Atualização em métodos microbiológicos

FUNDAMENTOS DE BIOTECNOLOGIA

2007
 DNA como material genético
Frederick Griffith, 1928
Oswald Avery, Colin MacLeod, MacLyn McCarty, 1944

Streptococcus pneumoniae
 DNA como material genético

Experimento de Hershey & Chase, (1952)

A Escherichia coli
Fago T2
A
• Marcação de proteínas S35
• Fagos marcados

Fago T2 Escherichia coli

B B
• Marcação de DNA P32
• Bactéria marcada
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Componentes

Pentose
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Componentes
5
Pentose 4 1
3 2

Ribose Desoxiribose
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Componentes

Pentose

Ribose Desoxiribose

RNA DNA
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Componentes

Pentose

Base nitrogenada
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Bases nitrogenadas

Púricas

Adenina (A) Guanina (G)

 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Bases nitrogenadas

Púricas

Adenina (A) Guanina (G)

Pirimídicas

Citosina (C) Timina (T) Uracila (U)

 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Componentes

Pentose

Base nitrogenada

Grupo fosfato
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Nucleotídeo

Pentose: desoxiribose
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Nucleotídeo

Base nitrogenada:
(A)

Pentose: desoxiribose
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Nucleotídeo: dAMP

Base nitrogenada:
(A)

Fosfato

Pentose: desoxiribose
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Pareamento das bases nitrogenadas

DNA
A T

G C
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Pareamento das bases nitrogenadas

RNA:
DNA
A T
A = U

G C
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Orientação das fitas: 5’  3’

5’

Timina

Adenina

Citosina 5’  PO4

Fosfato
3’  OH
3’ Desoxiribose
Guanina
 Estrutura geral dos ácidos nucléicos

Orientação das fitas: 5’  3’

DNA
Complementar
Antiparalela
 Material genético dos microrganismos
GENOMA
Cromossoma

Plasmídeo

Elementos genéticos de transposição

Seqüências de inserção (IS)

Transposons

Integrons

Vírus

DNA mitocondrial
Representação do tamanho do genoma de diferentes organismos

Mycoplasma E. coli
Bactérias
Leveduras
Fungos
Amoeba
Protistas
Mycoplasma E. coli
Plantas
Drosophila
Insetos
Moluscos
Tubarão
Peixes cartilaginosos
Peixes
Mycoplasma E. coli
Anfíbios
Répteis
Aves
Homo sapiens
Mamíferos

Número de nucleotídeos (pb) por genoma haplóide

2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and
Peter Walter. In: Molecular Biology of the Cell.
 Tamanho do genoma de procariotos

Archaeabacteria Tamanho (kb)

Nanoarcheum equitans 491

Methanosarcine acetivorans 5.800

Eubacteria

Buchnera sp 600

Streptomyces coelicolor 8.700 (cromossoma)

356 (plasmídeo)
31 (plasmídeo)
 Genoma de organismos procariotos e eucariotos

Espécie Replicon Tamanho Forma No.

(kb) rDNA
Agrobacterium tumefasciens Cromossoma 2842 Circular 2
Cromossoma 2057 Linear 2
Plasmídeo 543 Circular 0
Plasmídeo 214 Circular 0
Borrelia burgdorferi Cromossoma 911 Linear 1
Plasmídeos (n=11) 9-54 Circ./Linear 0
Brucella melitensis Cromossoma 2117 Circular 2
Cromossoma 1178 Circular 1
Clostridium acetobutylicum Cromossoma 3941 Circular 11
Plasmídeo 192 Circular 0
Saccharomyces cerevisae Cromossoma (16) 12.068 Linear ~140
Mitocondrial - Circular -
Plasmídeos -
Schizosaccharomyces pombe Cromossoma (3) 13.800 Linear ~120
Mitocondrial 20 Circular -
Plasmídeos
 Genoma de organismos procariotos e eucariotos (cont.)

Espécie Replicon Tamanho Forma No.

(kb) rDNA
Entamoeba histolytica Cromossoma (14-17) 24.000 Linear -
Mitocondrial Circular
Vários plasmídeos
*rDNA 24,5 Circular ~100

Leishmania major Cromossoma (~36) 32.817 Linear ~63

Mitocondrial
Plasmídeos
Trypanosoma brucei Cromossoma (~22) 26.075 Linear ~56
Mitocondrial
Plasmídeos
Trypanosoma cruzi Cromossoma (~30-40) ~60.373 Linear ~219
Mitocondrial
Plasmídeos

Fontes: Goffeau et al., 1996 (Science, 274). Wood et al., 2002 (Nature, 415). Bentley & Parkhill,
2004 (Ann.Rev.Genet., 38). Berriman et al., 2005 (Science, 309). El-Sayed et al., 2005 (Science,
309). Ivens et al., 2005 (Science, 309). Loftus et al., 2005 (Nature, 433).
 Cromossoma bacteriano
Escherichia coli K12

National Institute of Genetics

(www.shigen.nig.ac.jp)
 Plasmídeos

DNA circular extracromossômico

103 a 25 x 103 pb
Replicação autônoma

bla f1 (+): origem de replicação 135-441

Fragmento  da -galactosidase 460-816
Sítio múltiplo de clonagem (MCS: multiple cloning site)
P lac: Promotor lac
pUC ori: origem de replicação
bla: gene de resistência a ampicilina
 Cromossoma Eucarioto
Eletroforese em campo pulsado de cromossomas

Candida albicans
Biotechnology Research Institute,
National Research Council Canada
(candida.bri.nrc.ca/candida/contigs)

Trypanosoma cruzi
Yamada-Ogatta et al., 2004
Metáfase:
cromossoma
Cromossoma Eucarioto

Modelo para empacotamento do cromossoma

Arcabouço: proteínas

Cromatina
de 30 nm
DNA espaçador Proteínas não histonas

Cromatina
de 10 nm

Histona H1 Nucleossoma

2000 by Lodish, H.; Berk, A.; Lawrence 2000 by Cooper, G.M. In: The Cell-A Molecular
Zipursky, S.; Matsudaira, P.; Baltimore, D. & Approach. 2nd. ed.
Darnell, J. In: Molecular Cell Biology. 4th ed.
Conformação do DNA: superenovelamento (supercoiling)

DNA girase DNA girase

topoisômero

DNA circular
relaxado

Topoisomerase I Topoisomerase I

Supercoiling

DNA linear relaxado

Conformação do DNA: superenrolamento (supercoiling)

Topoisomerase Atividade

Tipo I Corte em fita simples

Tipo II Corte na fita dupla

supercoiling

relaxado

Eletroforese de DNA após digestão

com topoisomerase tipo I
 DNA mitocondrial
Trypanosoma cruzi: kDNA
Maxicírculo

Regiões (blocos) Origem de

conservadas replicação
Minicírculos

Região que
codifica para
~750 pb
RNA guia Região variável
rica em AT:
espécie-específica
Fluxo da informação genética: expressão gênica

Célula eucariótica
Fluxo da informação genética: expressão gênica
Célula procariótica
Célula eucariótica
sinais

RNA polimerase

RNAm
RNAm

repressor

sinal
Fluxo da informação genética: expressão gênica

Manutenção da informação genética: replicação do DNA

Forquilha de replicação do DNA

de Escherichia coli
Replicação do DNA in vitro

Mg2+

DNA polimerase

Amostra DNA
dNTP

Iniciadores
Replicação do DNA in vitro
 Seqüência nucleotídica de um gene

1 agatactact cagtaaccac aataagcaac acaaaaaaca gccttttatt tttccaagac

61 aatgtcctgc ggagacgcaa agctcaacca cccggcgccc gacttcaatg agacggcgct
121 gatgcccaac ggcaccttca agaaggtggc tctcagctcc tacaagggta agtggctggt
181 gctcttcttc tacccgatgg acttcacctt cgtctgcccc acagagatct gccaattctc
241 ggaccgtgtg aaggagttct ctgacattgg ctgcgaggtg cttgcctgct ccatggacag
301 cgagtactcc catctggcct ggacaagcgt tgaggccaag cgtggcggac ttggccagat
361 gaacatcccc attcttgccg acaagaccaa gtgcatcatg aagtcgtatg gtgtgctgaa
421 ggaggaggat ggcgtggcgt accgtggcct tttcatcatc gacccgaagc agaacctgcg
481 gcagatcacc gtcaacgacc tccccgttgg ccgcgacgtg gacgaggccc ttcgccttgt
541 gaaggcgttc cagtttgtgg agaagcatgg cgaggtgtgc cccgccaact ggaagcccgg
601 tgacaaggcg atgaagccgg atcccgaaaa gtccaaggag tactttggtg ctgtcgcgta
661 g
Genes multicópias: “cluster” dos genes que codificam histonas
 Organização gênica

Fita molde
 Organização gênica

Fita molde
 Organização gênica

Fita molde

Fita molde Fita codificante Sentido da transcrição

 Estrutura do gene

Regiões regulatórias Seqüências codificantes

 Transcrição

Seqüências promotoras Procariotos

promotor região codificante

sítio de início transcrição

Seqüência de promotores de E. coli

-35 -10
Seqüência consenso

1999 by Griffiths, A.J.F., Gelbart, W.M., Miller, J.H.,

Lewontin, R.C. In. Modern Genetic Analysis
 Transcrição
Início transcrição Procariotos

Formação do complexo
fechado: RNA
polimerase - DNA

Separação das fitas e

formação do complexo
aberto

Início da transcrição

Liberação do fator
sigma

Elongação

2000 by Cooper, G.M. In: The Cell-A Molecular Approach. 2nd. ed.
 Estrutura do gene

Regiões regulatórias Seqüências codificantes

Procariotos

-galactosidase permease transacetilase

Poliadenilação
Sítio início transcrição
Terminação
AUG UAG,UAA,UGA transcrição
Eucariotos Promotor

5’UTR 3’UTR
Processamento do RNA mensageiro: eucariotos

Poliadenilação
Sítio início transcrição
Terminação
AUG UAG,UAA,UGA transcrição
Promotor

5’UTR 3’UTR

Transcrição

Capping
Processamento do RNA mensageiro: eucariotos

Poliadenilação
Sítio início transcrição
Terminação
AUG UAG,UAA,UGA transcrição
Promotor

5’UTR 3’UTR

Transcrição

Poliadenilação
poli AAA
Processamento do RNA mensageiro: eucariotos

Poliadenilação
Sítio início transcrição
Terminação
AUG UAG,UAA,UGA transcrição
Promotor

5’UTR 3’UTR

Transcrição

poli AAA

poli AAA
Splicing
RNA mensageiro funcional
Processamento do RNA mensageiro: eucariotos

Splicing alternativo
RNA mensageiro funcional: eucariotos

5’ 3’

CAP
RNA mensageiro funcional: eucariotos

5’ 3’

CAP

5’UTR: untranslated region

RNA mensageiro funcional: eucariotos

5’ 3’

Região codificante
CAP

5’UTR: untranslated region

RNA mensageiro funcional: eucariotos

5’ 3’

Região codificante
CAP

5’UTR: untranslated region

3’UTR: untranslated region

RNA mensageiro funcional: eucariotos

5’ 3’

Região codificante Cauda poli-AAA

CAP

5’UTR: untranslated region

3’UTR: untranslated region

 Seqüência nucleotídica de um gene

1 agatactact cagtaaccac aataagcaac acaaaaaaca gccttttatt tttccaagac

61 aatgtcctgc ggagacgcaa agctcaacca cccggcgccc gacttcaatg agacggcgct
121 gatgcccaac ggcaccttca agaaggtggc tctcagctcc tacaagggta agtggctggt
181 gctcttcttc tacccgatgg acttcacctt cgtctgcccc acagagatct gccaattctc
241 ggaccgtgtg aaggagttct ctgacattgg ctgcgaggtg cttgcctgct ccatggacag
301 cgagtactcc catctggcct ggacaagcgt tgaggccaag cgtggcggac ttggccagat
361 gaacatcccc attcttgccg acaagaccaa gtgcatcatg aagtcgtatg gtgtgctgaa
421 ggaggaggat ggcgtggcgt accgtggcct tttcatcatc gacccgaagc agaacctgcg
481 gcagatcacc gtcaacgacc tccccgttgg ccgcgacgtg gacgaggccc ttcgccttgt
541 gaaggcgttc cagtttgtgg agaagcatgg cgaggtgtgc cccgccaact ggaagcccgg
601 tgacaaggcg atgaagccgg atcccgaaaa gtccaaggag tactttggtg ctgtcgcgta
661 g
 Gene
Definição

1940: um gene um polipeptídeo

1960: seqüência de DNA que é transcrita em RNA

RNAm  Proteínas
RNAs estruturais  RNAr, RNAt,

1970: “splicing alternativo”  seqüência de DNA que é

transcrita em RNA e codifica proteínas relacionadas
Tecnologia do DNA recombinante
Clonagem gênica
 Clonagem gênica
Inserto

Vetor

Participação de duas moléculas

Clonagem gênica

Construção de uma molécula

recombinante
Clonagem gênica

Amplificação da molécula
recombinante
Clonagem gênica

Seleção da uma molécula

recombinante
 Clonagem gênica

Vetores

Plasmídeos
Fagos
Cosmídeos
BAC
YAC
 Clonagem gênica

Vetores

Plasmídeos
Clonagem
Fagos
Cosmídeos
BAC
YAC
 Clonagem gênica

Vetores

Plasmídeos
Clonagem
Fagos
Cosmídeos
BAC
YAC Expressão
 Clonagem gênica

Vetores

Clonagem

Características:
Presença de um replicon
 Clonagem gênica

Vetores

Clonagem

Características:
Presença de um replicon
Marca seletiva
 Clonagem gênica

Vetores

Clonagem

Características:
Presença de um replicon
Marca seletiva
Sítio múltiplo de clonagem
 Clonagem gênica

Vetores

Clonagem

Características:
Presença de um replicon
Marca seletiva
Sítio múltiplo de clonagem
Seqüência nucleotídica conhecida
 Clonagem gênica

Vetores

Clonagem

Expressão
Características:
Sítio de ligação do ribossoma
 Clonagem gênica

Vetores

Clonagem

Expressão
Características:
Sítio de ligação do ribossoma
Códon de início da tradução
 Clonagem gênica

Vetores

Clonagem

Expressão
Características:
Sítio de ligação do ribossoma
Códon de início da tradução
Códon de término da tradução
 Clonagem Gênica: construção da molécula recombinante
Vetor

Inserto Digestão enzimática do DNA

 Clonagem Gênica: construção da molécula recombinante
Vetor

Inserto Digestão enzimática do DNA

Endonucleases de restrição
 Endonucleases de restrição

Endonuclease Microrganismo Sítio de reconhecimento

(direção 5’3’)
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC

Bgl II Bacillus globigli A GATCT

Eco RI Escherichia coli RY 13 G AATTC

Hae III Haemophilus aegyptius GG CC

Hind III Haemophilus influenzae A AGCTT

Mbo I Moraxella bovis GATC

Sma I Serratia marcescens CCC GGG

Xma I Xanthomonas malvacearum C CCGGG

 Clonagem Gênica: construção da molécula recombinante
Vetor

Inserto

Produtos da digestão
Clonagem Gênica: construção da molécula recombinante

Ligação das moléculas:

Complementariedade
Clonagem Gênica: construção da molécula recombinante

Ligação das moléculas:

Complementariedade
DNA ligase: ligação
fosfodiéster
 Ligação do DNA: DNA ligase

2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and
Peter Walter. In: Molecular Biology of the Cell.

2002 by Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L. In: Biochemistry, 5th ed.
Clonagem Gênica:inserção da molécula recombinante na
célula hospedeira
Método Toxicidade Mecanismo

Lipofecção variável Lipídios catiônicos ligam-se às moléculas de

DNA formando complexos que se aderem e se
fundem com a membrana plasmática carregada
negativamente

Fosfato de não O fosfato de cálcio forma um coprecipitado

insolúvel com o DNA, que se liga à superfície
cálcio
celular e é absorvido por endocitose

DEAE-dextran sim O composto ligado ao DNA forma agregados

que se ligam à membrana. Acredita-se que o
DNA entre na célula por endocitose

Biobalística não Pequenas partículas de tungstênio ou ouro

revestidas com o DNA de interesse são
aceleradas e introduzidas na célula

Eletroporação não A aplicação de curtos pulsos elétricos de alta

voltagem leva à formação temporária de poros
na membrana. O DNA é levado diretamente ao
citoplasma através desses poros
 Transformação Bacteriana
Oswald T. Avery, Colin MacLeod & Maclyn Mac Carty, 1944
Clonagem Gênica:seleção dos transformantes
Clonagem Gênica:seleção dos transformantes
Clonagem Gênica:seleção dos transformantes
Clonagem Gênica:seleção dos transformantes
Clonagem Gênica:seleção dos transformantes

inserto
Clonagem Gênica:seleção dos transformantes

inserto
Clonagem Gênica:seleção dos transformantes

azul branco

inserto
inserto
Clonagem Gênica:seleção dos transformantes
 Elementos genéticos de transposição

Seqüências de inserção (IS) Transposon

RI Transposase Genes
Genesbacterianos
bacterianos
Transposase
 Integrons

Componentes
-int: codifica para
integrase
-Genes cassete
-Sítio de integração
dos genes cassete
(attI)

Bennett, P.M. 1999. J. Antimicrob. Chemother., 43: 1-4