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Vírus

Em 1882 sabiam que existiam


enfermidades produzidas por
microrganismos mais pequenos que as
bactérias
1935 Wendell Stanley demostrou que
os vírus são diferentes dos demais
microrganismos.
Posem somente um acido nucleico
(ADN ou ARN)
Seu acido nucleico é rodeado por
proteínas e algumas vezes uma capa de
lipídios Fonte: Tortora G. Microbiology
an introdution . Edition 11.
Isolamento de vírus
1. Carência de organelas para produção de energia e proteínas – não
se pode multiplicar num meio artificial
2. Multiplicação em células:

Célula Embrião Plantas Animais


Isolamento de vírus
Vantagens
• Estudo mais detalhado de vírus
• Sensibilidade e especificidade muito alta
• Matérias primas da engenharia genética
• Criação de vacinas

Desvantagens
• Tempos prolongados em células não bacterianas
• Altos custos em células não bacterianas
Plaque method

O plaque method baseia-se na


eliminação celular ocasionada pelos
bacteriófagos sobre um meio de
cultivo solido (agar).

Fonte: Tortora G. Microbiology


an introdution . Edition 11.
Exemplo
Técnica Gold Standar o patrão de referencia
Esta técnica baseia-se na comparação das mudanças citopatogénicas
(CPE) quando uma célula é infectada.

Células não infectadas Células infectadas com o vírus


do herpes
Seleção de células

Crescimento e
Mutação do
Susceptibilidade mantimento Tempo
cariogama
fácil
Linhas celulares

Primaria Diploide Continua

Isolamento do tecido Subcultivo = 50 vezes Heteroploide

Subcultivo <2 Cromossoma diplode Subcultivo = 70 vezes

Mantimento custoso Exemplo: fibroblastos Exemplo= células cancerígenas

Fonte: Balows W.J. Hausler, Jf and E.H. Lennette. Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases
Principles and Practice. Volume II. Viral, Rickettsial, and Chlamydial Diseases. Springer-Verlag. 1988.
Composição básica do meio para isolamento
de células

• Compostos essenciais
• Soro bovino
• Buffer para manter o pH entre 6,9 e 7,2.
• Solução salina
• Antibióticos e antifúngicos
Isolamento de células

1. Retirar tecido adiposo e necrótico


2. Reduzir do tamanho do tecido
3. Aplicar enzimas
4. Remover enzimas
5. Depositar as células no meio
6. Conservar a – 70ºC
Subcultivo de células
• Descartar o médio e deixar somente as células
• Adicionar um quelante
• Incubar as células
• Tomar amostra celular e depositar num novo recipiente com médio de
crescimento
• Rotular a linha com o número de geração
• Agitar o médio suavemente
• Incubar as células
• Enxergar o crescimento diariamente
• Cambiar de recipiente e médio quando as células cresçam
• Estocar o cultivo
Recolecção da amostra

• Coleção da amostra no lugar da


doença e com o meio correto.
• Descontaminação da amostra.
• Agitar a amostra num vortex.
• Pegar o sobrenadante (aqui se
encontra o vírus)
• Armazenamento da amostra.
Inoculação e aparição dos CPE
CPE DO VIRUS DA ESTOMATITIS • As amostras tem que ser inoculadas
em cultivos de células de um ou dois
dias
• Inoculação com 0,2 ou 0,3 ml da
amostra com vírus.
• Incubação a 37ºC
• Verificação do diária do crescimento
• Comparação com patrão de
referencia
Fonte: Tortora G. Microbiology
an introdution . Edition 11.
Exemplo
Bibliografia
• Balows W.J. Hausler, Jf and E.H. Lennette. Laboratory Diagnosis of
Infectious Diseases Principles and Practice. Volume II. Viral, Rickettsial, and
Chlamydial Diseases. Springer-Verlag. 1988.
• Sandín, D y Algorta, G. Métodos de estudio de bacterias y vírus. Temas de
bacteriologia y virologia medica 2010.
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MetodosdeEstudiodeBacteriasyViru
s.pdf. Acceso 19/05/2016.
• Tortora, G. Funke, B and Case, C. Microbiology an introdution. Pearson.
Edition 11. 2013.
• Ryu, K. et al. Changes in physiological properties of bacteriophage-
insensitive Staphylococcus aureus. Annals microbiology. Volume 65, issue
4. 2015.
• Abba, Y. et al. In vitro isolation and molecular identification of
reptarenavirus in malaysia. Virus genes. May 2016.