Introduo

Malria
Doena parasitria que tem como agente etiolgico o Plasmodium falciparum; Presente em mais de 100 pases;

Aumento da mortalidade em virtude da resistncia do P. falciparum;

Desenvolvimento de Novos Antimalricos.

Introduo
Oligonucleotdeos Antisenso
Sequncia curta de nucleotdeos em fita simples;

Modulao de Genes; Inibio de Protenas; Inibio do Crescimento do P. falciparum.

Introduo
Oligonucleotdeos Antisenso

Alto Peso Molecular

Carter Hidroflico

Terapia a Base de Oligonucleotdeos

Rpida Degradao em Fludos Biolgicos

Introduo
Associao de cidos nuclicos a carreadores coloidais catinicos Polmeros ou Lipdios.

* Incorporao de oligonucletdeos antisenso em nanopartculas de Quitosana.

Introduo
Nanoemulso catinica como um sistema de liberao de oligonucleotdeos antisenso (modificados quimicamente) direcionados a topoisomerase II do P. falciparum; Caracterizao fsico-qumica; Avaliao da Atividade in Vitro.

Materiais e Mtodos
Materiais
Triglicerdeos de cadeia mdia Lecitina de ovo Lipoide E-80 1,2-dioleoil-3-trimel amnio propano DOTAP Corante vermelho do Nilo Glicerol

gua Milli-Q
Oligonucleotdeos - antisenso (5-ATG TAA TAT TCT TTT GAA CCA TAC GAT TCT-3) - senso (5-AGA ATC GTA TGG TTC AAA AGA ATA TTA CAT-3) *isotiocianato de fluroscena *- 33P-ATP

Materiais e Mtodos
Obteno e Caracterizao das Nanoemulses

Fase Orgnica + Etanol

H2O + Glicerol

t = 50C v = 5ml Agitao Evaporao do solvente

Materiais e Mtodos
Obteno e Caracterizao das Nanoemulses
Espectroscopia de Correlao de Ftons
-Tamanho de Gotculas

- ndice de Polidisperso
* Diluio em gua

Mobilidade Eletrofortica
-Potencial Zeta
*Diluio em NaCl 1mM

Materiais e Mtodos
Obteno e Caracterizao dos Complexos NE/ON
Nanoemulso

15 min t = ambiente H2O + PS e PO (10M) Complexo NE/ON

* Complexos de NE/ON com diferentes razes de cargas +/- : +0,5/; +2/- ; +4/- ; +6/-.

Materiais e Mtodos
Teste de Hemlise
Centrifugao Sangue O+
Eritrcitos em meio RPMI

I) Incubao dos complexos NE/PO e NE/PS (+0,5/-; +2/-; +4/- e +6/-) com eritrcitos no infectados 15min. II) Incubao dos complexos NE/PO e NE/PS (+4/-) com eritrcitos no infectados realizando anlise cintica (5, 15, 30, 60 e 180min). III) Incubao dos complexos NE/PO e NE/PS (+4/-) com eritrcitos infectados com o P. falciparum por15min e 44hs.

* Incubao de NE com eritrcitos infectados e no infectados por 44hs.

Centrifugao

NaCl 0,9% - controle positivo Triton 100 controle negativo

570nm

Materiais e Mtodos
Teste de Interao com os Eritrcitos
Obteno dos Oligonucleotdeos Radiocromados
5 L de PO ou PS (10M) 1 L de T4 p. nucleotdeo quinase 1 L de - 33P-ATP

Incubao por 30 min a 37C

Aquecimento por 15 min a 80C *desnaturao da quinase

Purificao do 33P-PO e 33P-OS por excluso molecular

Centrifugao a 2.400 rpm/min

Verificao da pureza atravs do TLC linear analyzer

Materiais e Mtodos
Teste de Interao com os Eritrcitos
I) Incubao dos complexos NE/PO e NE/OS (+0,5/-; +2/-; +4/- e +6/-) com eritrcitos no infectados 15min. II) Incubao dos complexos NE/PO e NE/OS (+4/-) com eritrcitos no infectados realizando anlise cintica (5, 15, 30, 60 e 180min). III) Incubao dos complexos NE/PO e NE/OS (+4/-) com eritrcitos infectados com o P. falciparum por15min e 44hs.

Centrifugao + Triton 100

Cintilao Lquida

*Coquetel de Cintilao = Flor

Materiais e Mtodos
Estabilidade dos Complexos em Meio de Cultura

NE NE/PO NE/PS
Meio RPMI

t = 15min, 1, 8, 24 e 44hs

Diluio

Tamanho de Gotculas ndice de Polidisperso

*(+0,5-; +2/-; e +4/-)

Materiais e Mtodos
Inibio do Crescimento do P. falciparum in vitro
Contaminao de eritrcitos pela cepa 3D7
Parasitas em RPMI = Cont. Neg. Parasitas com Cloroq. = Cont. Pos.

Seleo de trofozotos jovens Sorbitol

3 ciclos de gelo/degelo, aps 44hs a 37C

Incubao de NE, NE/sPO, NE/sPS, NE/PO e NE/PS (+4/-)

Elisa (pLDH) e Microscopia

*Eritrcitos com 0,5% de parasitemia

Materiais e Mtodos
Inibio do Crescimento do P. falciparum in vitro
Teste de Reinfeco
Clulas com 2% de parasitemia

P. Falciparum em diferentes estgios

Incubao com NE/PO e NE/PS por 44 hs

Produo de esfregaos aps 24 e 44hs Determinao da Parasitemia

Materiais e Mtodos
Microscopia de Fluorescncia Confocal
Determinao de Oligonucleotdeos FITC-PO e FITC-PS complexados e livres; Clulas infectadas e no infectadas incubadas por 15min com as formulaes;
Leitura 543 nm.

* Emulses marcadas com o Corante Nilo Vermelho

Materiais e Mtodos
Anlise Estatstica

Os resultados foram expressos como mdia e desvio padro e analisados por meio do Teste t de Student.

Resultados e Discusso
Propriedades das NE e Complexos NE-ON

Tabela 1. Tamanho (nm) e Potencial Zeta (mV) de NE e complexos NE/ON.

Resultados e Discusso
Propriedades das NE e Complexos NE-ON
Caractersticas Fsico-qumicas de acordo com a literatura; Valores do Potencial Zeta relacionados com o lipdio catinico;

Formao do complexo NE/ON ocorre independentemente do tamanho do ON;

Ausncia de diferena entre os complexos NE/PO e NE/PS (p>0,05);

Evidncias de instabilidade para os complexos com razo de carga +2/-.

Resultados e Discusso
Teste de Hemlise
NE/PO NE/PO NE/PS

NE/PS

Fig. 1 A. Efeito das diferentes propores de cargas dos complexos na hemlise.

Fig. 1 B. Efeito do tempo de incubao na hemlise.

Resultados e Discusso
Teste de Hemlise
Independente do complexo (PO ou PS) a hemlise ao longo do tempo semelhante (+4/-); Para valores de carga mais elevados (+6/-) e apenas NE o efeito hemoltico foi
significativamente maior (p<0,05);

Para os complexos NE/ON a ao hemoltica semelhante para eritrcitos infectados e

no infectados, o mesmo no ocorre para NE;

Resultados variam de acordo com o lipdio catinico.

Resultados e Discusso
Interao com Eritrcitos
NE/PO NE/PO NE/PS

NE/PS

Fig. 1C. Efeito das diferentes propores de cargas dos complexos NE/ON na interao com eritrcitos.

Fig. 1D. Efeito do tempo de incubao na interao com o eritrcito.

Resultados e Discusso
Estabilidade do Complexo NE/ON em Meio de Cultura

+2/-

+4/+0,5/-

Fig. 2. Tamanho mdio de gotculas e ndice de polidisperso para complexos NE/PO.

Resultados e Discusso
Inibio do Crescimento do P. falciparum in vitro

Fig.3.A. Inibio do crescimento do P. falciparum, quantificado pelo teste de Elisa pLDH, aps 44 hs de exposio aos diferentes tratamento.

Resultados e Discusso
Inibio do Crescimento do P. falciparum in vitro
Esquizontes Trof. Jovem

Fig.3.B. Teste de reinfeco quantificado por meio de microscopia, aps 24 e 44 hs do tratamento.

Fig.3.C. Teste de reinfeco quantificado por meio de microscopia, aps 24 e 44 hs do tratamento.

Resultados e Discusso
Microscopia de Fluorescncia Confocal

Fig.4. Imagens de microscopia de fluorescncia confocal de eritrcitos aps incubao com o complexo NE/OS +4/- .

Concluses
A incorporao de PO e PS foi semelhante; Aumento da interao hemcia-complexo proporcional ao aumento da carga;

Nanoemulses aumentaram a atividade dos Oligonucleotdeos; Realizao de mais estudos com cepas resistentes a Cloroquina;
Estudos avaliando os nveis de mRNA e protenas;

Ensaios futuros incluem estudos in vivo.