uma coluna empacotada com partculas inertes impregnadas com a fase estacionria; Uma coluna empacotada com a fase estacionria slida.

Fases mveis
O suprimento do gs de arraste pode ser obtido a partir de um cilindro de alta presso ou por um gerador de gs de alta pureza. Em ambos os casos, o gs passa por uma vlvula de reduo de presso e o fluxo medido para, ento, entrar na cmara de injeo e na coluna. O tempo e reteno e a eficincia do pico dependem da qualidade do gs de arraste; o tempo de reteno diretamente proporcional ao comprimento da coluna e a resoluo proporcional raiz quadrada do comprimento da coluna. Para colunas empacotadas, a mdia de fluxo do gs carreador usualmente expressa em mililitros por minuto, presso atmosfrica e temperatura ambiente. O fluxo mdio medido na sada do detector, ou com um dispositivo mecnico calibrado ou com um tubo de borbulhamento, enquanto a coluna est com temperatura de funcionamento. A velocidade linear do gs de arraste atravs da coluna empacotada inversamente proporcional raiz quadrada do dimetro interno da coluna para um dado volume de fluxo. Fluxos de 60 mL/min em uma coluna de 2 mm de dimetro interno e 15 mL/min em uma coluna de 2 mm de dimetro interno, proporcionam velocidades lineares idnticas e, com isso, tempos de reteno similares. A menos que especificado na monografia, a mdia de fluxo para colunas empacotadas de, aproximadamente, 30 a 60 mL/min. Para colunas capilares, a velocidade do fluxo linear usualmente utilizada ao invs da mdia de fluxo. Isto determinado a partir do comprimento da coluna e do tempo de reteno de uma amostra de metano diluda, utilizando um detector por ionizao de chama. Operando a altas temperaturas, existe presso de vapor suficiente para que ocorra uma gradual perda da fase lquida, um processo chamado sangramento. Hlio ou nitrognio so, geralmente, empregados como gases de arraste para colunas empacotadas, enquanto que os gases de arraste utilizados para colunas capilares so nitrognio, hlio e hidrognio.

Detectores
Detectores por ionizao de chama so os mais utilizados mas, dependendo da finalidade da anlise, outros detectores podem ser empregados, incluindo: condutividade trmica, captura de eltrons, nitrognio-fsforo, espectrometria de massas, espectrometria no infravermelho com transformada de Fourier, entre outros. Para anlises quantitativas, os detectores devem apresentar uma ampla variao dinmica linear: a resposta deve ser diretamente proporcional quantidade de composto presente no detector em uma ampla faixa de concentraes.
Detectores por ionizao de chama apresentam uma ampla faixa linear e so sensveis maioria dos compostos. A resposta dos detectores depende da estrutura e da concentrao do composto e da mdia de fluxo da combusto, do ar e do gs de arraste. A menos que especificado diferentemente na monografia, detectores por ionizao de chama operam tanto com hlio quanto com nitrognio como gs de arraste para colunas empacotadas, e com hlio ou hidrognio para colunas capilares. Os detectores por condutividade trmica empregam fio de metal aquecido localizado na corrente do gs de arraste. Quando um analito entra no detector com o gs de arraste, a diferena na condutividade trmica da corrente de gs de arraste (gs e componentes da amostra) relativo a um fluxo de

referncia do gs de arraste sem analito medido. Em geral, detectores por condutividade trmica respondem uniformemente a compostos volteis sem considerar sua estrutura; entretanto, so considerados menos sensveis que o detector por ionizao de chama. Detectores por ionizao de chama alcalina, tambm chamado NP ou detector nitrognio-fsforo, contm uma fonte terminica, com um sal metal-lcali ou um elemento de vidro contendo rubdio ou outro metal, que resulta numa eficiente ionizao de nitrognio orgnico e compostos contendo fsforo. um detector seletivo que apresenta baixa resposta para hidrocarbonetos. Detectores por captura de eltrons contm uma fonte radioativa de radiao ionizante. Exibem uma resposta extremamente alta a compostos halogenados e grupo nitro, mas pouca resposta a hidrocarbonetos. A sensibilidade aumenta com o nmero e o peso atmico de tomos de halognio.

Dispositivos para tratamento de dados Estaes de tratamento de dados conectadas na sada dos detectores calculam a rea e a altura dos picos, e apresentam os cromatogramas completos contendo os parmetros da corrida e os dados dos picos. Os dados dos cromatogramas podem ser armazenados e reprocessados por integrao eletrnica ou outro tipo de clculo que seja necessrio. Essas estaes de tratamento de dados so utilizadas tambm para programar as corridas cromatogrficas.

Procedimento
Colunas empacotadas e capilares devem ser condicionados antes do uso at que a linha de base esteja estvel. Isso deve ser realizado operando a uma temperatura acima da especificada pelo mtodo ou por repetidas injees do composto ou da mistura a ser cromatografada. O fabricante da coluna geralmente fornece instrues para o adequado procedimento de condicionamento da coluna. Em caso de polisiloxanos metil e fenil substitudos termicamente estveis, uma sequncia especial aumenta a eficincia e a inatividade: manter a coluna temperatura de 250 C por 1 hora, com fluxo de gs hlio, para remover o oxignio e solvente. Para o fluxo de hlio, aquecer at 340 C por 4 horas, e ento reduzir o aquecimento at temperatura de 250 C, e condicionar com fluxo de hlio at a estabilidade da linha de base. Aps o procedimento de condicionamento, equilibrar a coluna, o injetor e o detector s temperaturas e fluxo dos gases especificados na monografia at a obteno de uma linha de base estvel. Preparar a(s) soluo(es) amostra e de referncia como descrito. As solues devem estar isentas de partculas slidas. Muitos frmacos so molculas polares reativas. Nesse caso, pode ser necessria a converso destes a derivados menos polares e mais volteis, por tratamento dos grupos reativos com reagentes apropriados. Os ensaios requerem comparao quantitativa de um cromatograma com outro.

A maior fonte de erro a irreprodutibilidade da quantidade de amostra injetada, notadamente quando injees manuais so realizadas com o auxlio de uma seringa. Os efeitos de variabilidade podem ser minimizados pela adio de um padro interno, um composto no interferente adicionado na mesma concentrao nas solues amostra e padro. A mdia das respostas do pico do analito em relao ao padro interno comparada entre os cromatogramas da amostra e do padro. Quando o padro interno quimicamente similar substncia a ser analisada, existe tambm uma compensao para variaes menores na coluna e nas caractersticas do detector. Em alguns casos, o padro interno pode ser conduzido atravs da preparao da amostra antes da anlise cromatogrfica para controlar outros aspectos quantitativos do ensaio. Injetores automticos aumentam a reprodutibilidade das injees das amostras e reduzem a necessidade de padres internos.

Cromatografia a gs em espao confinado (headspace)

A cromatografia a gs em espao confinado (headspace) uma tcnica particularmente adequada para a separao e determinao de compostos volteis presentes em amostras slidas e lquidas. Este mtodo est baseado na anlise de uma fase de vapor em equilbrio com uma fase slida ou lquida.

Equipamento
O equipamento consta de um cromatgrafo a gs ao qual se adapta um dispositivo para a introduo da amostra, que pode estar conectado a um mdulo de programao que controle automaticamente a presso e a temperatura. Se for necessrio, pode-se acoplar um dispositivo de eliminao de solventes. A amostra a ser analisada introduzida em um frasco provido de um obturador adequado que o fecha e de um sistema de vlvulas que permite a entrada de um gs de arraste. O frasco colocado em uma cmara termostatizada a determinada temperatura para a amostra ser examinada. A amostra deixada nesta temperatura por tempo suficiente para permitir que se estabelea o equilbrio entre a fase slida e a fase gasosa. O gs de arraste introduzido no frasco e, depois de determinado tempo, uma vlvula aberta para permitir que o gs se expanda at a coluna cromatogrfica, arrastando os componentes volteis. Ao invs de utilizar um cromatgrafo especialmente adaptado para a introduo das amostras, tambm podem-se utilizar seringas hermticas e um cromatgrafo convencional. Neste caso, o equilbrio entre as duas fases conduzido em uma cmara separada e a fase de vapor transferida para a coluna, tomando as precaues necessrias para evitar qualquer modificao do equilbrio.

Procedimento
Ajustar as condies de trabalho do equipamento a fim de obter uma resposta satisfatria, utilizando as solues de referncia. Calibrao direta Introduzir separadamente, em frascos idnticos, a preparao a examinar e cada uma das solues de referncia, segundo as condies descritas na monografia e evitando o contato entre a amostra e o dispositivo de injeo. Fechar hermeticamente os frascos e introduzi-los na cmara termostatizada a temperatura e presso descritas na monografia. Aps atingir o equilbrio, proceder anlise cromatogrfica nas condies descritas.

Adio de padro
Adicionar, a uma srie de frascos idnticos, volumes iguais da soluo a examinar. Adicionar a todos os frascos, exceto a um deles, quantidades crescentes de uma soluo de referncia, de concentrao conhecida da substncia a examinar. Deste modo, se obtm uma srie de preparaes contendo quantidades crescentes de determinada substncia. Fechar hermeticamente os frascos e introduzi-los na cmara termostatizada, segundo condies de temperatura e presso descritas na monografia. Aps alcanar o equilbrio, proceder anlise cromatogrfica nas condies descritas. Calcular a equao da reta por regresso linear, utilizando o mtodo dos mnimos quadrados e, a partir dela, obter a concentrao da substncia em exame na preparao da amostra, indicada pelo intercepto da equao.

Bibliografia:
Farmacopia Brasileira