Aspectos importantes de

microbiologia:

coleta, preservação de
espécimes e noções de
biologia molecular
Maria Clara Padoveze
Divisão de Infecção Hospitalar
 Microbiologia – Surtos de IH

• Todo resultado liberado pelo laboratório de

microbiologia é conseqüência da qualidade da
amostra recebida.

• O material coletado deve ser representativo do

processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o
melhor sítio da lesão, evitando contaminação com as
áreas adjacentes.

• A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar

falhas no isolamento do agente etiológico e favorecer
o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a
um resultado inapropriado
 Microbiologia – Surtos de IH

• procedimentos adequados de coleta devem

ser adotados para evitar o isolamento de um
“falso” agente etiológico
• Na amostra devem estar identificados:
– 􀂃 Nome e registro do paciente
– 􀂃 Leito ou ambulatório e especialidade
– 􀂃 Material colhido
– 􀂃 Data, hora e quem realizou a coleta
 Considerações gerais da coleta
• 􀂃 Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível.
• 􀂃 Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais
clínicos.
• 􀂃 Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha
maior probabilidade de ser isolado.
• 􀂃 Considerar o estágio da doença na escolha do material.
Patógenos entéricos causadores de diarréia, estão
presentes em maior quantidade e são mais facilmente
isolados durante a fase aguda ou diarréica do processo
infeccioso intestinal.
• 􀂃 Quantidade suficiente de material deve ser coletado
para permitir uma completa análise microbiológica.
• O pedido do exame deve conter as informações
necessárias para o perfeito desenvolvimento da análise
clínica do espécime.
 Considerações de segurança
• 􀂃 Utilizar as barreiras de proteção necessárias a
cada procedimento.
• 􀂃 Toda amostra deve ser tratada como
potencialmente patogênica.
• 􀂃 Usar frascos e meios de transporte apropriados.
• 􀂃 Não manusear a amostra em trânsito.
• Não contaminar a superfície externa do frasco de
coleta e verificar se ele está firmemente vedado.
(caso ocorram respingos ou contaminação na parte
externa do frasco, fazer descontaminação com álcool
70%)
 Considerações de segurança

• 􀂃 Não contaminar a requisição médica que

acompanha o material.
• 􀂃 As amostras deverão ser transportadas em
sacos plásticos fechados.
• 􀂃 Identificar claramente a amostra coletada,
com todos os dados necessários.
• 􀂃 Colocar a identificação no frasco de coleta
e nunca na tampa ou sobre rótulos.
• 􀂃 Encaminhar os materiais imediatamente ao
laboratório.
 TRANSPORTE DAS AMOSTRAS
• Transportar as amostras IMEDIATAMENTE ao
laboratório para:

– 􀂃 Assegurar a sobrevivência e isolamento do

microrganismo
– 􀂃 Evitar o contato prolongado dos
microorganismos com anestésicos utilizados
durante a coleta, pois eles poderão exercer
atividade bactericida.
– 􀂃 Evitar erros de interpretação nas culturas
quantitativas, principalmente urina e lavado
broncoalveolar.
– 􀂃 Consultar o laboratório para verificar a
disponibilidade dos meios de transporte.
 Amostras Inadequadas
• 􀂃 Material clínico recebido em solução de fixação
(formalina).
• 􀂃 Ponta de cateter de Foley.
• 􀂃 Material conservado inadequadamente com relação a
temperatura
• 􀂃 Frascos não estéreis.
• 􀂃 Presença de vazamentos, frascos quebrados ou sem
tampa, com contaminação na superfície externa.
• 􀂃 Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro, ferida
colhida no mesmo dia e da mesma origem.
• 􀂃 Swab único com múltiplas requisições de testes
microbiológicos.
• 􀂃 Swab seco.
• 􀂃 Culturas para anaeróbios recebidas em condições
não apropriadas.
 MANUTENÇÃO DAS CULTURAS

PREPARO DE CULTURAS

• Uma vez obtida uma cultura satisfatória, a mesma

deve ser mantida pura e viável e para isso é preciso:

‫ـ‬Transferir periodicamente a cultura em um meio de

cultura adequado;
‫ ـ‬incubar até que a cultura atinja a fase estacionária
máxima de crescimento;
‫ ـ‬e estocar em temperatura apropriada para impedir
maior crescimento.
 MANUTENÇÃO DAS CULTURAS
PUREZA DAS CULTURAS

• Para assegurar a pureza das culturas, estas devem

ser obtidas periodicamente de uma cultura e
verificadas regularmente quanto à pureza.
• Os métodos para avaliar a pureza da cultura variam
com o tipo de cultura a ser testada.

VIABILIDADE DA CULTURA

• A viabilidade é avaliada pela taxa de crescimento e

atividade metabólica. A deterioração das culturas pode
resultar do manuseio incorreto, do cultivo inadequado,
de transferências freqüentes por um longo período,
meio de cultura impróprio, mutação e ataque da
bactéria por um bacteriófago.
 MANUTENÇÃO DAS CULTURAS
ESTOQUE DE CULTURAS
• O estoque de culturas deve ser
preparado de modo que as culturas
sejam armazenadas e preservadas por
um longo período sem transferência.
• Tais culturas tendem a permanecerem
estáveis e são utilizadas como fonte de
cultura caso a cultura ativa seja perdida
e/ou deteriorada.
 Surtos
• Colher material indicado pelo estudo
epidemiológico
• Não colher amostras cuja interpretação dos
resultados não será esclarecedora para o surto
• Não confundir procedimentos clínicos e
epidemiológicos com análise fiscal
• O exame microbiológico é um procedimento que
envolve custos e deve ser um recurso utilizado
com racionalidade
• Esclarecer o laboratório clínico quando se tratar
de amostras de investigação de surto e quais as
possíveis hipóteses
 Surtos
• Colher amostras clínicas que visem o esclarecimento do
diagnóstico:
– Confirmar a identificação da espécie ou da
susceptibilidade do microrganismo com um laboratório de
referência, se houver necessidade
– Ser criterioso na indicação de coletas de profissionais de
saúde para não gerar problemas institucionais.
• Quando necessária a coleta, esclarecer o profissional
suficientemente
• Ter clareza de qual será o procedimento a ser adotado
em caso de resultado positivo, antes de iniciar a
indicação da coleta (ex.: afastamento, tratamento,etc.)
• Manter a confidencialidade.
 Surtos
• Colher amostras ambientais que possam ser
correlacionadas com o diagnóstico estabelecido

– Ter em mente a hipótese de que se trata de surto

propagado por pessoa-a-pessoa ou fonte única
para saber indicar a coleta adequada .
– Ter em mente qual o possível agente e seus
prováveis reservatórios e formas de transmissão
(buscar na literatura)
– Não colher amostras ambientais se o laboratório
clínico não dispuser de recursos técnicos para
processá-la. Se necessário contatar um
laboratório de referência.
 Pseudo-surtos

• Mais freqüentemente associado a

contaminação durante a execução do
exame microbiológico.
• Eventualmente pode ser associado com
contaminação sistemática de coletas
– Anti-sépticos contaminados
– Recipientes contaminados
– Profissional de saúde
 Análise Fiscal

Fonte:
www.incqs.fiocruz.br/manual.htm
 Análise fiscal
• O processo de apreensão de amostra
para análise fiscal de medicamentos só
tem validade oficial se, tal ação, for
desencadeada pela autoridade sanitária
competente (
vigilâncias sanitárias estaduais ou
municipais), podendo ser desencadeada
por denúncia, embora nem toda denúncia
gere uma análise fiscal, ou indicado pelo
Sistema de Monitorização de
Medicamentos.
 Análise Fiscal
• A análise fiscal consistirá na coleta de amostra
representativa do estoque existente, a qual, dividida em três
partes, será tornada inviolável, para que se assegurem as
características de conservação e autenticidade.

• Uma parte é entregue ao detentor ou responsável, a fim de

servir como contraprova, e as duas outras partes são
imediatamente encaminhadas ao laboratório oficial do
estado para realização das análises indispensáveis.
– São necessários materiais suficientes para três análises
– Tabela de número mínimo de itens para análise fiscal de
medicamentos e produtos: ANVISA, FIOCRUZ

FONTE: Informe SNVS/Anvisa/UFARM nº 1, de 7 de

maio de 2004
[www.anvisa.gov.br/farmacovigilância/informes/2004]
 Caracterização dos sistemas de
tipagem
• 1. Tipabilidade: habilidade da técnica em produzir um
resultado de tipagem para cada resultado
2. Reprodutibilidade: capacidade de gerar os os
mesmos resultados quando uma mesma cepa for
testada em repetidos ensaios laboratoriais.
• 3. Poder discriminatório: capacidade da técnica em
diferenciar isolados não relacionados
epidemiologicamente
• 4. Facilidade de realização
• 5. Facilidade de interpretação
 Exemplos de tipagem
molecular

Staphylococcus aureus, Unidade de Leito-Dia, HC-UNICAMP, 1998.

 Exemplos de tipagem
molecular

Staphylococcus aureus, Unidade de Pesquisa Clínica, UNICAMP, 2004.

 Tipagem molecular

• A determinação de uma origem clonal para

microrganismos isolados de diversas fontes
(pacientes ou reservatórios) é uma etapa
importante na identificação de surtos
hospitalares.
• Informações quanto a origem clonal de
isolados microbianos também permite melhor
elucidar a cadeia epidemiológica e selecionar
as medidas de controle mais objetivas.
 Caracterização de clones
Métodos fenotípicos:

– Sorotipagem
– Perfil de susceptibilidade a antimicrobianos
– Susceptibilidade a bacteriófagos (fagotipagem)
• Apresentam algumas limitações de tipabilidade,
poder discriminatório e reprodutibilidade
• Microrganismos de uma mesma origem clonal
podem apresentar diferenças na manifestação
fenotípica de alguns aspectos avaliados
 Caracterização de clones
Métodos genotípicos:

• Baseado no polimorfismo encontrado no genoma

• Particularidades que podem ser acessadas por
clivagem da fita genômica ou amplificação de um
fragmento
• Resultado final: padrão de bandas específico
para o clone, cuja aparência lembra um código de
barras
• Interpretação envolve a comparação de padrões
estabelecendo critérios de similaridade e
diferenciação

– Maior tipabilidade, poder discriminatório e

reprodutibilidade.
 Métodos genotípicos
Mais freqüentemente utilizados:
• PCR = Polimerase Chain Reaction: baseado
na amplificação de uma seqüência do DNA e
análise do seu polimorfismo.
• Análise de plasmídeos: baseado na análise
do DNA extra-cromossômico de bactérias
• PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis:
baseado na análise de diferença entre os
fragmentos produzidos pela clivagem do DNA
com enzimas de restrição.
 Métodos genotípicos

• A seleção dos métodos a serem

utilizados depende de variáveis como:
– Tipo de microrganismo a ser estudado
– Tempo para execução do ensaio
– Disponibilidade dos recursos
 Tipagem molecular
• A utilização de recursos de tipagem
molecular não prescinde da necessidade de
um esmerado estudo epidemiológico do
fenômeno
• Nem todos os surtos requerem análises da
origem clonal para seu esclarecimento
• A adequada identificação da espécie e
correta realização do perfil de
susceptibilidade a antimicrobianos e
condição elementar para análise dos
aspectos microbiológicos do surto.
 Referências Bibliográficas:
• LEVI, CE. Procedimentos Laboratoriais: da Requisição do Exame à Análise
Microbiológica. IN: ANVISA. Manual de Microbiologia Clínica para o
Controle de Infecção em Serviços de Saúde. 2004. www.anvisa.gov.br
• Manual de Coleta. www.incqs.fiocruz.br/manual.htm
• FORTALEZA, CMCB. Aplicação dos sistemas de tipagem molecular à
epidemiologia hospitalar de bactérias. Monografia apresentada para
qualificação no Curso de Pós-Graduação em Patologia da Faculdade de
Medicina de Botucatu, Universidade Estadual de São Paulo - UNESP. MAIO,
1999.
• BRANCHINI, MLM. Aplicação de Métodos de Tipagem Molecular na
Investigação de surtos intra-hospitalares. Tese de livre-docência apresentada
à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas –
UNICAMP.
• PADOVEZE, MC. Estudo da Epidemiologia molecular dos Staphylococcus
aureus Resistentes à Oxacilina em Pacientes Portadores de Síndrome de
Imunodeficiência Adquirida. Tese apresentada ao Departamento de
Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual
de Campinas para obtenção do título de mestre.