Cinética Enzimática

Prof. Rita de Cassia Siqueira Curto Valle

Depto. Engenharia Química
Universidade Regional de Blumenau
Cinética enzimática
• Estuda a velocidade com que ocorrem as
transformações de reações catalisadas por enzimas.

• Velocidade de transformação de substrato em

produto

• Leva à determinação de parâmetros cinéticos para

deduzir a atividade enzimática, a afinidade da
enzima pelo substrato e os mecanismos através dos
quais leva a cabo a catálise.
Cinética enzimática - objetivos
• Medir as velocidades das transformações que se
processam;
• Estudar a influência de condições de trabalho
naquelas velocidades:
▫ pH;
▫ Temperatura;
▫ Concentração de reagentes e das enzimas;
▫ Concentração de inibidores e de ativadores;
• Correlacionar as velocidades das transformações
com algum dos fatores que as afetam;
• Colaborar com a otimização do processo;
• Estabelecer critérios para o controle de processo
• Projetar um reator adequado
Atividade enzimática
• É a velocidade na qual a enzima catalisa a
reação

• Unidades da atividade enzimática:

U: quantidade de enzima que promove a
formação de 1 μmol de produto por minuto

• Deve sempre estar referenciado à uma

quantidade específica de amostra
• Exemplo: 20 U/g de mamão 1 g de mamão
tem uma quantidade de enzima que
transforma 20 μmol de substrato por minuto
Atividade enzimática
• Unidades da atividade enzimática:
• Katal: quantidade de enzima que transforma
1 mol de substrato por segundo ou forma 1
mol de produto por segundo

• Deve sempre estar referenciado à uma

quantidade específica de amostra
• Exemplo: 45 katal/mL de amostra 1 mL da
amostra tem uma quantidade de enzima que
transforma 45 moles de substrato por
segundo
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
à medida que ↑T, ↑V da
• Temperatura reação, até o ponto em
que ↑T, vai V↓
T = temperatura
V = velocidade
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• Temperatura
▫ Estabilidade térmica
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• Temperatura
▫ Tempo de meia vida
(t1/2) – tempo no qual
as enzimas perdem
50% da sua atividade
numa determinada
temperatura
Fatores que influenciam a atividade
enzimática O sítio ativo da enzima está
• pH frequantemente composto de
grupos ionizáveis que devem estar
na forma iônica adequada para
manter a conformação, unir os
substratos ou catalisar a reação.
A atividade da enzima deve ser
medida no pH ótimo
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• pH

à medida que ↑pH, ↑V da reação, até

o ponto em que ↑pH, vai V↓
• Fixam-se [E], [S] e a temperatura.
• Ex.: pHótimo para pepsina = 1,5 a 3
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• pH
▫ Resistência ao pH
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• Concentração de enzima
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• Presença de inibidores
▫ compostos que diminuem a velocidade da reação
▫ Agem de diferentes formas
 Inibição competitiva
 Inibição não-competitiva
▫ Fármacos
▫ Preservativos de alimentos
▫ Compostos tóxicos
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• Concentração de substrato

Elevadas concentrações de substrato podem preservar a estabilidade

da enzima sob efeito da temperatura e do pH
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• Concentração de substrato
[E]; T e pH = ctes

à medida que ↑[S], ↑V da reação, até

o ponto em que ↑[S], V torna-se cte
V=Vmax
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• Concentração de substrato
▫ Concentrações altas a
velocidade será máxima.
Até o ponto de saturação da vo
Vmax
enzima não afeta a
velocidade.

[S]
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• Concentração de substrato
▫ Desvios da linearidade ocorrem:
 Presença de inibidores na solução de enzima;
 Presença de substâncias tóxicas;
 Presença de um ativador que dissocia a enzima;
 Limitações impostas pelo método de análise.
Determinação da velocidade de reação
• Complicador - a concentração do substrato
varia ao longo da reação à medida que este vai se
transformando em produto.
Velocidade de reação

• Então como medir a velocidade

de uma reação enzimática?
Velocidade de reação
• Limitar a velocidade em alta [S]
devido à saturação dos sítios ativos
da Enzima

• Determinar a velocidade inicial da

reação v0 (velocidade inicial)
Velocidade de reação
Variações da concentração de substrato
são negligenciáveis

[P] é baixa
Cinética de Michaelis e Menten
• Modelo cinético que melhor explica a influência
das concentrações iniciais de enzima e substrato
na velocidade inicial da reação enzimática

(1913)
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maud Menten - Pediatra
Cinética de Michaelis e Menten
• Hipóteses:
▫ O substrato e a enzima reagem reversivelmente
entre si formando um composto intermediário
denominado complexo enzima-substrato.
▫ O complexo formado ou se decompõe,
regenerando a enzima e formando os produtos da
reação.
Cinética de Michaelis e Menten

K1 = cte de velocidade de formação do complexo

K2 = cte de velocidade de dissociação do complexo
K3 = cte de velocidade de decomposição do complexo, formando produto
v = velocidade de formação do produto
S = concentração inicial de substrato
E = concentração inicial de enzima
P = concentração de produto
 Cinética de Michaelis e Menten

• velocidade de catálise, ou velocidade inicial (v0) é igual ao produto da

concentração de ES por k3
v0 = K3 [ES]
• A velocidade de formação de ES corresponde a k1 [E].[S]

• A velocidade de quebra de ES corresponde a (k2 + k3). [ES]

• A velocidade de formação de ES será: k1 [E].[S] = (k2 + k3). [ES]

A constante de Michaelis
Reescrevendo...
(KM) é definida como:
 Cinética de Michaelis e Menten
• Considerando que a concentração da enzima livre [E] corresponde à
concentração da enzima total [ET], menos a concentração da enzima ligada [ES]

Como: v0 = K3 [ES]

Fazendo as devidas substituições

Condição reacional necessária

Como a [S] >>> [ET], a E está saturada com o [S] e a [ES] = [ET]
Nestas circunstâncias, [S] é muito maior do que KM
e [S] /([S] + KM) ~ 1
Nestas condições Velocidade máxima de formação de P = Vmax

Então Equação de
Michalis-Menten
 Cinética de Michaelis e Menten
Vo = V [S] Essa equação explica o comportamento
max
da cinética de reações catalisadas por
Km + [S]
enzimas:

1) Se [S] é muito maior do que KM

a velocidade da reação é máxima e independe da

concentração do substrato
2) Se [S] é muito menor do que KM,

a velocidade da reação é diretamente proporcional à

concentração de substrato.
 Cinética de Michaelis e Menten
Essa equação explica o comportamento
Vo = V [S]
max da cinética de reações catalisadas por
Km + [S] enzimas:

3) Se [S] é igual a KM
v = Vmax [S]
v 2
Km
v = Vmax
1

Vmax 3
2

Km [S]
Determinação de Km e Vmáx
• Método gráfico de Lineweaver-Burk
1 Km 1 1
= + v
v Vmax [S] Vmax
Inclinação =
Km
Vmax

1
Vmax
-1 1
Km [S]
Determinação de Km e Vmáx
• Método gráfico de Eadie-Hofstee
v
v=V −K
max m [S]
Vmax -Km
Inclinação =
v
Vmax
Km

v
[S]
Determinação de Km e Vmáx
• Método gráfico de Hanes-Woolf

[S] K 1
[S]
m
= + [S] v
v V V
max max
Inclinação =
1
Km Vmax
Vmax

-Km [S]
 Constante de afinidade
KM = K2 + K3
K1
Imaginando um caso limitante, em que k2 seja muito maior
do que k3; isto significa que a dissociação do complexo ES
em E mais S é mais rápida do que a formação de E mais
produto (P). Portanto, quando k3 é muito menor do que k2,
KM é igual à constante de dissociação de ES. Em outras
•Km alto – baixa afinidade
•Km baixo – alta afinidade

•Km depende:
o aspectos específicos do mecanismo de reação;
o n° de passos da reação;
o velocidades relativas dos passos individuais