Anlise de Protenas

Prof. Eduardo Purgatto Depto. de Alimentos e Nutrio Experimental FCF USP Curso de Graduao Disciplina de Bromatologia Bsica
2005

Protenas
Macromolculas compostas de vrios AMINOCIDOS unidos por ligaes covalentes denominadas LIGAES PEPTDICAS

Classificao
Composio:
Simples (apenas AAs) Conjugadas com compostos no-AA

Glicoprotenas,

Lipoprotenas, fosfoprotenas, etc.

Classificao
Estrutura
Fibrosas (ex. colgeno)

Globulares (ex. albuminas, mioglobina)

Conjugadas (ex. Hemoglobina)

Classificao
Funo biolgica
- Elementos estruturais (colgeno) e sistemas contrteis; - Armazenamento (ferritina); - Veculos de transporte (hemoglobina); - Hormnios; - Enzimtica (lipases); - Nutricional (casena); - Agentes protetores (imunoglobulina); Entre outras...

Classificao
Solubilidade
Hidroflicas Hidrofbicas

Conalbumina

Protenas de membranas

Contedo em alimentos
Muito varivel Alimentos de origem animal e leguminosas so timas fontes de protenas

Anlise de protenas
Os princpios bsicos incluem:
Determinao de nitrognio orgnico (Kjeldahl) Presena de ligaes peptdicas (Biureto) Absoro no UV (devido a Trp e Tyr) Presena de grupos amino livres (Ninhidrina Arg e Lys) Capacidade de ligao de corantes (Bradford) Presena de AAs aromticos (Fluorescncia - Phe e Trp)

Mtodo de Kjeldahl
Desenvolveu em 1883 o processo bsico para determinao de nitrognio orgnico total. Os passos incluem:
Johann Kjeldahl (1849-1900)

Digesto: H2SO4 (conc.) a 350-400oC + catalisador Neutralizao e Destilao Titulao Converso do teor de N total para teor de protena

Mtodo de Kjeldahl
Protena H2SO4 (conc.) + K2SO4 + catalisador (NH4)2SO4

K2SO4 : Aumenta o Ponto de Ebulio do H2SO4 (de 337 para mais de 400oC) Digesto mais eficiente CuSO4 : Catalisador. Acelera o processo de oxidao da matria orgnica

Mtodo de Kjeldahl
Neutralizao e Destilao (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O

NH3

H3BO3

NH4H2BO3 Borato de amnio

Mtodo de Kjeldahl
Titulao NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4Cl

Mtodo de Kjeldahl
At que ponto o cido adicionado amostra? At o PONTO DE VIRAGEM

Volumetria
Baseado na equivalncia entre o contedo de N na amostra e o HCl usado na TITULAO

Tcnica analtica utilizada para determinar a concentrao de um determinado reagente Tambm chamada de Anlise Volumtrica

Volumetria

Bureta contm o Titulante

Titulante = Soluo padro de um reagente de Concentrao conhecida

Frasco contm a amostra a ser Titulada + um indicador

Indicador = Substncia que sofre mudana de cor quando atingido o PONTO DE EQUIVALNCIA entre o Titulante e a Amostra

Volumetria
1o passo: Despejar lentamente o contedo da bureta sobre a amostra agitando esta ltima constantemente. 2o passo: Quando ocorrer a mudana de incolor para rosa claro, a titulao ter atingido o ponto de equivalncia entre a base e o cido

NaOH 0,1N

3o passo: Anotar o volume de Titulante gasto e calcular a concentrao do Titulado.

Amostra contm HCl + Fenolftalena

Ntitulante x Vtitulante = Ntitulado x Vtitulado 0,1 x 10 ml = Ntitulado x 20 ml Ntitulado = 0,05 N

Mtodo de Kjeldahl
1 Eq HCl _____________ 1 Eq Nitrognio 1N (1Eq/1000 mL) _____ 14 g Nitrognio 1N (1mL) ____________ 0,014g Nitrognio 0,1N (1mL) ___________ 0,0014g Nitrognio Logo: 1mL (0,1N) __________ 0,0014g Nitrognio Vol. de HCl __________ Xg Nitrognio

Mtodo de Kjeldahl
A maioria dos alimentos (*) possui em mdia 16% de nitrognio, portanto:

16g N _______ 100g protenas 1g N ________ Xg

Xg = 100/16 =

6,25

O teor de protena bruta de um alimento obtido pela multiplicao do teor de N - total pelo fator de converso (6,25).

Mtodo de Kjeldahl
O contedo de protena para alimentos especficos pode utilizar fatores especficos:
% de N na protena Ovo ou carne Leite Trigo Milho Aveia Soja Arroz 16,0 15,7 18,76 17,70 18,66 18,12 19,34 Fator 6,25 6,38 5,33 5,65 5,36 5,52 5,17

Mtodo de Kjeldahl
Vantagens
Aplicvel a todos os tipos de alimentos Relativamente simples No caro Preciso. Trata-se de um mtodo oficial para a determinao de protenas Vem sendo modificado para anlise de microgramas de protena (micro Kjeldhal)

Desvantagens
Mede Nitrognio orgnico total, no apenas nitrognio de protenas Demorado menos preciso que o mtodo do biureto Utiliza reagentes corrosivos.

Mtodo de Kjeldahl
Outras possveis fontes de N na amostra: Amino cidos livres Pequenos peptdeos cidos nuclicos Amino acares Porfirinas Algumas Vitaminas Alcalides Uria ons Amnio

DNA

Cianocobalamina (Vit. B12)

Clorofila

Mtodo de Kjeldahl
1. Digesto: H2SO4 (conc.) a 350400oC + catalisador 2. Neutralizao e Destilao 3. Titulao 4. Converso do teor de N total para teor de protena

Mtodo de Kjeldahl
1. Digesto: H2SO4 (conc.) a 350400oC + catalisador