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LICENCIATURA EM BIOQUÍMICA – 2º ANO

LABORATÓRIOS DE BIOFÍSICA / BIOQUÍMICA Trabalhos Práticos

ICBAS 2012/2013

PLANO DE AULAS DE LABORATÓRIOS DE BIOQUÍMICA E BIOFÍSICA 2012 – 2013

TRABALHO

SEMANA Carnaval - 1314 Fev 19-20-21 26-27-28 Fev

TÍTULO DO TRABALHO PRÁTICO (Docente)

Simulação do isolamento de uma proteína usando o programa “ProteinLab” (MRA)

Protein Data Bank (PDB) (MS)
Quantificação de proteínas por espectrofotometria (MRA)

1 2 3

5 - 6 – 7 Mar 12 - 13 – 14 Mar 19 - 20 – 21 Mar

Produção de proteína recombinante (MRA)
Separação e caracterização de proteínas por electroforese (MRA) Férias Páscoa

4 5 6 7

2–3–4 Abril 9 - 10 - 11 Abril 16- 17 -18 Abril 23 - 24 – 25 Abril 30 - 1 -2 Maio 7 - 8 – 9 Maio

Ensaios imunoquímicos – imunoensaio enzimático (ELISA) e

“immunoblotting” (MRA)
Purificação de uma proteína por cromatografia de afinidade (MRA) Cristalização de proteínas - Estudos de caracterização estrutural de proteínas (MS) Cristalização de proteínas (MS) Cristalização de proteínas (MS) Queima das Fitas Fracionamento celular (MS) Fracionamento celular (MS) Apresentações dos alunos

8 9 10

14 - 15-16 Maio 21 – 22 - 23 Maio 28 - 29-30 Maio

Docentes: Profª. Doutora Maria do Rosário Almeida (MRA); Dr.ª Maria Strecht (MS)

Trabalho Prático nº1 Simulação do isolamento de uma proteína usando o programa «ProteinLab»
Objectivos:
- Familiarização com técnicas de isolamento e caracterização de proteínas e análise das informações obtidas em cada uma dessas técnicas; - Delinear a estratégia de purificação de uma proteína em função de alguns dados iniciais e principalmente em função dos resultados obtidos em cada uma das etapas cumpridas sucessivamente.

Endereço na web:

www.tlsu.leeds.ac.uk/courses/bioc2060/proteinlab102/Protein2/html

O ProteinLab é um programa de simulação do isolamento de proteínas concebido pelo Professor Andrew G. Booth da Universidade de Leeds – «ProteinLab» A. G. Booth, School of Biochemistry and Molecular Biology, University of Leeds, 1999.

Introdução
Neste programa é-nos dado escolher uma de 20 proteínas (1-20) para ser isolada. Relativamente a cada proteína são fornecidas informações relativas à temperatura óptima de actividade e ao intervalo de pH em que a proteína é estável. A partir desta informação é possível escolher uma das variadas técnicas disponíveis e ir tomando decisões sucessivas perante os resultados obtidos. Em cada etapa de purificação pode avaliar-se a eficiência do processo e identificar a proteína pela sua actividade enzimática. São particularmente úteis para análise dos produtos de cada etapa de purificação as técnicas de electroforese, immunoblotting e análise bidimensional. A selecção das técnicas a utilizar implica também uma escolha em função da viabilidade económica do processo. No decurso do programa é possível ainda obter informações mais detalhadas sobre as diferentes técnicas seleccionadas. 3

"Protein Lab", by A.G. Booth, School of Biochemistry and Biotechnology, University of Leeds, Leeds, United Kingdom. Summary of program features: (Note: The description below applies to the versions of "Protein Lab" available for download. The on-line Java version is slightly different.) The program follows an imagined scenario: purification of a protein in a research setting. For background information, as well as an explanation of the concepts needed to effectively use this program, we recommend that students start with the following HELP menu topics: SCENARIO, GETTING STARTED and STRATEGY. Once students understand the general layout of the program, they may begin the actual purification. "Protein Lab" offers the student a chance to purify one of twenty different proteins from a mixture. There is also an option to save an ongoing purification and then later return to the stored material. All of the target proteins are enzymes whose activity may be assayed. The student chooses BEGIN: START FROM THE BEGINNING to select a protein to purify. The program will then provide basic information about the chosen protein, including its pH and temperature stability range. Next, the student chooses the first purification procedure using the SEPARATION menu. There are numerous purification procedures available; the optimal procedure depends on the structural and functional properties of the desired protein. Use the HELP menu to get specific information about each of these procedures, which include Ammonium Sulfate Precipitation, Gel Filtration Chromatography, Ion Exchange Chromatography and others. If a chromatography technique is chosen for separation, the computer generates a chromatogram of A280 vs. fraction number. Following the purification, using a pull-down menu titled FRACTIONS, the fractions can then be assayed for enzyme activity and selected fractions pooled. At any step in the purification, the student may assess his or her progress in one of three ways: by asking for a PROGRESS REPORT (using the HELP menu), by using the ELECTROPHORESIS menu to run a virtual 1-dimensional or 2-dimensional PAGE gel, or by running a PAGE gel and then requesting an IMMUNOBLOT (Western Blot). PROGRESS REPORT includes information on yield, enrichment and efficiency (expressed in person hours). There is no fixed end-point for a given purification, except in the case where the student spends too much virtual money and is "fired". However, the instructor could set some standards for the class in terms of either purity or yield.

4

Sources of Background Information: Students benefit most from this software when it is preceded by at least one lecture of background material on protein purification. Some useful sources include: • Lisa A. Seidman and Cynthia J. Moore, Basic Laboratory Methods for Biotechnology: Textbook and Laboratory Reference, Prentice Hall, 2000 (especially Chapters 23 and 27). • Jeanette Mowery and Lisa Seidman, Protein Purification Manual: Purification of ßgalactosidase from E.coli, Madison Area Technical College. (Manuscript in preparation, please contact Jeanette Mowery for an advance copy.) • Material from the HELP screens of "Protein Lab" itself. Software: "Protein Lab" by A.J. Booth may be downloaded or used on-line by visiting http://www.booth1.demon.co.uk/archive.

5

Trabalho Prático nº2

Quantificação de proteínas por espectrofotometria
Objectivo
Neste trabalho pretende fazer-se um estudo comparativo de diferentes métodos de quantificação de proteínas baseados na espectroscopia de absorção. Para isso vai proceder-se à quantificação de albumina e tripsina em solução utilizando a absorção a 280 nm e os métodos do biureto, Lowry e Bradford. Pretende-se ainda, por análise dos resultados obtidos, verificar os limites de aplicabilidade da técnica.

Introdução
A quantificação de proteínas é, talvez, uma das técnicas mais comuns em bioquímica. Em qualquer estudo bioquímico há sempre uma etapa em que é necessário determinar a concentração de proteína de um modo absoluto ou relativo. Para uma quantificação absoluta o mais correcto seria determinar a massa de proteína, ou seja, o peso seco da proteína na amostra. Isso exigia que fossem retiradas todas as substâncias não proteícas da amostra, incluindo iões e moléculas de água. Este tipo de determinação para além de difícil não é muito sensível. A existência de uma relação linear entre a absorvância e a concentração de uma determinada substância (lei de Lambert-Beer) possibilita a utilização da espectrofotometria como método de quantificação. Assim, os métodos mais comuns para determinar a concentração de proteínas são métodos espectrofotométricos que usam cromóforos intrínsecos, como os anéis aromáticos de alguns resíduos de aminoácidos (absorvem a 280 nm) ou as ligações peptídicas (absorvem a 215 nm), ou

6

que se baseiam na reacção das proteínas com um reagente originando um produto corado ou fluorescente. Nas determinações espectrofotométricas o comprimento de onda seleccionado deve

corresponder ao comprimento de onda com absorvância máxima no sentido de aumentar a sensibilidade e minimizar os erros nas determinações. É muito importante que as soluções a serem lidas espectrofotometricamente se encontrem límpidas, caso contrário devem ser clarificadas, por exemplo por centrifugação. A escolha de um determinado método para a quantificação de uma proteína deve satisfazer alguns requisitos, nomeadamente, especificidade, sensibilidade, precisão e conveniência (isto é, deve ser rápido e económico). Na realidade devem avaliar-se os diferentes parâmetros de modo a escolher o método mais adequado aos objectivos a atingir, principalmente no que respeita à especificidade e à sensibilidade. A sensibilidade sendo um dos factores mais relevantes na escolha do método deve ser optimizada, por exemplo removendo substâncias contaminantes por precipitação, antes do doseamento. Outro factor que pode afectar a sensibilidade é a solubilidade da proteína. Assim, em alguns casos é necessário um passo inicial de solubilização da proteína. A validação de um método é feita pela determinação da exactidão e precisão desse método. Estes parâmetros são determinados através da análise estatística dos valores obtidos para várias determinações numa mesma amostra. Um ensaio exacto é um ensaio em que o valor médio obtido é muito próximo do valor real. Num ensaio preciso, a dispersão de resultados é pequena e o método é reprodutível, com boa resolução. Nos ensaios bioquímicos a precisão é na maior parte dos casos mais importante do que a exactidão pois são suficientes as quantificações relativas. Isso significa que, por exemplo, pode usar-se uma recta de calibração de concentração de albumina para a quantificação de uma outra proteína. No entanto, quando a determinação da concentração absoluta é importante deve usar-se uma curva de calibração da própria proteína. Os ensaios devem ser calibrados usando para isso soluções de concentração conhecida, em condições iguais às do ensaio propriamente dito. Para a calibração usa-se, em geral, uma solução stock de albumina sérica bovina (BSA) a uma concentração de 10 mg/ml ou uma diluição 1/10 desta solução. Soluções mais diluídas perdem proteína durante o armazenamento, principalmente por adsorção, devem por isso ser preparadas diariamente. A concentração exacta da albumina na solução stock deve ser determinada por leitura de absorvância a 280 nm usando como coeficiente de extinção o valor A2801%= 6.6. A concentração deve ser verificada periodicamente devido ao decréscimo da concentração por desnaturação da proteína. A calibração deve incluir pelo menos 5

7

concentrações diferentes de proteína na gama de concentrações em que o método apresenta linearidade. Como as proteínas têm composições diferentes em termos de aminoácidos o mesmo peso de proteína pode ter valores diferentes em diferentes ensaios. Por exemplo, um ensaio que responda relativamente aos anéis aromáticos vai subestimar o peso de uma proteína com poucos aromáticos. Assim, as calibrações baseadas em albumina são relativas. Tendo isto em conta um método que se baseie na reacção com as ligações peptídicas é talvez o que deve apresentar menos variações de proteína para proteína, podendo ser utilizado quase como um método absoluto.

Alguns aspectos práticos
Volume de amostra: Num ensaio espectrofotométrico uma amostra tem, em princípio, 3 componentes: a amostra propriamente dita, o solvente e o reagente de cor, em geral, em excesso relativamente à amostra. O volume de amostra deve ser sempre o mesmo, isto é, o volume final de amostra e solvente tem de ser sempre igual. O volume do reagente de cor deve ser constante para manter a diluição e o volume final. Sendo assim a absorvância é proporcional à quantidade de proteína na amostra não sendo necessário calcular a concentração de proteína na amostra de ensaio. Solvente: Para manter as condições dum ensaio, deve usar-se um solvente tamponado e os volumes de amostra não devem exceder 25% do volume de solvente. As substâncias tampão e os iões do solvente podem também contribuir para o desenvolvimento de cor no ensaio. Em todos os ensaios deve testar-se a influência do solvente da amostra no método. Ordem de adição: Embora este não seja um factor muito importante é sempre mais correcto adicionar o reagente de cor em último lugar. Uma das razões é que estes reagentes são menos estáveis nas misturas de amostra podendo decompor-se prematuramente.

Alguns métodos de doseamento de proteínas
Absorção de radiação ultravioleta Os resíduos de aminoácidos aromáticos absorvem luz no U.V. a 280 nm e as ligações peptídicas a 215 nm. Para uma proteína solúvel, incolor, a medição da absorvância a qualquer um destes comprimentos dá uma medida da concentração da proteína. A principal vantagem deste método é o facto de não destruir a amostra, e por isso poder ser utilizado, por exemplo, para monitorizar a 8

eluição de uma proteína duma coluna de cromatografia. A sua desvantagem é a falta de especificidade – muitos tampões comuns e alguns compostos biológicos (heme, ácidos nucleicos, ATP, etc.) absorvem fortemente no U.V., principalmente a 215 nm. Este método é particularmente útil para determinar a concentração de proteínas puras e com conteúdo de aromáticos conhecido.

Método do biureto Os iões Cu2+, em solução alcalina, complexam-se com os átomos de azoto das ligações peptídicas nas proteínas dando origem a um complexo de cor púrpura. O Cu 2+ é mantido em solução alcalina sob a forma de complexo de tartarato (fig.1).

Figura 1 – Complexo de Cu2+ com tartarato em solução alcalina.

A presença de altas concentrações de iões amónio, que complexam com os iões Cu 2+, ou a presença de agentes redutores (incluindo açucares redutores), que reduzem o Cu 2+ a Cu+ (formando um precipitado cor de laranja) podem interferir no método. Para remover substâncias que interferem no método, pode precipitar-se a proteína com ácido tricloroacético (TCA) e no caso de esta se encontrar ligada a cromóforos orgânicos pode fazer-se uma extração com etanol. A proteína precipitada pode ser solubilizada com uma solução de desoxicolato em NaOH.

Método de Lowry

Este é sem dúvida o método mais referenciado na literatura. É um método é muito mais sensível do que o método do biureto, o que faz com que seja preferido relativamente ao método do biureto, apesar de apresentar maior variabilidade de proteína para proteína. Tal como o biureto, o método de Lowry baseia-se na complexação da proteína com Cu2+ em solução alcalina. O cobre parece catalisar a redução, pela tirosina e pelo triptofano, dos aniões 9

fosfomolibdato/fosfotungstato do reagente fenólico de Folin adicionado subsequentemente. Esta última reacção conduz à formação de um composto de cor azul que pode ser medido a 700-750 nm. Muitos compostos interferem com o método nomeadamente, agentes redutores, tiois, fenois e alguns tampões (trietanolamina, Hepes, etc.) conduzindo a intensas colorações azuis na amostra que serve de branco. Outros compostos também interferem aumentando o branco, mas diminuindo a intensidade de cor das amostras (Tris, EDTA, açucares, glicerol). Alguns detergentes neutros e bases alifáticas podem causar a precipitação do reagente. Interferências devidas à precipitação de substâncias contaminantes ou da proteína podem ser obviadas da mesma forma que foi referida para o método do biureto.

Método de Bradford

Este ensaio baseia-se na alteração de cor que ocorre quando o Coomassie Brilliant Blue G250 (Fig. 2) em solução ácida, se liga à proteína.

Figura 2 – Forma não protonada do Coomassie Blue G250.

A forma protonada do Coomassie Blue tem uma cor laranja pálido. O corante liga-se fortemente às proteínas, através de interacções hidrofóbicas e interacções com grupos da proteína carregados positivamente. Nestas condições a protonação é suprimida e observa-se a cor azul . Este método é bastante rápido e simples não sofrendo interferências de tampões, sais, agentes redutores, etc. No entanto bases fortes causam falsos positivos e os detergentes aniónicos (ex. dodecil sulfato de sódio – SDS, desoxicolato) também interferem. As proteínas insolúveis podem ser solubilizadas com um detergente não iónico como o Triton X-100. A amostra não se deve 10

encontrar num tampão muito forte pois isso impede a protonação do corante aparecendo a cor azul na ausência da proteína.

Parte experimental - Materiais e métodos
1. Método do biureto Reagentes: 1) Reagente de cor (já preparado):
(Dissolver 1,5 g de Cu SO4.5H2O e 6g de tartarato de Na.4H2O em 500 ml de água destilada. A esta solução adicionar 300 ml de solução de NaOH (10%), seguida de 200 ml de água destilada. A solução é estável à temperatura ambiente durante meses. A decomposição do reagente é indicada pela presença de cor laranja devido ao precipitado de iões Cu+. Se necessário pode adicionar-se iodeto de potássio como preservativo da solução (1g/L)).

2) Solução stock de proteína 70 mg/ml (já preparada).

Método 1. A partir de uma solução stock de proteína (BSA) 70 mg/ml, prepare várias diluições dessa proteína (em microtubos), de acordo com a tabela seguinte:

Conc.final (mg/ml) Vol. Solução stock 70 mg/ml (L) Vol. H2O até 1 ml (L)

70

50

30

25

20

15

10

0

1000

714

428

357

286

214

143

0

0

286

572

643

714

786

857

1000

2. Pipete 0.2 ml de cada uma das soluções anteriores para 2 tubos de ensaio (altos). Marque os tubos. 11

3. Adicione 2.3 ml de reagente de cor ( fornecido aos alunos já pronto). 4. Aqueça 5 min a 80ºC (ou deixe à temperatura ambiente 2h), arrefeça rapidamente e deixe à temperatura ambiente 10 min. 5. Ler a absorvância a 540 nm.

Nota: 1 mg de proteína deve dar 0.1 de absorvância. A cor é estável durante vários dias nas soluções se estas forem conservadas no escuro.

2. Absorção no ultra-violeta Reagentes: 1) Soluções stock de proteínas 1,41 mg/ml.

Método: 1. Prepare 9 microtubos com 0.2 ml de H2O.

2. Acerte o zero de absorvância a 280 nm, com água, no espectrofotómetro. 3. Leia a absorvância da solução stock ( use ~1 mL). Soluções stock (SI (gamaglobulina) e SII (albumina)) 4. Retire 800 uL da solução que usou para ler e adicione a um dos microtubos com 200 uL de H2O . Agite e leia a OD . 5. Repita o passo anterior para as 8 diluições seguintes. (Não esqueça de medir a OD antes depassar à diluição seguinte. 6. Meça a OD de cada solução antes de fazer a diluição seguinte:

Conc.final (mg/ml) Vol. Solução stock 1,4 mg/ml (L) Vol. H2O até 1 ml (L)

1.4

1.12

0.90

0.71

0.57

0.45

0.36

.19

1000

800

800

800

800

800

800

800

0

200

200

200

200

200

200

200

12

7. Fazer as leituras de absorvância para as diluições de SI e para as diluições de SII. Medir a absorvância das amostras usando água como branco. ( 1 mg/ml proteína dá A280 1 )

3. Método de Bradford – ensaio em microplaca Reagentes: Reagente de cor comercial (Bio-Rad Protein assay).
(Alternativamente pode fazer-se: a) Dissolver 100 mg de Serva Blue G em 50 ml de etanol. Diluir a solução a 500 ml com H 2O. A concentração do corante numa solução stock fresca deve ser ajustada com 10% de etanol (v/v) para dar A 550  1.18 na mistura a+b. Isto assegura a consistência dos diferentes stocks de corante. b) ácido fosfórico 17% (ácido comercial diluído 1/5). As soluções a e b são misturadas em partes iguais no dia da utilização. As soluções a e b são estáveis durante meses à temperatura ambiente.)

Método 1. A partir de uma solução stock de albumina e de uma solução stock de gamaglobulina com concentração aproximada de 1,4 mg/ml (cada) preparar uma série de diluições (em microtubos) para cada proteína de acordo com a tabela seguinte:

Conc.final (µg/ml) Vol. Solução stock 1.4 mg/ml (L) Vol. H2O até 0.5 ml (L)

1400

1000

750

500

250

200

150

100

50

0

100

72

54

36

18

14

11

7

4

0

0

28

46

64

82

86

89

93

96

100

2. Usar o reagente de cor (Bio-Rad) 1:4 em H2O. 3. Adicionar 1 mL de reagente Bio-Rad Protein Assay diluído 1:4 a cada uma das 20 cuvetes (por proteína). 4. Pipetar 20uL de cada diluição para cada uma das cuvetes (duplicados). 5. Misturar e ler a absorvância a 595 nm (A595). A cor é estável durante cerca de 30 min, após os quais o complexo proteína-corante começa a precipitar 13

4. Método de Lowry

Reagentes: 1) Reagente de Cobre Alcalino (já preparado)
a) 1% CuSO4.5H2O b) 1% NaK tartarato.4H2O (As soluções a) e b) são estáveis à temperatura ambiente durante meses.) c) 2% Na2CO3 em 0.1 M NaOH. No dia da utilização misturam-se as soluções a) e b) em partes iguais e depois dilui-se com 98 volumes de c), para formar o solvente – Reagente de Cobre Alcalino.

2) Reagente de Folin-Ciocalteau (já preparado)
d) reagente comercial de Folin-Ciocalteau (tungstato de sódio, molibdato de sódio, ácido fosfórico, ácido cloridrico). (A solução d) é estável a 4ºC durante meses.) Diluir d) em partes iguais com água no dia de utilização para formar o reagente de cor.(Reagente de Folin-Ciocalteau)

Método

1.

A partir de uma solução stock de proteína de concentração 500g/ml preparar várias diluições (em tubos de ensaio curtos) de acordo com a tabela seguinte:

Conc.final (g/ml) Vol. Solução stock 500 g/ml (L) Vol. H2O até 2.5 ml (L)

500

200

100

50

25

10

5

2.5

1

0

2500

1000

500

250

125

50

25

12.5

5

0

0

1500

2000 2250 2375 2450 2475 2487 2495 2500

1.

Pipetar 1 ml de cada uma das soluções anteriores para tubos de ensaio (curtos).

2. Adicionar 3ml de Reagente de cobre alcalino. 3. Deixar repousar 10 min. 4. Adicionar 0.3 ml de Reagente de Folin-Ciocalteau e misturar imediatamente. 5. Deixar repousar à temperatura ambiente 1h, protegido da luz, e ler a absorvância a 750 nm (ou alternativamente a 550 nm)

14

Nota: A cor é estável durante várias horas. O pico de absorção é largo e a linearidade pode ser alargada se as leituras forem efectuadas a 550 nm.

BIBLIOGRAFIA: - D. A. Harris & C. L. Bashford: « Spectrophotometry & spectrofluorimetry – a pratical approach» IRL Press, 1987. (Capítulo 3- Spectrophotometric assays) - David Freifelder: «Physical Biochemistry», W. H. Freeman & Company, New York, 199 .

Trabalho Prático nº3

Isolamento de transtirretina recombinante produzida em E. coli Separação de proteínas por cromatografia
Introdução Produção de proteínas recombinantes em microorganismos
A necessidade de obter grandes quantidades de proteína para diferentes fins levou ao desenvolvimento de sistemas de produção de proteínas in vivo. As proteínas produzidas em sistemas heterólogos podem ser utilizadas para fins terapêuticos e farmacológicos como é o caso da hormona de crescimento, da insulina ou da vitamina da Hepatite B ou com objectivos industriais, por exemplo enzimas usadas na produção de detergentes ou na área alimentar para a produção de açucar e de queijo. A escolha de um determinado sistema de produção depende principalmente das características da proteína e do fim a que se destina. A bactéria E. coli é o sistema de produção in vivo mais comum embora as leveduras, em particular Saccharomyces

cerevisiae, Pichia pastoris e Kluyveromyces lactis, sejam cada vez mais utilizadas.
A expressão em E. coli é o sistema apropriado sempre que é possível obter a proteína na forma solúvel, em grande quantidade e com a estrutura correcta e consequentemente proteína funcional. Quando as proteínas requerem modificações pós-tradução tais como glicosilação e fosforilação é necessário recorrer a sistemas de expressão eucariotas.

15

Em qualquer sistema a estratégia básica passa pela clonagem do gene correspondente num vector de expressão e a transformação das bactérias com esse vector. Quando se pretende produção de uma grande quantidade de proteína pode utilizar-se um fermentador para crescer o microorganismo (bactéria ou levedura). O vector de expressão é em geral um plasmídio no qual deve ser clonado o cDNA do gene eucariota que se pretende expressar. Os vectores de expressão para além da origem de replicação e de marcas de selecção (por exemplo resistência a antibióticos) possuem também promotores reguláveis que quando induzidos possibilitam a produção de uma grande quantidade de mRNA do gene clonado. Um dos sistemas mais comuns envolve o promotor da T7 RNA polimerase. O gene específico é clonado sob o controle deste promotor. O gene é transcrio e depois traduzido por indução da expressão da T7 RNA

polimerase. O gene da polimerase é por sua vez controlado pelo promotor lac que é indutível pelo IPTG (isopropiltiogalactosido). Se por um lado se deseja uma expressão elevada da proteína alvo, por outro a sobre-expressão de proteína no citoplasma pode conduzir à formação de agregados insolúveis de proteína designados por corpos de inclusão («inclusion bodies»). A proteína em corpos de inclusão é fácil de purificar por ser maioritária nestas partículas e por estas serem isoladas por centrifugação. No entanto os processos de desnaturação para solubilizar a proteína podem não permitir uma renaturação perfeita da proteína não se obtendo uma proteína funcional. Para obviar estes problemas podem usar-se vectores de expressão que inserem sinais de secreção da proteína para o meio ou para o espaço periplásmico. Após produção da proteína no citoplasma ou no espaço periplásmico, torna-se necessário separar a proteína de interesse das proteínas bacterianas. Este processo de isolamento passa na maior parte dos casos por uma cromatografia.

Separação de proteínas por cromatografia A separação em cromatografia baseia-se na distribuição das substâncias a analisar por duas fases: fase estacionária (meio cromatográfico ou adsorvente) e fase móvel (ou eluente). As moléculas com tendência a ficarem na fase estacionária movem-se através do sistema a uma velocidade menor do que as que têm maior afinidade para a fase móvel. A forma mais comum de cromatografia é a cromatografia em coluna. A fase estacionária é empacotada numa coluna através da qual a fase móvel ou eluente se desloca. A amostra a ser separada é aplicada na extremidade superior da coluna e os diferentes componentes da amostra migram a diferentes velocidades, sendo detectados e recolhidos na outra extremidade. Existem diferentes tipos de cromatografia que permitem a separação de proteínas de acordo com diferentes propriedades: 16

- forma e tamanho – filtração em gel; carga efectiva e distribuição de carga à superfície - troca iónica; hidrofobicidade – cromatografia de fase inversa; ligação de metais – cromatografia de iões metálicos imobilizados; grupos tiol expostos – cromatografia covalente; afinidades bioespecíficas de ligandos, inibidores, receptores, anticorpos -

cromatografia de afinidade. Em cada uma das técnicas referidas as proteínas são separadas predominantemente em função de uma característica, mas a separação não é completamente independente das outras.

Cromatografia de troca iónica

Na cromatografia de troca iónica a separação depende da ligação competitiva de diferentes iões (proteínas ou iões salinos) com a mesma carga a um meio cromatográfico de carga oposta, o trocador iónico. A interacção entre as proteínas e o trocador iónico depende de vários factores: carga efectiva, distribuição de carga à superfície da proteína, força iónica e natureza dos iões no solvente, pH e outros aditivos como por exemplo solventes orgânicos. Os trocadores iónicos consistem numa matriz substituida com grupos positivos e são trocadores de aniões ou com grupos negativos e são trocadores de catiões. Os grupos funcionais mais comuns são as aminas nos trocadores aniónicos e os ácidos carboxílicos nos trocadores catiónicos. As condições de pH condicionam a carga do trocador iónico e da proteína podendo ser utilizadas para influenciar o processo de troca iónica. As proteínas são moléculas anfotéricas contendo à sua superfície grupos carregados positiva e negativamente. A carga efectiva da proteína depende da sua composição em amino ácidos e do pH do meio. O pH ao qual o número de cargas positivas da proteína é igual ao de cargas negativas é designado ponto isoeléctrico (pI). A pH superior ao seu pI a proteína encontra-se carregada negativamente; a pH inferior ao seu pI a proteína encontra-se carregada positivamente. A força iónica do eluente é outro dos factores que condicionam a eluição das proteínas na cromatografia de troca iónica. A uma concentração relativamente baixa de iões competitivos, a ligação das proteínas ocorre através de múltiplas interacções de carga entre os vários grupos da proteína e um número correspondente de cargas no trocador iónico. A concentrações mais elevadas dos iões competidores as proteínas começam a ser deslocadas do trocador iónico por 17

ordem da sua força de ligação, sendo as mais fracamente ligadas as primeiras a eluir. A escolha da fase estacionária e da fase móvel a utilizar depende das proteínas a eluir, isto é, dos seus pI, solubilidade e estabilidade. A eluição pode ser isocrática, descontínua ou de gradiente sendo esta última a que permite melhores separações entre os vários componentes de uma amostra devido ao poder crescente de eluição do meio.

TRABALHO PRÁTICO Produção de transtirretina recombinante em E. coli e seu isolamento por cromatografia de troca iónica
A transtirretina (TTR) é uma proteína plasmática que transporta hormonas da tiroide (em particular, tiroxina) e também vitamina A (retinol) através da formação de um complexo com a proteína de ligação do retinol – RBP (retinol binding protein). A proteína tem massa molecular de cerca de 55 000 Da sendo constituída por quatro subunidades idênticas de cerca de 14 000 Da cada. O seu ponto isoeléctrico é aproximadamente 5.5. A TTR tem sido associada a diferentes formas de amiloidose hereditária em particular à polineuropatia amiloidótica familiar (PAF) vulgarmente conhecida por «doença dos pézinhos». Assim, dada a sua importância biológica e a associação à doença, tornou-se de extrema importância o conhecimento da estrutura e função da proteína. Para estes estudos é necessária uma quantidade relativamente grande de proteína que no plasma humano existe apenas numa concentração de 20-30 mg por 100 mL. Por este motivo estabeleceu-se um sistema de produção de TTR em E. coli usando o vector de expressão pET3a (INVITROGEN). O cDNA da TTR foi clonado neste vector sendo a sua produção induzida pela adição de IPTG à cultura de E. coli. A proteína produzida mantem-se no citoplasma na sua forma solúvel e é recuperada após lise das bactérias. A TTR é em seguida isolada por cromatografia de troca iónica em DEAE-celulose (fig. 1) que entre pH 2 e 9 se encontra carregada positivamente comportando-se como trocadora de aniões. Nesta cromatografia vamos usar um sistema de tampão glicina-acetato sendo a proteína eluida por aumento da força iónica do eluente.

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CH2 – CH3 - O - CH2 - CH2 – N
+

– H

Cl-

CH2 – CH3

Figura 1 – Estrutura do grupo funcional da DEAE – celulose – dietilaminoetil - celulose

Parte experimental
I. Produção de TTR recombinante em E. coli Material   Stock de bactérias BL21pLysS transformadas com pTTR-ET3a. Meio LB (Luria-Bertani): 10 g bactotriptona, 5 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl por litro. Autoclavar.     Solução de Glucose a 20% (autoclavar) Solução de IPTG 1M (esterilizar por filtração). Ampicilina – 50 mg/ml (esterilizar por filtração). Solução de lise – 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 2 mM PMSF, 0.1% Triton X-100 pH 7.5.

Método 1. Inocular 5 mL de meio LB com ampicilina com uma colónia de E. coli BL21pLysS transformada com pTTR – ET3a. 2. Crescer a cultura durante a noite a 37ºC num incubador com agitação. 3. Inocular 250 mL de meio LB com ampicilina + gucose com os 5 mL de pré-cultura crescida durante a noite e crescer a cultura até esta atingir OD600=0.6-0.8. 4. Induzir a produção de TTR por adição de 100 L de IPTG 1M. Guardar uma alíquota de 500 L para análise posterior. 5. Crescer a cultura durante mais cerca de 3 – 4 h a 37ºC. Ao fim deste tempo retirar uma aliquota de 500 L 6. Recolher as células por centrifugação a 4000 rpm durante 10 min. 19

7. Desprezar o meio de cultura. 8. Ressuspender o pellet em 25 mL de solução de lise. 9. Congelar o lisado a –70ºC e descongelar. 10. Repetir o passo anterior. 11. Sonicar o lisado 10 s. 12. Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min. 13. Guardar o sobrenadante (retirar uma aliquota de 500 L). 14. Dialisar o sobrenadante em tampão de glicina-acetato 1X durante a noite.

II. Purificação da transtirretina recombinante por cromatografia de troca iónica 1. Ler a OD280nm do sobrenadante dializado. 2. Guardar uma aliquota de 200 L. 3. Retirar o excesso de tampão da DEAE-celulose e equilibrar o sobrenadante contendo a transtirretina, após diálise, com a resina durante cerca de uma hora, em agitação. 4. Aplicar a resina a uma coluna de cromatografia. Deixar empacotar a coluna. Recolher uma alíquota de 200 L do que não ligou à resina. Lavar extensamente com tampão inicial até a OD280 nm ser bastante baixa (0.0..) 5. Eluir a transtirretina com tampão final recolhendo fracções de ~2 mL. Ler a OD 280 nm e registar. Guardar uma alíquota de 200 L da fracção com OD mais elevada. 6. Juntar as frações de mais alta densidade óptica e dialisar contra H 2O. 7. As aliquotas recolhidas nas diferentes fases do trabalho serão analisadas no trabalho seguinte.

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Trabalho Prático nº4 Separação e caracterização de proteínas por electroforese e

Immunoblotting
Objectivos
O objectivo geral do trabalho é a analise de proteínas por electroforese em sistema nativo (PAGE) e sistema desnaturante (SDS-PAGE) e identificação por Immunoblotting. Em particular, pretende-se estudar o processo de produção e isolamento de transtirretina recombinante realizado na aula anterior, por análise das fracções recolhidas em diferentes fases do processo.

Introdução

Electroforese A maioria das macromoléculas biológicas possui carga eléctrica, sofrendo por isso a influência de campos eléctricos. Existem essencialmente duas respostas à aplicação de um campo eléctrico: a orientação das partículas, no caso da existência apenas de uma distribuição assimétrica de carga ou a migração, no caso de essas partículas possuírem uma carga eléctrica efectiva. Designa-se por electroforese a migração de partículas electricamente carregadas, num determinado meio, sob a influência de um campo eléctrico. Os meios de suporte para electroforese podem ser variados, como por exemplo, acetato de celulose, gel de agarose e gel de poliacrilamida. Na electroforese as macromoléculas são submetidas à acção da força eléctrica, na origem do seu movimento, mas também de uma força de viscosidade, em oposição a esse movimento, sendo atingida uma velocidade de migração constante quando a força eléctrica é equilibrada pela viscosidade. Por isso a mobilidade electroforética das macromoléculas (entendida como sendo a velocidade por unidade de campo eléctrico) depende também da sua forma e massa – electroforese em sistema nativo – PAGE (polyacrilamide gel electrophoresis). Em condições experimentais que eliminem a influencia de diferenças na forma e na carga eléctrica entre as partículas, será possível obter informação acerca da sua massa molecular. Este é o fundamento de uma técnica corrente de separação (e caracterização) de proteínas pelo tamanho, a electroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS) – SDS-PAGE. O SDS é um detergente aniónico que desnatura as proteínas formando com elas, independentemente da sua forma inicial, um complexo cilindrico. Além disso, a maioria das 21

proteínas liga aproximadamente a mesma quantidade de detergente por unidade de massa, adquirindo assim uma carga negativa proporcional à sua massa. A eficiência deste processo é ainda aumentada pelo tratamento prévio da amostra de proteínas pelo calor na presença de SDS e também de -mercaptoetanol (um agente redutor). A amostra tratada deste modo é colocada no gel e submetida a um gradiente de potencial eléctrico. Em resposta, as proteínas movem-se através do gel com uma velocidade que depende essencialmente da sua massa. De um modo geral é preferível utilizar um gel descontínuo, constituído por duas partes: uma primeira de trama mais larga e onde se dá o empacotamento das proteínas «stacking gel», e uma segunda onde ocorre a resolução dos componentes da amostra «running gel». As bandas das proteínas são reveladas no fim da experiência com um corante. A sua massa molecular é determinada por comparação com a migração de proteínas padrão, verificando-se que existe uma relação linear entre o logaritmo da massa molecular e a distância percorrida.

Curva de titulação isoeléctrica

A determinação da curva de titulação isoeléctrica é uma técnica bidimensional. Numa primeira fase faz-se uma focagem isoelectrica do gel de poliacrilamida, sem amostra, para que se estabeleça um gradiente de pH determinado pela distribuição de anfólitos ( ácidos poliaminados de baixo pm com diferentes pI) no gel. Numa segunda fase, aplica-se a amostra numa linha perpendicular ao gradiente de pH estabelecido e faz-se uma electroforese. A

proteína vai migrar para um e outro lado da linha de aplicação da amostra de acordo com a sua carga em cada ponto. A curva de titulação vai cruzar a linha de aplicação da amostra no ponto correspondente ao pI da proteína.

«Immunoblotting»

O immunoblotting combina a resolução da electroforese com a especificidade da detecção imunoquímica. Basicamente, a técnica consiste na separação de proteínas, antigénios, por electroforese em gel de poliacrilamida, seguida da transferência electroforética das proteínas do gel para uma membrana de suporte, fazendo assim a réplica das proteínas separadas no gel. A localização do antigénio é determinada usando anticorpos específicos que são marcados com compostos fluorescentes, radioactivamente ou acoplados a uma enzima envolvida numa reação com produção de uma substância corada (Figura 2).

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Fig. 2 – Detecção de proteínas por immunoblotting. As proteínas separadas em SDS-PAGE são transferidas para uma membrana e detectadas pela utilização de um anticorpo específico marcado (de «Biochemistry», L. Stryer, 5th ed., 2004)

TRABALHO PRÁTICO:

A transtirretina é uma proteína tetramérica constituída por quatro subunidades idênticas de massa molecular aproximadamente 14 000 Da. O seu ponto isoeléctrico é ~ 5.5. Neste trabalho vamos analisar diferentes fracções recolhidas em diferentes fases do processo de isolamento da proteína recombinante para verificar a produção no sistema bacteriano usado e o processo de purificação. As mesmas amostras serão analisadas por electroforese em sistema nativo descontínuo (PAGE) e por electroforese em sistema desnaturante (SDS-PAGE). Os geis obtidos serão corados por Coomassie Blue. Realizaremos também transferência electroforéctica das proteínas de gel de SDS-PAGE para posterior identificação da proteína com um anticorpo específico (Immunoblotting).

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PARTE EXPERIMENTAL:

A – Electroforese em gel de poliacrilamida em sistema nativo (PAGE)

Material      Método 1 - Para um gel de 1.5 mm prepare: Solução de acrilamida stock Solução tampão de electroforese 5X: H2O TEMED APS 10% 5.4 mL 4 mL 9.6 mL 20 µL 1000 µL Acrilamida: 29,2% acrilamida, 0,8% bis-acrilamida Solução tampão de electroforese 5X : 1 M glicina, 0,65 M acetato de sódio, pH 8.6 Para 500 mL: 37,54 g glicina , 26,6 g acetato de sódio Ajustar o pH até 8,6 com NaOH. 10% Persulfato de amónio Solução de amostra: azul de bromofenol em 50% glicerol

2 – Preparação das amostras: Tampão de amostra H2O (μL) ( 50% glicerol + bromoph) (μL) 0 0 15 15 10 10 10 10

Amostra

Volume de amostra (μL) 30 30 15 15

1- Antes do IPTG 2- Depois do IPTG 3 - Lisado 4 - Pico

3 – Aplicar 30 de cada amostra nos poços do gel. 4 - A electroforese decorre a 15-20 mA em tampão de electroforese 1X. 5 - Corar o gel com azul de Coomassie e descorar com o descorante apropriado 6 - Corar o gel em solução corante com Coomassie blue durante cerca de 30 min a 1h e descorar o gel em solução descorante.

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B – Electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE)

Material          Solução de acrilamida: 29.2% acrilamida, 0.8% N,N’-bisacrilamida (a mesma do gel nativo). Tampão do gel resolvente: 1.5 M Tris/HCl, pH 8.8. Tampão do gel de empacotamento: 0.5 M Tris/HCl, pH 6.8. Tampão de amostra (4X): 0.25 M Tris/HCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glicerol, 20% ßmercaptoetanol. SDS 10%. Tampão de electroforese: 0.025M Tris/HCl, pH 8.3, 0.192 M glicina, 0.1% SDS. Persulfato de amónio 10%. TEMED Corante e descorante - os mesmos que se usaram para a electroforese anterior.

Método

1 - Preparar o molde para polimerizar o gel. 2 - Num matrás, preparar a solução para o gel resolvente: 5 ml de solução de acrilamida 2.5 ml de tampão do gel resolvente 100 μl de SDS 10% 2.5 ml de H2O 100 µl de persulfato de amónio 5 µl TEMED Aplicar a solução no molde com uma pipeta Pasteur até cerca de 1.5 cm do topo. Aplicar um pouco de água de modo a cobrir a solução inicial. Deixar o gel polimerizar.

3 - Preparar a solução para o gel de empacotamento:

1 mL de solução de acrilamida 1.250 mL de tampão do gel de empacotamento 50 µl de SDS 10% 2.5ml de H2O 100 µl de persulfato de amónio 10% 4 µl de TEMED Remover a água que cobre o gel resolvente, colocar o pente e aplicar o gel de empacotamento. Deixar polimerizar, lavar os poços com água.

4 - Preparar as amostras: 25

Amostra 1- Antes do IPTG 2- Depois do IPTG 3 – Lisado 4 – Pico

Volume de amostra (μL) 30 30 15 15

H2O (μL) 0 0 15 15

Tampão de amostra (SB 4X) (μL) 10 10 10 10

5 - Ferver as amostras 2 min. Centrifugar as amostras. 6 - Aplicar 30 μL de cada amostra nos poços. Aplicar, em paralelo, uma amostra com padrões de peso molecular. Iniciar a electroforese, aplicando uma corrente de 30 mA até as amostras atingirem o gel resolvente e de 40 mA até ao fim da electroforese. 7 – Cortar o gel a meio. Uma das partes do gel é retirada para immunoblotting e a outra para corar. 8 - Corar e descorar o gel. Registar a distância que cada proteína migrou e calcular o seu peso molecular a partir da curva de calibração construída a partir dos padrões de peso molecular.

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C - Immunoblotting

1 - Transferência electroforética de geis de poliacrilamida com SDS

Soluções Tampão de transferência (39 mM glicina; 48 mM Tris, 0.0375 SDS; 20% metanol) 1 L: 2.93 g glicina 5.81 g Tris 0.375 g SDS 200 ml metanol Método - Equilibrar o gel e a membrana de nitrocelulose em tampão de transferência durante cerca de 15 min. - Molhar 6 folhas de papel de filtro 3 MM com o mesmo tampão. - Preparar a cassete de transferência colocando as folhas de papel 3MM molhadas no cátodo e sobrepor a membrana de nitrocelulose por cima. Sobrepor o gel de poliacrilamida previamente equilibrado em tampãp de transferência e colocar mais 6 folhas de papel 3 MM por cima. (Nota: Ao colocar o gel em cima da membrana deve ter-se o cuidado de evitar que se formem bolhas entre o gel e a membrana). - A transferência deve ocorrer durante cerca de 1 hora a 0.8 mA/cm 2.

2 – Revelação com anticorpo

Soluções: - PBS (phosphate buffered saline), pH 7.3 - 5% de leite em pó em PBS - 0.1% Tween-20 em PBS - Solução de cloronaftol : 5 mg p-cloronaftol/ml metanol - Solução de revelação (para 6 ml): 5 ml PBS 1 ml solução de cloronaftol 2 µl H2O2 Nota: a solução de revelação é extemporânea. O cloronaftol é carcinogénico pelo que deve ter-se o máximo de cuidado ao manusear a solução de revelação.

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Método:

- Bloquear a membrana em solução de leite em pó a 5% durante 45 min a 37ºC. - Lavar a membrana com 1x com PBS. - Incubar a membrana com um anticorpo anti –transtirretina humana produzido em coelho (rabbit

anti-human TTR), diluído 1:1000 em PBS, 1h a 37ºC

- Lava-se a membrana com : - PBS, 10 min; - 0.1% TW -PBS 10 min, duas vezes; - PBS 10 min.

- Incubar a membrana com anticorpo produzido em carneiro contra imunoglobulinas de coelho acoplado à peroxidase (sheep anti-rabbit immunoglobulins peroxidase conjugate). Usar uma diluição de 1:5000 em PBS. Incubar 1 h a 37ºC. - Colocar a membrana em solução de revelação e agitar até a cor aparecer. - Parar a reacção com água.

Curva de titulação isoeléctrica

Material  Solução de acrilamida: 29.1% acrilamida, 0.9% bisacrilamida.  Persulfato de amónio 40%.  Anfólitos 3.5-10  Solução do ânodo: H3PO4 1 M.  Solução do cátodo: NaOH 1M.  Solução fixadora: 3.5% ácido sulfosalicílico, 11.5% ácido tricloroacético (TCA).  Corante: 0.115% Coomassie blue R-250.  Descorante: 10% ácido acético, 30% etanol.  Tina para focagem isoeléctrica.  Alimentador de corrente

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Método

1 - Preparar a cassete do gel com uma folha de Gel-Bond, à qual o gel vai ficar aderente.

Preparar a solução do gel: 6.8 ml de acrilamida 1.2 ml de anfólitos H2O até 20 ml 20 µl de persulfato de amónio 40% 3.4 µl de TEMED 2 - Depois do gel ter polimerizado faz-se uma pré-focagem a potência constante de 12 W durante 50 min. 3 - Cortam-se as porções do gel que contêm os electrodos e roda-se o gel 90º. Colocam-se novas tiras de electrodo e paralelamente a estas, a amostra no meio do gel. 4 - A electroforese decorre a voltagem constante de 600 V durante 45 min. 5 - Fixa-se o gel em solução fixadora 40 min. Lava-se em descorante 10 min. Cora-se o gel a 60ºC 30 min e descora-se em descorante.

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Trabalho Prático nº5 ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS - Imunoensaio enzimático (ELISA) e «immunoblotting» na detecção e quantificação de transtirretina

Introdução
Os ensaios imunoquímicos baseiam-se na interacção de um anticorpo com um antigénio. Um anticorpo é uma proteína sintetizada por um animal em resposta à presença de uma substância estranha, que pode ser uma proteína, polissacárido ou ácido nucleico, e que se designa por antigénio. Os animais têm uma gama de células produtoras de anticorpos, cada uma delas

produzindo um anticorpo com uma determinada especificidade. Um antigénio actua estimulando a proliferação de algumas dessas células produtoras de imunoglobulinas. Assim, os anticorpos que reconhecem uma proteína particular podem ser obtidos, por exemplo, injectando essa proteína num coelho duas vezes consecutivas com intervalos de 3 semanas. Algumas semanas mais tarde recolhe-se sangue do coelho imunizado e centrifuga-se. O soro obtido é chamado antisoro e em geral contem o anticorpo para o antigénio que induziu a sua síntese. O anticorpo, ou imunoglobulina, é então purificado. Estes anticorpos são chamados policlonais pois são produtos de muitas populações de células diferentes produtoras de anticorpos e diferem apenas na especificidade e afinidade para o antigénio. Os anticorpos reconhecem regiões relativamente pequenas de um antigénio designadas por epítopes. Os epítopes de um antigénio proteíco podem ser formados por uma sequência linear de resíduos de aminoácidos ou por sequências não contíguas que se encontram enroladas e próximas na estrutura tridimensional à superfície do antigénio. Isso permite que os anticorpos reconheçam proteínas relacionadas, com epítopes semelhantes, no entanto, isso não implica uma relação funcional entre essas proteínas. Esta é também a base molecular das reacções cruzadas (reacções com antigénios para os quais o anticorpo não foi produzido específicamente). A interacção de um anticorpo com um antigénio baseia-se em ligações não covalentes ocorrendo o complexo em equílibrio com o antigénio e o anticorpo livres. Estas interacções não covalentes incluem ligações de hidrogénio, forças de van der Waals, interacções hidrofóbicas e electrostácticas entre átomos das cadeias laterais dos aminoácidos e átomos das cadeia principal. Os anticorpos podem distinguir proteínas muito semelhantes podendo ser usados para detectar e 30

quantificar uma proteína ou outro antigénio. Pequenas alterações na estrutura do antigénio são suficientes para para afectar a força da interacção antigénio - anticorpo.

A - IMUNOENSAIO ENZIMÁTICO - ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) detecção e quantificação de transtirretina

O imunoensaio enzimático (ELISA) é um ensaio de ligação que tem como base a reacção antigénio-anticorpo e tem acoplada uma reacção enzimática como marcador. Os imunoensaios em fase sólida podem ser realizados de diferentes formas sendo designados como ELISA directo ou ELISA de sandwich (Fig.1). No ELISA directo o antigénio é imobilizado numa microplaca, suporte polimérico com capacidade para adsorver proteínas. Depois de remover o excesso de amostra adiciona-se o anticorpo específico para o antigénio que se pretende detectar, para que se forme o complexo antigénio-anticorpo. Depois de retirar o excesso de anticorpo, o que não se ligou específicamente, adiciona-se um anticorpo secundário capaz de se ligar ao anticorpo primário e que está acoplado a uma enzima, em geral a peroxidase. Depois de se retirar o excesso de anticorpo adiciona-se o substracto (incolor) para a enzima que após reacção deverá originar um produto corado que será quantifcado

espectrofotometricamente. A quantidade de produto será proporcional à quantidade de antigénio na solução teste. Alternativamente pode realizar-se o ELISA de sandwich em que o primeiro passo é a imobilização de um anticorpo (anticorpo de captura) para o antigénio que se pretende detectar. Em seguida adiciona-se a solução teste que deverá conter o antigénio. Depois de retirar o excesso adiciona-se um segundo anticorpo para esse antigénio, que tenha sido produzido num organismo diferente do anticorpo de captura. O passo seguinte é a adição de um anticorpo secundário acoplado a uma enzima A detecção é então feita de modo semelhante ao ELISA directo. Estes ensaios, extremamente sensíveis, são capazes de detectar menos de um nanograma de proteína.

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Fig.1 - ELISA método directo e de «sandwich».(de «Biochemistry», L. Stryer, 5th ed., 2004).

Detecção e quantificação de transtirretina por ELISA

A transtirretina é uma proteína que existe no plasma a uma concentração de cerca de 0.2- 0.3 mg/ml. O anticorpo anti-transtirretina (TTR) usado neste trabalho é um anticorpo comercial preparado a partir de um antisoro de coelhos imunizados com TTR humana pura. O soro foi deslipidado e a fracção imunoglobulinica especificidade deste anticorpo foi separada por cromatografia de troca iónica. A testada por diferentes técnicas incluindo

depois

imunoelectroforese. A concentração do anticorpo foi determinada por densidade óptica a 280nm. O segundo anticorpo é também um anticorpo policlonal produzido em carneiros imunizados com imunoglobulinas de coelho e que foi ligado covalentemente a uma peroxidase. Como substractos para esta enzima usamos o peróxido de hidrogénio sendo o cromogénio o ABTS (2,2’azino-di-(3-ethylbenzothialzoline sulphonate)). O produto da reacção, de cor verde, é quantificado por leitura de densidade óptica a 405 nm.

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Parte Experimental
Materiais e reagentes

         

Microplacas para imunoensaio Pipetas automáticas Solução de transtirretina humana Anticorpo anti-transtirretina produzido em coelho Anticorpo conjugado anti-imunoglobulina de coelho-peroxidase Tampão de adsorção à placa (coating): 15 mM Na2CO3 (1,59 g/L), 35 mM NaHCO3 (2,93 g/L), pH 9.5 Tampão de bloqueamento da placa: 5% de leite em pó em PBS PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.3. Tampão de lavagem: PBS, 0.05% Tween-20 Solução de substracto: 1 ml de tampão citrato-fosfato ( 56.5 mM ácido cítrico, 66.7 mM Na2HPO4), 0.5 ml de solução de ABTS (2,2’azino-di-(3-ethylbenzothialzoline sulphonate)) 2%, 10 L de H2O2 para um volume total de 10 mL

Método

1- Preparar as amostras com o antigénio para aplicar na microplaca. Preparar várias diluições de transtirretina em tampão de adsorção (coating)para estabelecer uma curva padrão. Aplicar 100 µl de cada diluição por poço. Num dos poços aplicar apenas 100 µl de coating (branco). Aplicar as amostras a analisar em tampão de coating. 2- Aplicar 100 µl por poço, tanto as amostras como as diferentes diluições devem ser aplicadas em duplicado. Incubar 1h a 37ºC ou durante a noite a 4ºC. 3- Retirar o excesso e lavar os poços 1 vez com PBS. 4- Bloquear os poços com 100 µl de solução de bloqueamento, 30 min a 37ºC. 5 - Retirar o excesso e lavar a placa com PBS, PBS-TW e PBS respectivamente.. 6 - Adicionar 100 µl do anticorpo anti-transtirretina (produzido em coelho), diluido 1: 5000 a cada poço e incubar 45-60 min a 37ºC. 9 - Retirar o excesso e lavar os poços. 10 - Adicionar 100 µl de anti- Ig coelho conjugado com peroxidase diluído 1:5000. 11 - Adicionar 100 µl/poço de solução de substracto incubar 10-15 min à temperatura ambiente. 12 - Parar a reacção com 50µl/poço de H2SO4 2M. 13- Ler a densidade óptica a 405 nm, em cada poço, num leitor de placas.

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Trabalho Prático nº6

Purificação da transtirretina recombinante por cromatografia de afinidade
Introdução

Cromatografia de afinidade
A cromatografia de afinidade baseia-se principalmente na actividade biológica das proteínas, mais precisamente em interacções específicas que estas possam estabelecer com outras moléculas. Estas interacções podem ser de natureza electrostática, hidrofóbica, forças de van der Waals e/ou ligações de hidrogénio. Um processo de purificação por afinidade requer a existência de um ligando bioespecífico que possa ser ligado covalentemente a uma matriz cromatográfica. As amostras são aplicadas em condições que favorecem a ligação específica ao ligando. As substâncias de interesse são consequentemente ligadas ao ligando enquanto as substâncias que não se ligam são lavadas da coluna. O ligando imobilizado deve manter a sua actividade específica para a molécula alvo e após lavagem do material não ligado a ligação entre o ligando e a molécula alvo deve poder ser revertida para que as moléculas ligadas possam ser eluídas na sua forma activa. Para a recuperação das moléculas de interesse, eluição da molécula alvo do meio de afinidade, é necessário reverter a interacção, quer especificamente usando um ligando competitivo quer não especificamente, por alteração do pH, força iónica ou polaridade. Em seguida apresentam-se algumas interacções biológicas típicas que podem ser usadas neste tipo de cromatografia:

Enzimas - análogos dos substratos, inibidores, cofactores Anticorpos - antigénios, vírus, células Lectinas - polissacáridos, glicoproteínas, receptores da superfície celular, células Ácidos nucleicos - sequencias de bases complementares, histonas, polimerases de áacidos nucleicos, proteínas de ligação aos ácidos nucleicos. Hormonas, Vitaminas - receptores, proteínas transportadoras Glutationa - glutationa -S-transferase ou proteínas de fusão com GST 34

Iões metálicos - proteínas de fusão com poly(His), proteínas nativas com resíduos de histidina, cisteína e/ou triptofano na sua superfície.

A cromatografia de afinidade pode também ser utilizada para remover um contaminante específico. A grande selectividade da cromatografia de afinidade torna possível que muitas separações sejam conseguidas num só passo de purificação. como por exemplo o isolamento de anticorpos monoclonais ou de proteínas de fusão. Acoplamento de um ligando através de grupos amina primários

A Sepharose NHS-activada permite o acoplamento covalente de ligandos que contêm grupos amino primários (uma das formas mais comuns de acoplamento). A matriz baseia-se num gel de agarose altamente cross-linked com braços de espaçamento (spacer-arms) de 10 átomos (ácido 6aminobenzoico) activada por N-hydroxisuccinimida. A adsorção não específica de proteínas a esta matriz é muito baixa devido à grande hidrofilicidade da base da matriz. A matriz é estável a pH alto permitindo o acoplamento específico e lavagens fortes do ligando não adsorvido. Os ligandos contendo grupos amina ligam-se rápida e facilmente por ataque nucleofílico da ligação ester para originar uma ligação amida muito estável permitindo a utilização de pHs muito altos, até 13, o que faz com que esta técnica seja muito utilizada para sistemas que exigem esta gama de pH (fig. 1).

Fig. 1 – Acoplamento de um ligando a Sepharose NHS-activada

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A Sepharose CNBr activada tem características semelhantes à Sepharose NHS-activada. O CNBr reage com os grupos hidroxilo da Sepharose para formar esteres de cianato (fig. 2).

Fig. 2 – Activação pelo CNBr e acoplamento à matriz activada.

Proteínas, péptidos e aminoácidos podem ser acoplados à Sepharose CNBr-activada em condições moderadas através dos grupos amino primários ou de grupos nucleofílicos semelhantes. Os grupos activados reagem com grupos amino primários no ligando para formar ligações de isoureia.. A reação de acoplamento é espontânea e não requer condições especiais em termos químicos ou de equipamento. A ligação à matriz através de vários pontos assegura que o ligando não vai hidrolizar facilmente da matriz.

Trabalho prático
Neste trabalho prático pretende-se preparar uma coluna para cromatografia de afinidade que permita purificar a transtirretina produzida em bactérias. Para isso vai-se acoplar um anticorpo produzido em coelho contra a transtirretina humana a uma coluna de Sepharose NHS-activada (HiTrap NHS-activated affinity column – Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fornecedor. Em seguida vai-se aplicar uma solução de TTR produzida em E. coli e isolada por cromatografia de troca iónica em DEAE-celulose. Lava-se a coluna com tampão fosfato a pH 7.4 (PBS - phosphate buffer saline). A TTR ligada à coluna será depois eluído por diminuição do pH (tampão glicina pH 2.7). A eluição deverá ser monitorizada por leitura da densidade óptica das fracções. A eficiência do método deve depois ser confirmada por análise das fracções por electroforese em SDS-PAGE.

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Procedimento 1. A coluna HiTrap fornecida já se encontra acoplada com um anticorpo anti –TTR produzido em coelho (rabbit anti-human transthyretin immunoglobulins - Dako). 2. Equilibre a coluna com PBS. 3. Aplique 1 mL da solução de TTR produzida em bactéria e isolada por cromatografia de troca iónica (DEAE-celulose) à coluna de afinidade com uma seringa, lentamente tentando não ultrapassar um fluxo de 1 mL / min. 4. Lave a coluna com cerca de 5 – 10 mL de PBS, ou até que a densidade óptica a 280 nm seja muito baixa). 5. Elua a TTR com solução tampão de glicina-HCl 0.1 M pH 2.7. Para minimizar o tempo de exposição da proteína ao pH ácido deve recolher as fracções da coluna de cerca de 1 mL para tubos contendo cerca de 100 L de tampão Tris 1 M pH 8.5. Elua a TTR com cerca de 4-5 mL de tampão glicina pH 2.7. Verifique a eluição por leitura da OD a 280 nm ou por fluorescência. 6. Equilibre a coluna novamente com PBS (cerca de 5 mL). Analise as fracções obtidas por electroforese de SDS-PAGE.

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