ELETROFORESE

Prof. Dra. Adriana Dantas

UERGS Bento Gonalves, RS
 FUNDAMENTOS TERICOS
Introduzida por Tiselius em 1937, foi
inicialmente realizada em meio lquido, sendo
posteriormente aperfeioada com emprego de
um meio-suporte.
uma tcnica bioqumica verstil,
relativamente simples, rpida e de grande poder
informativo, tornando-se indispensvel nas mais
diversas reas da biologia molecular.
Atualmente aplicada na anlise de enzimas,
protenas e cidos nuclicos e tem amplamente
usada em estudos de taxonomia, bioqumica,
fisiologia e gentica humana, de plantas, animais
e microrganismos.
 POTENCIAL DE USO
Identificao de fungos, bactrias, nematides,
vrus, virides;
Caracterizao de fitopatgenos;
Estudos de gentica e evoluo de fungos
fitopatognicos;
Identificao de clones, cultivares e linhagens;
Estudos citogenticos, ecolgicos, fisiolgicos
e bioqumicos;
Estudos de resistncia doenas;
 POTENCIAL DE USO
Estudos da relao patgeno-hospedeiro;
Determinao do peso molecular de protenas;
Caracterizao de molculas de cidos
nuclicos;
DNA recombinante, seqnciamento de
nucleotdeos;
Mapeamento de fragmentos de restrio;
Amplificao de DNA.
 PRNCIPIOS DA TCNICA DE
ELETROFORESE
A eletroforese consiste na migrao de
molculas ionizadas, de acordo com suas cargas
eltricas e pesos moleculares em campo eltrico.
Molculas com cargas negativas migram para
o plo positivo (nodo) e molculas com carga
positivas migram para o plo negativo (ctodo).
Em razo das protenas serem substncias
anfteras, indispensvel manter constante o pH
do meio durante a eletroforese, atravs do uso de
solues-tampo para no gerar cargas, as quais
podem interferir na corrida.
 Ferramentas da Biologia Molecular

Enzima de restrio
PCR
Eletroforese Termociclador
A separao dos fragmentos da
molcula de DNA em gel de
eletroforese

Caractersticas do DNA

Separao por tamanho

 Eletroforese (Michaelis, 1909)

Gis
Amido
Agarose
Acrilamida
Solues-tampes

O sentido e a velocidade de migrao

determinado pelo tamanho e carga das
molculas
O princpio bsico envolvido na obteno e
deteco de cada classe de marcador
bioqumico ou de DNA reside no uso de
eletroforese.
O termo eletroforese foi criado por Michaelis
em 1909, para descrever migrao de
colides sob a influncia de um campo
eltrico.
Seu princpio simples: molculas de carga
negativa migram para o plo positivo, e
molculas com carga positiva migram para o
plo negativo.
A eletroforese visa separao de
molculas em funo de suas cargas
eltricas, de seus pesos moleculares e
de suas conformaes, em suportes
porosos (gis) e solues-tampes
(estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo
de corrente eltrica).
AGAROSE
Carregando o gel com as
amostras
Revelando gel de agarose em U.V. brometo de etdeo
 Anlise DNA forense

Exemplo, de caso resolvido pelo gel

vertical de acrilamida corado com nitrato
de prata
Sangue retirado de chapu e jeans
S = suspeito
V- vtima
SISTEMA TAMPO
Tampo usado na preparao do gel;
Tampo do tanque ou cuba eletroltica;

CONDUO DA ELETROFORESE
Gradiente de densidade
Meios de suporte:
* Papel filtro;
* Slica gel;
* Membranas de acetato de celulose;
* Amido;
* Gel de agarose;
* Poliacrilamida.
CORRENTE ELTRICA:
A passagem da corrente eltrica atravs de uma
soluo segue a lei de Ohm, na qual:
V=R.I
V = voltagem, R = resistncia e I = amperagem
Para que a tcnica funcione, deve ser desenvolvida sob
voltagem (V), corrente (I) e potncia (W) constantes.

VELOCIDADE DE MIGRAO:
* Diretamente proporcional: ao campo eltrico e carga
lquida.
* Inversamente proporcional: ao raio, distncia entre os
dois eletrodos e viscosidade.
TEMPERATURA:

Quanto mais elevada a voltagem ou a

intensidade da corrente, maior ser o aumento
de temperatura.
No caso de eletroforese de isoenzimas e de
protenas, as temperaturas elevadas podem
degradar as enzimas e protenas, o que,
eventualmente, resulta na perda da atividade
enzimtica e protica.
VISUALIZAO DAS BANDAS:

PROTENAS: corante coomasie blue

ENZIMAS: soluo especfica (substrato,
coenzimas, soluo-tampo e sais)
DNA e RNA: vrios sistemas de revelao, tais
como:
- Fluorescncia (Brometo de Etdio);
- Radioatividade;
- Nitrato de prata;
SISTEMA DE RESOLUO

AFLP
RAPD

Agarose

Brometo de Etdeo
U.V. Poliacilamida

Nitrato de Prata 0,2%

SISTEMAS DE ELETROFORESE:

POSIO DO GEL: vertical ou horizontal;

POROSIDADE: contnuo ou descontnuo;
PASSAGEM DA CORRENTE: unidirecional
ou bidirecional.
APLICAES EM ANLISE ENZIMTICA:

As isoenzimas so empregadas como

marcadores genticos, e suas aplicaes vo
desde a gentica de microrganismos at a
gentica humana.
Isoenzimas so usadas para reconstruo
da histria evolutiva das espcies, e como
ferramenta taxonmica capaz de caracterizar
variantes individuais de uma dada espcie,
apresentando valia na sistemtica de raas,
espcies e gneros estreitamente relacionados.
APLICAES EM ANLISE ENZIMTICA:

Anlises eletroforticas em plantas e

animais mostram que padres de isoenzimas
e a intensidade relativa dos eletromorfos so
espcie-especfica para rgos ou tecidos e
para estdios de desenvolvimento.
O estdio de desenvolvimento em que as
isoenzimas aparecem ou desaparecem
refletem a ativao ou represso de genes que
controlam a sntese das enzimas.
 Eletroforese de isoenzimas
* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de
uma mesma enzima, apresentando funo idntica ou similar,
presente num mesmo indivduo (Markert & Moller, 1959).

6PGDH -CM

Gel de Araucaria angustifolia

MANTOVANI, 2003
 monomrica
alelo 1

alelo 2
alelo 3

Resultado da presena de mais de um gene codificando cada uma das enzimas

MANTOVANI, 2003
APLICAES EM ANLISE PROTICAS:

A grande maioria das anlises proticas

realizada pelo sistema denominado SDS-PAGE,
na qual se usa o detergente Dodecil Sulfato De
Sdio (Sodium Dodecyl Sulfate).
Basicamente, a protena desnaturada
por aquecimento na presena de 2-
mercaptoetanol, que rompe as ligaes
dissulfeto, e os polipetdeos adquirem a carga
negativa do SDS. A separao no gel d-se
unicamente pela diferena dos pesos
moleculares.
APLICAES EM ANLISE DE DNA E RNA:
A migrao eletrofortica de cidos nuclicos
amplamente empregada em tcnicas de biologia
molecular, para separar, isolar e manipular fragmentos
de DNA e RNA.
O sentido da migrao dos cidos nuclicos
sempre em direo ao nodo ou plo positivo, pois
possuem carga total negativa decorrente de seus
grupamentos fosfato.
Alm disso, em presena de tampes adequados,
que permitem a desnaturao das conformaes
secundrias ou tercirias, fragmentos lineares
pequenos, bem como fitas simples, migram mais
rapidamente do que os longos e de fita dupla.
APLICAES EM ANLISE DE DNA E RNA:
Tcnicas eletroforticas usadas nas
separao de fragmentos de DNA/RNA:
DGGE - Eletroforese em Gel com Gradiente
Desnaturante: emprega gradientes desnaturantes
qumicos.
TGGE Eletroforese em Gel com Gradiente de
Temperatura: refere-se a gradientes de
temperatura.
PFGE/IFGE Eletroforese em Gel com Campo
em Pulso/Inverso: refere-se a gradientes
eltricos.
GEL DE AGAROSE
GEL DE POLIACRILAMIDA
Gel acrilamida
GEL DE PROTENA
Gel de Protena - Gluteninas