Extrao de RNA

ATENO: Todo protocolo de extrao de RNA deve ser realizado o tempo todo no gelo!

TRITURACAO/HOMOGEINIZACAO
Triturar o tecido em nitrognio liquido no cadinho
Add 1mL de Trizol Reagent (para placas de 10mL)
Aspirar o volume com a seringa cuidadosamente Poe 3X
Recolher o volume de Trizol Reagent do cadinho e acondicionar em eppendorf estril
EXTRACAO/SEPARACAO
Incubar por 5 10 minutos a temperatura ambiente em rotador (ou com agitao manual
por inverso)

2X

Add 0,2mL de clorofrmio (para cada 1mL de Trizol Reagent)

Homogeneizar por inverso
Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente em rotador (ou com agitao manual por
inverso)

Centrifugar a 13.000 rpm a 4C por 15 minutos

Recolher o sobrenadante (fase aquosa incolor) em eppendorf estril

PRECIPITACAO
Add 1uL de glicgenio ao sobrenadante recolhido
Homogeneizar por inverso
Add 0,5mL de isopropanol (=lcool isoproplico)
Homogeneizar por inverso
Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente em rotador (ou com agitao manual por
inverso)

Centrifugar a 13.000 rpm a 4C por 20 30 minutos

Desprezar o sobrenadante (OBS: guardar o sobrenadante da precipitao por precauo)

LAVGEM

2X

Lavar o pellet add 1mL de etanol 75 90% gelado (o etanol tem que ser gelado para evitar que
o pellet se solte, no necessrio ressuspender o pellet de RNA, mas apenas solt-lo da parede do
eppendorf)

Centrifugar a 13.000 rpm e 4C por 20 30 minutos

Desprezar o sobrenadante
Deixar o pellet secar ao ar (eppendorf invertido sobre papel absorvente, TC ambiente, no pode

secar demais seno ele no ressuspende depois, mas tambm no pode deixar ficar etanol)
RESSUSPENSAO

Ressuspender o pellet em 50uL de H2O DEPC

Armazenar no -80C

Antes da Extrao de RNA:

* It is therefore important that tissue samples are immediately frozen in liquid nitrogen and
stored at 70C, or immediately immersed in RNAlater RNA Stabilization Reagent.
* The procedures for tissue harvesting and RNA protection should be carried out as quickly as
possible. Frozen tissue samples should not be allowed to thaw during handling or weighing.
After disruption and homogenization in Buffer RLT (lysis buffer), samples can be stored at
70C for months.
* After storage in RNAlater RNA Stabilization Reagent, tissues become slightly harder than
fresh or thawed tissues. Disruption and homogenization of these tissues, however, is usually
not a problem.
* Usar Tissue Lyser ou Rotor-Stator homogenizer
* Disruption and homogenization using rotorstator homogenizers: Rotorstator
homogenizers thoroughly disrupt and simultaneously homogenize, in the presence of lysis
buffer, single samples of animal tissues in 1590 seconds depending on the toughness and size
of the sample.