Quim. Nova, Vol. 28, No.

3, 511-518, 2005 LIPOSSOMAS: PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS E FARMACOLGICAS, APLICAES NA QUIMIOTERAPIA BASE DE ANTIMNIO Frdric Frzard* e Dante A. Schettini Departamento de Fisiologia e Biofsica, Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antnio Carlos, 6627, 31270-901 Belo Horizonte - MG Olguita G. F. Rocha Laboratrio de Anlise de Traces Metlicos, Fundao Centro Tecnolgico de Minas Gerais, Belo Horizonte - MG Cynthia Demicheli Departamento de Qumica, Instituto de Cincias Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antnio Carlos, 6627, 31270-901 Belo Horizonte - MG Recebido em 24/5/04; aceito em 14/9/04; publicado na web em 17/2/05

LIPOSOMES: PHYSICOCHEMICAL AND PHARMACOLOGICAL PROPERTIES, APPLICATIONS IN ANTIMONY-BASED CHEMOTHERAPY. The use of organoantimonial complexes in the therapeutic of leishmaniasis and schistosomiasis has been limited mainly by the need for daily parenteral administration, their adverse side-effects and the appearance of drug resistance. Liposome encapsulation has been so far the most effective means to improve the efficacy of pentavalent antimonials against visceral leishmaniasis. Pharmacologically- and pharmaceutically-acceptable liposomal compositions are still being investigated through manipulation of preparation method, lipid composition and vesicle size. Recently, the encapsulation of a trivalent antimonial within stealth liposomes was found to reduce its acute toxicity and effectively deliver this compound to the parasite in experimental schistosomiasis. Keywords: liposomes; antimony; chemotherapy.

INTRODUO No incio do sculo passado, Gaspar Vianna, pesquisador pioneiro em doena de Chagas e leishmaniose, relatou a eficcia do complexo de antimnio trivalente (Sb(III)), trtaro emtico, no tratamento da leishmaniose muco-cutnea1. Da mesma forma, o trtaro emtico foi o primeiro medicamento empregado com xito no tratamento da esquistossomose2,3. Entretanto, o uso clnico deste composto foi interrompido, por causa de seus severos efeitos colaterais e da descoberta de novos frmacos menos txicos. A partir da dcada de 1940, complexos de antimnio pentavalente (Sb(V)) comearam a ser utilizados na teraputica das leishmanioses4. Os principais antimoniais atualmente em uso so complexos de Sb(V) com o N-metil-glucamina (antimoniato de meglumina) e com o gluconato de sdio (estibogluconato de sdio). At hoje, nem a estrutura desses compostos, nem seu mecanismo de ao foram completamente elucidados. Foi sugerido que o Sb(V) seria uma pr-droga, sendo reduzido no organismo hospedeiro a Sb(III) que seria a forma ativa e txica5. Recentemente, foi mostrado que os tiis podem estar envolvidos nesse processo de reduo6. Embora os antimoniais pentavalentes continuem sendo os medicamentos de primeira escolha no tratamento de todas as formas de leishmanioses, o seu uso clnico apresenta vrias limitaes. Esses compostos devem ser administrados por via parenteral (injeo intravenosa ou intramuscular), diariamente, num perodo de 20-40 dias. Nesse contexto, efeitos colaterais so freqentes4. O aparecimento de resistncia representa um outro problema srio no tratamento das leishmanioses4 e um risco potencial na teraputica da esquistossomose7. Em face dessas limitaes, a Organizao Mundial da Sade recomenda, com

*e-mail: frezard@mono.icb.ufmg.br

incentivo inclusive a outras entidades afins como a TDR (Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases), a pesquisa de novos medicamentos8. Essencialmente duas estratgias diferentes esto atualmente disponveis para o desenvolvimento de novos medicamentos. Uma estratgia envolve o planejamento/sntese de novas substncias ativas ou de frmacos j conhecidos com modificaes qumicas; a outra envolve a associao reversvel de frmacos j em uso a um sistema transportador, visando direcionar o frmaco para a clula alvo e evitar os locais indesejveis onde o frmaco exerce toxicidade. Esta ltima estratgia, alm de prolongar a validade de proteo por patente no uso do frmaco, oferece um ganho de tempo na fase de desenvolvimento do produto porque usa um frmaco j caracterizado do ponto de vista farmacolgico. Entre os sistemas transportadores de medicamentos atualmente disponveis, os lipossomas ocupam uma posio de destaque, tanto para terapia das leishmanioses quanto da esquistossomose. Como ilustrado na Figura 1, os lipossomas so vesculas esfricas, constitudas de uma ou vrias bicamadas concntricas de lipdeos, que isolam um ou vrios compartimentos aquosos internos do meio externo9. Uma grande vantagem dos lipossomas, com relao a outros sistemas transportadores de medicamento, a sua elevada biocompatibilidade, especialmente quando estes so formados de lipdeos pertencentes s famlias de lipdeos naturais9. Alm disso, so sistemas altamente versteis, cujo tamanho, lamelaridade, superfcie, composio lipdica, volume e composio do meio aquoso interno podem ser manipulados em funo dos requisitos farmacuticos e farmacolgicos. A capacidade dessas vesculas artificiais oferecerem barreiras para a difuso de solutos foi demonstrada pela primeira vez por Bangham, em 196510. O primeiro resultado espectacular na rea biomdica foi obtido, na dcada de 1970, com os antimoniais. Um aumento de at

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gicos alcanados, nos ltimos anos, na preparao dos antimoniais pentavalentes na forma encapsulada em lipossomas. Por outro lado, mostraremos que lipossomas furtivos contendo antimoniais trivalentes so promissores para o tratamento da esquistossomose mansoni. PROPRIEDADES BSICAS DOS LIPOSSOMAS Composio e propriedades fsico-qumicas Os lipossomas, classicamente, so preparados a partir do glicerofosfolipdeo, fosfatidilcolina. De uma forma mais geral, lipossomas podem ser obtidos a partir de qualquer substncia anfiflica formadora de fase lamelar9. A Tabela 1 apresenta exemplos de lipdeos utilizados na preparao de lipossomas. Tipicamente, o dimetro mdio dos lipossomas varia de 20 a 5000 nm. Quando formada de lipdeo de temperatura de transio de fase (Tt) menor que a temperatura do meio estudado, a membrana dos lipossomas se encontra na fase cristal-lquido ou fluida e os lipdeos e suas cadeias de hidrocarboneto tm grande liberdade de movimento (Figura 2). Exemplos desse comportamento podem ser vistos com lipossomas formados de dimiristoilfosfatidilcolina (Tt = 23 C) ou de dioleilfosfatidilcolina (Tt < 0 C). Quando formada de lipdeo de Tt maior que a temperatura do meio estudado, a membrana dos lipossomas se encontra na fase gel ou rgida e os lipdeos tm movimento restrito e suas cadeias de hidrocarboneto apresentam conformao toda-trans (Figura 2). Vesculas formadas de diestearoilfosfatidilcolina (Tt = 55 C) representam um exemplo deste tipo de lipossomas. Um componente lipdico importante, que entra muitas vezes na composio dos lipossomas, o colesterol. Este aumenta a rigidez das membranas no estado cristallquido e reduz a rigidez e os defeitos estruturais das membranas no estado gel (Figura 2). Lipdeos apresentando carga efetiva negativa ou positiva podem tambm ser includos na composio da membrana o que pode influenciar a taxa de incorporao de substncias, impedir a agregao/fuso das vesculas lipdicas e modular o seu destino no organismo.

Figura 1. Caractersticas estruturais dos lipossomas

700 vezes na atividade leishmanicida desses compostos foi relatado aps administrao na forma encapsulada em lipossomas11. Apesar da necessidade de aprimorar a quimioterapia antimonial atual e dos resultados extremamente promissores obtidos com os lipossomas em modelos experimentais de leishmaniose visceral, at hoje, nenhuma composio farmacutica associando lipossomas e antimoniais chegou a ser comercializada. Este fato pode ser atribudo, pelo menos em parte, s dificuldades tecnolgicas inerentes obteno de formulao estvel de compostos hidrossolveis encapsulado em lipossomas. Nesse artigo, apresentaremos propriedades bsicas dos lipossomas, de interesse para o desenvolvimento de frmaco na forma encapsulada em lipossomas. Mostraremos os aspectos farmacolgicos mais relevantes no uso dos lipossomas convencionais para a teraputica das leishmanioses. Apresentaremos os progressos tecnol-

Tabela 1. Exemplos de lipdeos formadores de bicamada, utilizados na preparao de fmacos na forma encapsulada em lipossomas Famlia de lipdeos Frmula estrutural Fosfatidilcolina CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-C(O)(oleil) CH3-(CH2)12-C(O)(miristoil) CH3-(CH2)14-C(O)(palmitoil) CH3-(CH2)16-C(O)(estearoil) Fosfatidilglicerol CH3-(CH2)12-C(O)(miristoil) CH3-(CH2)14-C(O)(palmitoil) Alquil polioxietileno ter (exemplo de surfactante no inico) CH3-(CH2)15(cetil) C16EO7 (+35 C) DMPG (+13 C) DPPG (+35 C) DOPC (<0 C) DMPC (+23 C) DPPC (+42 C) DSPC (+55 C) R (cadeia hidrofbica) (nome) Abreviao (T t )

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frmaco/lipdeo = 1/10). Vale ressaltar que a capacidade de substncias lipoflicas serem incorporadas na membrana de lipossomas no uma regra geral; no processo de encapsulao, deve ser verificado se a substncia est efetivamente incorporada na membrana e no simplesmente adsorvida na sua superfcie ou auto-associada na forma de microcristais em suspenso com os lipossomas. No caso das substncias hidrossolveis, como os antimoniais pentavalentes, teoricamente impossvel atingir nveis de encapsulao de 100%, por causa da necessria co-existncia dos compartimentos aquosos interno e externo. Fatores determinantes na cintica de liberao da substncia encapsulada Lipossomas, contendo uma substncia encapsulada no seu compartimento aquoso interno, no se encontram em equilbrio termodinmico, quando so resuspendidos em meio aquoso sem a substncia. A evoluo do estado desse sistema levar necessariamente liberao da substncia para o meio externo at que se atinja um novo equilbrio. No caso das substncias incorporadas nas membranas dos lipossomas, a quantidade de substncia liberada depender do coeficiente de partio da substncia entre a membrana e a fase aquosa, assim como dos componentes desta fase. No caso das substncias incorporadas no compartimento aquoso, a criao de um gradiente de concentrao da substncia atravs da membrana faz com que esta atue como barreira, limitando a velocidade de difuso das substncias para o meio externo. Este sistema evoluir espontaneamente para o equilbrio termodinmico, ou seja, para a igualdade das concentraes interna e externa de substncia. Nesse contexto, torna-se importante poder prever a cintica de liberao da substncia encapsulada e conhecer os parmetros fsico-qumicos que vo influenci-la. Descreveremos abaixo um modelo simples que nos permite ter acesso a essas informaes. O fluxo de substncia atravs da membrana (JS = nmero de mols de substncia que atravessa a membrana por unidade de tempo e unidade de rea da membrana) depender da concentrao da substncia no compartimento aquoso interno (Ci) e do coeficiente de permeabilidade da substncia atravs da membrana (PS), de acordo com a lei de difuso simples: JS = PSCi (1)

Figura 2. Comportamento de fase das membranas lipdicas e efeito do colesterol. Uma membrana, composta por um determinado tipo de lipdeo e caracterizada por uma determinada Tt, encontra-se na fase gel (ligaes C-C na conformao toda-trans) abaixo da Tt e na fase cristal-lquido (ligaes C-C na conformao trans ou gauche) acima da Tt. O colesterol apaga a transio de fase da membrana e mantm a membrana em estado de fluidez intermediria. O colesterol aumenta a permeabilidade da membrana na fase gel e a reduz na fase fluida

Capacidade de encapsulao de substncia Substncias farmacologicamente ativas podem ser incorporadas seja no compartimento aquoso interno (substncias hidrossolveis), seja nas membranas dos lipossomas (substncias lipoflicas ou anfiflicas). A taxa de encapsulao de uma substncia em lipossomas e a relao substncia encapsulada/lipdeo so dois parmetros importantes que devem ser considerados na escolha do mtodo de preparao, sobretudo quando se procura desenvolver uma composio farmacutica. Esses parmetros podem ser otimizados atravs da escolha do mtodo de encapsulao e da manipulao da composio lipdica da membrana. A taxa de encapsulao dever ser maximizada, pois inversamente relacionada quantidade de substncia no encapsulada que perdida na maioria das vezes. A relao frmaco/ lipdeo dever tambm ser maximizada, visto que determina a quantidade de lipdeo a ser administrada ao paciente. Assim, quanto menor for a quantidade de lipdeo veiculada, menor sero os riscos de efeitos colaterais associados aos mesmos. Teoricamente, taxas de encapsulao prximas de 100% podem ser obtidas com substncias lipoflicas incorporadas na membrana dos lipossomas. o caso da anfotericina B que, no produto farmacutico AmBisome, associada a lipossomas pequenos (45-80 nm de dimetro) formados de fosfatidilcolina hidrogenada, colesterol e de diestearoilfosfatidilglicerol (relao molar 2:1:0,8 e relao

No caso de lipossomas unilamelares de distribuio de tamanho homogneo, de volume e de rea internas Vi e Si, respectivamente, o fluxo JS tem a seguinte expresso: JS = -(1/Si)(dn/dt) (2)

onde n o nmero de mols de substncia no compartimento interno. Podemos deduzir: JS = -(Vi/Si)(dCi/dt) (3)

onde Ci a concentrao de substncia no compartimento interno. Podemos tambm escrever: JS = -(Ri/3)(dCi/dt) (4)

onde Ri o raio interno mdio dos lipossomas. A partir das Equaes 1 e 4, podemos deduzir a seguinte relao: dCi/Ci = -(3PS/Ri)dt (5)

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que, aps integrao, leva seguinte relao: Ci = Cio exp(-3Pst/Ri) (6)

onde Cio a concentrao interna de substncia no tempo zero. A Equao 6 mostra que a cintica de liberao da substncia, por mecanismo de difuso simples, a partir de lipossomas de distribuio de tamanho homogneo, monoexponencial e determinada pelo coeficiente de permeabilidade da substncia e pelo tamanho dos lipossomas. Quanto menor for o coeficiente de permeabilidade da substncia ou quanto maior for o tamanho dos lipossomas, mais lenta ser a liberao da substncia dos lipossomas. Vale ressaltar que o coeficiente de permeabilidade, PS, depende do coeficiente de partio da substncia entre a membrana e a fase aquosa (k = concentrao na membrana/concentrao na fase aquosa), da constante de difuso da substncia na membrana (DS) e da espessura da membrana (x), de acordo com a expresso: PS = kDS/x (7)

biolgicos, o que pode alterar a permeabilidade de sua membrana e a velocidade de liberao da substncia encapsulada. A Figura 3 ilustra as interaes dos lipossomas com dois fluidos biolgicos importantes: os sais biliares e o soro. Aps administrao dos lipossomas por via oral, os sais biliares se incorporam na sua membrana, tendendo induzir a transio da fase lamelar para a fase micelar. Nestas condies, os lipossomas fluidos, que apresentam membrana na fase cristal-lquido, sero desestabilizados. Apenas lipossomas com membrana na fase gel parecem resistir parcialmente ao dos sais biliares14. Aps administrao dos lipossomas por via endovenosa, estes interagem com as lipoprotenas plasmticas. Lipdeos podem ser transferidos dos lipossomas para as lipoprotenas, enquanto componentes das lipoprotenas (como a apolipoprotena) podem ser incorporados na membrana dos lipossomas. Nessas condies, lipossomas fluidos mantero sua integridade apenas se estes contiverem colesterol na proporo de pelo menos 30% do total de lipdeos. Por outro lado, lipossomas com membrana na fase gel ficam mais refratrios s trocas com as lipoprotenas e, portanto, mantm sua elevada capacidade de reteno.

No caso das molculas esfricas, DS depender do raio molecular (rm) e da viscosidade da membrana (), de acordo com a relao de Stockes-Einstein: DS = RT/6Nrm (8)

onde N o nmero de Avogadro, R a constante dos gases perfeitos e T a temperatura absoluta. Podemos deduzir que substncias de grande tamanho (DS pequeno) e elevada polaridade (k pequeno) sero retidas com maior eficincia no compartimento aquoso interno dos lipossomas que as substncias de pequeno tamanho e de baixa polaridade, respectivamente. Alm disso, como a constante de difuso da substncia inversamente proporcional viscosidade da membrana, podemos prever que membranas na fase gel retero a substncia encapsulada com maior eficincia que membranas na fase cristal-lquido. Por exemplo, membranas constitudas de diestearoilfosfatidilcolina mostraram-se, a 37 C, aproximadamente 6 vezes menos permeveis carboxifluorescena que membranas constitudas de dimiristoilfosfatidilcolina12. A presso osmtica do meio interno dos lipossomas um outro fator importante que vai influenciar a liberao do princpio ativo encapsulado. Como as bicamadas lipdicas so muito permeveis gua, a existncia de uma diferena de presso osmtica entre os meios interno e externo induzir um movimento de gua por osmose atravs da membrana. Portanto, deve-se evitar preparar lipossomas com presso osmtica interna superior externa, pois isto provoca a entrada de gua nos lipossomas, podendo induzir um choque osmtico com conseqente liberao da substncia encapsulada. O armazenamento dos lipossomas na forma de suspenso aquosa muitas vezes incompatvel com a estabilidade requerida para os produtos farmacuticos (de pelo menos um ano), mesmo se a substncia encapsulada apresenta um baixo coeficiente de permeabilidade ou se a preparao mantida na forma de sedimento com pequeno volume externo. Assim, outras formas de armazenamento devem ser procuradas para os produtos farmacuticos base de lipossomas. O armazenamento na forma liofilizada representa uma alternativa vivel, entretanto, deve ser includo na formulao um agente crioprotetor para evitar a fuso das membranas desidratadas e o conseqente vazamento da substncia encapsulada no momento da reidratao13. Quando administrados em organismos vivos, os lipossomas interagem, no primeiro momento, com os componentes dos fluidos

Figura 3. Efeito das lipoprotenas plasmticas e dos sais biliares na reteno de frmaco encapsulado pelos lipossomas. Esses componentes biolgicos aumentam a permeabilidade da membrana aos frmacos hidrossolveis e oferecem um meio para a transferncia dos frmacos lipossolveis

Interao lipossomas/clulas: influncia na biodisponibilidade da substncia encapsulada Como visto anteriormente, os lipossomas so capazes de reterem princpios ativos encapsulados e, portanto, de proteg-los in vivo de uma eliminao ou degradao rpida. Suas propriedades de liberao lenta levam reduo da concentrao de princpio ativo na forma livre, e prolongao de sua presena no organismo. Esse aumento na biodisponibilidade do princpio ativo pode levar potenciao da sua ao biolgica, assim como reduo dos seus efeitos colaterais. Enquanto a liberao da substncia encapsulada em condio de armazenamento passiva e espontnea, sua liberao in vivo a partir de lipossomas estveis ser mediada essencialmente por clulas com atividade endocitria. Nesse contexto, a manipulao das caractersticas de superfcie dos lipossomas representa um dos meios atualmente disponveis para controlar sua interao com as clulas e a velocidade de liberao da substncia nos organismos vivos. Como ilustrado na Figura 4, os lipossomas convencionais (formados de fosfatidilcolina ou de surfactantes no-inicos e de colesterol), quando administrados por via endovenosa, so natural-

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mente capturados pelos macrfagos do sistema mononuclear fagocitrio, principalmente do fgado, do bao e da medula ssea. Portanto, a administrao de frmacos na forma encapsulada nesses lipossomas resulta no aumento de sua concentrao nesses rgos, assim como na reduo da concentrao em rgos apresentando capilares contnuos. A captura celular dos lipossomas favorecida pelo processo de opsonizao, que ocorre assim que os lipossomas entram em contato com os componentes do sangue. Depois da fagocitose, os lipossomas so degradados pelas fosfolipases lisossomais e a substncia liberada nos fagolisossomas, podendo se difundir para o citossol ou ser excretada para o meio extracelular. A velocidade de liberao do princpio ativo pode ser controlada pela manipulao tanto da composio da membrana (influenciando a velocidade de degradao dos lipossomas), quanto do tamanho dos lipossomas (influenciando a eficincia de captura pelos macrfagos). Assim, lipossomas pequenos sero capturados com menor eficincia que lipossomas grandes, permanecero mais tempo na circulao sangunea e apresentaro uma liberao mais prolongada.

APLICAES DOS LIPOSSOMAS NA QUIMIOTERAPIA ANTIMONIAL As doenas alvos A esquistossomose uma doena parasitria crnica causada por espcies do gnero Schistosoma. Estima-se que no Brasil, 8 a 10 milhes de indivduos estejam infectados e que 30 milhes corram o risco de contrair a doena17. A infeco causada pelas cercrias, liberadas pelo hospedeiro intermedirio (molusco), que penetram atravs da pele do homem quando este entra em contato com a gua contaminada17. Os parasitas so encontrados nos pulmes, na forma de esquistossmulos, um dia aps a penetrao das cercrias. Em nove dias, os esquistossmulos vo para o fgado, onde se alimentam e se desenvolvem, alcanando a vida adulta. Os vermes adultos atingem as veias mesentricas, principalmente a inferior, no caso do S. mansoni. As leishmanioses so doenas parasitrias causadas por protozorios flagelados pertencentes Ordem Kinetoplastida, Famlia Trypanosomatidae e ao Gnero Leishmania. Estas atingem cerca de 12 milhes de pessoas no mundo18. No Brasil, dados recentes relatam a ocorrncia de cerca de 30.000 novos casos anuais da doena19. As leishmanioses so transmitidas aos hospedeiros vertebrados pela picada de um inseto que regurgita o parasita na forma promastigota. Esses parasitas so fagocitados por macrfagos, no interior dos quais estes se transformam em amastigotas. Os amastigotas multiplicamse livremente no compartimento cido dos fagolisossomas e escapam dos sistemas de defesa do hospedeiro. A Leishmania corresponde a um complexo de vrias espcies diferentes que causam vrios tipos de manifestaes clnicas, que incluem formas cutnea, mucocutnea e visceral. O co aparece como hospedeiro vertebrado nas formas cutnea e visceral e, particularmente no caso da leishmaniose visceral, tem papel importante como reservatrio e fonte de infeco da doena em rea endmica. A leishmaniose visceral apresenta ndice de letalidade de 100% nos casos no tratados clinicamente4. Conhecimentos sobre as caractersticas da doena alvo e, principalmente, a localizao do parasita, so essenciais na escolha do tipo de lipossoma a ser empregado. Como mostraremos em seguida, a localizao da Leishmania nos rgos do sistema mononuclear fagocitrio torna os lipossomas convencionais sistemas ideais para concentrar o frmaco especificamente no local de infeco. Por outro lado, a localizao do Schistosoma mansoni no sistema porta e seu modo de alimentao com os componentes do sangue sugere que os lipossomas furtivos so mais adequados para direcionar o frmaco para o parasita. Aspectos farmacolgicos no uso dos lipossomas no tratamento das leishmanioses Em 1977-78, grupos de pesquisa ingls e americano propuseram o uso de lipossomas convencionais contendo drogas leishmanicidas como uma nova abordagem para o tratamento da leishmaniose visceral 11,20. Esta proposta foi baseada na observao de que antimoniais pentavalentes encapsulados em lipossomas foram 200700 vezes mais eficazes que na forma livre, em modelo experimental de leishmaniose visceral (hamsters ou camundongos infectados por Leishmania donovani). O aumento espectacular de eficcia dessas drogas foi atribudo ao destino natural dos lipossomas quando administrados por via endovenosa: o fato de eles serem captados pelos mesmos rgos (o fgado, o bao e a medula ssea) e pelas mesmas clulas (os macrfagos teciduais) nas quais se localiza o parasita. Assim, os lipossomas convencionais apresentam-se como sistema ideal para direcionar drogas leishmanicidas para o local de infeco.

Figura 4. Destino dos lipossomas convencionais por via endovenosa. Os lipossomas so capturados pelos macrfagos do sistema mononuclear fagocitrio e no penetram nos rgos que apresentam capilares contnuos

A descoberta de que o destino in vivo dos lipossomas poderia ser controlado atravs da manipulao de suas caractersticas de superfcie constituiu um dos principais avanos da dcada de 199015. Foi observado que a incorporao na membrana dos lipossomas de lipdeos acoplados a polmeros de etilenoglicol altera suas interaes com o ambiente, sendo o efeito mais importante o impedimento da captura pelos macrfagos e a prolongao de sua presena no organismo. Em conseqncia, este tipo de lipossomas, chamado de lipossomas furtivos, promove uma presena prolongada da substncia no organismo, alm de distribu-la para outros rgos, alm daqueles do sistema mononuclear fagocitrio. Esses lipossomas podem ainda ser direcionados para determinados tipos celulares, via receptores ou ligantes especficos, atravs do acoplamento de anticorpo ou ligante na extremidade do polmero. Uma das maiores desvantagens da terapia tpica a baixa velocidade de penetrao dos frmacos atravs da pele. A barreira difusional da maioria das substncias o estrato crneo, que consiste de cornecitos embebidos em uma matriz lipdica. A matriz lipdica do estrato crneo formada de uma bicamada lipdica composta de colesterol, cidos graxos e ceramidas. O uso de lipossomas como promotor de absoro cutnea tem sido estudado intensivamente16. Numerosos estudos realizados com uma grande variedade de frmacos e lipossomas de diferentes composies mostraram que a aplicao do frmaco na forma encapsulada em lipossomas permite modular sua absoro na epiderme e na derme, assim como sua absoro sistmica.

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Estudos de biodistribuio/farmacocintica do antimnio em camundongos e ces mostraram que a forma lipossomal promove nveis de antimnio muito mais elevados e prolongados no fgado e no bao dos animais quando comparado forma livre21,22. Essa diferena de biodistribuio entre as formas livre e encapsulada ilustrada, na Tabela 2, a partir de dados obtidos em ces. Tabela 2. Nveis teciduais de antimnio em ces (g/g tecido), 48 h aps injeo intravenosa de antimonial pentavalente, na forma livre e na forma encapsulada, em lipossomas de tipo FDELs Forma do antimonial (dose) Forma livre (45 mg Sb/kg) Forma encapsulada em lipossomas (4 mg Sb/kg) Fgado 7 44 Bao Medula ssea 2 103 3 3 Ref. 21 22
Figura 5. Mtodo de preparao de lipossomas do tipo MLVs, baseado no processo de hidratao do filme lipdico

Vale ressaltar que o tamanho dos lipossomas um parmetro importante, pois tem influncia tanto na taxa de eliminao do parasita23, quanto na concentrao de antimnio ao nvel da medula ssea22. Portanto, lipossomas pequenos (dimetro < 200 nm) parecem ter acesso facilitado medula ssea, o que de interesse pois devem possibilitar a eliminao do parasita que se encontra nesse tecido. Uma formulao da anfotericina B base de lipossomas (AmBisome), depois de testes clnicos bem sucedidos, chegou a ser aprovada pela FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento do calazar24. Os principais impactos da encapsulao desse frmaco em lipossomas foram o aumento do seu ndice teraputico e o prolongamento de sua ao. Os benefcios clnicos da terapia baseada em lipossomas, quando comparada quimioterapia convencional, so a reduo do nmero de injees, da durao da terapia e dos efeitos colaterais. Entretanto, at hoje, o elevado custo comercial do AmBisome limitou o seu uso no Brasil. O desenvolvimento de formulaes tpicas seria altamente desejvel para o tratamento da leishmaniose cutnea. Diversos fatores apontam para o desenvolvimento de formulaes baseadas em antimoniais encapsulados em lipossomas: a capacidade comprovada dos lipossomas de promoverem a absoro cutnea de frmacos e a eficcia do antimoniato de meglumina intralesional na leishmaniose cutnea25. Aspectos tecnolgicos na preparao dos antimoniais pentavalentes na forma encapsulada em lipossomas O primeiro mtodo proposto para a encapsulao dos antimoniais pentavalentes em lipossomas foi o mtodo de hidratao do filme26. Como ilustrado na Figura 5, este consiste na hidratao de um filme lipdico com uma soluo aquosa do antimonial, levando formao de lipossomas multilamelares chamados de MLVs (multilamellar vesicles). As maiores taxas de encapsulao e de reteno foram obtidas com lipossomas constitudos de fosfolipdeo de alta temperatura de transio de fase (dipalmitoilfosfatidilcolina, Tt = 42 C), de colesterol e de fosfolipdeo carregado negativamente. Um outro mtodo avaliado foi o mtodo de evaporao em fase reversa 27 que, como descrito na Figura 6, leva formao de lipossomas oligolamelares de tipo REVs (reverse phase evaporation vesicles). Esse mtodo permite alcanar maiores taxas de encapsulao que o mtodo de hidratao do filme (Tabela 3). Entretanto, lipossomas de tipo REVs se mostraram menos estveis que aqueles do tipo MLVs, sendo que 25-50% de antimnio foi liberado

Figura 6. Mtodo de preparao de lipossomas do tipo REVs, baseado no processo de evaporao em fase reversa

da preparao aps uma semana de incubao em 25 C. Por outro lado, o uso de solvente orgnico na preparao desses lipossomas representa um inconveniente, considerando que sempre permanecem resduos potencialmente txicos na formulao final. Um outro inconveniente dos dois mtodos apresentados anteriormente que as preparaes resultantes s podem ser armazenadas na forma de suspenso aquosa, o que limita consideravelmente o seu potencial como produto farmacutico. Recentemente, nosso grupo avaliou o mtodo de desidrataoreidratao desenvolvido por Kirby e Gregoriadis28 para a encapsulao do antimoniato de meglumina em lipossomas formados de diestearoilfosfatidilcolina, colesterol e dicetilfosfato29. Como mostrado na Figura 7, esse mtodo consiste em misturar uma suspenso de lipossomas pequenos vazios (preparados em gua) com uma soluo de antimoniato de meglumina e em liofilizar a mistura. A reidratao dessa preparao em condies especficas de temperatura (>Tt) e de concentrao lipdica leva obteno de lipossomas com elevada taxa de encapsulao (Tabela 3), chamados de DRVs (dehydration rehydration vesicles). Uma alternativa a esse mtodo proposta por nosso grupo29 consiste em liofilizar os lipossomas pequenos vazios sem o antimonial e em reidratar o liofilizado, chamado de FDELs (freeze-dried empty liposomes), com a soluo de antimonial. Esse mtodo apresenta a vantagem de no submeter o antimonial liofilizao, alm de permitir uma elevada taxa de encapsulao (Tabela 3). Uma grande vantagem desses dois ltimos

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Tabela 3. Caractersticas de encapsulao dos antimoniais a partir de lipossomas obtidos por diferentes mtodos Tipo de lipossomas MLVs REVs DRVs FDELs Taxa de encapsulao mxima 7% 60% 63% 42% Relao Sb/lipdeo (m/m) mxima 0,3 0,55 0,37 0,25 Forma de armazenamento proposta Suspenso aquosa Suspenso aquosa Forma liofilizada intermediria Forma liofilizada intermediria

presena desse acar resulta em reduo da taxa de encapsulao do antimoniato de meglumina no caso dos lipossomas DRVs, mas no dos lipossomas FDELs. Alm disso, como mostrado na Tabela 4, um aumento da velocidade de liberao do antimonial observado nos lipossomas preparados com sacarose. Esse aumento na velocidade de liberao poderia ser explicado pelo aumento da presso osmtica do meio interno dos lipossomas, devido co-encapsulao da sacarose. Potencial dos lipossomas no tratamento da esquistossomose Os primeiros estudos realizados com lipossomas convencionais administrados por via subcutnea evidenciaram a capacidade dos lipossomas de potenciar e prolongar o efeito profiltico das drogas esquistossomicidas, oxamniquine32, praziquantel33 e trtaro emtico34. O efeito benfico dos lipossomas foi atribudo s suas propriedades de liberao prolongada, resultando no aumento da biodisponibilidade do princpio ativo. Foi tambm proposto que os lipossomas promoveriam, atravs do direcionamento passivo para o fgado, uma maior concentrao do frmaco no parasita durante o seu estgio final de diferenciao nesse mesmo tecido. Recentemente, nosso grupo relatou a preparao de lipossomas de tamanho calibrado (dimetro mdio = 110 nm), contendo trtaro emtico encapsulado na relao antimnio/lipdeo 0,015 (m/m). Esses lipossomas foram obtidos por filtrao de MLVs atravs de membranas de policarbonato de poro de 100 nm de dimetro. Dois tipos diferentes de lipossomas foram avaliados: lipossomas convencionais (LC) formados de diesteraroilfosfatidilcolina e de colesterol e lipossomas furtivos (LF) contendo, alm destes lipdeos, o lipdeo diestearoilfosfatidiletanolamina acoplado ao polietilenoglicol 2000. Estes lipossomas mostraram uma elevada estabilidade no soro, com cintica de liberao monoexponencial, de acordo com a lei de difuso simples, e uma meia-vida de liberao de 9 dias. Estes lipossomas foram avaliados em modelo experimental de esquistossomose mansoni, em estgio tardio da doena35. Camundongos SWISS com 35 dias de infeco pelo Schistosoma mansoni receberam trtaro emtico por via intraperitoneal em dose nica (10 mg Sb/kg), seja na forma livre ou na forma encapsulada em lipossomas LC ou LF. Apenas o grupo tratado com LF mostrou reduo significativa (55%) no nmero de vermes, quando comparado

Figura 7. Mtodo de preparao de lipossomas do tipo DRVs, baseado no processo de desidratao - reidratao

mtodos com relao aos primeiros que a preparao pode ser armazenada por tempo prolongado na forma liofilizada intermediria e reidratada um pouco antes do uso. Vale ressaltar que a presena do lipdeo carregado negativamente, dicetilfosfato, importante para a obteno de taxa de encapsulao elevada do antimoniato de meglumina. Na sua ausncia, taxas de encapsulao inferiores a 15% so obtidos30. Os diversos tipos de lipossomas obtidos por esses diferentes mtodos apresentam dimetro mdio elevado (400 - 5000 nm) e distribuio de tamanho heterognea. Essa caracterstica representa um problema potencial, pois a administrao endovenosa de lipossomas de tamanho grande (>1000 nm) pode levar obstruo dos capilares pulmonares. Segundo Zadi e Gregoriadis, possvel obter suspenso de lipossomas de tamanho reduzido e mais homogneo utilizando o mtodo de desidratao-reidratao, mediante ao uso de um acar como agente crioprotetor31. Como mostrado na Tabela 4, a utilizao de sacarose no processo de preparao de lipossomas DRVs e FDELs permite a obteno de lipossomas de tamanho reduzido. A

Tabela 4. Influncia da sacarose nas caractersticas dos lipossomas DRVs e FDELs (composio lipdica: DSPC/DCP/CHOL em relao molar de 5:4:1) resuspendidos em soluo salina tamponada (NaCl 0,15 mol L-1; fosfato 0,01 mol L-1; pH 7,2) Tipo de lipossoma DRVs FDELs DRVs + sacarosea FDELs + sacarosea Relao inicial Sb/lipdeo (m/m) 0,6 0,6 0,6 0,6 Dimetro mdio (nm) DP 465116 1205451 27380 312182 Taxa encapsulao (% Sb) DP 613 393 4214 377 % Sb liberado aps 24 h em 37 C 12,10,3 3,70,4 25,81,1 24,13,1

a Sacarose foi acrescentada a suspenso de lipossomas vazios antes da liofilizao na concentrao final de 0,3 mol L-1 e relao sacarose/ lipdeo 3:1 (m/m). DP: desvio padro.

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Demicheli et al.

Quim. Nova

aos grupos controles (grupo no tratado e grupo tratado com lipossomas vazios). A maior eficcia dos LF, quando comparados aos LC, pode ser atribuda ao aumento da biodisponibilidade do princpio ativo quando encapsulado em lipossomas furtivos, assim como captura dos lipossomas de circulao prolongada pelos parasitas. Quando submetidos a uma dose maior de antimnio (25 mg Sb/ kg), todos camundongos (12/12) que receberam o trtaro emtico na forma livre morreram, enquanto aqueles que receberam a forma encapsulada em lipossomas sobreviveram. Conclui-se que os lipossomas furtivos reduzem a toxicidade aguda do trtaro emtico e direcionam com eficcia a droga ao S. mansoni durante o curso da infeco. Esse estudo estabeleceu, pela primeira vez, o efeito benfico dos vetores furtivos no tratamento da esquistossomose mansoni. Em uma outra abordagem, espera-se que a captura dos lipossomas pelo parasita possa ser aumentada atravs do acoplamento na superfcie das vesculas de anticorpo ou ligante especifico para receptor/ligante do parasita. CONCLUSES A quimioterapia antimonial convencional sofre vrias limitaes, as mais srias sendo a necessidade de injees dirias, os seus efeitos colaterais e o aparecimento de resistncia. As propriedades farmacolgicas dos lipossomas convencionais fazem deste sistema um transportador ideal para direcionar medicamentos leishmanicidas para os stios de infeco e aumentar sua eficcia no tratamento da leishmaniose visceral. No caso dos antimoniais pentavalentes, nveis de atividade espetaculares foram alcanados em modelo experimental de leishmaniose visceral, aps sua administrao na forma encapsulada em lipossomas. Entretanto, a obteno de composio aceitvel, do ponto de vista farmacolgico e farmacutico, continua sendo investigada. A literatura mostra que a taxa de encapsulao do antimonial pentavalente em lipossomas pode ser otimizada atravs da seleo do mtodo de preparao e da composio lipdica da membrana. Por outro lado, a composio lipdica, o mtodo de preparao e a presso osmtica do compartimento interno so fatores determinantes para a obteno de uma composio de lipossomas estvel. Alm disso, o tamanho das vesculas parece ser importante para atingir os locais de infeco menos acessveis. Recentemente, foi mostrado que a encapsulao de um antimonial trivalente em lipossomas reduz sua toxicidade aguda. Alm disso, lipossomas furtivos, ao contrrio dos lipossomas convencionais, mostraram-se capazes de aumentar a eficcia do antimonial trivalente em modelo experimental de esquistossomose mansoni. Esses resultados mostram que os lipossomas representam tambm sistemas de transporte promissores para os antimoniais trivalentes no tratamento das leishmanioses e da esquistossomose. AGRADECIMENTOS Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) pela concesso de auxlios e bolsas. REFERNCIAS
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