Determinação Do Teor de Açúcar Numa Amostra de Produto Alimentar

Tnia Margarida Pereira Figueiredo
Validao de Mtodos Analticos: determinao do teor de acar numa amostra de produto alimentar.
VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS
2012
Determinao do Teor de Acar numa amostra de produto alimentar
Mestrado em Qumica
Departamento de Qumica
FCTUC
VALIDAO DE MTODOS
ANALTICOS
Determinao do teor de acar numa amostra de
produto alimentar.
Dissertao apresentada para provas de Mestrado em Qumica, rea de

especializao em Controlo de Qualidade e Ambiente
Jorge Lus Gabriel F. S. Costa Pereira
Julho de 2012
Universidade de Coimbra
Agradecimentos
Ao longo do nosso processo de crescimento como pessoas, vamos
deparando-nos com novas realidades at ento desconhecidas, preciso
percorrer um longo caminho para atingir os nossos objectivos, mas tudo isto
no seria possvel sem que haja interveno de todos aqueles que nos
rodeiam.
Este trabalho representa o fim de um ciclo e o incio de outro. No ciclo
que agora se fecha, muitas foram as pessoas que, de uma forma ou de outra,
contriburam para que esta caminhada fosse menos cansativa, com palavras
de incentivo, com conversas e ideias que me ajudaram a ver a vida de uma
forma diferente. A todas elas agradeo e dedico-lhes este trabalho.
Ao Doutor Jorge Costa Pereira, por ter aceitado ser meu orientador e,
desta forma, me ensinar a usar, de uma forma mais adequada e proveitosa, as
ferramentas analticas que se encontram ao nosso dispor e que, nem sempre
as usamos ou porque no sabemos que elas existem, ou ento porque no
sabemos como usa-las. Agradeo-lhe, ainda, por ter acreditado nas minhas
capacidades para a realizao deste trabalho, encorajando-me e dando-me
nimo para continuar e no desistir.
Dra. Ctia Vaz e Dra. Rita Oliveira pela pacincia e inestimvel
apoio prestados durante a realizao deste trabalho e, principalmente, pela
oportunidade de muito aprender com a experincia e conhecimento cientfico
que lhes pertence.
Agradeo ao meu namorado, Fbio, por todos os momentos fantsticos
que me proporcionaste, mas, acima de tudo, pela pacincia que tiveste comigo,
especialmente este ano que no foi nada fcil, pelo teu carinho, amor e
dedicao, mesmo nos momentos mais complicados da minha vida. Sem Ti
nada disto era possvel. Muito Obrigado!
Agradeo a todos os meus amigos por todo o seu apoio, carinho,
pacincia durante estes anos, com perodos bons e outros menos bons e ainda
aos meus colegas de curso que estiveram por perto na minha vida acadmica.
ii
Obrigada a toda a minha famlia, em especial minha av e minha

madrinha, pela pacincia, carinho, disponibilidade e apoio. Por ltimo o meu
muito obrigado ao meu pai, o meu anjo da guarda.
iii
Prefcio
Este trabalho encontra-se desenvolvido sob a forma de cinco captulos.
No primeiro captulo procurou-se transmitir e resumir, sob a forma de uma
perspectiva global o tema do trabalho e o objectivo do mesmo. No segundo
captulo pretendeu-se abordar os fundamentos tericos essenciais para a
execuo do mesmo enquanto no terceiro captulo apresenta-se a seco
experimental onde se descreve os mtodos e materiais necessrios. No quarto
captulo apresenta-se os resultados obtidos no decorrer do trabalho, bem como
o seu tratamento estatstico e discusso dos mesmos. No quinto captulo
apresenta-se as concluses finais do trabalho realizado. Por fim, no sexto e
ltimo capitulo, apresentam-se as referncias bibliogrficas consultadas na
elaborao do presente trabalho.
Para facilitar a transferncia de dados e permitir manter a coerncia
dessa informao, optou-se por representar os nmeros reais sob a forma
exponencial com a notao utilizada nos programas de clculo onde, por
exemplo, 3,201E-08 representa o valor 3,201 x 10-8 escrito correctamente no
formato cientfico.
Sempre que possvel e adequado, os valores estimados esto
representados com a sua incerteza associada, respectivo erro padro, indicada
entre parntesis, seguida das respectivas unidades, de forma a conferir maior
significado estatstico aos resultados obtidos.
iv
Resumo
A recomendao da Organizao Mundial de Sade (OMS) de que o
consumo de acar no ultrapasse os 10% das calorias na dieta e, para tal,
necessrio ter conhecimento da quantidade de acar que se ingere em cada
poro de alimento confeccionado e a rotulagem muito importante para este
conhecimento.
Deste modo, no presente trabalho, pretendeu-se validar o mtodo de
doseamento simultneo de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose, por
HPLC-RI, de forma a ser possvel determinar a quantidade (percentagem) total
e individual de acares numa amostra de pastelaria. Na validao foram
avaliados os parmetros: especificidade, gama de trabalho, sensibilidade,
limites analticos, preciso e exactido.
Abstract
The recommendation of the World Health Organization (WHO) is that
sugar consumption does not exceed 10% of the calories in the diet, and for this
it is necessary to know the amount of sugar you eat in each serving of cooked
food and labeling is very important for this knowledge. Thus, in this study was
intended to validate the method of simultaneous determination of fructose,
glucose, sucrose, maltose and lactose, by HPLC-RI to be able to determine the
quantity (percent) and individual total sugar in a sample pastry. In the validation
parameters were evaluated: specificity, working range, sensitivity, analytical
limits, precision and accuracy.
vi
Abreviaturas
ANOVA Analysis Of Variance
AOAC Association of Official Analytical Chemists
CE Cromatografia por Excluso
CG Cromatografia Gasosa
CSC Cromatografia com Fluido Supercrtico
CLC Cromatografia Lquida Clssica
CLFL Cromatografia Lquida com Fase Ligada
CLL Cromatografia Lquido-Lquido
CLS Cromatografia Lquido-Slido
CV Coeficiente de Variao
ER Erro Relativo
EUA Estados Unidos da Amrica
FE Fase Estacionria
FM Fase Mvel
FR Fase Reversa
GFC Cromatografia com Filtrao em Gel
GPC Cromatografia com Permeao em Gel
HCl cido Clordrico
HPLC Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
HPLC-RI - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia com detector de
ndice de Refraco
ISO Organizao Internacional para a Padronizao (do ingls
International Organization for Standardization)
IUPAC Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada (do ingls
International Union of Pure and Applied Chemistry)
vii
MRC Material de Referencia Certificado

NIST - National Institute of Standards and Technology
ODS Octadecilsilano
OMS Organizao Mundial de Sade
R Coeficiente de Correlao
RI ndice de Refraco
RSD Desvio Padro Relativo
USP Farmacopeia dos Estados Unidos da Amrica (do ingls United
States Pharmacopoeia)
Xd Limite de deciso
XLD Limite de deteco
XLQ Limite de quantificao
Yd Sinal instrumental referente ao limite de deciso
YLD Sinal instrumental referente ao limite de deteco
YLQ Sinal instrumental referente ao limite de quantificao
viii
ndice
1. Introduo .................................................................................................... 2
1.1
DanCake ............................................................................................... 2
2. Fundamentao Terica .............................................................................. 5

2.1
Hidratos de carbono .............................................................................. 5
2.1.1
Origem ............................................................................................... 5
2.1.2
Refinao ........................................................................................... 7
2.1.3
Monossacardeos ............................................................................. 10
2.1.3.1 Glucose ............................................................................................ 10

2.1.3.2 Frutose ............................................................................................. 11
2.1.4
Dissacardeos .................................................................................. 12
2.1.4.1 Sacarose .......................................................................................... 13

2.1.4.2 Maltose ............................................................................................ 13
2.1.4.3 Lactose ............................................................................................ 14
2.1.5
2.2
Acar no organismo ....................................................................... 14

Cromatografia ..................................................................................... 16
2.2.1
Mecanismos de separao .............................................................. 17
2.2.2
Tipos de cromatografia .................................................................... 23
2.2.2.1 Cromatografia planar ....................................................................... 23

2.2.2.2 Cromatografia em coluna ................................................................. 25
2.2.3
HPLC ............................................................................................... 26
2.2.3.1 Fases ............................................................................................... 30

2.2.3.2 Detectores........................................................................................ 34
2.2.4
2.3
Identificao e quantificao ............................................................ 35

Quantificao de hidratos de carbono ................................................. 36
2.3.1
Variantes .......................................................................................... 36
2.3.2
Equipamento .................................................................................... 37
ix
2.3.3
2.4
Teste de Conformidade do sistema de HPLC .................................. 46

Validao de procedimentos analticos (ICH) ..................................... 48
2.4.1
Parmetros de desempenho ............................................................ 48
2.4.1.1 Especificidade e selectividade ......................................................... 50

2.4.1.2 Gama de trabalho e linearidade da curva de calibrao .................. 50
2.4.1.3 Sensibilidade.................................................................................... 51
2.4.1.4 Limiares analticos ........................................................................... 51
2.4.1.5 Preciso ........................................................................................... 52
2.4.1.6 Exactido ......................................................................................... 54
2.4.1.7 Robustez .......................................................................................... 57
2.4.1.8 Coerncia......................................................................................... 57
2.5
Tratamento estatstico de dados ......................................................... 58
2.5.1
Distribuies estatsticas relevantes ................................................ 58
2.5.1.1 t-student ........................................................................................... 58

2.5.1.2 Fisher ............................................................................................... 59
2.5.2
Teste de hipteses ........................................................................... 60
2.5.2.1 Diagnstico de valores discrepantes ............................................... 62

2.5.2.2 Escolha do modelo .......................................................................... 63
2.5.3
Anlise de varincia ......................................................................... 64
3. Seco experimental ................................................................................. 67

3.1.
Reagentes ........................................................................................... 67
3.1.1.
Fase mvel (HPLC) ......................................................................... 67
3.1.2.
Soluo-me padro de glucose, frutose, sacarose, lactose e
maltose 67
3.1.2.1.
3.1.3.
3.2.
Preparao das solues padro de acares ............................. 67

Preparao das solues de Carrez ................................................ 68
Equipamento ....................................................................................... 68
3.3.
Mtodos .............................................................................................. 68
3.3.1.
Preparao da amostra.................................................................... 68
3.3.2.
Condies de operao ................................................................... 69
4. Resultados e discusso ............................................................................. 71

4.1.
Linearidade e gama de trabalho .......................................................... 71
4.2.
Limiares analticos............................................................................... 79
4.3.
Preciso .............................................................................................. 80
4.3.1.
Repetibilidade .................................................................................. 80
4.3.2.
Preciso intermdia ......................................................................... 80
4.4.
Exactido ............................................................................................ 86
5. Concluses ................................................................................................ 91
6. Bibliografia ................................................................................................. 94
Anexo I - As aplicaes do acar na rea da produo alimentar.................. 98
Anexo II Cromatogramas obtidos na leitura dos padres e amostra ........... 100
xi
1. Introduo
1. Introduo
Os hidratos de carbono, tambm conhecidos por glcidos, devem representar
a principal fonte de energia da nossa alimentao, entre 55 e 75%. So constitudos
por unidades bsicas denominadas oses. Todos os hidratos de carbono so
decompostos no organismo atravs da aco de enzimas especficas at sua
forma bsica, o monmero, sendo ento absorvidos e metabolizados.
Consoante o nmero de unidades bsicas pode-se agrupar os hidratos de
carbono em monossacardeos, dissacardeos ou polissacardeos.
Uma vez que os acares esto frequentemente presentes nos hbitos
alimentares, sobretudo dos consumidores mais jovens, e tendo em vista que o
doseamento dos acares deve ser precisa para o controlo de qualidade, pretendeuse com este trabalho efectuar a validao do mtodo de doseamento simultneo de
frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose, por Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia com deteco por ndice de refraco.
Neste trabalho, foi desenvolvido e implementado, de acordo com as
necessidades do laboratrio Fsico-qumico e de Controlo de Qualidade da empresa
DanCake, um mtodo que permite quantificar o teor de acar total ou o teor
individual de cada mono e dissacardeo, presente nos alimentos da sua linha de
produo.
1.1 DanCake
A DanCake uma empresa portuguesa fundada em 1978 que desenvolve a
sua actividade no sector alimentar. conhecida nacional e internacionalmente pela
sua oferta de bolos e produtos de confeitaria.
Um
negcio
assegurado por uma gesto

familiar,
DanCake
tem
vindo
apostar
no
desenvolvimento sustentado
que representa, actualmente,
Figura 1.1 Imagem area da DanCake Coimbra.
uma capacidade produtiva de

2
45 mil toneladas, com uma margem de crescimento adicional de cerca de 40%. A

empresa tem duas unidades de produo (Coimbra e Lisboa), sendo um dos
maiores fabricantes de biscoitos de manteiga a nvel mundial.
Mais de 600 colaboradores asseguram o funcionamento da empresa
portuguesa que representa o maior volume de exportao neste sector. A qualidade
dos produtos DanCake reconhecida internacionalmente, tendo sido certificada com
o Nvel Superior (Higher Level) pelo British Retail Consortium (BRC) e
International Food Standard (IFS).
O investimento tecnolgico e o alargamento da sua oferta de produtos para ir
ao encontro das necessidades do consumidor tm sido as suas preocupaes
principais.
Com 30 anos de actividade e uma posio solidificada nacional e
internacionalmente, a DanCake uma empresa sempre atenta aos desafios que o
mercado lhe tem colocado. Numa poca em que as preocupaes com a sade e
nutrio tem pautado a vida dos consumidores, a DanCake procura adaptar-se e
contribuir para um estilo de vida mais equilibrado, numa tendncia transversal a
todas as suas marcas e que procura influenciar especialmente as escolhas dos mais
jovens.
A reduo de acares, gorduras e sal em produtos DanCake j existentes e
o lanamento de novos snacks, mais saudveis, so caminhos que esta empresa
apontou para se desenvolver, respondendo e antecipando as necessidades de um
mercado sempre em mudana e crescentemente exigente.
2. Fundmento Teoric
2. Fundamentao Terica
Neste captulo procede-se a uma reviso bibliogrfica, na literatura existente,
de factos e conceitos essenciais ao desenvolvimento do restante trabalho.
2.1
Hidratos de carbono
Os hidratos de carbono so aldedos poli-hidroxilados, cetonas poli-
hidroxiladas ou compostos que, por hidrlise, se podem transformar nos anteriores.

Os hidratos de carbono que no se podem hidrolisar para compostos mais simples
designam-se por monossacardeos. Os hidratos de carbono que se podem hidrolisar
em duas molculas de monossacardeos designam-se por dissacardeos. Aos
hidratos
de
carbono
que,
por
hidrlise,
originam
vrias
molculas
de
monossacardeos d-se a designao de polissacardeos. [1]

Os monossacardeos podem, ainda, subdividir-se em aldoses no caso de
conterem o grupo aldedo, ou cetoses quando possuem o grupo cetona.
Os hidratos de carbono que reduzem o reagente de Fehling (ou o de
Benedict) ou o reagente de Tollens conhecem-se por acares redutores. Todos os
monossacardeos, quer aldoses quer cetoses, so acares redutores, assim como
a maioria dos dissacardeos, constituindo a sacarose uma excepo.
2.1.1 Origem
Antes de existir acar, tal como hoje o conhecemos, existiam apenas duas
fontes de sabor doce no mundo: o mel e a cana. [2]
A cana cultivada j desde a Antiguidade. Tero sido os povos das ilhas do
Sul do Pacfico, por volta do ano 20.000 a.C., a descobrir as propriedades desta
planta, que crescia espontaneamente nas suas terras. Foi na Nova Guin que a
cana foi pela primeira vez cultivada. A partir desta zona, a cultura estendeu-se
depois a outras ilhas vizinhas, como as Fiji ou a Nova Calednia. Mais tarde, a canade-acar ter chegado a outros pases, como as Filipinas, a Indonsia, a Malsia
ou a ndia. Foram os Indianos o primeiro povo a extrair o suco da cana e a produzir,
pela primeira vez, acar em bruto, baptizado com o nome gur, por volta de 500
a.C..
5
A tcnica da produo de acar disseminou-se aos poucos por toda a regio

do Mdio Oriente. Os rabes aprenderam com os Persas a produzir acar slido e
foi desta forma que, por volta do sculo III a.C., se estabeleceram as rotas do
acar, com caravanas a fazer o transporte entre os pases asiticos e africanos.
Mais tarde os Europeus viajaram at pases longnquos, descobriram a
cultura da cana-de-acar e introduziram-na na Grcia, em Itlia e em algumas
regies da Frana. No entanto, o sucesso no foi grande pois o clima no era o mais
adequado e o oriente continuou a ser o maior fornecedor de acar do mundo
ocidental.
Nesta altura, eram os mercadores venezianos os principais intermedirios
deste comrcio: em Alexandria compravam o acar proveniente da ndia, fazendo-o
depois chegar ao resto da Europa. Durante centenas e centenas de anos o acar
foi, assim, considerado uma especiaria extremamente rara e valiosa. Apenas nos
palcios reais e nas casas nobres era possvel consumir acar. Vendido nos
boticrios (as farmcias de ento), o acar atingia preos altssimos, sendo apenas
acessvel aos mais poderosos.
No incio do sculo XV deu-se uma viragem importante na histria do acar:
o infante D. Henrique resolveu introduzir na Madeira a cultura da cana. Com a
passagem do cabo da Boa Esperana, os Portugueses passaram a viajar para a
ndia com bastante regularidade e, nesta poca, tornaram-se os maiores
negociantes de acar.
Normalmente associa-se o acar a um produto de origem sul-americana, no
entanto, ter sido apenas na altura dos Descobrimentos que Cristvo Colombo ter
levado alguns exemplares de cana-de-acar provenientes das Canrias para
plantar em S. Domingos, a actual Repblica Dominicana.
A cultura de cana encontrou no novo continente excelentes condies para se
desenvolver, e no foram precisos muitos anos para que, em praticamente todos os
pases recm-colonizados, os campos se cobrissem de cana-de-acar. Os
navegadores portugueses apostaram nos solos frteis das terras brasileiras para
instalar plantaes de cana. Os solos eram frteis, o clima o mais adequado e o
sucesso foi elevado e, por volta de 1580, existiam no Brasil cerca de 115 engenhos,
a funcionar com a mo-de-obra de 10 000 escravos. Nesta poca, na Europa, o
6
acar era um produto de tal maneira cobiado que foi apelidado de ouro branco,
tal era a riqueza que gerava.
Em 1747, o qumico alemo Andreas Marggraf desenvolveu uma alternativa
ao acar de cana conseguindo produzir acar cristalizado a partir de suco extrado
de razes de beterraba. O discpulo de Marggraf, Franz Carl Achard, instala, em
1796, a primeira refinaria de acar de beterraba da Europa. O acar obtido no
tinha, no entanto, a qualidade desejvel, sendo ainda bastante caro.
A Primeira Guerra Mundial trouxe graves problemas. Os bombardeamentos
destruram muitas das refinarias de acar de beterraba europeias e foram grandes
as dificuldades em obter mo-de-obra e matrias-primas. No entanto, bastaram
alguns anos para a produo recuperar. Em 1920, a produo de acar de
beterraba corria to bem que se gerou uma crise e os preos acabaram por cair. Em
1937 realizou-se um acordo para regular o mercado de acar e foi criado o
Conselho Internacional do Acar, e em 1968 viria a nascer o mercado comum do
acar, que tornou a Comunidade Europeia o maior produtor de acar de beterraba
do mundo.
Hoje, entre 131 pases produtores de acar, 79 produzem acar de canade-acar e fornecem 3/4 da produo mundial de acar. O maior produtor o
Brasil, seguido pela ndia. O acar tornou-se um alimento comum dieta de todos
os pases, constituindo uma fonte de energia de fcil e rpida assimilao.
Consumido com moderao contribui para uma dieta equilibrada, proporcionando
um sabor agradvel aos alimentos. Para alm disso, o sabor doce um dos mais
apreciados pelo ser humano, o que torna o acar um dos alimentos capazes de
oferecer momentos de bem-estar e de prazer. [2]
2.1.2 Refinao
O produto obtido nas fbricas de acar de cana, acar bruto, no apresenta
uma qualidade suficiente, sob o ponto de vista qumico e microbiolgico, para ser
comercializado directamente para consumo humano.
Assim, o acar bruto deve ser purificado para obter a qualidade desejada.
Esta purificao efectuada num processo denominado Refinao.
O acar bruto transportado a granel das fbricas de acar para as

refinarias. Nas refinarias o acar bruto armazenado em silos, normalmente na
forma de capela. Dos silos o acar transportado por tapetes de banda para a
seco de Afinao. [3]
Na Afinao o acar bruto misturado com xarope de afinao (inicialmente
com gua) a 76 C, produzindo-se o magma de afinao. Este magma ento
centrifugado em centrfugas descontnuas de alta velocidade. Na centrifugao o
acar separado nas redes lavado com gua quente. O acar obtido na
centrifugao, o acar afinado, dissolvido com gua quente ou guas doces
obtendo-se o licor de afinao.
O xarope separado nas centrfugas, o xarope de afinao, usado para
formao do magma de afinao. O excesso de xarope de afinao enviado para
a seco de Recuperao.
Devido ao alto teor de substncias em suspenso no licor de afinao, este
deve ser clarificado antes das etapas de Descolorao e Cristalizao. Esta
clarificao pode ser efectuada usando um de trs processos:
Filtrao;
Carbonatao;
Fosfatao.
No primeiro processo, adiciona-se ao licor de afinao um auxiliar de filtrao

e efectuada uma filtrao atravs e uma pr-camada de auxiliar de filtrao em
filtros de placas, membranas ou rotativos. Este processo no econmico para
grandes capacidades e grandes contedos de substncias em suspenso no licor.
Na Carbonatao a filtrao do licor de afinao efectuada atravs de um
precipitado de carbonato de clcio. O precipitado obtido fazendo reagir hidrxido
de clcio, adicionado ao licor de afinao, com anidrido carbnico obtido das
caldeiras de produo de vapor. Durante a precipitao algumas impurezas de alto
peso molecular existentes no licor so co-precipitadas com o carbonato de clcio.
Depois da formao do precipitado, este filtrado em filtros de placa, membrana ou
rotativos.
Na fosfatao obtm-se um precipitado fazendo reagir o hidrxido de clcio,

misturado ao licor de afinao, com cido fosfrico. O fosfato de clcio formado
misturado com ar favorecendo a sua flutuao no licor. Para aumentar a separao
de corantes aninicos so usualmente adicionados polmeros catinicos. A
separao do precipitado formado efectuada em clarificadores.
O licor clarificado ento descolorado antes de ser concentrado e
cristalizado. Os principais sistemas de descolorao so:
Por resinas de permuta inica;
Por carves adsorventes (em p ou granulados);
Por oxidao (perxido de hidrognio ou ozono).
O licor final ento concentrado em evaporadores de mltiplo efeito

(normalmente dois efeitos). O licor obtido, licor concentrado, ento cristalizado
para se obter o acar branco.
Para se obter o acar branco o licor concentrado normalmente cristalizado
em trs etapas (trs cozeduras).
As massas cozidas obtidas nestas cristalizaes so centrifugadas em
centrfugas de alta velocidade onde os cristais de acar so separados do xarope
me da cristalizao.
O acar sado das centrfugas, com uma humidade de cerca de 1,5%, seco
em secadores com uma corrente de ar quente. O acar seco ento condicionado
em silos para libertar a humidade ligada. Depois do condicionamento, o acar
peneirado e/ou classificado antes de ser comercializado a granel, em contentores de
1 tonelada, em sacos de 50 kg, em pacotes de 1 ou 2 kg, em saquetas ou noutra
forma. [3]
2.1.3 Monossacardeos
Os monossacardeos (oses) so os acares simples, sendo geralmente
cristalinos, doces e solveis em gua, de frmula estrutural geral [CH2O]n, sendo o
nmero de carbonos superior a 2 (n > 2). Quimicamente estes compostos possuem
diversos grupos hidroxilo (-OH), podendo ser poli-hidroxialdedos (aldoses) ou polihidroxicetonas (cetoses), dependendo do grupo funcional que contm, aldedo ou
cetona, respectivamente.
So molculas no hidrolisveis e redutoras (grupos aldedo e cetona podem
sofrer oxidao), sendo classificadas de acordo com o nmero de tomos de
carbono. O gliceraldedo (aldotriose) e a di-hidroxiacetona (cetotriose) so os
monossacardeos mais pequenos com apenas 3 tomos de carbono (C 3H6O3).
No entanto, as oses mais comuns e importantes nos seres vivos so as aldopentoses e as aldo-hexoses com 5 e 6 tomos de carbono, respectivamente. As
hexoses que se destacam pela sua importncia so a glicose e frutose, que
obedecem frmula de estrutura geral C6H12O6 e so as principais fontes de energia
dos seres vivos. Estas biomolculas so ricas em energia, constituindo os principais
combustveis celulares. O monossacardeo mais abundante a glucose, que se
encontra presente no mel, uvas e outros frutos, assim como no sangue. [4]
2.1.3.1
Glucose
A
glicose,
glucose
ou
dextrose,
um
monossacardeo, o hidrato de carbono mais

importante na biologia. As clulas usam a glucose
como fonte de energia e intermedirio metablico. [5]
A glucose um dos principais produtos da
fotossntese e inicia a respirao celular em
Figura 2.1 Estrutura da Glucose.
procariontes e eucariontes. um cristal slido de sabor

adocicado, de frmula molecular C6H12O6, encontrado na natureza na forma livre ou
combinada.
No metabolismo, a glucose uma das principais fontes de energia e fornece 4
calorias de energia por grama. A glucose hidratada (como no soro glicosado) fornece
10
3,4 calorias por grama. A sua degradao qumica durante o processo de respirao
celular d origem a energia qumica (armazenada em molculas de ATP aproximadamente 30 molculas de ATP por molculas de glucose), gs carbnico e
gua.
A glicose contm seis tomos de carbono e um grupo aldedo e ,
consequentemente, referida como uma aldohexose. A molcula de glicose pode
existir numa forma de cadeia aberta (acclica) e anel (cclica). Em soluo aquosa as
duas formas esto em equilbrio, e em pH 7 a forma cclica predominante. Como o
anel contm cinco tomos de carbono e um tomo de oxignio, o que lembra a
estrutura do pirano, a forma cclica da glucose tambm referida como
glucopiranose. Neste anel, cada carbono est ligado a um grupo hidroxilo lateral
com excepo do quinto tomo, que se liga ao sexto tomo de carbono fora do anel,
formando um grupo CH2OH.
2.1.3.2
Frutose
Frutose,
tambm
conhecida
como
acar das frutas, um monossacardeo

(C6H12O6), com os carbonos dispostos em
anel. [6]
tambm conhecida como levulose,
pois uma soluo saturada capaz de
Figura 2.2 Estrutura da Frutose.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro
transformar luz linearmente polarizada em luz circularmente
polarizada, com rotao
ptica para esquerda. mais doce que a sacarose, que o acar refinado comum,
encontrado na cana-de-acar.
Como possui um grupo cetona como grupo caracterstico, a frutose
considerada uma cetose. Como possui 6 carbonos, considerada uma hexose. ,
portanto, uma cetohexose. Tem uma estrutura em anel pentagonal com dois grupos
hidroxi-metilo.
No organismo humano, a frutose fosforilada a frutose-6-fosfato pela
hexocnase, seguindo, posteriormente, para a gliclise onde metabolizada a ATP.
No fgado, contudo, a frutose transformada em gliceraldedo-3-fosfato e s depois
11
entra na via glicoltica. Desta forma, entra depois do maior ponto de regulao da
actividade glicoltica, a reaco catalisada pela cnase da frutose fosforilada. Assim,
um consumo excessivo de frutose leva a uma saturao da via glicoltica, o que leva
formao de elevadas quantidades de acetil-CoA o que aumenta a biossntese de
cidos gordos, provocando acumulao de gorduras no tecido adiposo.
A frutose e a glicose esto fortemente presentes nas uvas, e so a base
qumica do vinho. A aco de leveduras sobre estes acares (e nunca sobre
sacarose) faz a transformao dos acares em lcool etlico e gs carbnico.
Assim como a glucose, a frutose tambm se apresenta em duas formas:
cadeias abertas (acclicas) e cadeias fechadas (hemiacetal).
Em soluo aquosa, a forma tautomrica predominante a beta-Dfrutopiranose (73% a 20 C), seguida da forma beta-D-frutofuranose (20%).
Em forma cristalina, a anlise de raio X mostra que a forma adoptada a
beta-D-frutopiranose. [7]
Figura 2.3 - Relao entre os ismeros da frutose em forma acclica e cclica (hemiacetal).
2.1.4 Dissacardeos
As molculas de dissacardeo so relativamente pequenas e solveis em
gua, podendo alterar o equilbrio osmtico das clulas. So tambm a principal
forma de transporte dos hidratos de carbono.
12
Exemplos de dissacardeos importantes e comuns so a sacarose, maltose e

a lactose.
2.1.4.1
Sacarose
um dissacardeo formado
pela unio de uma molcula de

glicose e uma de frutose atravs de
uma lidao glicosdica,. Encontra-
C1
C2
se em abundncia na cana-deaucar, frutas e beterraba. [8]
Figura 2.4 Estrutura da Sacarose.
A sacarose, o acar comum comercial, hidrolisada com grande facilidade

por cidos diludos, resultando de uma mistura equimolar de D-glicose e D-frutose,
que levogira, porque a frutose possui rotao especfica negativa (-92,4) mais alta
do que a rotao especfica positiva da glicose (+52,7). A reaco chamada de
inverso e estritamente monomolecular, isto , a fraco da sacarose presente,
cindida por unidade de tempo, constante. Assim, a velocidade da reaco depende
exclusivamente da concentrao de sacarose.
A sacarose no um acar redutor. Isso significa que os dois grupos
redutores dos monossacardeos que a formam esto envolvidos na ligao
glicosdica, ou seja, o tomo de carbono C1 da glicose e C2 da frutose devem
participar da ligao.
2.1.4.2
Maltose
A maltose a principal substncia de
reserva da clula vegetal, tambm a juno de

duas molculas de glicose. Ao realizar a
digesto o amido passa a ser primeiramente
maltose
depois
glicose.
maltose
Figura 2.5 Estrutura da Maltose.
13
encontrada em vegetais, e tem funo energtica. [9]
2.1.4.3
Lactose
Lactose (galactose -1,4 glucose) um
tipo de glicdio que possui ligao glicosdica.

o acar presente no leite e seus derivados.
A lactose formada por dois hidratos de
carbono
menores,
chamados
monossacardeos, a glicose e a galactose,

sendo, portanto, um dissacardeo. [10]
Figura 2.6 Estrutura da Lactose.
O leite humano contm de 6-8% de lactose e, o de vaca, de 4-6%.

fracamente doce. As leveduras no a fermentam, mas podem ser
adaptadas para faz-lo. Lactobacilos transformam a lactose em cido lctico.
2.1.5 Acar no organismo

Juntamente com o oxignio, os acares so a principal fonte de energia da
clulas do corpo, indispensvel a todas as reaes metablicas que fazem o corpo
funcionar. O acar da cana uma fonte de energia rpida, de utilizao imediata. O
consumo de acar, em doses adequadas, tambm favorece a liberao de
substncias que produzem sensao de bem estar. [11]
No entanto, o acar no usado pelo organismo ser armazenado no corpo,
criando depsitos de gordura e aumentando o nvel de acar no sangue. Por isso, o
consumo excessivo do alimento est relacionado ao aumento da obesidade, da
diabetes e da sndrome metablica, um conjunto de distrbios que aumenta o risco
de doenas cardacas.
Um ponto negativo do excesso de consumo de acares a sobrecarga no
pncreas para produo de insulina1, que mantm os nveis de glicose controlados
no sangue. Esta deficincia pode levar diabetes tipo 2. O consumo exagerado de
1
O pncreas rgo responsvel pela produo de insulina.
14
acar pode contribuir para elevar o nvel de triglicridos, gordura perigosa, que ao
se acumular pode obstruir as artrias. O resultado pode ser a maior probabilidade de
desenvolver doenas cardiovasculares.
A figura 2.7 mostra, esquematicamente, a regulao da concentrao de
glicose no sangue, face a uma elevada ou a uma reduzida taxa de glicose.
Figura 2.7 Regulao da concentrao de glicose no sangue, face a uma elevada ou a uma reduzida taxa de
glicose. Figura adaptada de [http://revistaescola.abril.com.br/ensino-medio].
15
2.2
Cromatografia
Devido a facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao de

espcies qumicas, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os mtodos
analticos modernos, podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras
tcnicas instrumentais de anlise. [12]
Sendo a cromatografia um mtodo fsico-qumico, ela fundamenta-se na
migrao diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a
diferentes interaces entre duas fases imiscveis, sendo uma fase fixa que tem uma
grande rea superficial chamada fase estacionria, e a outra um fluido que se move
atravs da fase estacionria, designada por fase mvel. [13, 14]
Atribuida ao botnico russo Mikhael Semenovich Tswett,
a descoberta da cromatografia como tcnica analtica ocorreu
em 1906, quando este descreveu a sua experincia na
separao dos componentes de extrato de folhas. Neste
estudo
botnico
conseguiu
separar
pigmentos
de
cloroplastos em folhas verdes de plantas, onde usou uma

coluna de vidro recheada com carbonato de clcio como fase
estacionria e ter de petrleo como fase mvel, ocorrendo a
Figura
separao de componentes em faixas coloridas, este fato deu
russo Mikhael Semenovich
2.8
Botnico
Tswett.
origem ao nome de cromatografia (chrom = cor e grafie =

escrita) embora o processo no dependa da cor. Apesar de estudos semelhantes
terem sido desenvolvidos, Tswett foi o primeiro a compreender e interpretar este
processo como aceite atualmente, utilizando o termo cromatografia para descrever
as zonas coloridas que se moviam dentro da coluna. [14]
A tcnica cromatogrfica foi praticamente ignorada at a dcada de 30
quando foi redescoberta por Kuhn e Lederer que apefeioaram a cromatografia em
coluna, separando e identificando as xantofilas da gema de ovo, utilizando uma
montagem semelhante de Tswett, com carbonato de clcio como fase estacionria
e ter de petrleo como fase mvel. A partir da a cromatografia foi aperfeioada e,
em conjunto com os avanos tecnolgicos, foi levada a um alto grau de sofisticao
que resultou no seu grande potencial de aplicao em muitas reas. [12, 13]
16
2.2.1 Mecanismos de separao

A separao em cromatografia lquida de alta eficincia pode ocorrer por
partio, absoro, troca inica, fase ligada ou por excluso.
Lquido-lquido ou partio
Com a finalidade de obter a separao de aminocidos, Martin e Synge, em
1941 desenvolveram a cromatografia lquido-lquido (CLL), utilizando como fase
estacionria gua em slica e como fase mvel clorofrmio. Este mtodo
preferencialmente utilizado na separao de compostos no-inicos, polares e que
apresentem baixo a moderado peso molecular. [15]
O mtodo consiste de uma fase estacionria lquida que por adsoro fsica
retida na superfcie da coluna empacotada, geralmente com slica, e de uma fase
mvel, tambm lquida, que passa sobre esta fase estacionria sendo uma destas
polar e a outra apolar. A separao baseia-se na solubilidade da amostra em relao
ao solvente (fase mvel) e fase estacionria, sendo assim os componentes da
amostra que so mais solveis na fase mvel so eludos primeiro enquanto os que
tm maior afinidade com a fase estacionria so selectivamente retidos por ela. [15,
16, 18]
A desvantagem da cromatografia liquido-liquido, que pode acarretar a
deteriorao da coluna, a solubilidade da fase estacionria na fase mvel,
ocasionando a no reprodutibilidade nas separaes repetitivas. A fim de solucionar
este problema pode-se saturar a fase mvel com a fase estacionria atravs de uma
pr-coluna que contenha um percentual elevado da substncia que compe a
mesma, disposta antes do injector; ou tambm ligar a fase estacionria
quimicamente ao material de suporte. [16]
A CLL pode ser dividida em cromatografia lquido-lquido normal (onde a fase
estacionria polar e a fase normal apolar) e em cromatografia com fase reversa
(fase estacionria apolar e fase mvel polar). As fases mveis e estacionrias mais
utilizadas nestes mtodos esto descritas na tabela 2.1. [18]
17
Tabela 2.1 - Fases mveis e estacionrias mais utilizadas na CLL
Fases estacionrias
Fases mveis
Normal
, -oxidipropionitrila Carbowax
(400, 600, 750, etc.
Hidrocarbonetos
hexano
heptano; solventes aromticos: tolueno e

xileno;
Glicis (etileno, dietileno)
saturados:
hidrocarbonetos
saturados
misturados (at 10%) com dioxano, metanol,
Ciano-etil-silicone
etanol, clorofrmio, cloreto de metileno.

Fase reversa
Esqualano
gua
Zipax-HCP
misturas
lcool-gua;
acetonitrilo e misturas acetonitrilo-gua
Ciano-etil-silicone
Cromatografia Lquida com Fase Ligada

Tendo por objectivo solucionar o problema da perda da fase estacionria da
CLL surgiu a cromatografia liquida com fase ligada (CLFL), na qual a fase
estacionria est quimicamente ligada superfcie de um suporte eliminando, assim,
o problema da solubilidade desta na fase mvel. [16]
Nesta forma de cromatografia as fases monomricas e polimricas ligam-se a
uma vasta gama de materiais de suporte. As fases ligadas so geralmente
preparadas por reaces de silanizao. Na superfcie da slica que foi
completamente hidrolisada, por aquecimento com HCl 0,1M por um dia ou dois,
forma-se grupos silanis, estes grupos, posteriormente, iro reagir com cloro-silanos
substitudos formando as fases estacionrias quimicamente ligadas (sendo clorometil-silano amplamente utilizado), como pode ser visto na figura 2.9. [18]
CH3
Si
OH + Cl
Si
CH3
CH3
R
Si
Si
R + HCl
CH3
Figura 2.9 - Reaco de silanizao de um cloro-silano substitudo com silanol.
18
De acordo com o grupo funcional que est ligado ao radical R que se

classifica quanto a fase normal, quando este de natureza polar, e fase reversa
quando este de natureza apolar. Na tabela 2.2 esto descritas as principais
sustncias utilizadas como radical R tanto em fase normal como em fase reversa.
[15]
Tabela 2.2 - Principais radicais R utilizados nas fases estacionrias de cromatografia lquida com fase ligada
Fase normal
Fase reversa
- C2H4CN (ciano)
Cadeia C8 (- octil)
-C3H6OCH2CHOHCH2OH (diol)
Cadeia C18 (-octildecil)
-C3H6NH2 (amina)
-C3H6N(CH3)2 (dimetilamina)
Os grupos silanis que no reagiram podem absorver molculas polares,

levando a mudanas nas propriedades cromatogrficas da fase ligada na
cromatografia com fase reversa, j que esta apresenta a fase estacionria apolar, ou
tambm pode ocorrer a formao de caudas nos picos cromatogrficos,
particularmente com solutos bsicos. Estes efeitos podem ser reduzidos pela
inactivao de grupos silanis que so funcionalizados pela reaco com
trimetilcloro-silano, que em funo do seu tamanho menor, tem a capacidade de se
ligarem a muitos grupos silanis. [18,15]
Lquido-slido ou adsoro
Sendo introduzida inicialmente por Stwett no incio do sculo XX, a
cromatografia lquido-slido (CLS) a forma mais clssica da cromatografia lquida e
devido a recentes adaptaes tornou-se a mais importante tcnica de separao dos
mtodos de HPLC. [15]
Este tipo de cromatografia baseia-se na competio entre as molculas do
soluto e do solvente pelos stios activos do adsorvente, estando relacionada com a
19
interaco entre os grupos funcionais das partculas do suporte da fase estacionria

e os grupos polares das molculas do soluto. [19] Primeiramente uma molcula da
fase mvel passa a ser deslocada da superfcie para que possa ser adsorvida pela
fase estacionria, levando em considerao que esta possui uma superfcie polar,
ter pouca afinidade com grupos apolares que no sero retidos por no terem sido
deslocados da fase mvel. [16]
As fases estacionrias devem permitir a interaco diferencial com os
componentes da amostra a serem separadas. Os grupos que so capazes de formar
pontes de hidrognio sero fortemente retidos pela superfcie do adsorvente assim
como as molculas polarizveis que iro apresentar a interaco dipolo dipoloinduzido, portanto o grau de reteno depende da polarizao de cada molcula ou
grupo funcional, sendo que compostos que contm grupos funcionais polares sero
fortemente retidos pelo adsorvente polar e, portanto, eludos por ltimo, enquanto
que com os solutos apolares ocorrer o contrrio. [15, 16, 19]
Geralmente usa-se como adsorvente, um slido activo com grande rea
superficial, os mais comumente usados so a slica e a alumina. Um aspecto que
deve ser considerado que adsorventes muito activos podem adsorver
irreversivelmente o soluto sendo que a slica que ligeiramente cida pode reter
fortemente solutos bsicos e a alumina que bsica no deveria ser usada em
cromatografia de compostos sensveis a bases. [18]
A escolha do solvente de extrema importncia neste mtodo devido ao facto
deste competir com o soluto pelos stios activos do adsorvente, pois quanto mais
forte a interaco da fase mvel com a estacionria, menor a adsoro do soluto. Os
solventes so classificados de acordo com sua srie eluotrpica, ou seja, a sua
capacidade de absoro, que so utilizadas na escolha do melhor solvente a ser
utilizado para uma determinada separao. Este tambm deve ser puro, pois
impurezas podem afectar tanto a eficincia da coluna como a deteco. [18]
Cromatografia por troca inica
20
A cromatografia por troca inica um mtodo de absoro que se baseia na

interaco electrosttica entre o soluto e a fase estacionria, buscando o equilbrio
de troca entre ies em soluo e ies de mesmo sinal na superfcie de um slido que
deve ser insolvel e de alto peso molecular. A amostra a ser separada geralmente
uma soluo aquosa contendo ies orgnicos e inorgnicos. Na superfcie da fase
estacionria caties e anies so covalentemente ligados e ies so trocados com a
fase mvel, separando assim os ies que no interagem com a resina daqueles que
se ligam com os grupos carregados. [15, 19]
A fase estacionria utilizada neste mtodo, geralmente, uma resina de
poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno qual so ligados os grupos inicos.
As trocas podem ser catinicas ou aninicas o que depende da natureza da fase
estacionria. Os stios activos mais comuns para as resinas permutadoras de caties
so o grupo cido sulfnico -SO3-H+, um cido forte, e o grupo cido carboxlico COO-H+, um cido fraco. E para os trocadores de anies so os que contm grupos
amina tercirias -N(CH3)3+OH-, base forte, e aminas primrias N+OH-, base fraca.
Os grupos inicos possuem contra-ies que so deslocados por ies de carga
similar da fase mvel. Nas trocas catinicas, as resinas possuem stios activos
negativos e contra-ies com carga positiva, de forma que os caties da resina sejam
trocados pelos caties da amostra. Nas trocas aninicas, ocorre o contrrio, os stios
activos da resina tm carga positiva e o contra-io tem carga negativa permitindo a
troca destes com a fase mvel. O esquema das trocas catinicas e aninicas pode
ser visualizado na figura 2.10. [15, 16, 19]
X-
R+Y-
Y-
R+ X- (troca aninica)
X+
R-Y+
Y+
R- X+ (troca catinica)
Figura 2.10 - Esquema de troca inica da Cromatografia por Troca Inica
Atravs da alterao do pH ou aumento da troca inica, que leva ao

enfraquecimento das interaces electrostticas, a fase mvel deve ser modificada,
a fim de eluir o soluto da resina. [19]
21
Geralmente os compostos que so separados por este mtodo so cidos

carboxlicos, bases orgnicas, peptdeos e aminocidos, que podem ionizar-se em
solues com pH devidamente tamponado, bem como anies inorgnicos e caties
metlicos ou complexos. [20]
Cromatografia por excluso

Geralmente utilizada na separao de componentes de alto peso molecular, a
cromatografia por excluso (CE) baseia-se na separao de acordo com o tamanho
efectivo das molculas. Este mtodo subdividido em cromatografia por filtrao em
gel (GFC) e cromatografia com permeao em gel (GPC). A GFC utilizada na
separao de espcies solveis gua (polares) sendo a fase estacionria hidroflica,
na GFC os solventes utilizados so orgnicos apolares e fases estacionrias
hidrofbicas, o que torna o mtodo complementar, sendo que podem ser analisadas
substncias polares e apolares. [15, 18]
Pelo facto de no haver interaces fsicas ou qumicas entre o soluto e a
fase estacionria, a CE difere dos demais mtodos cromatogrficos. O principal
mecanismo de reteno das molculas do soluto a penetrao diferenciada destas
no interior das partculas do gel. A coluna empacotada com matria inerte com
poros de tamanho controlado, ao entrar em contacto com a fase estacionria as
molculas pequenas ficam retidas no interior dos seus poros apresentando maior
tempo de reteno e sendo eludas mais lentamente pela fase mvel, enquanto que
as molculas maiores, que no conseguiram penetrar nos poros, so carregadas
pela fase mvel, tendo, portanto, menor tempo de reteno. [15, 16, 18]
Utiliza-se este mtodo na separao de materiais orgnicos e inorgnicos,
mas a sua maior utilidade no estudo de biomolculas ou de compostos com alto
grau de polimerizao. O material utilizado no empacotamento da coluna deve ter
estrutura rgida a fim de facilitar o empacotamento, e que sejam capazes de suportar
as presses elevadas da cromatografia lquida de alta eficincia. Geralmente o
empacotamento da coluna para este mtodo feito por polmeros e partculas de
slica, ambos com dimetro de 5 a 10m. [15, 18]
22
2.2.2 Tipos de cromatografia

A classificao dos mtodos cromatogrficos pode ser quanto ao mecanismo
de separao, quanto a tcnica utilizada, e em relao ao tipo de fase utilizada. No
entanto, a classificao mais popular a que leva em considerao o tipo de
superfcie na qual ocorre a separao (figura 2.10), sendo dividida em cromatografia
em coluna e cromatografia planar. [13]
Cromatografia
Planar
Camada
fina
Coluna
Lquida
Papel
Clssica
Fluido
Supercrtico
Gasosa
HPLC
Figura 2.10 Diagrama resumo dos tipos de cromatografia.
2.2.2.1
Cromatografia planar
A separao ocorre numa superfcie plana, geralmente uma placa de vidro ou

metal, impregnado com a fase estacionria ou ento numa folha de papel embebida
com um solvente apropriado. Este mtodo divide-se em cromatografia em camada
fina e cromatografia em papel. [13]
Cromatografia em camada fina

A cromatografia em camada fina uma ferramenta para anlises qualitativas
rpidas e extremamente efectiva e conveniente para esse propsito. tambm
conveniente para o isolamento de pequenas quantidades de fraces de misturas
complexas ou na purificao de substncias. A fase estacionria constituda de um
slido finamente dividido que reveste um material de suporte rgido e inerte de modo
23
que o processo de separao ocorre numa superfcie plana, essencialmente

bidimensional, ao conjunto denomina-se placa de cromatografia.
A cromatografia desenvolve-se com a fase mvel migrando atravs da fase
estacionria por aco da capilaridade e a este processo chama-se corrida. Como a
amostra interage com a fase mvel e a fase estacionria, medida, que o solvente
vai ascendendo na placa a amostra vai sendo arrastada pelo solvente numa
velocidade que depende da atraco do soluto pela fase estacionria. Assim,
diferentes solutos com diferentes interaces com a fase estacionria seriam
arrastados a velocidades diferentes e, a partir de uma nica mancha seria obtido um
cromatograma com vrias manchas, tantas quanto os componentes de mistura. [21]
A separao consiste no deslocamento diferencial sobre uma camada fina de
adsorvente retido sobre uma superfcie plana. O processo de separao
fundamenta-se na adsoro, mas quando so utilizadas fases estacionrias tratadas
pode ocorrer partio ou troca inica, podendo ento ser utilizada tanto na
separao de substncias hidrofbicas como hidroflicas. [22]
Cromatografia em papel
Classificada como cromatografia de partio lquido-liquido, na qual a
separao dos componentes est relacionada com as diferentes solubilidades
relativas destes componentes nas fases mveis e estacionria. Os componentes que
tm maior solubilidade na fase estacionria so selectivamente retidos e
movimentam-se mais lentamente ao longo do papel, enquanto que os componentes
com maior solubilidade na fase mvel movem-se mais rapidamente. [23]
um mtodo de separao em funo do deslocamento diferencial de solutos
arrastados por uma fase mvel, sendo retirados selectivamente por uma fase
estacionria lquida, na cromatografia com fase normal. Uma mancha de amostra
depositada perto da base de um pedao de papel filtro e este colocado numa
cmara de desenvolvimento. O solvente migra por capilaridade e os componentes
movem-se a diferentes velocidades. [21]
Esta tcnica utiliza pequena quantidade de amostra, tem boa capacidade de
resoluo e preferencialmente aplicada na separao e identificao de
componentes polares. [23]
24
2.2.2.2
Cromatografia em coluna
A separao ocorre no interior de um tubo de vidro ou metal. De acordo com

o estado fsico da fase mvel distingue-se a cromatografia gasosa, a cromatografia
de fludo supercrtico ecromatografia lquida. [13]
Embora nas demais modalidades a unidade de separao possa ser
preparada pelo usurio para fins de pesquisa ou reduo de custos, no prtica
aconselhvel para aqueles que desejam executar experincias reprodutveis. Nestes
casos, produtos comerciais produzidos em srie apresentam maior homogeneidade,
o que se traduz em maior confiabilidade nos resultados.
Cromatografia gasosa
Neste mtodo a fase estacionria pode ser slida, com uma grande rea
superficial, ou lquida, onde uma pelcula delgada lquida recobre um slido inerte; e
a fase mvel um gs denominado gs de arraste, sendo este inerte tem a
finalidade de transportar as molculas a serem separadas. Assim, uma corrente de
gs elui continuamente pela coluna e quando a amostra vaporizada ela introduz-se
nesta corrente sendo arrastada atravs da coluna. [13, 24]
Cromatografia com fluido supercrtico (CSC)

Neste mtodo um gs ou um lquido no estado supercrtico utilizado como
fase mvel, possuindo propriedades do solvente que se situam entre as de um
lquido e de um gs. Existe uma presso na qual o lquido e o vapor esto como
fases separadas, acima do ponto crtico, independente da presso, existir apenas
uma fase que chamada de fluido supercrtico. Quando comparada com a
cromatografia lquida este mtodo proporciona um aumento na resoluo e na
velocidade, pois o coeficiente de difuso do soluto maior em fludos supercrticos.
Em relao cromatografia gasosa este tem menor resoluo e velocidade, mas
capaz de dissolver solutos no-volteis. [13, 25]
25
Cromatografia lquida
A fase estacionria utilizada neste mtodo, como na cromatografia gasosa,
pode ser um slido ou um lquido e como fase mvel utiliza-se um lquido no qual o
soluto est dissolvido, assim, enquanto a fase mvel elui sobre a fase estacionria
os solutos so separados de acordo com a interao destes com as fases, sendo
eludo primeiro os que tm maior afinidade com a fase mvel e posteriomente os que
tm maior afinidade com a fase estacionria. A cromatografia lquida pode ser
dividida em:
Cromatografia lquida clssica (CLC): este mtodo utiliza colunas
com dimetros relativamente grandes, empacotadas com fases estacionrias
finamente divididas, pelas quais passam as fases mveis sob ao da
gravidade. Separa misturas bastante complexas, porm demorada e
necessita que seja feito exame qumico ou espectroscpico das fraes
colhidas.
Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC): Utiliza colunas
fechadas que contm partculas muito finas que proporcionam separaes
muito eficientes, so utilizadas altas presses para forar a passagem do
solvente e assim diminuir o tempo da anlise.
2.2.3 HPLC
Sendo um dos mais novos e mais importantes membros das tcnicas de
separao, a cromatografia lquida de alta eficincia tem aplicao indispensvel em
vrios laboratrios. Ela utiliza equipamentos muito sofisticados que podem ser
totalmente automatizados.
Neste mtodo so utilizadas pequenas colunas, nas quais uma fase mvel
lquida elui sobre a fase estacionria que est em seu interior. Emprega-se alta
presso na separao dos componentes da amostra de forma a ser capaz de
completar a anlise em alguns minutos. [16, 26]
26
Inicialmente a cromatografia lquida utilizava colunas de vidro com dimetro

de 1 a 5 cm e comprimento de 50 a 500 cm, sendo o dimetro das partculas das
fases estacionrias slidas geralmente entre 150 a 200m, nestas condies o fluxo
era muito baixo, da ordem de alguns dcimos de milmetros por minuto, tornando os
tempos de separao muito longos. Na tentativa de acelerar o processo foi utilizado
bombeamento e aplicadas bombas de vcuo, o que no foi eficiente, pois o aumento
do escoamento fazia com que aumentasse tambm a altura dos pratos tericos.
Alguns cientistas j haviam percebido, no incio do desenvolvimento da
cromatografia, que a diminuio das partculas da fase estacionria poderia
aumentar a eficincia da coluna, mas somente nos anos 60 foi possvel rechear as
colunas com partculas pequenas, necessrias para aumentar a resoluo, e
tambm, adquirir equipamentos que funcionam a alta presso, o que necessrio
para uma boa velocidade de eluio. [15, 16]
O avano considervel da cromatografia lquida deu-se por volta de meados
dos anos 60, sendo o primeiro cromatgrafo lquido de uso prtico construdo em
1964 por Csaka Horvath na Universidade de Yale. Este operava em presses de at
1000psi (6897kPa ou 6897bar), com fase mvel em gua tamponada passando por
colunas de 1mm de dimetro interno e com detector de espectrmetro de
ultravioleta. As primeiras misturas separadas continham cidos nucleicos. [18]
Diferenas entre a CLC e a HPLC

A cromatografia lquida clssica utiliza-se de um equipamento barato no qual
o empacotamento da coluna descartado, pois parte da amostra pode se adsorver
de forma irreversvel; a coluna deve ser cheia a cada separao acarretando
desperdcio de material e de mo-de-obra. O analista deve ser experiente e a
eluio feita pela aco da gravidade tornando o processo moroso. A quantificao
e deteco so feitas pela anlise manual das fraces individuais, o que requer
muito tempo devido ao grande nmero de fraces colhidas, tambm pode ser
usada alguma tcnica que auxilie neste processo, como, espectrofotometria, anlise
qumica ou registo gravimtrico, e os resultados so registrados em forma de
cromatograma, um grfico da concentrao da amostra versus o nmero da fraco.
Estas etapas podem ser vistas na figura 2.11. [16, 26]
27
Preparao
de coluna
Aplicao de
Amostra
Eluio
Deteco e
Quantificao
Evaporar para
pesagem
Anlise
Qumica
Espectrofotom
trica
Figura 2.11 - Etapas da cromatografia lquida clssica
Na cromatografia lquida de alta eficincia (figura 2.12) o circuito fechado,

podendo ser utilizada inmeras vezes. As colunas utilizadas so bastante eficientes,
mas oferecem resistncia vazo da fase mvel necessitando a aplicao de
sistemas de bombas de alta presso, que fazem com que a velocidade da eluio
aumente. As anlises so mais precisas, pois a vazo da fase mvel facilmente
controlada. A injeco feita com microsseringas ou atravs de vlvulas de injeco
e podem ser utilizados diversos tipos de detectores. Este mtodo no necessita de
tanta experincia do operador, tem alta resoluo, sensibilidade e reprodutibilidade,
mas dispe de equipamentos caros e de alto custo de manuteno e operao. [16,
19]
Figura 2.12 - Etapas da cromatografia lquida de alta eficincia
Comparao da CG com a HPLC

Na cromatografia gasosa as amostras devem ser volteis, para que possam
passar pela coluna na forma de vapor, e termicamente estveis, a fim de que no se
decomponham nas condies da separao. Isso faz com que somente gases e
cerca de 20% dos compostos orgnicos possam ser analisados por este mtodo
28
sem que suas estruturas sejam modificadas para aumentar a sua volatilidade. A
amostra no deve interagir com a fase mvel, por este motivo que a fase mvel
um gs inerte tendo como funo somente carregar a amostra volatilizada. Neste
mtodo os equipamentos so mais baratos e o tempo de anlise reduzido. [16, 19,
26]
Na HPLC as amostras no precisam ser volteis nem termicamente estveis,
basta que sejam solveis na fase mvel, por isso tem uma maior aplicao. A
amostra interage com as duas fases, o que faz com que tenha maior variedade de
mecanismos de separao, enquanto que na CG a amostra s interage com a fase
estacionria. Este mtodo possui maior versatilidade, pois pode ocorrer a variao
tanto na fase mvel como na fase estacionria, o que no ocorre na CG, pois a fase
mvel sempre um gs inerte. As principais caractersticas de ambos os mtodos
esto descritas na tabela 2.3. [19, 26]
Tabela 2.3 - Principais caractersticas da CG e HPLC
Parmetros
CG
HPLC
Fase mvel
Gs inerte
Lquida
Fase estacionria
Lquida ou slida
Lquida ou slida
Tamanho da coluna
1,0 a 100,0m
Menor que 30,0cm
- Injectado
Gs ou lquido
Lquido
- Detectado
Gs
Lquido
Temperatura da coluna
100 a 300C
De ambiente a 65C
Tempo de reteno
Tempo de reteno
10-12g
10-9g
Fase do composto
Identificao dos sinais

cromatogrficos
Quantidade mnima
detectvel
Ionizao em chama
Detectores mais usados
ou captura de
electres
Pratos tericos por coluna
2.000 a 3000.000
Absorbncia do UVVIS
500 a 25.000
29
2.2.3.1 Fases
Em HPLC pode-se distinguir fase mvel e fase estacionria. De seguida
procede-se classificao de cada uma das fases mencionada.
Fases Mveis
Para que um solvente possa ser utilizado como fase mvel na HPLC este
deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fcil purificao. Deve dissolver a
amostra sem decompor os seus componentes, para que estes sejam transportados
pela coluna sem que haja modificao. No deve dissolver a fase estacionria e
deve ser compatvel com o detector.
A fase mvel deve ter baixa viscosidade, pois isso ir interferir directamente
na eficincia da separao, devido ao facto de solventes viscosos alm de
dificultarem a transferncia de massa entre a fase mvel e a fase estacionria,
tambm influenciarem na intensidade da vazo. [16]
Se durante a separao for utilizado um nico solvente de composio
constante a eluio chamada de isocrtica. Mas algumas amostras que so
formadas de componentes que necessitam de uma separao por gradiente, para
que esta seja mais eficiente, requerem mudana na composio da fase mvel
durante a anlise, com a variao da proporo entre os solventes, que geralmente
diferem entre si na polaridade. A separao por gradiente tem as vantagens de
reduzir
tempo
de
anlise,
aumentar
resoluo
reproduzir
sinais
cromatogrficos mais finos e mais simtricos. Mas tambm apresenta as

desvantagens de aumentar o custo (j que necessita de bomba com misturador),
no ser compatvel com todos os detectores (como por exemplo, com o detector de
ndice de refraco), ter menor estabilidade da linha de base pela variao da fase
mvel e tambm pode degenerar a coluna, sendo necessrio fazer a sua
regenerao, pois a mudana na fora da fase mvel, no incio e no final da
cromatografia, elevada. [15, 26]
Uma fase mvel adequada indispensvel para a HPLC, por isso
necessrio examinar factores que determinam a sua escolha, como a polaridade
desta, que determina seu poder de eluio juntamente com a polaridade da fase
estacionria e com a natureza dos componentes da amostra. Se a separao for
com fase normal, o poder de eluio aumenta com o aumento da polaridade, se a
30
separao for em fase reversa, o poder de eluio diminui com o aumento da

polaridade. Outros factores que tambm devem ser considerados so o ponto de
ebulio, a viscosidade, a compatibilidade com o detector e a toxicidade. [18]
Fases Estacionrias
As fases estacionrias a serem utilizadas na HPLC devem ter alta resoluo
entre os componentes da amostra, devem ser de fcil introduo na coluna, ter
dimetro uniforme e partculas porosas ou peliculares. [16, 26]
As partculas da fase estacionria podem ser classificadas quanto ao seu
tamanho em: macropartculas (quando apresentam dimetro entre 20 e 40m)
intermedirias (quando tem entre 20 e 10m) e micropartculas (de 3 a 10m).
Quanto menor for a partcula, maior ser a eficincia da separao, melhorando
assim o processo de difuso das molculas da amostra dentro e fora das partculas,
pois partculas menores reduzem a distncia de contacto do soluto com as fases
estacionria e mvel, facilitando o equilbrio e, consequentemente, melhorando a
eficincia da coluna.
Elas podem ser de formato esfrico, tambm chamado de regular, e de
formato irregular, sendo que as regulares so mais eficientes por oferecerem um
enchimento mais uniforme e mais reprodutvel da coluna e por esse motivo so mais
caras. [19, 26]
De acordo com a natureza das fases mvel e estacionria pode-se classificar
o processo como: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa:
Cromatografia em fase normal: neste mtodo a fase estacionria

utilizada polar e a fase mvel apolar, em relao eluio, os
solutos mais apolares so eludos primeiramente, enquanto que os
polares so retidos pela fase estacionria e so eludos por ultimo.
[18]
Cromatografia com fase reversa (FR): a fase estacionria apolar

e a fase mvel polar, portanto os compostos polares so eludos
primeiro e os mais apolares eludos posteriormente. [18]
31
Sendo o material mais utilizado como empacotamento de colunas a slica, que

consiste principalmente em dixido de silcio (SiO2) com o tomo de silcio no centro
de um tetraedro, sendo a valncia remanescente na superfcie ocupada por um
hidroxilo (-OH) (figura 2.13). Esta no deve ser utilizada em pH acima de 8,0, pois
isso acarretaria a sua dissoluo. Ento, para a cromatografia de compostos bsicos
com pH entre 8,0 e 12,0 recomenda-se o uso de compostos polimricos como
poliestireno, ligado covalentemente fase estacionria. [19, 25]
Figura 2.13 - Estrutura esquemtica da slica gel.
Uma superfcie de slica tem cerca de 8mol de grupos silanol (Si-OH) por
metro quadrado, em pH entre 2,0 e 3,0 estes encontram-se completamente
protonados e numa ampla faixa de pH acima de 3,0 dissociam-se em Si-O-, que se
ficarem expostos podem reter fortemente bases protonadas (como RNH 3+),
provocando a formao de caudas nos sinais cromatogrficos. [25]
A slica sozinha pode ser usada como fase estacionria para a cromatografia
de adsoro, j para sua utilizao na cromatografia de partio esta deve estar
quimicamente ligada, na qual dependendo do radical R esta pode ser utilizada como
fase normal ou fase reversa. A fase estacionria de octadecil (C 18) a mais utilizada
na cromatografia lquida de alta eficincia, sendo representada por ODS
(octadecilsilano). [25] Alguns tipos de fases estacionrias para HPLC esto descritos
na tabela 2.4.
32
Tabela 2.4 - Tipos de fases estacionrias para HPLC
Descrio
Polaridade/ interaco
Octadecil (C18)
Altamente apolar
Octil (C8)
Moderadamente apolar
Etil (C2)
Fracamente apolar
Metil (C1)
Fracamente apolar
Fenil (PH)
Cicloexano (CH)
Cianopropil (CN)
Moderadamente apolar/polar
Diol ( 2 OH)
Polar
Slica (Si)
Polar
cido Carboxlico (CBA)
Troca catinica fraca
cido Propilsulfnico (PRS)
Troca catinica forte
cido Benzenossulfnico (SCX)
Troca catinica forte
Aminopropil (NH2)
Troca aninica fraca/polar
Amina Primria/Secundria (PSA)
Dietilaminopropil (DEA)
Amina Quaternria (SAX)
Troca aninica forte
cido Fenilbornico (PBA)
Covalente
Como fase estacionria, alm da slica, podem ser utilizados slidos semirgidos, que geralmente so constitudos de partculas porosas de poliestireno
entrecruzado com divinilbenzeno. Estes podem ser usados em HPLC por excluso
com fase mvel orgnica e ainda so muito utilizados na cromatografia por troca
inica. [20]
Na cromatografia lquido-slido pode ser utilizada a alumina, alm da slica,
podendo esta tambm ser utilizada na cromatografia lquido-lquido, assim como o
vidro de porosidade controlada, carbono grafitizado, titnio, zircnio e slica
recoberta com zircnio.
33
2.2.3.2 Detectores
Tendo como funo monitorizar o fluxo da fase mvel na sada da coluna, o
detector mede de forma contnua propriedades fsicas ou fsico-qumicas da
amostra, ou da soluo que a contm enviando um sinal para registo que ,
geralmente, directamente proporcional concentrao do componente na amostra.
O detector ideal aquele que apresenta as seguintes caractersticas:
Possuir alta sensibilidade para detectar pequenas quantidades
de amostra;
Ser estvel e insensvel a variaes de temperatura e de fluxo,
no caso de eluies com gradiente;
O sinal deve manter uma relao linear com a concentrao da
amostra;
Deve efectuar uma leitura contnua; [20, 27]
Os detectores dividem-se em duas grandes classes:
Detectores de propriedades macroscpicas, que so aqueles
que medem as alteraes de propriedades fsicas provocadas pelo soluto na

fase mvel;
Detectores de propriedades do soluto, que so aqueles que
respondem a uma dada propriedade qumica ou fsica do soluto e so,

idealmente, independentes da fase mvel.
Os tipos de detectores esto descritos na tabela 2.5. Em HPLC os detectores

mais utilizados so os espectrofotomtricos (UV ou fluorescncia), condutomtricos
e refractomtricos. [18, 28]
34
Tabela 2.5 Detectores utilizados em HPLC
Detector
Limite de
Gradiente
Aplicao
0,1-1
Sim
Selectivo
100-1000
No
Universal
Espalhamento de luz
0,1-1
Sim
Alta massa molar
Electroqumico
0,01-1
No
Selectivo
Fluorescncia
0,0001-0,01
Sim
Selectivo
Espectrometria de massas
0,1-1
Sim
Universal
Infravermelho
1000
Sim
Selectivo
deteco (ng)
Ultravioleta
ndice de refraco
com
transformada de Fourier
2.2.4 Identificao e quantificao

A identificao dos componentes de uma amostra feita atravs da
comparao dos cromatogramas obtidos com padres.
Nestes padres o componente em questo eludo nas mesmas condies
da amostra a ser analisada, tendo a formao de um pico num determinado tempo
chamado de tempo de reteno, sendo assim os componentes so identificados
pelo tempo de reteno. Os cromatogramas so grficos do tempo em minutos pela
resposta do detector.
Os padres so obtidos comercialmente e so analisados em diferentes
concentraes, formando assim uma curva de calibrao. Esta trata-se de um
grfico da concentrao do componente pela rea do pico obtido. Atravs desta
pode-se quantificar os componentes da amostra quando se obtm a rea dos sinais
cromatogrficos.
35
2.3
Quantificao de hidratos de carbono

Para se estimar o teor de acares redutores e acares redutores totais em
alimentos, existem vrios mtodos qumicos no selectivos que fornecem resultados,

com elevado grau de confiabilidade, quando utilizados correctamente aps
eliminao de interferentes.
Os mtodos qumicos clssicos conhecidos para a anlise de acares
redutores so na sua maioria fundamentados na reduo de ies cobre em solues
alcalinas (soluo de Fehling), mas tambm existem mtodos fundamentados na
desidratao dos acares, por uso de cidos concentrados, com posterior
colorao com compostos orgnicos, alm da simples reduo de compostos
orgnicos, formando outros compostos de colorao mensurvel na regio do
visvel. [29]
2.3.1 Variantes
Entre os vrios mtodos quantitativos disponveis para determinao de
acares totais e de acares redutores esto: Musson-Walker; Lane-Eynon;
Somogy e Nelson; mtodos cromatogrficos e mtodos pticos. [29]
O mtodo Musson-Walker fundamenta-se na quantificao do precipitado de
xido cuproso formado aps a reduo de ies cobre bivalentes, em meio bsico,
pelos acares redutores (glicose e frutose). [30]
No mtodo Lane-Eynon os ies cpricos da soluo de Fehling so reduzidos
quantitativamente, sob ebulio, a xido cuproso por titulao com soluo de
acar redutor. O ponto final alcanado quando um pequeno excesso do acar
redutor descolora o azul-de-metileno.
No mtodo de Somogy e Nelson a glicose desproteinada da amostra reduz
sal de cobre, em meio alcalino e a quente. A forma reduzida do sal de cobre actua
sobre o reactivo molbdico determinando o aparecimento da cor azul, cuja
intensidade proporcional ao teor de glicose da amostra. Sob a aco do calor, os
acares redutores decompem-se parcialmente em fragmentos oxidveis pelo
hidrxido cprico, resultando em cido oxlico, malnico, etc. Nesta reaco o
36
hidrxido cprico (azul) reduz-se a hidrxido cuproso (amarelo). Continuando o

aquecimento, o hidrxido cuproso perde uma molcula de gua, transformando em
xido cuproso (vermelho). O xido cuproso assim formado vai reduzir o reactivo
molbdico dando o xido de molibdnio (Mo3O8) de colorao azul, cuja intensidade
proporcional a quantidade de glicose existente na amostra. [30]
No trabalho posteriormente descrito recorreu-se a mtodos cromatogrficos
como meio de separao dos mono e dissacardeos, e a mtodos pticos,
nomeadamente ao ndice de refraco, como meio de identificao e quantificao
dos acares.
2.3.2 Equipamento
A instrumentao bsica de um cromatgrafo lquido consiste nos seguintes
componentes (figura 2.14): Reservatrio do solvente, bomba de alta presso,
misturador de solventes, injetor, microsseringas, loop, coluna, detector, coletor de
solvente, registador e sistema computadorizado para colheita de dados. [19]
Colector de
solvente
Reservatrio
do solvente
Coluna
Sistema
computadorizado de
colector de dados
Microsseringa
Cmara de
mistura
Injector
Detector
Registo
loop
Bomba de
alta presso
Figura 2.14 - Esquema do cromatgrafo lquido.
Sistema de abastecimento da fase mvel

O abastecimento da fase mvel equipado com um ou mais reservatrios
que podem ser de vidro (o prprio recipiente do solvente), de plstico (desde que
este seja inerte), ou de ao inoxidvel, sendo que este no apropriado para fases
37
mveis tamponadas em pH baixo, pois poder ocorrer a corroso do recipiente. [15,

26, 31]
Fases mveis como a gua e outros solventes polares tm tendncia em
dissolverem gases como oxignio e nitrognio e, se estes gases forem libertados
dentro do equipamento, podem formar bolhas na coluna e, no sistema de deteco,
estas bolhas podem causar o alargamento da banda e interferir na eficincia do
detector. Por este motivo, os solventes devem ser desgaseificados, o que pode ser
feito atravs de sistemas de bomba de vcuo, de sistemas de destilao, de
dispositivos de aquecimento e agitao do solvente, sob a ao de ultra-som e
tambm atravs do sistema de borbulhamento que geralmente feito com gs hlio,
por ser um gs inerte e de baixa solubilidade. [15, 31, 32]
Alguns sistemas contem tambm filtros com a finalidade de impedir que a
poeira e particulas no solvente causem danos no sistema de bombeamento e de
injeo e entupimento da coluna. No necessriamente os desgaseificadores e
filtros devem fazer parte do equipamento, um mtodo bastante eficiente passar os
solventes em filtros milipore sob vcuo, antes de introduzi-los no recipiente, o que
ocasiona a remoo dos gases e materiais em suspenso. [15, 16]
Programadores de fase mvel
Quando se utiliza a eluio por gradiente necessria a mudana na

composio da fase mvel, que feita por programadores de fase mvel. Os
solventes utilizados apresentam diferentes polaridades variando a percentagem
destes em mistura binria, ternria ou quaternria, aumentando a fora
cromatogrfica da fase mvel, fazendo assim, com que os sinais cromatogrficos
retidos eluam mais rapidamente. Tambm podem ser utilizados em misturas
isocrticas, em que a fase mvel apesar de ter uma concentrao contnua,
formada por mais de um solvente. Para que a programao seja automtica so
utilizados microcomputadores. Existem dois tipos de programadores: a baixa e a alta
presso. [20]
Nos programadores de baixa presso (figura 2.15) os reservatrios de
solventes esto dispostos em ordem crescente de polaridade e os solventes so
misturados antes da bomba. O gradiente faz-se atravs de uma vlvula ligada ao
38
reservatrio do solvente, sendo que esta programada para ficar aberta at que
saia o volume desejado dos solventes, que sero misturados presso atmosfrica
numa cmara com agitao magntica, posteriormente so enviados a uma bomba
de alta presso, passando pelo injector, coluna e detector. [20]
Controlador
do sistema
Cmara de
mistura
Injector
Vlvulas
Bomba de
alta presso
Reservatrio
do solvente
Figura 2.15 - Programador de fase mvel a baixa presso
Nos programadores de alta presso (figura 2.16) diferentes solventes

alimentam diferentes bombas. A vazo de cada bomba modificada para produzir
os mais variados tipos de gradientes. Os solventes so liberados pelas bombas
estando estes a alta presso e vo para uma cmara de pequeno volume onde so
misturados por agitao magntica, sendo encaminhados posteriormente ao injector,
coluna e detector. [20]
Controlador
do sistema
Injector
Cmara de
mistura
Bomba de
alta presso
Reservatrio
do solvente
Figura 2.16 - Programador de fase mvel a alta presso
Sistema de bombeamento
Devido ao facto de trabalhar com colunas de partculas muito reduzidas, a
cromatografia lquida de alta eficincia necessita que o fluxo da fase mvel seja
constante e a alta presso o que se consegue atravs de um sistema de
bombeamento eficaz. A utilizao de alta presso necessria, pois as partculas
exercem alta resistncia ao fluxo da fase mvel e, se no fosse utilizada, a anlise
39
seria muito lenta. O fluxo deve ser constante para garantir a reprodutibilidade,
sensibilidade e resoluo da anlise. Utiliza-se tambm o sistema de bombeamento
para fazer gradiente de eluio quando os compostos apresentam factor de
separao muito prximo. [26]
Alguns aspectos importantes para o sistema de bombeamento so: presso
mxima de 600bars, vazo contnua, intervalos de vazo de 0,1 a 1mL/min,
reprodutibilidade e constncia da vazo de 1%. [16]
Tendo em considerao o desempenho e caractersticas de funcionamento,
existem basicamente dois tipos de bombas, as pneumticas e as mecnicas. [16]
Bombas pneumticas
Neste tipo de bombas um gs inerte exerce uma presso deslocando o

lquido de forma contnua, a presso pode ser directamente sobre o lquido ou sobre
um recipiente onde o mesmo est contido. Estas bombas so baratas e fornecem
um fluxo que no sujeito a pulsaes, sendo que o fluxo total depende do fluxo do
gs e a presso depende do gs usado e do recipiente. Ela pode ser vista na figura
2.17. [27]
Para a
coluna
Anel
Hermtico
Reservatrio
da fase mvel
Gs
Figura 2.17 - Bomba pneumtica.
Bombas mecnicas
As bombas mecnicas podem ser divididas em bombas recprocas e bombas

tipo seringa:
Bombas recprocas: Consiste de uma pequena cmara na qual o solvente

bombeado pelo deslocamento de um pisto controlado por um motor, desloca
40
fluxos de volume constante, porm de forma descontnua, ou seja, em pulsos.

Esse tipo de bomba pode ser visto na figura 2.18. [15, 27]
Para a
coluna
Anel
Hermtico
Vlvulas
unidireccionais
Do
reservatrio
da fase mvel
Figura 2.18 - Bomba recproca.
Bombas do tipo seringa: Tambm chamadas de bombas de deslocamento

contnuo (figura 2.19), estas bombas so formadas por um pisto que se
move por aco de um mecanismo de rosca, sustentado por um motor, o
fluxo contnuo e sem pulsaes, porm tem capacidade total limitada,
devendo parar para o enchimento aps o fornecimento de uma quantidade
relativamente baixa de solvente. [15, 32]
Para a coluna
Reservatrio
da fase mvel
Anel
Hermtico
Motor
Figura 2.19 - Bomba do tipo seringa.
Medidores e controladores de presso

Problemas no equipamento, como entupimentos ou vazamentos, podem ser
diagnosticados pelos monitores de presso, que tambm podem ser utilizados para
41
aperfeioar a separao. Podem ser utilizados dois tipos de medidores de presso:

Bourbon ou diafragma (figura 2.20) e transdutor de presso (figura 2.21).
Bourbon ou diafragma: no qual um tubo de ao inoxidvel flexvel

preenchido com um lquido viscoso a baixa presso, se expande com o
aumento da presso da fase mvel que vai da bomba para a coluna, essa
expanso desloca o ponteiro acusando o aumento da presso.
Figura 2.20 - Medidor de presso Bourbon
Transdutor de presso: Ao ir da bomba para a coluna a fase mvel exerce

uma presso numa membrana, que sentida no transdutor convertendo a
presso em corrente elctrica, cujo valor medido.
Figura 2.21 - Medidor de presso do tipo transdutor de presso.
Sistema de injeco da amostra

Para se obter uma boa eficincia em anlises cromatogrficas, um factor
muito importante a se considerar a maneira como se introduz a amostra na coluna.
A injeco deve ser reprodutvel e ter grandes variedades de volumes, assim como
no deve introduzir bolhas. Esta parte do instrumento necessita de um cuidadoso
desenho, pois devem resistir a altas presses e as suas cavidades devem ser
42
completamente lavadas pela fase mvel. So duas as formas de injeco da

amostra: com microsseringas e com vlvula rotatria, sendo esta de injeco
automtica. [20, 27]
O injector do tipo seringa apresenta a vantagem de ser mais barato, porm
de baixa reprodutibilidade e necessita de um septo para evitar o retorno da amostra
e do mbolo para fora do injector. O sistema de injeco mais utilizado o da
vlvula rotatria, pois alm de ser reprodutvel, elimina o problema de retorno da
amostra. Neste sistema o volume injectado no necessita ser preciso, pois a vlvula
rotativa tem um capilar de amostragem de volume fixo (loop) capaz de seleccionar
volumes de 1 a 100 L de amostra, sendo o excesso levado para fora do
equipamento. Na figura 2.22 pode ser visualizado o mtodo de injeco da amostra
com a vlvula rotatria. Na posio de carregar (figura 2.22 a) um determinado
volume de amostra carregado enquanto a fase mvel vai directa para a coluna, a
rotao da posio geralmente feita manualmente, assim na posio injectar
(figura 2.22 b), mudam-se as conexes, fazendo com que a fase mvel passe pela
ala de amostragem e arraste a amostra para a coluna. [20, 26]
Figura 2.22 - Vlvula rotatria de amostragem para HPLC: a) posio para carregar e b) posio para injectar.
Coluna
Num cromatgrafo lquido podem existir trs tipos de colunas, a coluna de
saturao, a coluna de guarda e a coluna analtica, como pode ser visto na figura
2.23.
43
Coluna de
saturao
Coluna de
guarda
Coluna
analtica
Figura 2.23 - Tipos de colunas utilizadas em HPLC.
Coluna de saturao
Tambm chamada de pr-coluna, colocada entre a bomba e o injector

sendo usada para condicionar a fase estacionria. Muito empregue no passado
quando se utilizava a cromatografia lquido-lquido com a finalidade de saturar a fase
mvel com o lquido da fase estacionria, no sendo to necessria actualmente
devido ao grande desempenho das fases estacionrias quimicamente ligadas. Mas
ainda pode ser utilizada quando se usam recheios base de slica e uma fase mvel
que dissolve este material, tendo este efeito aumentado com o aumento da
temperatura, polaridade, fora inica e pH da fase mvel, de modo que a fase mvel
estando saturada com fase estacionria, no ir reagir com a fase estacionria
contida na coluna. Pode ser usada tambm para reter impurezas da fase mvel a fim
de preservar a coluna. [20, 26]
Coluna de guarda
Colocada entre o injector e a coluna analtica, esta possui normalmente de 2 a

5cm e tem o mesmo dimetro interno e fase estacionria da coluna analtica.
utilizada para prevenir que impurezas e compostos fortemente retidos, contaminem a
coluna de separao, aumentando assim o seu tempo de uso, portanto a coluna de
guarda deve ser renovada com certa frequncia, pois satura rapidamente. Devido ao
seu pequeno tamanho, em relao ao tamanho da coluna analtica, o custo das
diversas trocas desta ainda muito menor do que uma nova analtica, que
deteriorada rapidamente quando no se usa a coluna de guarda. [20, 26]
44
Coluna analtica
Esta deve ser constituda de algum material inerte, de dimetro uniforme,

capaz de resistir s presses que sero usadas. O material mais utilizado o ao
inoxidvel, mas tambm podem ser constitudas de vidro reforado e slica fundida,
sendo esta ltima mais utilizada na confeco de colunas capilares. As mais usadas
apresentam dimetro interno de 4,6mm, comprimento de 250mm e so recheadas
com partculas porosas com dimetro de 5m. A escolha da coluna feita em
funo da sua capacidade, que determinada pelas suas dimenses, material de
empacotamento, comprimento e dimetro interno. Dependendo do dimetro interno
as colunas podem ser classificadas de diferentes formas, como descreve a tabela
2.6. [20, 26]
Tabela 2.6 - Classificao das colunas de separao
Nome
Colunas
Comprimento
Dimetro
Vazo
Tamanho de
(cm)
interno (mm)
(l min-1)
partcula (m)
3-10
2-6
1.000-5.000
5-30
2-6
1.000-3.000
3; 5; 10
10-100
1-2
5-200
1; 3; 5
20-200
0,1-0,5
0,1-20
1; 3
10-10.000
0,02-0,1
0,1-2
1; 3
100-10.000
0,01-0,075
0,05-2
>20
>10
>1.000
>10
Rpidas
Convencional
ou analtica
Small bore ou
microbore
Capilar
recheada
Capilar
semipermevel
Capilar aberto
Preparativa
a: Filme lquido ligado nas paredes.
Registo de dados
Os dados obtidos pelos detectores, podem ser registados ou manipulados
atravs de um registador, um integrador ou um microcomputador. O integrador
fornece o tempo de reteno de cada pico, a rea de cada um e a rea total de
45
todos eles. Para aumentar a versatilidade, exactido e preciso da cromatografia

lquida de alta eficincia utilizam-se microcomputadores, que alm de processar os
dados obtidos pelo detector, armazenando-os, podem controlar a composio da
fase mvel, a vazo que sai da bomba, a injeco da amostra, a temperatura da
coluna, podendo diagnosticar possveis problemas. [20]
2.3.3 Teste de Conformidade do sistema de HPLC

A execuo de um teste de conformidade do sistema uma parte necessria
em cada determinao cromatogrfica quantitativa. Num teste de conformidade de
sistema, verifica-se se o sistema cromatogrfico no seu todo se encontra num
estado satisfatrio para a aplicao do mtodo de HPLC especfico para um dado
produto e com eficincia suficiente. [33]
Distingue-se do teste de rotina de conformidade do sistema, a efectuar em
cada anlise, o teste alargado de conformidade do sistema, a realizar com uma
periodicidade pr-estabelecida e o teste completo de conformidade do sistema que
s usado em algumas ocasies. [33]
Teste de rotina de conformidade do sistema

Este teste realizado em cada anlise cromatogrfica que seja efectuada no
HPLC. O teste de qualificao visual do sistema, a preciso do sistema
cromatogrfico, a resoluo e a simetria so os parmetros verificados em cada
anlise. [33]
Teste alargado de conformidade do sistema

Este teste realiza-se quando se verificar uma das seguintes situaes: cada
500 injeces, de seis em seis meses, sempre que for necessrio comprovar o
desempenho do mtodo e quando se coloca uma coluna nova a uso. [33]
46
Teste completo de conformidade do sistema

Este teste realizado sempre que se verificar uma das seguintes situaes:
de dois em dois anos, o mtodo de anlise efectuado pela primeira vez no
equipamento, no caso de pequenas alteraes das caractersticas do equipamento.
Quando feita qualquer alterao nos mtodos cromatogrficos, o mtodo deve ser
revalidado de acordo com procedimentos vlidos. [33]
Alm dos pontos verificados no teste alargado de conformidade do sistema,
ainda feita uma linearidade completa e uma avaliao do limite de quantificao. [33]
47
2.4
Validao de procedimentos analticos (ICH2)

Este texto apresenta uma discusso sobre as caractersticas a serem
consideradas durante a validao dos procedimentos analticos incluindo a parte de

pedidos de registo apresentados na Comunidade Europeia, Japo e EUA. [34]
O objectivo da validao de um procedimento analtico demonstrar que
adequado para a sua finalidade pretendida
A discusso da validao de procedimentos analticos dirigida para os quatro
tipos mais comuns de procedimentos analticos:
Testes de identificao: so destinados a assegurar a identidade de um

analto numa amostra. Isto normalmente conseguido por comparao
de
uma
propriedade
da
amostra
(por
exemplo,
do
espectro,
comportamento cromatogrfico, a reactividade qumica, etc) com a de

um padro de referncia;
Testes para o contedo de impurezas; podem ser tanto um teste

quantitativo ou um teste de limite para a impureza numa amostra. Este
teste destina-se a reflectir com preciso as caractersticas de pureza da
amostra. So necessrias caractersticas diferentes de validao para
um teste quantitativo do que para um teste de limite;
Testes quantitativos da fraco activa em amostras de substncia de

frmaco ou medicamento, ou outro componente seleccionado no
produto. [34]
2.4.1 Parmetros de desempenho

O objectivo do procedimento analtico deve ser claramente entendido uma vez
que ir governar as caractersticas de validao que precisam ser avaliadas. Os
parmetros de desempenho do mtodo, necessrios avaliar, so:
Especificidade e selectividade
Gama de trabalho e linearidade da curva de calibrao
International Conference on Harmonisation
48
Sensibilidade
Limites: deciso, deteco e quantificao
Preciso: repetibilidade, intermdia e reprodutibilidade
Exactido
Robustez
Coerncia
A tabela seguinte lista as caractersticas de validao consideradas como as

mais importantes para a validao de diferentes tipos de procedimentos analticos.
Esta lista deve ser considerada tpica para os procedimentos de anlise citados, mas
as excepes ocasionais devem ser tratadas numa base caso a caso. Deve notar-se
que a robustez no est listada na tabela, mas deve ser considerada numa fase
adequada no desenvolvimento do processo analtico. [34]
Alm disso a revalidao pode ser necessria nas seguintes circunstncias:
quando se verificam alteraes na sntese do composto que constitui a amostra;
aquando alteraes na composio do produto acabado; e na presena de
mudanas no procedimento analtico. O grau de revalidao necessrio depende da
natureza das alteraes.
Tabela 2.7 Caractersticas de validao de diferentes procedimentos analticos.
Tipo de procedimento analtico

Exactido
Identificao
-
Teste de Impurezas
Quantificao Limite
+
-
Doseamento
+
Preciso
Repetibilidade
Preciso intermdia
+ (1)
+ (1)
Limite de deteco
Limite de quantificao
Linearidade
Gama de trabalho
Especificidade
(2)
(3)
- Significa que esta caracterstica no normalmente avaliada

+ Significa que esta caracterstica normalmente avaliada
(1) nos casos em que a reprodutibilidade (ver glossrio), foi realizada, preciso intermediria no necessrio verificar
(2) a falta de especificidade de um procedimento analtico pode ser compensada por apoio a outros procedimento(s)
analtico (s)
(3) Pode ser necessria em alguns casos
49
2.4.1.1 Especificidade e selectividade

A especificidade foi considerada como a capacidade do mtodo analtico em
detectar o(s) analto(s) de interesse na presena de outros componentes da matriz.
[35, 36]
a capacidade que o mtodo possui de quantificar exclusivamente um
composto especfico independente da matriz da amostra e das suas impurezas. Para
anlise qualitativa (teste de identificao) necessrio demonstrar a capacidade de
seleco do mtodo entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar
presentes. Isto deve ser confirmado pela obteno de resultados positivos em
amostras contendo o analto, comparativamente com resultados negativos obtidos
com amostras que no contm o analto, contendo estruturas semelhantes. [36]
A especificidade e a selectividade esto relacionadas com o evento da
deteco. A especificidade refere-se a um mtodo especfico para um nico analto e
a selectividade refere-se a um mtodo utilizado para vrios analtos com capacidade
de distino entre eles. [36]
Em HPLC estes parmetros so avaliados geralmente atravs da capacidade
de resoluo cromatogrfica, da eficincia da separao e do factor de assimetria.
2.4.1.2 Gama de trabalho e linearidade da curva de calibrao

Em qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de concentraes do
analto no qual o mtodo pode ser aplicado. Os primeiros valores da faixa podem ser
dos valores dos limites de deteco e de quantificao e os ltimos dependem do
sistema de resposta do equipamento de medio. [37]
A faixa linear definida como a faixa de concentraes na qual a
sensibilidade pode ser considerada constante e so normalmente expressas nas
mesmas unidades do resultado obtido pelo mtodo analtico. [38]
Para escolher a faixa de trabalho procede-se da seguinte maneira: quando se
tem uma amostra especfica, a concentrao esperada deve situar-se no meio da
faixa de trabalho e quando a concentrao do analto desconhecida utiliza-se a
faixa de trabalho estudada para amostras diversificadas. Os valores medidos tm
50
que estar dentro da faixa de trabalho, e os valores medidos prximos ao limite

inferior da faixa de trabalho ter que ser diferente dos brancos dos mtodos.
A linearidade a capacidade de uma metodologia analtica demonstrar que
os resultados obtidos so directamente proporcionais concentrao do analto na
amostra, dentro de um intervalo especificado.
A linearidade obtida por padronizao interna ou externa, e formulada como
expresso matemtica (equao da regresso linear) que vai ser utilizada o clculo
da concentrao do analto a ser determinado na amostra real.
O coeficiente de correlao (r) um indicador da interdependncia entre o
sinal medido e as concentraes dos respectivos padres. Contudo, o coeficiente de
determinao (r2) que deve ser utilizado para traduzir a adequabilidade de um
modelo linear aos valores experimentais.
2.4.1.3 Sensibilidade
Sensibilidade um parmetro que demonstra a variao da resposta em
funo da concentrao do analto. Pode ser expressa pela inclinao da curva de
regresso linear de calibrao, e determinada simultaneamente aos testes de
linearidade. A sensibilidade depende da natureza do analto e da tcnica de
deteco utilizada. [38]
2.4.1.4 Limiares analticos

Os limites inferiores da curva de calibrao so concentraes que indicam a
capacidade de deteco e quantificao do mtodo analtico a esse nvel de
concentrao. Estes so estimados com base na incerteza da quantificao do
analto e podem ser obtidos atravs de:
Rplicas do branco,
Incerteza dos parmetros da curva de calibrao,
Incerteza na disperso dos valores em torno da curva de calibrao.
Sempre que possvel deve-se estimar os limites inferiores com base em

leituras de rplicas de branco de padro. No caso de no se dispor de brancos de
51
padro ou algum destes limites conduzir a uma concentrao sem significado fsico
deve-se utilizar os parmetros da recta de calibrao. [38]
A capacidade de deteco ou limite de deciso (xd) a concentrao mnima
do analto que corresponde a um sinal dbio, com probabilidade de cometer um erro
do tipo
de 5% e um erro do tipo
de 50%, o que equivale a
(2.1)
O limite de deteco (xLD) a concentrao que corresponde ao menor sinal

instrumental que estatisticamente distinto do valor obtido pelo branco para o nvel
de significncia de 5%, assumindo um erro do tipo
= 0.05 e um erro do tipo
=0.05. Assim, o sinal instrumental referente ao limite de deteco (yLD) deve

corresponder a
(2.2)
O limite de quantificao (xLQ) a concentrao mnima acima da qual h

confiana estatstica na quantificao da concentrao (
). Este limite
corresponde ao sinal
(2.3)
Nas equaes anteriores,

calibrao,
o parmetro de ajuste obtido para a recta de
o valor crtico obtido da distribuio t-student com um nvel de
significncia de 0,05 e com n-2 graus de liberdade,
corresponde ao desvio
padro do parmetro da recta.
2.4.1.5 Preciso
A preciso a avaliao da proximidade dos resultados obtidos numa srie
de medidas de uma amostragem mltipla de uma mesma amostra, onde as duas
52
formas mais comuns de express-la so por meio de repetibilidade, preciso

intermdia e reprodutibilidade.
A preciso geralmente expressa como desvio padro ou desvio padro
relativo. Ambas repetibilidade e reprodutibilidade so geralmente dependentes da
concentrao do analto e, deste modo, devem ser determinadas para um diferente
nmero de concentraes.
A repetibilidade o grau de concordncia entre os resultados de medies
sucessivas, efectuadas sob as mesmas condies de medio. Todas as medies
so
efectuadas
com
mesmo
procedimento,
mesmo
analista,
mesma
instrumentao, no menor intervalo de tempo possvel.

A repetibilidade pode ser expressa quantitativamente em termos da
caracterstica da disperso dos resultados e pode ser determinada por meio da
anlise de padres, material de referncia ou adio ao branco de vrias
concentraes da gama de trabalho.
A repetibilidade dada pelo desvio padro sr associado mdia dos
resultados assim obtidos. O limite de repetibilidade (r) o valor mximo permitido
para a diferena absoluta entre dois ensaios obtidos em condies de repetibilidade,
calculada para o nvel de confiana a 95 %, onde m corresponde ao nmero de
rplicas do ensaio.
(2.4)
Reprodutibilidade avalia a impreciso ao nvel mundial, reflectindo as

diferenas aleatrias esperadas para a comparao dos mesmos resultados entre
laboratrios distintos. Embora a reprodutibilidade no seja uma componente de
validao do mtodo executado por um nico laboratrio, considerada importante
quando um laboratrio procura a verificao do desempenho dos seus mtodos em
relao aos dados de validao obtidos atravs de comparao inter-laboratorial. A
partir do desvio padro obtido sob condies de reprodutibilidade possvel calcular
o limite de reprodutibilidade R, o qual permite ao analista decidir se a diferena
entre
os valores
da
cpia
das amostras
analisadas sob condies de
reprodutibilidade significante. [38]
53
Preciso intermdia refere-se concordncia entre os resultados do mesmo

laboratrio, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou
equipamentos diferentes. Para a determinao da preciso intermdia recomendase um mnimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes. Esta medida de
impreciso reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos
resultados do laboratrio. Segundo a norma ISO 5725:3, a preciso intermdia pode
ser avaliada de trs formas distintas: atravs de cartas de controlo de amplitudes
aplicadas a rplicas, a duplicados da amostra e a padres, quando se realizam n
ensaios sobre t amostras ou padres ou quando se realizam n medies sobre uma
mesma amostra, amostras supostamente idnticas ou o mesmo padro. De acordo
com esta norma o mtodo considera-se preciso em termos de preciso intermdia
se o coeficiente de variao for inferior a 2.0 %.
2.4.1.6 Exactido
A exactido de um mtodo analtico traduz a proximidade do valor obtido em
relao ao valor esperado, estipulado ou verdadeiro. Um mtodo diz-se exacto se o
erro sistematico (modulo do erro absoluto) inferior ao intervalo de confianca
estimado. calculada como percentagem de recuperao da quantidade conhecida
do analto adicionado amostra, ou como a diferena percentual entre as mdias e
o valor verdadeiro, acrescida dos intervalos de confiana. [38]
A exactido do mtodo deve ser determinada aps o estabelecimento da
linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a
partir de, no mnimo, nove determinaes contemplando o intervalo linear do
procedimento, ou seja, trs concentraes, baixa, mdia e alta, com trs rplicas
cada.
Os processos normalmente utilizados para avaliar a exactido de um mtodo
so, dentre outros: uso de materiais de referncia, participao em comparaes
inter-laboratoriais e realizao de ensaios de recuperao.
Os materiais de referncia certificados so utilizados no processo de
validao de um mtodo de ensaio para avaliar o desempenho do laboratrio, por
isso o fornecimento de materiais de referncia certificados (MRC) realizado por
organismos reconhecidos e confiveis, como por exemplo o NIST. Na avaliao da
54
exactido utilizando um material de referncia, os valores mdios obtidos pelo

laboratrio e o desvio padro de uma srie de ensaios em duplicado, devem ser
comparados com os valores certificados do material de referncia, para esta
comparao podem ser utilizados:
Erro absoluto
Erro relativo (ER);
z Score;
Erro normalizado;
Testes de recuperao.
Erro Absoluto
A exactido de uma medida geralmente descrita em termos de erro
absoluto, que definido como a diferena entre o valor observado/obtido ( ) e o
valor aceite como verdadeiro ( ).
|
(2.5)
Erro relativo
o quociente entre o erro absoluto e o valor correcto. [38]
(2.6)
z Score
O factor de desempenho (Z-score) expressa-se em termos de varivel
reduzida e estimado atravs da equao 2.7.
(2.7)
55
Onde S representa a incerteza associada ao material certificado (MRC) ou o

desvio padro da mdia dos laboratrios no ensaio inter-laboratorial.
Segundo um protocolo com a Association of Official Analytical Chemists
(AOAC), International Organization for Standardization (ISO) e International Union of
Pure and Applied Chemistry (IUPAC) se o factor de desempenho em mdulo for
menor ou igual a um, o desempenho bom, se for menor ou igual a dois o
desempenho satisfatrio, caso se encontre entre dois e trs o desempenho
questionvel e por ltimo se for superior ou igual a trs o desempenho do mtodo
mau. [38]
Erro normalizado
O erro normalizado estimado atravs da equao 2.8 onde U lab corresponde
incerteza associada ao laboratrio e UCRM incerteza associado ao valor de
referncia. Quando o valor de erro normalizado em valor absoluto menor ou iguala
a 2 o ensaio realizado satisfatrio. [38]
(2.8)
Testes de recuperao
Os testes de recuperao permitem avaliar a exactido sem recorrer a
materiais certificados, o que uma excelente vantagem econmica para o
laboratrio, usando somente solues de padro e amostras. Este tipo de teste
permite testar a resposta na presena da prpria matriz da amostra em causa, o que
bastante vantajoso pois no comum haver materiais certificados com matrizes
idnticas ou similar aquele que se est interessado. [38]
Caso se represente a concentrao recuperada em funo da concentrao
adicionada obtm-se um grfico com variao linear que pode ser ajustado por um
polinmio de primeiro grau conhecido por funo de recuperao:
(2.9)
56
Com esta funo podemos interpretar o tipo de erro sistemtico cometido no

mtodo. Assim, a ordenada na origem (a) est relacionada com um erro sistemtico
constante e o declive (b) est relacionado com um erro sistemtico proporcional.
2.4.1.7 Robustez
A robustez de um mtodo de ensaio mede a sensibilidade que este apresenta
face a pequenas variaes. Um mtodo diz-se robusto se revelar praticamente
insensvel a pequenas variaes que possam ocorrer quando esse est sendo
executado. [38]
Para determinar a robustez de um mtodo de ensaio, pode-se recorrer ao
tratamento de Youden. Trata-se de um teste que permite no s avaliar a robustez
do mtodo, como tambm ordenar a influncia de cada uma das variaes nos
resultados finais, indicando qual o tipo de influncia de cada uma dessas variaes.
Convm salientar que quanto maior for robustez de um mtodo, maior ser a
confiana desse relacionamento sua preciso.
2.4.1.8 Coerncia
A coerncia de um mtodo analtico expressa a concordncia de valores
obtidos quando so introduzidas variaes aleatrias nas condies experimentais
do mtodo.
De acordo com a USP este parmetro pode ser medido atravs da
reprodutibilidade dos resultados obtidos sob a variao de diferentes condies
(diferenas dentro do laboratrio, analistas, instrumentos, reagentes, perodos de
trabalho).
57
2.5
Tratamento estatstico de dados

A estatstica uma ferramenta fundamental na anlise qualitativa e quantitativa
de um analto numa certa matriz. As medidas so inerentemente variadas [38], isto

, os dados analticos obtidos apresentam variaes em torno de um valor central,
regra geral, mais frequente. No entanto, a distribuio normal dos dados pode ser
assumida na grande maioria dos resultados de anlise fsico-qumica.
2.5.1 Distribuies estatsticas relevantes

As distribuies estatsticas (t-student e F de Fisher) esto muito relacionadas
com o teste de hipteses uma vez que estas, devido a serem bem caracterizadas,
podem ser utilizadas como termo de comparao em diversas situaes reais,
providenciando os valores crticos necessrios. [38]
2.5.1.1 t-student
Quando est em causa a comparao de estimativas de posio, assumindo
que se trata de distribuies normais e independentes, calcula-se o valor teste
Onde o valor mdio observado,
(2.10)
o valor tomado como verdadeiro e
o desvio padro associado ao valor mdio. Compara-se o resultado com o valor

crtico da distribuio t-student ao nvel de confiana de 100.(1 - ) %.
A hiptese nula assumie a igualdade de valores e a hiptese alternativa
assume a desigualdade:
Consequentemente o valor crtico refere-se distribuio cumulativa bilateral

(hiptese centrada assumindo eventual diferena nos extremos). [38]
Caso se procure demonstrar que o valor estimado superior ao valor
correcto, a hiptese nula assume a situao da igualdade (valor inferior ou igual ao
tomado como verdadeiro) enquanto que a hiptese alternativa d conta desta
diferena,
58
Os valores crticos correspondem distribuio cumulativa unilateral

(hiptese marginal), onde corresponde ao nvel de significncia.
2.5.1.2 Fisher
Quando est em causa a comparao de varincias de distribuies normais,
aleatrias e independentes, calcula-se o valor teste dado pelo quociente entre duas
varincias,
:
(2.11)
Este deve seguir uma distribuio de Fisher. Assume-se como hiptese inicial
(H0) que no h diferena significativa entre as varincias (diferena puramente
aleatria),
O que corresponde a efectuar um teste bilateral para o quociente das

varincias. O intervalo de confiana a 95% para este quociente de varincias dado
por:
(2.12)
Onde
correspondem aos graus de liberdade do numerador e
denominador, respectivamente.
Por uma questo de simplificao, impe-se que este quociente seja maior
que a unidade (por exemplo: maior nmero de graus de liberdade para o numerador,
diviso da varincia pela componente puramente aleatria) o que faz com que se
possa converter o teste bilateral num teste unilateral, mais fcil de processar.
Deste modo,
59
A hiptese nula (H0) assume que no h diferena significativa entre

varincias e a hiptese alternativa (H1) assume que se houver diferena
significativa, a varincia do numerador excede a do denominador.
Contudo, o valor teste deve ser comparado com o valor crtico de F bilateral.
2.5.2 Teste de hipteses

Devido ao pequeno nmero de dados normalmente usados, intervalos de
confiana largos podem obscurecer diferenas inaceitveis. Por outro lado, devido a
pequenas anomalias que ocorrem por vezes, nas sries analticas, as diferenas so
identificadas como significantes, o que no apresenta qualquer relevncia prtica.
A componente aleatria intrinsecamente envolvida implica sempre a
possibilidade de se cometer um erro de juzo. Atendendo forma como estes se
desviam em relao ao valor tomado como correcto, os erros estatsticos, podem ser
classificados em erros por excesso e erros por defeito. Os erros por excesso
correspondem a uma falsa rejeio, ou seja, um erro do tipo I () onde a hiptese
nula estava correcta e foi abusivamente rejeitada por ter sido considerada falsa. Os
erros por defeito referem-se a uma falsa aceitao, ou seja, um erro do tipo II ()
onde a hiptese nula estava errada e foi abusivamente aceite como verdadeira.
O nvel de significncia de teste, designada por (frequentemente expresso
sob a forma percentual 100%.) corresponde probabilidade mxima com que se
pretende proceder rejeio abusiva (erro tipo I). A probabilidade de aceitao de
hiptese correcta designa-se de nvel de confiana e corresponde probabilidade de
(1-) (em termos percentuais 100 (1-) %).
Na formulao de hipteses estatsticas, a hiptese nula (H0) vai no sentido
de no haver diferena significativa, isto , de pertencer ao grosso da distribuio
tambm designado de (1 ); a hiptese alternativa (H1) encontra-se direccionada
para a diferena significativa (), o complemento da hiptese nula. [38]
Procedimento
Os testes estatsticos constituem uma ferramenta para, com critrios
estatsticos, auxiliar na tomada de decises na interpretao de resultados. Cada
60
teste estatstico depende do nvel de confiana para o qual as concluses so

desejadas assim como do nmero de graus de liberdade para essas circunstncias.
[38]
Os testes estatsticos devem ser efectuados com base num procedimento
lgico que passa pelos seguintes passos:
a) Formulao do problema: Deve-se realizar uma anlise do evento de forma
a racionalizar a questo e poder testar.
b) Escolha do teste: O teste escolhido de acordo com o objectivo
pretendido, ou seja, com base na distribuio estatstica que melhor se adequa3.
c) Nvel de significncia: Nvel com o qual se pretende obter concluses. Deve
ser estabelecido previamente o valor do erro mximo admissvel para se tirar
concluses erradas por rejeio abusiva (). Regra geral o nvel de significncia
refere-se a = 0,05 podendo tambm ser reduzido para = 0,01 para serem tiradas
concluses mais definitivas.
d) Hipteses de trabalho: As hipteses devem ser complementares e de
forma a abranger o universo do evento. A hiptese nula (H0) deve ser formulada no
sentido de no haver diferena (est tudo correcto, dentro do intervalo de confiana
da estimativa, (1- )). A hiptese alternativa (H1) incide sobre a diferena
significativa (no est conforme, fora do intervalo de confiana da estimativa ()).
e) Simetria do teste: Esta depende do modo como as hipteses foram
formuladas. Se o que se pretende um teste de desigualdade (superior a ou inferior
a um determinado valor), apenas se est interessado em considerar um extremo da
distribuio como referncia e por isso o teste estatstico tem uma simetria unilateral.
Pelo contrrio, se o que se pretende um teste de igualdade, ou seja, comparar a
parte central da distribuio com determinada estimativa, agora o teste estatstico
apresenta uma simetria bilateral.
f) Clculo do teste: Calcula-se com base na expresso da distribuio
estatstica correspondente.
g) Comparao com valores crticos (Xcrit): Os valores crticos esto tabelados
de acordo com o nvel de significncia e com o nmero de graus de liberdade. Estes
3
As distribuies estatsticas mais comuns para efectuar testes estatsticos so a normal, t student,
F-Fisher e qui-quadrado.
61
valores permitem definir as regies de aceitao e de rejeio das hipteses

formuladas.
h) Concluso: No caso do valor experimental ultrapassar os limites tabelados
(regio de rejeio) diz-se que, ao nvel de confiana 100 (1-) % h diferena
significativa e a hiptese nula deve ser rejeitada em detrimento da hiptese
alternativa; caso contrrio, no existe evidncia estatstica para rejeitar a hiptese
nula. Os testes estatsticos podem ser efectuados a diferentes nveis de
significncia. As normas ISO recomendam testes de significncia aos nveis de 5%
(=0.05, probabilidade de efectuar 1 insucesso em cada 20 decises) e 1% (=0.01,
probabilidade de taxa de insucesso de 1/100).
2.5.2.1 Diagnstico de valores discrepantes

Valores discrepantes so valores que no pertencem a uma determinada
distribuio. Dado que as estimativas paramtricas so sensveis a valores
contaminados, estes valores, designados de outliers, produzem em geral erros de
estimativa quer na posio (enviesamento) quer na disperso (aumento da
impreciso). Como tal, para que este efeito de estimativa errada seja evitado tem
que se testar inicialmente qualquer conjunto de dados antes de se proceder a
qualquer estimativa.
Os resultados experimentais que mais se afastam dos valores previstos pelo
modelo podem ser eventuais outliers. Dado a sua insensibilidade a valores
discrepantes, a regresso robusta pode ser til para detectar estes outliers.
Os eventuais valores discrepantes da curva de calibrao podem ser testados
atravs de um teste F (similar ao teste de Mandel), o e/ou atravs de um teste do
tipo t-student. [38]
Teste F
O teste baseia-se em comparar o aumento da variabilidade residual ao incluir
o valor suspeito da curva de calibrao com uma estimativa de erro puramente
aleatrio. Compara-se o aumento na varincia do ajuste ao introduzir o valor dbio
no conjunto dos pontos da curva de calibrao com uma estimativa de erro
62
puramente aleatrio que resulta da varincia do ajuste com (n-1) valores

experimentais, pela equao (2.13).
(2.13)
Se este valor exceder o valor crtico isso indica que a hiptese nula (H0: o
valor em questo tambm pertence curva de calibrao ou seja, no afecta
significativamente a qualidade do ajuste) tem uma probabilidade inferior a 100.%4
de no ser vlida sugerindo a rejeio deste valor como precauo estatstica no
sentido de no cometer erros sistemticos na calibrao e de reduzir a incerteza na
estimativa da concentrao das amostras. [38]
Teste t-student
A anlise de valores discrepantes pode tambm ser efectuada sob a forma de
teste t-student em que se compara a proximidade do valor experimental em causa
( ) com o respectivo valor previsto pela curva de calibrao (
)) em relao
disperso dos valores da curva de calibrao sobre o modelo, pela equao (2.14).
|
(2.14)
Caso sejam detectados outliers na curva de calibrao esta dever ser

repetida para evitar que as estimativas obtidas com as amostras no corram risco de
erro sistemtico. [38]
2.5.2.2 Escolha do modelo

A
escolha
do
modelo
deve
assentar
em
diagnsticos
simples
estatisticamente fundamentados. Os diagnsticos mais utilizados so: determinao

visual da linearidade, teste de Mandel, anlise ANOVA do ajuste e a anlise de
resduos. [38]
4
A rejeio de pontos de uma curva de calibrao um procedimento que vai afectar todas as estimativas
subsequentes, razo pela qual o nvel de confiana imposto deve ser de 99% ( = 0.01).
63
A determinao visual da linearidade consiste em sobrepor aos valores

experimentais um segmento de recta por forma a se aproximar do nmero mximo
de valores experimentais. Esta abordagem no suficiente e existem diversas
situaes em que h dvidas.
O teste de Mandel consiste em ajustar um polinmio de primeiro grau (P 1) e
um polinmio de segundo grau (P2), estimar as respectivas somas de resduos
quadrados e comparar o aumento da varincia do ajuste ao baixar o grau do
polinmio.
O teste consiste em comparar o incremento da varincia do ajuste ao excluir
um parmetro (coeficiente do termo de segundo grau) com uma estimativa de erro
puramente aleatrio (pure error) que pode ser estimado com base na varincia do
modelo que melhor ajusta os valores experimentais (
).
(2.15)
Se o aumento na varincia do ajuste devida eliminao de um parmetro for

equiparvel varincia aleatria, o parmetro excludo no necessrio ao modelo.
As hipteses de trabalho so:
Se o valor F calculado no exceder o valor crtico
a hiptese nula
deve ser aceite o que indica que o polinmio de primeiro grau adequado para a
curva de calibrao.
2.5.3 Anlise de varincia

A anlise de varincia (ANOVA) uma ferramenta estatstica importante para
distinguir as diversas contribuies sobre a varincia total observada. A ANOVA
permite distinguir dentro da variabilidade total de diversos conjuntos de valores
experimentais as contribuies puramente aleatria e a contribuio sistemtica
entre amostras. Deste modo permite verificar se as amostras (ou factores) exercem
um efeito significativo fazendo com que estes se sobreponham componente
aleatria contribuindo para diferenas significativas entre si.
64
A ANOVA permite comparar em simultneo vrias mdias (nveis diferentes

do factor) e estimar as diversas contribuies de variabilidade: puramente aleatria
(estimada dentro de cada amostra), variabilidade entre amostras, etc.
Como pressupostos assume-se que as distribuies em causa so:
Normais e independentes,
H homogeneidade de varincia (variabilidade interna)
Se o factor em estudo (factor A) no influi de modo significativo, ambas as

disperses so estimativas da varincia da componente aleatria. J se o factor
influi de modo significativo, a disperso devida ao factor A (sA) torna-se maior que a
componente puramente aleatria (s0).
A comparao das disperses conseguida atravs do teste F, equao
(2.16):
(2.16)
65
3. Seco Experimentl
66
3. Seco experimental
Nesta seco so enumerados os reagentes e equipamentos necessrios
realizao do trabalho. Encontra-se tambm nesta seco a descrio da
preparao de algumas solues relevantes.
3.1.Reagentes
Os reagentes utilizados foram: Acetonitrilo e gua para HPLC adquiridos na
Fisher Cientific; padro de glucose, maltose, frutose e lactose, de grau analtico para
HPLC adquiridos na Sigma-Aldrich; e padro de sacarose de grau analtico para
HPLC adquirido na Acros-Organics.
Para as solues Carrez I e II foi utilizado Hexacianoferrato de potssio
trihidratado K4[Fe(CN)6].3H2O de grau analtico, adquirido na Merck e Sulfato de
zinco heptahidatado ZnSO4.7H2O de grau analtico, adquirido na Panreac.
3.1.1. Fase mvel (HPLC)

A fase mvel utilizada constituda de gua ultrapura para HPLC e
acetonitrilo numa razo de 78:22 (V:V).
3.1.2. Soluo-me padro de glucose, frutose, sacarose, lactose e

maltose
Pesar rigorosamente cerca de 2,5g de glucose, 2,5g de frutose, 5,0g de
sacarose, 2,5g de lactose e 2,5g de maltose para um balo volumtrico de 50,00mL.
Dissolver em gua e completar o volume.
3.1.2.1. Preparao das solues padro de acares

Para 7 bales volumtricos de 50,00 ml pipetar 0,7; 1,00; 2,00; 5,00; 10,00;
15,00 e 25,00mL da soluo padro de acares. Completar o volume dos bales
com gua.
67
3.1.3. Preparao das solues de Carrez

Soluo de Carrez I: soluo 150g/l de K4[Fe(CN)6].3H2O
Soluo de Carrez II : soluo 300g/l de ZnSO4.7H2O
3.2.Equipamento
No
desenvolvimento
deste
trabalho
foram
utilizados
os
seguintes
equipamentos:
-
Cromatgrafo lquido de alta resoluo com injector, detector de ndice de

refraco e sistema de aquisio de dados.
Coluna: de slica ligada a NH2 com 25 cm x 4 mm x 5 m, com pr-coluna.
Filtros de 0,45 m.
Filtros S&S 602 1/2.
Banho ultra-snico.
3.3.Mtodos
De seguida apresentam-se os mtodos utilizados no decorrer do trabalho.
3.3.1. Preparao da amostra

Para um balo volumtrico de 100mL pesar rigorosamente cerca de 15g da
amostra finamente triturada e adicionar 50 ml de gua a 60 C, mexer bem at
obter uma mistura homognea. Precipitar as protenas por adio sucessiva com
agitao de 3 ml da soluo de Carrez I e 3 ml da soluo de Carrez II. Arrefecer
at temperatura ambiente. Filtrar por filtro de pregas (S&S 602 1/2) e recolher o
filtrado em balo volumtrico de 100 ml e completar ao trao com gua. Filtrar por
membrana de 0.45 m. A amostra deve ser analisada imediatamente aps a
preparao.
68
3.3.2. Condies de operao

As condies cromatogrficas de trabalho para o doseamento doa acares
em simultneo na amostra foram:
Fluxo: 1.0 ml/min;
Temperatura do forno: 40 C;
Volume de injeco: 20,00l.
Auto injector: Temperatura ambiente
Tempo de corrida: 15 minutos
Deteco: RI
69
4. Resultdos e Discusso
70
4. Resultados e discusso
4.1.Linearidade e gama de trabalho
A linearidade foi avaliada por meio da construo de uma curva de calibrao
para as substncias a analisar. Para isto preparou-se uma soluo padro me, da
qual se diluiu, posteriormente, volumes de 0,5mL, 0,7mL, 1,0mL, 5,0mL, 10,0mL,
15,0mL e 25,0mL. De forma a facilitar a escrita e a compreenso dos resultados, s
diluies anteriores, passa-se a designar por padro 0,5, padro 0,7, padro 1,
padro 5, padro 10, padro 15 e padro 25, respectivamente.
Na figura seguinte consta um cromatograma obtido para a soluo padro 10,
onde se evidenciam os sinais cromatogrficos relativos a cada composto em estudo,
assim como os respectivos tempos de reteno.
Figura 4.1 Resposta instrumental ao padro 10, com respectiva identificao dos sinais
cromatogrficos e tempos de reteno.
Na Tabela 4.1 encontram-se registados os valores mdios obtidos para cada

padro, assim como a incerteza obtida pelo desvio padro das leituras das reas.
71
Tabela 4.1 reas da curva de calibrao do doseamento de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose.
Padro
0,70
1,00
2,00
5,00
10,00
15,00
25,00
Frutose
Concentrao (g/l)
rea
Incerteza
0,70
1,00
2,00
5,00
10,00
15,00
25,00
1,9298
3,10083
5,4231
12,5361
27,6570
40,4095
67,2123
0,0052
0,00065
0,0031
0,0059
0,0032
0,0022
0,0069
Glucose
Concentrao (g/l)
rea
Incerteza
0,70
1,00
2,00
5,00
10,00
15,00
25,00
0,79256
2,2091
3,5259
9,3785
20,8017
31,28600
51,8819
0,00047
0,0077
0,0022
0,0486
0,0050
0,00090
0,0037
Sacarose
Concentrao (g/l)
rea
Incerteza
1,40
2,00
4,00
10,00
20,00
30,00
50,00
3,986
6,5193
11,3080
26,1958
57,686
84,5179
140,6726
0,0053
0,0031
0,007
0,0046
0,013
0,0064
0,0076
Maltose
Concentrao (g/l)
rea
Incerteza
0,70
1,00
2,00
5,00
10,00
15,00
25,00
0,8811
1,592
2,7332
6,4666
14,3757
21,2329
35,458
0,0092
0,0188
0,0032
0,0065
0,007
0,0031
0,0105
Lactose
Concentrao (g/l)
rea
Incerteza
0,70
1,00
2,00
5,00
10,00
15,00
25,00
0,4364
1,1162
1,8419
4,5599
10,5518
15,7385
26,4962
1,0E-04
2,7E-05
2,7E-05
5,5E-05
9,0E-04
1,0E-03
5,9E-05
Na figura 4.2 encontram-se as curvas de calibrao da resposta analtica aos

padres.
72
60
80
50
60
40
30
40
20
20
10
A - Frutose
0
0
10
20
30
150
rea )
B - Glucose
0
10
20
30
40
30
100
20
50
10
C - Sacarose
D - Maltose
0
0
0
20
40
60
10
20
30
30
25
20
15
10
5
E - Lactose
0
0
10
20
30
Concentrao (g/L)
Figura 4.2 Curvas de calibrao da resposta analtica: A) frutose, B) glucose, C) sacarose, D) maltose e E) lactose.
Para um melhor ajuste para cada curva de calibrao realizaram-se testes

estatsticos adequados referentes s trs fases crticas da calibrao:
1. Representatividade
dos
valores
na
curva
de
calibrao
(homogeneidade da varincia);
2. Escolha do modelo;
3. Deteco de outliers.
O teste de homogeneidade da varincia tem como base a distribuio unilateral
F de Fisher, onde o valor experimental obtido comparado com um valor crtico
tabelado a 99% de confiana (
). Como hipteses de trabalho assume-
se que a hiptese nula (H0) indica que a diferena que existe entre as varincias
73
no tem significado estatstico. Por sua vez, a hiptese alternativa (H1) indica que as
varincias so estatisticamente diferentes.
Na tabela 4.2 encontram-se os resultados obtidos neste teste.
Tabela 4.2 Resultados obtidos no teste F de homogeneidade da varincia para os padres em
estudo.
Frutose
Glucose
Sacarose
Maltose
Lactose
padro 25
0,0069
0,0037
0,0076
0,0105
5,9E-05
padro 0,7
0,0052
0,0047
0,0053
0,0092
1,0E-04
1,76
1,61
2,06
1,30
7,95
TV
Pela anlise da tabela, e considerando 11.07 o valor crtico calculado a um nvel

de confiana de 99%, possvel ver que, para todos os compostos, o valor
experimental (TV) inferior ao valor critico. Assim, a este nvel de confiana, a
hiptese nula aceite, ou seja, verifica-se homogeneidade da varincia nos
resultados obtidos para a curva de calibrao.
Como as varincias so estatisticamente semelhantes, passa-se realizao
de um teste de Mandel para a escolha do melhor modelo de ajuste. Se o aumento
na varincia do ajuste devida eliminao de um parmetro for equiparvel
varincia aleatria, o parmetro excludo no necessrio ao modelo. Assumindo
como hipteses de trabalho que a hiptese nula indica que o modelo a usar o que
tem menor nmero de parmetros, neste caso P01 (modelo linear), e que a hiptese
alternativa indica que o melhor modelo ser aquele que possui maior nmero de
parmetros.
Se o valor F calculado no exceder o valor crtico
a hiptese nula deve
ser aceite, o que indica que o polinmio de primeiro grau adequado para a curva
de calibrao.
Na tabela 4.3 encontram-se os resultados obtidos na realizao deste teste.
74
Tabela 4.3 resultados do teste de Mandel para a escolha do modelo.
Frutose
Glucose
Sacarose
Maltose
Lactose
Modelo
SSqr
ndf
varFit
P01
1,57
0,31
P012
1,55
0,39
P01
1,00
0,20
P012
0,98
0,24
P01
6,52
1,30
P012
6,51
1,63
P01
0,43
0,09
P012
0,43
0,11
P01
0,39
0,08
P012
0,37
0,09
TV
Fcrit
0,03
0,12
0,01
21,20
0,02
0,19
Na tabela, SSqr corresponde soma de quadrados, ndf corresponde ao nmero

de graus de liberdade do modelo, varFit representa a varincia do ajuste, TV o
valor experimental calculado e Fcrit o valor crtico tabelado a um nvel de confiana
de 99%.
Pela anlise da tabela possvel verificar que os valores experimentais
calculados so inferiores ao valor crtico em todos os casos. Assim, para os
compostos, o melhor modelo de ajuste ser o polinmio de primeiro grau uma vez
que a hiptese nula vlida.
O ltimo passo para a construo da curva de calibrao foi a verificao da
existncia de outliers onde, numa primeira fase foram verificados por regresso
robusta, atravs da anlise de resduos.
A anlise de resduos pode ser efectuada com base em cartas de controlo
segundo duas perspectivas distintas: a representao dos resduos em funo do
ndice do valor experimental e representao dos valores com indicao dos limites
de aviso e de aco.
Na figura seguinte esto representados os resduos para todos os compostos.
75
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
B - Glucose
A - Frutose
0,0
0
7,0
6,0
5,0
4,0
Resduo
3,0
2,0
C - Sacarose
1,0
D - Maltose
0,0
0
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
E - Lactose
0,05
0,00
0
Nmero de resduo
Figura 4.3- Representao grfica dos resduos (em valor absoluto) em funo do nmero de resduo do padro
utilizado: A) Frutose, B) Glucose, C)Sacarose, D)Maltose e E) Lactose.
Atendendo a que o resduo obtido pela diferena, em valor absoluto, entre os

valores obtidos e os valores previstos, o nmero de resduo que possua maior
diferena poder constituir um valor aberrante da distribuio.
No caso da frutose o valor correspondente aos resduos 4 e 5 devem ser
analisados pois constituem possveis outliers. Para a glucose deve ser analisado o
resduo 3. No caso da sacarose e da maltose, deve se analisado o resduo 4 de
cada conjunto de dados. Para a h dois valores que devem ser analisados, pela
possibilidade de serem aberrantes, correspondentes aos resduos 3 e 4.
76
O diagnstico destes valores discrepantes realizado pelo teste de Mandel

considerando os dados com os possveis outliers e sem eles. A tabela 4.4 resume os
resultados obtidos na anlise de outliers.
Tabela 4.4 Resultados do teste de Mandel para verificar a existncia de outliers.
Frutose
Glucose
Sacarose
Maltose
Lactose
Resduo
SSqr
ndf
varFit
TV
7
6
1,57
0,46
5
4
0,31
0,11
9,75
7
6
1,01
0,52
5
4
0,20
0,13
3,76
7
6
6,52
1,71
5
4
1,30
0,43
11,22
7
6
0,43
0,09
5
4
0,09
0,02
14,82
7
6
0,39
0,10
5
4
0,08
0,02
11,81
Fu0.01
21,20
Pela anlise dos valores obtidos no teste estatstico realizado, verifica-se que
nenhum dos resduos analisados em cada padro corresponde a um outlier, pois o
valor obtido atravs do teste Mandel (TV) inferior ao valor crtico a 99 % de
confiana (Fu0.01).
Uma vez validado o conjunto de dados possvel determinar a equao linear
que melhor descreve os resultados obtidos. As figuras 4.4, 4.5, 4.6, 4.7 e 4.8
mostram as rectas de ajuste obtidas, assim como as respectivas equaes e
coeficientes de correlao.
rea
Curva de calibrao da Frutose

80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
y = 2,6908x + 0,0467
R = 0,9996
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
Ci (g/L)
Figura 4.4 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a frutose.
77
Curva de calibrao de Glucose

60,0
y = 2,1016x - 0,4994
R = 0,9998
50,0
rea
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
Ci (g/L)
Figura 4.5 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a glucose.
Curva de calibrao da Sacarose

160,0
y = 2,8158x + 0,0439
R = 0,9997
140,0
120,0
rea
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
Ci (g/L)
Figura 4.6 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a sacarose.
rea
Curva de calibrao da Maltose

40,0
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
y = 1,4232x - 0,1151
R = 0,9996
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
Ci (g/L)
Figura 4.7 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a maltose.
78
Curva de calibrao da Lactose

30,0
y = 1,0705x - 0,3013
R = 0,9995
25,0
rea
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
Ci (g/L)
Figura 4.8 Representao grfica da curva de calibrao obtida para a lactose.
A gama de trabalho linear fica estabelecida com uma faixa de concentraes

de 1,4 a 50,0 g/L para a sacarose, e 0,7 a 25,0 g/L para os padres de frutose,
glucose, maltose e lactose.
4.2.Limiares analticos
Os limites de deciso (Xd), limites de deteco (XLD) e limites de quantificao
(XLQ) foram estimados a partir dos parmetros das rectas de calibrao dos
compostos. A tabela 4.5 contm os limiares analticos calculados para os
compostos.
Tabela 4.5 Valores dos limiares analticos calculados
para os acares.
XD
XLD
XLQ
Frutose
0,11
0,22
0,66
Glucose
0,11
0,23
0,68
Sacarose
0,21
0,43
1,28
Maltose
0,11
0,22
0,65
Lactose
0,11
0,23
0,69
Pela anlise da tabela 4.5, e observando os valores da concentrao dos

padres mais baixos para ambos os compostos, possvel verificar que o limite de
79
quantificao inferior ao valor da concentrao do primeiro padro, o que est em

conformidade com os requisitos no estabelecimento deste mesmo limite.
4.3.Preciso
Avaliada em termos de repetibilidade e de preciso intermdia.
4.3.1. Repetibilidade
A repetibilidade avaliada atravs da anlise do coeficiente de variao de um
conjunto de rplicas consecutivas da mesma amostra. O mtodo considera-se
preciso em termos de repetibilidade se o coeficiente de variao for inferior a 1.0 %.
Neste caso fizeram-se dez injeces consecutivas de uma soluo amostra e da
soluo padro no mesmo dia, no mesmo equipamento e pelo mesmo analista e
procedeu-se anlise do coeficiente de variao das reas obtidas tanto para a
amostra como para a soluo padro. Os resultados obtidos encontram-se
presentes na tabela 4.6.
Tabela 4.6 - Concentrao e coeficientes de variao dos acares da amostra.
Padro
Amostra
Concentrao mdia
(desvio padro)
(g/L)
CV (%)
Concentrao mdia
(desvio padro)
(g/L)
CV (%)
Frutose
24.96 (5.07x10-03)
0.02
1.00 (6.43x10-04)
0.06
Glucose
24.94
(1.86x10-02)
0.07
11.97
(1.34x10-03)
0.01
Sacarose
49,94 (2.83x10-03)
0.01
28.80 (8.82x10-03)
0.03
Maltose
24.99 (1.50x10-02)
0.06
4.02 (4.81x10-03)
0.12
Lactose
25.03 (1.92x10-02)
0.07
5.99 (1.43x10-03)
0.02
Pela anlise dos coeficientes de variao pode-se considerar o mtodo

validado em termos de repetibilidade uma vez que os valores obtidos para o
coeficiente de variao so inferiores a 1,0 %.
4.3.2. Preciso intermdia

Para estudar a preciso intermdia do mtodo foram realizadas anlises de
amostras de padro e de amostra preparadas em diluies de 5mL, 15mL e 25mL
80
da soluo me, em dias diferentes, tendo sido avaliado o coeficiente de variao

decorrente da injeco de trs gamas de concentrao diferentes.
O mtodo considera-se preciso em termos de preciso intermdia se o
coeficiente de variao obtido for inferior a 2.0%.
Na tabela 4.7 encontram-se os valores obtidos para a anlise da preciso
intermdia no doseamento da frutose.
Tabela 4.7- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a frutose.
Amostra (g/L)
1 Dia
2 Dia
3 Dia
Padro (g/L)
15
25
15
25
0,199
0,412
0,997
4,637
15,000
24,969
0,197
0,414
1,006
4,638
15,001
24,965
0,197
0,412
1,002
4,646
14,996
24,955
0,201
0,412
0,995
4,639
15,002
24,974
0,195
0,417
0,995
4,642
15,002
24,959
0,204
0,419
1,002
4,646
14,996
24,971
0,201
0,411
0,999
4,648
14,998
24,962
0,194
0,410
0,997
4,646
15,001
24,965
0,193
0,411
1,005
4,639
14,996
24,965
Com estes dados foi efectuada uma anlise ANOVA para verificar se os
valores eram afectados pelo factor dia, ou seja, para verificar se o facto de as
anlises serem efectuadas em dias diferentes tem influncia para a variabilidade
total do conjunto de dados.
Para a soluo amostra 5 o valor de teste obtido foi de 0,81 que vai ser
comparado com o valor crtico, a um nvel de confiana de 95%, de 5,14. Como o
valor experimental inferior ao valor crtico tabelado, a hiptese nula aceite, ou
seja, o factor Dia no afecta os resultados e, por isso, no h interferncia para a
variabilidade total. Ao mesmo nvel de diluio, para o padro, o valor de teste obtido
da anlise ANOVA foi de 0,67. A um nvel de confiana de 95%, o valor tabelado
superior ao valor de teste, logo a hiptese nula aceite.
Para a soluo amostra 15 o valor de teste foi de 5,57 e, a um nvel de
confiana de 95% o valor de teste inferior ao valor crtico, indicando que a hiptese
nula (factor no influi) aceite. Na mesma gama, o factor no afecta os resultados
obtidos para o padro pois o valor de teste (0,38) inferior ao valor crtico tabelado
para um nvel de confiana de 95%.
81
Quando se analisa a soluo amostra 25 verifica-se que efeito dirio no influi

na varincia total uma vez que o valor de teste (0,61) inferior ao valor crtico a um
nvel de confiana de 95%. Para a soluo padro conclui-se o mesmo uma vez que
o valor de teste de 0,66.
Para as solues amostra e padro, preparadas de uma diluio de 5mL, o
coeficiente de variao de 1,8% e 0,1%, respectivamente. Para as solues de
diluio de 15mL, o CV de 0,5% para a amostra e 0,2% para o padro. Na gama
de diluio de 25 mL, o coeficiente de variao de 0,4% na amostra e 0,1% no
padro. Com isto, o mtodo de doseamento da frutose encontra-se validado
relativamente preciso intermdia.
intermdia no doseamento da glucose.
Tabela 4.8- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a glucose.
Amostra (g/L)
1 Dia
2 Dia
3 Dia
Padro (g/L)
15
25
15
25
0,888
7,174
11,974
4,707
15,123
24,935
0,883
7,182
11,974
4,704
15,130
24,940
0,898
7,191
11,971
4,703
15,127
24,935
0,898
7,183
11,962
4,691
15,117
24,936
0,888
7,179
11,973
4,704
15,113
24,940
0,897
7,180
11,970
4,709
15,116
24,937
0,886
7,184
11,962
4,698
15,123
24,938
0,894
7,178
11,963
4,703
15,118
24,935
0,899
7,182
11,971
4,696
15,133
24,946
valor experimental inferior ao valor critico tabelado, a hiptese nula aceite, ou
seja, no h interferncia do factor para a variabilidade total. Na mesma gama, para
o padro, o valor de teste obtido da foi de 0,70. A um nvel de confiana de 95%
possvel afirmar que o factor no influi na variabilidade total, uma vez que, o valor de
teste inferior ao valor tabelado.
O factor no afecta os resultados obtidos na amostra 15 pois o valor de teste
(0,07) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de confiana de 95%. Para a
82
soluo padro a 100% o valor de teste foi de 4,72 o que indica que o factor no
influi uma vez que o valor crtico superior.
Na gama das solues 25 o factor no afecta os resultados obtidos na amostra
pois o valor de teste (2,04) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de
confiana de 95%. Para a soluo padro o mesmo se conclui pois o valor de teste
(0,44) inferior ao valor tabelado.
Para as solues amostra e padro, preparadas atravs da diluio de 5 mL, o
coeficiente de variao de 1,0% e 0,1 %, respectivamente. Para as solues
diludas de 15 mL o CV de 0,1% para a amostra e 0,3% para o padro. Na gama
de diluio de 25mL, o coeficiente de variao de 0, 4% na amostra e 0, 2% no
padro. Com isto, o mtodo de doseamento da glucose encontra-se validado
intermdia no doseamento da sacarose.
Tabela 4.9- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a sacarose.
Amostra (g/L)
1 Dia
2 Dia
3 Dia
Padro (g/L)
15
25
15
25
5,769
17,284
28,802
9,289
30,005
49,942
5,756
17,282
28,800
9,284
29,999
49,937
5,772
17,283
28,802
9,288
29,995
49,943
5,763
17,283
28,798
9,285
30,002
49,943
5,767
17,279
28,790
9,286
29,998
49,947
5,761
17,281
28,802
9,292
30,008
49,948
5,756
17,286
28,799
9,287
29,997
49,948
5,768
17,281
28,798
9,284
29,998
49,945
5,761
17,281
28,797
9,287
30,001
49,939
83

na varincia total uma vez que o valor de teste (1,30) inferior ao valor crtico a um
o valor de teste de 1,82.
diluio de 15mL, o CV de 0,1% para a amostra e para o padro. Na gama de
diluio de 25 mL, o coeficiente de variao de 0,2% na amostra e 0,1% no
padro. Com isto, o mtodo de doseamento da sacarose encontra-se validado
intermdia no doseamento da maltose.
Tabela 4.10- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a maltose.
Amostra (g/L)
1 Dia
2 Dia
3 Dia
Padro (g/L)
15
25
15
25
0,808
2,426
4,017
4,617
14,999
24,988
0,803
2,411
4,029
4,622
15,009
24,991
0,800
2,414
4,011
4,615
15,004
24,995
0,807
2,410
4,023
4,621
14,994
25,001
0,804
2,404
4,015
4,623
15,005
24,991
0,809
2,420
4,022
4,630
15,005
24,984
0,814
2,412
4,016
4,625
14,999
24,987
0,802
2,401
4,020
4,622
14,998
24,989
0,795
2,411
4,024
4,623
15,009
25,010
seja, no h interferncia do factor para a variabilidade total. Na mesma gama, para
o padro, o valor de teste obtido da foi de 3,23. A um nvel de confiana de 95%
84
possvel afirmar que o factor no influi na variabilidade total, uma vez que, o valor de
teste inferior ao valor tabelado.
O factor no afecta os resultados obtidos na amostra 15 pois o valor de teste
(1,17) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de confiana de 95%. Para a
soluo padro a 100% o valor de teste foi de 0,24 o que indica que o factor no
influi uma vez que o valor crtico superior.
Na gama das solues 25 o factor no afecta os resultados obtidos na amostra
pois o valor de teste (0,02) inferior ao valor crtico tabelado para um nvel de
confiana de 95%. Para a soluo padro o mesmo se conclui pois o valor de teste
(0,17) inferior ao valor tabelado.
Para as solues amostra e padro, preparadas atravs da diluio de 5mL, o
coeficiente de variao de 0,9% e 0, 7%, respectivamente. Para as solues
diludas de 15mL o CV de 0,3% para a amostra e 0, 4% para o padro. Na gama
de diluio de 25mL, o coeficiente de variao de 0,2% na amostra e 0, 4% no
padro. Com isto, o mtodo de doseamento da maltose encontra-se validado
intermdia no doseamento da lactose.
Tabela 4.11- Resultados obtidos na anlise da preciso intermdia do mtodo de doseamento para a lactose.
Amostra (g/L)
1 Dia
2 Dia
3 Dia
Padro (g/L)
15
25
15
25
1,198
3,594
5,991
4,542
14,984
25,034
1,197
1,199
3,595
3,595
5,992
5,988
4,545
4,541
14,984
14,983
25,032
25,035
1,198
3,596
5,991
4,541
14,985
25,034
1,196
1,199
3,593
3,595
5,992
5,990
4,542
4,541
14,985
14,983
25,032
25,033
1,198
3,593
5,990
4,541
14,984
25,033
1,199
1,197
3,593
3,594
5,991
5,988
4,542
4,541
14,983
14,984
25,035
25,033
85

na varincia total uma vez que o valor de teste (0,53) inferior ao valor critico a um
o valor de teste de 0, 26.
diluio de 15mL, o CV de 0,3% para a amostra e 0,1% para o padro. Na gama
de diluio de 25 mL, o coeficiente de variao de 0,3% na amostra e 0,1% no
padro. Com isto, o mtodo de doseamento da lactose encontra-se validado
4.4.Exactido
Para avaliar a exactido do mtodo de doseamento dos acares na amostra
procedeu-se preparao de amostras de placebo, fortificadas com padro, de
modo a obter solues com concentraes diludas da soluo me 5mL, 15mL e
25mL, de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose e posteriormente
compararam-se os valores obtidos com o padro de referncia, na mesma gama de
concentraes.
A exactido do mtodo de anlise foi avaliada pelo erro absoluto atravs do
teste t-student e erro relativo e, posteriormente, procedeu-se determinao da
percentagem de recuperao.
86
Tabela 4.12- Resultados obtidos no estudo de exactido dos mtodos de

quantificao dos doseamentos frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose.
Frutose
Gama
Amostra (g/L)
Padro (g/L)
4,64
4,64
4,64
4,64
15,00
15,00
15,00
15,00
24,96
24,96
24,96
24,97
4,76
4,67
4,72
4,68
15,13
15,12
15,12
15,12
24,93
24,92
24,93
24,93
9,29
9,29
30,00
9,29
9,29
30,00
25
30,00
49,94
49,94
30,00
49,94
49,94
4,62
4,62
4,62
4,62
15,00
15,00
15,00
15,00
24,99
24,99
24,99
24,99
4,54
4,54
4,54
4,54
14,98
14,98
14,98
14,98
25,03
25,03
25,03
25,03
15
25
Glucose
5
15
25
Sacarose
5
15
Maltose
15
25
Lactose
5
15
25
Do estudo da exactido, tabela 4.12, obteve-se para a frutose, para cada

gama de concentraes ensaiadas, as estimativas mdias 4,64 (1,05E-03), 15,00
(8,67E-04) e 24,96 (7,88E-04) g/L que correspondem ao coeficiente de variao de
0,05, 0,01 e 0,01%, respectivamente. Tendo como valores de referncia 4,64 (3,10E03), 15,00 (1,58E-04) e 24,96 (1,45E-03) g/L, para cada gama de concentraes, a
exactido avaliada atravs do teste t-student conduz ao valor de teste 0,95, 1,26 e
87
0,06 que inferior ao valor previsto pela distribuio t-student bilateral ao nvel de
confiana de 95% (12,71). Os valores obtidos como estimativas de erro relativo
foram de 0,03, 0,01 e 0,01% que se encontram dentro da gama pretendida (inferior a
5,0 %) e as percentagens de recuperao obtidas (100,03, 100,01 e 100,04 %)
tambm se encontram dentro o intervalo pretendido (95,0 a 105,0 %). Pela anlise
dos valores obtidos podemos afirmar que o mtodo se considera validado em termos
de exactido para a frutose.
No estudo de exactido para a glucose, tabela 4.12, obteve-se para cada
gama de concentraes estimativas mdias de 4,74 (2,66E-02), 15,12 (1,01E-03) e
24,93 (1,14E-03) g/L que correspondem ao coeficiente de variao de 0,10, 0,01 e
0,02%, respectivamente. Tendo como valores de referncia 4,68 (5,99E-03), 15,12
(2,15E-03) e 24,93 (5,32E-03) g/L, para cada gama de concentraes, a exactido,
avaliada atravs do teste t-student, conduz ao valor de teste 0,40, 2,06 e 1,20 que
inferior ao valor crtico a um nvel de confiana de 95%. O valor obtido como
estimativa de erro relativo foi de 1,3, 0,01 e 0,02% que se encontra dentro do
pretendido uma vez que inferior a 5,0%, e a percentagem de recuperao obtida
foi 101,32, 100,01 e 100,02% que se encontram compreendidas entre o intervalo de
95,0 e 105,0%. Assim, possvel concluir que o mtodo se encontra validado ao
nvel de exactido para a glucose.
Para a sacarose obteve-se, para cada gama de concentraes ensaiadas, as
estimativas mdias 9,29 (1,16E-03), 30,00 (1,61E-03) e 49,94 (1,66E-03) g/L que
correspondem ao coeficiente de variao de 0,01, 0,01 e 0,02%, respectivamente.
Tendo como valores de referncia 9,29 (5,32E-03), 30,00 (1,03E-03) e 49,94 (1,41E03) g/L, para cada gama de concentraes, o teste t-student conduz ao valor de
teste de 19,43, 6,57 e 1,39 que inferior ao valor previsto pela distribuio t student
bilateral ao nvel de confiana de 95% (12,71) excepto para a gama de diluio de
5mL da soluo me, e desta forma verificou-se que, ao nvel de confiana 99% o
valor crtico de 63.66, sendo o valor de teste inferior. Assim, para esta gama a
hiptese nula considerada dbia, pelo que ao analisar o valor de prova (a
probabilidade de aceitao da hiptese nula) de 3,3% possvel afirmar que o
mtodo tende a ser exacto mas encontra-se levemente afectado por um erro
sistemtico.
88
Os valores obtidos como estimativas de erro relativo foram de 0,02, 0,01 e

0,01% que se encontram dentro da gama pretendida (inferior a 5,0 %) e as
percentagens de recuperao obtidas (100,01, 100,01 e 100,02 %, respectivamente)
tambm se encontram dentro o intervalo pretendido (95,0 a 105,0 %). Pela anlise
dos valores obtidos podemos afirmar que o mtodo se considera validado em termos
de exactido para sacarose.
Do estudo da exactido, tabela 4.12, obteve-se para a maltose, para cada
gama de concentraes ensaiadas, as estimativas mdias 4,62 (8,40E-05), 15,00
(3,32E-05) e 24,99 (8,93E-05) g/L que correspondem ao coeficiente de variao de
0,01, 0,02 e 0,02%, respectivamente. Tendo como valores de referncia4,62 (2,69E05), 15,00 (6,46E-05) e 24,99 (5,59E-05) g/L, para cada gama de concentraes, a
exactido, avaliada atravs do teste t-student, conduz ao valor de teste 1,86, 0,70 e
7,07 que inferior ao valor crtico a um nvel de confiana de 95%. O valor obtido
como estimativa de erro relativo foi de 0,01, 0,01 e 0,03% que se encontra dentro do
pretendido uma vez que inferior a 5,0%, e a percentagem de recuperao obtida
foi 100,02, 100,03 e 100,03% que se encontram compreendidas entre o intervalo de
95,0 e 105,0%. Assim, possvel concluir que o mtodo se encontra validado ao
nvel de exactido para a maltose.
Para a lactose obteve-se, para cada gama de concentraes ensaiadas, as
estimativas mdias 4,54 (2,53E-05), 14,98 (8,56E-04) e 25,03 (1,58E-03) g/L que
correspondem ao coeficiente de variao de 0,01, 0,02 e 0,01%, respectivamente.
Tendo como valores de referncia 4,54 (2,82E-03), 14,98 (4,83E-04) e 25,03 (1,24E04) g/L, para cada gama de concentraes, o teste t-student conduz ao valor de
teste de 0,92, 0,39 e 0,14 que inferior ao valor previsto pela distribuio t student
bilateral ao nvel de confiana de 95% (12,71). O valor obtido como estimativa de
erro relativo foi de 0,04, 0,01 e 0,03% que se encontra dentro do pretendido uma vez
que inferior a 5.0%, e a percentagem de recuperao obtida foi 100,04, 100,01 e
99,99% que se encontram compreendidas entre o intervalo de 95,0 e 105,0%.
Assim, possvel concluir que o mtodo se encontra validado ao nvel de exactido
para a lactose.
89
5. Conclusoes
90
5. Concluses
O trabalho desenvolvido visava essencialmente um objectivo a validao do

mtodo de anlise de produtos alimentares por Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia. Para esse efeito preparou-se uma soluo padro me contendo 2,5g de
frutose, 2,5g de glucose, 5,0g de sacarose, 2,5g de maltose e 2,5g de lactose, para
50,00mL. Desta soluo fizeram-se 7 diluies de 0,7mL, 1mL, 2mL, 5mL, 10mL,
15mL e 25mL, de forma a diminuir a concentrao inicial. A soluo da amostra foi
preparada pesando, rigorosamente 15,0g da amostra para um volume final, aps o
procedimento descrito na seco experimental, de 100,00mL.
Para a avaliao dos parmetros de validao do mtodo de anlise do
doseamento simultneo de frutose, glucose, sacarose, maltose e lactose na amostra
em HPLC comeou-se por verificar a especificidade/selectividade do mtodo e
atravs dos cromatogramas comprovou-se que no existem interferentes no
doseamento dos acares.
Pelo parmetro de linearidade estabeleceu-se para cada composto a
respectiva curva de calibrao linear com equao de polinmio de primeiro grau. A
gama de trabalho construiu-se a partir de sete padres e definiu-se de 1,4g/L a
50g/L para a sacarose, 0,7 a 25 g/L para os restantes acares considerados.
A partir das curvas de calibrao estabeleceu-se os limiares analticos para os
cinco compostos a dosear, onde se obteve como limites de quantificao 0,66g/L,
0,68g/L, 1,28/L, 0,65g/L e 0,69g/L, para a frutose, glucose, sacarose, maltose e
lactose, respectivamente.
A preciso do mtodo verificou-se pela repetibilidade e preciso intermdia.
Em termos de repetibilidade, os coeficientes de variao obtidos para os acares
na soluo padro e na soluo amostra foram inferiores a 1,0 %, logo o mtodo
encontra-se validado em termos de repetibilidade. Quanto preciso intermdia
avaliou-se a soluo padro e amostra em trs gamas de concentraes diferentes
(diluies de 5mL, 15mL e 25mL) e em trs dias diferentes. Em todos os casos os
coeficientes de variao obtidos foram inferiores a 2,0 %, logo o mtodo considerase validado em termos de preciso intermdia, nestas gamas de concentrao.
91
Como os parmetros indicadores da preciso do mtodo se encontram validados, o

mtodo encontra-se tambm validado no parmetro preciso.
A exactido do mtodo avaliou-se pelo erro absoluto atravs do teste tstudent a 95 % de confiana, erro relativo e posteriormente procedeu-se
determinao da percentagem de recuperao, como terceiro parmetro de
desempenho do mtodo quanto exactido, e em todos os casos verificou-se que o
mtodo exacto, ou seja, no apresenta erro sistemtico significativo.
A metodologia testada para doseamento, em simultneo, de frutose, glucose,
sacarose, maltose e lactose, considera-se validada, uma vez que satisfaz as
especificaes determinadas para cada parmetro de validao testado.
Futuramente seria ainda de todo conveniente avaliar a estabilidade das
solues amostra e padro, ao longo do tempo, enquanto se encontram na bancada
de trabalho e tambm quando se encontram no auto-injector. Aps esta avaliao
ser intenso validar o mesmo mtodo para o restante tipo de amostras produzidas
na indstria onde decorreu o trabalho.
92
6. Bibliogrfi
93
6. Bibliografia
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Cromatografia: Princpios bsicos e
tcnicas afins. Rio de Janeiro, RJ, 2003

[14] LANAS, Fermando M. Cromatografia em fase gasosa. So Carlos: Acta,
1993. 254p
[15] CECCHI, Heloisa Mscia. Fundamentos tericos e prticos em anlise de
alimentos. 2 ed. rev. Campinas: Editora da Unicamp, 2003, 207p.
[16] VOGEL, Arthur. Anlise Qumica Quantitativa. 6 ed. Rio de Janeiro: LTCLivros Tcnicos e Cientficos Editora S.A, 2002. 462p.
[17] HARRIS, Daniel C. Anlise Qumica Quantitativa. 6 ed. Rio de Janeiro: LTCLivros Tcnicos e Cientficos Editora S.A., 2005. 876p.
[18] HARRIS, Daniel C. Anlise Qumica Quantitativa. 6 ed. Rio de Janeiro: LTCLivros Tcnicos e Cientficos Editora S.A., 2005
[19] SKOOG, Douglas A.; HOLLER, James; NIEMAN, Timothy. Princpios de
Anlise Instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. 836p
[20] ARAJO, Julio M. A. Qumica de Alimentos: teoria e prtica. 3 ed. Viosa:
Editora UFV, 2004, 416p.
[21] DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve
ensaio. Atualidades em Qumica, n.7, p.21-25, mai.1998.
[22] NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S.
Cromatografia: Princpios bsicos e
tcnicas afins. Rio de Janeiro, RJ, 2003

[23] LOPES, Joo Luis Callegari. Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed.
Campinas: Editora da UNICAMP, 1997. p.45-57
[24] BRAGA, Gilberto Leite. Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed.
Campinas: Editora da UNICAMP, 1997. p. 29-43.
[25] BONATO, Pierina Sueli. Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed.
Campinas: Editora da UNICAMP, 1997. p.141-181.
[26] GUIMARES, Luis Fernando Lopes; COLLINS, Carol H. Cromatografia lquida
de alta eficincia. In: Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed.
Campinas: Editora da UNICAMP, 1997. p.183-238.
95
[27] POMBEIRO, Armando. Tcnicas e Operaes Unitrias em Qumica

Laboratorial. 4 ed. Lisboa: Fundao Calouste Gulbenkian, 2003, 1069p
[28] PIZZOLATO, Tnia. Apostila da disciplina de Cromatografia do PPG em
Qumica. Instituto de Qumica. UFRGS, 2001.
[29] ANDRADE, dira Castelo Branco de, Anlise de alimentos: uma viso
qumica da nutrio So Paulo: Livraria Varela, 2006
[30] SPENCER, G.L.; MEADE, G.P. Special Reagentes. Cane Sugar Handbook,
New York, Wiley, 1945.
[31] JARDIM, Isabel Cristina Fontes Sales; GUIMARES, Luis Fernando Lopes;
COLLINS, Carol H. Fundamentos de cromatografia. Campinas: Editora da
UNICAMP, 2006. 453p.
[32] SCOTT, Raymond P. W.: Liquid Chromatography. 2003. 101p. Disponvel
em: <http://www.library4science.com/>. Acesso em: 20 mai. 2012.
[33] NETO, Francisco R. de A.; NUNES, Denise, da S. S. Cromatografia:
Princpios bsicos e tcnicas afins. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003. 187p.
[34] Wellings, D. A., A Practical Handbook of Preparative HPLC, Elsevier, 2006.
[35] Validation of Analytical Procedures: text and Methology Q2(R1), ICH,
november 2005
[36] Chasin, A.M.; Nascimento, et all., Validao de mtodos em anlises
toxicolgicas: uma abordagem geral, Revista Brasileira Toxicologia, 1998,
v.11, n.1, p.1-6
[37] Guia Relacre 13, Validao de Mtodos Internos de Ensaio em Anlise
Qumica, Relacre, 2000
[38] Jorge L.G.F.S. Costa Pereira, Caracterizao e Validao de Mtodos
Analticos, Departamento de Qumica da Faculdade de Cincias e Tecnologia
da Universidade de Coimbra, Coimbra, 2008
96
Anexos
97
Anexo I - As aplicaes do acar na rea da produo alimentar
O acar, para alm de ser o adoante por excelncia, desempenha tambm

outras funes que, embora menos conhecidas, o tornam um ingrediente importante
na confeco alimentar.
A sua capacidade para dar cor e paladar, e o seu contributo na textura,
consistncia, conservao e fermentao dos alimentos, so propriedades que
outros adoantes no conseguem alcanar.
Eis aqui algumas das suas principais funes na cozinha:
ADOAR - O acar d um sabor doce imediato aos alimentos. O acar o

adoante de referncia.
CONSERVAR
acar
ajuda
travar
desenvolvimento
de
microrganismos, porque imobiliza as molculas da gua que as bactrias, o

fermento ou o bolor necessitam para crescer. Esta propriedade faz do acar
um importante agente na preservao de compotas e outras conservas, mas
tambm de bolos, impedindo que estes sequem e se tornem velhos. O
acar tambm actua como antioxidante. Protege a fruta em conserva de
oxidar e limita a tendncia das gorduras usadas na pastelaria ficarem
ranosas. O acar, em si, conserva-se durante muito tempo, quando em
condies normais de ambiente.
DAR COR - O acar est na base do processo de caramelizao que produz

sabores e graus de cor muito especficos em bolos e bombons.
MODIFICAR SABORES - Usado em pequenas quantidades, o acar pode

atenuar ou intensificar sabores. Os sabores salgado, amargo e cido so
reduzidos com a aplicao de acar. , por exemplo, o caso da maionese,
de produtos base de tomate e de frutos como groselha e toranja.
DAR TEXTURA - Na pastelaria, o acar essencial para dar diferentes

texturas aos alimentos confeccionados. O acar interage com gua,
fermento e farinha, desempenhando um papel importante na consistncia dos
produtos durante a cozedura, na sua densidade, cor e aparncia.
Dependendo da quantidade utilizada e do tamanho dos cristais (da haver
98
acar com tamanhos de granulado diferentes) podem obter-se diferentes

efeitos no produto final. Na confeitaria, a capacidade do acar cristalizar e se
dissolver em temperaturas diferentes e com quantidades variveis de gua,
permite adquirir uma grande variedade de estruturas. Por exemplo, a textura
do chocolate s possvel atravs da mistura do acar com a manteiga de
cacau. Nas mousses, a ligao do acar com as claras de ovo que
proporciona a estabilidade desta sobremesa.
DAR CONSISTNCIA- Nas bebidas e nos gelados, a viscosidade do acar

dissolvido d uma consistncia agradvel na boca. Nos iogurtes, a
consistncia promovida atravs da aco especial do acar nas protenas
do leite.
INFLUENCIAR PROCESSOS CULINRIOS - O acar tem tambm

propriedades que o tornam um agente activo em alguns processos culinrios:
um excelente substrato para muitas fermentaes, acelerando o seu
processo (ex.: a massa dos folares, bebidas); acelera o tempo de cozedura;
na congelao, retarda o tempo a que congelam os alimentos, impedindo, por
exemplo no caso dos gelados, que se formem demasiados cristais de gelo.
Fora da rea alimentar, o acar tem ainda uma srie de utilizaes

interessantes:
Na produo de colas e cimentos;
No fabrico de tintas;
No tratamento de peles;
Na composio de muitos produtos farmacuticos;
Ajuda a curar feridas;
usado para produzir penicilina.
Se adicionado gua, ajuda a manter as flores frescas durante mais tempo;
o ingrediente que faz o vidro utilizado no cinema nas cenas de duplo;
99
Anexo II Cromatogramas obtidos na leitura dos padres e amostra
Figura A 2.1 Cromatograma obtido para o padro 1.
100
101
Figura A 2.4 Cromatograma obtido para a amostra.
102
Anexo III Tabelas estatsticas relevantes

Tabela A 3.1 Valores crticos da distribuio t-student bilateral.
Tabela A 3.2 Valores crticos da distribuio de Fisher-Snedcor unilateral (=0,05).
103
Tabela A 3.3 Valores crticos da distribuio de Fisher-Snedcor unilateral (=0,01).
104

Determinação Do Teor de Açúcar Numa Amostra de Produto Alimentar

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Tnia Margarida Pereira Figueiredo

Tnia Margarida Pereira Figueiredo

VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS

Determinao do Teor de Acar numa amostra de produto alimentar

Tnia Margarida Pereira Figueiredo

Dissertao apresentada para provas de Mestrado em Qumica, rea de

Jorge Lus Gabriel F. S. Costa Pereira

Obrigada a toda a minha famlia, em especial minha av e minha

MRC Material de Referencia Certificado

2. Fundamentao Terica .............................................................................. 5

Hidratos de carbono .............................................................................. 5

2.1.3.1 Glucose ............................................................................................ 10

2.1.4.1 Sacarose .......................................................................................... 13

Acar no organismo ....................................................................... 14

Mecanismos de separao .............................................................. 17

Tipos de cromatografia .................................................................... 23

2.2.2.1 Cromatografia planar ....................................................................... 23

2.2.3.1 Fases ............................................................................................... 30

Identificao e quantificao ............................................................ 35

Teste de Conformidade do sistema de HPLC .................................. 46

Parmetros de desempenho ............................................................ 48

2.4.1.1 Especificidade e selectividade ......................................................... 50

Tratamento estatstico de dados ......................................................... 58

Distribuies estatsticas relevantes ................................................ 58

2.5.1.1 t-student ........................................................................................... 58

Teste de hipteses ........................................................................... 60

2.5.2.1 Diagnstico de valores discrepantes ............................................... 62

Anlise de varincia ......................................................................... 64

3. Seco experimental ................................................................................. 67

Fase mvel (HPLC) ......................................................................... 67

Soluo-me padro de glucose, frutose, sacarose, lactose e

Preparao das solues padro de acares ............................. 67

Condies de operao ................................................................... 69

4. Resultados e discusso ............................................................................. 71

Linearidade e gama de trabalho .......................................................... 71

Preciso intermdia ......................................................................... 80

assegurado por uma gesto

Figura 1.1 Imagem area da DanCake Coimbra.

uma capacidade produtiva de

45 mil toneladas, com uma margem de crescimento adicional de cerca de 40%. A

hidroxiladas ou compostos que, por hidrlise, se podem transformar nos anteriores.

monossacardeos d-se a designao de polissacardeos. [1]

A tcnica da produo de acar disseminou-se aos poucos por toda a regio

O acar bruto transportado a granel das fbricas de acar para as

No primeiro processo, adiciona-se ao licor de afinao um auxiliar de filtrao

Na fosfatao obtm-se um precipitado fazendo reagir o hidrxido de clcio,

Por resinas de permuta inica;

Por carves adsorventes (em p ou granulados);

Por oxidao (perxido de hidrognio ou ozono).

O licor final ento concentrado em evaporadores de mltiplo efeito

monossacardeo, o hidrato de carbono mais

Figura 2.1 Estrutura da Glucose.

procariontes e eucariontes. um cristal slido de sabor

acar das frutas, um monossacardeo

Figura 2.2 Estrutura da Frutose.

Exemplos de dissacardeos importantes e comuns so a sacarose, maltose e

pela unio de uma molcula de

se em abundncia na cana-deaucar, frutas e beterraba. [8]

Figura 2.4 Estrutura da Sacarose.

A sacarose, o acar comum comercial, hidrolisada com grande facilidade

reserva da clula vegetal, tambm a juno de

Figura 2.5 Estrutura da Maltose.

encontrada em vegetais, e tem funo energtica. [9]

tipo de glicdio que possui ligao glicosdica.