3.

3 Preparao de Solues Padro PG 31

As solues padro de agente antimicrobiano so preparadas em concentraes de, pelo menos, 1.000g/mL (exemplo: 1.280g/mL) ou dez vezes a concentrao mais alta a ser testada, das duas a maior. Existem alguns agentes antimicrobianos de solubilidade limitada, porm, que podem precisar de concentraes mais baixas. Em todos os casos, as informaes fornecidas pelo fabricante da droga devem ser consideradas na determinao da solubilidade.

Algumas drogas devem ser dissolvidas em solventes que no gua. Nesses casos: deve-se usar uma quantidade mnima de solvente para solubilizar o p antimicrobiano;

pode-se fazer a concentrao final da soluo padro com gua ou o diluente apropriado, conforme indicado na Tabela 4; e

no caso de solventes potencialmente txicos, deve-se consultar as folhas de dados de segurana do material (MSDS) disponibilizadas pelo fabricante (ver a Tabela 4).

5 Preparao do Inculo para Testes de Diluio

5.1 Padro de Turbidez para a Preparao do Inculo

Para padronizar a densidade do inculo para um teste de sensibilidade, deve-se usar um controle de turbidez de BaSO4, equivalente a uma soluo padro McFarland de 0,5 ou seu equivalente ptico (ex., suspenso de partculas de ltex). A soluo padro McFarland de 0,5 de BaSO4 pode ser preparada da seguinte maneira.

(1) Acrescenta-se uma alquota de 0,5mL de BaCl2 de 0.048 mol/L (1,175% (p)/v BaCl2 2H2O) a 99,5mL de H2SO4 de 0,18 mol/L (1% v/v), mexendo constantemente para manter a suspenso.

Nmero 2 NCCLS

(2) A densidade correta do controle de turbidez deve ser verificada usando um espectrofotmetro com fonte de luz de 1cm e cubetas apropriadas para determinar a absorbncia. A absorbncia em 625nm dever variar de 0,08 a 0,10 para a soluo padro McFarland de 0,5.

(3) A suspenso de sulfato de brio deve ser transferida, em alquotas de 4 a 6mL, para tubos com tampas de rosca do mesmo tamanho usado para cultivar e diluir o inculo bacteriano.

(4) Esses tubos devem ser selados hermeticamente e armazenados em local escuro, a temperatura ambiente.

(5) O controle de turbidez de sulfato de brio deve ser agitado vigorosamente num misturador mecnico tipo vrtex antes de cada uso, verificando-se se est uniformemente trbido. No caso de partculas maiores, o controle deve ser substitudo. As suspenses de partculas de ltex devem ser misturadas invertendoas suavemente, e no num misturado tipo vrtex.

(6) Os controles de sulfato de brio devem ser substitudos, ou suas densidades verificadas, todo ms.

5.2 Mtodo de Crescimento

(1) Seleciona-se, pelo menos, de trs a cinco colnias, bem isoladas, do mesmo tipo morfolgico de cultura em placa de gar. Toca-se o topo de cada colnia com uma ala, transferindo-se os microorganismos para um tubo contendo 4-5mL de um meio de cultura adequado, como caldo de soja trptica.

(2) Incuba-se a cultura em caldo, a 35 C, at alcanar ou exceder a turbidez de uma soluo padro McFarland de 0,5 (em geral, de duas a seis horas).

(3) Ajusta-se a turbidez da cultura em caldo em crescimento ativo com soluo salina estril ou caldo, de modo a obter uma turbidez ptica comparvel da soluo padro McFarland de 0,5. Isso resulta numa suspenso contendo aproximadamente de 1 a 2 x 108 UFC/mL de E. coli ATCC 25922. Para realizar essa operao corretamente, emprega-se um espectrmetro ou, quando executado a olho nu, luz suficiente para comparar o tubo de inculo e a soluo padro McFarland de 0,5 contra um carto de fundo branco e linhas contrastantes pretas.

5.3 Mtodo de Suspenso Direta das Colnias

(1) Como alternativa conveniente para o mtodo de crescimento, pode-se preparar o inculo fazendo uma suspenso direta, em caldo ou soluo salina, de colnias isoladas selecionadas numa placa de gar de 18-24 horas (deve-se usar um meio no seletivo, como gar sangue). A suspenso ajustada para que sua turbidez coincida com a da soluo padro McFarland de 0,5 conforme delineado na Seo 5.2.

(2) Recomenda-se este mtodo para testar os organismos fastidiosos, Haemophilus spp. e Neisseria gonorrhoeae, bem como os estreptococos (ver Seo 8), e para testar possvel resistncia dos estafilococos a

meticilina ou oxacilina.

6 Teste de Diluio em gar

A metodologia do teste de sensibilidade antimicrobiana por diluio em gar uma tcnica bem estabelecida.1,2 O agente antimicrobiano incorporado ao meio gar, sendo que cada placa contm uma concentrao diferente do agente. Os inculos podem ser aplicados rapida e simultaneamente s superfcies de gar usado um aparelho de replicao de inculo.3 A maioria dos aplicadores usada atualmente permite a transferncia de 32 a 36 inculos para cada placa.

(6) O meio apropriado para testes de diluio em gar de Neisseria gonorrhoeae a base gar GC com suplemento de crescimento definido.4

(7) As Sees 8 e 9, assim como a Tabela 7, contm informaes adicionais sobre testes de diluio ou testes especiais de triagem para alguns organismos fastidiosos ou problemticos.

6.1.2 Aplicadores de Inculo

A maioria dos aplicadores de inculo disponveis transferem de 32 a 36 inculos para cada placa.2 Os aplicadores com pontas de 3mm de dimetro aplicam aproximadamente 2L (faixa de 1 a 3L) na superfcie de gar. Os aplicadores com pontas menores, de 1mm, aplicam dez vezes menos, aproximadamente de 0,1 a 0,2L.5

6.2 Preparao da Diluio em Placas de gar

6.2.1 Procedimento

(1) Acrescentam-se diluies apropriadas de soluo antimicrobiana a gars derretidos que se permitiu chegar ao equilbrio em banho-maria a temperaturas de 45 a 50 C.

(2) O gar e a soluo antimicrobiana so misturados completamente e a mistura colocada em placas de Petri numa superfcie at se obter uma camada de gar de 3-4mm de profundidade.

(3) As placas devem ser produzidas o mais rapidamente possvel aps misturar, para evitar o resfriamento e solidificao parcial do gar no misturador. Deve-se evitar a formao de bolhas.

(4) O gar deve solidificar a temperatura ambiente e as placas devem ser usadas imediatamente, ou armazenadas em sacos de plstico a temperatura de 2-8 C, durante at cinco dias para trabalho de referncia, ou mais tempo para testes de rotina. Num estudo, placas de gar contendo cefaclor tiveram de ser preparadas dentro de um perodo de 48 horas devido degradao da droga, enquanto que o cefamandole permaneceu estvel por um perodo superior aos cinco dias recomendados.6 Outras drogas particularmente lbeis, alm do cefaclor, so ampicilina, meticilina, imipenem e cido clavulnico.

OBSERVAO: No se pode presumir que todos os agentes antimicrobianos mantero sua potncia nessas condies de armazenamento. O usurio dever, portanto, avaliar a estabilidade das placas a partir dos resultados obtidos com cepas de controle e desenvolver critrios relativos validade em condies de armazenamento. Algumas vezes, essa informao pode ser obtida das empresas farmacuticas.

(5) As placas armazenadas a temperaturas de 2 a 8 C devem ser mantidas a temperatura ambiente at chegar ao equilbrio antes de serem usadas. Certifique-se de que a superfcie de gar est seca antes de inocular as placas. Se necessrio, as placas podem ser colocadas num incubador ou cmara de fluxo laminar durante aproximadamente 30 minutos, semi-destampadas, para acelerar a secagem da superfcie

de gar.

3.3 Preparao de Solues Padro

As solues padro de agente antimicrobiano so preparadas em concentraes de, pelo menos, 1.000g/mL (exemplo: 1.280g/mL) ou dez vezes a concentrao mais alta a ser testada, das duas a maior. Existem alguns agentes antimicrobianos de solubilidade limitada, porm, que podem precisar de concentraes mais baixas. Em todos os casos, as informaes fornecidas pelo fabricante da droga devem ser consideradas na determinao da solubilidade.

Algumas drogas devem ser dissolvidas em solventes que no gua. Nesses casos:

 deve-se usar uma quantidade mnima de solvente para solubilizar o p antimicrobiano;

pode-se fazer a concentrao final da soluo padro com gua ou o diluente apropriado, conforme indicado na Tabela 4; e

no caso de solventes potencialmente txicos, deve-se consultar as folhas de dados de segurana do material (MSDS) disponibilizadas pelo fabricante (ver a Tabela 4).

Uma vez que a contaminao microbial extremamente rara, as solues no esterilizadas so, em geral, aceitveis. Se desejado, porm, pode-se esterilizar as solues por meio de membrana-filtro. Os filtros de papel, amianto, ou vidro sinterizado, que podem absorver quantidades apreciveis de certos agentes antimicrobianos, no devem ser usados. Sempre que se usar filtragem, importante documentar a ausncia de absoro por meio dos resultados de ensaios apropriados.

Pequenos volumes de solues padro estreis podem ser colocados em frascos estreis de vidro, polipropileno, ou polietileno, selados cuidadosamente e armazenados (de preferncia a temperatura de 60 C ou menos, mas nunca a temperaturas superiores a -20 C). Os frascos so retirados conforme necessrio e usados no mesmo dia. Qualquer droga no usada deve ser descartada no fim do dia. As solues padro da maioria dos agentes antimicrobianos podem ser armazenadas a -60 C, ou menos, durante seis meses, ou mais, sem perda significativa de atividade. Em todo caso, qualquer orientao fornecida pelo fabricante da droga deve ser considerada como parte destas recomendaes gerais. Qualquer deteriorao significativa do agente antifngico poder se refletir nos resultados dos testes de sensibilidade usando cepas de controle de qualidade.

3.4 Nmero de Concentraes Testadas