EXTRAÇÃO DE DNA

A PARTIR DE MINI-FRAGMENTOS DE ORELHA DE CAMUNDONGO

ANTES DE INICIAR:
 Usar luvas
 Usar reagentes de qualidade para PCR
 Ligar o banho a 55°C
 Colocar o isopropanol no gelo ou freezer
 Ligar a centrífuga a 4°C

SOLUÇÕES
1. Tail Buffer
100mM Tris pH 8,3
10 mM EDTA pH 7,5 – 8
200 mM NaCl
1% SDS
2. Proteinase K 10 mg/mL
3. 5M KOAc
4. Isopropanol
5. 70% ETOH

PROTOCOLO
1. amostras de tecido no eppendorf
2. 250µL tail buffer + 1,5 µL prot. K
3. 55°C, 2h (ou mais), vortex ocasionalmente
4. 100µL KOAc e mix por inversão até dissolver bem
5. TA por aprox 10 min. e mix por inversão 1 ou 2 x. (opcional)
6. centrifugar a 12.000 RPM, 20 min, 4°C.
7. transferir sobrenadante para tubo novo (com pipeta)
8. 280 µL isopropanol
9. centrifugar a 12.000 RPM, aprox 1 min
10. verter o isopropanol (o dna é o pellet e está lá! Acredite!)
11. 300 µL ETOH para lavar o pellet
12. centrifugar a 12.000 RPM por 2 min.
13. verter o ETOH, secar a borda do eppendorf até o papel não ficar mais molhado.
14. acrescentar 30 µL de TE (tampão do PCR)