Produo de enzimas por meio fermentativo

HISTRICO

A atividade cataltica de enzimas tem sido utilizada pelo homem h milhares de anos Fermentao do suco de uva para obteno do vinho; Fabricao de queijo; Fabricao de po.

No entanto, estas eram apenas aplicaes prticas, uma vez que o conhecimento do modo de ao dos catalisadores biolgicos s recentemente foi elucidado.

PROPRIEDADES GERAIS
Esquema Geral da Sntese de Protenas

DNA (Ncleo)

Transcrito em RNA

RNA traduzido em uma sequncia de polipeptdeos (protenas)

Enviado p/ o citoplasma

Nomenclatura e classificao das enzimas

Sculo XIX - poucas enzimas identificadas Adio do sufixo ASE ao nome do substrato: * gorduras (lipo - grego) LIPASE * amido (amylon - grego) AMILASE Nomes arbitrrios: * Tripsina e pepsina proteases Sculo XX - quantidade de enzimas descritas

Nomenclatura existente se tornou ineficaz Cada enzima cdigo com 4 dgitos que caracteriza o tipo de reao catalisada:
1 dgito classe 2 dgito subclasse 3 dgito - sub-subclasse 4 dgito - indica o substrato

1. Oxido-redutases (reaes de oxidao-reduo ou transferncia de

eltrons) 1.1.atuando em CH-OH 1.2.atuando em C=O 1.3.atuando em C=O1.4.atuando em CH-NH2 1.5.atuando em CH-NH1.6.atuando em NADH, NADPH

2.Transferases (transferem grupos funcionais entre molculas) 2.1.grupos com um carbono 2.2.grupos aldedo ou cetona 2.3.grupos acil 2.4.grupos glicosil 2.7.grupos fosfatos 2.8.grupos contendo enxofre 3.Hidrolases (reaes de hidrlise) 3.1.steres 3.2.ligaes glicosdicas 3.4.ligaes peptdicas 3.5.outras ligaes C-N 3.6.anidridos cidos

4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico) 4.1. =C=C= 4.2. =C=O 4.3. =C=N5.Isomerases (transferncia de grupos dentro da mesma molcula para formar ismeros)

5.1.racemases
6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre duas pr-existentes, sempre s custas de energia) 6.1. C-O 6.2. C-S 6.3. C-N 6.4. C-C

So protenas com exceo de alguns grupos de RNA que apresentam atividade cataltica Estrutura molecular
Maior parte de protena / CHO e lipdeos

Algumas enzimas necessitam molculas no proteicas:

Co-fatores: ons (Mg+2, Ca+2, etc) e molculas orgnicas (NAD, FAD)

Co-enzimas: derivados de vitaminas

As enzimas tem origem:

Tecido animal Tecido vegetal Microrganismos

Fontes: Animais

Lipase Pancretica, Pepsina

Bromelina, Papana

Vegetais

Micro-organismos

Lactase: S.fragilis, Lipase: Aspergillus niger

A produo se faz majoritariamente por fermentao submersa, nos pases orientais h uma tradio estabelecida de utilizao da fermentao semi-slida.

Catalisadores qumico x enzimas

Outras formas de classificar:

atuam no interior da clula Enzimas intracelulares

sintetizam o material celular

realizam reaes catablicas que suprem as necessidades energticas da clula.

atuam fora da clula Enzimas extracelulares executando as alteraes necessrias penetrao dos nutrientes para o interior das clulas.

Agem dentro das molculas

Endoenzimas Ex: endoamilases, que hidrolisam ligaes glicosdicas ao acaso ao longo das cadeias de amilose

Agem nas extermidades das molculas Ex: exoamilases, que hidrolisam,sucessivamente, ligaes glicosdicas a partir da extremidade no redutora das mesmas.

Exoenzimas

Enzimas habituais ou constitutivas

As clulas sempre as sintetizam

Enzimas indutivas

As clulas s as sintetizam quando esto na presena do substrato da enzima

Isoenzimas

Enzimas que tm a mesma funo, ou seja, catalisam uma mesma reao, porm apresentam estruturas diferentes

MECANISMO DE AO:

A reao enzimtica ocorre em duas etapas: E+S ES P+E

2 modelos: Modelo chave-fechadura Modelo do ajuste induzido

Modelo Chave-fechadura Emil Fischer em 1894 Relao estrica entre enzima e substrato

Modelo do ajuste induzido Koshland em 1958 Prev um stio de ligao no totalmente prformado, E e o S sofrem conformao para o encaixe.

Especificidade enzimtica

Algumas enzimas apresentam especificidade estrita:

Ex: fumarase que transforma L-malato em fumarato no atuando no Dmalato

Algumas no so to especificas:
Ex: xilose isomerase, catalisa a transformao de xilose em xilulose, bem como a de glicose em frutose

REAES CATALISADAS POR ENZIMAS

Catalisador atua diminuindo a Energia de Ativao

Energia do sistema (G)

No catalisada Catalisada

Energia de Ativao na ausncia de enzima Energia de Ativaao na presena de enzima

Reagentes

G reao
Produtos

Progresso da Reao

Estrutura da protena

Estrutura 1a tipo de sequncia dos aa na molcula proteica (gentico); Estrutura 2a configuraes espaciais das cadeias polipeptdicas determinadas pela estrutura 1a, como tambm pelas interaes entre seus aa. -hlice e folha ;

Estrutura 3 configura o stio cataltico da enzima. As interaes entre aa que provocam tores e dobramentos de regies da molcula;

Estrutura 4a Refere-se interao entre cadeias polipeptdicas ou subunidades e ocorre em algumas enzimas complexas da regulao.

Conformao e a estabilizao da estrutura molecular das enzimas

Atravs de ligaes:
Pontes de Hidrognio

Van der Waals

Ligaes inicas

Fatores que afetam a estabilidade e especificidade das enzimas:

Estrutura tridimensional Condies ambientais pH Temperatura Fora inica do meio

Atividade enzimtica

A expresso da atividade de uma enzima medida atravs de sua velocidade de reao A atividade enzimtica expressa em unidades de atividade. expressa em unidades (IU) quantidade de enzima que catalisa e transforma um micromol de substrato por minuto (U/mg).

Produo de enzimas por mo

Aplicao comercial:
bactrias, fungos filamentosos e leveduras;

Produo de enzimas extracelulares industriais:

Bacillus e Aspergillus (80- 85% do mercado de enzimas extracelulares)

Produo de enzima

Cintica de Produo de Metablitos

Produo de Enzimas
As enzimas como agentes metablicos tero o carter de metablitos primrios ou secundrios dependendo da sua funo metablica Maioria das enzimas comerciais: enzimas degradativas (catabolismo) e tm as caractersticas dos metablitos primrios. Isto no absoluto! Modelo de Ludecking & Piret para a cintica de produo de metablitos

por fermentao:

Produo de enzima

Cintica de Produo de Metablitos Modelo de Ludecking & Piret para a cintica de produo de metablitos

por fermentao:

Metablitos primrios: Metablitos secundrios, Situaes intermedirias so freqentes na prtica.

Ex.: -amilase de Bacillus subtilis, glucoamilase de Aspergillus niger e

lactase de Escherichia coli

Produo de enzima
Cintica de Produo de Metablitos Uma enzima no necessariamente sintetizada durante parte do ciclo de crescimento

Produo de enzima
divida em: Processo a montante (upstrean) Fermentao Processo a jusante (drownstream)

Processo a montante (upstream)

Importncia do inoculo Cuidados com manuteno e estocagem do microrganismo Preparo do inoculo

Processo a montante (upstream)

Controle dos parmetros:

Presena de contaminantes

Infeco por bacterifagos (protozorios)

Proliferao de mutantes de menor eficincias Inoculo de 1 a 10% (p/v)

O processo fermentativo

Utilizao do meio de cultura especifico para produo de enzimas Meios sintticos e matria-prima natural Os meios de cultivo devem conter:
Fontes de carbono e energia (glicose, farinhas amilaceas, melaos, licores de milho etc.) Fontes de nitrognio (peptona, farinha de peixe, gelatinas etc.) Minerais Fatores de crescimento (extrato de leveduras, farinha de sementes de leguminosas) Indutor (amido para amilase, ureia para urase, xilose para xiloseisomerase

Processo fermentativo

Escala industrial fermentao submersa Pases orientais utilizam-se fermentao semi-slido a partir de:
Farelo e palha de trigo, farelo e farinha de soja, resduos slidos do processamento de mandioca, palha de arroz, bagao de cana, casca de amendoim e etc.

Avanos tecnolgicos e o controle do processo proporcionam aumento do rendimento do processo

Processo fermentativo
Vantagens e desvantagens da fermentao em estado slido comparada com a fermentao submersa Vantagens Meio de cultura simples (resduos) Pr-tratamento do substrato mais fcil Desvantagens M.O. limitados ( baixo teor de agua livre) Deve-se retirar o calor gerado pelo metabolismo deve ser remivido

Gera pouco resduo

Utiliza pousa gua Auta [ ] de inculo (inib. contaminao.)

Distribuio de oxignio menor que a FS

Controle da temperatura Controle de crescimento microbiano

Menor custo de equipamentos

Exige menor gasto de energia

Controle de aerao
Controle do pH

FS x FSS

Processo a jusante (drownstream)

O que determina que operaes devem ser realizadas aps o processo fermentativo Depende da enzimas de interesse (intra ou extracelular).

Etapas inicias de separao e concentrao

Enzimas extracelulares ( 5C)

Evita o crescimento de contaminantes

pH ajustado no ponto timo da enzima Separao (centrifugao e filtrao). Centrifugao (fungos filamentosos) e floculao com CaCl2 (bactrias e leveduras) Ultrafiltrao melhor que a concentrao a vcuo

Etapas inicias de separao e concentrao

Enzimas intracelulares
Biomassa obtida atravs da centrifugao

Utilizao de agentes que precipitam os as substncias indesejveis

Tcnicas para rompimento celular

Homogeneizao em alta presso Congelamento

Tratamentos qumicos e enzimticos

Etapas inicias de separao e concentrao

A partir do concentrado enzimtico no diferenciado entre a natureza da enzima intra e extra celular

Preocupao com estado fsico e grau de pureza

Devido a aplicao, transporte, estocagem, necessidade de um preparo enzimtico bruto na forma solida Deve passar pelo processo de secagem por vcuo ou por atomizao

Etapas inicias de separao e concentrao

Produto solido No pode apresentar granulomtrica baixa (<200 a 500 m)

Algumas enzimas so encapsuladas Mistura-se material inerte para aplicao comercial

Produto liquido
Quando necessrio maior grau de pureza

Uso de precipitao
Solventes orgnicos (35C) Ultrafiltrao e microfiltrao Cromatografia liquida e alta eficincia CLAE

Purificao da enzima

A qualidade e tipo de purificao depende do destino do uso que se destina Em escala laboratorial necessrio maior pureza exigindo menor quantidade e tem auto custo

Em escala industrial (alimentcias e detergentes) a demanda pela enzima maior, menor pureza e visa um processo de menor custo Em industrias teraputicas precisa-se de alta pureza e menor quantidade

Purificao da enzima

Necessidade bsicas para realizar a purificao e preservar a atividade enzimtica Durante a etapa de purificao pode haver perdas divido a desnaturao e protelise Temperatura de purificao de 4C. O uso de tampo evita a desnaturao e tambm a inativao enzimatica O tampo de apresentar estabilidade qumica e biolgica e no ser toxico com as enzimas Ateno enzimas podem ser estabilizadas pelos seus substratos e co-fatores adicionados a soluo tampo Concluso

Aplicaes nas industrias

Enzimas podem ser aplicadas em vrias reas:

Indstria de curtumes, Indstria txtil, Indstria de papel e celulose, Produo de detergentes, Industrias de Alimentos leos e gorduras, Produo de lcool, Indstria de Cosmticos, Biossensores, Em anlises, Em medicina

Aplicaes nas industrias

Principais industrias que produzem enzimas

Detergentes

So substncias que baixam a tenso superficial da gua.

facilitando a penetrao nos tecidos

Constitudos de cadeia longa de hidrocarbonetos 12 a 20 tomos de carbono

Possui parte hidrofbica ou lipoltica

Possui parte hidroflica ( extremamente apolar)

No Brasil: atualmente a Unilever lder de mercado

Detergentes

As enzimas mais comumente usadas em detergentes so:

proteases (especfica para agir sobre protenas);

amilases (para amido);

lipases (para gorduras) celulases (atuam nas fibras dos tecidos para liberar as manchas, remover bolinhas e rejuvenescer as cores).

Detergente

Vantagem a substituio de produtos custicos, cidos e solventes e sua utilizao para:

(i) digerir e dissolver resduos orgnicos (sangue, fezes, urina, vmitos e outros);
(ii) higienizar as partes externas e internas de instrumentos cirrgicos; (iii) desobstruir canais com resduos coagulados; (iv) eliminar resduos fecais dos canais e superfcies dos fibroscpios; (v) remover contaminantes da rouparia hospitalar. (VI)economia de energia (VII) no necessitam investimento em equipamento especial resistente a calor, presso ou corroso (VIII) especificidade maior

Detergentes

Aplicao mais conhecida das enzimas (desde os anos 60) Detergentes industriais com enzimas:
Lavagem de roupas em domiclio (segmento mais importante) Lavagem de roupas industriais e institucionais Lavagem de pratos e talheres em domiclios

Ateno: no usar detergente biolgico em l e seda

Enzimas em detergentes atuam em condies drsticas de meio reacional
Presena de tensoativos, alcalinizastes, perfumes, pigmentos
Elevado pH, Elevada temperatura

Detergente

Tipos de enzimas usadas em detergentes Proteases:

Mais utilizadas em detergentes Removem manchas de ovo, sangue, suor, extratos vegetais e etc Detergentes sem enzimas: ineficiente para remover manchas de ptn

Proteases Alcalinas:

Possuem pH timo alcalino e atuam em T elevada (Europa) Fermentao submersa

Ex.: savinase, alcalase e etc

Microrganismo produtor: Bacillus sp.

Atuao sinergitica: Hidrlise limitada: manchas mais acessveis Protenas agem como cola

Detergentes

Lipases:
Lavagem de roupas em T baixa: difcil remoo de leo e gorduras

Estveis em pH alcalino cidos graxos, mono, di- glicerdeos e glicerol

Lipolase
Remove manchas de batom, frituras, azeite, molhos, etc

Transforma TG em cidos graxos, mono, di- glicerdeos e glicerol

Detergente

Amilases: (ISO 9000 e ISO 14000)

Remoo de resduos de alimentos que contm amido

Amido: atua como cola

Produo por: Bacilus licheniformis, B. amyloliquefaciens Hidrolisam amido transformando em oligmeros de cadeia curta Resistncia a pH alcalino e T elevadas

Detergente

Celulases:
Produzida por Bacillus sp. ou Humicola sp.

pH timo = 7; resistente a pH mais elevado

Modificao das fibrilas celulsicas (algodo) Degradam o tecido das roupas de algodo: remoo das fibrilas de celulose Efeitos: Intensificao da cor Amaciamento Remoo de partculas de sujeiras

Detergente

Detergente em p:
Dcada de 60: Enzima em p adicionada Problema: formao de poeira reaes alrgicas Presena de enzima revestida com substncia inerte altamente resistente a impacto e abraso no forma poeira Tamanho do grnulo: similar s partculas do detergente para no segregar durante o transporte

Partculas devem se dissolver rapidamente no lquido

Os detergentes biolgico tem maior rendimento do que os qumicos

Industria txtil

Fibras naturais:
algodo, l, seda;

Fibras sintticas:
polyester, nylon, lycra

Industria txtil

Limpeza: Remover sujeiras do algodo e tornar as fibras paralelas

Liberao de fibras celulsicas: destruio da parede secundria (substncias pcticas)
Tradicional: soda custica sob presso e temperatura elevada; Problema: segurana e poluio ambiental Enzimtico: uso de enzimas pectinolticas

Busca por micro-organismos produtor de pectinase e com baixa atividade de celulases

Micro-organismo: Penicilium sp.

Industria txtil

Desengomagem:
Remover goma (fcula de mandioca ou goma sinttica) aplicada ao tecido antes da tecelagem

Tradicional:
produtos qumicos fortes: cidos, bases ou agentes oxidantes; Problema: segurana e poluio ambiental

Enzimtico:
uso de enzimas que hidrolisam amido No causam estragos no tecido Mais utilizadas: alfa-amilases bacterianas termotolerantes

Industria txtil

Purga (limpeza) Processo convencional ( produtos qumicos alcalinos) Processo enzimatico

A pectinase uma enzima que degrada a pectina (polissacardeo de cadeia longa) Essa pectina atua como uma cola entre as impurezas, que deseja ser retirada, e as fibras de algodo.

Industria txtil

Alvejamento: Branqueamento do pano

Tradicional: Hipoclorito de sdio, perxido de hidrognio;
Problema: resduo pode interferir no processo de tingimento

Enzimtico: peroxidase para decompor o perxido de hidrognio em gua e oxignio.

Industria txtil

Tingimento:
Tratamento enzimtico com celulases e proteases (em algodo)
Retira de resduos de perxido de hidrognio Oxidas corantes naturais da gua (evitando a perda)

Confere uma aparncia mais regular e lustrosa Remove o fuzz:

filamentos minsculos da fibra que se projetam para fora da superfcie do fio

Industria de Alimentos
ENZIMA FONTE APLICAO

Papana

mamo

Ajuda na digesto, Mdica, bebidas, carnes

Bromelina

abacaxi

Ajuda na digesto, Mdica, bebidas, carnes

Diastase

malte

Panificao, xarope

Pepsina

mucosa gstrica suno

Amaciamento de carne

Lipase

Candida rugosa

Tratamento de efluentes

Industria de Alimentos
Proteases Leite: na preparao do leite de soja.

Carnes e Peixes: recuperao de protenas do osso ou espinha.

Vinhos: clarificao.
Queijo: coagulao da casena.

Industria de Alimentos
Lactase Sorvete: preveno da cristalizao da lactose. Leite: estabilizao das protenas do leite em leites congelados por remoo da lactose. Hidrlise da lactose, permitindo o uso por adultos deficientes na lactase intestinal e em crianas com deficincia em lactase congnita.

Reao: converso da galactose em lactose e glicose.

Industria de Alimentos

-amilase Fermentados: converso do amido a maltose por fermentao. Remoo da turbidez do amido

Cereais: converso do amido a dextrinas e maltose.

Chocolate/cacau: liquefao do amido

Industria de Alimentos
Peroxidase Deteriorao - Frutas: contribui na reao de escurecimento. Polifenoloxidase Ch/Caf: desenvolvimento do escurecimento durante o amadurecimento e fermentao. Deteriorao - Frutas e Vegetais: reao de escurecimento e perda de vitaminas.

Industria de Alimentos
Panificao

Industria de Alimentos

Glten: complexo protico formado quando a gua combinada com a farinha

Glutenina: tenacidade elasticidade

Gliadina: extensibilidade viscosidade

Propriedades de qualidade de panificao: dependem principalmente das propriedades viscoelsticas do glten --> composio das gluteninas e das gliadinas.

Industria de Alimentos

Panificao

Industria de Alimentos

Enzimas na Panificao Amilase: transformao de amido em acar por fermentao com leveduras, converso de amido em maltose por fermentao, liquefao do amido, mudanas de textura em vegetais.

Industrias de Alimentos

Vantagem de utilizar amilases:

Aumentam os acares fermentescveis, ( produo de gs) Retardam o envelhecimento precoce do po Aumentam o volume do po Permitem a modificao adequada do amido, evitando a formao de miolo gosmento

Tipos de amilases:
-amilase: produz dextrinas; farinhas podem ter quantidade excessiva, ideal ou a menos.
Baixa -amilase (bolo solado)

-amilase: produz maltose quantidade suficiente.

dextrinas;

farinhas

contm

A presena de ambas as enzimas necessria para assegurar a rpida converso do amido disponvel acar, responsveis pela cor da crosta e flavor.

Industria de Alimentos
1.

2.

3.

Proteases: Causam a ciso das ligaes peptdicas na estrutura do glten. Inicia-se na mistura e continua na fermentao at o cozimento. benefcios: reduo de tempo de mistura, aumenta a extensibilidade da massa, e aumento da vida til nos produtos de panificao.

1. 2.

Lipases: Hidrolisa lipdeos em glicerol e cidos graxos. Relacionados a estabilidade e ao armazenamento.

Industria de Alimentos
Sucos Fluxograma do suco de laranja

Industria de Alimentos

Despolpamento
Facilita a extrao: dissolve o tecido da planta , forma suspenso celular. Uso tambm de celulases que auxiliam na maior extrao em solues viscosas Sumo: reduo da viscosidade Solubilizao das pectinas - Capa intermediria destruio da estrutura, libera mais suco, aumenta porosidade da matria slida

Industria de Alimentos

Despolpamento (liberadas na mareceo) Uso de calor para acelerar Despolpamento Uvas : 50C Mas e peras: 15 a 30C 20 min a 4 horas

Industria de Alimentos

Clarificao
Desestabilizar material em suspenso para facilitar a retirada, acelera em at 50% o tempo de filtrao Reduo da viscosidade, facilita outros processos de clarificao (adio de gelatina, slica ou bentonita) Eliminao de substncias que poderiam turvar depois Quebra da protopectina (impede reao de floculao entre protenas e polifenis). Melhorar propriedades sensorial

Pancreatina apresenta atividade amiloltica, proteoltica e lipoltica

Pncreas de porco
Antigamente: realar sabor de queijos Atualmente: Auxiliar digestivo

Renina Usada na elaborao de queijos

Malte Proteases, lipases e hemicelulases, oxiredutases e amilases (alfaamilases: no gro durante a germinao; betaamilase presente no gro antes da germinao) Origem: malte de cevada Aps germinao feita secagem: paralisao da atividade biolgica do gro e reduzir teor de umidade

Produo de enzimas por tecido

Ainda se produz um nmero importante de enzimas de tecidos animais e vegetais renina usada na elaborao de queijos, proteases vegetais usadas em anti-inflamatrios, amilases para a preparao de mostos de cerveja As enzimas de origem vegetal so produzidas em grande parte como subprodutos da atividade agrcola; papana, extrada do latx do papaya, bromelina, obtida do talo da pinha. Situao anloga: enzimas de origem animal que se obtm como subprodutos dos matadouros (renina).

Produo em grande escala de enzimas em cultivos artificiais de tecidos: pouco factvel complexidade do sistema alto custo dos meios de cultivo Produo de enzimas sofisticadas de alto custo:

competio com a produo por fermentao usando microrganismos geneticamente modificados

Enzimas de Origem Animal Tecidos animais so secos e triturados (moinhos ou homogeneizadores) Extradas com soluo aquosa ou tampo Resduos removidos por filtrao (uso de terra diatomcea) ou centrifugao