Fundamentos dos Mtodos

Colorimtricos e Espectrofotomtricos
Prof.DSc.Williams Jorge da Cruz Macdo

CAPANEMA 2014
1.INTRODUO

Colorimetria e Espectrofotometria so
mtodos pticos que empregam a luz, ou
melhor, as propriedades da interao da
luz com a matria, para fazer a anlise
qualitativa e quantitativa das
substncias.

Matria e energia no so consideradas entidades distintas, de acordo com a
equao de Einstein: E = mC
2.
E = energia, m = massa, c = a velocidade da luz no vcuo,

Medem-se tambm o comprimento de onda e a freqncia (propriedades
ondulatrias) de partculas como eltron, prton ou nutron.

A radiao eletromagntica caracterizada por um:
Comprimento de Onda (=lambida): a distncia de
uma onda a outra;

Freqncia (v=ni): o nmero de onda mximo que
passa por um ponto fixo, por unidade de tempo; cuja
unidade dada em s-1 ou Hertz ( 1Hz= 1s-1);

Amplitude (A): a altura de um onda, medida a
partir do ponto mdio, at o ponto mximo.
2.PROPRIEDADES ONDULATRIAS E CORPUSCULARES DA LUZ
Comportamento da Radiao Eletromagntica
A radiao eletromagntica pode apresentar
propriedade de partcula (fton);

Comportar-se como uma onda de energia, viajando da
velocidade da luz (2,9979x10
8
m.s
-1
).

A luz um Conjunto de partculas se deslocando no
espao (ftons) com comprimento de onda(-lambida) e
freqncia (= ni),
. E = h ou E = hc/
Figura. Esquema geral do Efeito
Fotoeltrico. (OBS. Quando uma
radiao suficientemente energtica
atinge uma superfcie metlica,
observa-se a emisso de eltrons.
A esse fenmeno damos o nome de
efeito fotoeltrico)
E energia ; h a constante de
proporcionalidade (constante de Planck). Essa a
energia da partcula (um fton) de luz.

A energia do conjunto de ftons se deslocando no
espao seria dada por:
E = Nh, onde "N" seria o nmero de ftons.
Espectrofotometria de absoro Atmica
Comportamento da Radiao Eletromagntica
Espectrometria

Molecular
Faixa do espectro: 190 800 nm

Molculas absorvem a radiao

Espectro em forma de banda

Ex: colorimetria,
espectrofotometria

Atmica
Faixa do espectro: 190 800 nm

tomos absorvem a radiao

Espectro em forma de raias

Ex: absoro atmica, emisso
atmica

Espectrofotometria de absoro
Espectros de absoro
Riscas Abs. Atmica
(n limitado de frequncias
absorvidas)
Bandas Abs. Molecular
(maior n de estados de
energia)
tomo
Molcula
Energia
E
1
E
0
E = h.
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a

(nm)
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a

(nm)
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a

(nm)
Nvel de energia eletrnico
Nvel de energia vibracional
Nvel de energia rotacional

Absoro Molecular: espectro de bandas

Comportamento da Radiao Eletromagntica
Espectrofotometria de absoro Atmica
Absoro Atmica: espectro de raias

Nvel de energia eletrnico
Nvel de energia vibracional
Nvel de energia rotacional

Espectrofotometria de absoro Atmica
Fundamentos
Princpios de Kirchoff

Um elemento no estado fundamental capaz de absorver
radiao no mesmo que ele emite quando excitado (energia
quantizada)

E
0

E
*

E
0

E
*

E
0

E
*


Absoro
atmica
Emisso
atmica
Espectrofotometria de absoro Atmica
Ocorrncia da excitao
Energia Incidente
Eltron expulso
Energia Liberada
K
L
M
X
Espectrofotometria de absoro Atmica
Essas grandezas esto relacionadas entre si e com a
velocidade da luz (c) pela seguinte relao: c = x f
Espectro de radiao eletromagntica
A luz visvel parte muito pequena do espectro (de 3800 a 7800 )
3.A INTERAO DA LUZ COM A MATRIA
As cores so diferentes comprimento
de onda do espectro eletromagntico

Absoro de Luz

Espectro de emisso de uma lmpada de
tungstnio-halognio (luz branca)
Soluo etanlica (amarela)
de fluorescena 10
-5
molar
Regio espectral transmitida por uma soluo
aquosa de azul de bromotimol 10
-5
molar
(laranja!)
Espectroscopia
Termo geral para a cincia que trata da interao da
matria com vrios tipos de radiao.
Espectrometria /mtodos espectromtricos
So mtodos analticos baseados em espectroscopia
molecular e atomica (tratam da medida da intensidade
da luz com transdutor fotoeletrico)
Espectrofotometria
Medio de substncias qumicas baseadas em
informaes espectrais de um conjunto de ftons,
em um espectrofotmetro
Colorimetria quantificaao em colormetro
4. COMO E PARA QUE MEDIR A ABSORO DE LUZ

Se incide-se um feixe de luz com intensidade Po,
aps passar pela amostra ele ter uma nova
intensidade P, menor do que Po, pois uma parte
da luz foi absorvida. A nova intensidade
detectada.
A intensidade de P depende da intensidade
de Po, da concentrao do analito (C), do
dimetro do tubo (caminho tico-b), do que
incide e, claro, de que espcie a amostra.
Amostra de concentrao C
Para medir concentrao, os outros fatores no podem variar e
deve-se manter:
o mesmo comprimento de onda para o mesmo tipo de amostra.
a mesma espessura de cubeta.
a mesma intensidade de Po.
TRANSMITNCIA=Po/p
A idia geral de um mtodo instrumental
Mtodos espectroscpicos
A trs a informao sobre a
concentrao
a) FILTRO = COLORMETRO
b) PRISMA ou GRADE DE DIFRAO = ESPECTROFOTMETRO
Monocromador (luz visvel)
Fonte de
radiao
Fenda de entrada
Prisma
Fenda de sada
Feixe policrmico Feixe disperso
Feixe monocrmico
Celas de Medida
5. A LEI DE LAMBERT-BEER

Imagine um aparelho que capaz de medir a
transmitncia de uma amostra e que se
encontram disposio vrias solues-padro
da mesma substncia. Como seria o grfico?
A relao experimental entre transmitncia e concentrao tem a forma de uma
exponencial inversa.
Para se ter o grfico de uma reta, basta aplicar o logaritmo. Como os valores so
menores que 1, para no ter nmeros negativos, aplica-se o logaritmo do inverso
(log 1/T).

A razo entre a radiao transmitida e a radiao absorvida pela
amostra analisada a transmitncia (T). E o equipamento j fornece a
medida em absorbncia
(A= -logT ).
Lei de Beer

Exemplo: Absorbncia, Transmitncia e a Lei de Beer
Encontre a absorbncia e a transmitncia de uma soluo 0,00240 M de uma substncia
com coeficiente de absortividade molar de 313M
-1
cm
-1
numa clula com 2,00 cm de
caminho ptico.
Soluo: A equao 06 nos d a absorbncia
A = . b . c A = 313 x 2,00 x 0,00240 A = 1,50
A transmitncia obtida pela elevao da potncia de cada lado da equao 05:
log T = -A
A = - log T
= 0,0316
Apenas 3,16% da luz incidente emerge dessa soluo.
Espectrofotmetros Portteis
Cromforos Representativos
Composto Cromforo
max
(nm) Log
Octeno-3 C=C 185 , 230 3,9
Acetileno C=C 173 3,8
Acetona C=O 188 , 279 2,9 , 1,2
Acetato de diazoetila N=N 252 , 371 3,9 , 1,1
Butadieno C=C-C=C 217 4,3
Crotonaldedo C=C-C=O 217 , 321 4,2 , 1,3
Dimetilglioxina N=C-C=N 226 4,2
Octatrienol C=C-C=C-C=C 265 4,7
Decatetraenol [-C=C-]
4
300 4,8
Vitamina A [-C=C-]
5
328 3,7
Benzeno 198 , 255 3,9 , 2,4
1,4-Benzoquinona C C 245 , 285 , 435 5,2 , 2,7 , 1,2
Naftaleno 220 , 275 , 314 5,0 , 3,7 , 2,5
Difenilo 246 4,3
6. A CURVA DE CALIBRAO EM
ESPECTROFOTOMETRIA

Procedimento para calibrar aparelhos para anlise em
espectrofotometria:
Primeiramente ajustar o 100 %T do aparelho com a cubeta
contendo somente o solvente utilizado (normalmente gua).
Ajustar o 0 (zero) %T com o feixe de luz totalmente obstrudo.
Fazer a varredura da soluo da substncia em questo.
Com o comprimento de onda escolhido, fazem-se as medidas
de transmitncia de uma srie de padres da substncia.
Calculando as absorbncias, constri-se o grfico de A x C, que
servir de base para a anlise da amostra desconhecida:
7. Anlise Quantitativa

Mtodo da curva de calibrao
(padro externo)
Mtodo da adio de padro
Mtodo absoluto



Mtodo da curva de
calibrao (padro externo)
preparao de padres de concentraes C
1
, C
2
,
C
3
, ... C
n
, a que correspondem valores de
absorvncia medidos A
1
, A
2
, A
3
, ... A
n

C
1

A
1

C
2

A
2

A
3

A
n

C
3
C
n

A
x

C
x

ab
A = a.b.C
referente
amostra
Mtodo da Adio de padro
Amostra de composio
desconhecida e/ou complexa
Espcie absorvente presente
em concentraes muito baixas


No vivel utilizar o mtodo da curva
de calibrao
Mtodo da Adio de padro
Amostra
problema
C
x

C
x
+C
1
C
x
+C
2
C
x
+C
3
C
x
+C
n

Amostra problema acrescida de
uma concentrao C
1
, C
2
,...C
n

A
2

A
1

A
n

A
3

C
1
+
C
x

C
2
+
C
x

C
3
+
C
x

C
n
+
C
x

C
x

Pode-se medir o valor de A
x
correspondente a C
x

Mtodo absoluto
Aplicao direta da lei de Beer
A = abC
O valor a (absortividade) est tabelado
b (percurso ptico) conhecido
A (absorvncia) medida

Obteno do valor de C
(concentrao)
ANLISE DE MISTURA DE CROMFOROS


A lei de Beer refere o comportamento ideal
de uma soluo quando atravessada por um
feixe de energia radiante, o que na prtica
impossvel fixar

Desvios Reais, Qumicos ou Fsicos
8. DESVIOS DA LEI DE BEER

Desvios Reais desvios linearidade resultantes do
uso de:
solues concentradas do analito;
solues diludas do analito e concentradas em
electrlitos.

Desvios Qumicos a causa encontra-se no prprio
sistema a analisar (a espcie absorvente sofre
associao, dissociao ou reaco com outras
espcies presentes em soluo gerando produtos que
absorvem de uma forma diferente do analito)
A ocorrncia dos desvios qumicos controlada
fixando o pH, a fora inica, a concentrao de outras
espcies presentes.
Desvios Fsicos ou Instrumentais a causa
inerente aos instrumentos com os quais se
opera:

Uso de radiao no monocromtica;
Reflexo da radiao incidente;
Deficiente estado de conservao das
faces de incidncia das clulas que
suportam a amostra;
No paralelismo da radiao incidente.


Desvios da Lei de Beer

1 - Verifica-se a lei de Beer
2 - Desvio negativo
3 - Desvio positivo
1
3
2
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a

Concentrao
Anlise Qualitativa
240 250 260 270 280 290 300
Comprimento de onda (nm)

2
,
0








2
,
2




2
,
4







2
,
6







2
,
8








3
,
0







3
,
2


L
o
g

A ou B
C
D
C
5
H
11
C
5
H
11
OH
C
5
H
11
R
OH

OH
R
OH

C
5
H
11
OH

OH
OH OH

(A)
(B)
(C) (D)
Espectro de absoro do canabidiol comparado com outros fenis.
(661,6 nm)
(644,8 nm)
9.Concluso
Analise de medicamentos
Amostras ambientais
Vinho=Vinho= cido tartrico,
ferro, sulfito,aucar, cobre


Determinao de metais:Na K
Ca Mg Fe Al Cd Pb Hg Se Cu

10. Referncias Bibliogrficas
Christian, G.D., Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., 5a edio, 1994.
Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., Fundamentals of Analytical Chemistry,
Saunders College Publishing, 7a edio, 1995.
Gonalves, Ma de L., Mtodos Instrumentais para Anlise de Solues,
Fundao Calouste Gulbenkian, Lisboa, 1983.
Willard, H. , Merrit Jr., L., Dean, J., Anlise Instrumental, Fundao Calouste
Gulbenkian, 2 edio, Lisboa, 1979.
GORDON, D.B. 1995. Spectroscopic Techniques.pp. 324-344 in Principles and Techniques
in Practical Biochemistry. K. Wilson & J. Walker Eds., Cambridge University Press,
Cambridge
REED, R., HOLMES, D., WEYERS, J. & JONES,A.J. 1998. Practical Skills in Biomolecular
Sciences. Ed. Prentice Hall
HARRIS, D. C. 2008. Anlise Qumica Quantitativa. Pp.415-425.; traduo Jairo
Bordinho...[et al.] Rio de Janeiro: LTC.


7/10/2014 46
Transporte atravs da membrana e osmose



7/10/2014 47
Molculas se movem em soluo por
movimento browniano
7/10/2014 48
O tempo de difuso aumenta 10 vezes em
relao a distncia a ser difundida
Distncia da difuso (mm) Tempo
1 0,5 ms
10 50 ms
100 5 s
1000 8,3 min
10000 14 hr
7/10/2014 49
O Coeficiente de difuso (D) proporcional a
velocidade na qual a molcula se difunde pelo meio
D inversamente proporcional ao tamanho da molcula (pr)
e a viscosidade do meio circulante(h) ; k =constante de
Boltzman
D = kT/6prh
1 2 3
D1 < D2 < D3
7/10/2014 50
O fluxo (J) de uma substncia atravs de uma membrana proporcional a rea da
membrana (A) e a diferena de concentrao dessa substncia (C), e
inversamente proporcional a espessura da membrana (x) (lei de Fick)
Fluxo difusional lquido
J = -DA (C/x)
7/10/2014 51
A membrana celular lipdica e possui
protenas integrais que a atravessam
7/10/2014 52
O coeficiente de partio leo/gua reflete a solubilidade
de uma substncia em lipdeos e proporcional a sua
permeabilidade pela membrana
7/10/2014 53
Substncias hidrosolveis maiores que a gua
necessitam de caminhos hidroflicos para
atravessar a membrana
Poros (canais)
Transportadores
7/10/2014 54
Substncias podem atravessar a membrana passivamente seguindo o seu gradiente de concentrao
por difuso simples ou por difuso facilitada
Difuso simples usa poros
(canais)
Difuso facilitada usa
carreadores
7/10/2014 55
A difuso facilitada se caracteriza:
1. Pela saturao do transporte
2. Pela maior dependncia da temperatura
3. Por competio com antagonistas

Concentrao
V
e
l
o
c
i
d
a
d
e

d
o

t
r
a
n
s
p
o
r
t
e

Dif. Simples (canais)
Dif. Facilitada (carreadores)
7/10/2014 56
Os canais inicos so protenas que
formam poros que passam ons
Canal inico
Membrana
Canais podem ser seletivos para potssio, sdio, clcio ou cloreto ou para ctions ou nions

Os canais podem estar sempre abertos ou abrirem em resposta a algum estmulo
7/10/2014 57
Os ons so segregados por transportadores presentes na membrana que realizam transporte ativo
3 Na
+

2 K
+

ATP ADP + P
i
1
3 Na
+

Ca
++

2
3
1 - Na/K ATPase
2 Trocador Na/Ca
3 Ca-ATPase reticular
7/10/2014 58
Transporte ativo significa o transporte de substncias contra seu gradiente qumico s custas de
gasto energtico
3 Na
+

2 K
+

ATP ADP + P
i
1
Transporte ativo primrio: Usa o ATP como fonte de
energia livre
3 Na
+

Ca
++

2
Transporte ativo secundrio: Usa o gradiente qumico
cirado pelo transporte ativo primrio
7/10/2014 59
gua se difunde pela membrana
por duas maneiras
Por pequenos espaos criados momentaneamente por
dois fosfolipdeos adjacentes
Por poros formados por protenas permeveis a gua
(canais de gua)
7/10/2014 60
Osmose
Osmose definido como o fluxo de gua atravs
de uma membrana semipermevel
Membrana semipermevel: membrana permevel ao solvente
(gua) mas no aos solutos