ESPECTROMETRIA DE MASSA: FUNDAMENTOS

E APLICAÇÕES EM PROTEÔMICA
Introdução
O que é Espectrometria de massa?
É o estudo de sistemas que causam a formação de íons
gasosos com ou sem fragmentação que é caracterizada então
pela relação massa/carga e abundância relativa (Mede a massa
de moléculas individuais que tenham sido convertidas em íons).

Relação m/z – unidade de massa atômica por unidade

fundamental de carga. Em muitos casos, os íons encontrados
no espectrômetro de massa possuem uma carga (z =1) e, então
o valor m/z é numericamente igual à massa molecular iônica em
unidades de massa atômica.
 USADA:
 Biotecnologia: na análise de proteínas, peptídeos e
oligonucleotídeos, monitoramento de fermentação;
 Agropecuária: Análise e controle de qualidade de rações;
 Farmacêutica: Descobertas de novas drogas, farmaco-
cinética;
 Clínica: Análise da hemoglobina, teste de drogas;
 Ambiental: Qualidade de água, contaminação em alimentos;
 Geologia: Composição do petróleo, análise de solos;
 Esportes: Identificação de esteróides;
 Medicina Forense: Investigação de crimes
APLICAÇÃO DA ESPECTROMETRIA DE

MASSA EM PROTEÔMICA

 Informação de massa molecular – Com precisão;

 Identificação de proteínas usando massa molecular de
peptídeos trípticos;
 Informação Estrutural;
 Sequenciamento de peptídeos;
 Identificar modificações pós-traducionais (fosforilação,
glicosilação e pontes de sulfeto).
HISTÓRIA DA ESPECTROMETRIA DE
MASSA

 J.J. Thomson (University of Cambridge)

1897: estudos da descarga elétrica de
gases (descobrimento do elétron).
 1906: Prêmio Nobel (construção do
primeiro espectrômetro- espectrógrafo
de parábola) para a determinação das
razões massa-carga dos íons.
 Francis W. Aston (University of
Cambridge) 1922: Prêmio Nobel (estudos
isotópicos com um novo espectrômetro
de massa de maior resolução- íons
dispersos pela massa e focalizados pela
velocidade).
HISTÓRIA DA ESPECTROMETRIA DE
MASSA
 1960- MALDI e ESI- Hillenkamp e Fenn (Prêmio Nobel)

Evolução
Prêmio Nobel de Química, 2002 – foi para os
inventores de métodos de ionização branda em
espectrometria de massa - permitiu análise de
macromoléculas

John B. Fenn (E.U.A.) Koichi Tanaka (Japão)

- Electrospray (ESI) - Soft Laser
Desorption (SLD).
COMO UM ESPECTRÔMETRO DE
MASSA TRABALHA?
 Espectrometria de massa
MODOS DE IONIZAÇÃO PARA
ANALISADORES DE MASSA
BIOMOLÉCULAS

ELECTROSPRAY Setor magnético

FTICR (Fourier Transform cyclotron resonance)

ION – TRAP
TRIPLE QUADRUPOLE
TIME OF FLIGHT (TOF) Orbitrap

MALDI (matrix assisted laser

desorption ionization)
 MÉTODOS DE IONIZAÇÃO

Fonte de íons

Métodos agressivos
Métodos suaves
de ionização
de ionização
(fragmentos podem não ser detectados)
 Técnica de Ionização Por Electronspray (ESI)

 Adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas.

 Ionização ocorre pela nebulização de gotículas (nanolitros) de uma
solução em um campo elétrico intenso, formando gotículas altamente
carregadas.
Técnica de Ionização Por Electronspray (ESI)
Técnica de Ionização Por Electronspray (ESI)
EQUILÍBRIO DE ESTADOS MÚLTIPLOS
DA CARGA
Amina N-terminal

H H H 4+

H M E H F R W G K

4+ 3+ 2+ 1+
H
H H H H
H H H H H
ORIGEM DO ESPECTRO DE MASSA
DOS PEPTÍDEOS POR ESI
m/z = (Mr+3H)/3 m/z = (Mr+H)

4+ 3+ 2+ 1+
H
H H H H
H H H H H

m/z = (Mr+4H)/4 m/z = (Mr+2H)/2

ES-MS

2+

Rel. Inten. 3+
1+
4+
 VANTAGENS DO ELECTROSPRAY

1) Apropriado para compostos carregados, polares e básicos;

2) Permite a detecção de compostos de alta massa
molecular - maioria dos espectrômetros de massas;
3) Melhor métodos para análises de compostos
multicarregados;
4) Baixo ruído químico permite ótimos limites de detecção;
5) Permite o controle de fragmentações;
6) Compatível com métodos de MS/MS
Técnica de Ionização por MALDI (Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization)

 A amostra é misturada
com uma matriz que
absorva UV.

 A matriz absorve
energia do laser o que
causa sua volatilização
junto com a volatilização
da amostra
MATRIZES
PREPARO DAS AMOSTRAS
 VANTAGENS DO MALDI
1) Ionização suave – análise de biomoléculas intactas,
2) Extensa faixa de massa (> 400 kDa)
3) Análise de misturas - sem purificação
4) Alta sensibilidade
5) Fácil interpretação dos dados
6) Tampões e sais tem pouco efeito
7) Rápida
8) Fácil uso e manutenção
 Analisadores de Massa
 Após sua formação, os íons são acelerados para o
analisador de massa através de um campo elétrico.
 O analisador de massa separa os íons de acordo com
suas razões m/z.
 Os analisadores de massa podem ser contínuos ou
pulsados:
 Contínuos: transmitem um simples íon de razão m/z ao
detector (quadrupolos e campo magnético).
 Pulsados: coletam um espectro de massa inteiro a partir de
um pulso simples de íons (TOF).
 ANALISADOR TEMPO DE VOO (TOF)

Mede o tempo que íons de diferentes massas levam para

mover-se da fonte de íons até o detector:

Íons menores chegarão primeiro ao detector. Existem dois tipos de

analisadores TOF: linear e refletor.
 MS-TOF

A equação que governa a separação de íons por TOF é:

m/z razão massa/carga do íon
                                E potencial do pulso de extração
                                s comprimento do setor em que E é aplicado
               d comprimento do tubo de vôo
t tempo de vôo do íon

MS tempo de vôo:
Sem campo elétrico ou magnético,
 Ao contrário de outros MS, não há limite superior de detecção de m/z.
 É o mais preciso de todos os MS, permitindo análise elementar. Podem fazer até
100 espectros por segundo.
 MS de setor magnético

Ionização: um feixe de elétrons de alta energia é utilizado para ejetar um elétron

de uma molécula, formando um radical catiônico designado como íon molecular. Se o
íon molecular for muito instável ele poderá se fragmentar em íons menores.

Analisador de massa: os íons moleculares são focalizados, formando um feixe, são

acelerados através de um campo magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo
com as massas dos íons.
 Analisadores de massa Quadrupolo
 Quatro eletrodos, dois positivos e dois negativos.
 A voltagem aplicada afeta a trajetória de íons passando através dos eletrodos. Para
uma dada condição de corrente e voltagem, somente íons com uma determinada razão
massa/carga seguem o trajeto entre os tubos, e todos os outros são desviados para
fora.
 Obtém-se um espectro de massas variando-se gradualmente a corrente e voltagem
para detectar-se todos os íons presentes.

MS quadrupolo de transmissão:
consiste de um ionizador, lentes
para acelerar e focalizar os íons
para a entrada no quadrupolo, o
quadrupolo com controles de V e A,
um detector de íons. Todo o sistema
necessita de alto vácuo.

Resolução: separa íons com

diferenças de 0.3 m/z
 ESQUEMA DE UM ESPECTRÔMETRO DE MASSA
TRIPLO-QUADRUPOLO
IONIZAÇÃO: ELETROSPRAY - analíto e solvente são submetido a alta voltagem (3-4 kVolts)
Q1 : 1º QUADRUPOLO (DC/Rf) - modo MS (Q1) determina massa/carga (m/z) - molécula intacta
Q3 : 2º QUADRUPLO (DC/Rf) - modo MS/MS (Q3) detecta fragmentação dos ions - estrutura
CÉLULA DE COLISÃO: HEXAPOLO (somente Rf) Dissociação por colisão induzida - fragmetação
 Analisadores de massa Íon-trap

MS Íon-trap: formado por um quadrupolo tridimensional

 Consiste de eletrodos cilíndricos simétricos, que formam dois “end caps”
e um anel. Pode ser bastante pequeno, com somente 1-2 cm separando os
eletrodos.
 Face interna de cada eletrodo tem uma superfície hiperbólica.
 Ainda que a resolução do MS ion trap seja mais baixa, apresenta como
vantagem a pré-concentração do íon de interesse antes da análise.
 ANALISADOR POR RESSONÂNCIA
CICLOTRÔNICA DE ÍONS E TRANSFORMADA
DE FOURRIER - FTICR

 Consiste de três pratos

paralelos dispostos na forma de
um cubo, usados para capturar,
excitar e detectar íons em uma
célula pequena.
 Os íons capturados, sob a
influência de um campo
magnético movem-se em uma
trajetória circular de raio r e
freqüência w:
ANALISADOR POR FTICR
ORBITRAP
LTQ-Orbitrap
 Detectores
MULTIPLICADOR DE ELÉTRONS
 Multiplica uma corrente eletrônica, por aceleração de elétrons na
superfície de um eletrodo.
 A colisão libera um número de elétrons secundários maior que o número de
elétrons incidentes. Os elétrons secundários são acelerados também por um
outro eletrodo que por sua vez libera outros elétrons secundários e assim
por diante, resultando em uma amplificação do sinal.
PLACA DE MICROS CANAIS (MCP)
 Um arranjo de capilares de vidro
 paredes internas
 material condutor de energia elétrica
 alta voltagem
 íon que colidir na parede interna dos capilares criará uma avalanche
de elétrons secundários
RESOLUÇÃO DOS ESPECTRÔMETROS DE
MASSA
 PESQUISA EM BANCOS DE DADOS

m/z MH+ Delta

Submitted Matched ppm
1163.5960 1163.6312 -30
1439.7990 1439.8123 -9.2
1479.8420 1479.7960 31
1567.7940 1567.7433 32
1899.9710 1900.0081 -20

A pesquisa em banco de dados foi

realizada com submissão de
massa/carga de 7 mais intensos
peptídeos demonstrados no espectro
PROTEIN ID: serum albumin precursor (BOVINE)
de massa da figura e o programa
ProteinProspector foi acertado para a
menor especificidade possível, sem
nenhuma restrição ao peso molecular,
ponto isoelétrico e cadeia taxonômica.
A pesquisa envolveu 983900 entradas,
sendo que BSA foi prontamente
identificada.
• Proteínas são
identificadas inserindo-se
a massa dos peptídeos em
um banco de dados de
peptídeos como o
ProFound.
• Parâmetros de busca
são refinados incluindo
massa e ponto isoelétrico
determinados por 2D
PAGE.

•http://www.unb.br/cbsp/paginiciais/profound.htm
Busca em bancos de dados
NANOELETROSPRY
NANOELETROSPRAY
NANOELECTROSPRAY
 http://prospector.ucsf.edu/

http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/index.html 

http://www.ionsource.com/