Universidade Federal do Rio de Janeiro Cincias Biolgicas- Modalidade Biofsica- Plo Xerm.

Dsciplina: Mtodos Biofsicos

Nome: Gabriela Pimenta Dos Reis Professora: Lilian T. Costa

Trabalho: Descreva o fluxo eletroosmtico para eletroforese em gel e de capilar. 1. ELETROFORESE EM GEL uma tcnica de separao de molculas onde as partculas que so carregadas negativamente por um composto denominado SDS (detergente dodecil sulfato de sdio), com exceo do DNA que j possui um carter de ction, migram em um determinado gel durante a aplicao de uma diferena de potencial em direo a um eletrodo positivo, sendo que este criado por uma corrente eltrica, e posteriormente so aplicadas sobre o gel, e assim o princpio fsico da eletroforese bastante simples: partculas com carga eltrica so aceleradas quando colocadas em um campo eltrico; essa fora de propulso rapidamente balanceada pela fora de frico do meio, nesse momento as partculas movem-se uma velocidade constante, proporcional corrente eltrica, e sob influncia da diferena de potencial. Quando uma molcula se move em um campo eltrico, a taxa de migrao e a direo da migrao dependem do nmero de cargas e a carga positiva ou negativa. Se a molcula tem carga positiva, ela vai se mover para o polo negativo e vice-versa. Em gis como o de poliacrilamida, o meio funciona como uma peneira, retardando preferencialmente as molculas grandes, fazendo com que sejam separadas pelo seu tamanho. O gel de agarose tambm funciona a partir deste mesmo princpio, mas ele contm uma trama mais frouxa, e geralmente ele utilizado para separar molculas maiores. Para a separao das molculas nesta tcnica, temos que levar em considerao o tamanho da molcula, sendo que as de menor massa migram mais rapidamente do que as de maior, pois possuem mais agilidade de mobilidade. Em alguns casos a estrutura da molcula tambm influencia, pois dependendo da estrutura as mesmas migraro com maior ou menor facilidade pelo gel. importante ressaltar que a eletroforese em gel muito utilizada para a separao de protenas e molculas de DNA e RNA. o SUBDIVISES DA ELETROFORESE EM GEL: o ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose um polissacardeo composto por agar e pectina. Para preparar este gel, simplesmente faz-se a mistura entre o p de agarose e soluo tampo. Aps fundir,

coloca-se brometo de etidium, que tem ampla afinidade pelo DNA, e revela sobre presena de UV(ultra violeta) os cidos nuclicos. Quando a mistura esfriar o gel estar duro. Esse endurecimento feito em um local apropriado, o mesmo local onde ser feita a corrida da amostra. Um detalhe importante a colocao do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria poos que sero utilizados para a colocao das amostras. Podemos ver este processo como uma corrida. Cada um colocado numa pista e na presena de uma corrente eltrica vai deixando o seu rasto. So estes rastos que sero comparados no mtodo. Se formos utilizar o gel de agarose para avaliar a migrao de uma molcula de DNA, por exemplo, o tamanho e a conformao da molcula de DNA, a concentrao do gel de agarose , a corrente eltrica aplicada e tipo de tampo usado influenciam a velocidade da partcula no gel. o ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

A poliacrilamida uma mistura de dois polmeros, acrilamida e bisacrilamida. Para preparar este gel, basta adicionar os dois polmeros nas concentraes desejadas em um suporte de vidro e na presena de um catalisador. Esta tcnica utilizada, pois o gel poliacrilamida tem a capacidade de separar fragmentos muito pequenos de molculas e que apresentam uma mnima diferena de massa, alm disso o gel pode recuperar e purificar determinada amostra. Apesar das vantagens, o gel de agarose mais utilizado pois a poliacrilamida muito txica e difcil de ser preparada. Neste tipo de gel a corrida feita em cubas verticais, e o corante utilizado o mesmo da eletroforese em gel de agarose. Pode ser usado o SDS (dodecil sulfato de sdio) na composio do gel. A protena deve ser previamente desnaturada por aquecimento na presena de -mercaptoetanol para romperem as pontes de dissulfeto e os polipeptdeos adquirirem a carga negativa do SDS. A migrao do complexo SDS-protena no depende da conformao protica, mas do seu tamanho. Na saturao, cerca de 1,4g de SDS ligado por grama de protena, o que corresponde a uma molcula de SDS para cada dois resduos de aminocidos. O sistema SDS-Page formado por dois gis diferentes: o gel concentrador e o gel separador. O gel concentrador formado por uma malha de grande porosidade (gel de poliacrilamida 5%). Tem funo de compactar a amostra em um pequeno volume, depositando-a sobre a superfcie - limite do gel separador como uma banda estreita. O gel separador tem uma malha mais estreita (poliacrilamida a 8-20%) que tem a funo de separar os complexos SDS-protena em funo de suas massas moleculares. O que permite que a amostra seja compactada para a faixa estreita entre os dois gis a diferena de pH entre a constituio do gel e o tampo de corrida utilizado. O tamanho dos poros diminui com o aumento da relao molar bisacrilamida/acrilamida.

Para visualizao das bandas de protenas mergulha-se o gel, aps a migrao, em corante comassie-blue ou sais de prata.

2. ELETROFORESE CAPILAR

A eletroforese definida como o transporte, em soluo eletroltica, de compostos carregados eletricamente sob a influncia de um campo eltrico, no qual a separao entre dois solutos ocorre de acordo com diferenas entre suas mobilidades eletroforticas. Esta tcnica que foi introduzida em 1981, por Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita cada vez mais, como um importante mtodo analtico. Em sua forma mais simples a eletroforese capilar uma aproximao da tcnica original, descrita por Tiselius para o estudo de protenas em soro, porm emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletrlito, tendo como principal vantagem o uso de capilares com dimetros internos extremamente pequenos (na faixa de 15melhor dissipao do calor e, assim, possvel obter uma alta eficincia de separao com tempo reduzido de anlise. A eletroforese capilar uma tcnica aplicvel na determinao de uma grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos aromticos, vitaminas hidrossolveis e lipossolveis, amino cidos, ons inorgnicos, cidos orgnicos, frmacos, catecolaminas, substncias quirais, protenas, peptdeos e muitos outros. Uma caracterstica que difere a eletroforese capilar das demais tcnicas a sua capacidade nica para separar macromolculas carregadas eletricamente de interesse tanto em indstrias de biotecnologia quanto em pesquisas biolgicas. Um exemplo disso o projeto Genoma Humano, que teve como meta obter a seqncia completa do DNA humano e para isso foi necessrio distinguir os diversos polinucleotdeos, com massas molares, por volta de 200 a 500 Daltons que diferiam entre si por um nico nucleotdeo. Somente a eletroforese capilar tem resoluo suficiente para este tipo de separao. Alm disso, o DNA humano contm cerca de trs bilhes de nucleotdeos e as altas

velocidades de anlises, obtido pela eletroforese capilar, permitiram que milhares de nucleotdeos fossem seqenciados em um nico dia. o ELETROFORESE CAPILAR EM ZONA OU SOLUO LIVRE A separao de ons a forma mais simples de eletroforese capilar e denominada eletroforese capilar em soluo livre ou em zona. Muitos compostos podem ser separados rapidamente e facilmente por esta tcnica, pois a separao em nesta tcnica baseada nas diferenas nas mobilidades eletroforticas resultantes das diferentes velocidades de migraes de espcies inicas no tampo, contido dentro do capilar. O capilar preenchido com uma soluo tampo de composio constante, a qual est presente tanto no nodo como no ctodo. Em uma amostra tem-se uma mistura de espcies carregadas eletricamente e espcies neutras, onde os ons, apresentam tamanhos e cargas diferentes. A amostra introduzida na extremidade andica (nodo) do tubo e, ao ser aplicada uma diferena de potencial entre as extremidades da coluna, os ons migram atravs do tubo com diferentes velocidades e em diferentes sentidos. A velocidade e o sentido de migrao dependem do tamanho e da magnitude de carga de cada on. Deve ser ressaltado que as espcies neutras no sofrem influncia do campo eltrico e por isso migram conjuntamente. Na eletroforese capilar de zona, alm dos solutos, a soluo tampo, normalmente, move-se atravs do capilar sob o efeito de um campo eltrico (Este fenmeno denominado fluxo eletroosmtico ou eletro-endosmtico). Durante uma operao convencional, o fluxo eletroosmtico origina-se no nodo e dirige-se ao ctodo devido formao de uma dupla camada inica que ocorre na interface entre o capilar de slica fundida e a soluo nele contida. Os grupos silanis presentes na superfcie do capilar so cidos fracos que se ionizam a partir de pH 3-4 (estando totalmente ionizados em meio alcalino), criando uma superfcie carregada negativamente. Esta camada negativa na superfcie atrai para sua proximidade as espcies carregadas positivamente da soluo, formando uma camada positiva, a qual ser mobilizada pela presena do campo eltrico. A atrao dessa camada pelo ctodo arrasta a soluo do interior da coluna, criando assim um fluxo com perfil reto, em contraste com o perfil parablico que criado em sistemas pressurizados. O fluxo eletroosmtico proporciona duas grandes vantagens, sendo que a primeira delas que ctions e nions podem ser separados numa nica anlise, e a outra vantagem que mesmo os ons com razes carga/raio muito diferentes podem ser analisados em um tempo relativamente curto devido magnitude este fluxo. O pH da soluo tampo um dos parmetros que afeta fortemente a separao em eletroforese capilar em zona, pois este parmetro afeta tanto o fluxo eletroosmtico, quanto a mobilidade eletrofortica dos analitos. Isto, tendo em vista medida que o pH elevado tem-se um aumento do fluxo eletroosmtico, pois ocorre um aumento da dissociao dos grupos Si-OH que se encontram nas paredes internas do capilar. O fluxo eletroosmtico tambm afetado pela concentrao do tampo e pela fora inica mas, sobretudo, pelo pH. No que se refere ao controle da seletividade da separao dos analitos, a variao do pH afeta o grau de ionizao dos analitos e, portanto, suas mobilidades eletroforticas. Normalmente, o tampo escolhido para promover a melhor separao entre os analitos e no necessariamente a velocidade eletroosmtica mais adequada.

A anlise qualitativa feita atravs da comparao dos tempos de migrao dos padres com os tempos de migrao das substncias presentes na amostra e/ou atravs de espectros de UV/Vis (detector por arranjo de diodos) ou do espectro de massas (detector espectrmetro de massas). A quantificao das substncias, com concentraes desconhecidas, presentes na amostra, feita atravs do procedimento usual de calibrao.

o ELETROFORESE CAPILAR EM GEL

A separao de biomolculas grandes, tais como DNA, s vezes muito difcil de se obter devido similaridade nas razes massa/carga. Assim EC muitas vezes no suficiente para separar estes tipos de substncias. Uma alternativa preencher o capilar com um gel, onde o principal mecanismo de separao est baseado nas diferenas nos tamanhos dos solutos que migram atravs dos poros do polmero. Esta tcnica denominada eletroforese capilar em gel. ons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores ficam mais tempo retidos. Alm disso, o gel serve como um meio anticonvectivo, minimizando a difuso dos solutos. Ele tambm previne a adsoro do soluto nas paredes do capilar e ajuda a eliminar a eletroosmose. A implementao da tecnologia para fabricao de capilares preenchidos com gel confrontou-se com vrios problemas. Primeiramente, ocorria o fenmeno de encolhimento do polmero durante o processo de fabricao no interior do capilar, o que gerava rupturas na estrutura final do gel. Estas rupturas estruturais formavam bolhas de ar, que eventualmente causavam interrupo da corrente eltrica durante a eletroforese. Outro aspecto relacionava-se com o uso de altas voltagens. Nestas condies, o fluxo eletroosmtico era suficientemente forte para arrastar o gel para fora do capilar. Por este motivo, o uso de agarose na fabricao de capilares foi logo descartado, porque alm do baixo ponto de fuso, agarose contm grupos ionizveis, capazes de gerar fluxo eletroosmtico. Em 1987, B. L. Karger e A. S. Cohen apresentaram solues para ambos os problemas, descrevendo, a fabricao detalhada de capilares preenchidos com gis fisicos. O mtodo de Karger e Cohen consiste num pr-tratamento do capilar com o reagente de dupla finalidade: eliminar o fluxo eletroosmtico atravs de uma ligao covalente com os grupos da superfcie capilar e evitar a extruso do gel durante operao do sistema, atravs da ligao covalente com o gel a ser formado na etapa seguinte. O capilar ento preenchido com uma soluo tamponada e com catalisador. As extremidades do capilar so imersas em soluo tampo e a polimerizao do gel ocorre, aps algumas horas. Uma das principais vantagens de realizar separaes eletroforticas em um capilar que o seu formato possibilita a dissipao eficiente do calor gerado pelo efeito Joule. Em CGE, esta vantagem duplamente verificada, em razo da geometria do capilar e das propriedades anti-convectivas do gel.

Referncias: http://www.chemkeys.com/artigo/1/14