Fisiologia microbiana

Nutrio e crescimento
Nutrio microbiana Componentes necessrios s clulas Meios de cultura Condies ambientais Crescimento populacional Velocidade de crescimento Tempo de gerao Medidas do crescimento

Introduo
Nutrio de microrganismos
Nutricionalmente so os mais versteis e diversificados Alguns podem viver com poucas substncias inorgnicas Outros so to exigentes quanto o homem Para caracterizar suas propriedades (morfolgicas, fisiolgicas e bioqumicas) necessrio o cultivo em laboratrio:
- Cultivo in vitro: quando se conhece as exigncias nutricionais - Cultivo in vivo: quando no se conhece as exigncias nutricionais

Exemplo de microrganismos que precisam de hospedeiro para ser cultivado: - Mycobacterium leprae (causador da hansenase) - Glomus clarum (fungo simbionte)

Necessidade de meios de cultura adequados

 Para o cultivo laboratorial (in vitro) so utilizados meios de cultura que simulam e at melhoram as condies naturais.  Os elementos qumicos principais para o crescimento das clulas so denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P).  O carbono um dos elementos mais importante para o crescimento microbiano.

Com exceo para CO2, os compostos orgnicos so os que contm carbono

Macronutrientes: - Necessrios em grande quantidade.

- Tem papel importante na estrutura e metabolismo.

Micronutrientes:

- Necessrios em quantidades mnimas. - Funes enzimticas e estruturais das biomolculas

clula

atria seca gua

N H , , K, Na ...

Componentes necessrios s clulas Macronutrientes

 Fonte de carbono:
- Compostos orgnicos (microrganismos heterotrficos):
carboidratos lipdeos protenas

- Dixido de carbono (microrganismos autotrficos):

a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou de outros compostos inorgnicos.

 Fonte de Nitrognio:
- elemento necessrio em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %.
(constituinte das protenas, cidos nuclicos, etc.) molculas orgnicas (aminocidos, peptdeos) molculas inorgnicas (NH3, NO3-, N2) A capacidade de algumas bactrias em utilizar o nitrognio atmosfrico (FBN) de fundamental importncia para a vida de todos os seres.

Componentes necessrios s clulas

Hidrognio:
- Principal elemento dos compostos orgnicos e de diversos inorgnicos (gua, sais e
gases)
Funo: Manuteno do pH Formao de ligaes de H entre molculas Fonte de energia nas reaes de oxi-reduo na respirao

Oxignio:
- Elemento comum encontrado nas molculas biolgicas (aminocidos, nucleotdeos,

glicerdeos)
- obtido a partir das protenas e gorduras. Na forma de oxignio molecular (O2), requerido por muitos para os processos de gerao de energia.

Componentes necessrios s clulas

Outros macronutrientes:
 P  S  Sntese de cidos nuclicos, ATP Estabilidade de aminocidos, componente de vitaminas Estabilidade dos cidos nuclicos, bomba de Na/

 Mg Estabilidade dos ribossomos  Ca Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endsporos  Na Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. Bactrias haloflicas extremas no crescem com menos de 15 % de sal.  Fe Papel-chave na respirao, componente dos citocromos e das protenas envolvidas no transporte de eltrons.

Componentes necessrios s clulas Micronutrientes

Metais em quantidades muito pequenas (traos) na composio de um meio de cultura: Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B
Exercem funo estrutural em vrias enzimas (ativao) - Nem sempre sua adio necessria - Meios sintticos com compostos de alto grau de pureza e gua ultra pura podem apresentar deficincias desses elementos. Ex: Mo+6 necessrio para a nitrogenase, a enzima que converte o N2 para NH3 durante a FBN.

gua e outros aditivos

gua:
- Componente absolutamente indispensvel (com exceo dos protozorios que englobam partculas slidas) No laboratrio de utiliza gua destilada, filtrada e deionizada.

Outros aditivos:
Funo de aumentar a converso, evitar precipitao de ons, controlar a espuma, provocar inibio, estabilizar o pH:

Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitao dos fosfatos metlicos

EDTA, cido ctrico, polifosfatos.

Inibidores
Ex: produo de cido ctrico por Aspergillus niger Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o cido oxlico

Outros aditivos
Tampes
- Carbonato de clcio - Fosfatos - Protenas (peptona)

Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.

Ex: celulose induz a celulase pectina induz a pectinase amido induz a amilase

Antiespumantes: cultivos com aerao ocorre a produo de espuma

Remoo de clulas, perda do produto, contaminao Reduo do volume do meio

lcoois, cidos graxos, silicones, poliglicis: reduzem a tenso superficial das bolhas

Meios de cultura
Solues de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.

No existe um meio de cultura universal, mas Existem vrios tipos meios para diversas finalidades
Para obter sucesso no cultivo de microrganismos necessrio o conhecimento de suas exigncias nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e proporo adequada.

Classes

Quimicamente definidos (sais, compostos orgnicos purificados, gua) Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro,
leite, solo e rmem de bovino)

Meios de cultura

Meios quimicamente definidos so utilizados para determinar as necessidades nutricionais

At 1880 os microrganismos eram cultivados em meios lquidos. Robert och introduziu os meios de cultura slidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas (culturas puras).

Meio de cultura solidificado com 1,5 % de gar.

Controle um meio mnimo com apenas glicose e sais. 3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgnicos.

Meios de cultura
Embora no existam meios especficos para todos os microrganismos, existem centenas de formulaes para inmeras finalidades. Alguns so meios gerais: permitem o crescimento de muitas espcies Outros so meios especficos: servem para identificao de espcies, por ex.

Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey

Microplacas com diferentes meios de cultura para identificao de enterobactrias.

Meios de cultura para bactrias

Normalmente imitam o habitat normal
Ex. Se a bactria prefere os nutrientes encontrados no sangue, ento o sangue adicionado no meio de cultura.

Meio definido para quimioautotrficas

Meio definido para heterotrficas

Meio complexo para heterotrficas

Meios de cultura para fungos

Todos os fungos so heterotrficos
Geralmente so utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgnicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja. Tambm so utilizadas maiores concentraes de acares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactrias. Essa combinao permite inibir o crescimento de bactrias.

Meios de cultura para protozorios

Os protozorios so heterotrficos aerbios com exigncias nutricionais complexas
Muitos no so cultivados in vitro. Os que so necessitam muitos complementos, como emulses de tecidos cerebrais, soro fetal, infuso de fgado e clulas bacterianas. Ex: Tetrahymena pyriformis necessita de um meio contendo 10 aminocidos, 7 vitaminas e sais inorgnicos.

Tetrahymena pyriformis no patognico mas utilizado em pesquisas mdicas e biolgicas.

Meios de cultura para algas

As algas utilizam luz como energia, dixido de carbono, gua e ons inorgnicos solveis. So fotoautotrficos.
Ao contrrio dos meios para bactrias e fungos, existem poucos meios prontos para algas. Preparar um meio definido para algas marinhas pode ser muito trabalhoso, pois muitos sais contidos na gua do mar podero ser necessrios.

Mar vermelha. Algas que produzem toxinas.

Algas unicelulares

Meios especiais
 Meios para anaerbios: adio de agentes redutores (tioglicolato de sdio)  Meios seletivos: favorece o crescimento de um tipo particular ou suprime outros.
Ex. meio gar verde brilhante.

 Meios diferenciais: para diferenciar microrganismos dentro de uma cultura mista.

Ex. meio com sangue para distinguir as hemolticas.

 Meios seletivos/diferenciais:
Ex. Meio McConkey que contm sais de bile e cristal violeta.

 Meios de enriquecimento: se objetiva o aumento de uma determinada espcie sem inibir as demais.
Ex. isolar bactrias que oxidam fenol, fornecendo fenol como nica fonte de carbono.

Meios de Cultura Como determinar uma composio inicial para um meio de cultivo?
Passo 1: utilizar dados da composio elementar Ex: Para produzir 10 g de clulas bacterianas so necessrios de 1,3 g (13%) de N ou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N) Obs: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem introduzir o excesso de um deles. Com relao ao carbono considerar tambm frao para energia e manuteno (heterotrficos) Frao para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C) Frao para energia e manuteno (45%): YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose
Composio elementar mdia (% do peso seco)

MEIOS DE CULTURA

Elemento
Carbono hidrognio Nitrognio Fsforo Enxofre Potssio Sdio Clcio Magnsio

Bactria
52 7 13 2,5 0,6 2,5 0,75 0,55 0,25 0,5 0,1 4:1 85:23:4:1

Fungo
51 7 8,5 0,4-4,5 0,1-0,5 0,2-2,5 0,02-0,5 0,1-1,4 0,1-0,5 0,15 6:1

Relao C:N = 28,9/7,2 = 4:1 e assim por diante. Passo 2: otimizao

Cloro Ferro Relao C:N mdia Relao C:N:P:S

Condies ambientais (fatores abiticos)

    

Temperatura Oxignio pH Presso osmtica, atmosfrica, hidrosttica Radiao eletromagntica

Temperatura
Grupos
1. Psicrfilos temperatura tima abaixo de 15 oC, suscetveis de crescer a 0 oC. 2. Mesfilos temperatura tima 20o - 40 oC, maioria dos patgenos humanos. 3. Termfilos temperatura tima acima de 45 oC.

A velocidade de crescimento duplica a cada aumento de 10 C.

Efeito do oxignio no crescimento microbiano

Durante as reaes de reduo do O2 so formados vrios intermedirios txicos. Ex: H2O2, OH, O2Os microrganismos aerbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas txicas

Meio gelatinoso com indicador redox:

Rosa quando oxidado Incolor quando reduzido

Aerbio Anaerbio Facultativo Microaerfilo Anaerbio aerotolerante

Sistema para cultivo de anaerbios

Sistema para cultivo de aerbios

Equipamentos que transferem oxignio ao meio de cultura

pH
Ao contrrio da temperatura, o pH timo para o crescimento encontrase no valor mdio da variao sobre o qual o crescimento acontecer, Os microrganismos so encontrados em todos os ambientes e portanto em todas as condies de pH. Quando cultivados in vitro, o meio sofrer alteraes medida que os metablitos cidos ou alcalinos so produzidos. - Necessrio a adio de um tampo ao meio.

Presso osmtica
No devem existir grandes diferenas na concentrao de solutos dentro e fora da clula, pois podem desidratar-se ou romper-se.
Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais mais elevados.

CRESCIMENTO MICROBIANO
Em microbiologia crescimento geralmente o aumento do nmero de clulas Na maioria dos procariotos ocorre a fisso binria: crescimento e diviso

Varia de minutos at dias Depende muito das condies ambientais

O padro de crescimento o exponencial

Tratando-se bactrias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por diviso binria, temos: 21 > 22 > 23> 24
N = N .2n

Onde N = n microrganismos ao fim de n divises (geraes) N0 o nmero inicial

O nmero de geraes ser:

n = 3,3(logN - logN0 )

A velocidade exponencial de crescimento (R) expressa pelo nmero de divises no tempo: n R= t - t0

1 t - t0 = R n

A recproca de R o tempo de gerao:

G=

O ciclo de crescimento
A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma populao microbiana O crescimento de microrganismos apresenta um ciclo tpico com todas as fases de crescimento.

1) Fase Lag
Perodo de adaptao da cultura Mudana de meio, preparao do complexo enzimtico Reparao das clulas com danos.

2) Fase exponencial
Fase mais saudvel das clulas onde todas esto se dividindo. A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as velocidades de crescimento so bastante variveis: - Procariticos crescem mais rapidamente que os eucariticos - Eucariticos menores crescem mais rapidamente que os maiores

3) Fase estacionria:
Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial no pode ocorrer indefinidamente. Ocorre a limitao por depleo de nutrientes e acmulo de metablitos. Diviso = morte crescimento lquido nulo

Ainda pode ocorrer catabolismo e produo de metablitos secundrios

4) Fase de morte (declnio):

A manuteno de uma cultura no estado estacionrio por longo tempo conduz as clulas ao processo de morte. A morte celular acompanhada da lise celular

MEDIDAS DO CRESCIMENTO

Podem ser realizadas pelos seguintes mtodos: 1) Peso seco total das prprias clulas
filtrao, secagem e pesagem 2) Peso de algum componente celular extrao, secagem e pesagem

3) Variao no nmero de clulas a) contagem de clulas totais (direta) b) contagem de clulas viveis (indireta)

Contagem microscpica direta

Utilizam-se cmaras especiais de contagem (lmina com grade quadriculada) Ex.: Cmara de Neubauer

Vantagens: mtodo rpido e fcil Desvantagens: No distingue as clulas vivas das mortas Pode-se omitir clulas pequenas Clulas mveis precisam ser imobilizadas

Contagem de clulas viveis (indireta)

Contagem das colnias formadas em meio de cultura em placas.

Diluio das suspenses celulares Amostras concentradas precisam ser diludas

So empregadas vrias diluies decimais porque difcil prever o nmero de viveis. contada a placa com 30 a 300 colnias

MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO - Outros mtodos

- Turbidimetria
As clulas dispersam a luz e quanto mais clulas mais turvo o meio
Pode ser medida com um espectrofotmetro

O uso da turbidimetria exige a construo de uma curva padro Turbidez X quantidade de clulas

- Contagem eletrnica