Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Microscopia Varredura
Microscopia Varredura
Um pouco de histria
Amostras biolgicas e o ME
Clulas:
Frgeis Hidratadas Muito espessas para o feixe de eltrons Ambiente no interior do ME: vcuo e calor
No pode haver gua na coluna do microscpio As clulas tm de ser resistentes ao feixe As clulas precisam apresentar contraste As clulas tm de ser cortadas em fatias finas
5
FIXAO
Preservao da integridade morfolgica x molecular
Fixao de amostras
Fixadores qumicos
Contrastao negativa
Fixadores qumicos
Formaldedo
Instvel, preparado a partir de paraformaldedo. No forma ligaes cruzadas. Degrada rapidamente em metanol Preserva antigenicidade da amostra Penetrao rpida
10
Fixadores qumicos
Famous first electron micrograph of an intact cell was published in The Journal of Experimental Medicine in March 1945, in "A Study of Tissue Culture Cells by Electron Microscopy," by Keith R. Porter, Albert Claude, and Ernest F. Fullam. The cell is a cultured fibroblast originating from a chick embryo, which was grown by Porter on polyvinyl film, then peeled off and transferred to a wire specimen grid. The cell was fixed with osmium tetroxide, washed and then dried in order to prevent evaporation in the electron microscopeUs vacuum chamber. Magnified 1600 times
11
Fixadores qumicos
12
13
14
Solues tampo
15
Que fixador usar? Fixar por imerso ou por perfuso? Qual a concentrao de Glutaraldedo, formaldedo, tetrxido de smio? Recomenda-se adicionar o ferrocianeto de potssio na psfixao? Sacarose, NaCl, cido tnico. Qual seu papel na fixao? Quanto tempo se deve deixar a amostra no fixador? Quanto tempo se deve lavar para retirar o fixador? A que temperatura deve ser a fixao? Que tamanho deve ter a amostra? Como selecionar o tampo?
16
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
17
18
19
Palavra chave:
DIFUSO
20
21
Ps-Fixao
22
DESIDRATAO
23
Desidratao
Infiltrao em resina
Em seguida, o fluido de transio ser substitudo por uma resina lquida. Resina no estado lquido Este processo feito gradualmente ao longo de 24 horas.
25
Tipos de resina
EPOXI
METACRILATOS
Hidroflicas Polmeros de trama mais aberta Polimerizao a baixa temperatura sob U.V.
26
Quando as amostras estiverem completamente infiltradas na resina elas sero distribudas em moldes e levadas estufa...
27
Na estufa a resina se solidificar. Os blocos contendo as amostras podem ser retirados e desenformados.
48 horas 60oC
28
Nmero de identificao
amostra
29
Ultramicrotomia
As amostras precisam ser cortadas em sees ultrafinas para que o feixe de eltrons possa atravess-las. Isto feito num ultramicrtomo 30
brao bloco
O bloco preso no brao do instrumento. A cada oscilao do brao, h um pequeno avano. Ao passar pelo gume de diamante da faca, uma fina fatia flutua sobre o espelho dgua
31
32
33
36
37
1965
38
De acordo com os fixadores e solues utilizados possvel identificar seletivamente espcies moleculares ou protenas, havendo metodologias especficas para a localizao ou realce de vrios componentes celulares.
39
Congelamento instantneo do momento celular Evita: sofrimento, difuso de solutos, deformao osmtica, alterao bioqumica Problemas: velocidade de fixao em funo da espessura da amostra
40
Mtodos de congelamento
Criofratura
41
42
43
Mtodos de congelamento
Plunge Freezing
44
Mtodos de congelamento
45
46
Crio-eletronmicroscopia
47
48
49