3

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL APLICADA1

3.1 Anlise microbiolgica da gua (Decreto-lei 243/2001; anexo III)
Objectivos (1) Determinar os principais parmetros microbiolgicos de qualidade da gua; (2) Executar a tcnica da inoculao de tubos mltiplos e da quantificao indirecta de microrganismos coliformes pelo mtodo do nmero mais provvel (NMP); (3) Comparar os resultados obtidos com a legislao actual e criticar a qualidade sanitria da amostra de gua analisada. Introduo As fontes de gua potvel esto sujeitas a contaminaes por matria fecal dos esgotos ou de outra origem, podendo provocar infeces intestinais como febre tifide, disenteria e clera. A identificao das bactrias patognicas constituiria a prova mais directa de uma contaminao perigosa, mas tais organismos, quando presentes, encontram-se geralmente em to escasso nmero que as dificuldades tcnicas do seu isolamento tornam o ensaio impraticvel como mtodo de rotina. Assim, fazem-se pesquisas de microrganismos (ou grupos de microrganismos) denominados indicadores de contaminao da gua por fezes humanas ou de outros animais (bactrias entricas, bactrias coliformes, bactrias fecais). A anlise bacteriolgica da gua no feita apenas a guas que se destinam ao consumo das populaes, mas tambm a guas destinadas ao recreio (praias, rios, piscinas, etc.), aquacultura e rega. igualmente importante, numa perspectiva de preservao dos ecossistemas, vigiar a qualidade das guas que no tm uma utilizao especificamente humana. O processo de rotina consta de contagens em placa para determinar o nmero de bactrias presentes, testes para revelar a presena de bactrias coliformes e testes para revelar a presena de estreptococos fecais. As bactrias coliformes so indicadoras de poluio fecal e incluem bastonetes Gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos que no formam esporos e fermentam lactose com produo de cido e gs em 48 horas e a uma temperatura de 37 C, na presena de sais de blis. Como exemplo, citam-se Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e Klebsiella pneumoniae. O grupo dos microrganismos denominados "coliformes totais" inclui todos os coliformes especficos e no especficos do material fecal. um bom indicador microbiolgico da qualidade da gua, porque facilmente detectvel e quantificvel. A ausncia de coliformes totais numa gua potvel garante a sua pureza bacteriolgica. A sua presena pressupe que o tratamento da gua foi inadequado ou que a rede de distribuio no estanque e foi contaminada por guas residuais. A tecnologia actual do tratamento de guas permite, atravs do controlo cuidado da coagulao, sedimentao e filtrao, que mais de 99% dos coliformes sejam removidos.

Modificado de: (1) GALHANO, C., DUARTE, I. & ABELHO, M. Trabalhos prticos de Biologia mdulo Microbiologia, 2007/2008. ESAC, Coimbra. 2007; (2) GRUPO DE APIO COMUNIDADE - MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA. Anlise microbiolgica da gua, ESAC, 2005; (3) GAMAZO, C., LPEZ-GOI, I. & DAZ, R. Manual prctico de microbiologa. 3 edio, Masson, Barcelona. 2005; (2) PEPPER, I.L. & GERBA, C.P. Environmental microbiology a laboratory manual. 2 edio, Elsevier Academic Press, Amsterdo, 2004.

Protocolos de Microbiologia Ambiental

O grupo de microrganismos denominados "coliformes fecais" um subgrupo do anterior. Permite estabelecer uma correlao mais precisa entre a existncia de coliformes numa amostra de gua e a entidade responsvel pela sua libertao, que ter sido um organismo homeotrmico. De entre os coliformes que existem nas fezes de animais homeotrmicos, mais de 90% so coliformes fecais. Estes coliformes fermentam a lactose com produo de cido e gs a 44C.

conveniente pesquisar tambm a existncia de estreptococos fecais. A ocorrncia destes indica que houve contaminao fecal. Embora raramente se multipliquem na gua so capazes de persistir por longos perodos de tempo, desde que a temperatura e a concentrao hidrogeninica sejam favorveis. So muito resistentes, suportando concentraes relativamente altas de cloro. Exemplos deste grupo so Streptococcus durans e S. fecalis (homem) e S. faecium (vaca e ovelha). Os estreptococos so cocos, Gram-positivos e do resposta negativa ao teste da catalase. A determinao do nmero total de microrganismos vivos na gua constitui uma prova complementar (embora de limitado valor quando isolada), que fornece indicaes quanto ao teor e natureza da matria orgnica da amostra. O teste realizado a 22C e a 37C em caixas de Petri inoculadas por incorporao. Determina-se assim o nmero de bactrias mesfilas, heterotrficas, aerbias e anaerbias no estritas. 3.1.1 RECOLHA DE AMOSTRAS DE GUA PARA ANLISE MICROBIOLGICA

As mos e a roupa dos intervenientes na colheita devem estar limpas. Os recipientes para colheita das amostras de gua devem estar esterilizados. A amostra de gua deve ser colhida obedecendo aos cuidados de assepsia, deve ser representativa das caractersticas microbiolgicas do material a analisar e deve ter volume suficiente para permitir, se necessrio, a repetio dos testes (i.e. 500 mL). O recipiente (esterilizado) para a amostra deve permanecer fechado at ao momento da colheita; nessa altura enche-se sem enxaguar com a gua a analisar e fecha-se imediatamente, tendo cuidado para no contaminar durante estas operaes as superfcies interiores da rolha ou tampa. O frasco no deve ficar completamente cheio, pois algum espao vazio no seu interior facilitar a agitao e mistura da amostra antes de se efectuarem as anlises. Aps a colheita, os recipientes devem ser mantidos numa mala trmica para que a amostra no sofra alteraes relativamente ao seu contedo microbiolgico. Material e mtodos RECOLHA DE AMOSTRAS DE GUA DE UMA TORNEIRA 1. 2. 4. 5. 6. Lavar e desinfectar as mos (ou usar luvas) Retirar qualquer filtro (Figura 1, 1) e deixar correr o tempo necessrio (1-2 minutos) para esgotar a gua que tenha estado parada na canalizao (Figura 1, 2) Fechar a torneira e flamejar bem (no interior e no exterior) com um maarico ou uma tocha embebida em lcool (Figura 1, 3) Abrir a torneira com cuidado e deixar a gua correr de novo at arrefecer (Figura 1, 4) Abrir o frasco esterilizado s neste momento e colher a gua mantendo-o inclinado para evitar a sua contaminao pelo ar. Manter a rolha na mo esquerda virada para baixo e nunca tocar no interior da rolha ou no gargalo do frasco (Figura 1, 5) Recolher a amostra de gua mantendo o frasco inclinado para evitar a sua contaminao pelo ar e sem encher completamente o frasco (Figura 1, 6) Fechar imediatamente o frasco (Figura 1,7)

7. 8.

2|Pgina

Protocolos de Microbiologia Ambiental

9.

Colocar um rtulo que contenha a identificao da amostra: nome do requisitante; origem; ponto de amostragem e data de colheita 10. Transportar as amostras em caixa isotrmica com placas acumuladoras trmicas congeladas e realizar a anlise at 6 horas aps a colheita

Figura 1. Procedimento para a recolha de amostras de gua a partir de uma torneira.

RECOLHA DE AMOSTRAS DE GUA DE UM CURSO DE GUA OU DE UM RESERVATRIO 1. Segurar o frasco numa zona perto da sua base e mergulh-lo na massa de gua com a boca virada para baixo. Deve mergulhar-se at cerca de metade da altura da coluna lquida ou pelo menos at cerca de 20 cm abaixo da superfcie da gua Virar o frasco at que o gargalo aponte ligeiramente para a superfcie e a boca esteja voltada contra a corrente. Se no existir qualquer corrente (por exemplo, no caso de um reservatrio) empurrar o frasco horizontalmente Recolher a amostra e fechar imediatamente o frasco

2.

3.

3.1.2

ENUMERAO DE MICRORGANISMOS VIVEIS A 22C E A 37C (ISO 6222, 1999)

Consiste na enumerao de microrganismos cultivveis2, por contagem de UFC em agar nutritivo aps incubao aerbia a 22 e a 37C, em guas destinadas ao consumo humano. Faz-se a inoculao de um volume conhecido de amostra ou suas diluies, por homogeneizao com um meio de cultura especfico em caixas de Petri, com incubao de um conjunto a 37C durante 44 horas e de outro conjunto a 22C durante 68 horas. No final contam-se as colnias das caixas contveis e faz-se o clculo do nmero de UFC por mililitro da amostra. As bactrias aerbias mesfilas so aquelas que se multiplicam em aerobiose a temperaturas entre 20 e 40C. Neste grupo existem bactrias patognicas e no patognicas. O mtodo permite-nos conhecer a qualidade microbiolgica da gua; elevadas quantidades de mesofilos indicam que a gua no apropriada para consumo humano. Material e mtodos 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com as normas EN 25667-2 e EN ISO 5667-3 (ver acima)
2

Todos os microrganismos bactrias, fungos e leveduras capazes de formar colnias no meio especificado sob as condies de teste descritas.

3|Pgina

Protocolos de Microbiologia Ambiental

2. Fazer 3 diluies decimais sucessivas da amostra, fazendo inoculaes da amostra e das suas diluies3 3. Incorporar um inculo de 1 mL em 15-20 mL de meio plate count agar (PCA) fundido 4. Inocular no mnimo uma caixa de Petri por cada temperatura de incubao 5. Deixar solidificar, inverter e incubar um conjunto a 372C durante 444h e o outro conjunto a 222C durante 684h 6. Observar as caixas assim que terminar o tempo de incubao ou armazen-las a 53C e fazer a observao num perodo de 48h 7. Rejeitar as caixas de Petri que contenham colnias confluentes; nas outras caixas contar o nmero de colnias para cada temperatura de incubao 8. Exprimir os resultados como nmero de UFC/mL da amostra para cada temperatura 9. Se no existirem colnias nas caixas inoculadas com a amostra no diluda, exprimir os resultados como no detectados num mL. Se existirem mais de 300 colnias nas caixas inoculadas com a diluio maia alta utilizada, exprimir os resultados como> 300 Resultados 10. O relatrio deve incluir a referncia norma e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao e deve incluir tambm: a identificao completa da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados de contagem expressos como UFC/mL e qualquer ocorrncia particular observada durante o decorrer da anlise

3.1.3

ENUMERAO DE COLIFORMES TOTAIS, FECAIS E DETECO DE E. COLI

O grupo dos coliformes pertence famlia Enterobacteriaceae e inclui vrios gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. O seu habitat natural o intestino do homem e dos outros animais homeotrmicos, mas tambm podem ser isolados noutros ambientes como o solo, as plantas, etc., pelo que os coliformes totais no apresentam boa especificidade como indicadores de contaminao fecal. Apesar disso, a sua frequncia nas fezes, a sua fcil deteco e a possibilidade de que juntamente com eles existam microrganismos patognicos tornam-nos um dos principais indicadores de contaminao fecal. De acordo com as normas e a legislao em vigor, a enumerao de coliformes e a deteco de E. coli em guas destinadas ao consumo humano e outras, deve fazer-se atravs da filtrao por membrana, com cultura em meio diferencial de agar e clculo do nmero de microrganismos-alvo da amostra. Na tcnica da filtrao por membrana, a amostra deve conter pouca matria em suspenso de forma a no interferir com a filtrao, cultura e contagem. No entanto, a enumerao dos coliformes pode ser tambm feita pelo mtodo dos tubos mltiplos com determinao do Nmero Mais Provvel (NMP). O teste completo permite determinar os coliformes totais e os coliformes fecais (mas no especificamente E. coli) para o que so necessrias trs fases: teste presuntivo, teste confirmativo e teste final.

O mtodo no prev a inoculao de diluies; o uso de diluies neste exerccio pretende facultar aos alunos o treino da execuo de diluies decimais sucessivas e da contagem em placa, que no seria possvel caso os resultados fossem incontveis.

4|Pgina

Protocolos de Microbiologia Ambiental

No teste presuntivo (verificao da produo de gs) inoculam-se volumes apropriados da amostra em sries de tubos contendo meio de cultura apropriado, e a incubam-se a 350,5 C, durante 242 horas. Se findo esse perodo no tiver havido formao de gs em nenhum tubo, prolonga-se a incubao at s 483 horas. O meio de cultura inibe o crescimento dos microrganismos Gram-positivos e encoraja o crescimento dos microrganismos coliformes. Os coliformes usam o oxignio presente no meio e atravs da fermentao produzem cido e gs sob condies anaerbias. Se no existir produo de gs o resultado do teste negativo, estabelecendo-se que no existem coliformes na amostra. A formao de gs (resultado positivo) determina a presena de coliformes na amostra. O nmero de tubos positivos utilizado para calcular o NMP de microrganismos coliformes na amostra de gua. No teste confirmativo (confirmao dos resultados) todos os tubos positivos s 24 horas so repicados para um caldo de verde brilhante, lactose e sais de blis (VBLB), incubados a 35C e lidos nas condies anteriormente descritas. A formao de gs confirma a presena de coliformes na amostra. Este teste confirma os resultados uma vez que a formao de gs no teste presuntivo pode ter sido devida actividade de microrganismos no coliformes, como por exemplo Clostridium perfringens, que Grampositiva. No teste final (verificao da presena de coliformes fecais), repete-se o procedimento utilizado no teste confirmativo mas a incubao feita a 44.5C durante 24 a 48 horas. A formao de gs determina a presena de coliformes fecais na amostra. Se no existir formao de gs a 44.5C mas existir a 35C determina-se que existem coliformes mas que no so fecais. O NMP de coliformes fecais determinado com base no nmero de tubos positivos. Um teste adicional permite determinar se a presena ou ausncia de E. coli na amostra. Adiciona-se aos tubos inoculados para o teste final reagente de Kovacs (teste do indol). Uma reaco positiva (formao de um anel cor-de-rosa) mostra a presena de E. coli. Uma reaco negativa (formao de um anel da cor do meio) mostra que E. coli no faz parte da populao de coliformes fecais presentes na amostra. Material e mtodos TESTE PRESUNTIVO 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com as normas EN 25667-2 e EN ISO 5667-3 (ver acima) 2. Inocular 1 srie de 5 tubos com 10 mL de meio verde brilhante duplo (contendo um tubo Durham4) com 10 mL da amostra 3. Inocular 1 srie de 5 tubos com 10 mL de meio verde brilhante simples (contendo um tubo Durham) com 1 mL da amostra 4. Inocular uma srie de 5 tubos com 10 mL de meio verde brilhante simples (contendo um tubo Durham) com 0.1 mL da amostra5 5. Levar a incubar a 370.5 C, durante 242 horas 6. Na aula seguinte verificar a produo de gs nos tubos, anotando o nmero de tubos positivos e negativos em cada srie (embora este passo seja feito na aula seguinte, a verificao dos tubos positivos deveria ser feita aps 24 e 48 horas)
4

Os tubos Durham acumulam o gs produzido pelos coliformes permitindo assim a deteco da sua presena numa dada amostra de gua; a presena de gs nos tubos Durham um resultado positivo para coliformes. A utilizao de inculos de 10 mL, 1 mL e 0.1 mL semelhante a inocular a amostra e 2 diluies decimais dessa amostra.

5|Pgina

Protocolos de Microbiologia Ambiental

7. Determinar o NMP de microrganismos coliformes na amostra (ver abaixo) TESTE CONFIRMATIVO E TESTE FINAL6 8. Repicar com uma ansada os tubos positivos para novos tubos contendo 10 mL de meio verde brilhante 9. Levar a incubar a 44.5C durante 24+24 horas 10. Na aula seguinte verificar a produo de gs nos tubos, anotando o nmero de tubos positivos e negativos em cada srie 11. Determinar o NMP de coliformes fecais na amostra (ver abaixo) DETERMINAO DA PRESENA DE E. COLI (TESTE DO INDOL)

12. Repicar com uma ansada os tubos positivos para novos tubos contendo 10 mL de meio peptonado 13. Levar a incubar a 44.5C durante 24+24 horas 14. Na aula seguinte adicionar uma gota de reagente de Kovacs a cada um dos tubos 15. A formao de um anel cor-de-rosa um resultado positivo que indica a presena de E. coli na amostra Resultados 16. O relatrio deve incluir a referncia norma e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao e deve incluir tambm: a identificao completa da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados obtidos com os tubos, o NMP de microrganismos coliformes e coliformes fecais na amostra e qualquer ocorrncia particular observada durante o decorrer da anlise. 3.1.4 ENUMERAO DE ENTEROCOCOS

Os enterococos so bactrias Gram-positivas com a forma de cocos, aerbias, com reaco negativa catalase, que fermentam glucose com produo de cido e gs a 37C O seu habitat normal o tubo digestivo do homem e dos outros animais homeotrmicos, por isso so utilizados como indicadores de contaminao fecal. Embora na legislao actual a sua determinao seja levada a cabo atravs da tcnica da filtrao por membrana, tambm se podem quantificar com a tcnica dos tubos mltiplos seguida pela determinao do NMP. Material e mtodos 1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com as normas EN 25667-2 e EN ISO 5667-3 (ver acima) 2. Inocular 1 srie de 5 tubos com 10 mL de meio Bagg duplo com 10 mL da amostra 3. Inocular 1 srie de 5 tubos com 10 mL de meio Bagg com 1 mL da amostra 4. Inocular uma srie de 5 tubos com 10 mL de meio Bagg simples com 0.1 mL da amostra7
6

Embora o teste completo inclua nesta fase a incubao a 35C (para confirmao da presena de coliformes totais teste confirmativo) e a 44.5C (para determinao da presena de coliformes fecais teste final), neste exerccio faremos apenas a incubao a 44.5C, uma vez que a formao de gs a esta temperatura determinar a presena de coliformes fecais e tambm confirmar a presena de coliformes. No entanto, se o teste for negativo para coliformes fecais, no poderemos confirmar a presena de coliformes na amostra.

6|Pgina

Protocolos de Microbiologia Ambiental

5. Levar a incubar a 370.5 C, durante 242 horas (ou 48 horas) 6. Na aula seguinte observar os tubos para deteco da alterao de cor. Um resultado positivo (demonstrando a presena de enterococos) obtido quando a cor do meio de cultura fica amarela 7. Anotar o nmero de tubos positivos e negativos em cada srie 8. Determinar o NMP de enterococos presentes na amostra Resultados

9. O relatrio deve incluir a referncia norma e a classificao da qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao e deve incluir tambm: a identificao completa da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados obtidos com os tubos, o NMP de enterococos na amostra e qualquer ocorrncia particular observada durante o decorrer da anlise. 3.1.5 QUANTIFICAO DE MICRORGANISMOS PELO MTODO DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)

O mtodo do nmero mais provvel (NMP) pode ser usado para estimar o nmero de microrganismos viveis presentes numa determinada populao. A amostra diluda (diluies sucessivas ou inoculao de volumes 10 vezes inferiores para a mesma quantidade de meio) inoculando-se um meio de cultura lquido com um volume preciso dessas diluies. Desta forma, presume-se que os meios de cultura inoculados com as ltimas diluies no vo apresentar qualquer crescimento (resultados negativos) e que ocorrer crescimento nos tubos que tenham, pelo menos, um microrganismo vivel. Se a amostra e as diluies forem homogneas e se houver um nmero suficiente de repeties (podem fazer-se sries de vrios tubos), possvel tratar estatisticamente os resultados e generaliz-los amostra inicial. Por cada diluio da amostra inoculam-se, geralmente, 3-5 ou 10 sries de tubos com o referido meio de cultura (repeties). A prpria designao do mtodo aponta claramente para o carcter probabilstico que lhe deve ser atribudo. O NMP de microrganismos presentes na amostra inicial calcula-se a partir do nmero de tubos que manifestem crescimento (resultados positivos), recorrendo a tabelas estatsticas, como as tabelas de McCrady (Tabela 1).
Tabela 1. Tabela de McCrady para a determinao do nmero mais provvel (NMP) de microrganismos com base em 5 repeties de cada diluio

Nmero de tubos positivos nas diluies 10 mL 1 mL 0.1 mL 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 1 0 0 1 1 0 0 2 0 2 0 0 2 1 0 3 0

NMP por 100 mL de amostra 0 2 4 2 4 6 4 6 6

Nmero de tubos positivos nas diluies 10 mL 1 mL 0.1 mL 4 0 0 4 0 1 4 0 2 4 0 3 4 1 0 4 1 1 4 1 2 4 2 0 4 2 1

NMP por 100 mL de amostra 13 17 20 25 17 20 25 20 25

A utilizao de inculos de 10 mL, 1 mL e 0.1 mL semelhante a inocular a amostra e 2 diluies decimais dessa amostra.

7|Pgina

Protocolos de Microbiologia Ambiental

Nmero de tubos positivos nas diluies 10 mL 1 mL 0.1 mL 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 3 0 1 3 1 1 4 0 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 3 0 2 3 1 2 4 0 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 4 0 3 4 1 3 5 0 NMP por 100 mL de amostra 2 4 6 8 4 6 8 6 8 10 8 10 11 5 7 9 12 7 9 12 9 12 14 12 14 15 8 11 13 11 14 17 20 14 17 20 17 20 20 25 25 Nmero de tubos positivos nas diluies 10 mL 1 mL 0.1 mL 4 2 2 4 3 0 4 3 1 4 3 2 4 4 0 4 4 1 4 4 2 4 5 0 4 5 1 4 5 2 5 0 0 5 0 1 5 0 2 5 0 3 5 0 4 5 1 0 5 1 1 5 1 2 5 1 3 5 1 4 5 2 0 5 2 1 5 2 2 5 2 3 5 2 4 5 2 5 5 3 0 5 3 1 5 3 2 5 3 3 5 3 4 5 3 5 5 4 0 5 4 1 5 4 2 5 4 3 5 4 4 5 4 5 5 5 0 5 5 1 5 5 2 5 5 3 5 5 4 5 5 5 NMP por 100 mL de amostra 30 25 35 40 35 40 45 40 50 55 25 30 45 60 75 35 45 65 85 115 50 70 95 120 150 175 80 110 140 175 200 250 130 170 225 275 350 425 250 350 550 900 1600 1800+

8|Pgina