IV Mostra Interna de Trabalhos de Iniciao Cientfica do Cesumar 20 a 24 de outubro de 2008

SEQENCIAMENTO AUTOMTICO DE PARTE DA REGIO 3 DO GENE C3-22 DE RHYNCHOSCIARA AMERICANA (DIPTERA: SCIARIDAE)
Cludia Regina das Neves Saez1; Paulo Henrique Marquiori Visacre1; Fabiana de Souza Gouveia2; Maria Aparecida Fernandez3; Adriana Fiorini4
RESUMO: O seqenciamento de cidos nuclicos permite determinar a ordem das bases nucleotdicas na molcula do DNA. O seqenciamento automtico feito pela Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando, alm dos deoxinucleotdeos normais (dNTPs), os dideoxinucleotdeos (ddNTPs), que so marcados com material fluorescente, uma cor para cada base, permitindo a deteco de diferentes fragmentos durante a migrao pela eletroforese capilar. O seqenciamento apenas a primeira etapa de um processo cujo resultado final poder resultar em novos mtodos de anlise sobre as caractersticas funcionais e estruturais do DNA. O objetivo deste trabalho foi realizar a preparao dos clones de DNA contendo fragmentos pertencentes regio 3 do gene C3-22 de R. americana e a reao de seqenciamento destes clones, pelo mtodo didesoxi. O gene C3-22 do sciardeo Rhynchosciara americana est localizado em uma regio amplificada do pufe de DNA C3 e estima-se que o produto do gene C3-22 seja uma protena de secreo, que parece estar envolvida na formao do casulo pupal de R. americana. Para esta anlise, o DNA recombinante (plasmdeo + inserto) foi introduzido em linhagem DH5- de E. coli, atravs de choque trmico, multiplicado in vivo e extrado destas clulas pelo mtodo de extrao de DNA plasmidial utilizando o reagente CTAB. Aps a extrao, as amostras foram quantificadas por espectrofotometria de luz U.V. e submetidas reao de seqenciamento. As seqncias sero posteriormente processadas em equipamento Mega Bace e os dados analisados atravs de ferramentas de bioinformtica.

PALAVRAS-CHAVE: Gene C3-22; Rhynchosciara americana; Seqenciamento automtico.

1 INTRODUO O seqenciamento do genoma de diversos organismos vem sendo realizado cada vez mais nos grandes centros de pesquisa. A tcnica de seqenciamento utilizada para determinar em que ordem as bases contidas no DNA se encontram. O trabalho de seqenciamento comea com a preparao das chamadas bibliotecas de DNA (BROWN, 2003). Nessa fase, o genoma a ser mapeado cortado em inmeros fragmentos. Esses pequenos trechos de DNA so ento clonados, ou seja, cada trecho ligado a uma estrutura que possui a capacidade de se multiplicar chamada plasmdeo. Estes plasmdeos so inseridos em bactrias que so crescidas em meios especficos para multiplicao dos trechos originais do genoma em estudo. S aps esse procedimento iniciado o seqenciamento do genoma propriamente dito (FRANA et al., 2002). Existem duas maneiras de se seqenciar o DNA: o seqenciamento manual e o seqenciamento automtico.

Acadmicos do Curso de Cincias Biolgicas do Centro Universitrio de Maring CESUMAR. Programa de Bolsas de Iniciao Cientfica do CESUMAR (PROBIC). claursaez@hotmail.com , phmv_bio@hotmail.com 2 Mestre em Gentica e Melhoramento. Universidade Estadual de Maring. Maring PR. fabi.gouveia@gmail. 3 a a Prof . Dr . da Universidade Estadual de Maring. Coordenadora da Central de Biologia Molecular, Estrutural e Funcional CBM/COMCAP UEM. aparecidafernandez@gmail.com 4 Orientadora e docente do Curso de Cincias Biolgicas do Centro Universitrio de Maring CESUMAR. fiorini@cesumar.br

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Atualmente, a tcnica mais utilizada para o seqenciamento de DNA a de Sanger, nome dado ao pesquisador que props a tcnica (MARTIN, 1989). A sntese de DNA iniciada por um oligonucleotdeo, sendo que depois a DNA polimerase continua ao longo da seqncia molde, incorporando os nucleotdeos e sintetizando a fita nova, sendo realizada, portanto, atravs da amplificao por PCR (Reao em Cadeia da Polimerase (MULLIS, 1986). Nessa tcnica existem dois tipos de nucleotdeos: os normais (deoxi) dATP, dGTP, dCTP e dTTP; e os dideoxinucleotdeos (no tem o grupo hidroxila no carbono 3) ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, que so marcados com material fluorescente. Estes ltimos so denominados de terminadores de cadeia, por impedir a adio de novos nucleotdeos cadeia de DNA em crescimento (BARNES, 1987). A polimerizao do DNA prossegue, com a incluso dos nucleotdeos normais, at que, por acaso, a DNA polimerase insere um dideoxinucleotdeo, o que interrompe a polimerizao. Ao final desse processo, se observam fragmentos de tamanhos diferentes. Essa reao ento colocada em um gel poroso, no qual, aps a eletroforese, se observa a migrao dos fragmentos os menores migram mais rapidamente. No seqenciamento automtico, no so mais empregados gis de poliacrilamida e sim eletroforese capilar (KARGER et al., 1991, EELTINK e SVEC, 2007). Os fragmentos de DNA so sugados para os capilares e migram em eletroforese atravs deste polmero, e so lidos automaticamente por lasers, com o auxlio de softwares para leitura dos dados. O material para o seqenciamento colocado em placas de 96 poos (placas de microtitulao) e retirado dali diretamente. So obtidos no final cromatogramas com picos em 4 cores correspondendo aos 4 nucleotdeos. O seqenciamento apenas a primeira etapa de um processo cujo resultado final poder resultar em novos mtodos de diagnstico, na formulao de novos medicamentos, vacinas, na preveno e tratamentos mais eficazes contra doenas ou pragas, etc. (KIMURA e BAA, 2002). A partir da seqncia de bases definida, o pesquisador tem que saber onde comeam e terminam os genes. Para isso, existem softwares especializados. Exemplos destes tipos de programas so BLAST, CLUSTAL, PHRED, PHRAP, CONSED, CAP3, dentre outros. O pacote Phred/Phrap/Consed (NICKERSON et al., 1997) utilizado para a leitura de cromatogramas, atribuio de bases, atribuio de qualidade a cada base (Phred), montagem de seqncias (Phrap), visualizao, edio e finalizao das montagens (Consed). Neste trabalho foram submetidos reao de seqenciamento automtico clones pertencentes regio a jusante 3 da unidade de transcrio do gene C3-22 do sciardeo Rhynchosciara americana, como objetivo de concluir o seqenciamento desta regio amplificada. 2 MATERIAL E MTODOS 2.1 OBTENO DAS AMOSTRAS DE DNA Os clones recombinantes contendo insertos de 400 pb, 800 pb, 1100 pb, 1308 pb, 2000 pb e 4000 pb, comportando a regio a ser seqenciada, encontravam-se clonados em plasmdeo pBluescript II (Stratagene). Estes DNAs recombinantes foram introduzidos em bactrias competentes E. coli da linhagem DH5- por choque trmico, para se obter quantidades suficientes de DNA para a reao de seqenciamento. Estes clones foram gentilmente cedidos por Maria Albertina M. Soares, Ann J. Stocker e Francisco J. S. Lara, da USP-SP e pela Dra Maria Aparecida Fernandez UEM. Aps a seleo das colnias recombinantes, estas foram inoculadas em meio LB com ampicilina e a cultura foi incubada sob agitao a 37C durante a noite. As bactrias foram coletadas por centrifugao e o DNA recombinante foi obtido pelo mtodo de preparao de DNA
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plasmidial utilizando o reagente CTAB (DEL SAL et al., 1989). 2.2 SUBCLONAGEM DO FRAGMENTO DE 1254 PB O clone pHH 4.0 foi submetido clivagem com a enzima de restrio DraI para gerar o fragmento de 1254 pb. Este fragmento compreende os clones de 400 e 800 pb. Aps a clivagem e confirmao em eletroforese de gel de agarose a 0,7%, o DNA recombinante foi purificado pelo mtodo de fenol e clorofrmio. O inserto de 1254 pb (DraI + DraI) foi eludo de um gel de agarose a 0,8% e clonado em um plasmdeo pT7T3 previamente clivado com a enzima de restrio SmaI. A reao de ligao foi utilizada para a transformao de bactrias por choque trmico. Aps a confirmao da clonagem, o DNA recombinante ficou pronto para as etapas seguintes. 2.3 QUANTIFICAO DOS CLONES RECOMBINANTES Alquotas de 5 l do DNA recombinante purificado foram diludas em 1000l de gua estril e quantificadas em espectrofotmetro de luz U.V. A leitura foi realizada nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm. A concentrao do DNA foi estimada utilizando como padro o valor de 50 g/mL para 1 ABS. Para a comparao dos resultados de quantificao obtidos por espectrofotometria, uma alquota do DNA purificado foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 0,7% , utilizando o tampo de corrida TBE 1x (45mM Tris-borato; 1mM EDTA, pH 8.0). Aps a migrao, os gis foram fotografados em sistema digital sob UV. 2.4 REAO DE SEQENCIAMENTO PELO MTODO DIDEOXI Para a reao de seqenciamento dos clones recombinantes, foi utilizada a concentrao de 500 ng de DNA. A reao consistiu dos seguintes componentes (DNA recombinante, primers reverse e universal e o kit DYEnamic ET Dye Terminator Kit (Amersham Bioscience). As reao de seqenciamento foi processada em Termociclador Eppendorf e posteriormente as amostras foram precipitadas com acetato de amnio e etanol absoluto. As anlises e o alinhamento das seqncias sero feitos utilizando os seguintes programas: PHRED (Verso: 0.020425.c, 1993-2002 por Phil Green e Brent Ewing;, PHRAP e CROSS_MATCH (verso 0.990319, 1994-999 por Phil Green; CONSED (verso 14.0, Gordon, 2004, com o propsito de fazer o mltiplo alinhamento de seqncias de DNA). 3 RESULTADOS E DISCUSSO O mtodo de extrao de DNA plasmidial por CTAB forneceu quantidades suficientes de DNA, em nanogramas por L, para a reao de seqenciamento e integridade das amostras. Os valores obtidos aps quantificao por espectrofotometria de luz U.V. esto apresentados na Tabela 1. A subclonagem do fragmento de 1254 pb foi eficiente, sendo positiva para 5 colnias bacterianas transformadas. Aps a seleo dos clones recombinantes, o DNA foi extrado e a confirmao da clonagem foi realizada pela clivagem do DNA com as enzimas de restrio EcoRI e HindIII, liberando o vetor plasmidial e produzindo dois fragmentos de ~800 e 400 pb na anlise eletrofortica (Figura 1). Este resultado indica que os insertos de 800 e 400 pb j subclonados, pertencem a este subfragmento.
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Tabela 1. Resultado da quantificao, por espectrofotometria de luz U.V. a 260 nm, das amostras de DNA recombinante extradas pelo mtodo de CTAB. Todas as amostras apresentaram quantidades suficientes de DNA para a reao de seqenciamento.

Clones pHN 2.0 1308 1254 1100 800 400

nanogramas/L 210 120 170 240 160 270

Kb
9 6 4 2,3 2,2

0,5

800 pb 400 pb

Figura 1. Anlise eletrofortica em gel de agarose a 0,7% da reao de clivagem dos clones selecionados como recombinantes, aps a transformao bacteriana. As raias 1, 2 e 4 correspondem ao padro de clivagem que confirma a subclonagem. A raia 3 representa uma amostra negativa para a subclonagem. M: marcador de tamanho molecular HindIII.

4 CONCLUSO O sucesso no seqenciamento de fragmentos de DNA requer que o DNA a ser seqenciado seja cuidadosamente processado, durante as etapas de subclonagem, extrao de DNA e quantificao do DNA extrado. As etapas seguintes consistem na leitura e alinhamento das seqncias geradas. Nesse trabalho, a clonagem do fragmento de 1254 pb consistiu em uma etapa crucial para se conseguir contigs da regio j seqenciada, permitindo a obteno completa da seqncia de ~ 4.000 pb pertencente unidade de transcrio do gene C3-22 de R. americana e regio a 3. REFERNCIAS BARNES, W. M. Sequencing DNA with dideoxyribonucleotides as chain terminators: hints and strategies for big projects. Methods in Enzymology, v. 152, p. 538-556, 1987. BROWN, T. A. Clonagem gnica e anlise de DNA: Uma introduo. 4 ed. Porto Alegre: Artmed, p. 376, 2003.

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DEL SAL, G.; MANFIOLETTI, G.; SCHNEIDER, C. The CTAB-DNA precipitation method: a common mini-scale preparation of template DNA from phagemids, phages or plasmids suitable for sequencing. Biotechniques, v. 7, p. 514-520, 1989. EELTINK, S.; SVEC, F. Recent advances in the control of morphology and surface chemistry of porous polymer-based monolithic stationary phases and their application in CEC. Electrophoresis, v. 28, n. 1-2, p.137-147, 2007. FRANA, L.T.; CARRILHO, E.; KIST, T. B. A review of DNA sequencing techniques. Quarterly Reviews of Biophysics, v. 35, n. 2, p. 169-200, 2002. KARGER, A. E.; HARRIS, J. M. GESTELAN, R. F. Multiwavelength fluorescence detection for DNA sequencing using capillary electrophoresis. Nucleic Acids Research, v. 19, n. 18, p. 4955-4962, 1991. KIMURA, E. T.; BAA, G. S. Rede ONSA e o Projeto Genoma Humano do Cncer: Contribuio ao Genoma Humano. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabolismo, v. 46, n. 4, p. 325-329, 2002. MARTIN, W. J. New technologies for large-genome sequencing. Genome, v. 1, n. 2, p.1073-80, 1989. MULLIS, K. B.; FALOONA F.; SCHARF, S.; SAIKI R. K.; HOM, G. T.; ERLICH H. A. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, v. 51, Pt. 1, p. 263273, 1986. NICKERSON, D. A.; TOBE, V. O.; TAYLOR, S. L. PolyPhred: automating the detection and genotyping of single nucleotide substitutions using fluorescence-based resequencing. Nucleic Acids Research, v. 25, n. 14, p. 2745-2751, 1997.

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