Você está na página 1de 148

Apostila

Bioquímica dos Sistemas


Cardiovascular e Respiratório

Professores:
Russolina Zingali
Robson Monteiro
2

SUMÁRIO

UNIDADE 1. Metabolismo do Miocárdio ........................................... pág. 03


UNIDADE 2. Sistema Hemostático .................................................... pág. 19
UNIDADE 3. Regulação do Processo Hemostático ......................... pág. 47
UNIDADE 4. Testes de Hemostasia ................................................... pág. 67
UNIDADE 5. Hemácias e Grupos Sanguíneos .................................. pág. 75
UNIDADE 6. Metabolismo da Hemácia .............................................. pág. 87
UNIDADE 7. Hemoglobina e Mioglobina ........................................... pág. 104

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................... pág. 122

ANEXOS
I. Anemia e Índices Hematimétricos .................................................. pág. 125
II. Aula Prática 1 – Testes de Hemostasia ........................................ pág. 140
III. Aula Prática 2 – Índices Hematimétricos e Determinação de
Grupo Sanguíneo ................................................................................ pág. 143
3

UNIDADE 1
4

1. METABOLISMO DO MIOCÁRDIO

1.1. INTRODUÇÃO

O coração necessita de energia diariamente para poder exercer a sua


função de bombear o sangue por todo o corpo humano e, assim, perfundir os
tecidos. Para que isso ocorra em harmonia, é necessário que haja uma oferta
contínua de oxigênio e substratos energéticos, o que é obtido através da
circulação coronariana.

A utilização de cada substrato pelo coração é definida tanto pela


concentração arterial de cada um deles, quanto pela demanda energética do
miocárdio em determinado momento.

1.2. COMBUSTÍVEIS DO CORAÇÃO HUMANO

As principais fontes de energia do coração são carboidratos e ácidos


graxos, os quais são utilizados em maior proporção nos estados pós-prandial e de
jejum, respectivamente. Em jejum, ou no período entre as refeições, o nível de
ácidos graxos livres no sangue é alto, e estes são preferencialmente utilizados
para o metabolismo oxidativo (Figura 1), tornando-se então a principal fonte de
energia. Quando os ácidos graxos são oxidados, a oxidação da glicose é inibida,
e a mesma é altamente convertida a glicogênio. Este fenômeno é conhecido
como “o efeito econômico da oxidação do ácido graxo”. Inversamente, quando os
níveis de glicose e insulina circulantes estão elevados, os níveis de ácidos graxos
circulantes são suprimidos; logo, o coração diminui a captação dos mesmos e,
com isso, a inibição da glicólise pelos ácidos graxos é removida, e a oxidação da
glicose é aumentada. Além disso, o próprio metabolismo da glicose suprime
diretamente a oxidação de ácidos graxos (Figura 2).

Refeições ricas em gorduras levam a um aumento acentuado de


triglicerídeos no sangue durante a lipemia pós-prandial. Nestes casos, a enzima
lipase lipoprotéica converte o triglicerídeo a ácidos graxos, que então entra nas
vias de oxidação dos mesmos. Nestas circunstâncias excepcionais, os
triglicerídeos circulantes tornam-se o principal combustível do miocárdio.

Durante exercícios físicos intensos, o nível de lactato sanguíneo eleva-se e


este se torna o principal combustível do coração, enquanto a oxidação da glicose
e a captação de ácidos graxos passam a contribuir para a obtenção de apenas
15-20% da energia necessária ao coração durante o exercício.

Os corpos cetônicos contribuem significativamente para o metabolismo


energético do coração somente em estado de jejum ou em cetose diabética
severa, pois, assim como os ácidos graxos e o lactato, sua utilização é
dependente de sua concentração. Finalmente, na isquemia, vale ressaltar que o
padrão de captação de substratos modifica-se de uma predominância da
utilização de lipídeos para a de carboidratos.
5

Figura 1. Metabolismo Oxidativo dos Ácidos Graxos. Quando o nível sanguíneo de ácidos
graxos livres (FFA) é alto, estes são utilizados como a principal fonte de energia do coração. Além
disso, enquanto os ácidos graxos são oxidados, a oxidação da glicose encontra-se reduzida, e a
mesma é altamente convertida a glicogênio. GS = glicogênio sintase; PFK = fosfofrutoquinase;
PDC = complexo piruvato desidrogenase.

Figura 2. Controle da Insulina sobre a Absorção da Glicose pelo Coração. Quando os níveis
de glicose e insulina circulantes estão elevados, o coração diminui a absorção dos ácidos graxos,
e a oxidação da glicose é aumentada.
6

1.2.1. Ciclo Glicose-Ácido Graxo

O ciclo glicose-ácido graxo, primeiramente descrito por Randle e


colaboradores (1963), é baseado na variação dos papéis relativos da glicose e do
ácido graxo como principais fontes de energia entre os estados abastecidos e em
jejum (Figura 3). A produção cíclica (liga/desliga) de ácido graxo pelo tecido
adiposo é o evento básico no ciclo. Durante o jejum, o tecido adiposo é quebrado
para liberar ácidos graxos, inibindo o metabolismo da glicose pelo coração. Após
as refeições, a presença de glicose estimula a produção de insulina e a primeira
torna-se o principal combustível. A contribuição de determinado combustível para
o metabolismo oxidativo do coração varia no decorrer do dia de acordo com seus
níveis circulantes, assim como com o tipo de alimento ingerido e com a prática de
exercício físico.

Figura 3. Metabolismo Cardíaco da Glicose e dos Ácidos Graxos. Os miócitos cardíacos


transportam a glicose para o seu interior através dos transportadores específicos GLUT 1 e GLUT
4. A glicose é metabolizada na via glicolítica e produz piruvato, que pode ser então oxidado na
mitocôndria a acetil CoA pela enzima piruvato desidrogenase (PDH). A acetil CoA entra no ciclo do
ácido cítrico e gera equivalentes redutores para a produção de ATP na cadeia transportadora de
elétrons. Já os ácidos graxos entram nos miócitos por difusão passiva ou mediada por
translocases específicas. Estes são então esterificados pela acil CoA sintase e subsequentemente
transportados à mitocôndria pela via da carnitina acil transferase 1 (CAT-1 ou CPT-1, no
esquema), onde são oxidados e geram acetil CoA.
7

1.2.2. Metabolismo Oxidativo da Glicose

A captação da glicose pelas células cardíacas é controlada pelos


transportadores de glicose GLUT 4 e GLUT 1 (Figura 2). Como a concentração de
glicose no meio extracelular é maior do que no intracelular, este transporte não
requer energia. A absorção da glicose aumenta sempre que os transportadores
são estimulados, como durante o trabalho cardíaco aumentado, no período pós-
prandial, ou em situações de hipóxia ou isquemia, condições estas que aumentam
também a glicólise. Por outro lado, a absorção da glicose é reduzida pelos fatores
que inibem a glicólise, como um baixo trabalho cardíaco, o jejum, ou em casos de
diabetes mellitus severa. Nas últimas duas condições, o nível de ácidos graxos no
sangue encontra-se elevado.

No período pós-prandial com consumo de carboidratos, os níveis


circulatórios de glicose elevam-se e a liberação de insulina, um hormônio
circulante, é estimulada. Esta aumenta o número dos transportadores de glicose
GLUT 4 e GLUT 1 no sarcolema (Figura 2), translocando-os de sítios internos não
disponíveis para sítios externos. Logo, a insulina estimula a taxa de reciclagem
desses transportadores entre sítios internos e externos. A insulina se liga a
receptores específicos, os quais consistem de uma sub-unidade α externa e uma
sub-unidade β interna. A ligação da insulina na sub-unidade α leva a uma
autofosforilação da sub-unidade β, a qual amplifica fortemente o efeito da insulina
e promove a ativação de tirosina cinases, desencadeando vias de sinalização
celulares que irão culminar, por exemplo, em um aumento da atividade de
enzimas como a glicogênio sintase e a piruvato desidrogenase.

Em diversas doenças, tais como a diabete tardia, falha cardíaca congestiva


e alguns tipos de hipertensão, o transporte de glicose encontra-se prejudicado
mesmo com níveis de insulina aparentemente normais ou até elevados. Estes são
casos de resistência à insulina.

1.2.3. Via Glicolítica

A glicólise é a via metabólica que converte a glicose a piruvato (Figura 4a).


Durante o metabolismo oxidativo normal, a glicose gera piruvato, que então é
oxidado no ciclo do ácido cítrico (ou Ciclo de Krebs). Ao entrar na célula cardíaca,
a glicose é rapidamente convertida pela enzima unidirecional hexoquinase a
glicose 6-fosfato. Esta é então dirigida para a síntese de glicogênio ou para a
glicólise.

Na glicólise, a glicose-6-fosfato é convertida a frutose 1,6-bisfosfato pela


fosfofrutoquinase (PFK), uma das enzimas que regulam o fluxo desta via. Quando
sua atividade é aumentada, como em hipóxia, a conversão da glicose 6-fosfato a
frutose 1,6-bisfosfato, via frutose 6-fosfato, ocorre em uma taxa aumentada
(Figura 4a).
hexoquinase
glicose + ATP glicose 6-fosfato + ADP

glicose 6-fosfato frutose 6-fosfato


8

PFK
frutose 6-fosfato + ATP frutose 1,6-bisfosfato + ADP

Depois disso, cada frutose 1,6-bisfosfato é convertida a duas moléculas de


trioses fosfato (Figura 4a). Nas etapas seguintes, duas moléculas de piruvato e
quatro de ATP são formadas independentemente da presença de oxigênio, além
de 2 (NADH + H+) (Figura 4a).

frutose 1,6-difosfato + 2 Pi + 4 ADP + 2 NAD+ 2 x piruvato + 4 ATP + 2


NADH + + 2 H + + 2 H 2O

Logo, no balanço geral, uma molécula de glicose gera duas de ATP, duas
de piruvato, duas de H2O, e dois (NADH + H+).

a.

b. LDH

PDH

Figura 4. Metabolismo Aeróbio e Anaeróbio da Glicose. a) Via glicolítica: a via metabólica da


conversão da glicose a piruvato. b) Destinos do piruvato dependendo das condições de oxigênio:
anaeróbia – formação de lactato; aeróbia – descarboxilação oxidativa. LDH = lactato
desidrogenase; PDH = piruvato desidrogenase.
9

Cabe ressaltar que existe um controle intracelular coordenado da glicólise,


de tal modo que a absorção e fosforilação da glicose, a atividade da PFK e a da
piruvato desidrogenase podem aumentar ou diminuir simultaneamente em
resposta a um trabalho aumentado do coração, assim como a outros estímulos.
Esses são, portanto, pontos-chave no controle da glicólise.

1.2.4. Metabolismo Aeróbico dos Ácidos Graxos (AGs)

O metabolismo miocárdico dos AGs começa em função de seus níveis


circulantes. Ou seja, quanto maior o seu nível, maior será a relação molar
AG/albumina, e maior será a captação dos AGs pelo miocardio. Uma vez
captados, os AGs passam por uma série de mudanças até a formação de
moléculas de acetil CoA. O primeiro passo desta via é a ativação dos AGs
intracelulares pela coenzima A (CoA) para formar derivados de acil CoA. A
membrana mitocondrial não é permeável a essas moléculas, que necessitam,
portanto, serem transformadas e transportadas para o interior da mitocôndria.
Inicialmente, as moléculas de acil CoA combinam-se com a carnitina, formando
acil carnitina, que é transportada pelo sistema carreador de carnitina para o
espaço mitocondrial interno. Depois disso, as longas cadeias de acil CoA, já livres
de carnitina, sofrem β-oxidação e progressivamente são formadas moléculas de
acetil CoA, as quais são oxidadas no ciclo do ácido cítrico e finalmente levam à
geração de ATP. Qualquer AG intracelular não oxidado pode ser estocado como
triglicérides ou transformado em lipídeos estruturais por alterações no grau de
saturação. Os triglicérides (ou triacilgliceróis) teciduais podem ser fontes de
ácidos graxos quando os níveis destes estão baixos na circulação (Figura 5).

Sumário das etapas do metabolismo dos AGs:

1. AG intracelular reage com CoA e forma acil CoA extramitocondrial:


Acil CoA sintetase
AG + CoA + ATP acil CoA + AMP + PPi

2. Acil CoA extramitocondrial reage com a carnitina e forma acil cartinina,


reação essa catalisada pela enzima carnitina acil transferase 1 (CAT-1);
3. A enzima carnitina acil translocase transloca a acil carnitina
extramitocondrial para o espaço intramitocondrial;
4. A enzima carnitina acil transferase 2 (CAT-2) permite à acil carnitina
intramitocondrial reagir com a CoA, e ocorre a liberação de acil CoA
intramitocondrial e carnitina. Esta última é exportada de volta ao
citoplasma;
5. A acil CoA intramitocondrial sofre β-oxidação e forma unidades de dois
carbonos de acetil CoA, que entram no ciclo do ácido cítrico;
6. Quando os níveis de captação de AGs são bem elevados, ocorre mais
formação de acetil CoA do que o ciclo do ácido cítrico é capaz de
consumir. Nestes casos, o excesso de acetil CoA pode também reagir com
carnitina intramitocondrial, formando acetil carnitina, que é transportada ao
espaço extramitocondrial pela enzima carnitina-acetil translocase, onde
ocorre formação de acetil CoA citoplasmático. Este pode então sofre
transformação a malonil CoA, que provê um feedback inibitório.
10

O malonil CoA é produzido sempre que elevados níveis de acetil CoA


citossólico estão presentes devido ao alto metabolismo de AGs, ou às altas taxas
de oxidação da glicose.

1.2.5. β-Oxidação

A β-oxidação converte a longa cadeia de acil CoA em fragmentos de dois


carbonos de acetil CoA. A oxidação do AG continuamente remove uma molécula
de acetil CoA da terminação carboxi da cadeia.

Durante o esforço cardíaco aumentado, a mitocôndria torna-se mais


oxidada. Os níveis intramitocondriais de NADH2 e FADH2 diminuem, e ocorre um
aumento na taxa de oxidação dos ácidos graxos. Por outro lado, na anaerobiose,
os níveis de NADH2 e FADH2 aumentam, como resultado de uma redução da taxa
de β-oxidação devido ao diminuído transporte de elétrons.

Figura 5. Descrição detalhada da absorção e degradação dos ácidos graxos pela


mitocôndria. Os números correspondem às enzimas acil CoA sintase (1), carnitina acil
transferase 1 (2), carnitina acil translocase (3), carnitina acil transferase 2 (4) e 3-hidroxiacil-CoA
desidrogenase (5). Fp = flavoproteína, NAD+ = nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidada, NADH
= nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida.
11

Um resumo do metabolismo energético das células cardíacas está


representado na Figura 6.

Figura 6. Representação esquemática da absorção e metabolismo dos substratos nas


células musculares cardíacas. FAT, fatty acid translocase; FABP, sarcoplasmic fatty acid-binding
protein; NAD, nicotinamide adenine dinucleotide; NADH, reduced niconamide adenine
dinucleotide.

1.2.6. Piruvato e Lactato

O piruvato é formado a partir do lactato absorvido pelo coração e pela


degradação da glicose, e situa-se na intersecção da glicólise e do metabolismo
oxidativo no ciclo do ácido cítrico. No coração anaeróbico, o piruvato forma
lactato; no aeróbico, sofre descarboxilação oxidativa e entra no ciclo do ácido
cítrico. Esta reação ocorre pela atividade do complexo enzimático da piruvato
desidrogenase (PDH) (Figura 4b), encontrado na membrana interna da
mitocôndria. Os produtos desta reação de múltiplas etapas incluem a acetil Coa e
NADH2. A primeira entra diretamente no ciclo de Krebs e é totalmente oxidada a
CO2 e H2O, e a segunda forma ATP pela fosforilação oxidativa.

A piruvato desidrogenase é encontrada tanto na forma ativa como na


inativa. Normalmente, encontra-se na forma inativa, mas pode ser ativada pelo
aumento do esforço cardíaco, pelas catecolaminas ou pelas altas taxas de
glicólise do estado pós-prandial. Por outro lado, a enzima é inibida pela formação
12

de NADH2 na isquemia ou na hipóxia, ou pela oxidação dos ácidos graxos. A


inibição desta enzima é o evento-chave na inibição da glicólise durante a
oxidação dos ácidos graxos.

O lactato é absorvido pelo coração aeróbico e produzido durante a


anaerobiose; então, a sua liberação no seio coronário pode ser usada como um
sinal de isquemia do miocárdio. A contribuição do lactato para as necessidades
de energia de um miocárdio bem oxigenado pode aumentar a até 60% quando o
seu nível em circulação encontra-se elevado, como por exemplo durante e logo
após exercício físico. Durante infusão de lactato, a contribuição do mesmo pode
subir a até 90%. O lactato é um combustível muito menos importante quando seu
nível está baixo, ou quando os níveis dos ácidos graxos estão elevados. A
absorção do lactato pelo coração depende de um sistema de transporte
específico, pois o sarcolema não é livremente permeável ao mesmo. Uma vez
absorvido, o lactato é convertido a piruvato pela lactato desidrogenase (LDH),
sendo que esta reação é reversível:

LDH
lactato + NAD+ piruvato + NADH + H+

Existem cinco isoformas de LDH, nomeadas de acordo com suas


migrações eletroforéticas. Cada enzima é composta de quatro subunidades do
tipo H ou M. A isoforma cardíaca é constituída predominantemente de subunidade
H, e é conhecida como LDH-1. Pode-se estimar o tamanho de um infarto do
miocárdio dosando-se a taxa de aparecimento e desaparecimento de LDH-1 no
sangue periférico, com picos entre 35-43 horas após o aparecimento dos
sintomas.

1.2.7. Corpos Cetônicos

Os corpos cetônicos (CC) são formados no fígado em decorrência do


metabolismo excessivo de ácidos graxos através da β-oxidação. Esse processo,
como já mencionado anteriormente, consiste na degradação dos ácidos graxos
nas mitocôndrias através da liberação progressiva de fragmentos de dois
carbonos, na forma de acetil Coenzima A (acetil CoA).

Durante um jejum prolongado, quando a glicemia encontra-se muito baixa,


os níveis de ácidos graxos elevados, os níveis de insulina baixos e os de
glucagon altos, há estímulo para a gliconeogênese, que ocorre principalmente no
fígado, e desvia o oxaloacetato do ciclo do ácido cítrico. A gliconeogênese
aumentada é necessária porque alguns órgãos nobres, como o cérebro, utilizam
principalmente a glicose como fonte energética. Desta forma, ocorre o acúmulo de
acetil CoA pelo metabolismo excessivo de ácidos graxos, e diminuição da via do
ácido cítrico devido ao desvio do oxaloacetato para a gliconeogênese. Com esse
acúmulo, ocorre aumento na produção de corpos cetônicos pelo fígado que se
formam pela união de duas moléculas de acetil CoA. Inicialmente, é formado
acetoacetato, que é transportado pelo sangue do fígado para diversos órgãos que
podem utilizá-lo como fonte energética. O acetoacetato é ainda convertido a β-
13

hidroxibutirato ou acetona. Esses três compostos são denominados corpos


cetônicos (Figura 7).

Figura 7. Síntese dos Corpos Cetônicos. Duas moléculas de acetil CoA se juntam e formam o
acetoacetato, que pode se transformar em β-hidroxibutirato ou acetona. Corpos cetônicos:
acetoacetato, β-hidroxibutirato e acetona.

Portanto, quando grande parte da energia do organismo provém do


metabolismo das gorduras, como na inanição, nas dietas ricas em gorduras e no
diabetes não tratado, aumenta a produção de corpos cetônicos. A utilização
desses compostos pelas células cardíacas é mediada pela enzima tiolase, que
realiza a reação inversa e converte corpos cetônicos em duas moléculas de acetil
CoA. Como no miocárdio não ocorre gliconeogênese e, nessas células, o
oxalacetato não é desviado do ciclo do ácido cítrico, o acetil CoA formado segue
nesta via, gerando energia para o coração.

Nos diabéticos descompensados, mesmo que a glicemia esteja elevada, a


glicose não consegue ser absorvida pelas células insulino-dependentes, uma vez
que o estímulo para a exposição dos transportadores GLUT 1 e GLUT 4 dado
pela insulina não encontra-se ativo, por falta de ou resistência a esse hormônio.
Logo, observa-se uma intensa produção hepática de corpos cetônicos nesses
pacientes, assim como uma grande utilização desses substratos como fonte de
energia pelos miócitos cardíacos, mesmo em situações pós-prandiais. Vale
ressaltar que o acúmulo de corpos cetônicos na corrente sanguínea (cetose),
observado na diabetes não tratada, pode levar a um quadro de acidose
metabólica severa (cetoacidose) nesses indivíduos.
14

1.3. PRINCIPAIS RESERVAS DE ENERGIA

O coração possui reservas de energia que são poupadas para momentos


de carência energética, como por exemplo, durante a isquemia. A isquemia é a
interrupção do fluxo sangüíneo para determinado órgão, diferente da hipóxia, que
é a interrupção apenas da chegada de oxigênio, podendo ou não haver fluxo
sangüíneo.

Durante uma isquemia, portanto, o coração fica privado tanto dos


substratos energéticos, como ácidos graxos, glicose, lactato e corpos cetônicos,
quanto de hormônios como glucagon e adrenalina. Para continuar funcionando,
então, os miócitos cardíacos utilizam suas principais reservas energéticas:
creatina-fosfato e glicogênio.

1.3.1. Creatina-Fosfato

O miocárdio utiliza as reservas de creatina fosfato, principalmente, para a


manutenção da integridade da membrana plasmática (mantém os canais
dependentes de ATP). A creatina fosfato transfere fosfato ao ADP, formando
creatina e restaurando os níveis de ATP, cuja produção está muito reduzida
durante a isquemia. Essa reação é catalisada pela enzima creatina fosfoquinase
cardíaca (CPK-MB). Essa mesma enzima também se localiza próximo à
membrana mitocondrial, e, nessa região, quando as ofertas de oxigênio e ATP
são normalizadas, a CPK-MB restaura os níveis de creatina fosfato através da
reação inversa. Assim, a creatina fosfato é uma fonte energética de curtíssima
duração.

1.3.2. Glicogênio

O glicogênio é um polissacarídeo constituído de várias moléculas de


glicose, que forma grandes grânulos no citoplasma da célula cardíaca. As
moléculas de glicogênio estão em constante estado de turnover, como resultado
das taxas variáveis de síntese e degradação das mesmas. As vias de síntese e
degradação do glicogênio são realizadas por dois sistemas de enzimas diferentes.
A síntese ocorre em altas taxas nos períodos pós-prandiais sob influência da
insulina, que aumenta a absorção da glicose e estimula a atividade da enzima
glicogênio sintase (Figura 1). A síntese do glicogênio parece também acontecer
após intenso esforço cardíaco ou após isquemia, quando o glicogênio é
depletado, sugerindo que a própria diminuição dos níveis de glicogênio é capaz
de estimular sua produção. No estado de jejum, embora haja falta de insulina, a
síntese do glicogênio ainda pode ocorrer, mesmo que em menor taxa, porque a
glicogênio sintase é estimulada por altos níveis miocárdicos de glicose 6-fosfato,
que resultam do bloqueio da via glicolítica. A energia requerida para a síntese do
glicogênio é derivada de um composto fosfato de alta energia, uridina trifosfato
(UTP), que é formado a partir do ATP.

Já os dois principais mecanismos que levam à glicogenólise são: (1)


ativação da glicogênio fosforilase pela adenosina monofosfato cíclica (cAMP); ou
15

(2) na isquemia, por uma diminuição nos níveis de fosfato de alta energia. Um
aumento em cAMP promove uma cascata de eventos que no final converte a
enzima fosforilase b inativa à fosforilase a altamente ativa:

estímulo de catecolaminas β-receptor adenilato ciclase cAMP *


* ativação de proteína quinase ativação da fosforilase b quinase *
* mudança da fosforilase b à fosforilase a degradação do glicogênio

A glicogênio fosforilase cataliza a reação em que uma ligação glicosídica,


reunindo dois resíduos de glicose no glicogênio, sofre o ataque por fosfato
inorgânico (Pi), removendo o resíduo terminal não-redutor de glicose como
glicose 1-fosfato. A fosforilase age repetitivamente nas extremidades não-
redutoras das ramificações do glicogênio, controlando assim o início da
glicogenólise durante hipóxia ou isquemia. A continuação da degradação pode
ocorrer apenas depois da ação de uma enzima de desramificação, que cataliza as
reações sucessivas que removem as ramificações.

Função do Glicogênio Cardíaco

O glicogênio cardíaco é uma fonte potencial de energia miocárdica,


produzindo três moléculas de ATP durante a glicólise e a quantidade padrão de
ATP através do ciclo do ácido cítrico em condições aeróbicas. O glicogênio tem o
papel estabelecido como fonte de energia durante hipóxia ou isquemia
miocárdica. Além dessas condições de curta duração, o turnover do glicogênio
pode contribuir substancialmente para a glicólise aeróbica em um coração em
trabalho normal, e pode ser oxidado preferencialmente à glicose externa,
especialmente logo depois de um estímulo β-adrenérgico aumentado. Como o
glicogênio está situado nas proximidades do retículo sarcoplasmático, seu
turnover pode fornecer ATP no local para a bomba de captação de Ca2+.

1.4. DOENÇA CARDÍACA DA ESTOCAGEM DE GLICOGÊNIO

A degradação do glicogênio pode ocorrer em lisossomos das células


cardíacas através de uma outra via, dependente de α-1,4 glicosidase. Quando
esta enzima é inativa, ocorre um acúmulo muito grande de glicogênio que pode
levar a uma condição de glicogenólise cardiomegálica ou doença de Pompe
(Figura 8). As membranas lisossomais se rompem devido ao acúmulo de
glicogênio, com risco de destruição do músculo cardíaco. A glicogenólise
citoplasmática, dependente de fosforilase e da enzima desramificadora, ocorrem
normalmente.
16

Figura 8. Eletromicrografia de Tecido Cardíaco de Paciente com Doença de Pompe.


(aumento de 6.500 X) A célula superior consiste de muitos elementos contrácteis intactos, com as
terminações e a lateral da fibra esfiapadas, e glicogênio ligado à membrana (seta descontínua). O
citoplasma da célula inferior foi totalmente “substituído” pelo glicogênio (seta contínua). Verifica-se
que os elementos contráteis ou mitocôndrias não foram mantidos, e as membranas lisossomais
rompidas flutuam livremente no glicogênio.

1.5. REPERFUSÃO

O coração é irrigado pelas artérias coronarianas que, normalmente,


adaptam-se ao aumento de demanda energética. Caso isso não aconteça, pode
ocorrer hipóxia por redução do fluxo sanguíneo no coração, causando lesões
reversíveis ou irreversíveis, dependendo do tempo de hipóxia. Se as lesões forem
irreversíveis, mesmo após a reperfusão, não há restauração das estruturas
celulares, gerando áreas de necrose. Por outro lado, quando as lesões são
reversíveis, a velocidade de reperfusão deve ser definida pelo tempo de hipóxia
sofrido. Quanto maior o tempo de hipóxia, menor deve ser a velocidade de
reperfusão, pois a rápida restauração do fluxo sangüíneo após um longo período
de hipóxia gera aumento paradoxal da lesão.

Em situações fisiológicas, o metabolismo das bases nitrogenadas leva a


formação de pequena quantidade de hipoxantina, que através da enzima xantina
oxidase, na presença de O2, leva a formação de xantina e peróxido de hidrogênio
(H2O2), que são rapidamente degradados.

A isquemia, ao longo do tempo, leva ao esgotamento de fontes energéticas


como ácidos graxos, glicose, fosfocreatina e glicogênio, e ao acúmulo de
metabólitos do ATP, como ADP, AMP, adenosina e inosina (Figura 9). Como o
ATP nessas ocasiões não pode ser regenerado, as ligações fosfato de menor
energia (ADP e AMP) tendem a ser utilizadas como fonte energética para a
tentativa de manutenção da maquinaria celular, gerando, portanto, o acúmulo
dessas substâncias. O aumento da concentração desses metabólitos estimula a
17

formação de hipoxantina a partir de adenosina e inosina, através de reações


catalisadas por enzimas presentes no citoplasma das células cardíacas.

Quando o fluxo sangüíneo é restabelecido, através do uso de trombolíticos,


por exemplo, o oxigênio que chega ao miocárdio ativa a enzima xantina oxidase.
Essa enzima utiliza a hipoxantina como substrato para gerar xantina e H2O2, que
se acumula. Essa mesma enzima ainda pode utilizar a xantina como substrato
para gerar ácido úrico. Já o peróxido de hidrogênio formado pode dissociar-se em
dois radicais livres hidroxila (OH·). Essas espécies reativas peroxidam lipídios (os
lipídios peroxidados tornam-se instáveis e reativos, iniciando uma reação
autocatalítica em cadeia), reagem com proteínas da membrana celular
(aumentam a sua degradação) e provocam danos ao DNA (ruptura dos seus
filamentos), agravando as alterações em áreas com lesões ainda reversíveis. O
miocárdio possui mecanismos protetores antioxidativos contra esses radicais
livres, mas como estes radicais estão sendo formados em alta velocidade, há
discrepância entre a síntese dos mecanismos protetores e dos radicais livres.

O2

Glicólise Anaeróbia

Ciclo do
Ácido
NADH Cítrico
Cadeia FADH2 Lactato
Respiratória

Acidose Lática

ADP/AMP Reperfusão Estoque de Glicogênio


Adenosina/Inosina

O2

Hipoxantina Xantina Ácido Úrico


Xantina Xantina
Oxidase Oxidase

H2O2

Peroxidação de Lipídeos HO
- Modificação Oxidativa de
Proteínas

Danos ao DNA

Figura 9. Efeito da Reperfusão sobre o Metabolismo de Produtos de Degradação da


Adenosina. Durante a hipóxia, o metabolismo de adenosina e inosina leva ao acúmulo de
hipoxantina. A reperfusão, aumento repentino de O2, leva a uma ativação da enzima xantina
oxidase, que transforma a hipoxantina em xantina e liberação de H2O2. A xantina é posteriormente
transformada em ácido úrico. O acúmulo de espécies reativas de O2 leva a danos nos tecidos.
18

Quando a reperfusão ocorre gradualmente, apesar de haver muito


substrato (hipoxantina) para a enzima xantina oxidase, o estímulo lento do
oxigênio permite que haja sincronia entre a produção de radicais livres e
mecanismos antioxidantes de defesa celular.

Durante a perfusão normal do miocárdio, com aporte de oxigênio e


nutrientes, a enzima xantina oxidase também está ativa. No entanto, nessas
ocasiões, os níveis de metabólitos de ATP não estão elevados, pois o ATP está
sendo sempre renovado. Portanto, não há formação em excesso de hipoxantina,
o substrato da xantina oxidase. Assim, a formação de radicais livres não é
significante, pois os mecanismos celulares de proteção a esses radicais
conseguem dar conta da pequena quantidade produzida.

1.6. MARCADORES BIOQUÍMICOS DE ISQUEMIA MIOCÁRDICA

O dano celular provoca a ruptura da membrana plasmática, com


conseqüente extravasamento do conteúdo intracelular para o interstício. Através
da drenagem venosa, essas substâncias caem na corrente sangüínea, permitindo
que se estime ocorrência de infarto através das suas dosagens. Os principais
marcadores bioquímicos utilizados são as isoformas cardíacas das troponinas T e
I, mioglobina, CK-MB, e a enzima LDH-1. A troponina I é o marcador mais
específico, mas demora um pouco para ter sua concentração sangüínea elevada;
no entanto, seus níveis mantêm-se altos entre 7 a 10 dias após o episódio de
infarto. A mioglobina é o primeiro marcador a apresentar seus níveis elevados,
mas apesar de ser muito sensível, é pouco específica, pois sua concentração
aumenta após qualquer injúria muscular, não só do miocárdio. A CK-MB, uma
isoforma cardíaca da creatina fosfoquinase, e a LDH-1, isoforma cardíaca da
lactato desidrogenase, também apresentam alterações mais tardias na corrente
sangüínea, mas as suas dosagens são realizadas de rotina, pois apresentam
baixo custo e resultado satisfatório. Todas essas enzimas devem ser dosadas
periodicamente, e seus resultados anotados em um gráfico, formando uma curva
enzimática e permitindo, assim, a confirmação do diagnóstico, a monitoração da
lesão e a estimativa do tamanho do infarto do miocárdio.

Autor(es):
Catarina A. Miyamoto
Eduarda P. Redenschi
Luize Gonçalves Lima
Russolina Zingali
19

UNIDADE 2
20

2. SISTEMA HEMOSTÁTICO

2.1. PRINCÍPIOS GERAIS

Hemostasia é o processo fisiológico responsável pela manutenção da


fluidez do sangue e pela contenção da perda de sangue após algum dano
vascular, evitando perturbações no fluxo sanguíneo, além de estar envolvido no
início do processo de reparo tecidual. O sistema hemostático contribui ainda para
o sistema de defesa, uma vez que previne ataques de microorganismos por
formar uma rede de plaquetas e fibrina, que é dissolvida mais tarde com o
restabelecimento do fluxo sangüíneo normal. Simultaneamente à hemostase,
inicia-se um processo um pouco mais lento de formação de um novo tecido e
revascularização.

Mas quais são os agentes participantes do processo de hemostasia? De


maneira geral, podemos citar:

• Plaquetas;
• Parede vascular (especialmente endotélio e subendotélio);
• Fatores de coagulação e seus inibidores;
• Proteínas plasmáticas (fator de von willebrand, outras proteínas de
adesão, imunoglobulinas);
• Íons Ca2+;
• Substâncias orgânicas de baixo peso molecular (fosfolipídeos,
prostaglandinas, etc);
• Citocinas e hormônios.

As interações desses agentes podem ser estimuladas principalmente após


uma lesão vascular, mas também em condições patológicas como doenças auto-
imunes, aterosclerose ou câncer.
21

Mas por que, em condições fisiológicas, essas interações não ocorrem o


tempo todo, se grande parte dos fatores envolvidos encontra-se circulante ou
presente nos vasos sanguíneos? A resposta é que os fatores de coagulação, em
sua maioria consistindo de proteínas plasmáticas, circulam na forma de
zimogênios, isto é, pré-enzimas que requerem processamento por proteólise para
que se tornem ativas. Além disso, a camada interna dos vasos, formada pelas
células endoteliais, possui um papel preponderantemente anti-hemostático.

As células endoteliais são capazes de:

• Separar fisicamente o sangue do subendotélio (que é a camada que


possui substâncias pro-hemostáticas);
• Sintetizar e liberar prostaglandina do tipo PGI2 (prostaciclina) e óxido
nítrico, substâncias que reduzem a resposta plaquetária a estímulos
ativadores da hemostasia primária;
• Além disso, possuem em sua membrana externa, em contato com o
sangue, duas substância anti-hemostáticas: a proteína trombomodulina
e o glicosaminoglicano heparan sulfato (que será discutido
futuramente).

A figura abaixo demonstra como está o endotélio na hora em que a lesão


ocorre, ou seja, o endotélio intacto e, portanto, inibidor da hemostasia. Além
disso, o esquema à direita demonstra o endotélio lesionado e sua ação
trombogênica.

Figura 10. Ações Endoteliais Opostas (Antirombótica Vs. Pró-Trombótica) em Diferentes


Situações. Repouso (à esquerda); ou frente uma lesão (à direita).

Para o melhor entendimento do processo hemostático, este é dividido em fases:

• Hemostasia primária – consiste na formação de tampão ou agregado


plaquetário;
• Hemostasia secundária ou coagulação – consiste na formação de uma
rede de fibrina (coágulo) encarregada de estabilizar a agregação
plaquetária.
22

Após a hemostasia secundária, ocorre a dissolução do coágulo de fibrina.


A essa fase denominamos fibrinólise.

Cada capítulo dessa unidade é destinado a elucidar cada uma dessas


fases, que estão esquematizadas com suas respectivas durações na figura
abaixo:

LESÃO HEMOSTASIA HEMOSTASIA FIBRINÓLISE


PRIMÁRIA SECUNDÁRIA
(1-5 min) (3-15 min) Ativação da fibrinólise
(minutos)
Vasoconstricção Ativação dos fatores
(3-10 seg) de coagulação Lise do “coágulo”
(horas)
Adesão Formação de fibrina
plaquetária (minutos)
(segundos)

Agregação plaquetária
(minutos)

Figura 11. Resumo das Fases do Processo Hemostático.


23

2.2. HEMOSTASIA PRIMÁRIA

Hemostase primária consiste em uma série de eventos, os quais incluem


vasoconstricção e adesão, ativação e agregação plaquetárias, como apresentado
na figura abaixo.

Figura 12. Participação das Plaquetas no Processo de Hemostasia durante a Formação do


Tampão. A) Processo de injúria com exposição de agonistas plaquetários; B) Adesão das
plaquetas ao subendotélio; C) Mudança de forma da plaqueta com secreção de grânulos; D)
Ligação plaqueta-plaqueta; E) Depósito de fibrina sobre o tampão plaquetário.

2.2.1. Vasoconstricção

Eficiente forma de prevenir perdas sanguíneas, em especial na


microcirculação. É um processo mediado por uma interação do sistema nervoso
autônomo, células musculares e diversos mediadores como serotonina,
adrenalina e noradrenalina.

Para modular a vasoconstricção e impedir que essa seja extrema e cause


isquemia, a prostaciclina I2 e a liberação de óxido nítrico pelo endotélio possuem
ação vasodilatadora.

A vasoconstricção é extremamente rápida e eficiente para conter pequenos


sangramentos. Para sangramentos maiores, são recrutadas as plaquetas.

2.2.2. Plaquetas: Sua Estrutura e Funções

As plaquetas constituem o grupo celular mais importante da hemostasia.


São fragmentos de células com formato discoidal, sintetizados na medula óssea,
e representam uma forma especializada e madura dos megacariócitos. Sua
24

síntese é estimulada pelo hormônio trombopoietina, que é encontrado em baixas


concentrações no plasma.

O citoesqueleto da plaqueta contribui significativamente para a manutenção


da sua forma discóide e para a sua alteração de forma, que ocorre durante a fase
de ativação plaquetária. Metabolicamente, as plaquetas perderam a capacidade
de sintetizar proteínas. Sua energia é gerada essencialmente pela degradação da
glicose e fosforilação oxidativa.

Em geral, as plaquetas tornam-se ativadas e, portanto, pró-hemostáticas,


ao serem estimuladas por diferentes fatores. Por sua vez, as plaquetas ativadas
secretam diversas citocinas, fatores de crescimento e outras proteínas por meio
de grânulos.

A plaqueta contém dois sistemas internos de membrana:

• Sistema canalicular aberto, que é formado por múltiplas invaginações,


semelhantes a uma esponja, que são visualizadas na superfície da
plaqueta. Durante a ativação plaquetária, a plaqueta secreta seus
grânulos através desses canais. O sistema canalicular também fornece
pseudópodes que são emitidos com a mudança de forma que a
plaqueta sofre após sua ativação.
• Sistema tubular denso, que é constituído por restos de
reticuloendoplasmático. Este sistema membranoso, que não se
comunica com o exterior, serve como um local de depósito de cálcio
intracelular.

A forma como as plaquetas atuam na hemostase é discutida abaixo e,


didaticamente, dividimos essa participação plaquetária nas três fases a seguir:

Adesão Plaquetária

Essa etapa se inicia quando a plaqueta entra em contato com uma


superfície não fisiológica, gerada por uma lesão do endotélio. Tal lesão faz com
que o colágeno subendotelial seja exposto às plaquetas circulantes. A adesão
inicia-se com a interação entre o colágeno e as plaquetas, que ocorre pela ligação
direta do receptor plaquetário glicoproteína Ia/IIa (GPIa/IIa) às fibrilas de
colágeno. Outro receptor presente na superfície das plaquetas, a glicoproteína
Ib/IX/V (GP Ib/IX/V), também participa da interação plaqueta-colágeno, porém de
maneira indireta. Este receptor se liga a uma proteína plasmática denominada
fator de von WIllebrand (FwV), a qual, por sua vez, está ligada ao colágeno. O
FvW age, portanto, produzindo uma espécie de “gancho” entre a plaqueta (mais
especificamente o receptor plaquetário GP Ib/IX/V) e o colágeno subendotelial.

Cabe ressaltar que este último exemplo de interação (GP Ib/IX/V-FvW-


colágeno) é determinante para a estabilização da adesão plaquetária inicial ao
espaço subendotelial, especialmente sob alta força de fluxo da corrente
sanguínea, permitindo a continuidade do processo de hemostasia primária.
Assim, ambas as deficiências genéticas de FvW (Doença de von Willebrand) ou
25

do seu receptor GPIb/IX/V (Síndrome de Bernard-Soulier) resultam em adesão


plaquetária defeituosa e distúrbios hemorrágicos, como demonstrado na figura
abaixo.

Figura 13. Doenças Relacionadas à Hemostasia Primária.

Fator de von Willebrand

O FvW é sintetizado nos megacariócitos e nas células endoteliais, e


armazenado, respectivamente, em grânulos α e em organelas específicas,
denominadas corpos de Weibel-Palade. O FvW é uma proteína de alto peso
molecular que forma multímeros extensos, sendo encontrado tanto no plasma
(associado ao fator VIII) como em plaquetas, e, ainda, na região subendotelial.
Sua concentração plasmática é aproximadamente 30% menor em indivíduos do
grupo sanguíneo “O”.

Este fator apresenta sítios de ligação específica aos receptores


plaquetários GPIb/IX/V, ao fator VIII, ao colágeno, e à proteína botrocetina,
derivada de veneno de cobra. A função de carregar o fator VIII é de extrema
importância. A concentração plasmática do FvW é de 50 nmol/L excedendo em
quase 50 vezes a de FVIII (1 nmol/L). Ambas as proteínas possuem grande
afinidade uma pela outra e, portanto, praticamente todo o FVIII encontra-se ligado
ao FvW. Este estabiliza e protege o FVIII da inativação proteolítica, transportando-
o até o local da lesão e aumentando, assim, sua concentração local. Depois da
ativação do FVIII, este se desliga do FvW, podendo ser inativado pela proteína C.
26

Ativação Plaquetária

Uma vez aderida, através da interação plaqueta-subendotélio


eficientemente estabilizada pelo FvW, a plaqueta sofre um estímulo de ativação
pela própria ligação ao colágeno, além da ação de outras substâncias ativadoras
– os agonistas plaquetários. O colágeno, a trombina, o ADP e a adrenalina, entre
outros, são exemplos de agentes responsáveis pelo processo de ativação
plaquetária. Na tabela abaixo, estão os principais agonistas e seus respectivos
receptores plaquetários:

Agonista Receptor Tipo de receptor


P2Y1 Acoplados à Proteína G
ADP
P2Y12 Canal de cálcio
GP IV
Colágeno Tirosina fosfatase
GP VI
Epinefrina Receptor de Epinefrina Acoplado à Proteína G
PAF Receptor de PAF Acoplado à Proteína G
GP Ib
α-trombina PAR 1 Acoplados à Proteína G
PAR 4
Receptor de
Tromboxana A2 Acoplado à Proteína G
tromboxana A2

A ativação plaquetária induz vários eventos, dentre os principais:

• Secreção dos grânulos α e grânulos densos;


• Mudança de forma da célula – o formato original da célula (discóide) é
alterado para um formato esférico com emissão de pseudópodes;
• Aumento nos níveis intracelulares de cálcio;
• Alteração da composição lipídica da membrana externa;
• Exposição da GP IIb/IIIa.

Secreção de grânulos

A ativação plaquetária é iniciada pela ligação dos agonistas supracitados


aos receptores da superfície plaquetária, seguida pelo desencadeamento de uma
cascata de fosforilação de proteínas intracelulares que culmina, entre outras
coisas, na liberação dos grânulos plaquetários, os quais podem ser de três tipos:

• grânulos densos, contendo cálcio, serotonina, epinefrina e ADP;


• grânulos alfa, contendo FvW, fibronectina, trombomodulina, fator de
crescimento derivado das plaquetas (PDGF) e uma enzima inativadora
da heparina (fator plaquetário 4);
27

• lisossomas com endoglicosidases e heparinases.

Em especial, as liberações de tromboxano A2 (TXA2) – um derivado do


ácido araquidônico – e ADP são de extrema importância, por serem capazes de
ativar ainda mais plaquetas, desencadeando finalmente a agregação plaquetária.

Mudança de forma da célula e aumento nos níveis intracelulares de cálcio

Os agonistas plaquetários se ligam a seus receptores e estimulam a


fosfolipase C, uma enzima que hidrolisa o fosfatidilinositol (PIP2) em dois
componentes: o inositol trifosfato (IP3) e o diacilglicerol (DAG). O IP3 induz a
liberação de cálcio no citoplasma, proveniente do sistema tubular denso, além de
fosforilar a miosina, uma proteína contrátil do citoesqueleto plaquetário. Como
resultado, a plaqueta muda a sua forma e torna-se capaz de degranular (liberar os
seus grânulos, como explicado anteriormente).

Com o aumento de cálcio, a assimetria da membrana – presença de


fosfatidilserina exclusivamente na camada interna das células – é alterada, devido
a mudanças na atividade das seguintes enzimas:

• Aminofosfolipídeo translocase ATP-dependente (ou flipase) –


transporta especificamente os lipídeos fosfatidilserina e
fosfatidiletanolamina da camada externa para a camada interna da
membrana da célula. Ativada em baixos níveis de cálcio e inativa em
altos níveis de cálcio intracelular.

• Flopase ATP-dependente – transporta inespecificamente fosfolipídeos


da camada interna para a camada externa da membrana. Ação lenta.

• Escramblase – transporta inespecificamente fosfolipídeos da camada


interna para a externa e vice-versa. Ação rápida. Inativa em baixos
níveis de cálcio e ativa em altos níveis de cálcio intracelular.

Além disso, a alta concentração de cálcio também ativa as chamadas


fosfolipases A2, que liberam ácido araquidônico a partir de fosfolipídeos de
membrana, como a fosfatidilcolina para a produção de tromboxano A2, um
potente ativador de plaquetas. O ácido araquidônico sofre a ação da enzima
ciclooxigenase, produzindo compostos como PGG2 e PGH2. A partir destes, a
enzima tromboxano sintetase produz tromboxano A2 (TXA2), o qual, por sua vez,
age na própria plaqueta, estimulando fosfolipases de membrana – um mecanismo
de retroalimentação positiva.

Alteração da composição lipídica da membrana externa

O aumento nos níveis de fosfatidilserina na membrana externa da plaqueta


ativada é fundamental para a montagem de alguns complexos da coagulação
28

sanguínea, como demonstrado abaixo e melhor aprofundado no capítulo de


coagulação sanguínea.

Figura 14. Perda de Assimetria Fosfolipídica da Membrana Plasmática na Presença de


Cálcio. Efeito regulatório do cálcio sobre a atividade de enzimas transportadoras de fosfolipídios e
exemplo do papel da exposição de fosfatidilserina na montagem do complexo pró-coagulante
protrombinase.

DAG

O DAG, produzido na via ativada por fosfolipase C, estimula ainda a


proteína quinase C (PKC), que fosforila a miosina e conduz as plaquetas à
profunda mudança na forma plaquetária.

Agregação Plaquetária

A agregação plaquetária é estritamente dependente da ativação


plaquetária, especialmente devido à indução da maior exposição da GP IIb/IIIa,
presente na membrana da plaqueta, ao seu ligante fibrinogênio (decorrente de
mudanças conformacionais dessa glicoproteína), e à secreção de ativadores
plaquetários contidos nos grânulos. Este fenômeno de agregação consiste em
uma interação física entre as plaquetas, mediada pela proteína plasmática
fibrinogênio, que possui uma seqüência específica de aminoácidos que é
reconhecida pela GP IIb/IIIa.

O resultado final desta fase é a formação do agregado plaquetário, capaz


de impedir o sangramento até que a hemostase secundária (coagulação) esteja
concluída.
29

2.2.3. Distúrbios na Hemostasia Primária

Quando há deficiência em algum dos fatores envolvidos na hemostasia, há


um prejuízo em todo o processo descrito, que é o que caracteriza os distúrbios
hemostáticos. Os distúrbios hemostáticos congênitos mais importantes estão
descritos na tabela abaixo. Além dos congênitos, também há distúrbios
adquiridos, como pelo uso excessivo de antiinflamatórios, de ácido acetilsalisílico,
anti-histamínicos ou de psicotrópicos. Há também distúrbios numéricos, de
alteração na produção de plaquetas, como a aplasia medular, leucemia e
produção reduzida por deficiência de folato ou vitamina B12, ou de destruição
excessiva: coagulação intravascular disseminada (CID), envenenamento
botrópico e esplenomegalia.

Freqüência da
Distúrbio Descrição Gravidade do sangramento
ocorrência

Doença de von Relativamente Fator de von Willebrand Leve a moderado na maioria


Willebrand comum defeituoso ou ausente, a proteína dos casos. Pode ser severo
que mantêm as plaquetas unidas nas pessoas que apresentam
à parede vascular lesada, ou níveis muito baixos do fator de
deficiência do fator VIII da von Willebrand
coagulação

Doença da Relativamente Grânulos das plaquetas Leve


reserva de incomum defeituosos que impedem a
armazenamento aglomeração das plaquetas

Síndromes de Raras Formas especiais de doença do Variável


Chédiak-Higashi fundo de armazenamento
e de Hermansky-
Pudiak

Disfunção do Muito rara Resposta plaquetária Leve


tromboxano A2 comprometida aos estímulos de
aglomeração

Trombastenia de Rara Ausência de GP IIb/IIIa na Variável


glazman superfície da plaqueta que são
necessárias para a aglomeração
plaquetária

Síndrome de Rara Ausência de proteínas na Variável


Bernard-Soulier superfície da plaqueta e
plaquetas anormalmente grandes
que não aderem às paredes
vasculares lesadas
30

2.2.4. Importante Observação Farmacológica

O ácido acetilsalisílico, comercialmente conhecido como aspririna®, é


capaz de interferir no processo de hemostasia primária. A aspirina®, que inativa a
enzima ciclooxigenase, evita a síntese de PGH2 plaquetário e,
consequentemente, de tromboxano A2, o que dificulta uma eficiente ativação
plaquetária. Além disso, discute-se seu efeito limitador sobre a capacidade do
colágeno de ativar as plaquetas, uma vez que o colágeno é, por si só, indutor
fraco da ativação plaquetária, mas se torna um indutor poderoso na presença de
PGH2. Dessa forma, percebemos que a aspirina® possui um papel
antitrombótico, ou seja, de inibir a hemostase, mas que não ocorre tão
intensamente em indivíduos normais pela compensação da ativação plaquetária
por outros agonistas, tais como a trombina.

Por outro lado, no endotélio, a aspirina® também atuará inibindo a


ciclooxigenase endotelial. Esta produz PGG2 que passa a PGH2, o qual, no
endotélio, se converte em PGI2 – um inibidor da hemostasia primária. Logo, no
endotélio, a aspirina® agiria como um agente pró-hemostático.

Mas porque será que a sua ação predominante continua sendo


antitrombótica?

Porque apesar de a aspirina® agir na mesma enzima, tanto na plaqueta


quanto no endotélio, este último possui a capacidade de sintetizar novas
proteínas e, dessa forma, rapidamente repõe seus níveis de ciclooxigenase. Já
nas plaquetas, a síntese protéica não ocorre, e a enzima não é reposta, inibindo,
portanto, a produção de PGH2 e consequentemente de tromboxano A2, o que
dificulta a ativação plaquetária. O esquema abaixo busca resumir toda essa
produção dos derivados do ácido araquidônico.
31

ÁCIDO
ARACDÔNICO
Inibida
por
ciclooxigenase aspirina

PGG2

Tromboxana sintetase
(nas plaquetas)
PGH2 TROMBOXANA A2

Prostaciclina sintetase
(no endotélio)

PGI2

Assim, concluem-se os conceitos relacionados à hemostasia primária,


cujos pontos mais importantes são:

• As fases desse processo;


• A participação das plaquetas e de seus receptores;
• A ação da aspirina.

A partir de agora, passaremos à próxima etapa, hemostasia secundária,


mas tendo em mente que a hemostasia primária não é uma fase separada da
secundária. Os processos de ativação ocorrem todos juntos, somente com
diferença temporal para os efeitos apresentados que fazem com que sejam
agrupados em fases. Na verdade, essa divisão é meramente didática, e essas
fases interligam-se, estimulam-se e inibem-se, como será explicado a seguir.
32

2.3. HEMOSTASIA SECUNDÁRIA: COAGULAÇÃO SANGÜÍNEA

A coagulação sangüínea constitui a segunda etapa do processo


hemostático. Apesar da divisão didática e conceitual desta fase, como veremos
mais adiante, esta etapa está naturalmente relacionada à hemostase primária.

O sangue contém diversas proteínas plasmáticas, dentre as quais os


fatores de coagulação, que estão envolvidos em uma seqüência rigorosamente
controlada de reações de ativação, as quais resultam, em última instância, na
formação de trombina e, subsequentemente, fibrina. Esta série de eventos leva à
ativação parcial dos fatores de coagulação, que circulam em um estado precursor
inativo chamado de zimogênio (zimo= enzima, gênio= que dá origem).

O processo de ativação é primariamente uma seqüência de clivagens


proteolíticas em locais específicos – também conhecida como proteólise limitada
–, um mecanismo muito comum a vários outros sistemas do organismo, tais
como o sistema complemento, sistema de regulação da pressão sanguínea via
angiotensina/renina ou sistema de cininas, ativação de metaloproteases de
matriz, etc.

A enzima, nesta constelação, é um fator de coagulação ativado, e o


substrato (em muitos casos também ligados a superfície), um zimogênio de um
fator de coagulação diferente que se torna ativado depois de uma parte da
molécula ter sido clivada (o peptídio de ativação). Em alguns casos, várias
clivagens proteolíticas podem ser requeridas, porém nem sempre o peptídeo de
ativação é liberado, e isto se deve ao fato de o mesmo estar ligado à molécula
residual via pontes dissulfeto ou por ligação não covalente. No caso dos fatores
homólogos VIII e V, várias clivagens proteolíticas ocorrem, mas as cadeias de
proteínas individuais finais ainda formam uma molécula ligadora de cálcio
relativamente estável (ver figura 15 para sítio de clivagem nos fatores de
coagulação).

A clivagem das ligações do peptídio de ativação induz mudanças


conformacionais consideráveis que expõem o sítio ativo da enzima recém gerado,
geralmente escondido dentro da pró-enzima. Na maioria dos casos, os passos de
ativação proteolítica são mais ou menos restritos a superfície, porque muitos dos
fatores de coagulação ou de seus precursores têm locais de ligação específica a
fosfolipídios, íons metálicos, receptores específicos ou co-fatores localizados na
superfície de diferentes tipos de células. Todos os fatores de coagulação com
atividade proteolítica pertencem à classe de serino-proteases (que contém o
resíduo de aminoácido serina no sítio catalítico), as quais compartilham
significativa seqüência de homologia.

Em certas doenças, uma ativação inespecífica de fatores de coagulação


pode ser mediada por uma variedade de outras proteases de microorganismos,
liberadas por células tumorais, leucócitos ativados ou tecidos danificados. Um
caso especial são as proteases de animais venenosos, tais como certas espécies
de serpentes que contêm poderosos ativadores da coagulação (e inibidores) nos
seus venenos, e podem induzir mudanças maciças associadas à hemostase, com
severas complicações tromboembólicas ou hemorrágicas.
33

2.3.1. Fatores da Coagulação

Os fatores de coagulação representam uma família de proteínas


plasmáticas altamente glicosiladas. A maioria deles (exceto Fator II – protrombina
– e Fator I – fibrinogênio) é encontrada em concentrações muito baixas. À
exceção do fator tecidual (TF) que está ligado à membrana de células do
subendotélio, todos os fatores da coagulação são proteínas plasmáticas que
requerem uma etapa de ativação proteolítica. A pré-calicreína e o cininogênio de
alto peso molecular – HMWK –, e também o Fator XII estão envolvidos na então
chamada fase de contato da coagulação sanguínea ou via extrínseca, que parece
ser de mínima importância para a hemostase fisiológica.

Peso Concentração Concentração Necessária para


Fator Molecular Plasmática Hemostase
(Da) (µg/mL) (% concentração normal)
Fibrinogênio 330.000 3.000 30
*Protrombina 72.000 100 40
Fator V 300.000 10 10-15
*Fator VII 50.000 0,5 5-10
Fator VIII 300.000 0,1 10-40
*Fator IX 56.000 5 10-40
*Fator X 56.000 10 10-15
Fator XI 160.000 5 20-30
Fator XIII 320.000 30 1-5
Fator XII 76.000 30 0
Pré-calicreína 82.000 40 0
HMWK 108.000 100 0

*Fatores dependentes de vitamina K

Alguns dos fatores da coagulação são dependentes de vitamina K, isto é,


uma série de reações enzimáticas que resultam na modificação (gama-
carboxilação) de cadeias laterais de ácido glutâmico presentes no chamado
“domínio-Gla” dessas proteínas dependem de vitamina K. “Gla” é o acrônimo para
ácido gama-carboxiglutâmico (do inglês gamma-carboxyglutamic acid). Resíduos
Gla- são requeridos para ligação de íons cálcio, co-fatores pivôs da maioria das
reações da cascata de coagulação. Entretanto, a ligação do cálcio não está
restrita a apenas o ácido gama-carboxiglutâmico. É importante observar que mais
de um resíduo de ácido glutâmico é modificado por esta reação, somente no
domínio Gla.

Antagonistas da vitamina K (coumadim / Warfarin®, phenprocoumon /


Marcumar® / Falithrom®, acenocoumarol / Sintrom®) são drogas que são
ministradas para profilaxia e tratamento de doença tromboembólica. Sua função é
inibição de gama-carboxilação, o que leva a formação de fatores de coagulação
em parte inativos. Estes anticoagulantes orais inibem o sistema de reciclagem
34

(redução) enzimática de uma forma oxidada e inativa de vitamina K (vitamina K


epóxido) que é gerada nas reações de gama carboxilação.

Figura 15. Representação Esquemática da Seqüência de Alguns Fatores da Coagulação.


35

Figura 16. Formação do Domínio Gla. A reação de gama carboxilação dos fatores da
coagulação ocorre no fígado, e pode ser bloqueada por antagonistas da vitamina K como a
varfarina. Em (A) está representada a reação de gama carboxilação em resíduos de ácido
glutâmico, catalisada pela enzima gama-glutamil carboxilase. Esta converte uma forma reduzida
de vitamina K em vitamina K epóxido (oxidada), que por sua vez é reciclada a sua forma reduzida
pela enzima vitamina K epóxido redutase (em B), a qual é alvo de inibição pela varfarina e outros
cumarínicos relacionados.

2.3.2. Vias de Ativação da Coagulação Sanguínea

A ativação do sistema de coagulação pode ser separada em duas vias: a


via extrínseca ou via do fator VII, cuja ativação se dá pelo fator tecidual; e a
ativação por contato com superfícies não-fisiológicas, também chamada de
ativação intrínseca ou via de contato, onde há participação das proteínas pré-
calicreína (PK) e cininogênio de alto peso molecular (HMWK), e dos fatores XII, XI
e IX (FXII, FXI, FIX).

Estas duas vias não estão diretamente separadas; elas interagem em


diversas etapas. As duas vias se encontram no fator X. Etapas restantes são
comuns a ambas as vias. Por razões práticas, uma vez que os dois principais
ensaios de coagulação (TAP e PTTa) separaram estas vias, é comum tratá-las
individualmente.

Via Extrínseca

A ativação fisiológica da coagulação sanguínea é mediada quase


exclusivamente por meio da via do fator tecidual. Fator tecidual (TF) é uma
proteína de membrana que usualmente não é encontrada em quantidade
suficiente na superfície do endotélio, células brancas do sangue ou no plasma.
Entretanto, o subendotélio é constitutivamente rico em TF, o qual também tem
sido localizado em quase todos os tecidos. Placas ateroscleróticas e monócitos
estimulados com lipopolissacarídeos (endotoxina LPS) ou a citocina pró-
inflamatória interleucina 1 (IL-1) também podem gerar TF.
36

ou estímulos de ativação celular, ou sintetizado de novo por


leucócitos/células sanguíneas, respectivamente. Os indutores fisiológicos da
biossíntese do fator tecidual são diversas citocinas, tais como IL-1, fator de
necrose tumoral (TNF), trombina, proteína C 5a (do sistema complemento), a
anaflatoxina gerada do complemento C5, e provavelmente vários outros.

O fator tecidual consiste de um domínio intracelular, uma porção


transmembrana e um domínio extracelular, que é homólogo ao de receptores de
citocinas. Após injúria vascular, TF é exposto no subendotélio, e o contato do fator
tecidual com o fator VIIa leva à formação de um complexo ativo, chamado de
complexo tenase extrínseco, o qual pode ativar o fator X, ainda mais
eficientemente na presença de fosfolipídios (PL) e íons cálcio. De acordo com
outros resultados, concentrações muito baixas de fator VIIa parecem estar
sempre presentes no sangue (meia vida 2,5 h) e são responsáveis pela ativação
inicial de tal complexo nos locais onde há TF exposto. O sistema,
simplificadamente, pode ser ilustrado como uma série de etapas subseqüentes:

TF/FVIIa + FX (+ Ca2+ + PL) → FXa

FXa + FII (protrombina) → FIIa (Trombina)

FIIa + Fibrinogênio → Fibrina

Na realidade, entretanto, o sistema é muito mais complexo. Um elemento


muito importante da hemostase é o envolvimento de reações de feedback
positivo, caracterizadas pela participação de um produto da reação em sua
própria formação, levando a uma amplificação maciça.

Na hemostase, o feedback positivo é provido pela ativação de uma pró-


enzima pelo produto de sua reação, a enzima resultante, (p.ex., a ativação de
FVII pelo próprio FVIIa na presença de TF e íons cálcio), e pela ativação de co-
fatores que aceleram as reações enzimáticas. As reações de feedback positivo
estão envolvidas em muitas etapas na cascata de coagulação. Na via extrínseca,
provavelmente o feedback mais importante é alcançado depois que o fator V é
ativado pelos primeiros traços de trombina. Junto com Ca++ e PL, FVa acelera a
ativação de protrombina pelo FXa significativamente, enquanto a forma não
ativada não é efetiva. O complexo FXa, FVa, PL e cálcio (complexo
protrombinase) é muito mais efetivo na geração de trombina que o FXa sozinho, e
é parcialmente protegido contra inibição por inibidores tais como a antitrombina.

A contribuição do FVIII, FIX e FXI para a formação de trombina

Pacientes com deficiências de FVIII ou FIX (hemofílicos A e B,


respectivamente) são muito mais comuns que pacientes com uma deficiência em
um dos fatores extrínsecos típicos. Isso ilustra que a deficiência completa ou
muito severa de FVII, FX, FV e protrombina é provavelmente letal. Mas uma grave
deficiência de FVIII e IX é também associada com hemorragia maciça,
especialmente no tecido conjuntivo das articulações. No caso de deficiência de
FXI (hemofilia C), a tendência ao sangramento é relativamente fraca em alguns
37

pacientes. Outros sofrem de uma diátese hemorrágica severa, similar àqueles das
clássicas hemofilias A e B. Os achados clínicos provam que todos os fatores
devem estar envolvidos na ativação da coagulação.

O FVIII circulante está ligado ao FvW e é ativado pela trombina:

Figura 17. Esquema de Ativação do FVIII pela trombina.

O envolvimento de FVIII, FIX e FXI na formação de trombina foi


reinvestigado através dos últimos anos e isso levou a uma descrição revisada da
coagulação sanguínea, na qual a então chamada ‘’via intrínseca’’ não representa
mais um papel importante a respeito da formação de trombina fisiológica. Já há
um longo período, sabia-se que, na presença de baixas concentrações de TF, não
apenas fator X, mas também fator IX era ativado por FVIIa. Sob essas condições,
a taxa de formação de trombina tornou-se também dependente deste FIXa e de
FVIIIa (co-fator do FIXa, juntos formam o complexo tenase intrínseco, na
presença de Ca++ e PL). Usando um ensaio imune para o peptídio de ativação do
fator IX, que é liberado por ativação, foi demonstrado que FVIIa in vivo é de longe
o ativador mais relevante de FIX.

Sob as condições do ensaio de tempo de protrombina (TAP), entretanto, no


qual um grande excesso de TF é usado, a ativação da coagulação é
independente dos fatores IX e VIII. Mais recentemente, descobriu-se que a
38

trombina é capaz de ativar também o FXI, ativador conhecido do FIX. Essa etapa
é provavelmente dependente da presença de superfícies negativas ou compostas.
De acordo com dados mais recentes, FXI é ativado quando altos níveis de
trombina são gerados, que é um processo em andamento até mesmo quando
fibrina já está formada. Isto explica por que a deficiência do FXI não é detectada
em ensaios de coagulação para a via extrínseca, nos quais a taxa para formação
de fibrina (usualmente os primeiros filamentos de fibrina detectados) é
determinável.

A Fase de Contato da Coagulação Sanguínea e a Via Intrínseca

A interação do sangue com superfícies artificiais, especialmente superfícies


que são negativamente carregadas tais como vidro ou plásticos (em dispositivos
médicos), aciona uma complexa interação de várias proteínas que requerem uma
superfície negativamente carregada para uma mudança conformacional que as
ativa. Superfícies biológicas negativamente carregadas também podem ser
representadas por certos componentes de membrana, tal como sulfatídeos. Eles
são expostos ao sangue em casos de injúrias. Este processo é chamado de “fase
de contato” da coagulação sanguínea.

A fase de contato também é caracterizada por reações de feedback


positivo. Na presença de cininogênio de alto peso molecular (HMWK ou HK), pré-
calicreína é ativada pelo FXIIa a calicreína, que por sua vez ativa mais FXII e
assim por diante. O FXIIa, por sua vez, pode também ativar FXI a FXIa.

O único fator envolvido que parece ser um fator fisiológico de coagulação é


o FXI. Uma deficiência desta proteína (hemofilia C) pode levar a problemas
hemorrágicos leves e, às vezes, até mesmo severos, enquanto que a deficiência
de FXII e HMWK ou pré-calicreína não determinam quadros hemorrágicos. O
FXIa ativa FIX a FIXa. Todas as etapas subseqüentes requerem íons cálcio e são
fosfolipídeos dependentes. FIXa livre ativa FX, mas esta reação não é muito
efetiva. Tão logo alguma trombina é formada, entretanto, FIXa forma um
complexo com FVIIIa (que é ativado pela trombina). Junto com PL (na superfície
de plaquetas) e íons cálcio, este complexo (tenase intrínseco) ativa FX com
eficácia muito maior.

A via intrínseca, especialmente a fase de contato, parece ser um tanto


menos importante que a via extrínseca. Existe crescente consenso de que o
gatilho fisiológico típico da coagulação, em saúde e doença, é o fator tecidual.
Cabe ressaltar, entretanto, que a ativação por contato desempenha um papel
importante quando o sangue é exposto a superfícies não biológicas, tal como
durante cirurgia de by-pass cardiopulmonar, na qual a inibição da ativação por
contato é rotineiramente realizada com aprotinina, um inibidor de protease
polivalente. Aparentemente, o benefício terapêutico alcançado com aprotinina,
entretanto, é preferencialmente a inibição da fibrinólise induzida pela ativação por
contato (discutido em mais detalhes na parte de fibrinólise).
39

Figura 18. Resumo das Vias Extrínseca e Intrínseca da Coagulação. Observe a ligação
comum entre ambas as vias no nível de ativação do fator IX. PL=fosfolipídios; HMWK=cininogênio
de alto peso molecular.
40

Um Modelo Recente na Coagulação Sanguínea Fisiológica

Resultados mais recentes proveram evidências para um modelo baseado


em superfícies celulares hemostáticas que enfatiza a importância de receptores
celulares específicos para as proteínas da coagulação. Já há algum tempo foi
reconhecido que plaquetas fornecem fatores que apóiam a ativação de
protrombina, uma vez que FXa ligado à superfície da plaqueta pode levar à
geração de trombina. De acordo com este novo modelo, a coagulação não ocorre
simplesmente como uma “cascata”, mas em três estágios sobrepostos:

Fase 1: Iniciação
Ocorre na superfície de uma célula que expõe fator tecidual, p.ex. em células
subendoteliais ou monócitos ativados. A formação do complexo tenase extrínseco
(TF/FVIIa) resulta na formação de FXa e FIXa, e na geração de pequenas
quantidades de trombina. Essa fase de iniciação é facilmente desligada pelo
inibidor da via do fator tecidual (TFPI), como veremos mais adiante.

Fase 2: Amplificação
A trombina formada na fase inicial é essencial para ativação das plaquetas e dos
co-fatores das enzimas FXa e FIXa, respectivamente FV e FVIII, de modo a
permitir uma amplificação da geração de trombina em larga escala. Dessa forma,
o FXa, agora constituinte do complexo protrombinase, está protegido da inibição
por antitrombina.

Fase 3: Propagação
Grandes quantidades de trombina são geradas na superfície da plaqueta ativada,
onde a exposição de fosfolipídios aniônicos, especialmente fosfatidilserina, é
essencial para a montagem dos complexos tenase intrínseco (FIXa/FVIIIa/FX) e
protrombinase (FXa/FVa/protrombina). Níveis mais elevados de trombina levam
também à ativação de FXI, que está disponível no plasma, mas também é
liberado de plaquetas (através dos grânulos alfa). A superfície da plaqueta ativada
protege ainda o FXIa de inibição por inibidores plasmáticos. FXIa pode induzir a
formação de trombina de forma explosiva, por ativação mais eficiente de FIX na
superfície da plaqueta ativada. Obviamente, uma formação adicional maciça de
trombina através dessa via ocorre quando a fibrina já estiver formada.
41

Figura 19. Reações da Coagulação Dependentes de Superfícies de Membrana.


Representação esquemática dos principais complexos enzimáticos da coagulação, onde cada
serino-protease está associada ao seu co-fator protéico e substrato apropriados, em uma
superfície de membrana expondo Fator Tecidual (no caso do complexo tenase extrínseco) ou
fosfatidilserina, representada em azul (no caso dos complexos tenase intrínseco e protrombinase).

Formação de Polímero de Fibrina Solúvel e Fibrina Estabilizada

A fase final da cascata de coagulação leva à formação de fibrina insolúvel


por conversão da proteína solúvel no plasma, o fibrinogênio, pela trombina em
uma série de reações proteolíticas. Fibrinogênio é uma grande proteína
plasmática multimérica que é formada de duas cadeias alfa, beta, gama. As
cadeias de proteínas individuais do fibrinogênio são conectadas por diversas
ligações dissulfeto. A molécula forma uma estrutura nodular que pode ser depois
segmentada em um domínio-E central e dois domínios-D (Figura 20).

Figura 20. Desenho Esquemático aa Clivagem de Fibrinogênio pela Trombina. Este esquema
mostra os fibrinopeptídios A (FPA) e B (FPB), expostos no domínio-E central, sendo cortados pela
trombina. O produto da reação é chamado des-AB-fibrina, monômeros de fibrina, ou, depois da
formação de oligômeros, “fibrina solúvel”.
42

A liberação de fibrinopeptídios FPA e FPB (um processo gradual levando


primeiro a des-A-fibrina e um tanto depois a des-AB-fibrina) gera mudanças
significativas na estrutura geral da molécula e induz polimerização. Após certo
tamanho molecular ter sido atingido, a solubilidade da fibrina é reduzida
significativamente. Isso leva à formação de um polímero insolúvel, que forma uma
rede de cadeias ramificadas, o coágulo. A trombina permanece ligada ao coágulo
e ainda é ativa.

Em adição à trombina, existem diversas enzimas de cobras venenosas que


também podem gerar fibrina (Reptilase®, uma protease semelhante à trombina
proveniente de Bothrops atrox, Ancrod e várias outras). Algumas enzimas de
cobras venenosas cortam apenas FPA ou FPB. Defibrinação terapêutica com
enzimas de cobras venenosas parecem ser benéficas no acidente vascular
cerebral (AVC) e outras doenças tromboembólicas arteriais. Em contraste com a
trombina, batroxobin e enzimas de cobras venenosas altamente purificadas
similares não são inibidas por antitrombina ou inibidores de ação rápida similar, e
não ativam plaquetas ou FV, FVIII, FXI ou FXIII. Portanto, estas enzimas são
ferramentas valiosas na investigação da formação de fibrina e retração do
coágulo.

Fator XIII

A formação de des-A-fibrina por trombina leva à quase simultânea ativação


de outro fator da coagulação, FXIII, em uma reação dependente de cálcio. FXIIIa
age como uma transglutaminase e faz uma ligação cruzada entre as moléculas
de fibrina. De acordo com dados recentes, o substrato de FXIIIa já é a des-A-
fibrina.

FXIIIa também promove a ligação cruzada entre diversas outras proteínas


e o coágulo de fibrina. Dentre estas proteínas, estão a alfa2-antiplasmina, inibidor
central do sistema de fibrinólise, e o inibidor da fibrinólise ativado por trombina
(TAFI). Esses inibidores previnem o coágulo de ser dissolvido precocemente.

Figura 21. Conversão de Fibrinogênio em Fibrina (1) e Estabilização do Coágulo de Fibrina


pelo Fator XIIIa (2).
43

A ligação cruzada mediada pelo FXIIIa é a formação de uma ligação


isopeptídeo entre cadeias laterais de lisina e glutamina específicas no substrato.
Essa reação libera uma molécula de amônia/ligação cruzada (Figura 22).

Figura 22. Ligação Cruzada Isopeptídeo Catalisada pelo Fator XIIIa.

A fibrina forma uma rede tridimensional. In vivo, um coágulo de fibrina


contém células aprisionadas tais como plaquetas, eritrócitos e células brancas do
sangue. Devido à baixa atividade fibrinolítica inicial, o coágulo é relativamente
estável por algum tempo. Desde de que o coágulo ainda tenha trombina ativa,
pedaços dissolvidos do coágulo (embolia) podem transportar um material
altamente trombogênico para outros segmentos de vasos sanguíneos, que podem
então ser o início de um novo evento tromboembólico (p.ex., um infarto do
miocárdio ou um AVC).

A fixação direta de filamentos de fibrina a diferentes células tais como


plaquetas, fibroblastos, células do músculo liso e a proteínas adesivas garante
que a área afetada esteja mecanicamente (impacto do fluxo) e quimicamente
(impacto de enzimas fibrinolíticas ou proteases de leucócitos) bem protegida. Isto
limita a perda de sangue no caso da injúria de um vaso, protege contra invasão
por agentes infecciosos em feridas abertas, e previne os filamentos de fibrina e
células aprisionadas de formar êmbolos, que podem ocluir vasos sanguíneos em
outras áreas.

2.3.3. Deficiência dos Fatores da Coagulação


44

Deficiências Hereditárias

As deficiências congênitas da maioria dos fatores da coagulação são


relativamente raras.

Deficiências leves de fatores da coagulação (usualmente abaixo de 30% da


atividade normal ou até mesmo mais baixo), não levam a diátese hemorrágica
espontânea. Entretanto, a combinação com um fator de risco diferente, tal como
trombocitopenia, uso de AAS (ácido acetilsalicílico) e outros, pode ser perigoso,
especialmente quando é requerida uma cirurgia. Portanto, uma anamnese
cuidadosa é obrigatória, e testes de coagulação que investiguem a função das
vias de coagulação devem sempre ser efetuados, incluindo uma investigação da
função plaquetária, que é provavelmente mais importante que o sistema
plasmático.

As deficiências hereditárias que levam a diátese hemorrágica são mais


conhecidas como hemofilias, e três tipos diferentes são descritos: a Hemofilia A,
conhecida também como hemofilia clássica e que se caracteriza pela ausência do
fator VIII da coagulação; a Hemofilia B, também conhecida como doença de
Christmas, e que se caracteriza pela ausência do fator IX; e a Hemofilia C, que é
determinada por gene autossômico dominante não relacionado com o sexo e
caracteriza-se pela ausência de fator XI.

Terapia

Deficiências de fatores da coagulação são usualmente tratadas com fatores


purificados e concentrados de plasma agregado de diferentes doadores, ou de
origem recombinante, especialmente para a maioria das formas de hemofilia, as
deficiências de FVIII (hemofilia A) e FIX (hemofilia B). Deficiências de alguns dos
outros fatores da coagulação são usualmente tratadas com plasma fresco
congelado (ou liofilisado) ou com PPSB, uma fração do plasma que é rica em
fatores da coagulação dependentes de vitamina K. PPSB tem sido utilizado
cuidadosamente porque algumas marcas podem conter fatores da coagulação
ativados tal como FIXa. Apenas para alguns subtipos de deficiência do fator de
Von Willebrand, a peptídio hormônio desmopressina (que libera FvW de células
endoteliais) pode ser usada como uma alternativa menos cara, mas muito efetiva.
Terapia concentrada requer monitoração cuidadosa.

Inibidores

Uma complicação perigosa da terapia concentrada é o desenvolvimento de


“inibidores”, autoanticorpos, que agem diretamente contra o respectivo fator da
coagulação. O desenvolvimento de inibidores pode ter também causas genéticas.
No caso de deficiência do FVIII, a formação do inibidor afeta aproximadamente
1/3 dos pacientes. Inibidores podem também ser formados espontaneamente ou
depois do parto. Alguns inibidores desaparecem espontaneamente, outros
requerem tratamento com fármacos imunossupressores e/ou altas concentrações
de fatores da coagulação que estão associados com altos custos. Ademais,
45

concentrados de FVIII de porcos e concentrados de fatores da coagulação


ativados (FEIBA® = “atividade desviadora do inbidor do fator FVIII”), e também
FVIIa recombinante são usados.

Deficiência adquirida

Deficiências adquiridas dos fatores da coagulação (e seus inibidores


fisiológicos) são achadas freqüentemente em pacientes com doença hepática (a
maioria dos fatores da coagulação são sintetizados no fígado), durante
septicemia, no câncer, depois de trauma, queimaduras e várias outras doenças
ou alguns tratamentos específicos, tal como a terapia com L-asparginase no
câncer. Uma situação muito perigosa é o quadro clínico de coagulação
intravascular disseminada (CID), também conhecido como “coagulopatia de
consumo”. Essa doença ameaçadora da vida não é incomum em pacientes com
doença hepática, câncer e especificamente durante septicemia. O quadro clínico
é caracterizado pela ocorrência simultânea de sintomas de hemorragia severa e
trombose, induzida por desequilíbrio na hemostasia. O consumo de fatores da
coagulação e da fibrinólise e seus inibidores, diminuição da contagem de
plaquetas e fibrinogênio, e a ocorrência de marcadores de ativação do sistema
hemostático (p.ex., um aumento da fibrina solúvel, produtos de degradação de
fibrina e fibrinogênio e outros marcadores) são típicos.

Deficiência de fibrinogênio e desfibrinogenemia

Uma deficiência de fibrinogênio pode levar a complicações hemorrágicas.


Em adição às deficiências, várias formas mutantes são conhecidas. Usualmente
elas mostram o quadro clínico de uma leve a moderada diátase hemorrágica.
Algumas “desfibrinogenemias”, entretanto, mostram também uma tendência em
direção a freqüências aumentadas de doenças tromboembólicas, que podem
estar associadas com aumento da força do coágulo ou fibrinólise prejudicada
(devido a uma função co-fator prejudicada da respectiva fibrina na ativação
catalisada por ativadores do plasminogênio) do coágulo.

Deficiência do FXIII

Uma deficiência de FXIII pode levar a uma prejudicada cicatrização de


feridas e problemas hemorrágicos severos. A deficiência congênita de FXIII é
muito rara, mas deficiências adquiridas são achadas em diversas situações
clínicas, nas quais o sistema de coagulação é sistematicamente ativado, tal como
durante a coagulopatia de consumo, septicemia, em certas doenças de tumores,
em doença hepática, em doenças gastrointestinais inflamatórias e na púrpura
Henoch-Schoenlein. De acordo com os resultados de um estudo da European
Thrombosis Research Organization, pacientes com níveis muito baixos de FXIII e
pacientes com atividade <5% podem desenvolver hemorragia severa. Terapia
com substituição é possível. Existe também crescente evidência de que uma
deficiência de FXIII tratada com concentrados pode ser benéfica em certas
doenças inflamatórias, tal como morbus Crohn ou colite ulcerosa.
46

O FXIII é uma proteína altamente polimórfica. A presença da mutação


Val34Leu leva à atividade alterada de FXIII e parece estar associada com um
risco aumentado para hemorragia cerebral, mas protetor a respeito do infarto do
miocárdio ou tromboembolismo venoso.

Autor(es):
Rodrigo Maciel
Bruna Gouveia
Luize Gonçalves Lima
47

UNIDADE 3
48

3. REGULAÇÃO DO PROCESSO HEMOSTÁTICO

3.1. INIBIDORES DA COAGULAÇÃO

Os principais sistemas inibidores da coagulação sanguínea são:

• inibidores de protease – inibição de fatores de coagulação ativados;


• a via da proteína C – responsável pela inativação de co-fatores
ativados.

3.1.1. Inibidores de Protease

Os inibidores de proteases são achados em muitos fluidos corpóreos. Sua


função é a ligação e a neutralização de enzimas proteolíticas que estão
envolvidas em diversas vias regulatórias. Os inibidores de protease têm estrutura
homóloga uns com os outros. As serino-proteases, tais como fatores da
coagulação e da fibrinólise, são inibidas por proteínas inibidoras pertencentes à
família das serpinas (do inglês serpin, Serine-Protease Inhibitor). A vasta maioria
de inibidores de proteases funciona como um tipo de “pseudo-substrato” de
enzimas. Os inibidores formam um complexo com a enzima alvo similar ao
complexo transitório enzima/substrato. Em contraste à reação enzimática típica,
entretanto, o inibidor não é clivado rapidamente e, assim, a protease permanece
ligada à enzima. Na prática, isso significa que uma molécula de inibidor é
consumida por molécula de enzima.

Antitrombina e a Importância da Heparina

Antitrombina (AT, previamente conhecida como “antitrombina III” ou AT III)


é o inibidor plasmático mais importante para os fatores da coagulação ativados.
Seus principais alvos são a trombina, o FXa e o FIXa. A importância de AT na
inibição do FVIIa ainda não é completamente entendida. O produto de reação da
AT com a enzima é um complexo inativo (AT-enzima), na qual a enzima perde
permanentemente a sua atividade. Este complexo AT-enzima é retirado da
circulação em poucos minutos pelo fígado. Interessantemente, a concentração
aumentada de trombina-AT pode ser utlizada como marcador de um estado
hipercoagulante, em que há geração aumentada de trombina.

O efeito inibitório da AT é enormemente potencializado na presença de


glicosaminoglicanos (GAG) negativamente carregados, tal como o heparan
sulfato, que é achado na superfície de células endoteliais. Este fenômeno também
é produzido pela heparina não-fracionada (UFH) ou pela heparina de baixo peso
molecular (LMWH), uma forma de heparina degradada enzimática ou
quimicamente. A heparina não fracionada liga-se tanto à enzima quanto à AT,
enquanto a LMWH liga-se apenas à AT, induzindo uma mudança conformacional
no inibidor. Por esta razão, a LMWH inibe o FXa muito efetivamente, sendo
menos efetivos na inibição de trombina.
49

Figura 23. Papel de Glicosaminoglicanos na Inibição de Trombina por Antitrombina.

O local de ligação para AT nas moléculas de heparina é uma seqüência


curta composta por um pentassacarídeo com um padrão distinto de grupos
carboxi e sulfato ligados ao esqueleto glicosídico. Uma forma sintética deste
pentassacarídeo (Fondaparinux) é agora disponível como um fármaco, e
amplamente utilizado para profilaxia de doença tromboembólica. O mecanismo de
ação do pentassacarídeo é similar ao da LMWH.

A atividade da heparina requer a presença de uma concentração mínima


de AT no sangue, em torno de pelo menos 40%. Por esta razão, a deficiência de
AT é um fator de risco para doença tromboembólica. Ambas deficiências
hereditárias, qualitativa ou quantitativa, são conhecidas, mas são relativamente
raras (em torno de 1:10.000). Entretanto, deficiências adquiridas não são
incomuns. Uma atividade de AT reduzida pode enfraquecer a eficácia da terapia
com heparina e LMWH. Portanto, determinações de AT devem ser realizadas
antes e durante a terapia com heparina. A AT é parcialmente consumida durante
a terapia com heparina. Em casos graves, a substituição com AT purificada ou
com plasma congelado fresco é requerida.

Uma séria complicação do uso clínico de heparina é o desenvolvimento de


trombocitopenia induzida por heparina (HIT), que ocorre em 1-5% dos pacientes
tratados com heparina. A HIT tipo I, provavelmente induzida por um efeito direto
pró-agregatório de heparina, é relativamente leve (usualmente contagem de
plaquetas >100/nL). A HIT tipo II, entretanto, pode ser extremamente séria. Ela se
desenvolve de 4 a 14 dias depois da administração de heparina e pode levar a
uma diminuição maciça da contagem de plaquetas (muitas vezes <100/nL) e ao
desenvolvimento de trombose. Sabe-se que a HIT II tem uma patogênese imune
50

mediada pela produção de auto-anticorpos, contudo o mecanismo trombogênico


desses auto-anticorpos não está completamente elucidado. Ele pode incluir, por
exemplo, ativação plaquetária e lesão de células endoteliais com exposição de
fator tecidual e colágeno. Pacientes com HIT I não requerem tratamento
específico, contanto que a HIT II não se desenvolva durante a terapia. Em
pacientes com HIT II, a heparina deve ser interrompida imediatamente e a
anticoagulação com outro fármaco é requerida.

Co-fator II da Heparina

O co-fator II da heparina (HCII) é um inibidor homólogo à AT, mas


apresenta uma atividade inibitória específica contra a trombina. Assim como a AT,
sua ação é dependente de GAGs como o dermatan sulfato, um GAG distinto do
heparan sulfato, e também pode ser potencializada por heparina. Diferentemente
da AT, a ligação do HCII com heparina ou dermatan induz uma alteração
alostérica que facilita a sua interação com uma região específica da trombina
denominada “exosítio I”, o que explica a especificidade deste inibidor pela enzima.

Cerca de 1% dos pacientes com trombose apresentam deficiência de HCII,


mas esta não é necessariamente a causa da trombose.

Figura 24. Papel de Glicosaminoglicanos na Inibição de Trombina pelo Co-fator II da


Heparina.
51

Inibidor da Via do Fator Tecidual

O inibidor da via do fator tecidual (TFPI) inibe o FXa e o complexo formado


pelo fator tecidual e o FVIIa. Interessantemente, o TFPI só é capaz de inativar o
complexo FVIIa/fator tecidual depois de uma reação prévia com o FXa.
Inicialmente, com o início da coagulação, ocorre a formação de certa quantidade
de FXa. Parte deste será ligado ao TFPI, e isso levará à inibição do complexo
FVIIa/fator tecidual, responsável pela iniciação da coagulação sanguínea,
constituindo um feedback negativo.

O TFPI é encontrado no plasma, mas pode ser liberado da vasculatura


durante a terapia com heparina ou LMWH. Assim, sua concentração é várias
vezes maior na terapia com heparina. No plasma, TFPI está parcialmente
associada com lipoproteínas (LDL e VLDL). O TFPI liberado durante tratamento
com heparina parece ser uma forma presente nas células endoteliais. Existe
evidência recente de que a geração de trombina induz uma liberação de TFPI, o
que seria outro exemplo de uma reação de feedback negativo: a trombina
interrompe sua própria produção.

Figura 25. Mecanismo de Ação do TFPI. TFPI inativa FVIIa de maneira dependente de FXa.
TFPI Primeiramente se complexa ao FXa, e o complexo TFPI/FXa então inibe FVIIa inserido no
complexo FVIIa/TF.
52

3.1.2. A Via da Proteína C

Junto com a ativação de AT e TFPI, a via da proteína C é o sistema de


defesa mais importante e efetivo contra a trombose. Deficiências no sistema da
proteína C (PC), especialmente resistência à proteína C ativada (APC), são as
desordens congênitas mais freqüentemente associadas com a trombofilia.

A proteína C

A proteína C é uma proteína plasmática dependente de vitamina K que


compartilha seqüências de homologia com a protrombina e outros fatores
dependentes da vitamina K, o que inclui o seu próprio co-fator protéico, a proteína
S.

Figura 26. Representação Esquemática da Seqüência das Proteínas C e S.

A proteína C é o precursor de uma serino-protease que é ativado por


trombina. A proteína C ativada é uma protease que inativa especificamente os co-
fatores FVa e FVIIIa da coagulação, de um modo dependente de cálcio,
fosfolipídeos carregados negativamente e de um co-fator protéico, a proteína S
livre. Visto que um alto fator de amplificação é atingido por estes co-fatores
ativados, a neutralização deles é muito efetiva para interromper a formação de
53

trombina. Existe evidência de que o FV não ativado pode também representar um


papel de co-fator na inativação de FVa e FVIIIa por APC. A clivagem em Arg 506
no FV por APC enfraquece esta função de co-fator.

Vale ainda ressaltar a importância de duas proteínas transmembrana


presentes na superfície das células endoteliais: o receptor de proteína C
endotelial (EPCR) e a trombomodulina. A PC intacta interage com o EPCR com
uma afinidade muito alta na presença de Ca2+ e pode ser ativada por trombina.
Para fazer isso, a trombina precisa ligar-se a outro receptor na célula endotelial, a
trombomodulina. Esta acelera a ativação da proteína C pela trombina em torno de
1000 vezes em relação à enzima sozinha. Quando a trombina está ligada à
trombomodulina, ela perde todas as suas funções de coagulação, incluindo a
ativação de FV, FVIII e FXIII, além da capacidade de clivar o fibrinogênio e ativar
plaquetas.

++
Ca

Figura 27. Mecanismo de Ação da Proteína C Ativada. A PC inativa (PC) interage com seu
receptor (EPCR) na superfície da célula endotelial, e é ativada por trombina ligada à
trombomodulina (TM). A proteína C ativada (APC) inativa então, por proteólise, os co-fatores FVa
e FVIIIa (normalmente associados à superfície de plaquetas), de um modo dependente de cálcio,
fosfolipídeos carregados negativamente e de um co-fator protéico, a proteína S livre (PS).

Resistência à APC

A resistência a APC (APCR) descreve uma função prejudicada da via da


proteína C. Na APCR, a APC adicionada ao plasma não mostra o prolongamento
esperado do tempo de coagulação do plasma. A APCR pode ser herdada ou
adquirida.

A forma hereditária é uma mutação no fator V, que é chamado “FV


Leiden”. Uma mutação no éxon 10 do FV (1691 G→A), que determina uma troca
de arginina para glutamina na posição 506 da proteína, muda um dos sítios de
clivagem para APC no FVa. A conseqüência biológica desta mutação é um atraso
na inativação por APC na forma “Leiden” de FVa quando comparado com o “tipo
selvagem”.
54

O FVa mutado permanece ativo por muito mais tempo que o tipo selvagem
e pode produzir mais trombina. Ademais, o variante 506 Gln do FV parece ter
uma atividade de co-fator mais baixa para proteína C ativada na inativação de
FVIIIa e FVa. Portanto, os pacientes afetados por esta mutação podem
desenvolver doença tromboembólica, especialmente quando outros fatores de
risco estão presentes – p.ex., o uso de fármacos contraceptivos orais e a
ocorrência de patologias tais como lupus anticoagulante (produção de auto-
anticorpos que são direcionados contra fosfolipídios ou contra proteínas ligadoras
de fosfolipídios, como por exemplo, proteínas C ou S, protrombina, beta2-
glicoproteína I e anexina V), ou deficiências de um dos inibidores da coagulação,
como proteína C, proteína S ou antitrombina.

Vale ressaltar que a mutação do FV de Leiden tem uma alta prevalência


em caucasianos (5-10%), mas está ausente ou muito rara nas populações nativas
americana e australiana, no Japão e em alguns outros países da Ásia Oriental. A
forma homozigota é relativamente rara, mas ainda muito mais comum que a
deficiência de antitrombina, proteína S ou proteína C. Pacientes homozigotos para
FV Leiden tem um risco maior para trombose que heterozigotos, nos quais 50%
das moléculas de fator V são normais.

Já a resistência à APC adquirida é freqüentemente achada em:

• Pacientes com inflamação ou em gravidez (provavelmente parcialmente


induzida pelo aumento da proteína C4b-BP, cuja ligação à proteína S
leva a uma perda de funcionalidade dessa proteína regulatória);
• Pacientes com FVIII elevado (proteína de fase aguda, algumas vezes
seu aumento pode também ocorrer espontaneamente);
• Pacientes com síndrome antifosfolipídica;
• Pacientes com mutação G20210A de protrombrina;
• Pacientes com deficiências de antitrombina, proteína C ou proteína S.

Deficiência de Proteína C e Proteína S

Uma deficiência de proteína C e/ou S pode levar à trombose.


Aproximadamente metade dos pacientes com deficiência de proteína C
desenvolve trombose até a idade de 40 anos. A deficiência de proteína C está
associada com risco aumentado de até 7 vezes para o tromboembolismo venoso.
Também a deficiência de proteína S parece predispor à trombose venosa,
provavelmente com um risco de 5 a 10 vezes acima do normal. Formas qualitativa
(tipo I) e quantitativa (tipo II) de deficiência de proteína C e proteína S são
conhecidas.
55

3.2. FIBRINÓLISE

“Mais que apenas dissolver coágulos.”

O Sistema Fibrinolítico é responsável pela lise de coágulos de fibrina, mas


também está envolvido na degradação do colágeno, angiogênese, metástase
tumoral e nas cascatas proteolíticas das metaloproteases da matriz. No entanto,
apenas seu envolvimento direto na hemostase será discutido.

3.3.1. Mecanismos Básicos na Fibrinólise

A fibrinólise compartilha várias similaridades com o sistema de coagulação.


Os fatores e inibidores são homólogos às suas contrapartes e são obviamente
produtos de precursores comuns durante a evolução molecular. Além disso, o
sistema fibrinolítico requer etapas de ativação de pró-enzimas. As funções de co-
fator também representam um papel importante. A enzima central da fibrinólise é
a proteína plasmática plasminogênio, o precursor da serino-protease plasmina.
Os dois ativadores mais importantes do plasminogênio são o ativador de
plasminogênio tecidual (t-PA), e a uroquinase (u-PA). Ambos ativadores de
plasminogênio são precursores de serino-proteases e requerem uma etapa de
ativação proteolítica.

A principal via de ativação do sistema fibrinolítico é dependente de fibrina,


e é iniciada com a formação do coágulo, embora, inicialmente, a resposta
fibrinolítica não seja favorecida.

Ativação da Fibrinólise por t-PA: Fibrinólise Dependente de Fibrina

O plasminogênio tem afinidade à fibrina e se liga firmemente a esta


molécula. Células endoteliais sintetizam e liberam o ativador de plasminogênio
tecidual (t-PA) na corrente sanguínea. Aparentemente, certos estímulos tal como
estase ou formação de fibrina podem aumentar a secreção e a nova síntese de t-
PA. O t-PA também tem forte afinidade à fibrina. A fibrina serve como um co-fator
para a ativação de plasminogênio por uma clivagem proteolítica mediada por t-
PA. A fibrina, e especialmente a fibrina parcialmente degradada, aumentam a
ativação de plasminogênio mediada por t-PA. Além disso, o plasminogênio que se
liga à fibrina também é suscetível à ativação auto-proteolítica pela plasmina
(reação de feedback positivo).

A plasmina é uma enzima relativamente inespecífica, mas muito poderosa


que cliva a rede de fibrina e libera produtos de degração da fibrina (FDP) de
diferentes tamanhos moleculares, sendo os menores deles o fragmento D e o
fragmento E. Um produto de degradação importante diagnosticamente é o D-
dímero, o menor de uma série de FDPs com ligações cruzadas. Concentrações
aumentadas de D-dímero indicam formação de fibrina e subseqüente lise. A
plasmina, entretanto, também cliva fibrinogênio, o que gera produtos de
degradação do fibrinogênio tais como fragmento X e Y e produtos menores.
Alguns desses produtos de degradação prejudicam a agregação plaquetária e a
56

polimerização de fibrina, funcionando como anticoagulantes. Portanto, em


algumas situações clínicas com baixa concentração de fibrinogênio devido à
atividade fibrinolítica aumentada, o sangramento pode ser preferencialmente
causada pela presença de FDPs do que pelo nível de fibrinogênio diminuído.
Ativação de plasminogênio por u-PA

Uma via diferente para ativar a fibrinólise é mediada pelo ativador de


plasminogênio do tipo uroquinase (u-PA), a forma ativada de seu precursor
plasmático pró-uroquinase. A pró-uroquinase é encontrada em baixas
concentrações como uma molécula de cadeia única (scu-PA) no plasma. A
ativação deste precursor em uma forma de dupla-cadeia (tcu-PA) é mediada por
FXIIa, calicreína e por plasmina (reação de feedback positivo) e é aumentada pela
ligação ao receptor de uroquinase. A dependência de calicreína pode explicar
porque pacientes com uma deficiência de pré-calicreína, FXII ou HMWK, que
foram historicamente sendo considerados como parte da cascata de coagulação,
não têm problemas hemorrágicos, mas em vez disso sofrem de trombose.
Entretanto, a importância da via dependente de u-PA da fibrinólise não está
completamente entendida. A uroquinase pode, em vez disso, ser importante para
remodelamento tecidual e migração celular.

Figura 28. Representação Esquemática da Conversão de Plasminogênio em Plasmina.


Ativação por proteólise catalisada pelos ativadores de plasminogênio tecidual (t-PA) e uroquinase,
ou ainda pela estreptoquinase, uma proteína bacteriana e, portanto, exógena, bastante utilzada na
clínica como um trombolítico.

3.3.2. Inibidores da Fibrinólise

Alfa2-antiplasmina

Sob condições fisiológicas, a plasmina é rapidamente inativada por alfa2-


antiplasmina. Esta é uma serpina que possui afinidade à fibrina e é ligada
57

covalentemente à fibrina pelo FXIIIa durante a formação do coágulo. A reação


entre alfa2-antiplasmina e plasmina é muito rápida. A meia vida da plasmina livre
no sangue é de apenas 0,1 segundos. Na superfície de fibrina, na qual a plasmina
é muito menos acessível à alfa2-antiplasmina, a inibição é provavelmente cerca de
50 vezes mais lenta que no plasma. A deficiência de alfa2-antiplasmina está
associada com complicações hemorrágicas. Formas adquiridas da deficiência são
muito mais comuns que a deficiência hereditária.

Inibidor do Ativador de Plasminogênio tipo 1 (PAI-1)

Ambos t-PA e u-PA têm um inibidor específico, PAI-1. Esta serpina é


estabilizada pela ligação à vitronectina, uma proteína de matriz extracelular. O
PAI-1 é encontrado no plasma e nas plaquetas. O PAI-1 também é sintetizado por
células endoteliais, especialmente quando elas são estimuladas por
lipopolissacarídeos (LPS, endotoxinas) durante a sepse, por citocinas pró-
inflamatórias tais como IL-1 ou TNF, e também por trombina. O PAI-1 é
considerado uma proteína de fase aguda e pode aumentar significativamente
durante a inflamação, mas também durante a trombose. A rara deficiência de PAI-
1 hereditária está associada com hemorragia.

Inibidor da Fibrinólise Ativado por Trombina (TAFI)

O inibidor da fibrinólise ativado por trombina (TAFI) é uma proteína


plasmática que, quando convertida a uma enzima ativa, atenua a fibrinólise. O
TAFI é uma metaloendopeptidase dependente de zinco, e esta enzima retira
aminoácidos básicos C-terminais tais como lisina ou arginina. O TAFI existe na
forma precursora (pró-TAFI) e a sua ativação é realizada pela trombina associada
à trombomodulina (ver a via da proteína C) e dessa maneira ligada a células
endoteliais.

O TAFI ativado protege o coágulo de fibrina contra a lise por clivar os sítios
de ligação à lisina requeridos para a ligação de plasminogênio, o que
significativamente retarda o tempo de fibrinólise induzido por t-PA. Existe uma
correlação direta entre o tempo de lise do coágulo e a concentração de TAFI. O
fator XIIIa entrecruza TAFI à fibrina, desse modo ajudando a proteger o coágulo
recém formado da degradação prematura por plasmina. O entrecruzamento pode
facilitar a ativação de TAFI, estabilizar a atividade enzimática, e proteger a enzima
ativa de degradação mais adiante. A regulação positiva da produção de TAFI
durante a resposta inflamatória pode exacerbar a trombose, contribuindo para o
desenvolvimento de coagulação intravascular disseminada, bem como de outras
condições envolvendo trombose. A lise do coágulo por concentrações
farmacológicas de t-PA não é influenciada pelo TAFI. Em estudos animais,
antagonistas contra o TAFI promoveram trombólise. Dados recentes sugerem que
a aspirina pode inativar o TAFI.
58

Figura 29. Resumo dos principais mecanismos de controle da fibrinólise.

3.3.3. Fisiopatologia da Fibrinólise

Hiperfibrinólise

A produção excessiva de plasmina (hiperfibrinólise) é uma situação clínica


potencialmente perigosa que está associada com um forte risco hemorrágico.
Visto que muitos testes de laboratório não são sensíveis para detecção de
hiperfibrinólise, o aumento excessivo da formação de plasmina e a geração de
FDPs anticoagulatórios freqüentemente não são reconhecidos cedo o bastante.
Os ensaios globais típicos realizados no plasma não são muito sensíveis para
hiperfibrinólise. O único ensaio global que é prontamente disponível e sensível
para detecção imediata da hiperfibrinólise são a tromboelastografia, ou a sua
versão mais sofisticada, a tromboelastometria.

Devido a sua especificidade limitada, a plasmina não pode degradar muitos


substratos no sangue. Ademais, a plasmina pode ativar metaloproteases da
matriz que estão associadas com destruição tecidual e apoptose. Hiperfibrinólise
pode desenvolver-se em pacientes politraumatizados, durante sepse, coagulação
intravascular disseminada ou em outras situações. Também uma deficiência
congênita ou adquirida em um dos inibidores da própria plasmina (deficiência de
alfa2-antiplasmina) ou de seus ativadores (deficiência de PAI-1) pode induzir
hiperfibrinólise.

A hiperfibrinólise é um círculo vicioso que dispõe a sangramento, mas


parcialmente também a trombose. Um diagnóstico associado a tratamento
subseqüente é necessário. O fármaco de escolha é a aprotinina, um inibidor de
baixo peso molecular relativamente inespecífico isolado do parênquima do
pulmão. A aprotinina é utilizada com sucesso em circuitos cardiopulmonares,
p.ex. em cirurgias de coração aberto, para reduzir a hemorragia induzida por
hiperfibrinólise. Outros fármacos antifibrinolíticos são o ácido tranexâmico ou o
59

ácido epslon-amino capróico, que interferem com a interação de plasminogênio/t-


PA e fibrina. Assim, esses fármacos previnem a formação de plasmina.

Fibrinólise Prejudicada (Hipofibrinólise)

A hipofibrinólise pode ser esperada a partir de:

• Deficiência de t-PA, u-PA ou plasminogênio;


• Liberação defeituosa de t-PA do endotélio (síntese e armazenamento);
• Concentração elevada de PAI-1 (muito comum) ou alfa2-antiplasmina.

Em casos raros, a hipofibrinólise é também o resultado de uma forma rara


de disfibrinogenemia, na qual a fibrina (fibrinogênio) mutante perdeu a habilidade
de estimular a fibrinólise. Deficiências dos fatores de contato FXII, pré-calicreína e
HMWK – resultando em ativação prejudicada de pró-uroquinase por calicreína –
também podem levar a uma fibrinólise defeituosa.

A hipofibrinólise está associada com o desenvolvimento de doença


tromboembólica, mas certamente não ao mesmo grau como na resistência à
APC, deficiências da via da proteína C ou deficiência de antotrombina. Testes
clínicos amplos, tal como o estudo da trombofilia de Leiden, não necessariamente
suportam o conceito de que a hipofibrinólise é um forte fator de risco no
desenvolvimento da trombofilia.

3.3.4. Terapia Trombolítica

A terapia trombolítica é empregada em milhões de pacientes com doença


tromboembólica, especialmente com acidente vascular cerebral e infarto agudo do
miocárdio. O benefício clínico foi mostrado em testes multicêntricos amplos
durante a última década. A terapia trombolítica dissolve os coágulos,
especialmente quando iniciada muito cedo após o evento agudo.

Fármacos trombolíticos que são amplamente utilizados para o tratamento


do infarto do miocárdio, trombose venosa profunda, acidente vascular cerebral
isquêmico e desordens relacionadas são:

• Estreptoquinase (SK), uma proteína bacteriana capaz de ativar o


plasminogênio já citada acima;
• Ativador de plasminogênio tecidual (t-PA), um ativador específico de
fibrina produzido por técnicas recombinantes (alteplase) e derivados de
t-PA construídos geneticamente, p.ex. com meia vida plasmática
prolongada (reteplase, lanoteplase) ou inibição prejudicada por PAI-1
(tenecteplase);
• Uroquinase (da urina humana ou recombinante) ou rscu-PA (saruplase);
• Estreptoquinase anisolitada (APSAC), um complexo de plasminogênio e
estreptoquinase que está bloqueado no sítio ativo por um agente
bloqueador lábil.
60

O t-PA é utilizado com sucesso para tratamento de acidente vascular


cerebral (AVC), se um AVC hemorrágico puder ser excluído. A terapia trombolítica
é freqüentemente combinada com heparina. Como resultado, uma resposta
hiperfibrinolítica maciça é gerada, ou sistematicamente (SK), ou mais localizada a
áreas ricas em fibrinas (t-PA). Isto pode levar à lise parcial ou completa do trombo
de fibrina e recanilização de vasos ocluídos.

Também o fibrinogênio é parcialmente degradado. Isto poderia ser outro


efeito colateral positivo, porque a viscosidade do sangue e a adesão e agregação
plaquetárias são diminuídas. Além disso, os produtos de degradação do
fibrinogênio possuem um efeito anticoagulante poderoso porque eles prejudicam
a polimerização da fibrina. O grau de degradação de fibrinogênio é fortemente
dependente do fármaco e da dose. Obviamente, a terapia com t-PA induz uma
redução relativamente leve de fibrinogênio. Um efeito colateral da terapia
trombolítica é o sangramento, embora esquemas terapêuticos modernos e o
aperfeiçoamento de fármacos trombolíticos tenham reduzido este risco
significativamente.
61

Resumo de alguns dos principais reguladores do processo hemostático

Equilíbrio entre os mecanismos pró- e anticoagulantes

PAI-1 PTN C / PTN S

antiplasmina TFPI

Fator Tecidual AT / HC II

Fatores da coagulação Sistema fibrinolítico

Fatores Fatores
Pró-coagulantes Anticoagulantes
62

3.3. TROMBOSE

Tendo discutido os componentes da hemostasia normal, voltamos agora


nossa atenção à desregulação que se submete à formação patológica do trombo.

3.3.1. Patogênese

Três influências principais predispõem à formação do trombo, conhecida


como a tríade de Virchow: (1) lesão endotelial; (2) estase ou turbulência do fluxo
sanguíneo; e (3) hipercoagulabilidade sanguínea.

Lesão Endotelial

Essa é a influência dominante; a lesão endotelial por si só pode levar à


trombose. É particularmente importante para a formação do trombo que ocorre no
coração ou na circulação arterial, em que as freqüências do fluxo, normalmente
altas, poderiam de qualquer forma atrasar a coagulação pela prevenção da
adesão plaquetária ou fatores da coagulação diluídos. Assim, a formação
trombótica dentro das câmaras cardíacas (p.ex., seguida à lesão endocárdica
devido ao infarto miocárdico), sobre as placas ulceradas nas artérias
ateroscleróticas ou em locais de lesão vascular traumática ou inflamatória
(vasculite) é devido, em grande parte, à lesão endotelial. Claramente, a perda
física do endotélio levará a exposição da matriz extracelular subendotelial, adesão
plaquetária (presença de colágeno), liberação do Fator Tecidual, e depleção local
de prostaciclina e ativadores de plasminogênio. Todavia, é importante observar
que o endotélio não necessita estar fisicamente rompido para contribuir para o
desenvolvimento da trombose; qualquer perturbação no equilíbrio dinâmico dos
efeitos pró e antitrombóticos do endotélio pode influenciar os eventos de
coagulação local. Assim, o endotélio disfuncional pode passar a expressar
quantidades maiores de fatores pró-coagulantes (p.ex., moléculas de adesão
plaquetária, Fator Tecidual, e o inibidor do ativador de plasminogênio) ou pode
sintetizar menos efetores anticoagulantes (p.ex., trombomodulina, PGI2, e o
ativador de plasminogênio tecidual). Uma disfunção endotelial significativa (na
ausência de perda celular endotelial) pode ocorrer, p.ex., devido aos estresses
hemodinâmicos da hipertensão ou presença de endotoxinas bacterianas. Mesmo
influências relativamente sutis, como a hemocistinúria, a hipercolesterolemia, a
radiação, ou os produtos absorvidos da fumaça do cigarro, podem iniciar a lesão
endotelial.

Alterações do Fluxo Sanguíneo Normal

A turbulência contribui para a trombose arterial e cardíaca por causar lesão


ou disfunção endotelial, bem como pela formação de bolsas contracorrentes e
focais de estase: a estase é um fator principal para o desenvolvimento do trombo
venoso. O fluxo sanguíneo é laminar, com as plaquetas fluindo centralmente no
lúmen do vaso, separado do endotélio por uma zona clara do plasma de
movimento mais lento. A estase e a turbulência, portanto, (1) rompem o fluxo
63

laminar e trazem as plaquetas em contato com o endotélio; (2) impedem a


diluição dos fatores coagulantes ativados pelo fluxo de sangue fresco; (3)
retardam o fluxo interno dos inibidores dos fatores coagulantes e permitem a
formação do trombo; e (4) promovem a ativação celular endotelial, predispondo à
trombose local, adesão leucocitária e uma variedade de outros efeitos celulares
endoteliais.

A turbulência e a estase contribuem claramente para a trombose em um


número de cenários clínicos. As placas ateroscleróticas ulceradas não somente
expõem a matriz extracelular subendotelial, mas também são fontes de
turbulência. As dilatações aórtica e arterial anormais, denominadas aneurismas,
causam estase local e são locais favoráveis de trombose. Os infartos miocárdicos
não somente têm lesão endotelial associada, mas também têm regiões de
miocárdio não-contrátil, adicionando um elemento de estase na formação dos
trombos murais. A estenose da valva mitral (p.ex., após doença cardíaca
reumática) resulta em dilatação atrial esquerda. Em conjunto com a fibrilação
atrial, um átrio dilatado é um local de estase profunda e uma localização principal
ao desenvolvimento do trombo. As síndromes de hiperviscosidade (como a
policitemia) causam estase de pequenos vasos. E finalmente, os eritrócitos
deformados na anemia de células falciformes causam oclusões vasculares, com a
estase resultante predispondo à trombose.

Hipercoagulabilidade

A hipercoagulabilidade é outro componente importante na equação que


contribui para os estados trombóticos. É imprecisamente definida como qualquer
alteração das vias de coagulação que predisponha à trombose. As causas de
hipercoagulabilidade podem ser disfunções primárias (genéticas) e secundárias
(adquiridas).

Das causas herdadas de hipercoagulabilidade, as mutações nos genes do


fator V e da protrombina são as mais comuns. Aproximadamente 2 a 15% dos
caucasianos carregam uma mutação específica no fator V (denominada mutação
Leiden, uma cidade na Holanda, onde ela foi descoberta), substituindo o resíduo
da arginina normal na posição 506 por uma glutamina e tornando a proteína
resistente à clivagem pela proteína C. O fator V de Leiden mutante não pode ser
inativado por clivagem no resíduo de arginina normal e, portanto, é resistente ao
efeito anticoagulante da proteína C ativada. Tal resistência à inativação mediada
pela fator Va promove coagulação incontrolada. Entre os pacientes com trombose
venosa profunda recorrente, a freqüência no portador é consideravelmente maior,
em torno de 60% em algumas séries. Finalmente, uma única alteração
nucleotídea (transição de G para A) na região não-traduzida 3’ do gene da
protrombina é um alelo bastante comum (1 a 2% da população), que está
associado a níveis elevados de protrombina e um risco aumentado de quase três
vezes de tromboses venosas.

Outros exemplos podem ser ainda citados, como a elevação dos níveis de
homocisteína, que contribui para trombose arterial e venosa e, realmente, para o
desenvolvimento da aterosclerose. Provavelmente, esse efeito é devido à inibição
64

da antitrombina III e trombomodulina endotelial. A hiperomocistenemia pode ser


herdada ou adquirida. Uma mutação homozigota no gene da metiltetraidrofolato
redutase causa homocistenemia branda em 5 a 15% das populações branca e da
Ásia Ocidental, correspondendo, assim, à freqüência do fator V de Leiden.
Todavia, a relação entre esta mutação e a trombose é bem menos estabelecida.
Além dessas mutações pontuais bem caracterizadas, os polimorfismos nos genes
dos fatores coagulantes também parecem fornecer o risco aumentado de
trombose venosa. Demais estados hipercoaguláveis primários, menos comuns,
incluem deficiências herdadas de anticoagulantes, como a antitrombina III,
proteína C, ou proteína S; indivíduos afetados apresentam-se, tipicamente, com
trombose venosa e tromboembolismo recorrente na adolescência ou no início da
vida adulta.

Ainda que individualmente estas disfunções herdadas sejam incomuns, de


maneira coletiva elas são significativas por duas razões. Primeiro, as mutações
subjacentes dessas trombofilias herdadas podem ser co-herdadas e o efeito de
ter duas mutações em risco de trombose é muito mais que suplementar.
Segundo, indivíduos com tais mutações têm um risco maior que os indivíduos
normais de desenvolver trombose venosa quando as causas adquiridas de
hipercoagulabilidade, como na gravidez, também estão presentes. As causas
herdadas da hipercoagulabilidade devem ser consideradas em pacientes abaixo
dos 50 anos de idade que se apresentam com trombose na ausência de qualquer
predisposição adquirida.

Diferente destas disfunções hereditárias incomuns, a patogênese da


diátese trombótica adquirida em um número de cenários clínicos comuns é mais
complicada e multifatorial. Em algumas situações (p.ex., insuficiência cardíaca ou
trauma) certos fatores, como estase ou lesão vascular, podem ser mais
importantes. Em outros casos (p.ex., o uso de contraceptivos orais e o estado
hiperestrogênico da gravidez), a hipercoagulabilidade pode ser causada,
parcialmente, pela síntese hepática aumentada de muitos fatores da coagulação e
síntese reduzida da antitrombina III; a heterozigoticidade pelo fator V de Leiden
também pode ser um componente contribuidor de base. A hipercoagulabilidade
vista com o avanço da idade pode ser devido á suscetibilidade aumentada de
agregação plaquetária e liberação de PGI2 reduzida pelo endotélio. O tabagismo e
a obesidade promovem a hipercoagulabilidade por mecanismos desconhecidos.

Entre as causas adquiridas de diátese trombótica, a supostamente


conhecida síndrome da trombocitopenia induzida pela heparina e a síndrome do
anticorpo antifosfolipídico (previamente denominada síndrome anticoagulante de
lupus) merecem atenção especial.

Destino do Trombo

Se um paciente sobrevive aos efeitos imediatos de uma obstrução vascular


trombótica, os trombos são submetidos a uma combinação dos quatro eventos
seguintes, nos dias-semanas que se seguirão:
65

• Propagação – o trombo pode acumular mais plaquetas e fibrina


(propagação), levando eventualmente à obstrução do vaso;
• Embolização – os trombos podem deslocar-se e viajar para outros
locais da vasculatura;
• Dissolução – os trombos podem ser removidos pela atividade
fibrinolítica;
• Organização e recanalização – os trombos podem induzir a inflamação
em fibrose (organização) e podem tornar-se eventualmente
recanalizados, isto é, podem restabelecer o fluxo vascular, ou podem
ser incorporados na parede vascular espessada.

Quanto à dissolução, a ativação das vias fibrinolíticas pode levar à redução


rápida e mesmo à lise total dos trombos recentes. Com os trombos mais velhos, a
polimerização extensiva de fibrina dá ao trombo uma resistência mais substancial
à proteólise, tornando a lise ineficiente. Isso é importante devido às infusões
terapêuticas de agentes fibrinolíticos, como o t-PA (p.ex., no tromboembolismo
pulmonar ou trombose coronária), que provavelmente são efetivos somente por
um curto período de tempo após a formação dos trombos.

Os trombos mais velhos tendem a tornar-se organizados. Isso se refere ao


crescimento interno de células endoteliais, células musculares lisas, e fibroblastos
no trombo rico em fibrina. A tempo, os canais capilares são formados, que podem
se anastomosar para criar condutos de uma terminação do trombo a outra,
restabelecendo, numa extensão limitada, a continuidade do lúmen original. Ainda
que os canais não possam restaurar com sucesso um fluxo significativo a muitos
vasos obstruídos, tal recanalização pode converter, em potencial, o trombo numa
massa vascularizada de tecido conjuntivo. Com o tempo e a contração das
células mesenquimais (particularmente em trombos menores), o tecido conjuntivo
pode ser incorporado como tumefação subendotelial da parede do vaso;
eventualmente, somente um bloco fibroso permanece para marcar o local original
do trombo. Ocasionalmente, em vez de se organizar, o centro de um trombo
submete-se à digestão enzimática, presumivelmente como um resultado da
liberação das enzimas lisossomais dos leucócitos e plaquetas nele contidos. Isso
é particularmente provável nos trombos maiores dentro das dilatações
aneurismáticas ou das câmaras cardíacas. Se ocorrer a semeadura bacteriana,
tal trombo degradado será um meio ideal de cultura, resultando, por exemplo,
num aneurisma micótico.

Correlações Clínicas

Os trombos são significativos, pois eles causam obstrução das artérias e


veias, e são fontes possíveis de êmbolos. A importância de cada um depende de
onde ocorre o trombo. Assim, enquanto o trombo venoso pode causar congestão
e edema nos leitos vasculares distal a uma obstrução, uma conseqüência séria
distante é que eles podem embolizar-se nos pulmões, causando morte.
Reciprocamente, ainda que os trombos arteriais possam embolizar-se, seus
papéis na obstrução vascular em locais críticos (p.ex., artérias coronárias,
resultantes no infarto miocárdico) é muito mais importante.
66

Autor(es):
Luize Gonçalves Lima
67

UNIDADE 4
68

4. TESTES DE HEMOSTASIA
Os testes hemostáticos ou provas da hemostasia são de extrema
importância na avaliação de uma suposta desordem hemostática. As duas provas
a seguir - tempo de sangramento e prova do laço – são indicadas para a
avaliação da hemostasia primária. As outras duas – tempo de ativação de
protrombina (T.A.P.) e tempo de tromboplastina parcial ativado (P.T.T.a.) –
avaliam a coagulação sanguínea (formação do coágulo de fibrina).

4.1. TEMPO DE SANGRAMENTO

O tempo de sangramento ou TS é um exame sugestivo de desordens da


hemostasia primária, considerado um parâmetro de atividade plaquetária.
Consiste em avaliar o tempo necessário para cessar o sangramento de uma
pequena lesão de tamanho e profundidade padronizados. Os valores de TS
considerados normais estão entre 1 e 4 minutos.

Inicialmente, a técnica para avaliação do tempo de sangramento consistia


em mensurar o tempo necessário para cessar o sangramento de uma pequena
lesão feita com uma lanceta ou estilete, no lóbulo da orelha ou polpa digital
(Método de Duke). No entanto, surgiu para fins comparativos, a necessidade de
se padronizar as condições da realização do teste. Isto porque alguns outros
parâmetros, que não a capacidade hemostática, podem influir no tempo de
sangramento. Dentre estes podemos destacar, por exemplo, alterações de
pressão arterial, irrigação da região, e profundidade e tamanho da lesão. Desta
forma, Ivy introduziu modificações do método para padronizar as condições de
realização do teste para melhor avaliar a hemostasia (Método de Ivy).

No método de Ivy, o tamanho e profundidade da lesão são padronizados


pelo uso de um equipamento apropriado. O local da lesão é uma área do
antebraço que seja pouco coberta de pelos e sem vasos visíveis e a pressão
sanguínea é mantida dentro de uma faixa controlada pelo inflamento de um cuff
no braço para a manutenção da pressão em torno de 40mmHg.

O teste do tempo de sangramento, feito nestas condições, avalia a


capacidade de formação do plug plaquetário, fase inicial da hemostasia, e,
portanto é um método de avaliação da hemostasia primária e de funcionalidade
plaquetária. Alterações do tempo de sangramento são indicativos de alterações
qualitativas ou quantitativas das plaquetas.

Qualidade das plaquetas:


Na trombastenia de Glanzmann, a plaqueta perde sua capacidade de agregação,
desse modo a formação do tampão fica dificultada e o TS fica prolongado.

Número de plaquetas:
Pode estar elevado (trombocitose) ou diminuído (trombocitopenia).
Dentre as tromboses, destaca-se a trombocitemia hemorrágica, em geral TS é
elevado e o número de plaquetas pode chegar a 2 ou 3 milhões por mm3.
69

As trombocitopenias são a causa mais comum, na clínica, de TS alongado.


Distúrbios da coagulação e deficiências dos componentes da cascata de
coagulação têm pouca ou nenhuma influência sobre o tempo de coagulação.
Resumindo, o TS depende da hemostase primária (plaquetas, fator de von
Willebrand, integridade vascular cutânea). Portanto, um TS alargado diante de
uma plaquetometria normal, sugere: doença de von Willebrand ou distúrbio de
função plaquetária hereditário (trombastenia de Glazmann, síndrome de Bernard-
Soulier) ou adquirido (uremia, circulação extracorpórea).

4.2. PROVA DO LAÇO

Esse exame também é chamado de prova de fragilidade capilar ou teste da


resistência de Hess. Esta prova é feita colocando-se torniquete de borracha
(garrote) ou manguito de pressão no antebraço e insuflando ar até manter a
pressão média entre a sistólica e a diastólica por 5 minutos. Após esse tempo,
verifica-se na parte anterior do antebraço e na dobra do cotovelo o número de
petéquias que aparecem. Petéquias são pontos avermelhados indolores que
surgem na pele devido ao extravasamento de sangue que ocorre quando há
fragilidade capilar. As petéquias devem ser contadas quando afastadas pelo
menos 5 cm da posição do garrote ou manguito.

O número de petéquias depende da fragilidade capilar. Normalmente há 4


ou 5 petéquias numa área de 1 cm2. Quando há fragilidade capilar, o número de
petéquias é maior, ou seja, 6 ou mais petéquias.

Com essa prova, promove-se aumento da pressão nos capilares e


obstrução do retorno venoso, o que favorece o extravasamento de sangue para o
meio intersticial. Portanto, o impedimento de formação petequial depende da
resistência da parede capilar e também em função da quantidade e qualidade das
plaquetas. Não há, porém, uma relação perfeita entre fragilidade capilar e número
de plaquetas, mas em geral a trombocitopenia (número de plaquetas diminuído) é
acompanhada de fragilidade capilar.

O aumento da fragilidade capilar pode ser observado na trombocitopenia,


trombastenia de Glanzmann, trombocitopatias, doença de von Willebrand, púrpura
Henoch-Schonlein, disproteinemias, púrpura senil, diabetes mellitus, hipertensão,
artrite reumatóide. É importante ressaltar, porém, que em mulheres esse teste é
de difícil interpretação devido ao fácil desenvolvimento de petéquias.

4.3. TEMPO DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA (TAP) E TEMPO DE


TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPa)

Os dois testes a seguir avaliam a coagulação sanguínea, sendo o primeiro


dedicado à avaliação da via extrínseca e o segundo dedicado à via intrínseca.
70

4.3.1. Tempo de Ativação de Protrombina (TAP)

Tempo de protrombina (TAP) é o tempo que o plasma leva para coagular


quando a ele se adiciona Cloreto de Cálcio e excesso de um preparado
denominado tromboplastina tecidual (trata-se de um preparado contendo altos
níveis de Fator Tecidual). Para a realização desse teste, é necessário que o
sangue seja coletado com quelantes de cálcio fracos como o oxalato ou citrato de
sódio.

Assim, ao se adicionar o Cálcio ionizado, a coagulação é prontamente


iniciada pela via extrínseca, uma vez que a tromboplastina adicionada nesse teste
contém fosfolipídio de membrana e o próprio Fator Tecidual, o que garante que a
coagulação ocorra preferencialmente pela via extrínseca, que é mais rápida que a
via intrínseca.

Na via extrínseca atuam, além do Fator Tecidual, os fatores V, VII, X e


protrombina. Portanto, a deficiência de um ou mais destes fatores ou presença de
inibidores da coagulação levarão a um TAP prolongado.

Clinicamente, o resultado do TAP pode ser dado da seguinte forma:

• Em segundos - o TAP de um plasma humano normal é de 11,5 s a 12,5


s (segundo método de Quick);
• Uma relação entre tempo do paciente e o tempo controle - o normal é
uma relação de 1,0 a 1,4;
• Pela “Atividade de Protrombina” - o normal é acima de 70-80%.

A deficiência de um dos fatores citados provocará um aumento em segundos


do TAP, por exemplo: tempo do paciente = 24s. Este valor é comparado com o
controle, que se for, por exemplo, de 12s a relação será 2. Neste mesmo exemplo
a “Atividade de Protrombina” será 50%, logo o TAP em segundos aumenta e a
“Atividade de Protrombina” diminui.

Uma utilização clinica importante deste exame está em testes pré-cirúrgicos


para avaliação do sistema de coagulação do paciente, uma vez que a cirurgia
predispõe a hemorragias.

Outra utilização clínica está na avaliação de insuficiência hepática, uma vez


que os fatores da via extrínseca (exceto o Fator Tecidual) são sintetizados no
fígado e estarão em quantidades menores no plasma em pacientes com este
quadro.

Segundo o critério de Child-Pugh temos:

1 ponto 2 pontos 3 pontos


TAP (segundos
1-3 s 4-6 s >6 s
prolongados)

O TAP está elevado nas coagulopatias extrínsecas ou comuns, geralmente


quando a deficiência é moderada ou grave (< 10% da atividade). As condições
71

que mais elevam este tempo são: uso de cumarínicos (warfarim), deficiência de
vitamina K, insuficiência hepática, deficiência dos fatores da via extrínseca ou da
via comum.

4.3.2. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (PTTa)

Este exame também é denominado tempo de formação de tromboplastina


do sangue ou tempo de cefalina, nesta prova se adiciona ao plasma citratado o
reagente denominado de tromboplastina parcial ou cefalina, a qual eventualmente
contém uma suspensão de caulim (partículas de vidro). A adição de cloreto de
cálcio inicia a coagulação pela via intrínseca. O PTTa para um plasma humano
normal ativado por caulim é de 32 s a 46 s.

Como este teste é realizado na ausência de Fator Tecidual, o processo de


coagulação é obrigatoriamente iniciado pela via intrínseca, ou seja, pelo contato
com as partículas de vidro, que garantem a superfície negativa capazes de ativar
os fatores XI e XII.

Desse modo, se o teste for anormal, é porque deve haver deficiência em


um dos fatores plasmáticos da via intrínseca.

Clinicamente, o resultado do PTTa deve ser dado:

• Em segundos - normal em torno de 32 s a 46 s;


• Atividade normal;
• Relação entre o tempo do paciente e o tempo de controle.

O PTTa estará alargado nas coagulopatias da via intrínseca ou via comum,


geralmente quando a deficiência é leve, moderada ou grave (<15 – 30% da
atividade normal). As condições que mais elevam este tempo são: deficiência do
fator VIII (hemofilia A), deficiência do fator XI (hemofilia B), CID, insuficiência
hepática, deficiência grave de vitamina K e intoxicação grave por cumarínicos.
Vale lembrar que na Doença de von Willebrand pode haver uma deficiência leve
do fator VIII, mas capaz de alargar o PTTa.

A deficiência mais comum na prática diária clínica é a do fator VIII. Quando o


teste for anormal deve-se logo pesquisar este fator.

Devemos ressaltar também que na obtenção do sangue para a realização


deste exame, deve-se tomar cuidado para puncionar e pegar a veia na primeira
tentativa, caso contrário poderá haver contaminação com Fator Tecidual, o que
poderia gerar um resultado impreciso.

4.4. PROVAS DE HEMOSTASIA – COMO UTILIZÁ-LAS?

Agora, estamos diante de um paciente que apresenta uma hemorragia


sugestiva de uma desordem hemostática. Por onde começamos? Como
interpretar o resultado dos exames e qual o próximo passo?
72

Para começar utilizamos as quatro ‘Provas da Hemostasia’ mais importantes:

1) Contagem de plaquetas;
2) Tempo de Sangramento;
3) PTTa;
4) TAP.

As duas primeiras medem a hemostasia primária e as duas últimas, a


hemostasia secundária. Nos pacientes que apresentam o sangramento clássico
dos distúrbios da hemostasia primária (sangramento imediato após procedimento
odontológico ou cirúrgico, sangramento muco-cutâneo), os primeiros testes a
serem pedidos devem ser a contagem plaquetária e o Tempo de Sangramento.
Se a suspeita inicial for de distúrbio da hemostasia secundária (hemartrose,
hematoma profundo), o PTTa e o TAP são os exames mais importantes. Nas
hemorragias não características, todos estes testes devem ser prontamente
analisados.

1) Se houver trombocitopenia significativa (<50.000 plaquetas/mm3), com


PTTa e TAP normais (sem coagulopatia), o diagnóstico está claro.
Devemos procurar as causas de trombocitopenia - púrpura
trombocitopênica idiopática, púrpura trombocitopênica trombótica,
síndrome hemolítico-urêmica, anemia aplásica, leucemia, hipersplenismo
etc. Só para lembrar: a trombocitopenia justifica o prolongamento do
Tempo de Sangramento e do tempo de retração do coágulo.

2) Se houver trombocitopenia e coagulopatia (alargamento do PTTa e/ou do


TAP), devemos pensar na insuficiência hepática com hiperesplenismo, na
CID (coagulação intravascular disseminada) e no uso de heparina.
Devemos solicitar o tempo de trombina, a dosagem do fibrinogênio
plasmático e dos produtos de degradação de fibrina. Se anormais, confirma
CID.

3) Se a plaquetometria for normal, mas o Tempo de Sangramento for anormal


(>7-10 min), a suspeita recai sobre a doença de von Willebrand ou outros
distúrbios da função plaquetária (hereditários, mais raros ou adquiridos,
como uremia). A presença da combinação Tempo de Sangramento
alargado e PTTa alargado, com os restantes das provas normais indica
doença de von Willebrand. Neste distúrbio hereditário relativamente
comum, a deficiência parcial do fator VIII explica o alargamento de PTTa.

4) Se as provas da hemostasia primária forem normais, mas da hemostasia


secundária (PTTa e TAP) estiverem alteradas. Veja as combinações
abaixo:

4.4.1. PTTa Alto e TAP Normal (o Problema Está na Via Intrínseca):

POSSÍVEIS CAUSAS: uso de heparina, deficiências hereditárias da via


intrínseca, como fator VIII (hemofilia A), fator IX (hemofilia B), fator XI, doença de
73

von Willebrand, anticorpos anti-fator VIII, IX ou XI. A deficiência do fator XII, pré-
calicreína ou cininogênio de alto peso molecular não se associa a sangramento.

Desordem provavelmente adquirida – pensar em uso de heparina ou


anticorpo anti-fator VIII.

Desordem provavelmente hereditária – teste para os fatores da via


intrínseca cuja deficiência pode levar ao sangramento (VIII, IX e XI).

4.4.2. PTTa Normal e TAP Alto (o Problema Está na Via Extrínseca):

POSSÍVEIS CAUSAS: insuficiência hepática inicial, deficiência de vitamina


K inicial, uso de cumarínicos, alguns casos de CID, anticorpo anti-fator VII,
deficiência hereditária da via extrínseca (fator VII).

Desordem provavelmente adquirida: pensar em insuficiência hepática (fase


inicial) ou uso de cumarínico.

Desordem provavelmente hereditária: teste para fator da via extrínseca


(fator VII).

4.4.3. PTTa e TAP Altos (o Problema Está na Via Comum):

POSSÍVEIS CAUSAS: insuficiência hepática, deficiência de vitamina K, uso


de cumarínicos, uso de heparina, CID e deficiências hereditárias da via comum
(fibrinogênio, protrombina, fator X ou fator V).

Desordem provavelmente adquirida: tempo de trombina e dosagem de


fibrinogênio plasmático anormais, confirmam CID; se forem normais, pensar em
insuficiência hepática, deficiência de vitamina K ou uso de cumarínicos.

Desordem provavelmente hereditária: testes para fatores da via comum


(fibrinogênio, protrombina, fator X ou fator V). O Tempo de Trombina está alterado
nos distúrbios do fibrinogênio (pedir testes especiais para disfibrinogenemia).

4.4.4. PTTa e TAP Normais:

Se todos os testes estiverem normais, incluindo aqueles da hemostasia


primária, as hipóteses passam a ser: 1- hiperfibrinólise; 2- deficiência de fator XIII
e 3- disfibrinogenemia.

Desordem provavelmente adquirida: pensar em distúrbios relacionados à


hiperfibrinólise. O teste da lise da euglobulina e o aumento dos PDF confirmam o
diagnóstico.

Desordem provavelmente hereditária: considerar deficiência de fator XIII e


disfibrinogenemia. O exame mais importante nesse momento é o Teste da
74

Solubilidade do Coágulo a Uréia 5M. Este teste é feito adicionando-se uréia na


concentração 5M ao coágulo formado. Normalmente não há dissolução – se
houver, há forte suspeita da deficiência do fator XIII.

Autor(es):
Ana Carolina Menezes

Revisor(es):
Heitor Affonso de Paula Neto
75

UNIDADE 5
76

5. HEMÁCIAS E GRUPOS SANGUÍNEOS

5.1. INTRODUÇÃO

O Sangue é um tecido conjuntivo especializado constituído de células e


plasma. O plasma é o componente líquido do sangue e é constituído por sais e
componentes orgânicos (incluindo aminoácidos, lipídios, vitaminas, proteínas e
hormônios). Os elementos celulares do sangue compreendem as hemácias, os
leucócitos, e as plaquetas. Os eritrócitos sedimentados constituem cerca de 45%
do volume de sangue. Há dois tipos de leucócitos: os granulócitos (neutrófilos,
eosinófilos e basófilos), os agranulócitos (linfócitos e monócitos)

Nos capítulos anteriores, estudamos o plasma e os fatores de coagulação


que nele circulam; além da função das plaquetas na manutenção da hemostasia.
Neste capítulo vamos nos deter especificamente no estudo das hemácias,
também chamadas de eritrócitos (Gk. erythros, vermelho; kitos, célula).

5.2. HEMATOPOIESE E ERITROPOIESE

A hematopoiese é o processo pelo qual os elementos celulares do sangue


são formados. As células sanguíneas aparecem primeiramente na terceira
semana do desenvolvimento embrionário fetal, a partir do saco vitelino. Estas
células são geradas por meio de uma população de células-tronco restrita à
produção de células mielóides. No terceiro mês da embriogênese, as células-
tronco hematopoiéticas definitivas (originadas do mesoderma intra-embrionário na
região aórtica/gonadal/mesonéfrica e/ou do saco vitelínico) migram em direção ao
fígado, o órgão principal de formação das células sanguíneas até pouco tempo
antes do nascimento. No início do quarto mês de desenvolvimento embrionário,
células-tronco migram em direção à medula óssea para iniciar a hematopoiese
neste local. Durante o sétimo mês de vida intra-uterina, a medula óssea torna-se
o local principal de hematopoiese e permanece durante a vida adulta. Ao
nascimento, a medula presente em todo o esqueleto é ativa na hematopoiese e
praticamente a fonte exclusiva de células sanguíneas. Até a época da puberdade,
a medula de todo o esqueleto permanece vermelha e hematopoieticamente ativa.
Aproximadamente aos 18 anos apenas as vértebras, costelas, crânio, pélvis, e
regiões próximas às epífises de úmero e fêmur conservam a medula vermelha, e
a medula restante se torna amarela, gordurosa e inativa.

Os elementos celulares formadores do sangue têm uma origem comum a


partir de células-tronco pluripotentes hematopoiéticas, situada no ápice de uma
hierarquia complexa de progenitores. As células-tronco pluripotentes dão origem a
dois tipos de progenitores multipotentes, as células-tronco mielóides comuns e
linfóides comuns. A célula-tronco linfóide comum pode originar precursores de
células T, células B e células natural killer. A partir da célula-tronco mielóide
comum surgem pelo menos três tipos de células-tronco comprometidas, capazes
de diferenciação ao longo dos caminhos eritróide/megacariocítico, eosinofílico, e
granulocítico/macrofágico. As células-tronco comprometidas são chamadas de
77

unidades formadoras de colônia (CFU), pois in vitro dão origem a colônias de


progênies diferenciadas.

Seguindo o processo de comprometimento de linhagens, o progenitor


hematopoiético e as células precursoras proliferam diante da influência reguladora
de fatores de crescimento e hormônios, como a eritropoietina (EPO).

A eritropoiese é o processo no qual os glóbulos vermelhos são originados.


Para que ela ocorra de maneira completa e eficiente, alguns pré-requisitos
básicos são necessários: uma medula óssea íntegra (tecido hematopoiético
quantitativa e qualitativamente normal), fatores estimulantes para a formação de
colônias eritróides (EPO, entre outros), além dos fatores nutrientes para a
proliferação, diferenciação e amadurecimento dos precursores de eritrócitos e
formação de todos os seus constituintes, principalmente a hemoglobina. Entre os
fatores nutricionais podem-se citar o ferro, o ácido fólico, a vitamina B12,
proteínas (aminoácidos) e a piridoxina como os principais.

A EPO é uma glicoproteína produzida principalmente no rim (células


intersticiais peritubulares localizadas na região cortical interna e medular externa
do rim). Sua produção é estimulada em duas situações: 1) elevadas altitudes e 2)
anemia, como veremos no capítulo de Anemia e índices Hematimétricos. A EPO é
necessária para manter o comprometimento das células progenitoras eritróides.
Na ausência deste hormônio, as células sofrem apoptose.
A eritropoiese inclui a seguinte seqüência: pró-eritroblasto, eritroblasto
basófilo, eritroblasto policromático, eritroblasto ortocromático, reticulócito e
eritrócito. A hemoglobina é formada ainda na fase de pró-eritroblasto,
completando sua formação apenas na fase de reticulócitos. À medida que este
processo se desenvolve, a célula vai perdendo a basofilia e adquirindo um caráter
ácido. A extrusão nuclear ocorre durante o processo de diferenciação do
78

eritroblasto ortocromático a reticulócito. Por fim, estes passam dois a três dias na
medula óssea, para só então irem para o sangue periférico, onde por mais um dia
completam a síntese da hemoglobina e se transformam em eritrócitos maduros.
Os eritrócitos maduros duram em torno de 120 dias na circulação, quando então,
sob a forma de esferócitos, são retirados da circulação por meio do sistema
reticuloendotelial.

5.3. ERITRÓCITOS MADUROS

É uma célula anucleada, constituída basicamente por uma membrana, um


conteúdo citoplasmático restrito à proteína hemoglobina, enzimas, íons e água.

Sua forma na circulação é de um disco bicôncavo (discócito), com diâmetro de 7,2


a 8,2 µM, a espessura mais externa (borda) de 2,3 a 2,8 µM e a espessura mais
interna (centro) de 0,5 a 0,11 µM. Perfaz um volume médio de aproximadamente
90 fentolitros (fL) (80 a 100 fL).

Uma população de eritrócitos de um indivíduo normal apresenta-se


aparentemente com a mesma forma (discóide/arredondada), tamanho uniforme (a
variação fisiológica de tamanho considerada normal entre os eritrócitos é de até
14,5%) e com a mesma coloração (mesma tonalidade de cor, que se deve a uma
saturação de aproximadamente 34% de hemoglobina por volume total, em cada
eritrócito).

5.3.1. Membrana Eritrocitária

É constituída essencialmente por uma camada bi lipídica à qual estão


inseridas proteínas transmembrana (banda 3 e glicoforinas), que tem como base
de sustentação um citoesqueleto constituído por uma malha de espectrinas (α e
β).
79

A membrana eritrocitária possui quantidade de lipídeos maior que a


necessária para envolver seu conteúdo total. Este “excesso” lipídico, juntamente
com as proteínas integrais do citoesqueleto e do complexo juncional, concede ao
eritrócito uma fluidez ótima, para que este possa alongar-se quando houver
necessidade de passagem por sinusóides capilares com diâmetros menores que
o seu, para depois retornar à forma discóide.

O complexo juncional é formado basicamente por proteína 4.1, monômeros


de actina, aducina, tropomiosina, proteína 4.9 e extremidades do tetrâmero de
espectrina.

A proteína 4.1 também se liga à glicoforina C, interage com a β-espectrina,


no domínio de ligação com a actina, e aumenta a afinidade desta ligação.

Os principais constituintes da membrana eritrocitária são:


• Proteínas (pouco mais de 50%) - I) Integrais: são transmembranar;
servem de canal de troca com o meio extracelular, de reforço para a
bicamada lipídica. São as proteínas banda 3 e as glicoforinas (A, B, C e
D). II) Periféricas: formam o citoesqueleto de sustentação à camada
lipídica; permitem o alongamento reversível e a capacidade
regenerativa da membrana. São espectrinas (α e β), a anquirina
(proteína 2.1), a proteína 4.1, a proteína 4.2, a actina, a aducina, etc.
• Lipídeos (cerca de 40%) – essencialmente fosfolipídeos e uma pequena
quantidade de colesterol.
• Carboidratos (menos de 10%).

Funções e Características das Principais Proteínas da Membrana


Eritrocitária

Banda 3: é um canal de passagem de ânions, para a comunicação intra-


extracelular. Mantém o pH intracelular. Sua deficiência causa perda de
lipídeos e formação de esferócitos (esferocitose hereditária).
Espectrina (α e β): são responsáveis pela sustentação à face externa da
membrana. A β-espectrina se entrelaça com a α, de modo a formar dímeros.
Estes se associam em tetrâmeros, essenciais para a integridade do
citoesqueleto. Também se associam ao complexo juncional por meio da
proteína 4.1. Sua ausência ou defeito de síntese nos locais de ligação entre as
unidades α e β (locais de auto-associação para formação de tetrâmeros) ou
em locais de ligação à proteína 4.1 do complexo juncional leva à formação de
eliptócitos (eliptocitose hereditária). Sua diminuição quantitativa ou um defeito
nos locais de ligação com a banda 3-anquirina (2.1) acarreta perda de lipídeos
de membrana e formação de esferócitos (esferocitose hereditária).
Anquirina (proteína 2.1): ponte de ligação da banda 3 com a β-espectrina,
ajustada pela proteína 4.2. Seu defeito pode causar formação de esferócitos.
Proteína 4.1: liga-se às espectrinas, permitindo maior articulação e
deformabilidade ao eritrócito. Seu defeito ou deficiência dificulta a ligação da
espectrina com o complexo juncional, favorecendo a formação de eliptócitos
(eliptocitose hereditária).
80

Esferocitose Hereditária (EH):


Este distúrbio herdado é causado por defeitos intrínsecos na membrana dos eritrócitos que tornam as células
esféricas, menos maleáveis e vulneráveis ao seqüestro e à destruição esplênicos. Um padrão de herança
autossômica dominante é visto em três quartos dos casos. Os pacientes restantes têm uma forma autossômica
recessiva grave da doença.
A EH é causada por diversas mutações afetando a anquirina, banda 3, espectrina, ou banda 4.2,
presumivelmente porque este complexo é importante na estabilidade da bicamada lipídica. A causa mais
comum de EH autossômica dominante é a mutação da anquirina do eritrócito.
O baço é o órgão mais atingido na EH. Eritrócitos devem sofrer extrema deformação para deixar os cordões
de Billroth e entrar nos sinusóides. Enquanto os esferócitos são aprisionados no baço, a circulação já lenta
dos cordões fica estagnada, produzindo microambiente progressivamente mais hostil. Ácido lático se
acumula e o pH cai, inibindo a glicólise. A incapacidade de gerar ATP prejudica a capacidade de os
eritrócitos expulsarem Na+, adicionando um elemento de lesão osmótica. A estagnação nos cordões também
promove contato com abundantes macrófagos, os quais fagocitam os esferócitos. O principal papel do baço
na morte prematura dos esferócitos é evidenciado pelo invariável efeito benéfico da esplenectomia. Os
esferócitos persistem, mas a anemia é corrigida.
Aumento moderado do baço é característico. Isto resulta da congestão dos cordões de Billroth e de

5.4. GRUPOS SANGÜÍNEOS

5.4.1. Introdução

O termo grupos sangüíneos refere-se a um sistema de antígenos presentes


na membrana das células vermelhas, que são a expressão de genes herdados.
Esses antígenos não são encontrados apenas nos eritrócitos, mas também em
uma variedade de tecidos e muitos líquidos biológicos, incluindo saliva, leite, suco
gástrico, líquido seminal, urina e líquido de cisto ovariano.
Há vários sistemas de grupos sangüíneos herdados independentemente
entre si, entre eles podemos citar os sistemas ABO, Rh, MNS, Kell, Lewis e
outros. Os sistemas ABO e Rh, descobertos em 1900 e 1940, respectivamente,
por Landsteiner, são os de maior importância na prática por serem os mais
antigênicos.

5.4.2. O sistema ABO

Os genes ABO não codificam diretamente seus antígenos específicos, mas


sim enzimas que tem a função de transportar açúcares específicos para uma
substância precursora e, a partir daí, produzir os antígenos A e/ou B.

O antígeno A é formado pela ação da enzima N-acetil galactosaminil


transferase sobre a molécula precursora, e o antígeno B pela ação da enzima
galactosil transferase. Se apenas a enzima N-acetil galactosaminil transferase
estiver ativa, haverá formação apenas do antígeno A e a pessoa pertencerá ao
grupo A. Por outro lado, se apenas a enzima galactosil transferase estiver ativa,
haverá formação apenas do antígeno B e a pessoa pertencerá ao grupo B. Caso
ambas as enzimas sejam ativas, haverá formação de antígenos A e B e a pessoa
pertencerá ao grupo AB. Por outro lado, se nenhuma das duas enzimas estiverem
presentes, não haverá formação de antígenos A nem B e a pessoa pertencerá ao
grupo O (ver figura abaixo) .
81

Os antígenos A e B ficam expostos na membrana das hemácias, e no caso


do grupo AB cada hemácia possui a mesma proporção de antígenos A e B
expostos na sua membrana.

Como os indivíduos não possuem anticorpos contra os próprios antígenos,


só produzem anticorpos contra antígenos estranhos. Desta forma o indivíduo do
grupo A possui anticorpo (aglutinina) anti-B em seu plasma; o do grupo B possui
anticorpo (aglutinina) anti-A no plasma; o do grupo AB não possui anticorpos anti-
A nem anti-B em seu plasma e o do grupo O possui tanto anticorpo anti-A quanto
anti-B em seu plasma.

Todos esses anticorpos produzidos no sistema ABO são de resposta inata, ou


seja, são produzidos sempre, sem a necessidade de exposição prévia a um
determinado antígeno. São da classe IgM, cuja estrutura é pentamérica. As suas
5 cadeias são ligadas entre si por pontes dissulfeto e por uma cadeia polipeptídica
inferior chamada de cadeia J. A IgM é encontrada principalmente no sangue,
sendo uma classe de anticorpos "precoces" ( também são produzidas nas fases
agudas iniciais das doenças que desencadeiam resposta humoral). É uma
proteína que não atravessa a placenta por ser grande (pentamérica).

J-chain
82

5.4.3. O antígeno H

O antígeno H é formado pela ação da enzima fucosil transferase


(codificada pelo gene H) que catalisa a adição da fucose na galactose terminal da
molécula precursora (polímero de carboidratos com uma seqüência específica,
ver figura abaixo). Isso é necessário para a adição dos carboidratos que vão
formar os antígenos A e B, portanto o antígeno H é precursor dos antígenos A e
B. Já o grupo O, que não apresenta antígenos A e B, apresenta o antígeno (H) na
membrana das suas hemácias. O gene alelo h (recessivo) codifica uma fucosil
transferase não funcionante, portanto os indivíduos hh não são capazes de
sintetizar o antígeno H, caracterizando o grupo O Bombaim. Nesse caso, mesmo
que as enzimas N-acetilgalactosaminil transferase e galactosil transferase
estejam presentes e ativas, estas não são capazes de adicionar os carboidratos
específicos na molécula precursora. Portanto, esses indivíduos não possuem
nenhum antígeno (A, B ou H) na membrana das suas hemácias. As pessoas do
grupo O Bombaim, além de possuir anticorpos anti-A e anti-B, apresentam
também anticorpos anti-H (classe IgM), por isso, durante uma transfusão
sangüínea para esse grupo, o doador deve ser obrigatoriamente O Bombaim.

5.4.4. O sistema Rh

Existem seis tipos comuns de antígenos Rh, esses tipos são designados
por C, D, E, c, d, e e. A pessoa que possui antígeno D não apresentará antígeno
d, e vice-versa. O mesmo ocorrerá com os antígenos C-c e E-e. Além disso,
devido ao modo de herança desses fatores, cada pessoa terá um antígeno de
cada um dos três pares.

O antígeno tipo D é muito prevalente na população, sendo também,


consideravelmente, mais antigênico do que os outros antígenos Rh, por
conseguinte, é o de maior interesse e é chamado de fator Rh.
83

O fator Rh é determinado por um loco em que se situam dois gens


alternativos (D e d), sendo D dominante em relação a d. Portanto, os indivíduos
Rh positivos são representados por homozigotos dominantes ou heterozigotos, e
apresentam o antígeno D, que é uma proteína integral da membrana das
hemácias. Já os indivíduos Rh negativos são representados por homozigotos
recessivos e não apresentam o antígeno D na membrana das suas hemácias.

As pessoas que pertencem ao grupo Rh negativo começam a produzir


anticorpos anti-D somente após a exposição a esse antígeno (D). Nesse caso, os
anticorpos são da clase IgG, uma imunoglobulina monomérica simples que perfaz
80% das imunoglobulinas do organismo. Está igualmente distribuída nos
compartimentos extracelulares, é a única que, normalmente, atravessa a placenta
e é o principal anticorpo nas respostas imunes secundárias.

5.4.5. O sistema MN

O grupo sangüíneo MN é determinado pelas isoformas da glicoforina. A


glicoforina A contém o antígeno M e a glicoforina B o antígeno N. Essas duas
glicoforinas diferem apenas nas suas seqüências NH2-terminal. Os indivíduos do
grupo M possuem apenas glicoforina A, enquanto os do grupo N possuem apenas
glicoforina B, já os heterozigotos MN possuem ambas as glicoforinas.

5.4.6. O Sistema LEWIS

Os antígenos Lewis, Le_a e Le_b, são de natureza glicídica à semelhança


dos antígenos A, B e H, no entanto, não são sintetizados na membrana
eritrocítária em desenvolvimento, mas são adsorvidos do plasma nas células
adultas. São antígenos solúveis, glicoesfingolipídios que permanecem adsorvidos
na superfície dos eritrócitos.
84

5.4.7. Doença Hemolítica do Recém Nascido (Eritroblastose Fetal)

Também conhecida como eritroblastose fetal, é caracterizada por


aglutinação progressiva dos eritrócitos do feto por anticorpos presentes no
sangue materno. Para que isso ocorra é necessário que a mãe pertença ao grupo
Rh– e a criança ao Rh+.

O determinante antigênico do sistema Rh é protéico e os seus anticorpos


são do tipo IgG, que são produzidos apenas a partir do momento em que o
organismo entra em contato com o antígeno. Durante a gravidez não há contato
entre os sangues materno e fetal, no entanto, durante o parto esse contato pode
ocorrer em pequena quantidade. No primeiro parto, portanto, não há
complicações, pois o contato entre os sangues materno e fetal é mínimo, sendo
capaz apenas de sensibilizar a mãe que passa a produzir anticorpos anti-Rh. Em
uma segunda gestação de filho Rh+, como a mãe já foi sensibilizada
anteriormente, os anticorpos maternos anti-Rh passarão pela placenta, pois são
do tipo IgG, de pequeno tamanho, e irão provocar a aglutinação dos eritrócitos
fetais, levando à destruição dos mesmos, e eventualmente à morte do feto. Isso
também pode ocorrer na primeira gestação de uma mãe Rh–, grávida de um filho
Rh+, mas que já tenha sido sensibilizada anteriormente através de uma transfusão
sangüínea, por exemplo.

A prevenção da doença hemolítica do recém nascido se dá através da


administração de soro anti-Rh (Rhogan) na mãe no momento do parto. Com isso,
as hemácias do feto que caem na circulação da mãe serão destruídas pelos
anticorpos do soro antes que a mãe seja sensibilizada.

5.4.8. Doação de Sangue (Hemácias, Plasma e Sangue Total)

Para a doação de sangue ser realizada, deve-se verificar a compatibilidade


entre as aglutininas (plasma / anticorpos) e os aglutinogênios (hemácias /
antígenos) dos doadores com os receptores. Para isso, são realizados
procedimentos que visam determinar a classificação pelo sistema ABO e pelo Rh.

Técnica de classificação direta em lâminas: inicialmente, marcam-se


lâminas de microscópio com anti-A, anti-B e anti-AB para poderem ser
diferenciadas posteriormente. Em cada lâmina, coloca-se uma gota do soro com o
anticorpo correspondente (anti-A, anti-B e anti-AB). Para cada gota de anti-soro
coloca-se uma pequena quantidade de sangue total. Após misturar o sangue total
85

com o anti-soro em cada lâmina, deve-se observar em qual delas ocorreu


aglutinação. Se aglutinar na lâmina com soro anti-A, o sangue testado pertence
ao grupo A, se aglutinar com soro anti-B pertence ao grupo B, se aglutinar com o
soro anti-AB pertence ao grupo AB e se não aglutinar em nenhuma lâmina
pertence ao grupo O. Para determinar o sistema Rh deve-se proceder da mesma
maneira: marca-se uma lâmina com anti-Rh, e depois se coloca uma gota de soro
anti-Rh nessa lâmina. Uma pequena quantidade de sangue total é adicionada.
Após misturar, se houver aglutinação o sangue testado é Rh positivo, e se não
aglutinar é Rh negativo.

Desta forma, as possibilidades de transfusão em relação ao sistema ABO


são:
86

Já em relação ao sistema Rh, as possibilidades de transfusão são:

Obs.: A transfusão de hemácias do doador Rh positivo para o receptor Rh


negativo, não terá problemas na primeira vez, pois após a doação o receptor será
apenas sensibilizado e produzirá anticorpos anti-Rh tardiamente depois que
hemácias forem substituídas. Em transfusões posteriores os anti-Rh, provocarão
uma reação contrária ao fator Rh estranho, com resultados clínicos bastante
sérios.

Obs.: A transfusão de Plasma do doador Rh negativo para o receptor Rh positivo,


não terá problemas se o doador não apresentar anti-Rh, caso contrário os
anticorpos do doador provocarão uma reação contrária ao fator Rh, com
resultados clínicos bastante sérios.

Autor(es):
Heitor Affonso de Paula Neto
87

UNIDADE 6
88

6. METABOLISMO DE HEMÁCIAS

6.1. ERITROPOIESE

Como as demais populações de células do sangue, as hemácias são


produzidas na medula óssea a partir da proliferação e diferenciação de células
progenitoras em resposta a fatores de crescimento e estímulos hematopoiéticos.
No caso particular das hemácias, a eritropoietina (EPO) é o principal fator
hematopoiético envolvido nesta diferenciação. A EPO é produzida nos rins em
resposta a um estado de baixo aporte de oxigênio e, através da circulação
sanguínea, alcança a medula óssea e estimula os progenitores da linhagem
mielocítica a diferenciarem em eritrócitos. Esta diferenciação ocorre de maneira
relativamente rápida, totalizando cerca de quatro divisões celulares em um
período de aproximadamente 72 horas (figura 30). Neste tempo, as células em
diferenciação, além de se expandirem em número, devem sintetizar todo o
conteúdo protéico da hemácia madura necessário para o adequado
funcionamento desta célula. Este período se caracteriza, portanto como um
período de intensa síntese metabólica, com intensa síntese de ácidos nucléicos
(para a replicação do DNA e a síntese de RNA), lipídeos (para membrana celular)
e proteínas (para o citoesqueleto e hemoglobina). Além disso, a geração de
hemácias normais e funcionais é, em grande parte, dependente de um aporte
adequado de nutrientes, entre eles o Ferro e cofatores envolvidos na síntese da
hemoglobina. Distúrbios no metabolismo destas substâncias ou deficiências
nutricionais levam, portanto a alterações na maturação das hemácias e um
quadro clínico de anemia.

Em seus estágios finais de maturação, os precursores eritróides perdem


todas as organelas celulares (mitocôndrias, complexo de Golgi, retículo
endoplasmático) e o núcleo. Este processo torna o eritrócito limitado em termos
metabólicos e implica na necessidade de se sintetizar tudo o que for necessário
para o correto funcionamento celular antes do final da diferenciação, uma vez que
esta célula se torna incapaz de sintetizar proteínas após sua completa maturação.

Figura 30. Esquema da Diferenciação de um


Progenitor Hematopoiético (Stem Cell) para
a Formação de um Eritrócito Maduro.
89

Portanto, o eritrócito é uma célula relativamente ativa em termos


metabólicos durante sua diferenciação na medula óssea e que se torna limitado
metabolicamente após sua maturação por perder suas organelas e núcleo.

6.2. HEMOCATERESE

A vida útil de um eritrócito é de aproximadamente 120 dias. Após este


período, a célula é retirada da circulação pelo sistema fagocítico mononuclear do
baço, num processo denominado hemocaterese. Este processo também é
responsável pela retirada de eritrócitos não funcionais ou anormais da circulação.

A hemocaterese é seguida da degradação dos componentes celulares e


reaproveitamento de grande parte destes compostos. Lipídeos e proteínas são
degradados e reaproveitados para a síntese de novos lipídeos e proteínas. O
ferro da hemoglobina também é recuperado e reaproveitado para a síntese de
novas ferro-proteinas como a própria hemoglobina. O heme sem o ferro
(protoporfirina IX) é degradado por um sistema enzimático para formar bilirrubina,
um precursor dos pigmentos biliares.

6.3. PARTICULARIDADES DO METABOLISMO DE HEMÁCIAS

Como dito anteriormente, as hemácias são células limitadas em sua


capacidade metabólica. A ausência de núcleo torna desnecessária a síntese de
ácidos nucléicos e a ausência de organelas celulares indica que esta célula é
incapaz de sintetizar proteínas, tornando desnecessária também a síntese de
RNA e aminoácidos.

A ausência de mitocôndrias impossibilita o ciclo de Krebs, a fosforilação


oxidativa e, portanto a metabolização de lipídeos e a completa metabolização da
glicose. Desta forma, o eritrócito se torna ineficiente em termos de geração de
energia quando comparado a outras células. A metabolização completa da glicose
por células aeróbias, por exemplo, gera 32 moléculas de ATP. Na impossibilidade
de se realizar o ciclo de Krebs e a fosforilação oxidativa, como no caso da
hemácia, a metabolização da glicose gera apenas 2 moléculas de ATP. No
entanto, esta ineficiência na geração de ATP é não só suficiente, como é
necessária, para o desempenho adequado de suas funções. Isto porque a
eficiência metabólica de células aeróbicas, o ciclo de Krebs e a fosforilação
oxidativa, dependem do consumo de oxigênio e a hemácia, como uma célula cuja
função primária é transportar oxigênio, não poderia consumir o composto que
transporta. Neste sentido, uma célula de metabolismo anaeróbio se torna ideal
para o transporte de oxigênio a despeito de sua relativa ineficiência de geração de
energia.

Como a geração de energia em eritrócitos reside exclusivamente no


metabolismo anaeróbio da glicose, esta célula deve possuir um mecanismo que
garanta o aporte constante de glicose para o interior celular. De fato, o eritrócito é
uma das poucas células que consomem exclusivamente glicose e, por isso, são
90

dotadas de um sistema de transporte facilitado de glicose que independe de


insulina, o que garante a constante entrada de glicose na célula.

6.4. VIAS METABÓLICAS UTILIZADAS PELOS ERITRÓCITOS

Como dito anteriormente, o metabolismo das hemácias reside


exclusivamente na glicólise anaeróbica. No entanto, o eritrócito, dependendo de
suas necessidades, utiliza ainda dois desvios da via glicolítica: a via das pentoses
e o desvio de Rapoport-Luebering. A via das pentoses supre a célula do
composto redutor NADPH, enquanto que o desvio de Rapoport-Luebering gera o
2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) que modula a afinidade da hemoglobina pelo
oxigênio.

A glicólise responde por cerca de 90% de todo o metabolismo da glicose no


eritrócito e os outros 10% são desviados para a via das pentoses. No entanto, em
caso de necessidade de geração de NADPH, pode-se desviar quase que 10
vezes mais glicose para a via das pentoses. Isto é um exemplo de como opera o
metabolismo em eritrócitos: o metabolismo da glicose pode ser desviado de sua
via principal (glicólise anaeróbica) para outras vias dependendo da necessidade
da célula.

6.5. FUNÇÕES E MECANISMOS CELULARES DEPENDENTES DO


METABOLISMO

A função primária do eritrócito é o transporte de oxigênio pelo corpo. Para


desempenhar adequadamente esta função, a célula deve manter um eficiente
mecanismo antioxidante e manter a osmolaridade celular, com níveis
intracelulares altos de potássio e baixos de sódio, cálcio e magnésio.

Estas necessidades são supridas por compostos formados durante a


metabolização da glicose pela hemácia através de uma das vias descritas
anteriormente. A manutenção da osmolaridade celular, por exemplo, é mantida
pela atividade de bombas de íons que utilizam o ATP como combustível para
transportar íons através da membrana celular contra o gradiente osmótico. O ATP
utilizado por estas bombas é proveniente da glicólise anaeróbia que, embora
menos eficiente na geração de ATP que a glicólise aeróbia, é perfeitamente capaz
de suprir as necessidades celulares de energia. Os mecanismos antioxidantes,
por sua vez, utilizam compostos redutores formados pela própria glicólise ou na
via das pentoses. A contribuição individual das vias metabólicas para os
processos celulares serão apresentados a seguir.
91

6.6. CONTRIBUIÇÃO DA GLICÓLISE PARA A FUNÇÃO DAS HEMÁCIAS

6.6.1. Glicólise como Fonte de ATP

Uma das funções da glicólise nas hemácias é suprir a demanda de ATP


para as bombas de íons. A osmolaridade da hemácia é mantida em níveis bem
controlados e a distribuição de íons no interior da célula segue um padrão
particular com níveis intracelulares altos de potássio e baixos de sódio, cálcio e
magnésio. Esta distribuição é mantida contra o gradiente osmótico e, por isso,
depende da atividade de bombas de íons que fazem o transporte ativo de íons
potássio para dentro e dos demais íons para fora da célula. A atividade destas
bombas depende da quebra de moléculas de ATP geradas durante a glicólise.

Nas primeiras etapas da glicólise ocorre o consumo de duas moléculas de


ATP. A primeira reação, catalizada pela hexoquinase, fosforila a glicose no
carbono 6, gerando glicose-6-fosfato e impedindo que a glicose se difunda
novamente para fora da célula. A outra reação que consome ATP é a fosforilação
da frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bisfosfato, catalizada pela fosfofrutoquinase.

O consumo de duas moléculas de ATP nas etapas iniciais da glicólise é


compensado pela geração de quatro moléculas de ATP nas reações
subseqüentes. A conversão de 1,3-difosfoglicerato em 3-fosfoglicerato, com a
geração de 1 ATP, e a conversão de fosfoenolpiruvato em piruvato, com a
geração de outro ATP. Como estas duas reações ocorrem duas vezes para cada
molécula de glicose consumida, o saldo de geração de ATP por estas reações é
de 4 moléculas, e o saldo final da glicólise é de 2 ATPs por cada molécula de
glicose consumida (figura 31).

O destino das moléculas de ATP formadas pela metabolização da glicose é


basicamente prover energia para o bombeamento ativo de íons para dentro e
para fora da célula, de modo a manter a distribuição iônica e a osmolaridade
celular.
92

GLICOSE

HEXOQUINASE -ATP

GLICOSE-6-FOSFATO

FRUTOSE-6-FOSFATO

FOSFOFRUTOQUINASE -ATP

FRUTOSE-1,6-DIFOSFATO

DI-HIDROXIACETONAFOSFATO

GLICERALDEIDO-3-FOSFATO GLICERALDEIDO-3-FOSFATO

G3P DESIDROGENASE

1,3-DIFOSFOGLICERATO 1,3-DIFOSFOGLICERATO
+ATP +ATP

3-FOSFOGLICERATO 3-FOSFOGLICERATO

2-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO

FOSFOENOLPIRUVATO FOSFOENOLPIRUVATO
+ATP +ATP
PIRUVATO QUINASE
PIRUVATO PIRUVATO
LACTATO DESIDROGENASE
LACTATO LACTATO

Figura 31. Esquema da Via Glicolítica com Destaque para as Reações de Consumo e
Formação de ATP.

6.6.2. Glicólise como Fonte de NADH

Um outro importante composto formado durante a metabolização da


glicose é o agente redutor adenina dinucleotídeo reduzido ou NADH. O NADH é
formado durante a conversão de gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-difosfoglicerato,
reação catalizada pela enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Este NADH
formado é, em grande parte, utilizado em uma reação subseqüente da glicólise, a
conversão de piruvato em lactato. No entanto, a utilização de NADH pode ser
desviada para reações de redução que visam manter a função celular em
ambientes altamente oxidativos.
93

GLICOSE

-ATP

GLICOSE-6-FOSFATO

FRUTOSE-6-FOSFATO

-ATP

FRUTOSE-1,6-DIFOSFATO

DI-HIDROXIACETONAFOSFATO

GLICERALDEIDO-3-FOSFATO GLICERALDEIDO-3-FOSFATO
NAD+ NAD+
NADH GAPDH NADH
1,3-DIFOSFOGLICERATO 1,3-DIFOSFOGLICERATO
+ATP +ATP

3-FOSFOGLICERATO 3-FOSFOGLICERATO

2-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO

FOSFOENOLPIRUVATO FOSFOENOLPIRUVATO

+ATP +ATP

PIRUVATO PIRUVATO
NADH NADH
NAD+ LDH NAD+

LACTATO LACTATO

Figura 32. Esquema da Via Glicolítica com Destaque para as Reações onde é Gerado ou
Consumido o NADH.

A hemácia, por ser o transportador de um composto altamente reativo


como o oxigênio, é constantemente submetida a ambientes altamente oxidantes.
Sem um controle adequado, o oxigênio forma radicais livres que podem reagir
com proteínas celulares ou lipídeos da membrana, interferindo com suas funções.
Desta forma, a hemácia deve manter um ambiente intracelular redutor capaz de
impedir as ações oxidativas do oxigênio.

Um outro importante efeito do oxigênio e radicais livres derivados é a


oxidação do ferro da hemoglobina. O ferro que compõe a hemoglobina encontra-
se no estado ferroso (Fe2+) e o oxigênio é capaz de oxidá-lo, formando Fe3+ que
não é capaz de transportar oxigênio. Esta reação de oxidação da hemoglobina,
formando metemoglobina não funcional, ocorre espontâneamente e cerca de 3%
de todo o conteúdo de hemoglobina é convertido em metemoglobina diariamente.
94

Para reduzir a metemoglobina e retorná-la ao seu estado funcional, a


hemácia conta com uma enzima chamada metemoglobina redutase que utiliza o
NADH formado pela glicólise para reduzir o Fe3+ da metemoglobina para Fe2+.
Neste momento, o consumo de NADH é desviado da reação de formação de
lactato a partir de piruvato, para suprir a enzima e permitir a redução do ferro de
volta ao seu estado funcional.

6.7. CONTRIBUIÇÃO DA VIA DAS PENTOSES PARA A FUNÇÃO DAS


HEMÁCIAS

A via das pentoses é uma via metabólica derivada da glicólise que, em


outras células, inicia a síntese de bases nitrogenadas para a formação de ácidos
nucleicos. Nestas células, a via das pentoses é considerada uma via metabólica
própria porque utiliza um metabólito (glicose) para a formação de um componente
celular (ribose). Hemácias, no entanto, não sintetizam bases nitrogenadas e a
ribose formada é reconvertida em intermediários da glicólise, como o
gliceraldeído-3-fosfato e a frutose-6-fosfato. Desta forma, nas hemácias, a via das
pentoses pode ser considerada um desvio da glicólise ao invés de uma via
metabólica.

A vantagem de se desviar o metabolismo da glicose para uma série


alternativa de reações é que, através destas reações, é formado o composto
redutor NADPH. Este composto, assim como o NADH discutido anteriormente,
será utilizado em reações de oxirredução que visam a manutenção de um
ambiente redutor no interior da célula capaz de lidar com os efeitos oxidantes do
oxigênio.

6.8. CONTRIBUIÇÃO DO DESVIO DE RAPOPORT-LUEBERING PARA A


FUNÇÃO DAS HEMÁCIAS

Pelo desvio de Rapoport-Luebering, a hemácia transforma o intermediário


1,3-difosfoglicerato (1,3-DPG) em 2,3-DPG. Esta reação é catalizada pela
difosfoglicerato mutase, que transfere o fosfato do carbono 1 para o carbono 2 do
1,3-DPG. O produto formado, 2,3-DPG, pode ser convertido em 3-fosfoglicerato (o
intermediário seguinte ao 1,3-DPG na via glicolítica) pela difosfoglicerato
fosfatase, retornando para a via glicolítica. No entanto, a transferência do fosfato
para a posição 2 torna este fosfato pouco energético e a defosforilação deste
intermediário (ao contrário da defosforilação do 1,3-DPG) acaba não formando
ATP.

Desta forma, a hemácia possui um desvio da via glicolítica que não forma
ATP para formar 2,3-DPG. Este desvio, despendioso em termos energéticos para
a célula, é importante pois permite que a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio
seja modulada através da concentração de 2,3-DPG na célula.
95

GLICOSE
-ATP NADP+ NADPH

GLICOSE-6-FOSFATO 6-FOSFOGLUCONA-δ-LACTONA 6-FOSFOGLUCONATO


G6PDH
NADP+ NADPH
FRUTOSE-6-FOSFATO

-ATP

FRUTOSE-1,6-DIFOSFATO RIBOSE-5-FOSFATO RIBULOSE-5-FOSFATO

DI-HIDROXIACETONAFOSFATO

GLICERALDEIDO-3-FOSFATO GLICERALDEIDO-3-FOSFATO

1,3-DIFOSFOGLICERATO 1,3-DIFOSFOGLICERATO
+ATP +ATP

3-FOSFOGLICERATO 3-FOSFOGLICERATO

2-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO

FOSFOENOLPIRUVATO FOSFOENOLPIRUVATO
+ATP +ATP

PIRUVATO PIRUVATO

Figura 33. Esquema da Via das Pentoses com Destaque para as Reaçòes de Formação de
NADPH.

A formação de 2,3-DPG é regulada pela concentração de prótons (H+) no


meio, sendo que em meio ácido, a atividade da fosfatase é estimulada enquanto
que a atividade da mutase é inibida. Desta forma, em meios ácidos (isto é,
durante acidose), a formação de 2,3-DPG diminui e seu consumo aumenta,
diminuindo a concentração final deste intermediário na célula. Da mesma forma, a
alcalose aumenta a concentração de 2,3-DPG por estimular a mutase e inibir a
fosfatase.

A ligação do 2,3-DPG à hemoglobina, torna a afinidade desta proteina ao


oxigênio menor. Com base nisso e com base na modulação da produção de 2,3-
DPG pela concentração de H+, podemos afirmar que a concentração de 2,3-DPG
aumenta durante a alcalose e que, portanto, a afinidade da hemoglobina pelo
oxigênio é menor na alcalose.

A importância deste efeito é que a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio


pode ser modulada rapidamente durante a adaptação do organismo baixas
pressões de oxigênio, como nas grandes altitudes. Em baixas pressões de
oxigênio, o organismo aumenta a fequência respiratória, aumentando a
eliminação de gás carbônico e consumindo H+, causando um quadro de alcalose
respiratória. Esta alcalose então leva a um aumento da produção de 2,3-DPG que
diminui a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio.

Isto que parece incongruente (diminuição da afinidade da hemoglobina em


baixas pressões de oxigênio) pode ser explicado ao se analisar a curva de
saturação da hemoglobina na presença de concentrações normais de 2,3-DPG
(5mM) e a concentração encontrada em hemácias ob baixa pressão de oxigênio
96

(8mM). De fato, a saturação da hemoglobina torna-se menor na presença de 8mM


de 2,3-DPG, consequencia da menor afinidade da proteína pelo oxigênio. No
entanto, esta menor saturação é compensada por uma maior liberação de
oxigênio para os tecidos periféricos, o que torna o aporte tecidual de oxigênio
normal mesmo em um ambiente onde a pressão atmosférica de oxigênio é menor.

GLICERALDEIDO-3-FOSFATO

P O OH
C – C – C - OPO3
O
1,3-DIFOSFOGLICERATO
mutase H+
P
O O
+ATP
C – C – C - OPO3
O
2,3-DIFOSFOGLICERATO
-Pi (2,3DPG)
-
O fosfatase H+
C – C – C - OPO3
O OH
3-FOSFOGLICERATO

2-FOSFOGLICERATO

FOSFOENOLPIRUVATO

+ATP

PIRUVATO

Figura 34. Esquema das Reações do Desvio de Rapoport-Luebering.

sat O2

2,3-DPG 0mM
2,3-DPG 5mM
2,3-DPG 8mM

pO2 tec pO2 pul pO2 pul


(alt) (mar)

Figura 35. Curva de Saturação da Hemoglobina em Função da Pressão de Oxigênio na


Presença de Diferentes Concentrações de 2,3-DPG.
97

6.9. MECANISMOS OXIDATIVOS DO OXIGÊNIO

O oxigênio é um composto extremamente reativo. Devido a suas


propriedades químicas, o oxigênio forma radicais livres capazes de reagir com
componentes celulares (proteinas e lipídeos, por exemplo), interferindo com suas
propriedades biológicas. Dentre os radicais livres formados pelo oxigênio,
podemos destacar dois importantes para a hemácia: o peróxido (O22-) e o
superóxido (O2-).

Estes radicais são capazes de reagir com componentes celulares e


interferir com suas funções. A reação de radicais livres de oxigênio com lipídeos,
por exemplo, causa a peroxidação lipídica, que interfere com as propriedades dos
lipídeos e a estabilidade da membrana celular, tornando a hemácia mais frágil a
estresses mecânicos.

O oxigênio também é capaz de oxidar proteínas, principalmente em


radicais de aminoácidos reativos, como os radicais de cisteína. A cisteína, por
possuir um átomo de enxofre em sua cadeia lateral, torna-se relativamente reativo
e susceptível ao ataque pelo oxigênio. A oxidação de cisteínas induz a formação
de pontes dissulfeto entre cisteínas dentro da própria proteina ou cisteínas de
duas proteínas diferentes. Além disso, a cisteína oxidada pode reagir com outros
resíduos de enxofre presentes em componentes celulares não proteicos
(grupamentos tiol). A oxidação de cisteínas pode acarretar perdas significativas
de função biológica, principalmente em enzimas cujo sítio ativo possui um resíduo
de cisteína, como a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.

Por fim, o oxigênio pode oxidar o ferro do grupamento heme da


hemoglobina, formando metemoglobina. O transporte de oxigênio pela
hemoglobina depende da presença de um íon ferro no estado ferroso (Fe2+). A
oxidação deste ferro pelo oxigênio, leva à conversão do ferro para seu estado
férrico (Fe3+), formando a hemoglobina oxidada ou metemoglobina, incapaz de
transportar oxigênio.

Vê-se, portanto, que o transporte de oxigênio, embora essencial para a


homeostase e o metabolismo celular, implica em grande risco para a célula que o
transporta por impor um ambiente intracelular extremamente oxidante. Desta
forma, a hemácia, como célula transportadora de oxigênio, deve dispor de
mecanismos moleculares que funcionem para manter um ambiente intracelular
redutor que contrabalanceiem os efeitos oxidativos do oxigênio.

6.10. MECANISMOS ANTI-OXIDANTES DAS HEMÁCIAS

A hemácia possui alguns sistemas enzimáticos capazes de detoxificar


radicais livres de oxigênio e prevenir o ataque oxidativo de seus componentes
celulares. O sistema da glutationa funciona para detoxificar radicais peróxido,
disponibilizando um radical de cisteína para ser oxidado no lugar das cisteinas de
proteínas celulares. O sistema superóxido dismutase/catalase funciona para
detoxificar o radical superóxido formado durante a oxidação expontânea da
98

hemoglobina em metemoglobina. A enzima metemoglobina redutase, por fim,


reduz a metemoglobina de volta a seu estado funcional de hemoglobina com Fe2+.

6.10.1. Síntese de Glutationa

A glutationa (GSH) é sintetizada em duas etapas pela ação de duas


enzimas. Na primeira etapa, a enzima -glutamil-cisteína sintetase gera um
dipeptídeo glutamil-cisteína, a partir de um ácido glutâmico e uma cisteína. Na
segunda etapa, catalizada pela glutationa sintetase, é adicionada uma glicina a
este composto, gerando a glutationa. É importante perceber que a glutationa nada
mais é que um tripeptídeo que possui uma cisteína (ácido glutâmico-cisteína-
glicina). Esta cisteína é disponibilizada pela célula para ser oxidada, prevenindo a
oxidação de cisteínas de proteínas celulares.

ácido glutâmico cisteína

γ-glutamil-cisteína
sintetase

γ-glutamil-cisteína

glicina

glutationa
sintetase

glutationa
(GSH)

glu-cys-gli

Figura 36. Esquema da Via de Síntese da Glutationa.

6.10.2. Glutationa Peroxidase

A glutationa peroxidase é uma enzima que cataliza a reação de oxidação


da glutationa por radicais peróxido livres. Por ser uma reação catalizada
enzimaticamente, esta reação ocorre preferencialmente em relação à oxidação de
grupamentos tiol de proteínas ou outros componentes celulares. Além de prevenir
o ataque de proteínas e lipídeos por estes radicais de oxigênio, a glutationa
peroxidase atua na detoxificação de peróxidos, ajudando a manter um ambiente
redutor intracelular.
99

6.10.3. Glutationa S-transferase

Mesmo na presença de glutationa peroxidase, alguns radicais de oxigênio


conseguem atacar proteínas ou outros componentes celulares. A glutationa S-
transferase é uma enzima que atua sobre componentes oxidados, transferindo
elétrons para eles enquanto oxida a glutationa. Em outras palavras, esta enzima
transfere a oxidação do componente celular para a glutationa, gerando glutationa
oxidada (GSSG) e voltando o componente celular para seu estado natural.

6.10.4. Glutationa Redutase

As glutationas oxidadas formadas nas reações da glutationa peroxidase e


da S-transferase devem ser retornadas a seu estado reduzido para recompor os
níveis intracelulares de glutationa reduzida e manter o potencial redutor da célula.
Esta recomposição da glutationa reduzida é feita pela glutationa redutase, uma
enzima que reduz a glutationa oxidada ao oxidar o NADPH formado na via das
pentoses.

NADPH GSSG H2O

Se
glutationa glutationa
redutase peroxidase

NADP+ GSH H2O2

NADPH GSSG HS-


H2O2
glutationa Glutationa
redutase S-transferase

H 2O
NADP+ GSH R SS-

Figura 37. Esquema da Utilização de Glutationa pelos Sistemas Anti-Oxidantes da


Glutationa Peroxidase e Glutationa S-transferase, e a Reposição de Glutationa Reduzida
pela Glutationa Redutase com Utilização de NADPH.
100

6.10.5. Superóxido Dismutase

A superóxido dismutase (SOD) é uma enzima que transforma radicais


superóxido em radicais peróxido. A oxidação da hemoglobina em metemoglobina
gera radicais superóxido que são convertidos em radicais peróxido por ação da
SOD. Estes radicais peróxido devem então ser detoxificados por ação do sistema
glutationa peroxidase/glutationa redutase, ou pela enzima catalase.

6.10.6. Catalase

A catalase converte radicais peróxido livres em água e oxigênio. Da mesma


forma que o sistema glutationa peroxidase/glutationa redutase, a catalase
funciona de forma a detoxificar peróxidos intracelulares. No entanto, a ação desta
enzima é restrita a radicais livres (não reverte a oxidação de componentes
celulares como a gluationa S-transferase), não utiliza cofatores (como NADPH ou
NADH) e gera oxigênio e água.

(a) 2H+ + O2- SOD


H2O2
catalase
(b) 2 H2O2 2 H2O + O2

Figura 38. Reações Catalizadas pela (a) Superóxido Dismutase (SOD) e (b) Catalase.

6.10.7. Metemoglobina Redutase

A oxidação da hemoglobina forma superóxido, detoxificado pelo sitema


SOD-catalase ou SOD-GSH, e metemoglobina. A metemoglobina é afuncional,
uma vez que não é capaz de transportar oxigênio. Desta forma, a metemoglobina
deve ser rapidamente reduzida e reconvertida a seu estado funcional. Esta
redução da metemoglobina é catalizado pela enzima metemoglobina redutase,
que utiliza o cofator NADH, proveniente da glicólise, para reduzir o Fe3+ da
metemoglobina a Fe2+.

metemoglobina
(não funcional) Hb-Fe3+ Cytb5.RED NAD+

hemoglobina
(funcional) Hb-Fe2+ Cytb5.OXI NADH

Figura 39. Esquema da Redução de Metemoglobina pela Metemoglobina Redutase, com


Consumo de NADH. Cytb5 é a unidade funcional da enzima, um citocromo.
101

6.11. ANEMIAS HEMOLÍTICAS

O metabolismo das hemácias funciona para a manutenção da estrutura


celular da hemácia e para a manutenção de um ambiente intracelular redutor
capaz de contrapor os efeitos oxidativos do oxigênio. Algumas deficiências
genéticas em enzimas-chave do metabolismo celular ou de enzimas envolvidas
nos sistemas anti-oxidantes das hemácias, interferem com a funcionalidade da
célula, tornando-as mais frágeis e predispondo o indivíduo a episódios
hemolíticos.

6.11.1. Deficiência de Glicose-6-Fosfato Desidrogenase

A glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é a primeira enzima da via das


pentoses. A deficiência genética desta enzima é relativamente comum e está
associada a quadros anêmicos. A deficiência de G6PDH diminui o aproveitamento
da glicose para a via das pentoses, diminuindo portanto a formação de NADPH.
Como o NADPH é utilizado pela glutationa redutase para repor os níveis de
glutationa reduzida, a baixa formação de NADPH nestes casos acarreta uma
diminuição na reposição de glutationa reduzida, interferindo com este importante
sistema redutor e tornando a célula mais sensível a estresses oxidativos.

6.11.2. Deficiência de Piruvato Quinase

A piruvato quinase cataliza a reação que forma piruvato a partir do


fosfoenolpiruvato com geração de uma molécula de ATP. Na deficiência desta
enzima, ocorre um acúmulo de fosfoenolpiruvato e uma menor formação de ATP,
pois esta etapa da via encontra-se suprimida. O fosfoenolpiruvato acumulado é
reconvertido em 2-fosfoglicerato, 3-fosfoglicerato, 2,3-difosfoglicerato, 1,3-
difosfoglicerato, gliceraldeido-3-fosfato, até frutose-1,6-bisfosfato, pois todas estas
reações são reversíveis. Além do acúmulo de intermediários metabólicos, a
reversão destas reações acarreta uma não produção de ATP (das reações 1,3-
difosfoglicerato a 3-fosfoglicerato e fosfoenolpiruvato a piruvato) e NADH (da
reação gliceraldeído-3-fosfato a 1,3-difosfoglicerato). A deficiência de piruvato
quinase resulta, portanto, em uma diminuição da produção de ATP e de NADH. O
comprometimento da produção de ATP leva a uma deficiência funcional das
bombas de íons e consequentemente um comprometimento na manutenção do
equilíbrio osmótico da célula. A menor formação de NADH, por sua vez,
compromete a atividade da metemoglobina redutase, resultando em um acúmulo
de metemoglobina e uma diminuição da capacidade de transporte de oxigênio
pelas hemácias. Além disso, o acúmulo intracelular de 2,3-DPG, leva a uma
diminuição da afinidade da hemoglobina pelo oxigênio, comprometendo ainda
mais o transporte de oxigênio para os tecidos.

6.11.3. Deficiência de Hexoquinase

A hexoquinase é a primeira enzima da via glicolítica e sua função é


fosforilar a glicose que entra na célula para que esta não se difunda de volta para
102

o meio extracelular. Na deficiência desta enzima, a utilização de glicose pela


hemácia fica bem comprometida pois grande parte da glicose absorvida pela
célula é perdida por difusão para o meio extracelular. Como o aproveitamento de
glicose é comprometido, a formação de todos os produtos utilizados pela hemácia
(ATP, NADH e NADPH) é consequentemente comprometido. Esta célula se torna,
portanto, extremamente susceptível a rompimento (hemólise) por estresse
osmótico (por falta de ATP para a atividade das bombas) e por estresse oxidativo
(por falta de cofatores redutores, NADH e NADPH). Além disso, a liberação de
oxigênio para os tecidos periféricos é comprometida pela baixa concentração de
2,3-DPG nestas células, o que aumenta a afinidade da hemoglobina pelo
oxigênio.

6.11.4. Deficiência de Selênio

O selênio é um importante cofator para a atividade da glutationa


peroxidase. Na deficiência de selênio, a atividade da glutationa peroxidase e,
portanto, a detoxificação de peróxido estarão comprometidos. Com isso, a
hemácia se torna mais sensível a estresse oxidativo. É importante lembrar que,
na deficiência de selênio, outros mecanismos detoxificadores de radicais peróxido
estão atuantes como a catalase e a glutationa S-transferase. Portanto, a
deficiência de selênio se manifesta como uma sensibilidade moderada ao
estresse oxidativo, menos grave, por exemplo, do que a deficiência de glutationa
redutase.

6.11.5. Deficiência de Glutationa Redutase

Na deficiência da glutationa redutase, a reposição dos estoques celulares


de glutationa reduzida é diminuido. Desta forma, o potencial redutor da célula
diminui e a célula se torna mais sensível a estresse oxidativo. É importante
perceber que a deficiência da glutationa redutase compromete dois sistemas
redutores da célula, o da glutationa peroxidase e o da glutationa S-transferase,
pois ambos dependem de um estoque de glutationa reduzida. Isso, portanto,
acarreta um aumento grande da sensibilidade das hemácias ao estresse
oxidativo. Além disso, como a glutationa redutase utiliza NADPH formado pela via
das pentoses, a deficiência desta enzima leva a um acúmulo de NADPH e uma
inibição desta via. Isso resulta em uma modificação do aproveitamento da glicose,
com o consumo de glicose quase que exclusivamente através da metabolização
pela glicólise.

6.11.6. Anemia Química

Alguns fármacos utilizados clinicamente, bem como alguns compostos


químicos induzem estresse oxidativo em hemácias. Dentre os fármacos,
destacam-se as sulfonamidas, um grupo de antibióticos, e a primaquina, um
fármaco anti-malárico. Dentre os compostos químicos, destacam-se o naftaleno e
a anilina. Por gerarem a formação de radicais livres, a ingestão destes fármacos
ou destes compostos geralmente é acompanhada por um pequeno grau de
103

anemia. A grande importância destes efeitos resulta de uma anemia severa em


indivíduos que já apresentam uma fragilidade das hemácias ou uma sensibilidade
das hemácias ao estresse oxidativo, como observado nas deficiências
enzimáticas discutidas anteriormente.

6.11.7. Metemoglobinemia

A metemoglobinemia é caracterizada por uma proporção aumentada de


metemoglobina, comprometendo o transporte de oxigênio para os tecidos. A
metemoglobinemia pode ser adquirida (química) ou hereditária. Na
metemoglobinemia adquirida, alguns compostos químicos favorecem a oxidação
da hemoglobina, compromentendo o transporte de oxigênio. Entre estes
compostos, podemos destacar as sulfonamidas e a anilina. A metemoglobinemia
hereditária resulta de mutações nas cadeias da hemoglobina que a torna mais
propensa a ser oxidada, gerando uma proporção aumentada de metemoglobina
circulante. É importante lembrar que a geração de metemoglobina é
acompanhada da formação de radicais superóxido e que, portanto, nestes casos
de metemoglobinemia, o estresse oxidativo também está aumentado.

Autor(es):
Heitor Affonso de Paula Neto
104

UNIDADE 7
105

7. HEMOGLOBINA E MIOGLOBINA

7.1. INTRODUÇÃO

A capacidade de utilizar completamente a glicose através do metabolismo


aeróbico dá aos vertebrados uma disponibilidade de aproximadamente 18 vezes
mais energia que a adquirida como metabolismo anaeróbico. Porém, para suprir
adequadamente as suas células com fluxo contínuo de oxigênio, os vertebrados
se utilizam de dois mecanismos principais: 1) o sistema circulatório; e 2) proteínas
carreadoras de oxigênio, para contornar a limitação imposta pela baixa
solubilidade do oxigênio em água. Os carreadores de oxigênio nos vertebrados
são a hemoglobina e a mioglobina (Figura 40).

A B

Figura 40. Estrutura da Hemoglobina e da Mioglobina. A) Hemoglobina A – formada por quatro


cadeias, duas alfa e duas beta; B) Mioglobina – formada por uma única cadeia (homóloga às
cadeias da hemoglobina).

Estudos detalhados da hemoglobina e da mioglobina ilustram tipos de


relações estruturais comuns a muitas proteínas. A propriedade da mioglobina ou
da hemoglobina de se ligar ao oxigênio depende de uma unidade não peptídica, o
grupamento hemo ou heme. Este grupo prostético, um tetrapirrol cíclico, é
responsável pela cor avermelhada do sangue.

O hemo é constituído de uma parte orgânica e de um átomo de ferro. A


parte orgânica, protoporfirina, é constituída de quatro anéis pirrólicos. Estes estão
ligados por pontes de meteno, para formar anéis tetrapirrólicos. Quatro metilas,
duas vinilas e duas cadeias laterais de propionato estão ligadas (Figura 41).
106

Figura 41. Grupamento Heme e a Origem dos seus Nitrogênios.

O átomo de ferro no heme se liga aos quatro nitrogênios no centro do anel


pirrólico. O ferro forma duas ligações adicionais, uma em cada lado do plano do
heme. O átomo de ferro pode estar no estado de oxidação ferroso (+2) ou no
férrico (+3), e as formas correspondentes de hemoglobinas são chamadas ferro-
hemoglobina e Ferri-hemoglobina (também chamada de meta-hemoglobina).
Somente a ferro-hemoglobina, o estado de oxidação +2, pode ligar-se ao
oxigênio. A mesma nomenclatura se aplica à mioglobina.

7.2. A MIOGLOBINA

A mioglobina é uma proteína monomérica de baixo peso molecular,


encontrada nas musculaturas esquelética e cardíaca. É uma proteína ligadora de
oxigênio, e atua como reserva desta molécula, o que facilita a sua movimentação
dentro das células musculares. Uma lesão celular da musculatura esquelética ou
cardíaca leva à liberação de mioglobina para a circulação sangüínea.

A mioglobina é uma proteína globular, que contém diversos tipos de


estruturas secundária, enrolados em esfera ou num arranjo que lembra um globo
(Figura 42). É uma proteína conjugada, já que é formada por uma cadeia
peptídica e um grupo prostético, heme. Aproximadamente 75% de seus resíduos
de aminoácidos estão presentes em α-hélices de passo direito, contendo de 7 a
20 resíduos de comprimento. Iniciando no resíduo N-terminal, essas hélices são
denominadas de A a H. Os resíduos individuais são designados por um número
que indica a sua distância do resíduo N-terminal da hélice. Por exemplo, “His F8”
refere-se ao 8o resíduo da hélice F e o identifica como um resíduo de histidina.

O Heme da mioglobina está localizado dentro de uma fenda entre as


hélices E e F. Na mioglobina desoxigenada, o ferro hemínico está localizado
107

cerca de 0,03 nm para fora do plano do anel, na direção da His F8. Na mioglobina
oxigenada, o átomo de oxigênio ocupa a 6a posição de coordenação do átomo
ferro, que se localiza a cerca de 0,01 nm fora do plano do heme. Portanto a
oxigenação a mioglobina determina uma mudança na conformação de porções da
proteína.

Figura 42. Representação Esquemática da Estrutura da Mioglobina.

O local de ligação do oxigênio compreende somente uma pequena fração


do volume da molécula de mioglobina. Realmente, o oxigênio está diretamente
ligado somente ao átomo ferro do grupo heme. Então, por que a porção
polipeptídica da mioglobina é necessária para o transporte e armazenamento do
oxigênio? A resposta está nas propriedades de ligação de um heme isolado para
o oxigênio. Na água, um heme na forma de ferroso livre pode se ligar à molécula
de oxigênio, mas o faz por um momento fugaz. A razão é que o O2 oxida muito
rapidamente o heme ferroso a heme férrico, que não consegue se ligar ao
oxigênio. Um complexo de O2 “em sanduíche” entre dois grupos hemes é um
intermediário nesta reação. Na mioglobina, o heme é muito menos susceptível à
oxidação, porque duas moléculas de mioglobina não conseguem se associar
rapidamente para formar um complexo heme-O2-heme. A formação deste
“sanduíche” é estericamente impedida pela histidina distal e outros aminoácidos
locais que cercam o sexto local de coordenação.

Por que a mioglobina é inadequada como proteína transportadora de


oxigênio; porém eficaz no armazenamento de oxigênio? A quantidade de O2
ligado à mioglobina (expresso como porcentagem de saturação) depende da
concentração de oxigênio (expressa como pressão parcial de oxigênio, PO2) no
ambiente próximo do ferro hemínico. Para a mioglobina, a curva de saturação
isotérmica é hiperbólica, ou seja, mediante uma PO2 de apenas 1mmHg, ela
atinge sua saturação máxima. Como a mioglobina não pode liberar grande parte
do oxigênio a ela ligado, mesmo a 20 mmHg (PO2 do músculo), ela não serve
como veículo adequado para transportar oxigênio dos pulmões para os tecidos
periféricos. Todavia, à falta de oxigênio, que acompanha exercício físico intenso,
o PO2 do tecido muscular pode baixar até 5 mmHg. Nessa pressão, a mioglobina
facilmente libera o oxigênio ligado, suprindo a síntese oxidativa de ATP na
mitocôndria da célula muscular (Figura 43).
108

Figura 43. Gráfico comparativo da Saturação da Mioglobina (azul) e da Hemoglobina (vermelho).

Em pacientes com infarto agudo do miocárdio (IAM), podemos encontrar


níveis elevados de mioglobina em circulação já nas primeiras horas após infarto,
com pico entre 6 e 9 horas, retomando aos níveis normais em 24 a 48 horas após
o infarto. A elevação da mioglobina é extremamente precoce quando comparada
a outras enzimas cardíacas, devido ao seu baixo peso molecular, que permite um
rápido deslocamento para a circulação. Essa mesma característica responde por
sua curta permanência em níveis alterados, já que é rapidamente filtrada e
eliminada pelos rins.

A dosagem de mioglobina é apontada como um marcador de rastreamento


no diagnóstico precoce do IAM, por sua rápida elevação após a lesão miocárdica.
Entretanto, como já mencionado, valores elevados de mioglobina podem ser
encontrados também nas lesões da musculatura esquelética, não tendo, portanto
uma especificidade para lesões cardíacas. Por sua característica de rápida
eliminação renal, resultados alterados obtidos em pacientes com patologias renais
devem ser interpretados com cautela, pois podem ser causados pela diminuição
da eliminação renal.

7.3. HEMOGLOBINA

A hemoglobina (Hb) é o pigmento vermelho das hemácias, e foi a primeira


molécula cuja função fisiológica específica, ou seja, o transporte de oxigênio foi
caracterizada. Foi a primeira proteína na qual se demonstrou que uma mutação
pontual poderia levar a uma mudança de um único aminoácido, como na anemia
falciforme. A Hb não é simplesmente um tanque de oxigênio, mas sim um sistema
sofisticado de entrega adequada de oxigênio aos tecidos sob diversas
circunstâncias.

A hemoglobina dos vertebrados é constituída por quatro cadeias


polipeptídicas, de dois tipos distintos. As quatro são mantidas juntas por ligações
não covalentes. Cada monômero contém um grupo heme e um só centro de
ligação ao oxigênio. A hemoglobina A (HbA), a principal dos adultos, é constituída
109

por duas cadeias alfa (α) e duas beta (β). A outra hemoglobina dos adultos, que
corresponde a cerca de 2% da hemoglobina total, é a hemoglobina A2 (HbA2), na
qual as cadeias β são substituídas por cadeias delta (δ). Sendo assim, a
composição da hemoglobina A é α2 β2 e da hemoglobina A2 é α2δ2.

Os embriões e os fetos apresentam hemoglobinas diferentes. Logo após a


concepção, os embriões sintetizam cadeias zeta (ξ), que são cadeias do tipo α; e
cadeias épsilon (ε), que são do tipo (β). Durante o desenvolvimento, ξ é trocado
por α, e ε é trocado por gama (γ) e depois por β. A principal hemoglobina durante
os últimos dois terços da vida intra-uterina é a hemoglobina F (HbF), cuja
composição em subunidades é α2γ2. As cadeias α e ξ contém 141 aminoácidos e
as cadeias β, γ e δ contém 146. Logo, a hemoglobina consiste em vários
polipeptídios que diferem entre si e as interações das subunidades determinam a
capacidade da hemoglobina de transportar O2, CO2 e H+, atendendo às condições
fisiológicas.

A hemoglobina dos eritrócitos dos vertebrados realiza duas funções


biológicas principais: 1) transporte de O2 do órgão respiratório aos tecidos
periféricos e 2) transporte de CO2 e prótons do tecido periférico ao órgão
respiratório para subseqüente excreção.

7.3.1. Transporte de Oxigênio

O oxigênio é transportado no sangue sob duas formas: dissolvido no


plasma e no fluido intracelular eritrocitário e combinado quimicamente, de forma
reversível, com a hemoglobina.

Quando o oxigênio difunde dos pulmões para o sangue, uma pequena


proporção fica em solução nos líquidos do plasma e dos glóbulos vermelhos, mas,
quantidade de oxigênio sessenta vezes maior combina imediatamente com a
hemoglobina dos glóbulos vermelhos e é transportado, sob essa forma
combinada, para os capilares dos tecidos. Somente uma pequena porção
permanece dissolvida e é transportada por difusão simples. Esta forma de
transporte obedece à Lei de Henry (“A solubilidade de um gás dissolvido em um
líquido é proporcional à pressão parcial do gás acima do líquido.”), de modo que a
quantidade de oxigênio dissolvido é diretamente proporcional à sua pressão
parcial no sangue. No sangue arterial normal (considerando-se PO2 igual a 100
mmHg), há somente 0,3 % do volume de O2 dissolvido.

A quantidade de O2 dissolvida não é, entretanto, suficiente para manter


funcionante o organismo de um indivíduo normal. Quando o sangue passa pelos
capilares dos tecidos, o oxigênio se separa da hemoglobina e se difunde para as
células. Dessa forma, a hemoglobina atua como um carreador de oxigênio
aumentando a quantidade de oxigênio que pode ser transportada desde os
pulmões até os tecidos até cerca de 60 vezes mais do que poderia ser
transportado apenas em solução. No repouso, mais de 95% do oxigênio fornecido
aos tecidos são transportados em associação com a hemoglobina, e este valor
ultrapassa 99% durante o exercício físico.
110

Em 1938, Félix Haurowitz descobriu que cristais de desoxi-hemoglobina se


fragmentavam quando eram expostos ao oxigênio. Os cristais de
desoximioglobina, por outro lado, ligam-se e libertam oxigênio sem alteração da
sua forma. A fragmentação dos cristais da hemoglobina sugeriu que a proteína
passa por uma mudança conformacional importante quando se liga à molécula de
O2. De fato, estudos de cristalografia com raios X mostraram que a oxi- e a
desoxi-hemoglobina diferem-se acentuadamente em suas estruturas quaternárias.
A molécula oxigenada é mais compacta. A estrutura quaternária da desoxi-
hemoglobina é chamada de forma T (Tensa), a da oxi-hemoglobina é chamada de
forma R (relaxada) (Figura 44).

Figura 44. Transição da Hemoglobina da Forma T para a Forma R.

Na hemoglobina não oxigenada, o ferro do grupo heme situa-se cerca de


0,03 nm (0,3 Ǻ) fora do plano do anel, na direção de His F8. Na hemoglobina
oxigenada, uma molécula de oxigênio ocupa a sexta posição de coordenação do
átomo de ferro que, então, se situa apenas a cerca de 0,01 nm (0,1 Ǻ) fora do
plano do heme. A oxigenação da hemoglobina é, portanto, acompanhada pelo
movimento do íon de ferro e, consequentemente, pelo movimento de His F8 e os
resíduos ligados covalentemente a His F8, em direcção ao plano do anel. Este
movimento gera uma nova conformação das porções da proteína.

Curva de dissociação Oxigênio-Hemoglobina

As hemoglobinas ligam 4 moléculas de oxigênio por tetrâmero (um em cada


grupo heme), e as curvas de saturação das hemoglobinas por oxigênio são
sigmoidais. Assim, a facilidade de ligação do oxigênio à hemoglobina depende da
presença de outras moléculas de O2 no mesmo tetrâmero. Se o O2 já está
presente, ocorre mais facilmente a ligação subseqüente de moléculas de O2.
Assim a ligação das moléculas de O2 à hemoglobina apresenta cinética de
ligação cooperativa, uma propriedade que permite a hemoglobina ligar
quantidade máxima de O2 no órgão respiratório e liberar quantidade máxima de
O2 no PO2 prevalente dos tecidos periféricos.
111

Essa curva é estabelecida a partir da porcentagem de hemoglobina que


está combinada ao oxigênio, para determinada pressão de oxigênio (PO2). O
sangue aerado que deixa os pulmões tem, usualmente, pressão do oxigênio da
ordem de 100 mmHg.

Dependendo do organismo, a pressão parcial em que as hemoglobinas


encontram-se 50% saturadas pelo oxigênio (P50) pode variar amplamente, porém
em todos os casos está acima da PO2 dos tecidos periféricos do organismo
considerado. A HbF humana fornece um exemplo ilustrativo. Para a HbA, P50 é de
26 mmHg; enquanto que, para a HbF, P50 é igual a 20 mmHg. Esta diferença
permite a HbF extrair o oxigênio do sangue placentário. Todavia, pós parto, a HbF
é inconveniente para este propósito, uma vez que alta afinidade pelo O2 faz com
que ela possa liberar menos O2 para os tecidos. Assim, algumas semanas após o
parto, o bebê apresenta substituição completa das subunidades γ por
subunidades β, ou seja, passa a haver a predominância da HbA.

Figura 45. Curva de Dissociação da Hemoglobina. Mostra os pontos normais arterial e venoso.
Uma unidade KPa corresponde a 7,5 mmHg.

A curva de dissociação da hemoglobina é consideravelmente íngreme no


seu trecho inicial até cerca de 40 ou 50 mmHg de PO2, enquanto na porção final
gradualmente se horizontaliza. Na parte ascendente, as variações da saturação
de oxigênio (SO2) são quase proporcionais às de PO2, ao passo que, na parte alta
da curva, grandes modificações de PO2 correspondem a pequenas variações de
SO2.

Fazendo referência à curva é visto que, na pressão de 60 mmHg (8 KPa),


aproximadamente 97% da hemoglobina estão combinados com o oxigênio. Como
a saturação normal do sangue arterial sistêmico é de 97%, uma diminuição da
PO2 arterial de 100 para 60 mmHg acompanha-se de dessaturação apenas
discreta. Por outro lado, é desprezível o aumento de saturação resultante da
hiperventilação em ar atmosférico, uma vez que, em condições basais, já é quase
de 100% a SO2.
112

Quando o sangue é oxigenado até o nível arterial normal de 97% de


saturação, cerca de 19 ml de oxigênio estarão fixados à hemoglobina. Então,
conforme o sangue perde oxigênio para os tecidos e a saturação da hemoglobina
cai a 70%, a quantidade de oxigênio que permanece fixada ao sangue ainda é da
ordem de 14 ml para cada 100 ml de sangue. Por conseguinte, cada 100 ml de
sangue que passam pelos tecidos, normalmente, liberam cerca de 5 ml de
oxigênio para as células.

Durante o exercício intenso, essa liberação pode aumentar até 15 a 18 ml


para cada 100 ml de sangue que passa pelos tecidos.

Em condições normais, um quarto da hemoglobina é utilizado no transporte


de oxigênio aos tecidos.

Quando os tecidos sofrem de extrema necessidade, a PO2 nos mesmos cai


a valores muito baixos, permitindo que o oxigênio difunda do sangue capilar com
maior rapidez que a usual. Como resultado, a saturação da hemoglobina no
sangue capilar pode cair a 10 - 20%, em lugar dos 70% normais.

Portanto, sem qualquer aumento da quantidade de fluxo sanguíneo, a


quantidade de oxigênio pode ser aumentada por mais três vezes. Se também for
lembrado que o débito cardíaco pode aumentar de até cinco a sete vezes nos
períodos de estresse então fica claro que a quantidade de oxigênio que pode ser
transportada para os tecidos pode ser aumentada de até 15 a 20 vezes a normal,
parte desse aumento correspondendo à queda do percentual de saturação da
hemoglobina e parte ainda maior pelo aumento do débito cardíaco.

7.3.2. Transporte de CO2 e H+

No metabolismo aeróbio a cada molécula de O2 consumida, cerca de 0,8,


em proporção, de CO2 é produzida.

Além de transportar oxigênio dos pulmões aos tecidos periféricos, a


hemoglobina facilita o transporte de CO2 no sentido oposto, para eliminação. A
hemoglobina pode ligar-se diretamente ao CO2 quando o oxigênio é liberado.

Todavia, como CO2 está dissolvido no sangue, a anidrase carbônica dos


eritrócitos catalisa a formação de ácido carbônico. O ácido carbônico se dissocia,
rapidamente, em bicarbonato e um próton; e o equilíbrio é favorável à
dissociação.

CO2 + H2O ↔ H2CO3 ↔ HCO3- + H+

Para prevenir a diminuição do pH sanguíneo, deve haver um sistema


tampão para neutralizar esse excesso de prótons. A hemoglobina liga 2 prótons
para cada 4 moléculas de O2 perdidas e assim funciona como principal tampão do
sangue. A maioria dos H+ gerados por esta reação é captada pela desoxi-
hemoglobina, como parte do efeito de Bohr.
113

Figura 46. Efeito Bohr.

O conjunto de fenômenos relacionados com o aumento do caráter ácido da


Hb quando ela se liga ao oxigênio, e o aumento do caráter básico causado pela
desoxigenação, constitui o que se conhece como efeito Bohr alcalino ou normal:
4 Hb (O2) ↔ 4 Hb + 4 O2

Quando esta equação se desloca para a direita, a reação está ocorrendo


nos capilares e os íons H+ promovem a liberação do oxigênio. Já quando a reação
é deslocada para a esquerda, nos pulmões ou brânquias, a oxigenação leva à
liberação do H+.

A hemoglobina desempenha importante papel na manutenção do pH


plasmático: à medida que a pO2 cai e a concentração de H+ aumenta, a
hemoglobina libera O2 e capta H+. Quando a pO2 aumenta e a concentração de
H+ diminui, a hemoglobina se liga ao O2 liberando o H+.

O aumento da concentração ácida do plasma provoca uma queda na


afinidade da Hb por oxigênio. Este efeito é normalmente encontrado nos vasos
sangüíneos dos tecidos, onde há uma maior concentração de prótons e dióxido
de carbono, decorrente da atividade celular.

7.3.3. Fatores que Interferem no Transporte de O2

Há quatro fatores bem conhecidos que alteram a interação do O2 com a


hemoglobina: a PCO2, o pH, a temperatura e o nível de 2,3-difosfoglicerato.
114

A Interferência da PCO2

Aproximadamente 15% do CO2 do sangue é carregado pela hemoglobina,


na forma de bicarbonato. Os bicarbonatos ligados formam pontes salinas que
estabilizam a forma T, por isso a ligação do CO2 diminui a afinidade da
hemoglobina pelo oxigênio. Assim, aumentando a concentração de CO2 (em pH
constante), observamos que a curva de dissociação da hemoglobina é deslocada
para a direita.

Figura 47. Efeito do CO2 na Curva de Dissociação da Hemoglobina.

A Interferência do pH

Na hemoglobina, a acidez aumenta a liberação de oxigênio.


Fisiologicamente, baixando o pH há um deslocamento da curva de dissociação do
oxigênio para a direita, de tal maneira que a afinidade pelo oxigênio fica
diminuída. Contrariamente, o aumento do pH desvia a curva para a esquerda e a
saturação de Hb para um dado PO2 aumenta, indicando uma maior afinidade da
Hb pelo oxigênio.

Figura 48. Efeito do pH na Curva de Dissociação da Hemoglobina.


115

Em tecidos em rápida metabolização, tais como o músculo em contração,


muito CO2 e H+ são produzidos. A presença de maiores níveis de CO2 e H+ nos
capilares de tal tecido metabolicamente ativo promove a libertação de O2 da oxi-
hemoglobina. Estes importantes mecanismos para enfrentar a maior necessidade
de oxigênio nos tecidos metabolicamnte ativos foram descobertos por Christian
Bohr, em 1904.

O efeito recíproco, descoberto 10 anos mais tarde por J. S. Haldane ocorre


nos capilares alveolares dos pulmões. A alta concentração de O2 promove a
libertação de H+ e CO2 da hemoglobina, assim como as altas concentrações de
H+ e de CO2 nos tecidos ativos libertam o O2. Este elo entre a ligação do O2, H+ e
CO2 são conhecidos como o Efeito de Bohr.

A Interferência da Temperatura

Variações na temperatura também afetam a curva de dissociação da Hb.


Enquanto a queda da temperatura redunda em desvio da curva para a esquerda,
a temperatura elevada desvia a curva para a direita.

Figura 49. Efeito da temperatura na Curva de Dissociação da Hemoglobina.

A Interferência do 2,3-difosfoglicerato

Nos tecidos periféricos, a deficiência de oxigênio determina um acúmulo de


2,3-difosfoglicerato (DPG). Este composto é formado de um intermediário
glicolítico, o 1,2-difosfoglicerato, e está presente nas hemácias humanas em uma
concentração molar semelhante à da hemoglobina. Uma molécula de DPG liga-se
à hemoglobina tetramérica, numa cavidade central, formada pelas 4 subunidades.
A cavidade central tem tamanho suficiente para acomodar o DPG somente
quando o espaço entre as hélices da cadeia β é suficientemente largo, isto é,
quando a hemoglobina está na sua forma T (tensa, desoxi-hemoglobina) (Figura
50).
116

O estado T da Hb tem um O estado R da Hb perde


sítio para BPG (azul) seu sítio para BPG

Figura 50. Interação da Hemoglobina com o DPG.

O DPG está ligado à hemoglobina através de pontes salinas entre os seus


átomos de oxigênio e ambas as cadeias β via resíduos de amino, grupos N-
terminais (Val NA1), Lys EF6 e His H21. Assim, o DPG estabiliza a forma T, a
forma desoxigenada, da hemoglobina, por ligação cruzada das cadeias β, e
contribui, adicionalmente, para a formação de pontes salinas, que devem ser
rompidas para que a forma T se “transforme” na forma R da hemoglobina. Assim,
é importante notar que o DPG diminui a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio
ligando-se à desoxi-hemoglobina, mas não à forma oxigenada.

Na ausência de DPG, o P50 da hemoglobina é 1 mmHg, tal como a


mioglobina. Na presença de DPG, o P50 vai a 26 mmHg. Assim, o DPG abaixa
afinidade da hemoglobina pelo oxigênio por um fator de 26, o qual é essencial na
habilitação da hemoglobina a descarregar o oxigênio em capilares dos tecidos.

O DPG liga-se com menor afinidade à hemoglobina fetal, do que à adulta,


porque o resíduo H21, da cadeia gama da hemoglobina fetal é uma serina em vez
da His,e aquela não pode participar na formação da ponte salina (que mantém o
DPG na cavidade central). Portanto, o DPG tem um efeito menos pronunciado na
estabilidade da forma T da hemoglobina fetal e é responsável pela maior
afinidade que a hemoglobina fetal apresenta para o oxigênio quando comparada
com a hemoglobina do adulto.

Figura 51. A Hemoglobina Fetal Tem Maior


Afinidade para o Oxigênio do que a Hemoglobina
Adulta.
117

Num ambiente pobre em oxigênio, como é o da placenta, o oxigênio é


libertado da hemoglobina da mãe e a HbF do feto liga-se a ele. Esta pequena
diferença na afinidade dada pela diferente capacidade de ligação ao DPG medeia
a transferência de oxigênio da mãe para o feto. No feto, a mioglobina do músculo
possui uma afinidade ainda maior para o oxigênio, de forma que as moléculas do
oxigênio passam da hemoglobina fetal para serem armazenadas e usadas no
músculo.

7.3.4. Adaptação à Mudança de Altitude

Uma situação relevante de adaptação do nosso organismo ao ambiente


constitui a reação à mudança na altitude. A resposta ao baixo PO2 arterial
resultante da alta altitude é comandada pelos quimiorreceptores periféricos,
levando a hiperventilação e aumento do débito cardíaco (DC). Ocorre aumento na
PO2 alveolar (por aumento na ventilação alveolar) e conseqüentemente aumento
na PaO2 e decréscimo na PaCO2. O decréscimo na PaCO2, entretanto, reduz o
estímulo ao nível dos quimiorreceptores centrais, limitando a hiperventilação.

Altitude (m) Pressão Atmosférica (mmHg) PO2 (mmHg)


0 (nível do mar) 760 159,2
1.000 674 141,2
2.000 596 124,9
3.000 526 110,2
4.000 462 96,9
9.000 231 48,4

Figura 52. Gráfico Comparativo entre a Saturação de Oxigênio da Hemoglobina e a Pressão


Atmosférica, em Situações de Aumento da Altitude.
118

A compensação metabólica compreende:

• A curto prazo: Hiperventilação (taquipnéia) estimulada pela baixa PO2


que diminui o percentual de saturação da hemoglobina; maior
eliminação de CO2 que baixa a PCO2 e aumenta o pH provocando a
alcalose respiratória; tonturas, vertigens e enjôo.
• A médio prazo: Excreção de HCO3- pela urina para baixar o pH até o
nível normal; perda de água, que provoca desidratação e diminuição do
volume plasmático; hemoconcentração - aproximação das hemácias
para facilitar o transporte de O2 por um processo difusional.
• A longo prazo: Secreção de eritropoietina pelo rim estimulando a
medula óssea a fazer eritropoiese; aumento de volume sanguíneo -
recuperação da capacidade de transporte de O2 com o sangue com
mais hemácias que o normal à nível do mar (policitemia/eritrocitose).
Aumento do 2,3 DPG , desviando a curva de dissociação para a direita.

SO2 %

PO2 (mmHg)

Figura 53. Comportamento da Saturação da Hemoglobina por Oxigênio em Situações que


Aumentam (azul) ou Diminuem (vermelho) a sua Afinidade por Esta Molécula.

Tempo de adaptação: Até 2.100 m - 2 semanas; a cada 600 m a mais


aumenta mais uma semana.

7.4. HEMOGLOBINOPATIAS

As hemoglobinopatias são anemias hereditárias causadas por distúrbios na


intensidade de síntese (alteração de genes reguladores) ou na estrutura (troca de
aminoácidos – alterações em genes estruturais) das cadeias polipeptídicas da
hemoglobina. São divididas basicamente em: alterações quantitativas – as
talassemias, que se caracterizam pela diminuição ou ausência de síntese de uma
ou mais cadeias polipeptídicas de globina; alterações qualitativas – as
hemoglobinas variantes, que aparecem como resultado de mutações estruturais
119

dos genes α, β, γ ou δ e acarretam a substituição de aminoácidos nas respectivas


cadeias polipeptídicas.

Existem mais de 700 variantes de hemoglobinas já caracterizadas no


mundo, e em sua maior parte a substituição de aminoácidos ocorrem na cadeia β,
seguida pela α. Contudo, a grande maioria destas mutações não dá origem a
anemias hemolíticas.

Além das talassemias-α e β, as hemoglobinas variantes de importância


clínica são as hemoglobinas S, C, D, E em homozigose ou em heterozigose, as
quaís causam anemias hemolíticas.

7.4.1. Síndromes Talassêmicas

As síndromes talassêmicas são um grupo heterogênio de distúrbio


hereditários causados por lesão genética, que têm como conseqüência a
diminuição parcial ou ausência total de produção de cadeias globínicas (sem
alterações estruturais na seqüência de aminoácidos). Caso o defeito seja em
genes ligados à síntese de cadeias α, tem-se uma talassemia-α. Quando a
deficiência ocorre na síntese da cadeia β, ocorre a forma talassêmica β.

Para que a molécula da hemoglobina adulta seja considerada normal, é


necessário que a quantidade de cadeias α seja equivalente á soma das cadeias β
(96 a 98%), δ (2,5 a 3,7%) e γ (0 a 1%).

Em virtude da redução no ritmo ou da ausência total de síntese de certas


cadeias peptídicas da hemoglobina, há hemoglobinização deficiente e,
conseqüentemente, microcitose (volume médio dos eritrócitos encontra-se
diminuído) e hipocromia. Como a síntese de cadeias não afetadas permanece
inalterada, há acúmulo e formação de agregados instáveis destas cadeias
despareadas. A precipitação destes agregados provoca numerosos efeitos
deletérios sobre os eritrócitos e seus precursores, causando sua destruição
prematura. Por exemplo, na β-talassemia, o excesso de cadeias α livres se
agregam na forma de inclusões insolúveis dentro dos eritrócitos e seus
precursores, levando à uma destruição prematura de eritroblastos em
amadurecimento na medula (eritropoiese ineficaz) e lise de hemácias maduras no
baço (hemólise).

7.4.2. Doença Falciforme

Doença falciforme é uma importante hemoglobinopatia hereditária


caracterizada pela presença de hemoglobina S no interior dos eritrócitos,
independentemente da sua quantidade ou da sua herança genética (heretozigose
ou homozigose).

A anemia falciforme é causada por uma mutação pontual na sexta posição


na cadeia β-globina, levando à substituição do resíduo ácido glutâmico por um
120

resíduo de valina. As propriedades físico-químicas anormais resultantes da


hemoglobina falcêmica (HbS) são responsáveis pela doença falcêmica.

Quando desoxigenadas, as moléculas de HbS sofrem agregação e


polimerização. Inicialmente, o citosol do eritrócito se converte de um líquido fluido
a um gel viscoso à medida que a HbS forma agregados. Com a persistência do
estado desoxigenado, os agregados de HbS se reúnem na forma de fibras longas
dentro dos eritrócitos, dando o aspecto de foice à célula.

A falcemização ou falcização do eritrócito é, inicialmente, um fenômeno


reversível. Com oxigenação, HbS se despolimeriza e a forma das células se
normaliza. Entretanto, com episódios repetidos de falcemização, ocorrem danos à
membrana e os eritrócitos se tornam irreversivelmente falcemizados, mantendo
sua forma anormal mesmo quando totalmente oxigenados.

A falcemização dos eritrócitos provoca aumento da viscosidade sanguínea,


estase (parada do fluxo sanguíneo) e fenômeno venoclusivos dolorosos, típicos
da doença. Em órgãos de circulação mais lenta, esse fenômeno ocorre com mais
facilidade, causando formação de trombos e infarto de áreas adjacentes. A longo
prazo a isquemia pode acarretar comprometimento funcional de vários órgãos.

7.4.3. Outras Hemoglobinas Variantes

Hemoglobina C

A hemoglobina C é resultante da alteração molecular do ácido glutâmico na


sexta posição da cadeia β-globina por um resíduo de lisina (βC). Depois da HbS, é
o tipo mais comum no Brasil.

Hemoglobina D

Esta hemoglobinopatia resulta da substituição do ácido glutâmico da


posição 121 da cadeia β-globina por glutamina (βD). Mesmo em homozigose,
caracteriza-se por uma anemia hemolítica branda. Seu diagnóstico tem como
importância maior o aconselhamento genético para evitar cruzamento com
portadores assintomáticos de outras hemoglobinopatias, como o traço falciforme.
É a terceira variante de hemoglobina mais freqüente na população brasileira.

Hemoglobina E

A hemoglobina E é originada a partir da troca de ácido glutâmico por uma lisina


na posição 26 da cadeia de β-globina (βE). É uma hemoglobina bastante instável
e não altera a vida média dos eritrócitos. É comum nos povos do sudeste da Ásia.
121

Autor(es):
Ana Carolina Soares Matos de Menezes

Revisor(es):
Heitor Affonso de Paula Neto
122

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
123

UNIDADE 1
• Opie, L. H. The Heart: Physiology, from Cell to Circulation. 3ª edição. 1998.

• Thurberg, B. L.; Maloney, C. L.; Vaccaro, C.; Afonso, K.; Tsai, A. C.; Bossen,
E. H.; Kishnani, P.S.; O’Callaghan, M. Characterization of pre- and post-
treatment pathology after enzyme replacement therapy for pompe
disease. Laboratory Investigation (2006) 86: 1208–1220.

UNIDADES 2 / 3 / 4
• Kolde, H. J. Haemostasis (Physiology, Pathology and Diagnostics). 2ª
edição. 2004.

UNIDADE 7

• Murray, R. K.; Graner, D. K. Harper: Bioquímica. 7a Edição. 1994.

• Lehninger, A. L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. Principles of Biochemistry. 2a


Edição. 1998.

• Strayer, L.; Berg, J. M.; Tymoczko, J. L. Bioquímica. 5a Edição. 2004.

• Aires, M. M. Fisiologia. 2a Edição. 1999.

• Kumar, V.; Fausto, N.; Abbas, A. K. Robbins & Cotran - Patologia. 7a Edição.
2005.
124

ANEXOS
125

Anexo I. Anemias e Índices Hematimétricos

INTRODUÇÃO

Anemia (do grego, “an” = privação, “haima” = sangue) é síndrome clínica


caracterizada pela diminuição da concentração intraeritrocitária de hemoglobina
ou pela redução da quantidade de eritrócitos circulantes, ou seja, diminuição do
hematócrito. Como toda síndrome, ela pode ser caracterizada por um conjunto de
sinais e sintomas, que podem variar conforme o tempo de instalação do quadro.
Assim, as anemias são primariamente classificadas em anemias crônicas e
anemias agudas.

Na anemia aguda (perda súbita de sangue) a falta de volume no sistema


circulatório é mais importante que a falta de hemoglobina. A perda de até 10% do
volume sangüíneo, como a que ocorre numa doação de sangue, é bem tolerada.
Perdas entre 10 e 20% causam hipotensão postural, tonturas e desmaios. Nas
perdas acima de 20% há taquicardia, extremidades frias, palidez extrema, e
hipotensão, depois choque; se a perda ultrapassar 30%, sem reposição imediata
de líquidos intravenosos, o choque torna-se rapidamente irreversível e mortal.

Nas anemias crônicas não há baixa do volume sangüíneo, que é


compensado por aumento do volume plasmático. A falta de hemoglobina, como
regra acompanhada de diminuição do número de eritrócitos, causa descoramento
do sangue, com palidez do paciente, e falta de oxigênio em todos os órgãos, com
os sinais clínicos daí decorrentes. Hipócrates (@400 a.C.) descreveu-os: palidez
e fraqueza devem-se à “corrupção do sangue”.

O sistema nervoso central, o coração e a massa muscular são os órgãos


mais afetados, pois são os que mais necessitam oxigênio para suas funções. A
sintomatologia aumenta com a atividade física, pois esta consome oxigênio.

Com hemoglobina entre 9 e 11 g/dL há irritabilidade, cefaléia e déficit de


concentração; nos pacientes idosos há astenia (fraqueza muscular) e podem
ocorrer dores anginosas. Com hemoglobina entre 6 e 9 g/dL há taquicardia,
dispnéia e fadiga aos menores esforços (como por exemplo, fraqueza que surge
ao tomar banho ou ao percorrer pequenas distâncias). Com hemoglobina abaixo
de 6 g/dL a sintomatologia está presente mesmo em atividades sedentárias e
quando abaixo de 3,5 g/dL a insuficiência cardíaca é iminente e toda a atividade
impossível. Quando a anemia torna-se grave (Quadro1), ela pode inclusive
acarretar um acidente vascular cerebral ou um infarto do miocárdio.

As queixas espontâneas dos pacientes, entretanto, são menos exuberantes


que a descrição acima: sem se aperceberem diminuem progressivamente a
atividade física até níveis assintomáticos, e dizem nada sentir.
126

Quadro 1. Valores de Referência (para indivíduos residentes ao nível do mar).

Não-anêmicos:
• Homens
Hb > 14,0g/dl
• Mulheres
Hb > 12,0g/dl
• Grávidas e crianças pequenas
Hb > 11g/dl

Anemia Leve:
• Homens
Hb de 11,5 a 13,9g/dl
• Mulheres
Hb de 10,0 a 11,9g/dl
• Grávidas e crianças pequenas
Hb de 9,5 a 10,9g/dl

Anemia Moderada:
• Homens
Hb de 9,0 a 11,4g/dl
• Mulheres
Hb de 8,0 a 9,9g/dl
• Grávidas e crianças pequenas
Hb de 7,6 a 9,4g/dl

Anemia Grave:
• Homens
Hb < 9,0g/dl
• Mulheres
Hb <8,0g/dl
• Grávidas e crianças pequenas
Hb < 7,5g/dl

CLASSIFICAÇÃO MORFOLÓGICA

Esta classificação tem por base a caracterização dos eritrócitos do ponto


de vista morfológico, ou seja, quanto ao seu conteúdo de hemoglobinas e ao
tamanho da célula. Deste modo as anemias são divididas em três grandes
grupos:

• Microcítico-hipocrômicas: eritrócitos de pequeno tamanho e pouca


concentração de hemoglobina, não obrigatoriamente com baixo número de
eritrócitos circulantes (eritrócitos normais ou diminuídos);
127

• Normocítico-normocrômicas: tamanho dentro da média, concentração e


conteúdo de hemoglobina na média, normais, mas com pouco número de
eritrócitos circulantes;
• Macrocítica: glóbulos grandes, com concentração interna de hemoglobina
normal, mas com conteúdo interno (peso) de hemoglobina aumentado,
também com baixo número de glóbulos circulantes (eritrócitos diminuídos).

CLASSIFICAÇÃO FISIOPATOLÓGICA

A Síndrome Anêmica pode advir de inúmeras etiologias. Podemos agrupá-


las, segundo a sua fisiopatologia, em três grandes grupos: a) anemia por falta de
produção, com ou sem comprometimento do sistema hematopoiético; b) anemia
por aumento da destruição; c) anemia por perda sanguínea (Quadro2).

Anemias por Diminuição da Produção

As anemias por diminuição da produção dizem respeito a qualquer estado


em que, mesmo havendo hipóxia, não há aumento da produção de eritrócito. Elas
são conseqüência de algum problema no órgão formador de sangue (medula
óssea); ou, quando esta é sadia, da não disponibilidade de elementos nutrientes
para uma eritropoiese ótima (anemias carenciais); ou de defeitos genéticos ou
adquiridos que impedem a formação do heme; ou da falta de eritropoietina
(hormônio secretado pelos rins cuja função é estimular a formação de eritrócitos).

Estes estados são muitas vezes chamados de anemias arregenerativas,


posto que não há aumento de produção mesmo havendo hipóxia. Para estas
anemias a produção só aumentaria (regeneração) caso houvesse a solução da
causa, ou seja, a reposição do ferro, folato, cura da aplasia (transplante de
medula), etc.

Anemias Hemolíticas

As anemias por excesso de destruição são caracterizadas pela diminuição


do tempo de vida média do eritrócito na circulação sem que o aumento da
produção se faça suficiente para compensar o grau de hemólise. São também
chamadas regenerativas, pois há aumento a produção como conseqüência da
hipóxia.

Apesar de sempre existirem alguns pontos em comum (como o aumento da


contagem de reticulócitos, da bilirrubina indireta e da LDH) pode haver grande
divergência de sinais, sintomas e quadros laboratorial nas diferentes anemias
hemolíticas. O local e a intensidade da hemólise, bem como a causa da
destruição (se por problemas do próprio eritrócito ou extra-eritrócitário) conduzem
a quadros laboratoriais bastante variados.
128

Hemólise Extravascular

De modo distinto ao ocorrido no processo normal de destruição dos


eritrócitos senescentes (1% ao dia), os casos de anemias por hemólise
extravascular ocasionarão apenas elevação da LDH e da bilirrubina indireta
séricas (desde que o grau de hemólise seja maior que a capacidade de
conjugação hepática), do urobilinogênio e estercobilonogênio, sem, entretanto
haver hemoglobinemia e/ou hemoglobinúria e/ou hemossiderinúria.

São exemplos de hemólise extravascular as hemoglobinopatias, as


anemias por defeito da membrana ou por déficits enzimáticos hereditários (G6PD,
GR, PK, etc.), após o uso de drogas oxidantes, doença hepática, etc.

Hemólise Intravascular

Na hemólise intravascular do eritrócito, a hemoglobina livre no plasma


formará um complexo com a haptoglobina, e o heme da metamoglobina ligar-se-á
com a hemopexina, para só então formar metamalbumina. Dependendo do grau
de hemólise, haverá depleção parcial ou total da haptoglobina. Quaisquer das
causas de destruição intravascular dos eritrócitos, cuja hemólise for suficiente
para liberar hemoglobina livre que causa depleção da haptoglobina e da
hemopexina, resultarão em metalbuminemia e hemossiderinúria. Entretanto, nem
sempre levam à hemoglobinúria.

São exemplos de hemólise intravascular: térmicas (queimaduras), por


destruição osmótica, por destruição mecânica por prótese cardíaca, na
microangiopatia, na vasculite, por formação de trombos intravasculares, por
incompatibilidade transfusional, por malária, na septicemia por clostrídio,
Mycoplasma pneumoniae, etc.

Anemias Hemorrágicas

As anemias decorrentes da perda sanguínea podem ocorrer de forma


aguda ou crônica, gerando quadros clínicos e laboratoriais distintos.

Anemias por Perda Aguda de Sangue

Imediatamente após a perda aguda de sangue (volume plasmático e


celular juntos), ocorre hipovolemia. As determinações da hemoglobina, do
hematócrito e do número de eritrócitos permanecem semelhantes àquelas
anteriores ao quadro hemorrágico agudo. Apenas após processo de
normovolemização é que é possível avaliar a real diminuição da massa eritróide
circulante.

Como a reserva de reticulócitos mais imaturos medulares é pequena e há


necessidade de, pelo menos, uma semana para formação de novos eritrócitos,
durante os primeiros dias pós normovolemização, a anemia revela-se
129

normocítico-normocrômica (decorrência dos eritrócitos anteriores ao


sangramento, com apenas poucas células policromáticas circulantes- uns poucos
eritrócitos). Por volta do oitavo ao décimo dia, ocorre um pico de reticulócitos.
Caso o paciente não disponha de reservas suficientes de ferro e/ou folato, poderá
desenvolver secundariamente e apresentar quadro superponível de anemia
ferropriva e/ou anemia megaloblástica.

Anemias por Perda Crônica de Sangue

São decorrentes de pequenos sangramentos crônicos que promovem um


espoliamento paulatino das reservas dos fatores nutricionais essenciais para
eritropoiese, principalmente o ferro.

A cinética do ferro é fechada, ou seja, o ferro dos eritrócitos senescentes é


totalmente recuperado pela transferrina e volta para a medula, resultando em uma
necessidade diária mínima de absorção de ferro (apenas para o ferro perdido com
as células epiteliais).

A perda de sangue quebra esse ciclo e aumente cada vez mais a


necessidade de aporte de ferro alimentar, o que na maioria dos casos não é
obtido, provocando assim o desenvolvimento de anemia ferropriva.

A anemia ferropriva sem causa definida pode ser conseqüência de um


carcinoma, úlceras, gastrites, hérnia de hiato, varizes de esôfago, parasitoses
intestinais, hemorróidas, hematúria por carcinoma geniturinário, etc.

Além do quadro clínico-laboratorial típico de cada doença de base, os


achados hematológicos são de anemia microcítica-hipocrômica, para a carência
de ferro, de anemia megaloblástica se houver apenas falta de folato, ou anemia
pluricarencial para deficiência simultânea destas duas substâncias.
130

Quadro 2. Classificação Fisiopatológica das Anemias.

Anemias por falta de produção


• Com sistema hematopoiético íntegro:
o Deficiência de ferro
o Deficiência de folato
o Deficiência de vitamina B12
o Deficiência de eritropoietina: insuficiência renal crônica;
hipotireoidismo;
o Deficiência de piridoxina (B6)
• Com sistema hematopoiético comprometido (medula óssea alterada ou
falha na regulação da eritropoiese):
o Aplasia medular (anemia aplástica)
o Síndromes mielodisplásicas (SMD) e sideroblásticas
o Leucemias
o Linfomas leucemizados
o Metástases
o Mielofibrose
o Estados inflamatórios e/ou infecciosos
o Drogas que inibam a hematopoiese
o Doenças de depósito

Anemias por excesso de destruição


• Anemias hemolíticas por defeito hereditário:
o Eritroenzimopatias (metabólicas):
ƒ Deficiência de G6PD
ƒ Deficiência de piruvato quinase
ƒ Outras enzimopatias (glicolíticas, não glicolíticas)
o Hemoglobinopatias (defeitos na síntese de globinas):
ƒ Com globina de estrutura anormal: anemia falciforme (SS),
hemoglobinopatias CC, SC, SD, SE, etc.
ƒ Com globina de estrutura normal: talassemias
o Por defeitos protéicos da membrana eritrocitária:
ƒ Esferocitose
ƒ Eliptocitose
• Anemias hemolíticas por defeito adquirido:
o Imunes:
ƒ Anemia hemolítica auto-imune (AHAI): induzida por drogas,
aglutininas a frio, etc.
ƒ Anemia hemolítica aloimune: doença hemolítica do recém
nascido, transfusões.
o Não-imunes (dano direto ao eritrócito, sem desenvolvimento primário
de resposta imune):
ƒ Por trauma mecânico: anemias microangiopáticas, próteses
cardíacas, hemoglobinúria da marcha, etc.
ƒ Por danos térmicos: queimados, danos químicos, venenos
ƒ Tóxicas, agentes infecciosos: protozoários (malaia, Babesia),
bactérias (Clostrídium).
131

Quadro 2. Classificação Fisiopatológica das Anemias (continuação).

Anemias por perdas sanguíneas:


• Perdas crônicas: epistaxe, hemorróidas, sangramento menstrual intenso, etc.
• Perdas agudas: acidentes, cirurgias, parto, ruptura de vasos sanguíneos.

Pseudo-anemias: (resultantes apenas do aumento do volume do plasma):


• Edema: último trimestre de gravidez; tratamento com drogas esteróides;
desbalanço hidrosmótico.
• Hiperesplenismo (aumenta a quantidade de glóbulos retidos no
compartimento extravascular)
• Outros: uso de soro intravenoso, atletas em treinamento, etc.

DIAGNÓSTICO

O diagnóstico de anemia pode ser feito através de uma anamnese (história


do paciente e da sua queixa principal) bem colhida e um exame físico acurado.
Contudo, para determinar a etiologia da síndrome anêmica, podemos fazer uso de
exames complementares.

O protocolo inicial para investigação das anemias constitui-se de:

• Hemograma completo;
• Contagem de reticulócitos;
• Ferrocinética (para avaliar a absorção de ferro);
• Dosagem de uréia/ creatina (para avaliação da função renal);
• Bilirrubinas (a fim de avaliar se há aumento da hemólise);
• LDH;
• Albumina e globulinas;
• Exame Parasitológico de Fezes (EPF) e Pesquisa de Sangue Oculto;
• EAS (elementos anormais no segmento da urina);
• Hepatoglobinas.

Para nosso estudo, interessa analisarmos os achados do hemograma, bem


como os Índices Hematimétricos obtidos a partir da amostra de sangue. Este
conteúdo será mais detalhado a seguir.

Hemograma

O hemograma contempla diversas provas efetuadas com a finalidade de


avaliar quantitativa e qualitativamente os componentes celulares do sangue. Os
itens avaliados incluem: hemácias, hemoglobina, hematócrito, índices
hematimétricos, leucócitos totais, contagem diferencial de leucócitos, plaquetas e
exame microscópico de esfregaço de sangue corado.
132

O sangue é colhido com anticoagulante (EDTA), para se evitar a


coagulação do mesmo. Não há necessidade de colher o sangue com o indivíduo
em jejum.

Contagem de Eritrócitos

A contagem de hemácias é a primeira informação fornecida e é expressa


em milhões por mm3. A contagem dos eritrócitos é feita através de contadores
eletrônicos, ou microscópio em câmara de Neubauer, com acurada diluição
interna do sangue.

Valores de referência:

• Homens adultos: 4,6 a 6,2 milhões de hemácias/ mm3 de sangue


venoso
• Mulheres adultas: 4,2 a 5,4 milhões de hemácias/ mm3sangue venoso
• Crianças: 3,8 a 5,5 milhões de hemácias/ mm3de sangue venoso
• Bebês a termo: 4,4 a 5,8 milhões de hemácias/ mm3de sangue capilar
ao nascimento, diminuindo para 3,8 milhões de hemácias/ml na idade
de 2 meses, e aumentando lentamente daí em diante.

Os níveis de hemácias iguais ou maiores que 6,20 milhões/mm3 em


homens e iguais ou maiores que 5,70 milhões/mm3 em mulheres são
considerados poliglobulia.

Dosagem de Hemoglobina

A concentração de hemoglobina é expressa em g/dL, e sua avaliação é de


grande importância pelo papel no transporte de oxigênio e por estar diretamente
relacionada à anemia, sendo sua melhor forma de avaliação laboratorial.

A concentração de hemoglobina correlaciona-se estreitamente com a


contagem de hemácias.

Valores de referência:

• Recém-nascidos: 14 a 20 g/dl
• 1 semana de idade: 15 a 23 g/dl
• 6 meses de idade: 11 a 14 g/dl
• Crianças de 6 meses a 18 anos: 12 a 16 g/dl
• Homens: 14 a 18 g/dl
• Mulheres: 12 a 16 g/dl.

Baixas concentrações de hemoglobina podem indicar anemia, hemorragia


recente ou retenção de líquido causando hemodiluição. Hemoglobina elevada
sugere hemoconcentração, originária de policitemia ou desidratação.
133

Hematócrito

O volume relativo das hemácias dentro do volume de sangue é fornecido


pela análise do hematócrito, que é expresso percentualmente. Por exemplo, 40%
de Ht indica 40 ml de hemácias contidas em uma amostra de 100ml. Essa
concentração é obtida centrifugando-se o sangue total anti-coagulado em um tubo
capilar, de forma que as hemácias sejam firmemente concentradas sem hemólise.

Valores de referência:

• Recém-nascidos: 42% a 60% de Ht


• 1 semana de idade: 47% a 65% de Ht
• 6 meses de idade: 33% a 39% de Ht
• Crianças de 6 meses a 18 anos: 35% a 45% de Ht
• Homens: 42% a 54% de Ht
• Mulheres: 36% a 46% de Ht.

Um hematócrito baixo sugere anemia, hemodiluição ou uma perda maciça


de sangue. Um hematócrito alto indica policitemia ou hemoconcentração devido à
perda sangüínea ou desidratação.

Contagem de Leucócitos

A contagem global e diferencial de leucócitos e suas alterações


quantitativas e qualitativas são as principais informações fornecidas na análise da
série branca. Os leucócitos totais são expressos em mil/mm3. A contagem
diferencial é de grande importância, podendo definir perfis patológicos, e é
fornecida pela análise conjunta dos equipamentos automatizados e pela leitura do
esfregaço corado, que avalia as diferentes formas leucocitárias e as expressa de
forma percentualmente (relativa) e em mm3 (absoluta). A análise das alterações
morfológicas dos leucócitos também é realizada por observação microscópica do
esfregaço corado.

A contagem de leucócitos varia de 4.000 a 10.000/ mm3.

Uma contagem elevada de leucócitos (leucocitose) com freqüência


assinala uma infecção, como, por exemplo, um abscesso, meningite, apendicite
ou amigdalite. Uma contagem alta de leucócitos pode também resultar de
leucemia e necrose tecidual devido à queimaduras, infarto do miocárdio ou
gangrena.

Uma contagem diminuída de leucócitos (leucopenia) indica depressão da


medula óssea, que pode resultar de infecções virais ou de reações tóxicas, como,
por exemplo, as que acompanham o tratamento com antineoplásicos, ingestão de
mercúrio ou outros metais pesados, ou exposição ao benzeno ou arsênicos. A
leucopenia caracteristicamente acompanha influenza, febre tifóide, sarampo,
hepatite infecciosa, mononucleose e rubéola.
134

Os leucócitos podem ser divididos em granulócitos (mielócito,


metamielócito, bastão, neutrófilos, eosinófilos e basófilos), monócitos e linfócitos.

O diferencial de leucócitos é usado para avaliar a distribuição e morfologia


dos glóbulos brancos, fornecendo informação mais específica sobre o sistema
imune do paciente do que a contagem de leucócitos isoladamente.

Na contagem diferencial dos linfócitos, estes são classificados de acordo


com os cinco tipos principais – neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e
monócitos – sendo determinada a porcentagem de cada tipo. A contagem
diferencial é o valor percentual de cada tipo de glóbulo branco no sangue. O
número absoluto de cada tipo de glóbulo branco é obtido por meio da
multiplicação do valor percentual de cada tipo pela contagem total de glóbulos
brancos.

• Basófilos: 0 a 200/ml; 0 a 2%
• Eosinófilos: 40 a 500/ml; 1 a 5%
• Linfócitos: 880 a 4.000/ml; 22 a 40%
• Monócitos: 120 a 1.000/ml; 3 a 10%
• Neutrófilos: 1.800 a 7.500/ml; 45 a 75%.

Para crianças, os valores absolutos e porcentagens normais podem diferir.

• Basófilos: 0 a 2%
• Eosinófilos: 1 a 5%
• Linfócitos: 45 a 75%
• Monócitos: 3 a 10%
• Neutrófilos: 22 a 40%.

Contagem de Plaquetas

A avaliação das plaquetas pode ser feita de forma quantitativa, expressa


em mm3, e de modo qualitativo, pela avaliação das características analisadas no
esfregaço corado, o que permite a identificação de alterações morfológicas das
plaquetas.

A contagem de plaquetas é o mais importante teste de rastreamento da


função plaquetária. A utilização de equipamentos automatizados, além de
fornecer contagens mais precisas, permite que se obtenham informações em
relação à presença de anisocitose e grumos plaquetários, e também de índices
plaquetários, que, em sua maioria, ainda não estão liberados para uso clínico.

As alterações quantitativas podem ser tanto o aumento da quantidade de


plaquetas, chamada hiperplaquetemia (ou trombocitose), quanto a diminuição,
denominada plaquetopenia (ou trombocitopenia).

Valores de referência:

• Adultos: 150-450 mil/mm3


135

• Crianças: 150-550 mil/mm3

Uma contagem diminuída de plaquetas (trombocitopenia) pode resultar de


medula óssea aplástica ou hipoplástica; uma doença infiltrativa de medula óssea,
como, por exemplo, carcinoma ou leucemia; hipoplasia megacariocítica;
trombopoiese infecciosa proveniente de deficiência de ácido fólico ou vitamina
B12; acúmulo de plaquetas em um baço aumentado; destruição aumentada de
plaquetas devido à drogas ou desordens imunes; coagulação intravascular
disseminada; síndrome de Bernard-Soulier; ou lesões mecânicas às plaquetas.

Uma contagem aumentada de plaquetas (trombocitose) pode resultar de


hemorragias, desordens infecciosas; câncer; anemia por deficiência de ferro;
cirurgia recente, gravidez, ou esplenectomia e desordens inflamatórias. Em tais
casos, a contagem de plaquetas retorna ao normal após o paciente recuperar-se
da desordem primária. Todavia, a contagem permanece elevada em
trombocitemia primária, mielofibrose com metaplasia mielóide, policitemia vera e
leucemia mielóide crônica. Em tais desordens, as plaquetas podem estar
disfuncionais, resultando em sangramento.

ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS

A relação entre os achados da contagem de hemácias, dosagem de


hemoglobina e hematócrito pode ser obtida pela análise dos índices
hematimétricos. Estes irão fornecer informações adicionais sobre variações de
volume e concentração da hemoglobina. Os achados morfológicos do esfregaço
corado fornecem mais informações sobre conteúdo da hemoglobina, forma,
tamanho e inclusões eritrocitárias.

Velocidade de Hemossedimentação

Este índice é um dado complementar ao Hemograma completo. A


velocidade de hemossedimentação (VHS) reflete o resultado entre as forças
envolvidas no movimento de sedimentação das hemácias e os mecanismos
oponentes exercidos por substâncias plasmáticas, principalmente o fibrinogênio e
as proteínas de fase aguda.

A capacidade de agregação das hemácias depende de fatores ligados às


mesmas, como a força de coesão entre as hemácias e sua carga elétrica, que
tem uma força repulsiva que mantém as hemácias afastadas em condições
normais, e fatores plasmáticos que têm como função atenuar o efeito das forças
repulsivas.

A presença de processos inflamatórios leva a uma agregação maior das


hemácias, formando agregados conhecidos como rouleaux. Esse fenômeno
favorece o aumento da velocidade de sedimentação das hemácias.

O aumento da concentração plasmática de imunoglobulinas e fibrinogênio


leva a uma diminuição da força repulsiva entre as hemácias, facilitando a
136

agregação e aumentando portanto a VHS. A presença de proteínas anômalas,


como no mieloma, de hemácias alteradas em número, forma ou tamanho e o uso
de medicamentos podem levar a uma alteração da VHS, mesmo na ausência de
resposta de fase aguda. As principais alterações que podem levar a um aumento
significativo da VHS (=100mm na 1a hora) são processos infecciosos, doenças do
tecido conjuntivo, neoplasias e doenças renais.

A velocidade de hemossedimentação (VHS) é um indicador não-específico


de infecção e lesão tecidual. É útil para monitorar inflamação crônica, inclusive a
atividade da doença como na artrite reumatóide. A VHS é mais útil do que a
proteína C reativa para o diagnóstico e a monitorização da polimialgia reumática e
a artrite de células gigantes, em que se encontra freqüentemente elevada durante
a recaída. Homens entre 45-64 anos com VHS no limite superior têm duas vezes
mais risco de morte de doença coronária do que os homens com VHS na faixa
inferior, depois de ajustar outros fatores de risco.

O método tem alta sensibilidade com baixa especificidade, o que leva a


alterações em inúmeras situações patológicas e em algumas situações
fisiológicas como período menstrual, gravidez, temperatura, sexo e idade.

ALTERAÇÕES DA VELOCIDADE DE HEMOSSIMENTAÇÃO


ELEVADA DIMINUÍDA
Infecções bacterianas Policitemia
Hepatite aguda, hepatopatia crônica Hemonoglobinopatia
Pancreatites, colites e ilites, peritonite Esferocitose
Processos inflamatórios agudos e crônicos Alterações da forma das hemácias
Febre reumática Microcitose
Lúpus eritematoso sistêmico Hipofibrinogenemia
Artrite reumatóide Insuficiência cardíaca
Vasculites e dermatomiosites Cardiopatia congênita
Anemias graves Desnutrição grave
Leucemias e linfomas Lesões hepáticas graves
Metástases Uso de antiflamatórios
Síndrome nefrótica, glomerulonefrite aguda, pielonefrite
Tireoidites
Mieloma, crioglobulimia e macroglobulinemia
Necrose tecidual (cirurgias, queimaduras, quimioterapia
e radioterpia)
Uso de heparina

Volume Corpuscular Médio (VCM)

Avalia a média do tamanho (volume) das hemácias, que podem estar em seu
tamanho normal, quando são ditas normocíticas, diminuídas (microcíticas) ou
aumentadas (macrocíticas).

Onde, Ht = hematócrito (L/L); e Hm = número de hemácias


x 1012/L. O resultado é dado em fentolitros (fL) = 10-15L .
137

Valor de referência para >12anos: 80 a 98 fL.

ALTERAÇÃO ADULTOS CRIANÇAS CRIANÇAS DE 4


DE TAMANHO ATÉ 3 ANOS A 14 ANOS

NORMOCITOSE 80,0 73,0 73,0


MICROCITOSE <ou = 80 <ou= 71,0 <ou= 73,0
MICROCITOSE 79 a 79,9 71 a 72,9 73 a 74,9
DISCRETA
MICROCITOSE < 60 < 60 < 60
ACENTUADA
MACROCITOSE > 98 > 99 > 99
MACROCITOSE >120 > 120 > 120
ACENTUADA
ANISOCITOSE Presença de hemácias de volumes diferentes

Hemoglobina Corpuscular Média (HCM)

Índice hematimétrico que corresponde à média de hemoglobina por


eritrócito ou seja, a quantidade, em peso, de hemoglobina contida em cada célula.
Pode estar elevado na presença de macrocitose e diminuído na presença de
hemácias microcíticas.

Onde, Hb = hemoglobina (g/L) e Hm = número de hemácias


x 1012/L. O valor é dado em picogramas (pg)= 10-12g.

Valor de referência para >12anos: 27 a 31 pg.

Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM)

É a avaliação da hemoglobina encontrada em 100 mL de hemácias, ou


seja, é a relação do peso da hemoglobina para o volume do eritrócito que a
contém. Esse índice permite a avaliação do grau de saturação de hemoglobina no
eritrócito. A saturação da hemoglobina normal indica a presença de hemácias
ditas normocrômicas. Quando diminuída, teremos hemácias denominadas
hipocrômicas e, quando aumentadas, hemácias hipercrômicas.

Onde, Hb = hemoglobina (g/dL) e Ht = hematócrito (dl/dl). A


unidade de medica é g/dl ou g%.

Valor de referência: 32 a 36 g%.

Tendo em vista os conceitos expostos acima, podemos reescrever a


classificação de anemias quanto à morfologia vista no início do capítulo,
relacionando-as com as etiologias associadas (ver também Quadro 3).
138

• Microcítico-hipocrômicas: eritrócitos de pequeno tamanho (VCM baixo)


e pouca concentração de hemoglobina (CHCM baixa), não
obrigatoriamente com baixo número de eritrócitos circulantes (eritrócitos
normais ou diminuídos);
• Normocítico-normocrômicas: tamanho dentro da média, concentração e
conteúdo de hemoglobina na média, normais, mas com pouco número
de eritrócitos circulantes (VCM normal, CHCM normal e HCM normal e
eritrócitos diminuídos, respectivamente);
• Macrocítica: glóbulos grandes (VCM alto), com concentração interna de
hemoglobina normal (CHCM normal), mas com conteúdo interno (peso)
de hemoglobina aumentado (HCM alta), também com baixo número de
glóbulos circulantes (eritrócitos diminuídos).

Quadro 3. Classificação das Anemias segundo Tamanho do Eritrócito e Etiologias


Associadas.

™ MICROCÍTICA:

¾ Ferroprivas:
ƒ Carência alimentar
ƒ Absorção inadequada
ƒ Aumento na demanda
ƒ Hemorragias
¾ Não ferroprivas:
ƒ Doenças crônicas
ƒ Talassemia / Esferocitose
ƒ Anemia Sideroblástica

™ MACROCÍTICA

¾ Deficiência de viamina B12:


ƒ Carência alimentar
ƒ Absorção deficiente
ƒ Aumento na demanda
ƒ Erros congênitos
¾ Deficiência de ácido Fólico:
ƒ Carência alimentar
ƒ Absorção deficiente
ƒ Aumento na demanda
ƒ Drogas (AZT, quimioterapia, álcool)
¾ Outras:
ƒ Síndrome Mielodisplásica
ƒ Adiser congênita
ƒ Eritroleucemia
ƒ Hipotireoidismo
ƒ Doença hepatica

™ NORMOCÍTICA:

¾ Anemias nutricionais: deficiência simultânea de Fe+2 e vitamina B12


¾ Anemias da insuficiência renal e da medula óssea
¾ Anemias hemolíticas
139

Autor(es):
Ana Carolina Soares Matos de Menezes

Referências Bibliográficas:

Modificado de:
• Oliveira, R. & Neto, A.: Anemias e Leucemias: conceitos básicos e
diagnósticos por técnicas laboratoriais. 1a Edição-2004
• Failace. R: HEMOGRAMA: manual de interpretação. 4a Edição-2003
140

Anexo II. Aula Prática 1 – Testes de Hemostasia

Provas de Hemostase e Coagulação

Hemostase: É o conjunto de fenômenos fisiológicos capaz de atuar em um vaso


para estancar uma hemorragia e reduzir a lesão vascular. Para que isso ocorra,
são acionados: a) o endotélio vascular e as plaquetas, levando à formação de uma
rolha plaquetária e à parada do sangramento – fenômeno chamado de Hemostase
Primária; b) as proteínas do plasma, através do mecanismo de Coagulação,
levando à formação de um coágulo de fibrina organizado que evita a retomada da
hemorragia – fenômeno chamado de Hemostase Secundária. Em seguida, ocorre
o processo de reparação tecidual, concomitante ao mecanismo de Fibrinólise.

Testes para Plaquetas e Vasos Sangüíneos

1. Tempo de Sangramento – Método de Duke:

Princípio: É a medida da duração de um sangramento quando se pratica com uma


lanceta uma incisão cutânea, cuja profundidade não ultrapasse 4 mm.

Material: Lanceta estéril descartável ou lanceta de Bensaude;


Álcool 70% ou álcool iodado;
Algodão;
Papel de filtro;
Cronômetro.

Método: Fazer a assepsia do lóbulo da orelha com álcool e deixar secar. Executar
a incisão de 3 a 4 mm de profundidade com a lanceta estéril. Deixar o sangue fluir
naturalmente (sem fazer pressão). Disparar o cronômetro junto com a incisão e
pará-lo quando o sangramento cessar. Absorver com papel de filtro a gota formada
a cada 15 segundos, sem tocar a ferida diretamente para não perturbar a formação
do tampão hemostático.

Interpretação:
• O valor normal é de 1 a 4 minutos.
• Tempos prolongados podem ser observados em: Trombocitopenia,
Trombastenia de Glanzmann, Trombocitopatias, Doença de von Willebrand,
Parahemofilia, Afibrinogenemia Congênita e Síndrome Fibrinolítica.
• Resultados normais são encontrados nas Hemofilias.

2. Prova do Laço ou Prova de Fragilidade Capilar – Prova de Rampel-Leede:

Princípio: A fragilidade capilar é testada pelo aumento da pressão intracapilar por


obstrução do fluxo venoso, aplicando-se um torniquete de borracha (garrote) ou
manguito do esfigmomanômetro no braço do paciente.
141

O número de petéquias formadas mostra a fragilidade capilar. O impedimento de


formação petequial em indivíduos depende da resistência da parede capilar e
também ocorre em função do número e funcionalidade das plaquetas.

Material: Torniquete de borracha (garrote) ou esfigmomanômetro;


Cronômetro.

Método: Verificar previamente se existem petéquias no braço do paciente. Colocar


o garrote no braço de forma que seja feita certa pressão. Se for utilizado o
esfigmomanômetro, aferir a pressão e mantê-la entre a máxima e a mínima
(pressão arterial média, dada pela média aritmética das pressões sistólica e
diastólica) durante 5 minutos. No fim, contar o número de petéquias que
aparecem.

Interpretação:
• Considerar a prova positiva quando houver formação de mais de seis petéquias
por área circular de 5 cm de diâmetro (ou 20-25 cm2).
• O aumento da fragilidade capilar pode ser observado na Trombocitopenia,
Trombastenia de Glanzmann, Trombocitopatias, Doença de von Willebrand,
Púrpura Henoch-Schonlein, Disproteinemias, Púrpura Senil, Diabetes Mellitus,
Hipertensão, Artrite Reumatóide e Escorbuto.
• O teste é de difícil interpretação e tende a ser de ajuda limitada, particularmente
na mulher, porque ela desenvolve petéquias mais facilmente.

Testes de Coagulação

1. Tempo de Ativação de Protrombina (T.A.P.) – Método de Quick:

Princípio: Este teste avalia a VIA EXTRÍNSECA da coagulação. A protrombina é


transformada em trombina na presença de tromboplastina. O teste consiste na
adição ao plasma de uma mistura de tromboplastina tecidual e cálcio, de modo
que o tempo de coagulação dependerá dos fatores I, II, X, V, e VII contidos no
plasma.

Material: Tubos de ensaio (10 x 75 mm);


Pipetas de escoamento total;
Banho-Maria a 37ºC;
Cronômetro.

Reagente: Plasma citratado na proporção adequada;


Suspensão de tromboplastina + Cloreto de Cálcio 0.02 M (segundo
Quick).

Método: Em um tubo de ensaio conservado em banho-maria a 37ºC, pipetar 0,1


mL de plasma, adicionar 0,2 mL de tromboplastina cálcica, agitar a mistura e,
simultaneamente, disparar o cronômetro para marcar o tempo de coagulação
(inclinando o tubo várias vezes).
142

Interpretação:
• O tempo de protrombina de um plasma normal humano é de 11,5 a 12,5 s
(segundo Quick), embora resultados com preparações comerciais variem de 12
a 15 segundos.
• Tempo de protrombina prolongado indica deficiência de um ou mais fatores: II,
X, V, e VII, ou presença de inibidores de coagulação.

2. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado ou Tempo de Cefalina (P.T.T.a.):

Princípio: Esta é uma prova que avalia a VIA INTRÍNSECA da coagulação.


Adiciona-se ao plasma tromboplastina parcial ou cefalina (que irá substituir o fator
plaquetário 3), e uma suspensão de ácido elágico (para ativar o fator XII),
medindo-se assim a atividade do sistema intrínseco em condições padronizadas.

Material: Tubos de Ensaio (10 x 75 mm);


Banho-Maria a 37ºC;
Cronômetro;
Pipetas de escoamento total.

Reagente: Plasma citratado;


Solução de CaCl2 0,02 M;
Suspensão de ácido elágico + Cefalina em solução fisiológica.

Método: Para um tubo de ensaio mantido a 37ºC, pipetar:

0,1 mL de Cefalina + 0,1mL de Misturar bem e deixar a 37ºC por 2 minutos.


Plasma
0,1 mL de CaCl2 0,02 M Agitar levemente. Acionar o cronômetro, colocar a
37ºC e deixar durante 30 segundos. A seguir
observar a cada
5 segundos a coagulação do plasma.

Interpretação:
• O PTTa para um plasma humano normal ativado é de 32 a 46 segundos.
• Tempos mais prolongados indicam deficiência de um ou mais fatores da via
intrínseca da coagulação (fatores XII, XI, IX, VIII, fator de Fitzgerald e fator de
Fletcher) e da via efetora (fatores X, V, II e I) de um modo global. Esta prova
só não mede o fator VII e o fator plaquetário 3 (FP3).
• É útil no controle pré-operatório. Serve para demonstrar deficiência de um dos
fatores anti-hemofílicos e serve também como controle da terapêutica
heparínica.

Obs1: Esta prova deve ser efetuada sempre em paralelo com um plasma normal.
Relação Paciente/Normal até 1/3 é considerada normal.

Obs2: Fator de Fitzgerald Î Cininogênio de Alto Peso molecular (HMWK);


Fator de Fletcher Î Pré-Calicreína.
143

Anexo III. Aula Prática 2 – Índices Hematimétricos e


Determinação de Grupo Sanguíneo

Valores Fundamentais da Série Vermelha – Índices Hematológicos

1. Determinação da Velocidade de Hemossedimentação (VHS) – Método de


Westergreen:

Fundamento:
No sangue colhido com anticoagulante, as hemácias em suspensão no plasma
tendem a sedimentar pela ação da gravidade. A velocidade de
hemossedimentação é expressa como a distância (em milímetros) da queda das
hemácias na unidade de tempo (usualmente uma hora). Concentrações elevadas
de alfa-2 globulinas, gama-globulinas e fibrinogênio provocam aumento da
velocidade porque facilitam a formação de aglomerados de hemácias (rouleaux).
Esta prova está aumentada nos processos inflamatórios agudos e crônicos: artrite
reumatóide, enfermidade do aparelho genital feminino, processos neoplásicos, etc.
Tem utilidade no acompanhamento de uma enfermidade e não como valor
diagnóstico. Na gravidez, após o 3º mês, o VHS encontra-se aumentado.

Material:
- Material de colheita de sangue;
- Anticoagulante: solução de Citrato de Sódio a 3,8% (p/v);
- Pipeta de Westergreen, graduada de 0 a 200 mm e diâmetro interno de 2,5 mm;
- Suporte apropriado.

Técnica:
- Colher sangue venoso com anticoagulante Citrato de Sódio a 3,8% na proporção
de uma parte de Citrato para quatro partes de sangue total;
- Homogeneizar e encher a pipeta de Westergreen até a marca zero;
- Colocar a pipeta no suporte adequado, de modo que permaneça na posição
vertical, e marcar o tempo;
- Proceder a leitura em milímetros após a 1ª hora.

Valores Normais
3 a 5 mm/1ª hora
Homens
Mulheres 4 a 7 mm/1ª hora
Crianças 4 a 7 mm/1ª hora
144

2. Determinação do Hematócrito (Ht) ou Volume Globular (VG):

Fundamento:
O Hematócrito é definido como o volume ocupado pelos eritrócitos em um dado
volume de sangue e é usualmente expresso em volume (mL) de eritrócitos por mL
de sangue ou volume (Litro) de eritrócitos por litro de sangue.

Material:
- Tubo de Wintrobe;
- Seringa munida de agulha longa;
- Frascos para colheita de sangue, contendo anticoagulante.

Técnica:

- Colher o sangue cuidadosamente para evitar hemólise;


- Verter para o vidro contendo o anticoagulante;
- Homogeneizar o sangue e encher o tubo de Wintrobe com seringa munida de
agulha longa;
- Centrifugar a 3000 rpm em uma centrífuga clínica de 15 cm de raio durante 30
minutos (1500 x g);
- Proceder a leitura do Hematócrito, desprezando a parte correspondente aos
glóbulos brancos e plaquetas.

Nota:
O valor do Hematócrito depende do número, da forma e do tamanho das hemácias
circulantes. Pode-se empregar também o Microhematócrito, que fornece
resultados mais rápidos (de 3 a 4 minutos) e utiliza menor quantidade de sangue
obtido por punção digital. Tem maiores aplicações em Pediatria e Medicina de
Urgência.

Valores Normais
Homens 40 a 54% ou 0,40 a 0,54 L/L
Mulheres 36 a 47% ou 0,36 a 0,47 L/L
Obs: Os recém-nascidos têm valores mais elevados que se reduzem na
, 1ª infância até atingirem os valores da idade adulta.

Interpretação:
- Valores elevados são encontrados na Poliglobulia genuína (Policitemia Vera),
onde há um aumento patológico do número de eritrócitos, e nas Poliglobulias
Falsas, onde há hemoconcentração causada por diminuição do volume plasmático
por perdas aquosas importantes (desidratações, choque e queimaduras).
- Valores diminuídos são encontrados nas anemias, que têm diminuição do
número de eritrócitos, e em condições associadas a Hidremia (descompensação
cardíaca, gravidez e administração excessiva de fluidos).
145

3. Dosagem da Hemoglobina no sangue integral pelo Método da


Cianometemoglobina [Van Kampen, E.J. and Zijlstra, W.G. Clin Clin – Acta
6:538 (1961)]:

Fundamento:
Baseia-se na oxidação da Hemoglobina à Metemoglobina pelo Ferricianeto de
Potássio e subsequente reação com o Cianeto de Potássio originando
Cianometemoglobina, derivado estável que tem o máximo de absorção em 546 nm
(filtro verde).

Material:
- Solução de Drabkin;
- Padrão de Cianometemoglobina correspondendo a concentrações de 14 g/dL de
Hb;
- Pipeta automática de 20 μL;
- Espectrofotômetro ou Fotocolorímetro;
- Sangue colhido com anticoagulante.

Técnica:
- Pipetar 5 mL de Solução de Drabkin para um tubo de ensaio;
- Pipetar 20 μL de sangue para o tubo acima, tendo o cuidado de lavar a pipeta 3
vezes com a solução;
- Homogeneizar bem e aguardar 3 minutos;
- Medir a extinção da amostra em 546 nm (filtro verde) contra branco (H2O
destilada).

Cálculos:
A concentração de Hemoglobina (Hb) pode ser obtida:
- Através da curva padrão de Cianometemoglobina;
- Através da tabela que acompanha a técnica;
- Utilizando um fator.

Valores Normais
Homens 14,0 a 18,0 g/100mL ou g/dL
Mulheres 12,0 a 16,0 g/100mL ou g/dL

4. Contagem de Eritrócitos:

Fundamento:
A enumeração dos eritrócitos pode ser feita pelo método clássico - Contagem em
Câmara por Método Opaciométrico (fotoelétrico) - ou por método eletrônico.

Técnica:
Pipetar o sangue e diluir de 1:200 com solução salina tamponada. O sangue
diluído é colocado na câmara e contado com o auxílio do microscópio.
146

Valores Normais
Homens 4,5 a 6,3 x 1012/Litro
Mulheres 4,2 a 5,5 x 1012/Litro

5. Índices Hematológicos:

Os valores de contagem de eritrócitos (Hm), concentração de Hemoglobina (Hb) e


Hematócrito (Ht) podem ser usados para a obtenção dos Índices Hematológicos
que definem o tamanho e o conteúdo de Hemoglobina dos eritrócitos.

a) Volume Corpuscular Médio:

Indica o volume de um eritrócito médio de uma dada amostra de sangue em


fentolitros (fL) – 10-15 Litro.

VCM = Ht (L/L) em fl ou μ3
Hm x 1012/L

Ex: Ht = 45% = 0,45 L/L VCM = 0,45 = 83 x 10-15L = 83


fL
Hm = 5,4 milhões/mm3 = 5,4 x 1012/L 5,4 x 1012

Valores Normais
Normocítico Entre 83 e 96 Fl
Macrocítico >96 fL
Microcítico <83 fL

b) Hemoglobina Corpuscular Média:

Indica o peso de Hemoglobina em um eritrócito médio de uma dada amostra


de sangue em picograma (pg) – 10-12 g.

HCM = Hb (g/L) em pg
Hm x 1012/L

Ex: Hb = 15 g/dL = 150 g/L HCM = 150 = 30 x 10-12 g =


30 pg
Hm = 5,0 milhões/mm3 = 5 x 1012/L 5 x 1012
147

Valor Normal
Entre 28 e 32 pg

c) Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média:

Indica a concentração de Hemoglobina na média de eritrócitos, isto é, a relação


entre o peso de Hemoglobina para o volume de eritrócitos que a contém em
grama/decilitros (g/dL).

CHCM = Hb (g/dL) em g/dL ou g%


Ht (dL/dL)

Ex: Hb = 15 g/dL CHCM = 15 = 33,33 g/dL


Ht = 0,45 dL/dL 0,45

Valores Normais
Normocrômica Entre 32 e 36 g/dL
Hipocrômica <32 g/dL
Hipercrômica >32 g/dL

6. Exercício:

Determinar os Índices Hematológicos e classificar morfologicamente o tipo de


anemia dos
pacientes abaixo segundo seus eritrogramas.

Paciente Ht Hb Hm x 1012/L VCM HCM CHCM Tipo de


(%) (g/dL) (fl) (pg) (g/dL) Anemia
A 40 13,5 4,5
B 40 11,5 4,5
C 32 10,5 4,5
D 25 7,5 2,2
E 25 5,0 2,2
148

Determinação do Tipo Sangüíneo

1. Classificação pelo sistema AB0:

A tipagem AB0 deve ser feita pelo método chamado Classificação direta, que diz
respeito à pesquisa de antígenos AB0 nas hemácias.

Técnica de Classificação Direta em Lâmina:

1) Marcar lâminas de microscópio com “anti-A”, “anti-B” e “anti-AB”.


2) Colocar uma gota de soro anti-A na lâmina marcada “anti-A”, uma de soro anti-B
na lâmina marcada “anti-B” e uma de soro anti-AB na lâmina marcada “anti-AB”.
3) Para cada gota de anti-soro, colocar pequena quantidade de sangue total (cerca
de metade da quantidade do soro).
4) Misturar as células e o anti-soro com palito de madeira de modo circular,
cobrindo uma área de aproximadamente 1,5 a 2,0 cm de diâmetro.
5) Inclinar a lâmina com movimentos circulares e suaves. Observe o aparecimento
de AGLUTINAÇÃO.
6) O tempo máximo para se observar a lâmina deve ser de 2 minutos.

Obs: O teste deve ser realizado à temperatura ambiente e nunca em placa


aquecida.

2. Classificação Rh (D):

A classificação de antígeno Rh (D) é feita testando-se hemácias com soro anti-Rh


(D). Rotineiramente utiliza-se o soro Rh (D) bloqueador, também chamado de soro
de técnica em lâmina. Em situações especiais pode-se utilizar o soro anti-Rh ou
anti-D salino.

Técnica de Classificação Direta:

1) Marcar uma lâmina com “anti-Rh”.


2) Colocar uma gota de soro Anti-Rh (D) na lâmina marcada “anti-Rh”.
3) Adicionar uma pequena quantidade de sangue numa proporção de
aproximadamente metade da quantidade de anti-soro.
4) Misturar as células e o anti-soro com um palito de madeira com movimentos
circulares e suaves.
5) Observar o aparecimento de AGLUTINAÇÃO. O tempo máximo para
observação é de 2 minutos.