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Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

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BIOLOGIA CELULAR

AULAS PRÁTICAS

1º ANO
2010/2011

Protocolos Práticos

Biologia Celular

SEGURANÇA EM L ABORATÓRIO
1. INTRODUÇÃO
Embora todo o trabalho efectuado no laboratório de Biologia seja potencialmente perigoso, e as pessoas que nele trabalham estejam sujeitas a numerosos riscos e perigos, é importante ter a noção de que a grande a maioria doa acidentes que ocorrem em laboratório não se devem a procedimentos que são tecnicamente perigosos em si mesmos mas a faltas de atenção e cuidado com o que se está a fazer. É muito importante ter a noção de que a falta de atenção com o trabalho no laboratório poderá muito provavelmente resultar, não só em fracos resultados experimentais, mas também em possíveis acidentes. O trabalho em laboratório envolve uma grande diversidade de riscos, sendo necessário um conhecimento sério e aprofundado dos materiais, técnicas e equipamentos utilizados assim como dos riscos que envolvem e atitudes a adoptar de forma a minimizá-los. O objectivo desta aula é o de alertar e familiarizar os alunos com os principais perigos e riscos associados com o trabalho no laboratório de Biologia, assim como com a forma de os reduzir ao mínimo através da utilização de boas práticas de trabalho que permitam a realização de um bom trabalho de forma segura.

2. ATITUDE A ADOPTAR NO LABORATÓRIO
DSer responsável. D Planear sempre o trabalho a realizar, conhecer bem todos os procedimentos

e estar consciente dos potenciais riscos associados, e adoptar as atitudes adequadas de modo a evitá -los.

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Protocolos Práticos

Biologia Celular

3. REGRAS DE SEGURANÇA
D Não é permitido comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos no laboratório.

Manter os dedos, lápis e outros materiais afastados da boca e face.
D Dentro do laboratório deve usar sempre uma bata, de forma a proteger -se a

si próprio e o seu vestiário de contaminações acidentais com culturas, corantes ou outros produtos químicos.
D Usar luvas apropriadas sempre que se manipulam produtos potencialmente

perigosos; as luvas deverão ser substituídas sempre que contaminadas ou danificadas; deverão ser retiradas no fim do trabalho ou sempre que este for interrompido, de modo a evitar a contaminação de objectos do laboratório ou fora dele, como as maçanetas das portas, interrupto res, telefones, etc.
D No início de cada aula, proceder à desinfecção da área de trabalho,

utilizando um desinfectante impregnado em papel absorvente. Este procedimento deve ser repetido no final do trabalho laboratorial.
D Manter perto da área laboratoria l somente o material estritamente necessário

(papel e lápis) para registo das observações. Conservar sempre a bancada limpa e arrumada.
D No início e no fim de cada aula lavar as mãos com um antisséptico. Proceder

da mesma forma sempre que suspeite ter contactado com materiais contaminados.
D Para pipetar, utilizar sempre um dispositivo de pipetagem. A pipetagem à boca é proibida. D Mudar de luvas e lavar as mãos sempre que haja contaminação evidente

com o produto derramado.
D Conhecer a localização e funcionamento dos sistemas de segurança

(telefone, saídas de emergência, extintores, chuveiros).
D Colocar todo o material utilizado durante o trabalho nos locais apropriados:

Material reutilizável: Em contentores apropriados para posterior lavagem e tratamento; material contendo substâncias potencialmente perigosas deverá ser previamente tratado de forma apropriada.
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Protocolos Práticos Material não reutilizável:

Biologia Celular

- Vidro e metal cortante (lâminas de bisturi, agulhas de seringa): em lixo próprio devidamente rotulado. - Material contaminado com produtos biológicos: Em lixo próprio para autoclavar/incinerar. - Substâncias químicas perigosas: em locais apropriados, de acordo com o composto em questão e em contentores devidamente rotulados. - Não despejar nos canos qualquer material perigoso/infeccioso.
D Todos os materiais para guardar ou incubar deverão ser devidamente

rotulados, com indicação de conteúdo, nome do utilizador e data.

RISCOS ASSOCIADOS AO TRABALHO DE LABORATÓRIO E PRECAUÇÕES A TOMAR:

4. PRINCIPAIS

4.1 Equipamento de vidro

Riscos: O material de vidro é o mais utilizado no laboratório, e a fonte mais comum de acidentes, resultantes de cortes provocados por vidro partido, incluindo: - cortes provocados pela introdução de tubos de plástico em tubos ou pipetas de vidro - cortes provocados por vidro partido e outros materiais cortantes colocados de forma imprópria em contentores de lixo normal Precauções: - Antes de usar, inspeccionar o material de vidro de forma a garantir que se encontra em perfeitas condições ± sem quebras, falhas ou rachas. - Colocar o vidro partido e os materiais de vidro não reutilizáveis (por ex. Pipetas) em contentores de lixo próprios. Não utilizar os contentores de
lixo geral. Recolher vidros partidos imediatamente e de forma muito

cuidadosa. - Não guardar ou deixar material de vidro na beira de bancadas ou prateleiras.
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Protocolos Práticos

Biologia Celular

- Cuidado com o vidro quente. Colocar num local em que não possa ser acidentalmente tocado até arrefecer.

4.2 Equipamento eléctrico

Não utilizar fichas e tomadas partidas ou danificadas.

4.3 Equipamento de aquecimento: Bicos de Bunsen, placas e banhos de aquecimento

Riscos: Queimaduras provocadas por superfícies e líquidos quentes, vapores ou chamas. Precauções: - Todos os aparelhos de aquecimento (com excepção dos banhos) deverão ser mantidos afastados de materiais e substâncias inflamáveis. - Os bicos de Bunsen nunca deverão ser usados perto de contentores abertos de líquidos inflamáveis, nem em ambientes onde estejam presentes concentrações apreciáveis de vapores inflamáveis. - A chama poderá não ser visível em condições de luz muito intensa. Nunca deixar uma chama acesa sem vigilância. - O vapor dos banhos de aquecimento poderá provocar queimaduras. Ter atenção, especialmente quando se abrem as tampas de banhos a temperaturas elevadas.

4.4 Fontes de luz ultravioleta

Riscos: Queimaduras e danos graves na pele e nos olhos. Precauções - Utilizar protecção adequada para os olhos ± óculos ou máscaras de material opaco aos raios UV.
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Símbolo de E plosão ³E´: E plosivo Símbolo ³ ´ em chamas ³ ´: idante ¦¢ ¥ ¤£ ¢ ¡    i l l -5- P t ¨ § ©¦ ¨   §   ¦ l P ti . ³F+´: E tremamente inflamável Subst ncias que usam o símbolo do fogo: subst ncias inflamáveis. que se especificam em seguida: Riscos físicos Riscos para a saúde Riscos Físicos As subst ncias químicas que representam riscos físicos são geralmente identificadas pela presença. odas estas subst ncias apresentam um risco elevado de provocar incêndio no laboratório. dos seguintes símbolos e letras. que se relacionam com as propriedades das subst ncias: Símbolo do Fogo ³F´: uito inflamável.5 Rel ti manual E ente i t m equi ent utili no l orat rio. combustíveis ou piróforas. tendo especial e instruções atenção aos riscos associados e ao modo de os utili ar de modo a arantir a segurança e a manutenção dos aparel os em om estado. 5.Bi l 4. nos rótulos. ler empre o ui adosamente antes de os utili ar. SE Q Í I s riscos associados manipulação e utili ação de subst ncias químicas são essencialmente de dois tipos.

irritantes corrosivos) . o que pode ocorrer. mesmo em doses reduzidas. Provocam reacção alérgica cut nea ou respiratória. óxicos ³ ) / uito tóxicos . s produtos perigosos para a saúde. irritar ou atacar destrutivamente os tecidos vivos. ICAÇÃO OS P ODUTOS QUÍ ICOS PRI CIPAIS TIPOS DE RISCOS PARA A SAÚDE CLASSI DE ACORDO orrosivos ³ ´ Podem queimar. para as subst ncias químicas. Prejudiciais ³Xn´)/Irritantes ³Xi´) Por contacto causam vermelhidão ou inchaço da pele ou olhos.venenos ³ +´) danos menores danos menores que produtos Sensibili antes morte ou danos muito graves.Bi l Riscos para a Saúde ma subst ncia química considerada nociva para a saúde quando existem evidências de que pode provocar efeitos nocivos. crónicos ou agudos. apenas representam um risco quando entram em contacto com o organismo. em pessoas ou animais expostos a esse produto. por três vias: Inalação Absorção pela pele ou entrada através de feridas Ingestão s efeitos provocados pelas subst ncias químicas no organismo relacionam-se com a sua toxicidade capacidade de uma subst ncia causar um efeito nocivo) e com a dose quantidade) a que o organismo é exposto.       i l l COM OS      P t l P ti ausam a -6- . mas não causam danos tecidulares permanentes prejudiciais que produtos tóxicos.

Activar o sistema de alarme e ligar o 112 . 6. 6. Nunca deverão ser utilizados antes de adquiridos esses conhecimentos. de forma calma e ordenada . à medida que se abandonam as salas -7- . aparelhos eléctricos e outras possíveis fontes de ignição de forma cuidadosa 6.Trabalhar com produtos inflamáveis em hotes .Protocolos Práticos Carcinogéneos ± Podem provocar cancro.2 Medidas de emergência em caso de incêndio .1 Medidas de Prevenção . fontes de aquecimento. É essencial ter a noção da necessidade de evitar práticas perigosas no laboratório e dos perigos colocados por um fogo que atinge proporções descontroladas. extintores e mangueiras . podendo causar malformações congénitas ou morte do feto.Evacuar o edifício o mais rápido possível. Biologia Celular Teratogéneos ± Afectam o desenvolvimento embrionário normal. cuja utilização apresenta riscos específicos pelo que requer um conhecimento e preparação técnica especiais. desde que tal não ponha em risco a sua própria segurança .Conhecer a localização dos alarmes de incêndio.Ajudar qualquer pessoa que se encontre em perigo.Não usar os elevadores echar as portas e se possível as janelas. Radioactivos ± Estes produtos representam uma classe especial de produtos químicos.Utilizar fósforos. PREVENÇÃO DE INCÊNDIOS A prevenção de incêndios é tão importante como o desenvolvimento de meios de os combater.

seguir os seguintes procedimentos: .Remover lentes de contacto tão depressa quanto possível .2 Ingestão de produtos químicos .Lavar com água abundante no sentido do nariz para a orelha durante pelo menos 15 minutos .No caso de a área afectada cobrir uma extensão larga.Utilizar protecção adequada de modo a não ser também afectado Pele: .Ligar 112 -8- .1 ueimaduras químicas No caso de queimaduras provocadas pelo contacto de produtos químicos nocivos com a pele ou olhos.Não aplicar gorduras nas zonas afectadas .3 Inalação de produtos químicos .Ligar 112 .Abrir as pálpebras de modo a assegurar uma lavagem eficaz .Cobrir com um penso seco e estéril .Se a vítima estiver consciente e for capaz de engolir.Protocolos Práticos Biologia Celular 7. dar-lhe a beber água ou leite 7.Lavar a zona afectada com água abundante durante pe lo menos 15 minutos .Ligar 112 7. ligar 112 e pedir ajuda Olhos .Remover qualquer peça de roupa que cubra a zona afectada .Evacuar a área e mover a vítima para local arejado . PRIMEIROS SOCORROS 7.

reactividade. -9- . MSDS Todos os produtos químicos são acompanhados de um folheto denominado MSDS (Material Safety Data Sheet ). Qualquer pessoa que manuseie qualquer produto químico deverá ler o MSDS correspondente. detritos. primeiros socorros. Os MSDS acompanham sempre os produtos comercializados e deverão ser mantidos no laboratório de forma acessível a todos os que trabalhem com os produtos em questão. armazenamento. perigos para a saúde. elaborado de mo do a fornecer tanto a quem os utiliza como ao pessoal de emergência todas as informações referentes aos procedimentos adequados para a utilização e manuseamento do produto em questão. toxicidade. assim como em caso de acidente. Todas estas informações são essenciais para trabalhar em condições de segurança.Protocolos Práticos Biologia Celular 8. equipamento de protecção e procedimentos de emergência. de modo a familiarizar-se com os perigos e precauções que deverá ter ao utilizá -lo. Os MSDS incluem informações como propriedades físicas e químicas.

sistema objectiva . Por esta razão. al como é visível na Figura . a ampliação obtida é dada pelo produto da ampliação descrita na objectiva e da ampliação descrita na ocular. como é descrito no diagrama da Figura . .Bi l Aul MICROSCÓPIO ÓPTICO I TRODUÇÃO limite inferior para o olho humano distinguir dois objectos é da ordem dos 0. permite -nos visualizar células com tamanhos na ordem de células na ordem dos 0 nm 0. ou de campo claro. uma vez que permitiu descobrir um novo mundo.ocular é responsável pela ampliação e projecção da luz que atravessa a amostra para o olho. microscópio óptico é composto por um sistema de lentes de vidro distribuído de modo a que a luz emitida pela fonte de luz se concentre no plano da amostra e depois seja de novo concentrada e ampliada de forma a ser visualizada no olho do observador. concentra a luz que vai incidir so bre esta. e distinguir detalhes nessas µm). por isto mesmo. . . mm. o microscópio óptico. situado após a fonte de luz e antes da amostra.Limi utili ação i rsos ti os mi roscópios &" % $# " ! i l l 46 48 6 46 7 46 543 ( ' )& ( 22 10 ' P t l P ti & . o condensador. µm 0 -6 m). Para tal. a revolução que o microscópio induziu na biologia.10 - @ 9 i ura . É compreensível. .

Verifica -se que. deixando de s er útil.3. ± Esquema e formação a imagem o microscópio óptico.Bi l Ampliação total = Ampliação da objectiva x Ampliação da ocular Fi ura .11 - U U T V T IAH PG IA AHA AG S R Q P t l P ti . era legítimo afirmar que a capacidade de aumento do microscópio óptico seria virtualmente infinita. a partir de determinados limites essa ampliação não é acompanhada por melhoria de resolução. o entanto. Este facto é compreensível com a introdução do conceito de resolução. i vertida e virtual Estando a ampliação total do microscópio dependente das ampliações parciais da objectiva e da ocular. apesar de teoricamente ser possível ampliar ma lente indefinidamente a imagem. pode ampliar uma imagem sem aumentar a sua resolução. a ampliação útil é na realidade na ordem das 000 X. Para melhor compreender este conceito observe a Figura . GC F ED C BA A i l l . A imagem observada ampliada.

Bi l Figura .N .N.d. é a abertura numérica definida pela equação.N .12 - cY b a` Y XW W i l l h eWd fc eW WdW Wc g P t l P ti .o.61 v P A. ! N ™ sen U . A. em que P é o comprimento de onda c.Efeito da ampliação e da resolução a imagem obtida É possível calcular o limite de resolução r) de um microscópio recorrendo equação.3 .) da luz incidente e A. r! 0.

e para a maior abertura numérica teórica 60 nm. cujo c.Principais constituintes do microscópio óptico q t sr q pi i i Protocolos Práticos l l r w v x u .Bi l com N o índice de refracção do meio compreendido entre a amostra e a objectiva e U o semi-ângulo de abertura do cone luminoso que após passar pela amostra atinge a objectiva Figura . máximo é de 0 nm para um c. ) o limite de resolução seria de cerca de .3 ficando o limite de 0 nm.o. ).d. o valor de A.5 .4).13 - .N. Figura .4 . varia entre 400 nm e 700 nm.Representação gráfica do significado dos parâmetrosN e U para o cálculo da Abertura u m rica Assim para a luz visível. a prática. de resolução com o valor de Para aprender a trabalhar com o microscópio convém saber a localização e nome dos seus principais constituintes Figura . . Figura .o.d.

sobre a preparação. rodar a objectiva de 40X e.7). utilizando o parafuso micrométrico. Figura . Focar.14 - .Efeito da adição do óleo de imersão sobre a dispersão da luz y ‚ € y Protocolos Práticos Biologi l l r ƒ . colocar uma gota de óleo de imersão. focar com a om o auxílio do parafuso micrométrico podem-se obter se uma maior resolução na observação da amostra Figura . já com a objectiva de 00X.7 . puxar a platina para baixo até obter uma imagem nítida da amostra D epois da amostra estar focada com a objectiva de objectiva de 40X. O uso de óleo de imersão umérica por influenciar o valor de N obtendomelhora o valor da Abertura 0X. diferentes planos das estruturas a observar DSe pretender utilizar a objectiva de 00X.PARTE EXPERIME TAL Observações microscópicas DLigar a fonte luminosa D olocar a amostra na platina lamela para cima) D om o auxílio do condensador e do diafragma obter uma boa iluminação Subir o condensador para a objectiva de imersão em óleo ou baixar para objectivas de baixa ampliação) DRodando o parafuso macrométrico aproximar a platina o mais perto possível da objectiva de 0X DRodando novamente o parafuso macrométrico.

y y y y . e saber utilizá -lo.). Compreender os factores que influenciam a ampliação e a resolução. Perceber a utilização do óleo de imersão. o.Protocolos Práticos Biologia Celular OBJECTIVOS: y Compreender o âmbito de aplicação da microscopia óptica (noção de escala microscópica). Conseguir nomear os principais constituintes do m. o.15 - . Saber descrever o funcionamento do microscópio óptico (m.

i.6. de cada objectiva.4 mm 4 0 Qm) da lâmina. DVerificar em que outro ponto do campo as escalas se sobrepõem igualmente. verifica -se que 80 divisões da ocular divisão = 4 0/80 = .6).. „ ‡ †… „ Protocolos Práticos Biologi l l r ‰ˆ . o exemplo da Figura .0).Aula 3 MEDIÇÃO COM OCULAR MICROMÉTRICA Medições em preparações microscópicas As observações em microscopia envolvem muitas vezes a medição do objecto de estudo.16 - . .e. DRodar a ocular micrométrica de modo a que as escalas da ocular e da lâmina fiquem paralelas e se sobreponham parcialmente ver Figura .6 correspondem a 0. D eslocar a lâmina para que o início da graduação das duas escalas se sobreponha 0 e 0. com auxílio de uma ocular micrométrica e uma lâmina graduada.Representação esquemática da calibração DColocar a ocular micrométrica em posição no tubo do microscópio e instalar a lâmina graduada na platina do microscópio. Calibração (mm) Figura . A medição pode ser realizada após calibração.

6. 5. DPara a medição de um objecto desconhecido. Qm.Protocolos Práticos Biologia Celular Qm. por ex. recorrendo a uma ocular micrométrica e lâmina graduada.17 - . Este valor só é válido para a objectiva utilizada. nm. o. e multiplica-se pelo valor micrométrico previamente determinado. y . determina -se primeiro o número de divisões. sendo pois necessário proceder à calibração para cada uma das outras objectivas. Saber converter as Unidades de medida (µm. obtendo -se a dimensão 22. Å). por ex. OBJECTIVOS: y Saber fazer medições ao m. .

cobrir com uma lamela e observar ao microscópio ver Figura . os pormenores relevantes e sempre que possível. coli que lhe foi fornecida sobre uma lâmina. com indicação da amostra observada.18 - . Cultura de Esc eric ia coli DColocar uma gota da cultura de E. ) ’ ‘  Protocolos Práticos Biologi el l r ”“ – • “ .Aula 4 DIVERSIDADE CELULAR PARTE EXPERIME MATERIAL Zaragatoa ou palito Pinça Bisturi Lâminas e lamelas Soro fisiológico Solução de azul de metileno Esc eric i coli S cc aromyces cerevisiae Bolbo de cebola Folha de Elodea TAL otas importantes: y Antes de efectuar cada preparação limpe bem a lâmina e a lamela com álcool y Para cada desenho a efectuar não se esqueça de indicar: a) a ampliação com que observou a preparação b) a legenda. as dimensões PROCEDIME TO EXPERIME — — TAL 1.

primeiro com a objectiva de 0X. Lenta e cuidadosamente. Células de Sacc aromyces cerevisiae fermento de padeiro) DCom a ajuda de um palito colocar uma pequena amostra de S.19 - . 00 X até esta ficar na usar apenas o parafuso .Figura . ™ ˜ Protocolos Práticos Biologia el lar g e i d hh f .Recol a da epiderme do bolbo de cebola DColocar sob uma gota de soro fisiológico em cima de uma lâmina. rodar a objectiva de posição correcta e focar a preparação micrométrico e fazendo pequenos movimentos D esenhar o que observa. Epiderme interna da escama do bolbo da cebola Alli m cepa) DSeparar duas escamas carnudas que formam o bolbo da cebola e com a ajuda de uma pinça destacar um pequeno quadrado da epiderme interna que recobre a parte côncava que ficou a descoberto. . cerevisiae sobre uma lâmina. Figura . . 3. Juntar uma gota de soro fisiológico e misturar bem. Colocar uma lamela e observar DDesenhar o que observa com a objectiva de 00X. Observar ao microscópio.Colocação da lamela DComeçar por focar a preparação com a objectiva de 0 X e em seguida mudar para a objectiva de 40 X e voltar focar. Rodar o revólver no sentido da objectiva de 00 X e colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lamel a. Cobrir com uma lamela. Proceder como indicado na Figura .

Saber registar e legendar a observação realizada. Compreender os limites de resolução do microscópio óptico e do microscópio electrónico. Repetir o processo. Aplicar sobre uma gota de azul de metileno. Saber escolher a ampliação adequada ao objecto que pretende observar. espalhando bem. 5. Cobrir com uma lamela e desenhar o que observa. Tente reduzir a iluminação ajustando o diafragma do microscópio. OBJECTIVOS: y y y y Compreender o conceito de célula. Diferenciar células animais e vegetais.20 - . . Células de gengiva D riccionar ligeiramente a gengiva a vezes com a ponta de uma zaragatoa. Examine então com a objectiva de maior ampli ação. Cobrir com uma lamela DDesenhar o que observa com as objectivas de Xe1 X. Diferenciar células procariotas de eucariotas. mas desta vez com azul Nota : especímenes não corados são muitas vezes melhor visualizados com menos luz. Biologia Celular X. Adicionar uma gota de soro fisiológico.Protocolos Práticos depois com a objectiva de de metileno. y y . olha de uma planta aquática ( Elodea canadiensis) DDestacar uma folha de Elodea e fazer um pequeno corte na epiderme superior da folha com o auxílio do bisturi. DDesenhar o que observa.

soro fisiológico. que permitem uma melhor visualização dos componentes celulares. Para tal. Preparações temporárias ou extemporâneas Destinam-se à observação momentânea de uma amostra de material biológico no seu estado natural. A coloração de preparações temporárias pode fazer -se de dois modos:  Imersão: o corante é adicionado ao meio de montagem . Outro obstáculo à qualidade da observação é a opacidade da amostra à luz. De forma a superar estes factores.Protocolos Práticos Biologia Celular Aula CITO UÍMICA E HISTO UÍMICA INTRODUÇÃO A observação de células ao microscópio óptico de fundo claro apresenta dois problemas: as pequenas dimensões das células e a ausência de contraste entre os constituintes celulares. etc) e depois colocada entre lâmina e lamela. Estas substâncias são denominadas corantes vitais (azul de metileno. etc. este tipo de preparação não permite observar estruturas celulares com grande detalhe. I.) e a sua utilização permite a coloração de estruturas celulares mantendo as funções vitais da célula durante algum tempo. Este tipo de líquidos que não alteram as condições do material a observar designam-se líquidos indi erentes . utilizam-se as técnicas denominadas técnicas citológicas ou técnicas citoquímicas . vermelho Congo.21 - . Embora evitem a formação de artefactos na amostra. vermelho neutro. Estas preparações podem contudo ser contrastadas com substâncias que não alteram as características do material biológico. a amostra é colocada num ambiente o mais semelhante possível às condições nas quais ela se encontra in vivo (água doce ou salgada. TIPOS DE PREPARAÇÕES 1. Sudão III.

  Coloração: os cortes são tratados com corantes.) tendo como finalidade preservar as estruturas do material a observar.  Inclusão e corte: processo normalmente utilizado em histoquímica. Esta técnica permite também proceder à substituição de um meio de montagem por outro em preparações temporárias. frio) ou químicos (metanol. o material biológico é submetido a uma sequência de tratamentos destinados a desidratar e a fixar as células a ser observadas.  Fixação: tratamentos físicos (calor. as amostras são de novo desidratadas e cobertas com um meio de montagem (usualmente o Bálsamo do Canadá). Essas finas fatias são então montadas em lâmina. A substância mais utilizada como matriz é a parafina fundida. não tendo igual importância no caso de se trata r de células isoladas.Protocolos Práticos Irrigação: Biologia Celular o meio de montagem com a amostra entre lâmina e  lamela é substituído por capilaridade. . Fase inal de montagem: após a coloração.22 - . É fundamentalmente utilizada na obtenção de preparações definitivas de tecidos. etc. 2. Depo is de solidificada. a amostra é cortada em sucessivas camadas muito finas utilizando um micrótomo. De modo a permitir esta conservação. Consiste na inserção da amostra numa matriz de um material que a mantenha estável e sem deformações. ácido acético. Preparações definitivas Permitem conservar o material biológico entre lâmina e lamela durante longos períodos de tempo.  Desidratação: usualmente obtida através da passagem do mater ial biológico por álcoois ou acetonas de concentração crescente (este tratamento visa a remoção da água dos tecidos a observar).

designa-se como histoquímica. possibilitando ou aumentando a eficácia da coloração. d Mordentes: substâncias que favorecem a ligação de corantes sem carga eléctrica a determinadas estruturas celulares. Se estiverem em estudo tecidos. geralmente de natureza orgânica.23 - .  Coloração di erencial: um agente de envolve o uso.Protocolos Práticos II. COLORAÇÃO Biologia Celular Uma das técnicas mais usadas para incrementar o contraste das preparações biológicas é a coloração. este método é designado como citoquímica. o iodo. Alguns mordentes utilizados em citoquímica são o cobre. proteínas). Exemplos de corantes utilizados em microscopia óptica . o ferro. Utilizam-se substâncias.corantes . b Acido ilia: os corantes acidófilos são substâncias de natureza básica que se ligam a estruturas celulares ácidas (ácidos nucleicos. c Baso ilia: os corantes basófilos são substâncias de natureza ácida que se ligam a estruturas celulares básicas. No estudo de células isoladas.  Coloração simples: utilização de um único corante para pôr em evidência estruturas celulares (ex: azul de metileno). no processo de coloração de que permite distinguir diferentes diferenciação composições da mesma estrutura celular (ex: coloração Gram).  Coloração combinada: utilização de diferentes corantes para pôr em evidência e distinguir estruturas celulares diferentes (ex: hematoxilina eosina). que coram estruturas celulares em geral ou em particular . assim como os mecanismos de ligação às moléculas biológicas: a) Forças electrostáticas: corantes com carga positiva podem ligar-se a estruturas celulares com carga negativa e vice -versa. As especificidades dos corantes são variadas.

24 - .Protocolos Práticos Corantes gerais Básicos: y y y Biologia Celular Hematoxilina ucsina básica Violeta de cresilo Ácidos: y y y Eosina Laranja G Azul de anilina Corantes para citoquímica y y y y Ácido periódico-Schiff: corante para glúcidos Corante de eulgen: DNA e RNA Negro Sudão (Sudão III): lípidos Enzimas Corantes para imunocitoquímica y y y y luoresceína Rodamina Enzimas Ouro coloidal PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL - Culturas em meio sólido de Escherichia coli Corantes: violeta cristal e safranina Lugol Álcool a 95% Óleo de imersão Soro fisiológico estéril Lâminas para microscópio Palitos .

uma pequena quantidade de massa bacteriana e colocar na lâmina DEspalhar de forma a obter uma distribuição homogénea. para de seguida se executar a coloração. até desaparecimento completo da cor DLavar a preparação com água . com as iniciais do organismo a testar e o nome do grupo D lamejar a lâmina. 2. durante 1 a 2 segundos. mantendo a lâmina em posição oblíqua. segura pela pinça DCobrir a lâmina com lugol (Gram's Iodine) e deixe actuar durante 1 minuto DLavar a preparação com água DDescorar a lâmina com álcool etílico 95%. Deixar actuar durante segundos DRetirar o excesso de corante com água destilada.Protocolos Práticos Pinças Bico Bunsen Microscópio Varetas de vidro Pipeta de Pasteur Pompete Biologia Celular - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1.25 - . (esterilizada à chama e arrefecida). arrefecer e transferir duas gotas de soro fisiológico estéril para o centro da lâmina DRecolher com o auxílio de uma ansa. no lado oposto onde é efectuado o esfregaço. Preparação de esfregaços D Marcar a lâmina. Método de Coloração: coloração diferencial de Gram DCobrir o esfregaço com violeta cristal. Evitar fazer esfregaços densos DDeixar secar e fixar a preparação à chama.

safranina e deixar actuar durante segundos DLavar com água e deixar secar DColocar uma gota de óleo de imersão e observar a preparação ao microscópio na objectiva de imersão DRegistar as formas e cores das células observadas. Observação de preparações definitiva DObservar as diferentes preparações definitivas. Inferir sobre a vantagem da utilização de corantes (comparação das preparação de E. Conhecer os métodos de coloração de preparações temporárias (imersão e irrigação). Distinguir os vários tipos de coloração (simples. Saber enumerar os passos necessários à elaboração destes dois tipos de preparações. combinada e diferencial). Conhecer a técnica de preparação de esfregaços Saber executar a coloração de Gram. y y y y y y y . coli corada com a realizada na aula anterior). assim como as cores associadas.26 - . OBJECTIVOS: y y Compreender o que é a Citoquímica e qual a sua utilidade. registando os tipos de células e componentes celulares observados. . perceber em que se baseia e qual a sua utilidade.Protocolos Práticos Biologia Celular DAplicar o corante de contraste. Diferenciar os vários corantes quanto aos mecanismos de ligação às moléculas biológicas e classificá-los quanto à sua natureza. Distinguir preparações temporárias de definitivas. Distinguir cocos de bacilos.

27 - . aquela em que existe maior número de moléculas de água) para a solução com maior concentração i.Aula 6 OSMOSE I TRODUÇÃO A célula tem necessidade de trocar substâncias com o meio exterior e com outras células. .Determinação da pressão osmótica k j Protocolos Práticos Biologia el lar l .e. De uma forma geral. ). Osmose . de forma a assegurar o seu metabolismo. pelo que a compreensão dos mecanismos de difusão movimento de solutos a favor do gradiente de concentração) e osmose movimento de água através de uma membrana semi-permeável) é fundamental para o estudo da biologia celular.e. menor número de moléculas de água).. que separa o meio intracelular do extracelular. A pressão osmótica de uma solução é a pressão que deve ser aplicada para impedir que a entrada de água por osmose ocorra Figura ..passagem de água através de uma membrana semi-permeável que separa duas soluções com concentrações diferentes. As trocas real izam-se através da membrana plasmática. A água movimentase da solução com menor concentração de soluto i. as células vivas são constituídas por 7 -8 % de água. Figura 5.

O número de partículas por unidade de volume (litro) é dado pela osmolaridade . Em células animais A ausência de parede celular torna as células animais mais vulneráveis ao fenómeno da osmose. Meio hipotónico . Hipotónica Isotónica Hipertónica Figura .2). com as células perdendo água e ficando encolhidas ± crenadas ( igura 5.quando comparado com outro. O termo osmol designa a concentração em número de partículas. Meio hipertónico . Daqui a importância de se manter as células animais sempre em meio isotónico. podendo mesmo rebentar ± lisar ( igura 5. independentemente da sua natureza (moléculas ou iões). em meio hipotónico. tem maior con centração de soluto (em número de partículas). tem menor concentração de soluto (em número de partículas).quando comparado com outro.2 Preparações de glóbulos vermelhos em soluções com di erentes osmolaridades o n m . O fenómeno inverso ocorre em meio hipertónico. a água tende a entrar e as células aumentam de volume. Assim.2). A.Protocolos Práticos Biologia Celular A pressão osmótica é determinada pelo número de partículas em solução.28 - .

5M NaCl . Esta turgidez origina a rigidez mecânica característica da maioria das plantas. A parede celular impede que a célula aumente de volume e rebente. Meio hipotónico Meio hipertónico PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL olhas frescas de Elodea Lâminas Lamelas Soro fisiológico NaCl . Quando colocadas em meio hipertónico. a célula vegetal tende a absorver água e a acumulá -la no vacúolo. as células perdem água (através do vacúolo).3 Comportamento de uma célula vegetal em soluções com di erentes osmolaridades . ficando túrgida.Protocolos Práticos B.2M NaCl . Em células vegetais Biologia Celular Em meio hipotónico.1M . M NaCl . ocorrendo o fenómeno de plasmólise ( igura 5. M NaCl . ).29 - r q p Figura .

fazendo um esquema legendado DDeverá determinar e indicar. Solução NaCl Lamela Papel Lâmina Figura . cobrir com uma gota de soro fisiológico e montar com uma lamela. . M. 5M) DObservar cada preparação ao microscópio DPara cada solução utilizada. ao mesmo tempo que se coloca a nova solução de montagem. para cada caso.5M. hipertónica ou isotónica. registar as alterações que observar. Observar ao microscópio DUtilizando o método de irrigação ( igura 5. . M.Protocolos Práticos NaCl . com o auxílio de uma pipeta de Pasteur t s . substituir o meio de montagem por cada uma das soluções de NaCl que lhe foram fornecidas ( .1M e .2M. .4 Técnica da irrigação: O primeiro meio de montagem é retirado por absorção com papel. se a solução utilizada é hipotónica.30 - . ). . 5M Papel absorvente Pipetas Pasteur Microscópio Biologia Celular - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DColocar uma folha de Elodea sobre uma lâmina.

Distinguir meios hipotónicos. Compreender a técnica utilizada (irrigação) na determinação da solução isotónica para as células de Elódea. Compreender o conceito pressão osmótica. isotónicos e hipertónicos. y .Protocolos Práticos Biologia Celular OBJECTIVOS: y y y y Distinguir osmose de difusão simples. Perceber as alterações produzidas em células animais e vegetais quando colocadas em meios de diferentes osmolaridades.31 - .

2 divisão nuclear e a 1 Profase Metafase v u Protocolos Práticos Biologia el lar . o ADN encontra-se descondensado cromatina interfásica) e dá -se o ) é o processo celular que rege a repartição do material genético entre células eucarióticas em divisão. os cromossomas individualizam-se e inicia-se um processo que garante a distribuição do material genético de uma célula que foi duplicado na fase S) em partes iguais para as células filhas. . das quais as quatro primeiras correspondem última divisão do citoplasma. o ADN é condensado. Este ciclo pode ser dividido em Interfase e sua divisão em duas células itose.Aula 7 MITOSE I TRODUÇÃO O ciclo celular consiste na sequência contínua e ordenada de processos que ocorrem numa célula desde o crescimento até filhas.Se ). Os acontecimentos que ocorrem na mitose são classicamente divididos em cinco fases.32 - . Ao entrar na mitose. A mitose fase fase. esta A interfase representa a maior parte do ciclo celular fases processo de replicação fase S).

Na Telofase. Cada cromatídeo fica ligado a um dos polos do fuso mitótico é aqui que se garante a divisão do material genético em duas partes iguais). localizados nas extremidades de caules e raízes e no câmbio. o fuso mitótico desaparece e a membrana nuclear reconstitui-se em torno de cada um dos dois conjuntos de cromossomas.33 - x w Protocolos Práticos Biologia el lar y .Fases da Mitose Telofase Na Profase.3 4 Anafase Figura 7. Dá-se o aparecimento do nucléolo. dá-se a condensação dos cromossomas cada um com dois cromatídeo). Na Metafase. . a divisão nuclear e celular ocorre em áreas específicas. o desaparecimento da membrana nuclear e a formação do fuso mitótico. ocorre a divisão do citoplasma com a distribuição dos organelos e outros constituíntes celulares pelas duas células filh as. Formam -se dois conjuntos de Nas plantas. Na Citocinese. Na Anafase. meristemas. É a fase mais curta da mitose. migração de cada cromatídeo para um dos polos da célula. O meristema apical é a região que contém a maior percentagem de células em mitose. os cromossomas descondensam-se. Este processo tem início durante a telofase. a interação dos centrómeros com o fuso mitótico leva cromossomas idênticos. ao nível do centrómero. dá-se o alinhamento dos cromossomas no plano equatorial do fuso mitótico. .

Região de divisão celular Figura 7. Observação de figuras de mitose em ápices radiculares de Alli m cepa MATERIAL icroscópio óptico Lâminas Pinça de madeira Bico de Bunsen Ápices radiculares de Alli m cepa cebola) Cl 1N Orceína acética PROCEDIME TO EXPERIME TAL DColocar o ápice radicular de Alli m cepa em Cl 1N. .34 - DAdicionar 3 gotas de orceína acética e deixar repousar { z Protocolos Práticos Biologia el lar }  ~ | . durante 3min min .Secção longitudinal da extremidade de uma raíz PARTE EXPERIME TAL 1.

2.1 DConsiderando que o número de células em cada fase da mitose é directamente proporcional ao tempo que cada célula passa em cada uma destas fases. após adicionar uma gota de orceína acética DTransferir o material para uma lâmina limpa. determinar a fracção de tempo (%) que as células do tecido . mais duas vezes. sem deixar secar DRepitir a operação.1 como ajuda para identificar as fases do ciclo celular nas quais se encontram as células DDesenhar e legendar uma célula em cada fase DContar em diferentes campos de observação o número de células que se encontra em cada fase da mitose e apontar os dados na Tabela . de forma a obter uma única camada de células.Protocolos Práticos Biologia Celular DAqueçer suavemente até concentrar o corante em torno do ápice. Com a ponta do dedo aplicar uma pequena pressão sobre a lamela. Observação de figuras de mitose em preparações definitivas de cortes histológicos de Ascaris MATERIAL Microscópio óptico Preparação definitiva de cortes histológicos de Ascaris corados com azul de toluidina PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DLigar o microscópio DColocar a preparação definitiva na platina D ocar a uma ampliação 1 X e observar a X ou 1 X. Use as imagens da igura .35 - . adicionar uma gota de orceína acética e colocar a lamela.

Protocolos Práticos Biologia Celular observado passam em cada fase do ciclo celular que observou. Descrever as várias fases da mitose. Compreender o cálculo da duração relativa de cada uma das fases do ciclo celular. Identificá -las em preparações de células animais e vegetais. Perceber a função da mitose e em que células ocorre. y . Anotar os valores obtidos na Tabela .36 - .1 ase da Mitose Interfase Número de células % de tempo em cada fase ____________% Profase ____________________________________________ ____________% Metafase ____________________________________________ ____________% Anafase ____________________________________________ ____________% Telofase ____________________________________________ ____________% Total ____________________________________________ 100% OBJECTIVOS: y y y Compreender o processo da mitose e a sua integração no ciclo celular.1 Tabela 7.

A meiose I denomina-se por isso divisão reducional . a meta ase II. os acontecimentos que têm lugar durante cada uma das divisões meióticas I e II são distintos. através do qual os organismos produzem células com metade do material genético (haplóides n ) destinadas à reprodução sexual. A meiose II compreende a pro ase II. A fertilização é o processo que resulta da fusão de duas células sexuais haplóides. A meiose I compreende a pro ase I. Durante a meiose ocorrem duas divisões sucessivas . anafase e telofase. a ana ase I e a telo ase I . a meiose ocorre nos órgãos sexuais tanto masculinos como femininos. de modo a dar origem a duas células haplóides (n) cada uma delas cromatídeos das células resultantes da meiose I originando células haplóides. metafase. e a meiose. estruturas que garantem a diversidade genética de todos os organismos sexuados através do mecanismo de ³crossing over´. S e G2. em que ocorre a separação dos é separado. . Corresponde a uma divisão equacional . Apesar de cada uma das divisões meióticas ser também formalmente dividida em profase. a meta ase I . No final da meiose I cada par de cromossomas homólogos da célula -mãe (2n) com 2 cromossomas.Protocolos Práticos Biologia Celular AULA 8 MEIOSE INTRODUÇÃO A meiose constitui um tipo de ciclo celular especializado. engloba a interfase meiótica.37 - . A combinação da meiose e da fertilização no ciclo de vida é a base da reprodução sexuada. Nos animais superiores. Nesta primeira divisão ocorrem os processos de recombinação entre cromossomas homólogos: formam -se os bivalentes . a ana ase II e a telo ase II. O ciclo celular meiótico. que se subdivide nas fases G1. à semelhança do ciclo celular mitótico. que é a fase mais longa e complexa. num processo que se denomina respectivamente espermatogénese e oogénese.meiose I e meiose II ± sem a ocorrência de uma fase S intercalar.

: Profase I etafase I Anafase I ƒ - icroscópio e Preparações definitivas de Lili m sp. Para tal. guie-se pelas fotografias da Figura 8.Representação esquemática da meiose PARTE EXPERIME MATERIAL TAL PROCEDIME TO EXPERIME TAL Identificar e desenhar ampliação de 400X) células em cada uma das fases da meiose. .38 - .Figura 8. elofase I  € Protocolos Práticos Biologia el lar ‚ .

Compreender o fenómeno de ³crossing -over´ e suas consequências.39 - … „ Protocolos Práticos Biologia el lar † . . b) ao tipo de células em que AULA 9 EXTRACÇÃO DE DNA PLASMÍDICO INTRODUÇÃO .Intercinese etafase II Anafase II elofase II Figura 8. Conhecer as causas do aumento da variabilidade genética em organismos com reprodução sexuada versus assexuada.Fases da meiose OBJECTIVOS: y Distinguir meiose e mitose quanto a) ocorre e c) fases que a compõem. y y y Distinguir células haploides de diploides. função. y Identificar as diferentes fases da meiose nas preparações observadas na aula.

Protocolos Práticos Biologia Celular O DNA genómico bacteriano é geralmente circular com tamanho que varia entre algumas centenas de kb (1 kb aproximadamente 1 1 pares de bases) e kb. produção de insulina). Os plasmídeos podem ainda ser transferidos por conjugação ocorrendo a sua passagem de uma célula para a outra (transmissão horizontal). A maioria são circulares e possuem replicação autónoma. existem outros elementos genéticos como plasmídeos. Na bactéria. entre outros.1) de uma estirpe de Escherichia coli recorrendo à técnica de lise alcalina. transposões e vírus. além do DNA genómico. Esta vantagem pode ser conferida através de genes de resistência a antibióticos. por processos de restrição / modificação. Os plasmídeos contêm genes essenciais para a sua manutenção na célula e ainda genes que em determinados ambientes. os plasmídeos são frequentemente utilizados como vectores de clonagem.ver igura 1 . conferem vantagem selectiva ao hospedeiro. pela produç ão de toxinas. por processos de virulência. contendo cada célula uma cópia. permitindo a expressão de genes de outros organismos pela bactéria (ex. é a extracção de DNA plasmídico (plasmídeo pBR322 que confere resistência ao antibiótico ampicilina . Os plasmídeos de ocorrência natural apresentam uma variação de tamanho entre 1 kb e algumas centenas de kb. .40 - . O objectivo desta aula prática. sendo repartidos entre as células quando há divisão celular (transmissão vertical). Em laboratório.

. Misturar por inversão e colocar em gelo durante 3 min à temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para novo tubo e adicionar 9 µl de etanol absoluto (a -2 ºC). 5 min. DPipetar 1 ml para um tubo eppendorf e centrifugar 1 min a 15 rpm. a ºC.Solução 2 (preparar no momento): NaOH . .41 - . DAdicionar 2 DAdicionar 15 Q l de solução 2. µl de etanol a 70% Deixar 15 min a -2 ºC.Cultura de Escherichia coli em meio LB líquido com ampicilina.Etanol %.Protocolos Práticos Biologia Celular PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL . ajustado com ácido Tris HCl 1 mM (pH ) EDTA 1 mM RNAse 2 Qg / ml PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DInocular a estirpe de E.2 M SDS 1% .Solução 1: Glucose 5 mM EDTA 1 mM TrisHCl 25 mM (pH ) . DCentrifugar 3 min a 15000 rpm. . e adicionar 1 Q l de solução 1. Centrifugar 15 min a ºC e remover o sobrenadante. durante 3 min. . Remover o sobrenadante e secar o pellet de DNA plasmídico a 60ºC. Remover completamente o sobrenadante. Misturar suavemente por inversão e manter Ql de solução 3.Solução 3: . DCentrifugar o lisado durante 5 min a 15 rpm. coli contendo o plasmídeo em 1 ml de meio LB com ampicilina e incubar durante a noite a 37ºC com agitação. com micropipeta.Tampão TE (com RNase) KAc 3 M (pH acético glacial) . DLavar o sedimento de DNA plasmídico com 5 (-20ºC). a ºC. Ressuspender e incubar 3 min em gelo.Etanol absoluto.

Protocolos Práticos Biologia Celular DRessuspender o sedimento de DNA em 50 µl de TE com RNase.42 - . Conservar a -20ºC. y y . Saber executar e explicar cada uma das etapas do protocolo de extracção de DNA plasmídico. Perceber a importância dos plasmídeos em processos como a clonagem. Saber que a sua transmissão além de vertical é também h orizontal. Compreender a função dos plasmídeos nas bactérias que os possuem. OBJECTIVOS: y y Perceber que os plasmídeos fazem parte do genoma extracromossomático.

Kb e .GAANN NNTTC. A separação e visualização destes fragmentos serão feitas por electroforese. .AULA DI ESTÃO DE DNA PLASMÍDICO E ELECTROFORESE EM EL DE AGAROSE INTRODUÇÃO As endonucleases são enzimas que reconhecem sequências de bases no DNA sendo capazes de hidrolisar digerir) as cadeias de DNA em locais específicos. Kb pBR3 4. XmnI 1.3 Kb XmnI Amp R Š ‹Š Figura . respectivamente.1). as endonucleases são ferramentas importantes em processos de clonagem de genes. por exemplo o caso dos bacteriófagos. ˆ ‡ Protocolos Práticos Biologia el lar ŒŒ  ‰ com a . Em laboratório. Estas enzimas são quase exclusivamente produzidas por procariotas sendolhes imputada uma função protectora µi vivo¶ contra ácidos nucleicos invasores como é.Mapa de restrição do plasmídeo pBR3 com a enzima XmnI. produzindo-se. O objectivo desta aula prática é a digestão do plasmídeo pBR3 enzima de restrição XmnI.43 - . dois fragmentos lineares de DNA com 1.4 Kb. após a hidrólise. Este plasmídeo possui dois locais contendo a sequência de bases que XmnI reconhece 5'.3') ver Figura 10. execução de mapas físicos e outros.

Este composto intercala -se nas cadeias de ácidos nucleicos e fluoresce quando submetido ultravioleta. A velocidade de migração depende da massa função do número de pares de bases pb)). da concentração da matriz de agarose utilizada.(A) Marcador de pesos moleculares. Após a electroforese. . da conformação das moléculas. por interpolação é possível relacionar o peso molecular da amostra com as bandas do marcador. do campo eléctrico aplicado ao sistema e ainda da composição do tampão utilizado na electroforese. A separação de ácidos nucleicos que se encontram carregados negativamente grupos fo sfato) é geralmente efectuada em géis de agarose.A electroforese é uma técnica capaz de separar moléculas com carga pela aplicação de um campo eléctrico) em função do seu peso molecular e/ou carga eléctrica das moléculas. uando se faz uma electroforese de ácidos nucleicos em gel de agarose é indispensável a utilização de um marcador de pesos moleculares para o cálculo do peso molecular da amostra. A agarose forma uma matriz porosa cujo tamanho do poro pode ser controlado) através da qual migram as moléculas de ácidos nucleicos. m marcador de pesos moleculares é constituído por uma série de fragmentos de DNA de peso conhecido. radiação A com o produto da digestão de pBR3 ’’ ‘ Figura .44 - . (B) esquema da electroforese realizada com XmnI  Ž B Protocolos Práticos Biologia el lar ’ . os ácidos nucleicos no gel de agarose tornam -se visíveis por acção do brometo de etídeo adicionado previamente ao gel de agarose).

DNA plasmídico (pBR322) (extraído na aula anterior) .Protocolos Práticos Biologia Celular PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL . Digestão de DNA plasmídico com a enzima de restr ição XmnI DFazer a mistura de digestão (em tubo eppendorf) adicionando cada um dos reagentes indicados na tabela pela ordem apresentada.Agarose .Solução STOP (tampão de aplicação): Sacarose 0% Azul de bromofenol 0.25% PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1. Água Tampão de enzima 10 X BSA 10X DNA plasmídico Enzima de restrição XmnI 10.5 µl 2 µl 2 µl 5 µl 0.Marcador de pesos moleculares .5 M (pH .5 µl .0) H2O até perfazer 1l Ajustar pH a .0 .BSA 10 X .1 ml ácido acético glacial 100 ml EDTA 0.25% Xilenocianol 0.Tampão TAE 50 X: 2 2 g Tris base 57.Enzima XmnI 5U / Q l .Tampão de enzima 10 X .45 - .Brometo de etideo .

Para tal pesar a agarose necessária para um volume final de 50 ml e colocar num recipiente adequado. % em tampão TAE 1X. Saber para que serve um marcador de pesos moleculares e como permite calcular o peso molecular das bandas da amostra. Perceber o processo utilizado para a visualização de ácidos nucleicos em gel de agarose. Adicionar o tampão (TAE 1X) até atingir o volume desejado. DIniciar a electroforese por aplicação de um campo eléctrico (100 V 20 min). Ferver em microondas até obter uma mistura homogénea. DPreparar um gel de agarose 0. DRemover o pente e colocar o gel na tina de electoforese. Adicionar tampão (TAE 1X) à tina de electroforese até cerca de 1 mm acima da superfície do gel. 2. MUITO IMPORTANTE usar óculos de protecção contra UV. Saber qual a sua função in vivo¶ e perceber a sua utilização in vitro¶ (ferramentas moleculares).Protocolos Práticos D Misturar cuidadosamente e incubar a 37ºC durante 1h. DApós a corrida retirar o gel da tina e colocar em cima do transiluminador (fonte de radiação ultravioleta). OBJECTIVOS: y Perceber o que são endonucleases (enzimas) de restrição. Deixar solidificar b 30 min. Biologia Celular DRetirar os tubos da estufa e adicionar 2 µl de solução STOP a cada tubo.( MUITO IMPORTANTE usar luvas para manipular este reagente). DFotografar o gel. Deitar a agarose dentro do molde contendo um pente adequado ao volume e número de amostras que pretende aplicar. Compreender a técnica de electroforese.46 - y y y . DConservar a ºC. DAplicar 5 Ql do marcador de pesos moleculares no primeiro poço e 5 Q l no último poço do gel. Deixar arrefecer a mistu ra líquida até atingir aproximadamente 50ºC e adicionar 1 Q l de brometo de etídeo. . Visualização dos produtos de digestão por elecro orese em gel de agarose.

Conseguir interpretar um perfil de digestão de DNA plasmídico.Protocolos Práticos Biologia Celular y Saber realizar uma reacção de digestão de um DNA plasmídico. y .47 - . Co nhecer as condições óptimas de actuação das enzimas de restrição.

sendo por vezes necessário quantificá -las.Protocolos Práticos Biologia Celular AULA 11 UANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS INTRODUÇÃO As proteínas encontram-se envolvidas na maioria dos processos biológicos que ocorrem dentro da célula. A espectrofotometria nas regiões visível e ultra -violeta. procede -se da seguinte forma: 1. Esta técnica baseia-se na proporcionalidade direct a existente entre a quantidade de luz absorvida por uma dada solução e a sua concentração. Traçar em papel milimétrico o gráfico ³Absorvância vs. Executar o procedimento experimental escolhido para quantificar a substância padrão 3. é uma técnica que permite determinar a concentração de substâncias em solução. Soluções padrão: preparar diferentes soluções de concentrações conhecidas 2. Determinar a gama de concentrações onde é válida a Lei de Lambert -Beer (onde há proporcionalidade directa entre A e C) . (concentração da solução padrão ´ 4.48 - . determina -se a relação entre as concentrações conhecidas de várias soluções dessa substância e as absorvâncias registadas a um dado comprimento de onda (construção da curva de calibração). definida pela Lei de Lambert-Beer: A = IC l A: Absorvância I: Coeficiente de extinção molar C: concentração da solução absorvente l: Percurso óptico na solução absorvente Para avaliar a concentração de uma substância. Para traçar a curva de calibração e determinar a equação da recta.

Para amostras com maior concentração de proteína pode usar -se o Lowry mg/dL) ou étodo do Biureto g/dL). étodo de – • •• Figura . permitindo num curto espaço de tempo analisar várias amostras. C + b Quantificação de proteínas Existem vários métodos para quantificar as proteínas presentes em amostras biológicas ou em soluções de proteínas preparadas no laboratório. . que apresenta uma O método de Bradford é suficientemente sensível para detectar quantidades de proteína de 1 µg/mL. Alguns desses métodos baseiam-se na formação de complexos corados entre reagentes específicos e as ligações peptídicas ou determinados aminoácidos.1) e alguns aminoácidos. Outros métodos exploram as propriedades espectroscópicas intrínsecas das proteínas absorvância a 80 nm). originando um complexo azul. sendo um método rápido e simples. O método de Bradford baseia -se na formação de interacções iónicas ou hidrofóbicas entre um corante azul de Coomassie absorvância máxima a 595 nm.49 - . -250) Figura 11.5.Azul Coomassie G25 (forma desprotonada) ” “ Protocolos Práticos Biologia el lar . Calcular a equação da recta resultante regressão linear) A = m.

Protocolos Práticos Biologia Celular PARTE EXPERIMENTAL MATERIAL .1 mg/mL .Espectrofotómetro .Micropipetas .Amostra desconhecida PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1. Medir a absorvância de cada tubo a 595 nm DRepresentar graficamente a absorvância medida a 595 nm versus a concentração de proteína em µg/mL e traçar a correspondente curva de calibração DCalcular a equação da recta da zona linear da curva de calibração .25 DAdicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford a cada tubo DIncubar 5 minutos à temperatura ambiente.5 25 31.5 6.25 2.Cuvettes para espectrofotómetro . Construção da curva de calibração O método de Bradford apresenta uma resposta linear numa gama de concentrações de proteína entre 1 e 20 µg/mL.25 12. DPreparar 7 tubos com a seguinte composição: Tubo (número 1 (Branco 2 3 4 6 7 Volume de solução BSA 0.Solução de albumina sérica bovina (BSA) a 0.1 mg/mL (µL 0 10 20 50 100 200 250 Volume de água (µL 00 790 780 750 700 600 550 [BSA] (mg/L 0 1.50 - .Reagente de Bradford . A construção de uma curva que relacione a concentração de proteína co m a absorvância a 595 nm.Calculadora . permite determinar a concentração de proteína existente numa amostra.Papel milimétrico .

utilizando a equação que determinou. Conhecer outros métodos de quantificação de proteínas. Compreender qual o seu fundamento e as suas limitações. y y y y y y y .Protocolos Práticos A (595nm) m . Identificar a gama de concentrações onde é válida a lei de Lambert -Beer. Saber executar o método de Bradford. Conhecer os conceitos de branco e solução padrão. Saber usar a equação da recta para calcular a concentração de proteína duma solução desconhecida. Quantificação da concentração de proteínas numa amostra desconhecida DPipetar para um tubo (nº 8) 800 µL da amostra desconhecida DAdicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford DIncubar 5 minutos à temperatura ambiente. Saber calcular a equação da recta que expressa a relação entre a absorvância e a concentração de proteína. Saber elaborar uma curva de calibração.51 - . Medir a absorvância a 595 nm DDeterminar a concentração de proteína na amostra. OBJECTIVOS: y y Compreender a importância de quantificar proteínas. Perceber sumariamente o funcionamento da técnica de espectrofotometria. [proteína] b Biologia Celular 2. Compreender a necessidade da sua utilização. Compreender e aplicar a lei de Lambert-Beer.

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