Cromatografia de Interaco

Hidrfoba

Explora a hidrofobicidade da
superfcie das protenas;

Tcnica de resoluo e rendimento

mdio;

Normalmente

usada

nos

passos

iniciais do processo de purificao de

protenas e aps sua precipitao

Fase estacionria

constituda

por

uma

matriz

slida,

insolvel e inerte (resina) com grupos

hidrfobos normalmente alquil (ex. hexil,
fenil ou octil) e empacotada numa coluna.
Resinas Matriz

ter < Fenilo < Butilo

< Hexilo

Aplicao da amostra

As amostras utilizadas tm elevada fora

inica (ex. precipitados de sulfato de amnio)
Adio
de
concentrao
elevada de sal
mistura
de
protenas
a
separar;

Aumento
da
exposio
dos
resduos
hidrfobos
(destabilizao
da estrutura da
protena);
Aumento
da
interaco
da
protena
com
grupo hidrfobos
da resina;

Eluio - tcnicas
Nesta

tcnica

aplicado

um

gradiente

decrescente de concentrao de sal / fora inica;

Protenas primeiro eludas menos hidrfobas
Protenas

mais

retidas

(mesmo na ausncia de sal)

Maximizar o
processo
ajustar pH da
protena para o
seu pI

mais

hidrfobas

Eluio - tcnicas
Na aplicao de um gradiente decrescente de pH
ocorre uma
diminuio da hidrofobicidade da
protena.
Aplicao de um soluto com maior afinidade para a
fase estacionria
Ex. Detergentes no-inicos: Tween 20 e Triton X-100;
Alcois alifticos: butanol e etilenoglico;
Aminas alifticas: butilamina pode desnaturar protena

Aplicao de um gradiente crescente de solvente

orgnico (ex.
propanol, etilenoglicol) competio para a resina
Protenas primeiro eludas menos hidrfobas eludas com < %

 Para explicares a imagem anterior, basicamente precisas

de dizer que na presena de um gradiente elevado de sal,
as proteinas apresentam uma conformaao diferente
daquela que tm quando a concentraao de sal baixa.
Entao, inicialmente aplicada uma elevada concentraao
de sal, o que provoca uma exposiao da parte hidrofoba
das proteinas e desta forma ocorre a sua ligaao resina.
Seguidamente feita uma lavagem que provoca a
eliminaao da parte das proteinas que no interessa, e no
fim, para obtermos aquilo que nos interessa, vamos
diminuindo a concentraao de sal e baixamos o valor de
pH de modo a que a proteina mude a sua conformaao
(deixa de ter a sua parte hidrofoba exposta) e assim
separa-se da resina.

Vantagens e desvantagens
Vantagens

Desvantagens

Velocidade elevada

Dificuldade em prever
as condies ideais
para a ocorrncia da
separao proteica

No provoca
desnaturao da
protena
Usada a propriedade
de hidrofilicidade da
prpria protena para a
sua separao

A fraco final obtida

de protenas elevada
mtodo pouco
especfico

Interferentes

Aditivos;
pH;
Temperatura;
Tipo de resina/matriz.

Aplicaes desta tcnica

Utilizada na separao de protenas e
pptidos;
um passo ideal depois da
cromatografia por troca Inica.