INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZNIA INPA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS NATURAIS PPGBTRN

Estudo morfomtrico, evolutivo e filogeogrfico nas espcies do gnero Pterophyllum, Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) da Bacia Amaznica.

NATASHA VERDASCA MELICIANO

Manaus AM Abril, 2009.

NATASHA VERDASCA MELICIANO

Estudo morfomtrico, evolutivo e filogeogrfico nas espcies do gnero Pterophyllum, Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) da Bacia Amaznica.

ORIENTADOR: Dr. TOMAS HRBEK Co-orientador: Dra. Izeni Pires Farias

Financiamento:

CT-Amazonia/CNPq (Processo No. 554057/2006-9) BECA (B/2006/01/BMP/09)

Dissertao apresentada ao Programa de Ps - Graduao em Biologia tropical e Recursos Naturais do convnio INPA/UFAM, como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Mestre em Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva.

Manaus AM Abril, 2009.

FICHA CATALOGRFICA
SINOPSE

M522

Meliciano, Natasha Verdasca Estudo filogeogrfico do gnero Pterophyllum, Heckel, 1840 (Cichlidae/Heroini) na Bacia Amaznica, utilizando o gene do citocromo b e morfometria geomtrica / Natasha Verdasca Meliciano.--- Manaus : [s.n.], 2008.

xi, 71 f. : il. Dissertao (mestrado) --- INPA/UFAM, Manaus, 2008 Orientador : Tomas Hrbek Co-orientador : Izeni Pires Farias
rea de concentrao : Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva 1. Pterophyllum Filogeografia. 2. Pterophyllum Morfometria. 3. Peixes - Amaznia. I. Ttulo. CDD 19. ed. 597.5

SINOPSE
Neste trabalho foi desenvolvido, um estudo filogeogrfico dos peixes do gnero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae) no contexto amaznico, utilizando como ferramentas o gene mitocondrial do citocromo b e morfometria geomtrica, buscando entender como este grupo, com trs espcies (P. scalare, P. altum e P. leopoldi), est atualmente distribudo e quais so os provveis processos evolutivos que provocaram ou que mantm a disposio gentica e morfomtrica encontrada nestes peixes ao longo da bacia amaznica. Como resultado foi visto que a delimitao taxonmica molecular condiz com a validao das espcies existentes para o gnero e est, tambm, refletida na diferencio morfomtrica observada. O processo evolutivo da espcie de mais ampla distribuio, P. scalare, resultante de antigos eventos de fragmentao seguidos por episdios de expanso geogrfica e populacional, em conjunto com processos de fluxo gnico associado s plancies de inundao e limitado pela composio qumica das guas, podendo ser visto tanto no perfil molecular quanto no morfolgico destes peixes. Foi evidenciado, tambm, variaes morfomtricas nas regies de simpatria entre duas espcie do gnero (P. altum e P. scalare), diferente do que foi visto nas regies de ocorrncia de somente uma das duas espcies. Contudo necessrio identificar o valor ecolgico e evolutivo das variaoes morfomtricas observadas nas regies de simptria e de ambientes aquticos distintos.

Aos meus queridos pais, Maria Fernanda Ferreira Verdasca Meliciano e Rogrio Ruas dos Santos Meliciano. s minhas amigas e irms, Vanessa Verdasca Meliciano e Priscilla Verdasca Meliciano.

II

AGRADECIMENTOS
No s nesta trajetria, mas durante toda minha vida, gostaria de agradecer a Deus, pois me presenteou com a vida, fora e coragem, reafirmando minha f perdida. Agradeo a minha famlia pelo apoio, compreenso, carinho e pacincia demonstrado, independente de minhas atitudes. Maior gratido devo aos meus pais, Rogrio Ruas dos Santos Meliciano e Maria Fernanda Ferreira Verdasca Meliciano, pela palavra sempre oportuna. minha me dedico gratido adicional por ter apoiado este sonho, mesmo quando esteve com sua sade frgil. Agradeo tambm as minhas duas irms, Vanessa Verdasca Meliciano e Priscilla Verdasca Meliciano, que me deram forte base familiar. Ao meu querido Olavo, agradeo pela ajuda neste projeto, pelo carinho, apoio e compreenso, estando sempre presente, ao meu lado, mesmo fisicamente distante. Agradeo aos meus antigos amigos e aos novos, que conquistei nesta jornada, especialmente: Annelyse, Cleiton, Murilo, Marcelo (Brasa), Slvia, Renato, Carlos (Kak), Pedro (Peter), Rafael (Narck), Rafael (Rafolia), Marco, Gisele, Michelly, Rafael (Angrizzane), Frida e Rafinha, por terem assumido o papel de famlia postia. Agradeo a todas as pessoas que me ajudaram no desenvolvimento deste trabalho, que agora as considero como amigas e colegas de ofcio. A meu ver, realmente praticaram cincia, democratizando o conhecimento e trabalhando em equipe. Sou grata aos meus amigos de trabalho no laboratrio, pelo timo ambiente que promoveram e pelos ensinamentos que melhoraram decisivamente minha pesquisa: Adam, Andria, ureo, Carlinha, Cleiton, Maria da Conceio, Daniel, Eduardo, Edvaldo, Fbio, Kelmer, Liza, Mrio, Marina, Pedro Sena, Pedro Ivo, Rafinha, Themis, Valria, Waleska e Will, todos unidos formam um exemplo de equipe. Agradeo aos docentes Dr. Lcia Rappi-Py Daniel, Dr. Eliana Feldberg e Dr. Jansen Zuanon, pela prestatividade e por contribuir cientificamente para este trabalho. Agradeo a equipe da RDS Piaga Purus, pela ajuda durante algumas coletas. Tenho gratido a muitas outras pessoas que me assistiram durante as coletas deste trabalho, que mesmo sem saber o significado deste projeto me ajudaram muito sem interesse algum: Senhor Carlos, Senhora Ray e famlia, Senhora Iolanda, Senhora Rosa e famlia, Senhor Elder Batista, Senhor Fbio, Senhora Raimunda Farias e famlia, Serelepe e ao Senhor Xavier, Senhora Raimunda e famlia Nogueira. III

Agradeo, especialmente, meu orientador o professor Dr. Tomas Hrbek, por acreditar em mim, por acompanhar e contribuir significativamente no meu desenvolvimento acadmico. O Dr. Tomas me aceitou sem ao menos me conhecer, me orientou com liberdade e exigncia ao mesmo tempo. Respeitou-me como indivduo e reconheceu-me como pesquisador, permitindo o meu desenvolvimento cientfico e a realizao deste sonho. com muita admirao, orgulho e respeito que demonstro o meu sincero obrigado. Com muito carinho agradeo minha co-orientadora, a professora Dr. Izeni Pires Farias, pela confiana, por estar sempre presente e pelos ensinamentos de Gentica e Biologia Evolutiva. Mesmo sendo minha co-orientadora, esteve sempre muito prxima, me acompanhando de perto, estando disposta sempre que necessrio. Agradeo ao programa de Ps-Graduao em Biologia Tropical e Recursos Naturais do convnio INPA/UFAM, especialmente ao curso de Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva (GCBEV/INPA), pela oportunidade de mestrado. Agradeo aos integrantes docentes do curso GCBEV/INPA, pelos conhecimentos adicionados durante o mestrado. Agradeo a Universidade Federal do Amazonas (UFAM) pelo espao utilizado do Laboratrio de Gentica Animal (LEGAL), sob a coordenao da Professora Dr. Izeni Pires Farias. Agradeo a CAPES (Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de nvel Superior) pela bolsa de estudos oferecida. Ao IEB (Instituto Internacional de Educao no Brasil) / programa BECA e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico) pelo financiamento deste trabalho, sob os processos de nmero:

B/2006/01/BMP/09 e 554057/2006-9, respectivamente.

Muito Obrigado!!!

IV

RESUMO
Este trabalho foi desenvolvido em dois captulos: no primeiro foi abordado o enfoque gentico e no segundo foi trabalhado o aspecto morfomtrico dos peixes do gnero Pterophyllum, amplamente distribudos pela bacia amaznica, buscando entender os provveis processos histricos e atuais, que causaram ou que mantm o padro filogeogrfico, haplotpico e morfomtrico, observados nestes peixes, utilizando como ferramentas o gene mitocondrial do citocromo b e morfometria geomtrica, aplicados no estudo de peixes amostrados em quatorze localidades ao longo dos principais tributrios Negro, Solimes e Amazonas. Como resultado, foi visto que, mesmo existindo variao entre os morfotipos e a distribuio espacial e a caracterizao gentica, os padres morfomtricos encontrados apresentam forte relao com o grupo taxonmico delimitado molecularmente. Alm disso, ambas anlises (molecular e morfomtrica) concordaram com a identificao taxonmica clssica efetuada para as trs espcies validadas para o gnero. Em particular, na espcie P. scalare foi possvel observar a existncia de uma complexa histria filogeogrfica, modelada por processos antigos de fragmentao, seguidos por episdios de expanso geogrfica, juntamente com eventos de fluxo gnico e isolamento influenciados pela ampla distribuio da espcie. Porm, no foi possvel observar relao entre a distncia geogrfica e a divergncia gentica e morfolgica entre as localidades estudadas, onde se observou maior variao gentica e morfolgica intralocal do que entre localidades distintas, resultado que pode estar relacionado com as plancies de inundao amaznicas, que oferecem intercomunio, permitindo fluxo gnico e a homogeneidade morfolgica encontrada entre as localidades amostradas. Alternativamente, a homogeineidade morfolgica observada na espcie P. scalare, em toda exteno coletada, tambm, pode ter explicaes ecolgicas decorrentes da oferta de recursos e inexistncia de espcies simptricas, ao contrrio das regies de simpatria entre P. scalare e P. altum, sugerindo a existncia de plasticidade fenotpica em P. scalare e que o padro morfomtrico encontrado nas regies coletadas de P. altum pode ser resultado da existncia de P. scalare nas regies de Santa Isabel e Boa Vista. A distinta composio qumica e fsica das guas podem ter atuado na significante diferenciao morfomtrica e na estruturao gentica populacional, sendo um fator limitante para a disperso destes peixes e promovendo diferenciao morfolgica. Por outro lado, a significante diferenciao morfomtrica entre os diferentes habitats aquticos pode ser meramente resultante de acmulo por deriva gentica. Dessa maneira, preciso identificar a importncia ecolgica da variao morfomtrica entre os diferentes ambientes para que se tenha entendimento do valor adaptativo e evolutivo dessas variaes morfolgicas.

ABSTRACT
This study was developed in two chapters: the first chapter focuses on genetic and the second on morphometric aspects of the genus Pterophyllum, which is widely distributed in the Amazon basin. The goal was to understand the probable historical and ongoing processes that caused and maintain phylogeographic and morphometic patterns observed in this group of fishes, using cytochrome b mitochondrial gene and geometric morphometric data from fourteen localities along Negro, Solimes and Amazonas rivers. It was observed that even existing significant varied morphotypes, the morphometric patterns showed a strong relationship with the taxonomic group molecularly determined. Furthermore, both analysis (molecular and morphometric) agree with classical taxonomical identification done for the tree valid species in the Pterophyllum genus. In the P. scalare specie, a complex

phylogeographic history was found, resulting from ancient fragmentation events followed by episodes of geographic expansion and restricted gene flow with isolation by distance. Although the relation between geographic, genetic and morphological distances was not significant in the studied area, it had higher genetic and morphological variation within localities. This result may be attributed to the Amazon floodplain that offers intercommunication, allowing gene flow and the morphologic homogeneity found in the sampled locations. The morphologic homogeneity observed in P. scalare specie along the sampled sites may be related with the ecological resource availability and the inexistence of sympatric species, differing from regions with P. scalare and P. altum (Santa Isabel and Boa Vista), suggesting the existence of phenotype plasticity in P. scalare and the morphometric pattern found in P. altum may be a result of the presence of P. scalare. The distinct water composition may have significantly influenced the morphometric differentiation and population genetic structure and maybe a limiting factor for the dispersion of this fish. Put differently the significant morphometric differentiation between habitats may be a consequence of genetic drift accumulation. Thus, it is necessary to identify the ecological importance of morphometric variation found between different environments for a complete understanding of the adaptive and evolutionary value of these morphological variations.

VI

SUMRIO
FICHA CATALOGRFICA ................................................................................................. I SINOPSE .................................................................................................................................. I AGRADECIMENTOS ......................................................................................................... III RESUMO ................................................................................................................................. V ABSTRACT .......................................................................................................................... VI LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... IX LISTA DE GRFICOS.......................................................................................................... X LISTA DE TABELAS .......................................................................................................... XI I. Introduo Geral .................................................................................................................. 1
I.1. A Bacia Amaznica .............................................................................................................1 I.2. A famlia Cichlidae ..............................................................................................................2 I.3. Aspectos evolutivos da famlia Cichlidae ..........................................................................4 I.4. A Tribo Heroini ...................................................................................................................6 I.5. O gnero Pterophyllum Heckel, 1840 ................................................................................7

CAPTULO 1 - Filogenia e Filogeografia do gnero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) na Bacia Amaznica, utilizando o gene do citocromo b. .............. 11
1. Introduo ............................................................................................................................11 1.1. Objetivos........................................................................................................ 14 1.1.1. Objetivo Geral ...................................................................................................14 1.1.2. Objetivos Especficos .........................................................................................14 2. Material e Mtodo ................................................................................................................15 2.1. Amostragem .................................................................................................. 15 2.2. Identificao Taxonmica.............................................................................. 16 2.3. Mtodos Moleculares: Extrao de DNA, Amplificao e Seqenciamento................................................................................................... 17 2.4. Anlises Moleculares .................................................................................... 18 2.4.1. Alinhamento, Edio de seqncias e Anlises de Composio Molecular ......18 2.4.2. Anlises Moleculares .........................................................................................19 3. Resultados .............................................................................................................................23 3.1. Alinhamento, Edio de seqncias e Anlise de Composio Molecular .............................................................................................................. 23 VII

3.2. Anlises Moleculares .................................................................................... 24 a) Anlise Filogentica ..........................................................................................24 b) Anlise Filogeogrfica ......................................................................................25 c) Anlise gentico - populacional e demogrfica (por localidade) ...............26 4. Discusso e Concluso .........................................................................................................36 a) Anlise de Composio Molecular................................................................... 36 b) Anlise Filogentica ......................................................................................... 36 c) Anlise Filogeogrfica ...................................................................................... 37 d) Anlise gentico - populacional e demogrfica (por localidade) .................... 39

CAPTULO 2 - Estudo da forma corporal de peixes do gnero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) ao longo da bacia Amaznica, utilizando morfometria geomtrica...................................................................................................... 46
1. Introduo ............................................................................................................................46 1.1. Objetivos........................................................................................................ 49 1.1.1 Objetivo Geral ..................................................................................................49 1.1.2. Objetivos Especficos ....................................................................................49 2. Material e Mtodo ................................................................................................................50 2.1. Amostragem .................................................................................................. 50 2.2. Identificao Taxonmica.............................................................................. 51 2.3. Mtodos Moleculares: Extrao de DNA, Amplificao, Seqenciamento e Anlises ................................................................................. 52 2.4. Mtodos Morfomtricos ................................................................................. 53 2.4. 1. Coleta de dados Morfomtricos ........................................................................53 2.4.2. Demarcao de pontos anatmicos e Obteno de dados morfomtricos ........53 2.5. Anlises Estatsticas ..................................................................................... 55 3. Resultados .............................................................................................................................57 4. Discusso e Concluso .........................................................................................................65

II. Concluso Geral................................................................................................................ 70 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................... 72 ANEXOS................................................................................................................................. 89

VIII

LISTA DE FIGURAS
Introduo geral
Figura 1: Distribuio geogrfica mundial da famlia Cichlidae............................................ 4 Figura 2: Pterophyllum scalare (Schultze, 1823)................................................................... 8 Figura 3: Pterophyllum altum (Pellegrin, 1903)......................................................................8 Figura 4: Pterophyllum leopoldi (Gosse, 1963)...................................................................... 9 Figura 5: Esquema da distribuio geogrfica das espcies do gnero Pterophyllum......................10

Captulo 1 Filogenia e Filogeografia do gnero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) na Bacia Amaznica, utilizando o gene do citocromo b

Figura 6: Mapa com a distribuio dos pontos amostrados................................................................ 16

Figura 7: rvore de relacionamento de hapltipos critrio Mxima Verossimilhana (HKY85), indicando os valores de boostrap acima de 60%..........................................................................29

Figura 8: Diagrama da rede haplotpica de clados hierarquizados por meio da anlise NCAP.altum......................................................................................................................................... 31

Figura 9: Diagrama da rede haplotpica de clados hierarquizados por meio da anlise NCAP.scalare....................................................................................................................................... 32

Captulo 2 Estudo da forma corporal de peixes do gnero Pterophyllum Heckel, (Cichlidae / Heroini) ao longo da Bacia Amaznica, utilizando morfometria geomtrica

1840

Figura 10: Mapa com a distribuio dos pontos amostrados.......................................................... 51 Figura 11: Descrio esquemtica de pontos anatmicos....................................................... 56

IX

LISTA DE GRFICOS
Captulo 1 Filogenia e Filogeografia do gnero Pterophylum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) na Bacia Amaznica, utilizando o gene do citocromo b
Grfico 1: Composio percentual de bases............................................................................ 24 Grfico 2: Relao entre a distncia e as taxas de transio (ts) e transverso (tv)................. 24

Captulo 2 Estudo da forma corporal de peixes do gnero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) ao longo da Bacia Amaznica, utilizando morfometria geomtrica
Grfico 3: Distribuio dos hapltipos ao longo dos dois primeiros componentes principais construdos com as variveis morfomtricas................................................................... 60 Grfico 4: Distribuio das localidades amostradas ao longo dos dois primeiros componentes principais construdos com as variveis morfomtricas............................ 60 Grfico 5: Distribuio das localidades amostradas da espcie P. scalare (grupo Ptero 3) ao longo dos dois primeiros componentes principais construdos com as variveis morfomtricas.................................................................................................................. 64 Grfico 6: Distribuio das populaes amostradas da espcie P. scalare (grupo Ptero 3) ao longo dos dois primeiros componentes principais construdos com as variveis morfomtricas.................................................................................................................. 64

LISTA DE TABELAS
Captulo 1 Filogenia e Filogeografia do gnero Pterophylum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) na Bacia Amaznica, utilizando o gene do citocromo b
Tabela 1: Resultado das anlises do agrupamento dos clados hierarquizados para as espcies
P.altum e P.scalare, mostrando somente clados com permutaes significativas (X2) para estrutura geogrfica (p < 0,05)..................................................................................................... 30

Tabela 2: ndices de diversidade gentica, testes de neutralidade e de expanso populacional, onde

N = N amostral, S = N Stios Segregantes ou Polimrficos e NH = N de hapltipos. Esto representados os parmetros populacionais de acordo com a localidade, espcie, agrupamento filogentico formado e N > 5....................................................................................................... 33

Tabela 3: Anlise de Varincia Molecular (AMOVA), entre todas as localidades, com N > 5, nas
espceis P.altum e P.scalare. significativa a estrutura populacional nas duas espcies (P < 0,001)........................................................................................................................................... 34

Tabela 4: Comparaes par a par dos valores de Fst (abaixo e cor preta) e Nm (acima e cor azul)
entre as localidades analisadas com N > 5 na espcie P.scalare............................................. 34

Tabela 5: Distncia gentica intralocalidade. Esto representados os parmetros populacionais de

acordo com a localidade, espcie e agrupamento filogentico formado. O desvio padro foi estabelecido com base em 200 replicaes de bootstrap......................................................... 35

Tabela 6: Distncia gentica entre localidades par a par, pertencentes espcie P.scalare,
estabelecida com base em 200 replicaes de bootstrap..............................................................35

Captulo 2 Estudo da forma corporal de peixes do gnero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) ao longo da Bacia Amaznica, utilizando morfometria geomtrica
Tabela 7: Pesos das variveis morfomtricas sobre os cinco primeiros componentes da anlise de
componentes principais....................................................................................................... 59

Tabela 8: Pesos das variveis morfomtricas sobre os cinco primeiros componentes da anlise de
componentes principais na espcie P. scalare (grupo Ptero 3)................................................ 63

XI

I. Introduo Geral

I.1. A Bacia Amaznica

A regio amaznica possui a maior bacia hidrogrfica do mundo, com cerca de 7 x 106 km2, abrangendo nove pases ao longo de sua extenso (Brasil, Peru, Bolvia, Colmbia, Equador, Venezuela, Suriname e Guianas). formada, principalmente pelo rio Amazonas e um conjunto de incontveis outros rios e igaraps, alm de um complexo sistema de sub-bacias, tendo principal destaque: a sub-bacia do Rio Negro com 750 000 km2 de rea e a sub-bacia do rio Madeira com 1.300 000 km2 (Goulding, 1980, 1981; Santos; Ferreira, 1999). Em termos de extenso, o rio Amazonas possui 6.518 km, s sendo ultrapassado pelo rio Nilo com 6.671 km, e sua largura varia entre 1.8 km (em bidos) at 20 km (na desembocadura do rio Negro) (Santos; Ferreira, 1999). Uma importante caracterstica desta bacia consiste em uma alta pluviosidade que distribuda desigualmente ao longo do ano nas diferentes sub-regies, fazendo com que existam pocas de seca (chamada de vero) e chuvosas (chamada de inverno), sendo que os afluentes da margem direita (como os rios: Madeira, Tapajs e Xingu) no tm a mesma dinmica de chuvas que os afluentes da margem esquerda (como o rio Negro) (Sioli, 1984; Santos; Ferreira, 1999), promovendo ciclos de cheia e vazante, que durante o inverno (cheia) compreendem as regies de plancie e do origem as florestas de inundao (vrzea e igap). Dessa forma, o sistema da bacia amaznica basicamente de origem fluvial onde o sistema Solimes-Amazonas representa um coletor final de toda drenagem formada por igaraps, riachos, crregos, vrzeas e rios (Santos & Ferreira, 1999). A natureza dos rios amaznicos diferente entre si e isso se deve a existncia de caractersticas fsicas e qumicas distintas das guas, o que leva a classificao dos rios em: rios de gua branca, negra e clara (Sioli, 1984). A diferena limnolgicas entre as classes dos rios amaznicos est profundamente relacionada s origens geolgicas de cada tipo de gua (Lundberg et al., 1998). 1

Geologicamente, a formao do sistema fluvial amaznico foi moldada por profundas transformaes que consistiram no surgimento da cadeia andina, na interao dos escudos cristalinos das Guianas e do Brasil, no envolvimento de uma plancie sedimentar situada na regio central e nos movimentos de invaso e regresso das guas marinas. Dentre elas, a mais notvel transformao geolgica ocorreu no Cenozico quando os Andes emergiram formando uma importante barreira com o oceano Pacfico, fazendo com que a comunicao existente entre o sistema de rios da regio amaznica e o oceano Pacfico fosse interrompida e um novo mecanismo de drenagem foi estabelecido passando do sentido leste-oeste para oeste-leste, desembocando no Atlntico (Lundberg et al., 1998). Essas transformaes geolgicas no s moldaram o sistema amaznico, mas, tambm, delimitaram toda distribuio fluvial na Amrica do Sul (Lundberg et al., 1998; Albert et al., 2006). Dessa maneira, ao longo dos milhes de anos subseqentes elevao dos Andes, o continente sulamericano tem sofrido grandes mudanas geolgicas e ambientais (Lundberg et al., 1998). O levantamento da cordilheira andina, juntamente com outros fenmenos geolgicos e variaes sazonais ambientais influenciaram os processos evolutivos e de diversificao de alguns grupos de animais, principalmente, dos peixes (Albert et al., 2006), onde a famlia Cichlidae merece destaque, por apresentar notria capacidade adaptativa e de diversificao (Kocher, 2004; Turner, 2007).

I.2. A famlia Cichlidae

A famlia Cichlidae pertence ordem Perciformes e representa um dos mais diversificados grupo de peixes de gua doce do mundo. Com 1.300 espcies (de um nmero maior e estimado de 2000) considerada a quarta famlia com o maior nmero de espcies dentre os vertebrados (Kullander, 1998). Sua distribuio geogrfica abrange a frica (com o maior nmero de espcies), o Oriente mdio (Iran e Sria), o sul da ndia e do Sri Lanka, as ilhas de Madagascar, Cuba e Hispaniola e as Amricas Norte, Central e do Sul (Figura 1) (Kullander, 1998; 2003; Chakrabarty, 2004).

Na Amrica do Sul so conhecidas aproximadamente 291 espcies vlidas distribudas em 39 gneros, sendo um grande nmero delas encontradas na Amaznia, possuindo importncia econmica na regio tanto como fonte de protena animal, como para fins ornamentais (Chao, 1995; Kullander, 2003). Os peixes desta famlia so encontrados nos mais diferentes habitats, compreendendo margens de rios, igaraps, florestas alagadas, lagos e locais rochosos, tendo preferncia por ambientes lnticos, existindo algumas espcies adaptadas a ambientes reoflicos (Lowe-McConnell, 1991; Kullander, 2003). So conhecidos pelo comportamento territorialista e de cuidado parental e, na sua maioria, se alimentam de pequenos invertebrados e de vegetais, com um nmero pequeno de grupos que se alimentam de outros peixes e de plncton (Kullander, 2003). A diversidade encontrada neste grupo abrange os mais diferentes aspectos que variam desde caractersticas morfolgicas e ecolgicas, como, tambm, no comportamento e na dieta (Lowe-McConnell, 1969a; Kullander; Nijssen, 1989), o que demonstra uma grande capacidade adaptativa nos peixes desta famlia (LoweMcConnell, 1969b; Kocher, 2004). A famlia Cichlidae monofiltica e estava subdividida em oito subfamlias, sendo trs do velho mundo (Etroplinae, Pseudocrenilabrinae e Heterochromidinae) e cinco do novo mundo (Retroculinae, Cichlinae, Astronotinae, Geophaginae e Cichlasomatinae), (Farias et al., 1998; Kullander, 1998). Em 2000, Farias e colaboradores rejeitaram as subfamlias Cichlinae e Astronodontinae, o que tambm foi proposto por Lpez-Fenndez et al., 2005, com relao ao grupo formado pela subfamlia Cichlinae, restando monofilia para trs subfamlias do novo mundo (Retroculinae, Geophaginae e Cichlasomatinae).

Figura 1: Distribuio geogrfica mundial da famlia Cichlidae.

Fonte: Sparks, 2001.

I.3. Aspectos evolutivos da famlia Cichlidae

A diversidade encontrada na famlia Cichlidae, como um todo, atribuda complexidade de habitats ocupados por este grupo, que no s proporcionaram eventos de especiao, como originaram um rpido processo de irradiao, como foi visto entre os cicldeos africanos (Liem, 1991; Parker & Kornfield, 1997, Turner, 2007) e nas Amricas Central (Concheiro-Prez et al., 2007) e do Sul (LopzFernandez et al., 2005). A historia evolutiva dos ciclideos teve incio a partir de um grupo basal de formato mais plesiomrfico existente no continente Gondwana, que divergiram no ancestral comum ao agrupamento formado pelos cicldeos da ndia e de Madagascar e no antecessor comum dos cicldeos africanos e neotropicais, que se diferenciaram aps o evento vicariante de separao do continente Gondwana h aproximadamente 105 - 90 milhes de anos (Ma) (Stiassny, 1991; Farias et al., 1998; 1999; Lundberg et al., 1998; Avise, 2000). Uma segunda hiptese evolutiva foi proposta em trabalhos mais recentes, os quais cogitam a possibilidade desta famlia ter passado por provveis disperses marinhas durante o perodo Tercirio, alcanando a poro oeste da ndia e de 4

Madagascar posteriormente a separao destas regies da Gondwana h, aproximadamente, 150 milhes de anos (Ma) (Murray, 2001; Vences et al., 2001; Briggs, 2003). Desde sua separao, os cicldeos africanos e neotropicais experimentaram efeitos bem distintos do meio ambiente, que levaram ntidas diferenas entre estes dois grupos e dentro de cada um, configurando conjuntos evolutivos prprios e com alta diversidade (Farias et al., 1999). No caso sul-americano, principalmente na regio noroeste, os cicldeos tiveram sua histria evolutiva influenciada por diferentes mudanas geomorfolgicas, dentre as quais se destacam: o desenvolvimento dos Andes, acompanhado de transgresses e regresses marinhas e a formao do moderno fluxo oeste-leste dos rios Amazonas e Orinoco, proporcionando eventos para a especiao e enriquecimento do grupo na Amrica do Sul (Lundberg et al., 1998). Ready et al., (2006) relacionaram o perfil filogeogrfico observado nos peixes do gnero Symphysodon aos eventos geomorfolgicos do arco do Purus e a mudana de direo da drenagem amaznica, alm da adaptao destes peixes s plancies baixas de inundao, influenciando a distribuio gentica, morfolgica e a diversificao desses peixes. Entretanto no foi observada relao entre o tempo de divergncia do gnero e a origem geolgica do arco, que est estimada em trs milhes de anos (3 Ma.). Farias e Hrbek (2008) ao estudarem os padres de diversificao no mesmo gnero observaram que estes peixes possuem sua distribuio filogeogrfica relacionada s diferenas qumica e fsica das guas, alm da influncia do arco do Purus na diversificao do gnero, j proposta por Ready et al. (2006). Entre os cicldeos neotropicais, estudos filogenticos, tanto de base morfolgica quanto molecular, demonstraram uma origem monofiltica deste grupo, que, de acordo com os caracteres compartilhados, foi posteriormente subdividido por Kullander (1998) em cinco grandes agrupamentos (subfamlias) conhecidos como: Cichlasomines, Geophagines, Cichlinae, Retroculinae e Astronotinae, sendo Retroculinae a subfamlia mais basal e Geophaginae e Cichlasomatinae as mais derivadas (Kullander, 1998, Farias et al., 1998; Farias et al., 1999). LpezFernndez et al., 2005, rejeitou a subfamlia Cichlinae, invalidando as sinapomorfias (caracteres osteolgicos), que colocavam Crenicichla + Teleocichla como um 5

agrupamento irmo de Cichla dentro da subfamlia Cichllinae, considerando tanto Crenicichla, como Teleocichla pertencentes da subfamlia Geophaginae, como j tinha sido proposto por Farias et al. 2000, que tambm no encontrou monofilia para a subfamlia Astronotinae, separando Chaetobranchus de Astronotus. Farias et al. (1998) utilizando o gene mitocrondrial 16S rRNA, identificou monofilia, em grande parte, nas subfamlias do Neotrpico, alm de maior diversidade nucleotdica quando comparado ao grupo externo Africano (5.3%), sugerindo que as linhagens sulamericanas apresentam origens mais antigas do que se especula ou que estas experimentaram um rpido processo de evoluo molecular, principalmente na subfamlia Geophaginae, que, segundo LpezFernndez et al., 2005, experimentou um rpido processo de irradiao (de acordo com o sensu de Geophaginae de Lpez-Fernandez et al, 2005).

I.4. A Tribo Heroini

A tribo Heroini (Kullander, 1998) pertence subfamlia Cichlasomatinae e considerada uma das mais diversas tribos entre os cicldeos neotropicais (Concheiro-Prez et al., 2007). Compreende mais de 139 espcies e est amplamente distribuda desde Buenos Aires, Argentina, at o Texas nos Estados Unidos (Kullander, 2003; Concheiro-Perz et al., 2007). Na Amrica do Sul representada por 27 espcies distribudas em dez gneros (Kullander, 1998; Santos, 2006): Heros Heckel, 1840, Pterophyllum Heckel, 1840, Uaru Heckel, 1840, Symphysodon Heckel, 1840, Hoplarchus Kaup, 1860, Mesonauta Gnther, 1862, Caquetaia Fowler, 1945, Hypselecara Kullander, 1986, Heroina Kullander, 1996. Este grupo diversificado e apresenta variao morfolgica principalmente com relao aos caracteres trficos, o que dificulta estudos filogenticos e baseados na morfologia deste grupo, assim como a identificao taxonmica e classificao sistemtica destes peixes (Concheiro-Perz, 2007). No entanto a monofilia deste grupo bem suportada. Cichocki (1976), utilizando dados morfolgicos (morfologia; nmero de espinhos na nadadeira anal; ligamentos do palatino e padres dentrios), 6

encontrou monofilia para o grupo, o que mais tarde foi corroborado por Kullander (1996) e Farias et al. (1998; 1999; 2000; 2001), que tambm encontraram relao filogentica entre as tribos heroines e cichlasomines. Ainda de acordo com Farias et al. (1998), esta tribo (Heroini), juntamente com Cichlasomini, ocupa a posio mais derivada e recente na subfamlia Cichlasomatinae tendo seu aparecimento no final do Tercirio.

I.5. O gnero Pterophyllum Heckel, 1840

Dentre os diversos cicldeos ornamentais na Amaznia, encontra-se o acarbandeira (Chapman et al., 1997; Yamamoto et al., 1999). Este peixe pertence ao gnero Pterophyllum Heckel, 1840, sendo um representante da tribo Heroini, que faz parte da subfamlia Cichlasomatinae (Kullander, 1998; 2003). As espcies da tribo Heroini apresentam, em geral, um corpo lateralmente bem achatado de contornos dorsais e ventrais arqueados. Isso bem evidente no gnero Pterophyllum, que tambm apresenta as nadadeiras dorsal e anal altas com raios de comprimento crescente e decrescente no sentido antero-posterior dando uma aparncia triangular a forma corporal (LoweMcConnell, 1969a; Kullander, 1986). A nadadeira caudal truncada e apresenta filamentos de raios extensos, a nadadeira plvica apresenta raios de comprimento alongado e juntamente com a nadadeira anal no apresentam escamas. O corpo apresenta com um contorno pr-dorsal cncavo com a presena de um entalhe prximo do focinho; a base da nadadeira dorsal convexa e semicircular e o contorno total dorsal maior que o ventral. O focinho longo e triangular, visto lateralmente, e a regio interorbital levemente elevada. As mandbulas so anteriores regio orbital sendo a mandbula inferior situada posteriormente, levemente projetada para frente e inclinada para cima. O abdmen e o pednculo caudal so curtos, as escamas pequenas e lbios moderadamente grossos (Kullander, 1986). A colorao cinza prateada contrastando com barras verticais de cor cinza amarronzadas ou pretas distribudas ao longo do corpo. Alm disso, contm a regio 7

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peitoral prateada e uma mancha preta na base da nadadeira dorsal. Possuem baixa mobilidade, comportamento territorialista e so encontrados em gua branca ou em gua negra com aspecto turbido, preferindo habitats lacustres ou guas lnticas prximas s margens de vegetao densa (Kullander, 1986) e alimentam-se de pequenos invertebrados (Yamamoto et al., 1999). Sua distribuio geogrfica compreende: Peru, Brasil, Venezuela, Colmbia, Guiana, Guiana Francesa e Suriname (introduzido) (Lowe-McConnell, 1969a; Kullander, 1986; 2003). De acordo com Kullander (1986, 2003) existem trs espcies vlidas neste gnero: P. scalare (Schultze, 1823), P. altum Pellegrin, 1903 e P. leopoldi (Gosse, 1963). P. scalare (Localidade tipo: localidade incerta): a mais estudada dentre todas as espcies conhecidas e bem apreciada entre os peixes ornamentais. Apresenta 7,5cm de comprimento padro (CP), 30-39 escamas ao longo da linha lateral e o entalhe no contorno pr-dorsal prximo ao focinho, sendo menos aparente a mancha preta localizada na base da nadadeira dorsal citada na descrio acima. Sua distribuio geogrfica abrange a
Figura 2: Pterophyllum scalare (Schultze, 1823).
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regio da bacia amaznica no Peru, Brasil, Colmbia ao longo dos rios Ucayali, Solimes, Amazonas (at Belm), mdio rio Negro e nos rios Madeira e Branco. Tambm encontrado nos rios Araguaia (estado de Tocantins) e Oiapoque entre o Bjame Saetrang estado do Amap (BR) e a Guiana Francesa, no rio Essequibo na Guiana e recentemente foi introduzido no Suriname. (Lowe-McConnell, 1969a; Kullander, 1986; 2003) (Figura 2 e 5). P. altum (Localidade tipo: alto do rio Orinoco/ Municpio de Atabapo): os representantes desta espcie possuem um corpo mais triangular, barras verticais mais amplas, contorno pr-dorsal mais visvel, maior nmero de escamas (46-48) ao longo da linha lateral e comprimento padro (CP) de 6,5cm. Sua distribuio compreende o alto rio Negro (bacia amaznica) e alto rio Orinoco nas regies da
Figura 3: Pterophyllum altum (Pellegrin, 1903).
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Colmbia e Venezuela, preferencialmente em gua preta e limpa (Lowe-McConnell, 1969a; Kullander, 1986; 2003) (Figura 3 e 5).

P. leopoldi (Localidade tipo: nas proximidades (90 km) de Manacapuru): os representantes desta espcie diferenciam-se por terem a regio pr-dorsal menos evidente, apresentando um contorno mais contnuo. Na base da nadadeira dorsal, possui a mancha preta, j descrita acima, bem evidente. Dentre as trs espcies a que tem os menores comprimento padro (CP) e nmero de escamas ao longo da linha lateral, que so respectivamente 5 cm e 27-29. So encontrados nas guas dos rios Solimes e Amazonas desde Manacapuru at Santarm (BR) e na drenagem do rio Essequibo na Guiana (Kullander, 1986; 2003). De acordo com Kullander (1986), esta a espcie, que apresenta maior semelhana morfolgica com o gnero Mesonauta Gnther, 1962 (Figura 4 e 5). Historicamente, alguns estudos ressaltaram algumas questes sobre anlise taxonmica e filogentica, gerando incertezas na delimitao e na estrutura deste gnero. Existem cinco espcies nominais neste gnero sendo: Zeus scalaris Schultze, 1823 (Platax scalaris Cuvier, 1831), Plataxodes dumerilii Castelnau, 1855, Pterophyllum altum Pellegrin, 1903, Pterophyllum eimekei Ahl, 1928 e Pterophyllum leopoldi (Gosse, 1963) (Kullander, 1986; 2003). Lowe-McConnell em 1969(a) citou problemas sobre a validao do gnero e a existncia de sobreposio dos caracteres mersticos. Kullander em 1986 ressaltou que o grupo apresentava uma baixa resoluo taxonmica, tendo como causas a falta ou a conservao precria de exemplares tipo, a existncia de espcies sinnimas e a considervel variao dos caracteres mersticos utilizados. Dessa forma, sugeriu que Zeus scalaris, Plataxodes dumerilii, Pterophyllum eimekei eram do mesmo gnero (Pterophyllum) e espcie sinnimas de Pterophyllum scalare e que Pterophyllum altum e Pterophyllum leopoldi seriam duas espcies distintas. Atualmente estas trs espcies esto definidas para o gnero, mas estudos de natureza evolutiva, principalmente moleculares, so escassos neste grupo. Alm disso, a existncia de variao morfolgica e a sobreposio dos caracteres mersticos, como o nmero de escamas, podem representar diferentes mortipos, o que dificulta a identificao taxonmica das espcies deste genro (LoweMcConnell, 1969(a); Kullander, 1986).
Figura 4: Pterophyllum leopoldi (Gosse, 1963).
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Dessa maneira, diante da carncia de dados, da grande capacidade adaptativa dos heroneos, em geral, resultando na alta diversidade morfolgica desta tribo e da variedade de morfotipos existente nas espcies do gnero Pterophyllum, este trabalho prope um estudo filogeogrfico, evolutivo e morfomtrico nas trs espcies vlidas de peixes do gnero Pterophyllum, amplamente distribudos pela bacia amaznica, buscando entender como se encontra a distribuio da variao gentica e morfomtrica nas espcies ao longo da respectiva distribuio geogrfica, assim como investigar a delimitao da variao morfolgica e gentica das trs espcies ao longo da bacia amaznica, utilizando, como ferramentas, o gene mitocondrial do citocromo b e morfometria geomtrica. Esta dissertao foi desenvolvida em dois captulos, visando simplificar a redao e uma melhor compreenso do objetivo proposto deste trabalho. Dessa forma, no primeiro captulo, foi abordado sob o enfoque gentico e no segundo foi trabalhado o aspecto morfomtrico aplicados no estudo de peixes amostrados ao longo dos rios Negro, Solimes e Amazonas.

Figura 5: Esquema da distribuio geogrfica das espcies do gnero Pterophyllum.

* O asterisco de cor verde indica a localidade, aonde a espcie P. scalare foi introduzida.

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CAPTULO 1 Filogenia e Filogeografia do gnero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) na Bacia Amaznica, utilizando o gene do citocromo b.

1. Introduo
Estudos filogeogrficos proporcionam consistente informao evolutiva em peixes de gua doce, pois tm a capacidade de estabelecer ligaes entre a

evoluo dos organismos aquticos e os eventos hidrogeolgicos que os cercam, uma vez que dependem diretamente dos sistemas fluviais como meio de disperso (Bermingham & Martin, 1998; Avise, 2000; Sivasundar et al., 2001). Neste contexto, marcadores moleculares genticos (nuclear e mitocondrial) vm sendo amplamente utilizados, mostrando-se muito eficazes em reconstrues filogeogrficas e outras abordagens evolutivas em diferentes nveis taxonmicos, podendo chegar ao de espcie (Avise, 1994; Puorto et al., 2001). Dentre os marcadores moleculares genticos, o DNA mitocondrial (DNAmt) tem sido empregado extensivamente nos mais diferentes aspectos evolutivos como, por exemplo, em: reconstrues genealgicas, estudos filogenticos, no

delineamento de processos evolutivos e na diversificao de um dado taxa em relao a sua distribuio geogrfica (Bermingham & Mortiz, 1998; Avise, 2000). Isso se deve ao fato desta molcula ser mais compacta, simples e apresentar um mecanismo de evoluo mais rpido, quando comparado ao DNA nuclear. Alm disso, possui o padro de herana vinculado me (Brown et al., 1982; Meyer, 1993; 1994; Ballard & Whitlock, 2004). Essas caractersticas, em conjunto, fazem esta molcula til para estudos evolutivos (Lee et al., 1995). Em se tratando do DNAmt, o gene do citocromo b tem sido a regio mais conhecida e utilizada em estudos moleculares dos mais variados como em estudos sistemticos, filogenticos e populacionais de vertebrados, principalmente de peixes (Meyer & Wilson, 1990; Meyer, 1993; 1994). No entanto, pesquisas evolutivas e 11

moleculares nesse grupo ainda so escassas se levarmos em conta a grande diversidade de peixes encontrada nesta famlia e suas questes evolutivas (Bermingham & Martin, 1998). Isto mais evidente na regio neotropical, mesmo esta rea possuindo uma das maiores drenagens de gua doce do mundo (amaznica) e uma rica fauna ictiolgica, cuja variedade de peixes da famlia Cichlidae merece destaque (Kullander, 1998; Farias et al., 1998). At hoje, a maioria dos estudos moleculares esto concentrados em cicldeos do velho mundo. Entre os estudos com txons neotropicais poucas pesquisas possuem representantes sul-americanos (ex. Zardoya et al., 1996; Roe et al., 1997; Concheiro-Prez et al., 2007), portanto questes taxonmicas e filogenticas em relao aos grupos da Amrica do Sul continuam sem respostas e confusas (Farias et al., 1998; Kullander; 1998). Farias e colaboradores, em 1998, foram pioneiros no estudo molecular e sistemtico de txons sul-americanos aumentando esforos em 1999, 2000 e 2001. Farias et al. (1998; 1999; 2000; 2001) e Lpez-Fernndez et al. (2005), utilizando dados moleculares e morfolgicos em conjunto, obtiveram maior resoluo filogentica entre os cicldeos neotropicias, mostrando a utilidade dos dados moleculares mitocondriais em estudos evolutivos de grupos de cicldeos, como no caso dos geofagneos e heroneos (Farias et al., 1998; Lpez-Fernndez et al., 2005;Concheiro-Prez et al., 2007). A tribo Heroini (Kullander, 1998) uma das maiores e mais diversas tribos entre os cicldeos neotropicais. Atualmente, compreende 139 espcies vlidas, que esto amplamente distribudas desde Buenos Aires (Argentina) at o Texas (Estados Unidos), apresentando maior representatividade na Amrica Central, onde constituem 25% da ictiofauna da regio (Kullander, 2003). Alm dos nveis de diversidade de espcies encontrados, os representantes deste grupo possuem altos nveis de variao morfolgica e diferentes morfotipos (ex:Pterophyllum sp.), dificultando a identificao taxonmica nesta tribo e reflete a existncia de capacidade adaptativa, como o caso dos heroneos da centroamrica (Concheiro-Prez et al., 2007), indicando versatilidade de resposta evolutiva deste grupo de peixes perante variaes geolgicas e ambientais (Concheiro-Prez et al., 2007, Ready et al., 2006). Recentemente Ready et al. (2006) e Farias & Hrbek (2008), observaram que a histria do desenvolvimento geolgico amaznico, juntamente com suas caractersticas ambientais participaram

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do padro de distribuio e diversificao do heroneo Symphysodon, ao longo de sua ampla distribuio pela plancie baixa amaznica. Uma vez que: 1) eventos geomorfolgicos e hidrolgicos podem influenciar o padro de distribuio e evoluo dos organismos aquticos; 2) marcadores gentico - moleculares so eficazes em estudos filogeogrficos e de taxonmicos; 3) existem relaes entre o padro filogeogrfico dos peixes da tribo Heroini e os eventos geolgicos que os cercam; 4) conhecida a variedade de padres biogeogrficos para regio amaznica e 5) dados evolutivos sobre os cicldeos neotropicais so carentes, o presente trabalho prope uma anlise filogeogrfica, populacional e evolutiva das espcies pertencentes ao gnero Pterophyllum Heckel, 1840, no contexto amaznico, com a finalidade de entender como estas espcies esto evolutivamente relacionadas entre si e como se encontram geneticamente distribudas pela bacia amaznica, buscando os provveis processos atuantes na distribuio filogeogrfica destes peixes ao longo da bacia amaznica, utilizando como ferramenta o gene mitocondrial do citocromo b.

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1.1. Objetivos 1.1.1. Objetivo Geral

Buscar as relaes filogenticas entre os indivduos coletados e entre as espcies descritas para o gnero e, com base nisso, relacionar taxonmia vlida para o gnero e, partir disso, definir e discutir o perfil gentico populacional e filogeogrfico observado nas espcies do gnero Pterophyllum da Amaznia, ao longo da rea coletada, buscando entender os provveis processos evolutivos, que influenciaram ou que matem a distribuio gentica encontrada nas espcies delimitadas, utlizando a identificao taxonmica, as relaes filogenticas, a distribuio filogeogrfica, a estrutura e as caractersticas populacionais de cada espcie, associada distribuio geogrfica coletada, tendo em vista as hipteses filogeogrficas para diversificao evolutiva no ambiente amaznico.

1.1.2. Objetivos Especficos

Identificar os indivduos coletados, com base na descrio taxonmica de cada espcie descrita para o gnero; Seqenciar e caracterizar o segmento do gene mitocondrial citocromo b no grupo de estudo; Inferir as relaes filogenticas entre os indivduos coletados; Relacionar a identificao taxonmica com a hiptese filogentica resultante; Testar a existncia de hipteses de distribuio filogeogrfica em cada espcie; Determinar os ndices de diversidade gentica nas espcies, de acordo com as localidades amostradas; Testar estrutura gentica populacional, dentro de cada espcie, entre as localidades amostradas; Definir a distribuio gentica populacional das espcies do gnero ao longo da rea coletada, testando a correlao entre a distncia gentica e geogrfica; Discutir a distribuio gentica populacional e o padro filogeogrfico das espcies do gnero Pterophyllum perante o contexto amaznico.

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2. Material e Mtodo 2.1. Amostragem

Levando-se em conta a distribuio dos peixes do gnero Pterophyllum (Kullander, 2003), foram coletados 328 espcimes ao longo dos rios: Negro (Boa Vista N=16, Santa Isabel N=34, Barcelos N=21 e Novo Airo N=4), Solimes (Aman N=17, Mamirau N=45, Campina N=2, Iranduba N=16 e Janauac N=27), Amazonas (Catalo N=29, encontro das guas, Careiro da Vrzea N=5, Careiro do Castanho N=28), e alguns afluentes (Purus N=33, Solimes X Tapajs, Santarm N=51), totalizando catorze pontos de coleta (Figura 6), das quais oito foram coletadas, anteriormente, por Izeni P. Farias (seis localidades) e por Tomas Hrbek (dois pontos). A diferena do N coletado decorrente de problemas logsticos de campo (tempo, clima e recursos financeiros). As coletas foram autorizadas pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (IBAMA) sob o processo de n 02001.000162/2006-67. O processo de captura foi efetuado com o auxlio de um rapich e de uma rede de cerco. Aps a captura, anestesiou-se cada exemplar com 0,4 ml - 1,0 ml de uma soluo de eugenol 10% (diludo em etanol), de acordo com o protocolo de eutansia estabelecido pela American Veterinary Medical Association (AVMA). Posteriormente, a nadadeira peitoral direita de cada espcime foi removida e fixada em um tubo eppendorf contendo lcool 95%. Aps a retirada da nadadeira, cada indivduo foi etiquetado e fixado numa soluo de formol diluda a 10%, que foi substituda por uma soluo de lcool 70%, sendo estes as amostras que sero utilizadas no prximo captulo. Do total de coletas, de seis pontos somente foram obtidos o tecido, enquanto que o restante das localidades (oito pontos) tem-se tanto o tecido como o indivduo fixado. Cada amostra de tecido foi depositada na Coleo de Tecidos de Gentica Animal CTGA (Fiel Depositrio/CGEN) do Laboratrio de Evoluo e Gentica Animal (ICB / UFAM). 15

Figura 6: Mapa com a distribuio dos pontos amostrados. As cores sinalizadas dentro de cada circunferncia indicam a ocorrncia de qual espcie na rea coletada. A figura de tringulo (vermelho) simboliza a cidade de Manaus, indicando um ponto de referncia. A distncia relativa entre os pontos amostrados, considerando o curso dos rios, est exposto no Anexo I.

2.2. Identificao Taxonmica

Para traar o perfil gentico e filogeogrfico das espcies existentes no gnero preciso delimitar taxonomicamente o indivduos coletados. Para isso, os espcimes coletados foram identificados com base na descrio taxonmica (abordada no item I, 5 da introduo geral) das espcies conhecidas para o gnero Pterophyllum, segundo Kullander (1986; 2003), resumida em: P. scalare: 7,5cm de comprimento padro (CP); 30-39 escamas ao longo da linha lateral; presena do entalhe prximo ao focinho; a mancha escura localizada na base da nadadeira dorsal menos aparente; 16

P. altum: 6,5cm de comprimento padro (CP); 46-48 escamas ao longo da linha lateral; presena do entalhe prximo ao focinho; a mancha escura localizada na base da nadadeira dorsal aparente; corpo mais triangular; barras verticais mais amplas; P. leopoldi: 5,0cm comprimento padro (CP); 27-29 escamas ao longo da linha lateral; entalhe prximo ao focinho menos evidente; mancha escura na base da nadadeira dorsal bem evidente. Vale ressaltar que a amostragem efetuada no Careiro da Vrzea no teve seus indivduos coletados e consequentemente no foram identificados em laboratrio, sendo considerados como P. leopoldi por meio de comunicao pessoal da identificao de campo do coletor professpr Dr. Tomas Hrbek.

2.3. Mtodos Moleculares: Extrao de DNA, Amplificao e Seqenciamento

Uma amostra (5 25 mg) de tecido da nadadeira fixada em lcool foi cortada e o DNA total (nuclear e mitocondrial) foi isolado, seguindo o protocolo de extrao de DNA via proteinase K/ fenol/ clorofrmio de Sambrook et al. (1989), que compreende as seguintes etapas: (1) rompimento da clula, (2) isolamento dos cidos nuclicos pela remoo das protenas e outras estruturas celulares e (3) purificao final, tendo como produto final o DNA diludo. O material gentico extrado foi submetido reao de amplificao da regio do gene mitocondrial do citocromo b, via PCR (Polimerase Chain Reaction Reao da Polimerase em Cadeia), utilizando os primers (iniciadores) Cich_Glu5 Lcytb (forward) 5 GAC YAA TGA CTT GAA AAA CCA C - 3 e Cich_Thr6 Rcytb (reverse) 5 TGG TGC TCT ACR CTG ACY TAC T - 3, ambos desenvolvidos para este trabalho por Tomas Hrbek. A PCR foi realizada para um volume final de reao de 15 l, contendo: 1,5 l de dNTPs (10 mM); 1,2 l de tampo 10X (100 mM Tris HCL / pH 8.4, 500 mM KCl); 1,2 l de cada primer (2 M); 1,5 l de MgCl2 (25 mM); 1l de DNA (50 ng/l); 0,3 l (0,3 U) da DNA polimerase Taq (1U/l) e 7,1 L de gua miliq. Os ciclos de amplificao foram realizados da seguinte maneira: um nico ciclo de prdesnaturao de 1 minuto a 72 oC, seguido de 35 ciclos de desnaturao a 94 oC 17

por 40 segundos; anelamento a 52 oC por 40 segundos e extenso a 72 oC por 1 minuto, terminando com uma etapa de extenso final realizada a 72 oC por 5 minutos. O produto da PCR foi visualizado em gel de agarose 1%, corado com brometo de etdeo (EtBr - 0,5 g/mL) e observado em um transluminador de luz UV Image Master (Pharmacia Biotech). As amostras da PCR positivas foram purificadas atravs da precipitao com acetato de amnia e etanol 95%, para que os produtos da PCR sejam limpos de resduos de baixo peso molecular, tais como sais, primers e dNTPs. Para a reao de seqenciamento (tambm uma PCR) foi utilizado o kit de reao kit ET Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Bioscience), em uma placa especfica, para um volume final, por amostra, de 10 L, contendo: 4 L de DNA amplificado e purificado; 2 L de dois oligonucleotdeos (primers - iniciadores) internos (2 M); 2 L de tampo do kit e 2 L de gua autoclavada deionizada. Os ciclos da reao de seqenciamento foram realizados a 52 oC (anelamento) e seguindo protocolo recomendado pelo fabricante do kit de reao kit ET Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Bioscience). Como primers foram utilizados o PteroIntF510_Cytb (forward) - 5 CTT TGA GGG GGC TTT TCA GT 3

(seguimento final do gene) e PteroIntR701_Cytb (reverse) - 5 GTC TTT GTA GGA RAA GTA GGG - 3 (seguimento inicial do gene), ambos internos e desenvolvidos para este trabalho por Tomas Hrbek. Os produtos resultantes desta PCR foram precipitados adicionando-se 1 L de acetato de amnia (7,5 M) e 27,5 L de etanol absoluto, de acordo com as instrues do fabricante. Posteriormente esses produtos foram ressuspendidos e resolvidos no seqenciador automtico ABI 3130xl (Applied Biosystems Inc.).

2.4. Anlises Moleculares

2.4.1. Alinhamento, Edio de seqncias e Anlises de Composio Molecular

As seqncias obtidas foram editadas manualmente no programa BioEdit Version 7.0.9.0/2007 (Hall, 1999) e alinhadas por meio do aplicativo (Thompson et al., 1994), implementado no BioEdit. ClustalW

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A composio molecular de bases, a identificao de stios variveis e a existncia de cdons de parada inesperados foram checados no programa MEGA 4/2007 (Kumar et al., 2004). Com o programa DAMBE/4.5.53/2001 (Xia, 2000) avaliou-se a existncia de saturaes entre os eventos mutacionais de transverso (TV) e transio (TS), comparando graficamente as distncias genticas (p) e o nmero de substituies (TS ou TV) para casa posio no cdon (Farias et al., 2001). Se a relao ts/tv for < 1, ser evidenciado a existncia de saturao. Do banco de dados gerado foram escolhidas algumas seqncias, que foram submetidas ao banco de dados do GeneBank do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), para checagem da identidade do segmento seqenciado, por meio do aplicativo online BLAST do NCBI .

2.4.2. Anlises Moleculares

a) Anlise Filogentica

Com o banco de dados das seqncias foi gerada uma rvore filogentica entre os hapltipos obtidos, para a determinao de relacionamento evolutivo entre os indivduos identificados em cada espcie e entre as espcies do gnero, visando traar hipteses filogenticas para o grupo e, tambm, relacionar a identificao taxonmica morfolgica com o perfil gentico molecular encontrado. A rvore filogentica entre os hapltipos foi desenvolvida utilizando o critrio de Mxima Verossimilhana (MV) (Felsenstein, 1981), implementado no programa

Treefinder/2008, (Jobb, 2008), com base no modelo molecular evolutivo de Hasegawa Kishino Yano (HKY85), porque este modelo molecular evolutivo considera a composio molecular desigual entre as bases e diferenas na taxas de substituio nucleotdica (transio e transverso), mostrando-se um modelo robusto e de processamento computacional vivel. Como teste de consistncia da rvore foi utilizado o mtodo de bootstrap com 1000 pseudoreplicaes de amostragem.

19

b) Anlise Filogeogrfica

Com base nos hapltipos obtidos em cada espcie, foi estimada uma rede de hapltipos usando o programa TCS 1.18 (Clement et al., 2000) que utiliza o algoritmo de parcimnia estatstica (SP) descrito por Templeton et al. (1992), estabelecendo relacionamento entre os hapltipos de acordo com os passos mutacionais. A rede de hapltipos formada foi submetida ao processo descrito por Templeton et al. (1987) e Templeton & Sing (1993) de hierarquizao, onde os hapltipos distantes por um passo mutacional entre si so agrupados no sentido da extremidade para o interior da rvore haplotpica, formando uma srie de nveis mais complexos de agrupamentos, em que, no final, encontram-se agrupados num nico nvel maior, que depois traduzido em uma matriz de dados. Com estes dados e as distncias geogrficas entre as localidades amostradas, que foram estimadas em quilmetros, seguindo o curso dos rios, foi realizada a anlise de NCA (Nested Clade Analysis Anlise de Clados Agrupados) (Templeton, 1998) no programa GEODIS 2.4 (Posada et al., 2000). Os resultados desta anlise (Dc e Dn significativos) foram interpretados por meio de uma chave de inferncia desenvolvida por Templeton (2005), disponvel online pelo endereo

http://darwin.uvigo.es. A distncia entre os pontos de coleta foi estimada com base no programa GoogleEarth (Anexo I ). Embora existam ressalvas e crticas com relao a este mtodo analtico (ex.Panchal & Beaumont, 2007; Petit, 2008), compartilho a opinio com outros autores de que a anlise de NCA uma abordagem til para determinao de inferncias ao redor de antigos e atuais processos evolutivos atuantes na modelagem e na distribuio da diversidade gentico-populacional, auxiliando no desenvolvimento de hipteses filogeogrficas passveis de validao em outros testes estatsticos (ex.Templeton, 2004; Garrick et al., 2008). Dessa maneira, testes adicionais sero desenvolvidos, sempre que necessrio, para a validao das inferncias oferecidas pelo NCA.

20

c) Anlise populacional (por localidade)

Feito o relacionamento molecular e evolutivo dos hapltipos e a distribuio filogeogrfica em cada espcie, foram desenvolvidas anlises populacionais, com base na identificao taxonmica, nos agrupamentos de hapltipos formados por Mxima Verossimilhana e pela rede de hapltipos, considerando um N amostral superior a cinco (N < 5) e cada ponto de coleta como uma unidade populacional, buscando mapear a distribuio e detectar o comportamento da diversidade gnica ao longo das reas amostradas. Com o programa, Arlequin/3.1 (Excoffier et al., 2005) determinou-se os seguintes parmetros moleculares populacionais (localidade ponto de coleta): 1 - o nvel de variao gentica dentro das localidades amostradas, com base no nmero de hapltipos observados em cada populao (na), assumindo que cada mutao nova gera um novo hapltipo; 2 - o ndice de diversidade gnica (h), probabilidade de duas seqncias tomadas ao acaso em uma populao sejam diferentes entre si (Li, 1997); 3 - o ndice de diversidade nucleotdica (p ), mdia das diferenas nucleotdicas em cada stio entre duas seqncias tomadas da populao ao acaso (Tajima, 1983 ; Nei, 1987; Li, 1997) e 4 - nmero de stios segregantes (S), stios que so variveis ao longo de seqncias distintas (Li, 1997). Com o mesmo programa (Arlequin/3.1) foi testada a existncia de estrutura de populacional, efetuando-se uma anlise de varincia molecular (AMOVA) global e par a par, considerando cada ponto de coleta como uma populao e N amostral mnimo de cinco, com o nvel de significncia das comparaes par a par ajustado pela correo de Bonferroni (Rice, 1989). Essa anlise anloga s anlises de varincia convencional (ANOVA), porm avalia a varincia de freqncias gnicas, considerando as mutaes existentes entre os hapltipos, seguindo nveis hierrquicos de comparaes entre hapltipos de: 1 - uma mesma populao; 2 populaes distintas vistas para a par e 3 - grupos populacionais regionais (Excoffier et al., 1992).

21

O fluxo gnico foi avaliado com base no nmero de migrantes por gerao (Nm), estabelecido pela relao entre o ndice Fst de Wright (1951), o tamanho efetivo populacional (Ne) e a taxa de migrao entre duas populaes (m), sob o modelo de migrao de ilhas, sendo Fst = 1/(4Nm+1) (Wright, 1951). Para o DNAmt a equao modificada para Fst = 1/(2Nm+1), em conseqncia do mecanismo de evoluo haplide e herana materna desta molcula (Ballard & Whitlock, 2004). O nvel de significncia das comparaes mltiplas foi corrigido pela correo de Bonferroni (Rice, 1989). Para testar se as mutaes observadas eram neutras ou estavam sob seleo foram realizados os testes de neutralidade de D de Tajima (1989) e Fs de Fu (1997), com nvel de significncia ajustado pela correo de Bonferroni (Rice, 1989). O teste de D de Tajima examina a significncia da diferena entre o nmero de stios segregantes (S) e a diversidade nucleotdica encontrada (p ). O teste Fs de Fu baseado na probabilidade de observar determinado nmero de alelos em uma amostra de determinado tamanho, levando em conta a diversidade nucleotdica encontrada (p ). Ambos os mtodos esto embasados no balano entre a neutralidade e a seleo (Li, 1997; Ford, 2002). Ademais, estes dois testes so sensveis aos eventos de variao no tamanho populacional, e por isso foram aplicados, tambm, com esta finalidade analtica (Ford, 2002; Durand et al., 2005; Santos et al., 2007). Em cada localidade foi observado a distribuio das freqncias haplotpicas (Mismatch Distribution) entre o observado e o esperado, considerando a distribuio das diferenas par a par de hapltipos de uma dada populao, partindo do pressuposto de que uma populao em equilbrio demogrfico (de tamanho constante) apresenta uma distribuio multimodal (Rogers; Harpending, 1992). Para testar a significncia dessa distribuio foi aplicado um teste que utiliza o ndice de desigualdade de Harpending (r) com o suporte de consistncia de 10.000 replicaes e um intervalo de confiana de 95% (Durand et al., 2005). O teste de correlao de Mantel (Mantel, 1967) foi aplicado buscando testar alguma correlao significativa entre as distncias genticas por localidade (Fst) encontradas e a distncia geogrfica entre as mesmas, ajustando o nvel de confiana para 1000 permutaes com o nvel de significncia estabelecido em 5%. O clculo do Nm (nmero de migrantes), os testes de neutralidade (D de Tajima e Fs de Fu) e de Mantel foram desenvolvidos, tambm, no programa 22

Arlequin/3.1, enquanto que a representao grfica da distribuio e o teste de Mismatch Distribution foram realizados no aplicativo DNAsp/4.5/2008 (Rozas et al., 2003). Calculou-se, tambm, a distncia gentica (d) entre e dentre os pontos coletados, com base na identidade ou similaridade gentica entre os indivduos dentro de uma mesma localidade e entre localidades distintas, tomadas duas a duas, com base nas freqncias allicas encontradas (Nei, 1972), utilizando, para isso, o programa MEGA 4 / 2007 (Kumar et al., 2004). Por causa do nmero amostral (N) inferior a cinco (N < 5) as localidades Campina (N=2) e Novo Airo (N=4) foram descartadas das anlises populacionais.

3. Resultados 3.1. Alinhamento, Edio de seqncias e Anlise de Composio Molecular

Do total coletado, foram obtidas, amplificadas com sucesso e seqenciadas, 244 seqncias alinhadas com 1134 pb (pares de base), dos quais 190 foram polimrficos e 175 parcimoniosamente informativos. A composio percentual de bases foi de T = 31,3%; C = 31,1%; A =24,1% e G = 13,5% (Grfico 1). Foi encontrado apenas um cdon parada na poro terminal (3) da seqncia do citocromo b. As seqncias obtidas corresponderam seqncia depositada no GeneBank do NCBI de Pterophyllum scalare (acesso: AF370676, Farias et al., 2001), de acordo com o BLAST efetuado. A relao entre as taxas de transio (ts), transverso (tv) e a distncia gentica no indicou existncia de saturao, estando indicado no grfico 2 divergncias moleculares entre e dentro de cada espcie.

23

13,5%

31,3%
T C A G

24,1% 31,1%

Grfico 1: Composio percentual de bases.

Grfico 2: Relao entre a distncia e as taxas de transio (ts) em azul e transverso (tv) em verde. Esto representados nos dois eixos deste grfico a distribuio das divergncias existentes entre e dentre as trs espcies estudadas do gnero.

3.2. Anlises Moleculares

a) Anlise Filogentica

Na rvore de hapltipos resultante, utilizando o critrio de mxima verossimilhana (MV), foi possvel observar trs grandes grupos, os quais foram chamados de P. leopoldi, P. altum e P. scalare, representando as trs espcies 24

morfolgicas e taxonmicas do gnero, formando agrupamentos monofilticos com nveis de bootstrap maiores que 90%. A rvore foi coincidente com a identificao taxonmica dos indivduos coletados. O agrupamento P. leopoldi (Ptero1), com cinco exemplares, foi representado somente pela localidade do Careiro da Vrzea, enquanto que o grupo P. altum (Ptero2) contm 24 indivduos provenientes de Santa Isabel (14) e de Boa Vista (10) e o grupo P. scalare (Ptero3) compreendeu em 215 espcimes de todas as localidades, exceto do Careiro da Vrzea (Figura7).

b) Anlise Filogeogrfica

Por representarem trs linhagens filogenticas e trs distintos grupos taxonmicos, resultando na falta de conexo no network (rede) entre os hapltipos das trs espcies pela parcimnia estatstica ao nvel de confiana de 95% e pela existncia de muitas ambigidades (loops), as redes (networks) das trs espcies foram desenvolvidas separadamente, de acordo com as linhagens filogenticas principais formadas na rvore de MV (Mxima Verossimilhana). Como resultado, foram obtidas duas redes (networks) referentes, somente, s espcies P. altum e P.scalare, j que P. leopoldi contm indivduos de uma mesma localidade (Careiro da Vrzea) e este network seria invivel para as anlises de NCA. As redes de hapltipos das espcies P. altum e P. scalare formaram clados hierarquizados de nveis mximos de 4 e 7, respectivamente (Figura 8 e 9). Os clados hierarquizados cujas hipteses nulas de panmixia ou de ausncia de relao entre a distribuio geogrfica e haplotpica foram rejeitadas (p < 0,05) esto discriminados na (Tabela 1). A anlise de NCA para o grupo P. altum sugere que o episdio demogrfico mais antigo representa uma colonizao a longa distncia combinada com eventos antigos de expanso geogrfica gradual e de fragmentao (nvel 4) (Figura 8 e Tabela 1). J para o grupo P. scalare a anlise de NCA prope como episdios mais antigos eventos de isolamento por distncia e de fluxo gnico restrito, alm de episdios de colonizao a longa distncia combinada com eventos de uma antiga expanso geogrfica e gradual juntamente com episdios de fragmentao (nvel 6). Num momento mais recente, o NCA sugere a existncia de fragmentao aloptrica e de colonizao a longa distncia combinada com uma antiga e gradual expanso 25

geogrfica com eventos de fragmentao (nvel 5), seguido por eventos de fluxo gnico restrito, isolamento por distncia e de fragmentao aloptrica (nvel 4), com subseqentes perodos de colonizao a longa distncia em conjunto com uma antiga e gradual expanso geogrfica e com processos de fragmentao, alm da existncia eventos de fragmentao aloptrica (nvel 3). Nos momentos mais recentes de histria genealgica e evolutiva do grupo P. scalare, a anlise de NCA indica provvel expanso geogrfica contgua (nvel 2) (Figura 9 e Tabela 1). A distribuio e a freqncia dos hapltipos, obtidos nos networks, das duas espcies (P. altum e P.scalare) esto disponibilizados no Anexo II.

c) Anlise gentico - populacional e demogrfica (por localidade)

A partir dessas trs espcies (P.leopoldi, P.altum e P.scalare), linhagens evolutivas monofilticas e grupos taxonmicos distintos, e tendo como base: o agrupamento filogentico, distribuio filogeogrfica, localidade e um N superior a cinco (N > 5), foram obtidos os ndices gentico-populacionais, os resultados de estrutura e de distribuio populacional, por espcie e ponto de coleta amostrado. Dessa forma, as localidades de Campina (N = 2), Novo Airo (N = 4) e Boa Vista (N = 3), agrupadas em P.scalare foram descartadas dessas anlises por apresentarem um nmero amostral inferior a cinco. Os parmetros genticos populacionais obtidos, em cada espcie, podem ser visualizados na Tabela 2. O nmero de hapltipos por localidade variou desde 4 (Boa Vista) a 6 (Santa Isabel) para P.altum e de 2 (Santa Isabel) a 15 (Catalo) para P.scalare, dentro do total de 97 hapltipos nesta espcie. O nmero de stios polimrficos em P.altum esteve entre 3 (Boa Vista) a 15 (Santa Isabel) e de 1 (Santa Isabel) a 39 (Catalo) em P.scalare. A espcie P.leopoldi contm uma nica localidade com o nmero de hapltipos e de stios polimrficos igual a 5. Os nveis de diversidade gnica (H) variaram de 0,7111+/-0,1175 (Boa Vista) a 0,8132+/0,0737 (Santa Isabel) em P. altum; de 0,1538+/-0,1261 (Santa Isabel) a 0,9643+/0,0772 (Aman) em P. scalare e 1,0000+/-0,1265 (Careiro da Vrzea) para P.altum. Os ndices de diversidade nucleotdica estiveram entre 0,000823 (+/0,000696; Boa Vista) e 0,002442 (+/-0,001542; Santa Isabel) para P.altum; 0,00014 (+/-0,000227; 26

Santa Isabel) a 0,01109 (+/-0,00580; Purus) para P.scalare e 0,002381(+/-0,001769; Careiro da Vrzea) para P.leopoldi. Para o teste de neutralidade D de Tajima, somente as localidades de Santa Isabel da espcie P.altum e as do Catalo, de Santarm e de Barcelos de P.scalare resultaram em valores negativos e significativos para um p = 0,05, sendo que a populao de Santarm mostrou significncia ao p = 0,01. Para o teste de neutralidade Fs de Fu, a nica localidade (Careiro da Vrzea) de P.leopoldi e quatro localidades (Aman, Mamirau, Santarm e Barcelos), coletadas de P.scalare, tiveram valores negativos e significativos com p = 0,05, exceto a regio de Santarm, que obteve valor tambm negativo, mas significncia a um p = 0,01 (Tabela 2). Depois da correo de Bonferroni para o grupo P.scalare (p = 0,0011), nenhum dos valores estimados para teste D de Tajima foram significativos, enquanto que para o teste de neutralidade de Fs de Fu, Santarm ainda manteve significncia no seu resultado. Dentre estes dois testes de neutralidade, o teste Fs de Fu tem uma capacidade analtica mais sensvel para a deteco de expanso demogrfica (Fu, 1997; Durand et al., 2005). Nas anlises de AMOVA foram encontrados os resultados de Fst = 0,38245 (p < 0,001), para as localidades de P.altum, sendo que 61,75% da variao observada foi intrapopulacional e 38,25% entre populaes, enquanto que para a espcie P.scalare o Fst observado foi de 0,47833 (p < 0,001), em que 47,83% da variao est entre populaes e 52,17% de origem intrapopulacional (Tabela 3). Para P.scalare, a variao do Fst entre as localidades, para a par, foi mais marcante com relao aos pontos de Santa Isabel e de Barcelos, possuindo os maiores ndices significativos de Fst (com a correo de Bonferroni de p = 0,0011) entre comparaes par a par com as demais populaes (Tabela 4). A estimativa do nmero efetivo de migrantes por gerao (Nm) entre as diferentes localidades em P.scalare mostrou os menores valores de migrantes por gerao (Nm < 1), indicativo de um fluxo gnico restrito, entre as comparaes com as localidades de Santa Isabel e Barcelos, ao passo que as correlaes com as localidades de Catalo e Careiro do Castanho (C. Castanho) apresentaram os maiores nveis de Nm (Catalo X Careiro do Castanho/Nm = 21; Careiro do Castanho X Janauac/Nm = 10), o que pode ser correlacionado com a no significncia do F st (Tabela 4). O Nm encontrado entre os locais de Santa Isabel e Boa Vista na espcie P.altum foi de um Nm = 0,80736. 27

O teste de equilbrio demogrfico mostrou o ndice de desigualdade de Harpending (r) significativo (p < 0,05) em dois pontos para P. scalare: Purus, Janauac, o que mostra desequilbrio demogrfico nestas populaes (Tabela1), indicando que a hiptese nula (Ho) de ausncia expanso demogrfica pode ser rejeitada nestas populaes. No entanto, os resultados encontrados, por meio desses testes, nestas localidades no foram corroborados pelos testes de neutralidades, expostos na tabela 2. No teste de Mantel no foi encontrada significncia na correlao entre a variao gentica e a distribuio geogrfica ao longo de todas as localidades amostradas da espcie P. scalare (r = 0,003820; p = 0,011000 > 0,05) e, dessa forma, o aumento da distncia gentica observada no est diretamente relacionado com o aumento da distncia geogrfica entre as localidades amostradas. Na espcie P.scalare, a localidade de Purus alcanou o maior ndice de distncia gentica intrapopulacional (d = 0,011; 1,1%), enquanto que Santa Isabel obteve o menor valor, sendo d = 0,000; 0,00%. J para P.altum, Santa Isabel resultou no maior valor de d (0,002; 0,2%) e Boa Vista no menor valor (d = 0,001; 0,1%). A nica populao de P.leopoldi, Careiro da Vrzea, teve d = 0,002; 0,2% (Tabela 5). Nas comparaes interpopulacionais, tomadas duas a duas, dentro de P.scalare, as combinaes entre as populaes das regies de Barcelos, Santa Isabel e Boa Vista e as demais localidades alcanaram os maiores valores de distncia gentica obtidos (d = 0,010 = 1,0% e = 0,017 = 1,7%) e a comparao entre as populaes de Santarm e Mamirau resultou no menor valor de distncia gentica interpopulacional encontrado (d = 0,001; 0,1%) (Tabela 6). A comparao entre as populaes de Santa Isabel e Boa Vista na espcie P.altum, resultou na distncia d = 0,001; 0,1%.

28

Figura 7: rvore de relacionamento de hapltipos critrio Mxima Verossimilhana (HKY85), indicando os valores de boostrap acima de 60%, onde Careiro = Careiro da Vrzea; StaIsa = Santa Isabel e CCast = Careiro do Castanho. Foi utilizado como grupo externo o gnero Symphysodon (acesso DQ990693 do NCBI).

29

Tabela 1: Resultado das anlises do agrupamento dos clados hierarquizados para as espcies P.altum e P.scalare, mostrando somente clados com permutaes significativas (X2) para estrutura geogrfica (p < 0,05).

Grupo (espcie) P.altum

Clado

Chave de inferncia

Padro inferido

4-1

1-2-11-YES-12-13-YES-21-NO

Colonizao distncia combinados com antigos eventos de expanso geogrfica gradual e de fragmentao.

P.scalare 2-20 3-12 3-19 3-20 1-2-11-12-NO 1211-17-NO 1-19-20-2-3-4-9-NO 1-19-20-2-11-12-13-YES-21NO 1-2-3-4-9-NO 1- 2- 3- 4- NO 1-19-20-2-3-5-15-NO-21-NO Expanso geogrfica contgua. Resultado inconclusivo. Fragmentao aloptrica. Colonizao distncia combinados com antigos eventos de expanso geogrfica gradual e de fragmentao. Fragmentao aloptrica. Fluxo gnico restrito com isolamento por distncia. Colonizao distncia combinados com antigos eventos de expanso geogrfica gradual e de fragmentao. Fragmentao aloptrica. Colonizao distncia combinados com antigos eventos de expanso geogrfica gradual e de fragmentao. Fluxo gnico restrito com isolamento por distncia. Resultado Inconclusivo.

4-1 4-4 5-2

5-3 6-1

1- 19- 20- 2- 3- 4- 9-NO 1-19-20-2-11-YES-12-13-YES21-NO 1- 2- 3- 4-NO

6-3

7-1

1- 2- 11- 17-NO

30

1-1

1-4

2-3

7
1-2 2-1 1-9 3-2

1-5

10
1-6 2-4

3
2-2

1-3

9 5
1-8

1-7 2-5

3-1 4-1

Figura 8: Diagrama da rede haplotpica de clados hierarquizados por meio da anlise NCA (espcie P.altum Ptero2). Cada cor representa um nvel hierrquico e hapltipos hipotticos intermedirios so indicados por o.

31

Figura 9: Diagrama da rede haplotpica de clados hierarquizados por meio da anlise NCA (espcie P.scalare - Ptero3 ). Cada cor representa um nvel hierrquico e hapltipos hipotticos intermedirios so indicados por o. .

32

Tabela 2: ndices de diversidade gentica, testes de neutralidade e de expanso populacional, onde N = N amostral, S = N Stios Segregantes ou Polimrficos e NH = N de hapltipos. Esto representados os parmetros populacionais de acordo com a localidade, espcie, agrupamento filogentico formado e N > 5. Os valores marcados de vermelho indicam os valores que foram significativos depois da correo de Bonferroni. Espcie (grupo) Localidade N S NH H
(Diversidade Gnica Haplotpica) (Diversidade nucleotdica /sitio)

D de Tajima

Fs de Fu

r (mdio)

P.leopoldi Careiro da Vrzea Total P.altum Sta. Isabel Boa Vista Total P.scalare Catalo Purus Aman Janauac Sta.Isabel Mamairau Santarm C.Castanho Iranduba Barcelos Total 25 22 8 18 13 30 42 19 12 17 206 39 36 9 19 1 12 10 15 22 26 189 15 14 7 13 2 10 10 8 6 12 97 0,9400+/-0,0270 0,9394+/-0,0325 0,9643+/-0,0772 0,9477+/-0,0392 0,1538+/-0,1261 0,7609+/-0,0721 0,5540+/-0,0911 0,7251+/-0,1066 0,8636+/-0,0716 0,8897+/-0,0732 0,00518+/-0,002850 0,01109+/-0,005800 0,00289+/-0,001890 0,00564+/-0,003130 0,000136+/- 0,000227 0,00164+/-0,001079 0,00069+/-0,000570 0,00301+/-0,001800 0,00929+/-0,005130 0,00390+/-0,002260 -1,63881* 1,06495 -0,26159 0,61929 -1,14915 -1,24968 -1,95025** -0,76355 1,97847 -1,71327* -3,59288 -0,32785 -2,98845* -3,38627 -0,53714 -3,47563* -7,33915** -0,58309 3,33541 -4,29105* 0,08836 0,09141* 0,76700 0,09214* 0,09072 0,08922 0,08783 0,09367 0,08809 0,08547 14 10 24 15 3 18 6 4 10 0,8132+/-0,0737 0,7111+/-0,1175 0,002442+/-0,001542 0,000823+/0,000696 -1,68371* -0,43130 -0,11467 -1,02041 0,09213 0,09112 5 5 5 5 5 5 1,0000+/-0,1265 0,002381+/-0,001769 0,84298 -2,44206* 0,0893

Nota: *< 0,05; **< 0,01; Correo de Bonferroni para Pterophyllum scalare = 0,0011.

33

Tabela 3: Anlise de Varincia Molecular (AMOVA), entre todas as localidades, com N > 5, nas espcies P.altum e P.scalare. significativa a estrutura populacional nas duas espcies (P < 0,001). Espcie (grupo) P. altum Fonte da variao Entre populaes Dentro das populaes Total Entre populaes Dentro das populaes Total d.f. 1 22 23 9 196 205 Soma dos quadrados 8,300 22,200 30,500 390,319 436,963 827,282 Componentes da Varincia 0,62494 Va 1,00909Vb 1,63403 2,04418 Va 2,22940 Vb 4,27358 Porcentagem (%) de variao 38,25 61,75 100 47,83 52,17 100

P. scalare

P.altum F st = 0,38245, p < 0,001; P.scalare F st = 0,47833, p < 0,001

Tabela 4: Comparaes par a par dos valores de Fst (abaixo e cor preta) e Nm (acima e cor azul) entre as localidades analisadas com N > 5 na espcie P.scalare. Os valores em vermelho correspondem respectivamente aos maiores ndices significativos de Fst e aos valores significativos de baixo Nm.
Localidade 1. Catalo 2. Purus 3. Aman 4. Janauac 5. Sta. Isabel 6. Mamirau 7. Santarm 8.C.Castanho 9. Iranduba 10.Barcelos 1 ---------0,12124 0,07112 0,09754 0,70567* 0,08072* 0,07922* 0,02246 0,20494 0,67384* 2 3,62393 ---------0,19665 0,20118* 0,57745* 0,30880* 0,37103* 0,22004* 0,17410 0,54204* 3 6,53057 2,04260 ---------0,19032 0,88847* 0,07786 0,30062* 0,13766 0,23896 0,74885* 4 4,62633 1,98533 2,12719 ---------0,70235* 0,26486* 0,31957* 0,04489 0,27016* 0,68187* 5 0,20854 0,36588 0,06277 0,21189 ---------0,87678* 0,93930* 0,81337* 0,68081* 0,85896* 6 5,69430 1,11917 5,92176 1,38778 0,07027 ---------0,08435* 0,10905 0,38165* 0,81167* 7 5,81159 0,84761 1,16324 1,06459 0,03231 5,42796 ---------0,10183 0,48209* 0,86779* 8 9 21,76281 1,93979 1,77230 2,37188 3,13211 1,59236 10,63784 1,35073 0,11472 0,23442 4,08526 0,81009 4,41031 0,53716 ---------1,29603 0,27839 ---------0,74591* 0,57980 * 10 0,24202 0,42245 0,16769 0,23328 0,08210 0,11602 0,07618 0,17032 0,36236 ----------

*p < 0, 0011 (Correo de Bonferroni)

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Tabela 5: Distncia gentica intralocalidade. Os nmeros de colorao azul e vermelha representam, respectivamente, os maiores e os menores valores obtidos. Esto representados os parmetros populacionais de acordo com a localidade, espcie e agrupamento filogentico formado. O desvio padro foi estabelecido com base em 200 replicaes de bootstrap.
Espcie (grupo) P.leopoldi P.scalare Catalo Purus Iranduba Aman Mamirau Subtotal 1 Total P.altum Sta. Isabel Boa Vista Total Localidade Careiro da Vrzea Distncia Desvio Padro Populao Distncia Desvio Padro

0,002 0,005 0,011 0,009 0,003 0,002 0,03 0,044 0,002 0,001 0,003

0,001 0,001 0,002 0,002 0,001 0,001 0,007 0,011 0,001 0,000 0,001
Janauac StaIsabel Santarm C.Castanho Barcelos Subtotal 2

0,006 0,000 0,001 0,003

0,004

0,002 0,000 0,000 0,001

0,001

0,014

0,004

Tabela 6: Distncia gentica entre localidades par a par, pertencentes espcie P.scalare, estabelecida com base em 200 replicaes de bootstrap. Os nmeros de colorao azul e vermelha representam, respectivamente, os maiores e menores valores obtidos.
Localidade 1. Catalo 2. Purus 3. Aman 4. Mamirau 5. Janauac 6. Sta. Isabel 7. Santarm 8. C.Castanho 9. Iranduba 10.Barcelos 1 ----0,009 0,005 0,004 0,006 0,011 0,003 0,004 0,009 0,014 2 ----0,010 0,009 0,011 0,016 0,008 0,009 0,013 0,017 3 4 5 6 7 8 9 10

----0,002 0,006 0,011 0,002 0,003 0,008 0,014

----0,005 0,010 0,001 0,003 0,008 0,013

----0,011 0,004 0,005 0,010 0,015

----0,009 ----0,010 0,002 ----0,015 0,007 0,008 ----0,016 0,013 0,014 0,015 -----

35

4. Discusso e Concluso

a) Anlise de Composio Molecular

Neste trabalho foram estudas caractersticas gerais do genoma mitocondrial de vertebrados como a composio molecular de bases e a existncia de saturao. A menor porcentagem observada de guanina (13,5%) em relao s demais bases constitui um fenmeno comumente encontrado no DNA mitocondrial dos vertebrados (Grfico 1) (Zhang & Hewitt, 1996). Eventos de saturao no foram vistos, o que esperado entre txons filogeneticamente muito relacionados entre si, assim como em nveis populacionais (Meyer, 1993; Farias et al., 2001) (Grfico 2).

b) Anlise Filogentica

A rvore de Mxima Verossimilhana apresentou trs grandes grupos definidos (bootstrap > 95%) e relacionados com as trs espcies descritas para o gnero Pterophyllum (P. leopoldi, altum e scalare, nesta ordem), se considerarmos a identificao taxonmica efetuada, a distribuio geogrfica, proposta no esquema da figura 5, e os nveis de consistncia filogentica destas trs linhagens. Mesmo no tendo conseguido coletar indivduos P. leopoldi e existindo diferentes morfotipos no gnero, principalmente em P. scalare, o que poderia confudir a identificao das espcies, foi possvel separar molecularmente as trs espcies para o gnero e os 5 espcimes coletados no Careiro da Vrzea foram determinados P. leopoldi, de acordo com o perfil filogentico obtido e comunicao pessoal do coletor Tomas Hrbek. A capacidade de separao entre as trs espcies reconhecidas para o gnero mostra que o gene mitocondrial do citocromo b pode ser um marcador molecular til em estudos filogenticos e sistemticos de cicldeos de nveis taxonmicos mais altos, 36

como o de espcie. Farias et al., 2001, ao estudarem a eficcia do gene do citocromo b como um marcador molecular de relacionamento filogentico e sistemtico de cicldeos africanos e neotropicais, encontraram boa performance desta regio mitocondrial em diferentes nveis taxonmicos. O agrupamento formado por P. leopoldi (Ptero1) e P. altum (Ptero2) monofiltico, o que interessante dentro do ponto de vista morfolgico destas duas espcies, pois apresentam maior diferenciao morfolgica entre si, em comparao com P. scalare, segundo a descrio taxonmica de cada espcie, abordada nos itens I.5. da Introduo geral e 2.2 do Material e Mtodo deste trabalho. Alm disso, foi encontrada uma distribuio geogrfica mais restrita ao Careiro da Vrzea (Careiro) para P. leopoldi, ao passo que P.altum foi encontrado presente em Santa Isabel e Boa Vista. O grupo P. scalare (Ptero3) est agrupado de maneira monofiltica (grupo irmo) ao conjunto formado por P. leopoldi e P. altum e tem uma distribuio mais ampla ao longo de toda regio amostrada neste trabalho, exceto na regio do Careiro da Vrzea (Figura 7), sendo Santa Isabel e Boa Vista localidades de simpatria entre duas destas linhagens (Ptero 2 e Ptero 3) ou espcies (P. altum e P. scalare). Embora as espcies Pterophyllum leopoldi (Ptero1) e Pterophyllum scalare (Ptero3) tenham registros de distribuio geogrfica simptrica entre o eixo Iranduba - Santarm, o mesmo no foi evidenciado filogeneticamente nestas localidades (Figura 7).

c) Anlise Filogeogrfica

Na espcie P. altum, a anlise de NCA sugeriu, que a distribuio da diversidade gentica observada nas localidades de Santa Isabel e Boa Vista (Figura 8; Anexo II) tenha sido resultado de eventos histricos de colonizao distncia combinados com antigos eventos de expanso geogrfica gradual e de fragmentao (clado 4-1) (Tabela 1), podendo ser observado na significncia do teste de neutralidade D de Tajima na localidade de Santa Isabel, a existncia de expanso demogrfica nesta regio.

37

Para a espcie P.scalare a histria de diversificao evolutiva proposta pelo NCA mostrou-se mais complexa e indica que esta espcie, ao longo da rea amostrada, passou por pulsos de expanso geogrfica (clados 2-20; 3-20; 5-2; 6-1), colonizao distncia e de fragmentao (clados 3-20; 5-2; 6-1), intercalados por episdios de fluxo gnico restrito, de isolamento por distncia (clados 4-4; 6-3) e de fragmentao (clados 3-19; 4-1; 5-3) (Tabela 1). No entanto os resultados de Nm e do teste de Mantel (Tabela 4), no corroboram a existncia de fluxo gnico restrito e isolamento por distncia no clado 4-4 (Figura 9), que contm hapltipos das regies de Santarm; Purus; Janauac; Iranduba; Catalo; Mamirau; Aman; Campina e Careiro do Castanho. Uma provvel explicao para a inferncia de fluxo gnico restrito oferecida para o clado 6-3 (Figura 9, Anexo II), pode estar relacionada aos hapltipos agrupados, neste clado, entre as localidades de Santa Isabel + Boa Vista e Barcelos, todas de gua preta, e as regies de Santarm + Purus + Janauac + Iranduba + Catalo + Mamirau + Aman + Campina + Careiro do Castanho, todas de gua branca, o que tambm foi observado na representao filogentica da rvore de MV (Figura 7), possivelmente resultado de fluxo gnico restrito entre os diferentes tipos qumicos e fsicos de guas (Sioli, 1984) como pode ser visto nos ndices de Nm e acarretanto estrutura populacional pelo significante Fst (para a par; Tabela 4). Os padres de fragmentao aloptrica sugeridos para os clados 3-19; 4-1 e 5-3 (Tabela 1; Figura 9) no apresentam uma explicao direta sobre qual barreira evolutiva teria influenciado no padro da distribuio gentica entre as localidades que compem os clados destes nveis hierrquicos. No caso do clado 3-19, o panorama observado de fragmentao e diversificao dos hapltipos entre as regies de Santa Isabel + Boa Vista e de Barcelos, pode estar relacionado influncia da drenagem do rio Branco na regio de Barcelos, atuando como uma barreira entre os indivduos de Barcelos e as regies de Santa Isabel e Boa Vista, o que reflete os ndices significativos e elevados de Fst e de Nm inexistente entre essas localidades, sendo este fenmeno, de separao haplotpica, tambm observado no relacionamento filogentico entre essas localidades (68,44%; Barcelos e 98,08%; Santa Isabel + Boa Vista; Figura 7). 38

No caso das hipteses oferecidas de expanso geogrfica gradual nos clados 3-20; 5-2 e 6-1 (Tabela 1; Figura 9), so corroboradas pela significncia dos testes de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu nas localidades de Aman, Santarm e Mamirau (Tabela 2). J para o clado 2-20 a hiptese de expanso geogrfica contgua pode ser associada significncia do r nas localidades de Janauac e Purus no teste desigualdade de Harpending, porm estas regies no apresentaram significncia qualquer nos testes de neutralidade.

d) Anlise gentico - populacional e demogrfica (por localidade)

Os parmetros gentico populacionais de diversidade gnica maiores do que os de diversidade nucleotdica (Tabela 2) podem estar relacionados a eventos de expanso populacional depois de longos perodos de reduo do tamanho efetivo da populao (Grant; Bowen, 1998), o que pode ser corroborado pelos resultados significativos obtidos nos testes de neutralidade (D de Tajima e Fs de Fu) e de desigualdade de Harpending (r) em algumas das localidades estudadas (Tabela 2), atuando, tambm, nas inferncias de expanso populacional propostas pelo NCA (Tabela 1), tanto para Pterophyllum scalare, quanto P. leopoldi. Os resultados de estrutura populacional obtidos neste trabalho sugerem que a espcie P. scalare (Ptero3) no se comporta como uma populao panmtica ao longo das localidades amostradas pela bacia amaznica, possuindo nveis significativos (p < 0,0011) de estrutura populacional entre algumas regies, sendo reforado pelo baixo fluxo gnico (Nm), como mostrado pela tabela 4. A AMOVA generalizada em Pterophyllum scalare tambm resultou num Fst (0,47833) significativo (p < 0,001), porm maior parte da variao gentica encontrada foi atribuda a diferenas genticas intralocais, representando 52,17% da variao (Tabela 3), sendo que o mesmo resultado, de maior variao gentica intrapopulacional (61,75%) do que

interpopulacional (38,25%), foi visto nas populaes de P. altum (Ptero2) com um Fst significativo igual a 0,38245 (p < 0,001) e Nm = 0,80736, o que significa, que nesta espcie, tambm no foi encontrado panmixia. 39

Em relao as localidades de P. scalare prximas do eixo Solimes - Amazonas, os Fsts significativos observados, associados aos ndices de baixo fluxo gnico (Nm), entre algumas das comparaes populacionais de P. scalare (Tabela 4), juntamente com as inferncias de fluxo gnico restrito do teste de NCA (Figura 9 e Tabela 1), podem estar relacionados com a ampla distribuio geogrfica entre as localidades amostradas no Solimes Amazonas (Figura 5 e Anexo I), o que pode acarretar estrutura populacional e fluxo gnico restrito. Mesmo no existindo correlao significativa entre a distncia geogrfica e a variao gentica pelo teste de Mantel, o que leva a rejeio da hiptese de isolamento por distncia sugerida pelo NCA, possvel observar que os maiores nveis de fluxo gnico foram encontrados entre locais geograficamente mais prximos entre si (Tabela 4). Peixes com ampla distribuio geogrfica podem exibir baixa conectividade gentica quando possuem caractersticas biolgicas e comportamentais tais como o territorialismo, sedentarismo e preferncia por habitats mais isolados, resultando em baixa disperso e conseqente estrutura gentica populacional, sendo este o caso dos peixes da famlia Cichlidae, que possuem comportamento territorialista, filoptrico e habitam preferencialmente ambientes lacustres e mais lnticos (Lowe-McConnell, 1991; Chelappa; Yamamoto, 1999; Kullander, 2003). Espcies do gnero Cichla (tucunar) da bacia amaznica detm pronunciado territorialismo e filopatria, o que pode ter determinado o baixo fluxo gnico encontrado entre suas populaes (Willis et al., 2007). Mesmo em reas geogrficas mais restritas, os cicldeos podem apresentar reduzido fluxo gnico e estrutura gnica entre locais prximos, como caso dos cicldeos africanos (ex. Melanochromis auratus), podendo ser conseqncia de adaptaes a variaes geolgicas e ambientais pontuais (Markert et al., 1999), proporcionando oportunidades para os eventos de adaptao e de especiao. Em contrapartida espcies migradoras e de grande disperso como, Colossoma macropomum (tambaqui), mostraram, em estudos genticos, o comportamento populacional de panmixia ao longo da bacia amaznica (Santos et al., 2007). Sivasundar et al (2001) notaram pouca estrutura gentica entre os peixes migradores da espcie Prochilodus lineatus ao longo de mais de 1.500 quilmetros (km) de extenso geogrfica na bacia dos rios Paran Paraguai. 40

No entanto, mesmo com a existncia de filopatria, territorialismo e sedentarismo nos cicldeos do gnero Pterophyllum e com evidncias de estrutura populacional (Tabela 4) e reduzido fluxo gnico entre alguns pontos amostrados de P. scalare (Ptero3), possvel observar, tanto na rvore de Mxima Verossimilhana (Figura 7) como na rede de relacionamento de hapltipos (Figura 9; Anexo II), a existncia de hapltipos compartilhados entre localidades geograficamente distantes, ao longo do eixo Solimes Amazonas (Santarm X Mamirau ou X Aman = 1300 km; Anexo I). Uma possvel explicao para o resultado observado est na dinmica das plancies de inundao peridicas (vrzea e igap), muito comuns na bacia amaznica, que podem estabelecer fluxo gnico, migrao (Tabela 4) e o provvel padro de colonizao distncia proposto pelo NCA (Clados 3-20, 5-2 e 6-1, Figura 9 e Tabela 6). Dessa maneira, os sistemas de vrzea e igap podem formar um amplo sistema aqutico interconectado, aumentando as possibilidades de eventos de migrao e de fluxo gnico (Cantanhede et al., 2005). Ready et al. (2006), ao estudarem caracteres morfolgicos e genticos nas espcies do gnero Symphysodon, atriburam o limitado nmero de espcies observado dentro do gnero a coeso gentica, possibilitada pelo fluxo gnico entre as populaes associadas s plancies de inundao, habitat onde esses peixes esto amplamente distribudos na Amaznia. Portando a variao do nvel de gua pode influenciar os padres de diversificao em populaes naturais dispostas ao longo de sistemas aquticos, ocasionando eventos de diversificao e de especiao, mediante ao rompimento ou a manuteno do fluxo gnico, mesmo em animais de conduta territorialista e filoptrica, que podem comprometer a capacidade de disperso e de fluxo gnico. Dessa maneira, a flutuao peridica do nvel das guas pode estar ligada difusa relao entre a distribuio geogrfica e a haplotpica na espcie P. scalare (Ptero3) (Figuras 7 e 9) como, por exemplo, o forte agrupamento filogentico formado entre alguns indivduos das populaes de Purus e de Novo Airo, como mostra na figura 7 (bootstrap de 98,93%). Essas duas populaes encontram-se geograficamente mais distantes entre si, quando comparadas com as populaes de: Iranduba, Janauac, Catalo, Careiro do Castanho e Careiro da Vrzea em relao aos peixes da localidade Purus, ao passo que a populao de Novo Airo situa-se geograficamente 41

mais prxima das localidades de: Janauac, Catalo, Careiro do Castanho, Careiro da Vrzea, Iranduba e Barcelos (Anexo I). Alm disso, estas duas localidades so influenciadas por uma distinta dinmica hdrica, relacionada aos rios Negro e Solimes (Figura 6). Mas olhando-se atentamente pode-se perceber que algumas reas esto localizadas geograficamente de maneira intermediria entre estas duas populaes como as regies de Iranduba, Catalo, Janauac, Careiro do Castanho e Careiro da Vrzea e, por conseguinte, sugere-se a possibilidade de existir uma provvel conexo entre essas localidades, garantindo fluxo gnico auxiliado pela flutuao do nvel das guas. Eventos de flutuao do nvel das guas durante a escala geolgica so muito conhecidos como um dos principais fatores no processo de diversificao dos cicldeos dos lagos africanos (Turner, 2007; Egger et al. 2007; Koblmller et al., 2007; Crispo & Chapman, 2008). Porm o presente estudo trata de uma dinmica peridica e anual do nvel das guas durante as estaes de vero e inverno amaznico e que contribui para a homogeneidade gentica entre os pontos amostrados do eixo Solimes - Amazonas, superando caractersticas comportamentais da famlia Cichlidae. Ao longo das regies coletadas de P. scalare do rio Negro (Barcelos a Santa Isabel) nota-se maiores nveis de estrutura gentica e de fluxo gnico restrito, do que entre as localidades amostradas do eixo Solimes-Amazonas e geograficamente mais distantes entre si como Santarm e Aman. Alm disso, a populao de Barcelos se diferenciou significativamente das demais populaes de P. scalare, incluindo as de gua preta, o que pode ser visto na distribuio de hapltipos da rede (Figura 9; Anexo II), na rvore da MV (Figura 7) e nos ndices populacionais de Nm e de Fst da Tabela 4, evidenciando ausncia de fluxo gnico e estrutura gnica. At o momento, so poucos os registros cientficos que abordem eventos geomorfolgicos antigos nesta rea que descrevam padres semelhantes biogeogrficos em outros grupos de animais. Uma provvel explicao para o padro encontrado, nessa localidade de P. scalare em questo, poderia estar relacionada maior influncia das populaes de P. scalare provenientes do rio Branco, que sofreram diferentes processos evolutivos prprios da drenagem onde vivem, o que pode estar contribuindo, tambm, para distinta diversificao populacional observado na populao de Barcelos, o que proporciona a 42

inferncia de fragmentao aloptrica sugerida pelo NCA (clado 3-19; Figura 9, Tabela 1). No entanto, para testar tal hiptese necessrio uma amostragem proveniente da localidade do rio Branco. Lovejoy & Arajo (2000) encontraram maior relao filogentica entre os peixes do gnero Potamorrhaphis das regies de Apure (baixo Orinoco), Barcelos (rio Negro) e Santarm (rio Amazonas) do que entre populaes mais prximas e de mesma drenagem como Belm (rio Amazonas), Atabapo e Santa Rita (duas ltimas so do rio Orinoco). Alm disso, foi observado, tambm, forte estrutura gentica de acordo com localidade amostrada, o que foi relacionada com a baixa capacidade de disperso do grupo estudado. Com base nesses dados, os pesquisadores sugeriram a existncia de uma histrica conexo entre as reas de Barcelos, Santarm e Apure, intermediada pelo rio Branco, por meio da comunicao entre as bacias dos rios Branco, Essequibo (na Guiana) e Orinoco. Alternativamente, a diferenciao gentica notada na regio de Barcelos com as demais localidades coletadas pode ser resultante de variaes qumicas na qualidade da gua antes e depois da confluncia do rio Branco com o Negro, gerando maiores nveis de estrutura gentica e de fluxo gnico restrito entre esse ponto e as demais localidades, o que pode ser visto na estrutura filogentica entre os pontos coletados de Novo Airo e Barcelos. A significante estrutura populacional e fluxo gnico inexistente observado nas comparaes entre as populaes de P. scalare (Ptero3) provenientes de Barcelos e Santa Isabel com as demais localidades (Tabela 3) e o padro do agrupamento formado na rvore MV (Figura 7) e de relacionamento de hapltipos (Figura 9; Anexo II) encontrado nestas populaes pode estar relacionado s diferenas qumicas e fsicas dos dois tipos de gua encontradas nos rios Negro e Solimes (Sioli, 1984). Esta hiptese tambm foi sugerida por Thoisy et al. (2006), Vasconcelos et al. (2006) e Willis et al. (2007) para explicar o padro de diversificao das populaes de Melanosuchus niger, Caiman crocodilus e de espcies do genero Cichla coletadas entre estes dois tipos de guas. Farias e Hrbek (2008) notaram fluxo gnico restrito com isolamento por distncia entre as populaes de discus do baixo rio Amazonas (branca) e as rio Negro (preta) e relacionaram este resultado ao comportamento adaptativo desses peixes as diferenas qumicas e fsicas das guas branca e preta. Dessa forma, as diferenas nas 43

condies limnolgicas dessas guas atuariam como um fator ecolgico limitante para a migrao entre as populaes dos distintos tipos de guas, restringindo o fluxo gnico. Esse tipo de estrutura populacional, limitada por condies ambientais, tambm foi descrita para os ambientes lacustres dos lagos africanos, onde trabalhos j mostraram a existncia de correlaes entre a estrutura de habitats e a diferenciao populacional de haplochromneos africanos (Markert et al., 1999). Com base nos resultados moleculares obtidos neste estudo foi possvel distinguir molecularmente as trs espcies dentro do grupo Pterophyllum, espcies j reconhecidas para o gnero, mostrando a eficcia do marcador molecular utilizado. No geral, os padres filogeogrficos que resultaram na distribuio e na diversificao observadas nas espcies do gnero Pterophyllum, mostraram-se como um mosaico de processos evolutivos. De acordo com os resultados obtidos, eventos de expanso demogrfica, aparentemente, influenciaram a histria evolutiva das espcies P. altum e P. scalare. Apesar das caractersticas comportamentais (ex. territorialismo, filopatria e sedentarismo) e dos nveis de estruturao genticos populacionais (Fst) significantes e de fluxo gnico restrito entre alguns pontos de coleta, foi encontrado maior variao gentica dentro das localidades amostradas em cada espcie, do que entre pontos distintos, assim como evidncia de fluxo gnico entre pontos distantes entre si, o que influnciou a falta de correlao significativa, pelo teste Mantel, entre a distribuio geogrfica e haplotpica em Pterophyllum scalare, apresentando sua diversificao gentica, influenciada, em parte, pela ampla distribuio geogrfica desta espcie e, em grande parte, pela dinmica peridica de cheia a vazante da bacia amaznica. As diferenas encontradas no padro de distribuio gentica dos diferentes tipos de gua (branca e preta) em P. scalare pode estar relacionado variao das influncias e dinmicas ambientais nos rios Solimes Amazonas e Negro, como caractersticas fsico qumicas. No caso das regies coletadas de P. scalare do rio Negro, foi sugerido e existncia de uma contribuino limitante de disperso do rio Branco entre Barcelos e Boa Vista + Santa Isabel, resultando na inferncia filogeogrfia de fragmentao aloptrica. De uma maneira resumida notou-se, neste estudo, que a distribuio da variabilidade gentica segue um comportamento diferenciado de acordo com: 1- as duas espcies P. scalare e P. altum; 2- a dinmica de variao do nvel das 44

guas em P. scalare; 3- as diferenas limnolgicas das guas branca e preta, P. scalare; 4- as influncias das drenagens principais, mais prximas dos pontos coletados: rios Solimes Amazonas, Negro e Branco, P. scalare e 5- da variao histrica do tamanho populacional nos pontos coletados de P. altum e P. scalare.

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CAPTULO 2 Estudo da forma corporal de peixes do gnero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) ao longo da bacia Amaznica, utilizando morfometria geomtrica.

1. Introduo

Pesquisas relacionadas ao formato corporal dos organismos assumem importante papel em estudos biolgicos, uma vez que podem refletir experincias biolgicas e evolutivas (Bookstein, 1991; Zelditch et al., 2004), tendo como base o conceito de que o fentipo apresentado por um organismo decorre da interao existente entre um dado gentipo e o meio ambiente em que se encontra (Ricklefs; Miles, 1994) e que a evoluo de um mesmo fentipo em populaes naturais situadas em um mesmo ambiente pode ser evidncia de seleo natural e de adaptao (Mcguigan et al., 2005). De um outro ponto de vista, variaes estruturais podem afetar o comportamento e a interao ecolgica dos organismos, principalmente se levarmos em conta caractersticas fsicas e qumicas do ambiente (Webb, 1984). Dessa maneira, o formato corporal pode ter relevncia evolutiva e ecolgica para um dado organismo (Klingenberg et al., 2003). Diante disto, anlises de estruturas morfolgicas como as morfomtricas podem ser de grande valia (Schluter, 1993), sendo utilizada em distintas abordagens biolgicas durante anos (Monteiro et al., 2002; Rosenberg, 2002). Historicamente, o estudo da variao corporal consistia em medidas relativas de estruturas anatmicas que eram analisadas por meio de arranjos cannicos, componentes principais e outros recursos de estatsticos multivariados, configurando a tcnica denominada de morfometria tradicional (Monteiro et al., 2002). O avano de ferramentas estatsticas e computacionais, das teorias matemticas de espao forma (Goodall, 1983; Kendall, 1984) e o desenvolvimento de novas abordagens metodolgicas (Bookstein, 1991), permitiram novas aplicaes 46

biolgicas para esse tipo de estudo, que se tornou mais acurado em definir, quantificar e explicar estatisticamente as origens, manuteno e as conseqncias dos padres morfolgicos encontrados, sendo esta nova abordagem chamada de morfometria geomtrica, a qual considera variaes geomtricas da forma (espao geomtrico ocupado), com base numa configurao de pontos anatmicos e na reduo dos efeitos inerentes ao tamanho, a localizao e a posio estrutural ocupada, oferecendo dados mais informativos, de fcil manipulao e maior compreenso dos resultados obtidos (Monteiro et al., 2002; Parsons et al., 2003). No caso dos peixes da famlia Cichlidae, a plasticidade fenotpica e as variaes estruturais apresentadas so bem evidentes, assumindo um importante papel no desenvolvimento evolutivo, ecolgico e comportamental de cada espcie (Klingenberg et al., 2003), como visto nos cicldeos dos lagos africanos, que representam um excepcional exemplo de especiao, diversificao, irradiao e convergncia adaptativa, possuindo elevado nmero de morfotipos e variao morfolgicas, alm dos altos nveis de endemismo (Greenwood, 1991; Joyce et al. 2005). Dessa forma, torna-se importante a determinao do grau de variao morfomtrico, assim como das caractersticas morfolgicas neste grupo de peixes, podendo ser de grande valia o uso combinado de ferramentas moleculares neste tipo de quantificao, auxiliando na elaborao dos provveis mecanismos evolutivos atuantes na diversificao desses peixes (Monteiro; Gomes-Jr, 2005; Kassan et al., 2007). Kocher et al (1993), utilizando dados do DNA mitocondrial e de morfometria, identificaram separao gentica entre dois cicldeos de morfotipos similares entre dois lagos africanos Malawi e Tanganyika, mostrando que outros aspectos, alm dos genticos, esto influenciando o padro morfomtrico observado. Monteiro e Gomes-Jr (2005), utilizando dados combinados de morfometria geomtrica e parmetros genticos (herdabilidade, Ne e nmero de geraes) encontraram tendncias de seleo direcional entre populaes da espcie de peixes Poecilia vivpara (Poeciliidae), indicando a existncia de aspectos genticos na determinao morfolgica deste peixes, sendo um exemplo de que este tipo de estudo combinado pode ser de grande utilidade, podendo ser aplicado em vrios grupos de peixes. 47

J Ready et al., (2006) no encontraram relao entre os dados moleculares e os morfotipos das espcies do gnero Symphysodon (tribo Heroini), questionando a determinao morfolgica das espcies deste gnero, o que evidenciado para mais grupos de heroneos, em que a variao morfolgica e a existncia de morfotipos podem levar a incertezas taxonmicas e evolutivas, como aconteceu com o histrico taxonmico dos peixes do gnero Pterophyllum (Lowe-McConnell, 1969(a); Kullander, 1986) e com a sistemtica e taxonmia dos heroneos da Amrica Central (ConcheiroPrez et al., 2007). Klingenberg et al. (2003) em estudos com o gnero Amphilophus, utilizando morfometria geomtrica detectaram diferenas significativas entre as trs espcies do estudo (A. citrinellus, A. labiatus, A. zaliosus), especialmente em A.citrinellus, que apresentou diferenas de acordo com a distribuio geogrfica e os morfotipos de cor e de trfico. Parsons et al. (2003) analisando duas dessas espcies (A. citrinellus, A. zaliosus) e comparando os dois tipos de abordagem morfomtrica (clssica e moderna) entre si, concluram que tanto um mtodo quanto o outro eram eficazes em diferenciar morfologicamente cada espcie, no entanto o poder de resoluo de dados oferecido pela morfometria geomtrica era maior, o que tambm foi visto por Maderbacher et al. (2008), ao aplicar as duas tcnicas morfomtricas no estudo morfomtrico das populaes de Tropheus moorii do lago Tanganiyka. Diante da capacidade adaptativa dos cicldeos, da evidncia de diversificao ecolgica e evolutiva dos heroneos, da variedade morfolgica e de morfotipos neste grupo e do poder de dicernimento taxonmico e de deteco da variao morfolgica oferecido pela morfometria geomtrica, o presente trabalho pretende utilizar os dados de morfometria geomtrica e de gentica molecular (DNAmt - citocromo b) para testar a existncia das relaes existntes entre os padres morfolgicos e as espcies vlidas, assim como comparar o perfil morfomtrico encontrado com a distribuino gentica e geogrfica encontradas nas espcies de cicldeos do gnero Pterophyllum ao longo da bacia amaznica, buscando entender os provveis eventos evolutivos (como adaptao, plasticidade fenotpica e convergncia adaptativa) que resultaram na variao morfolgica observada, buscando justific-la biogeogrficas desenvolvidas para o contexto amaznico. 48 por meios das teorias

1.1. Objetivos

1.1.1 Objetivo Geral

Discutir os padres de variao morfolgica nas espcies do gnero Pterophyllum ao longo da bacia amaznica, com base na caracterizao morfomtrica, na identificao taxonmica, na distribuio geogrfica e ambiental e no perfil haplotpico encontrado, buscando compreender os processos que deliniaram a diversificao morfolgica observada, por meio das ferramentas de morfometria geomtrica, associado aos resultados de gentica molecular (gene mitocondrial do citocromo b) obtidos no captulo anterior.

1.1.2. Objetivos Especficos

Relacionar a identificao taxonmica com o padro morfomtrico de cada espcie;

Caracterizar a variao morfomtrica nas espcies do gnero Pterophyllum, ao longo da rea coletada;

Testar

discutir

as

provveis

relaes

existentes

entre

os

padres

morfomtricos encontrados entre as populaes das espcies do gnero Pterophyllum e sua respectiva caracterizao gentica;

Testar

discutir

as

provveis

relaes

existentes

entre

os

padres

morfomtricos encontrados nas espcies do gnero Pterophyllum e sua respectiva distribuio geogrfica e ambiental. 49

2. Material e Mtodo

2.1. Amostragem

Levando-se em conta a distribuio dos peixes do gnero Pterophyllum na bacia amaznica (Kullander, 2003), foram coletados 215 espcimes ao longo dos rios: Negro (Boa Vista N=16, Santa Isabel N=34, Barcelos N=21), Solimes (Iranduba N=16 e Janauac N=21), Amazonas (Careiro do Castanho N=28), e alguns afluentes (Purus N=28, Santarm N=51 na regio Solimes X Tapajs), totalizando oito pontos de coleta (Figura 10), das quais duas foram coletadas, por Tomas Hrbek (Boa Vista a Santa Isabel). As coletas foram autorizadas pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (IBAMA) sob o processo de n 02001.000162/2006-67. O processo de captura foi efetuado com o auxlio de um rapich e de uma rede de cerco. Aps a captura, anestesiou-se cada exemplar com 0,4 ml -1,0 ml de uma soluo de eugenol 10% (diludo em etanol), de acordo com o protocolo de eutansia estabelecido pela American Veterinary Medical Association (AVMA). Posteriormente, a nadadeira peitoral direita de cada espcime foi removida e fixada em um tubo eppendorf contendo lcool 95%. Cada amostra de tecido foi depositada na Coleo de Tecidos de Gentica Animal CTGA (Fiel Depositrio/CGEN) do Laboratrio de Evoluo e Gentica Animal (ICB / UFAM). Aps a retirada da nadadeira, cada indivduo foi etiquetado e fixado numa soluo de formol diluda a 10%, que depois foi substituda por uma soluo de lcool-etanol 70%.

50

Figura 10: Mapa com a distribuio dos pontos amostrados. As cores sinalizadas dentro de cada circunferncia indicam a ocorrncia de qual espcie na rea coletada. A figura de tringulo (vermelho) simboliza a cidade de Manaus, indicando um ponto de referncia. A distncia relativa entre os pontos amostrados, considerando o curso dos rios, est exposto no Anexo I.

2.2. Identificao Taxonmica

Para as comparaes morfomtricas entre os indivduos de cada espcie e para relacionar a identificao taxonmica, baseada em caracteres mersticos, com os dados morfomtricos obtidos, os espcimes coletados foram identificados com base na descrio taxonmica (abordada no item I, 5 da introduo geral) das espcies conhecidas para o gnero Pterophyllum, segundo Kullander (1986; 2003), resumida em: P. scalare: 7,5cm de comprimento padro (CP); 30-39 escamas ao longo da linha lateral; presena do entalhe prximo ao focinho; a mancha escura localizada na base da nadadeira dorsal menos aparente;

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P. altum: 6,5cm de comprimento padro (CP); 46-48 escamas ao longo da linha lateral; presena do entalhe prximo ao focinho; a mancha escura localizada na base da nadadeira dorsal aparente; corpo mais triangular; barras verticais mais amplas; P. leopoldi: 5,0cm comprimento padro (CP); 27-29 escamas ao longo da linha lateral; entalhe prximo ao focinho menos evidente; mancha escura na base da nadadeira dorsal bem evidente.

2.3. Mtodos Moleculares: Extrao de DNA, Amplificao, Seqenciamento e Anlises

Amostras de tecido foram retiradas da nadadeira peitoral e submetidas ao mtodo de extrao de DNA total (nuclear e mitocondrial) via proteinase K/ fenol/ clorofrmio desenvolvido por Sambrook et al. (1989) e descrito na seo 2 do material e mtodo (2.3. Mtodos Moleculares: Extrao de DNA, Amplificao e Seqenciamento) do captulo anterior, assim como os procedimentos de amplificao e seqenciamento do gene mitocondrial do citocromo b. Com estes dados foi gerada uma rvore de relacionamento de hapltipos de Mxima Verossimilhana, seguindo os critrios de analticos propostos na seo 2.4.2.a. do captulo 1, resultando na rvore filogentica representada pela figura 7. Neste captulo os dados moleculares filogenticos sero utilizados com o objetivo de relacionar os padres morfomtricos encontrados entre as espcies e as populaes das espcies caracterizao gentica. do gnero Pterophyllum e sua respectiva

52

2.4. Mtodos Morfomtricos

2.4. 1. Coleta de dados Morfomtricos

Cada exemplar fixado em formol e transferidos para o lcool 70% teve seu perfil esquerdo fotografado por uma cmera digital (Cnon EOS Rebel XT), em mxima resoluo, mantendo sempre a cmera na mesma distncia, em posio perpendicular e central ao exemplar, com zoom constante de 5.5 mm (zoom natural), utilizando somente o foco e a luminosidade como recurso fotogrfico. Foram escolhidos de 15 20 indivduos por localidade, totalizando 142 indivduos (Santa Isabel N=22; Barcelos N=18; Boa Vista N=16; Purus N=20; Iranduba N=9; Janauaca N=20; Santarm N=20; Careriro do Castanho N=17). Os espcimes que tiveram sua boca e oprculos fixados acidentalmente abertos foram descartados deste estudo.

2.4.2. Demarcao de pontos anatmicos e Obteno de dados morfomtricos

Em cada indivduo fotografado foram digitalizados pontos anatmicos referncias, num total de dezenove, utilizando o aplicativo tpsDig/2.10/2006 (Rohlf, 2006). Os pontos foram selecionados com base no critrio de homologia morfomtrica e pela maior capacidade de cobrir a extenso corporal (Sneath; Sokal, 1973), utilizando como referencial os esquemas de marcos anatmicos propostos por Klingenberg et al., 2003 e Parsons et al., 2003, sumarizado na figura abaixo (Figura 11). A obteno dos dados brutos de morfometria geomtrica foi efetuada, seguindo a metodologia de sobreposio dos marcos anatmicos GLS (Generalized Least Squares Procrustes Superimposition Supersobreposio dos Quadrados Mnimos de Procrustes), que utiliza como critrio de otimizao a soma mnima dos quadrados das distncias, ou distncia de Procrustes, entre os pontos homlogos (Rohlf; Slice, 1990; Rohlf; Marcus, 1993), retirando, consequentemente, da anlise morfomtrica os efeitos do tamanho, da localizao e da posio corporal (Bookstein, 1989; Monteiro; Gomes53

Jr, 2005). Dessa maneira, de cada espcime, fotografado e marcado com os pontos, calculado seu respectivo centro de configurao (mdia das coordenadas X e Y de cada ponto). Com isso, uma medida conhecida como centride calculada (raiz quadrada da soma dos quadrados das distncias entre todos os pontos da configurao e seu respectivo centro), sendo esta a nica medida de tamanho morfomtrico considerada, por ser desvinculada da forma (Zelditch et al, 2004). Feito isto, uma configurao de pontos foi selecionada ao acaso e, a partir desta, outras configuraes foram sobrepostas, passando por eventos de translao, rotao e escalonamento, tendo como base de referncia o centride (escalonado para o valor de 1 e centrado na origem 0,0) e os pontos homlogos de cada configurao, utilizando como mtodo de otimizao a soma mnima dos quadrados das distncias entre os pontos homlogos das configuraes. Ento uma configurao mdia calculada e o processo de sobreposio iniciado mais de uma vez at a configurao mdia resultante do ltimo ciclo de sobreposio no se diferencie da configurao mdia gerada do ciclo anterior (Rohlf; Slice 1990; Rohlf; Marcus 1993), sendo esta a configurao mdia chamada de consenso. Como conseqncia dos efeitos de translao, rotao e escalonamento as formas comparadas entre si assumem novas posies no espao (conhecida como espao de Kendall, ou espao forma), que ao serem projetadas em um espao tangente, foram traduzidas em novas coordenadas de (X, Y) de pontos. Estas coordenadas alinhadas foram, ento, projetadas num espao de deformao, gerando componentes de deformao parciais e uniformes, sendo estes as variveis utilizadas nas anlises (Monteiro et al., 2002; Zelditch. et al, 2004; Monteiro; Gomes-Jr, 2005). Estes componentes de deformao refletem as diferenas entre uma dada forma em relao a uma outra configurao de referncia (muitas vezes a forma consenso). Neste caso, a referncia utilizada foi o consenso de todas as configuraes gerado pela sobreposio dos marcos anatmicos GLS (Generalized Least Squares Procrustes Superimposition Supersobreposio dos Quadrados Mnimos de Procrustes). A utilizao dos componentes parciais e uniformes muito comum na literatura como meio de acesso as variaes estruturais da forma e como dados para anlises estatsticas multivariadas (Bookstein, 1991).

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A sobreposio de imagens foi efetuada no aplicativo tpsSuper/1.14/2004 (Rohlf, 2007) e os componentes de deformao uniformes e parciais foram obtidos pelo aplicativo tpsRelw/1.45/2007.

2.5. Anlises Estatsticas

Com as variveis geradas (dados da distncia de Procrustes transformados) pelo procedimento descrito acima (Supersobreposio dos Quadrados Mnimos de Procrustes) estavam correlacionadas, foi efetuado uma Anlise de Componentes Principais ACP (Principal Components Analysis - PCA) para produzir um menor nmero de variveis independentes. Os primeiros componentes gerados pela anlise, que compreendessem 50% da variao total morfolgica (Gauch, 1982, Simes et al.,2008) foram utilizados como variveis dependentes em uma anlise de varincia multivariada (MANOVA), para testar a significncia da variao morfolgica entre os grupos taxonmicos de cada indivduo e entre as localidades coletadas neste estudo expostas na seo 2.1 do material e mtodo neste captulo. A delimitao dos txons foi desenvolvida com base: 1) na identificao taxonmica (por meio dos caracteres mersticos descritos na seo 2.2 do material e mtodo deste captulo) e 2) na caracterizao molecular gentica (com base no perfil molecular do gene mitocondrial do citocromo b obtido no captulo 1), resultado de uma rvore de hapltipos de Mxima Verossilhana (MV) (Felsenstein, 1981) gerada no captulo anterior deste trabalho (Figura 7). Seis morfotipos includos no tiveram sua seqncia determinada e, portanto, no ocuparam posio na rvore de MV (Mxima Verossimilhana). Todas as anlises estatsticas foram realizadas atravs do programa computacional Systat/8.0 (Wilkinson, 1998). O critrio de escolha dos primeiros componentes principais que totalizem a soma de 50% de toda a variao encontrada tem como respaldo o fato de que os primeiros componentes principais contm a maior parte da informao de similaridade entre amostras, ao passo que componentes principais mais distantes tendem a reter variao relativa ao rudo do tratamento adotado (Gauch, 1982).

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Figura 11: Descrio esquemtica de pontos anatmicos. 1. Juno entre o pr-maxilar e o etmoidal; 2. Juno entre o lbio inferior e a mandbula; 3. Concavidade pr-dorsal; 4. Final da poro mandibular; 5. Margem anterior ocular; 6. Margem posterior ocular; 7. Margem inferior ocular; 8. Limite opercular; 9. Base superior da nadadeira peitoral; 10. Base inferior da nadadeira peitoral; 11. Base anterior da nadadeira plvica; 12. Base posterior da nadadeira plvica; 13. Base anterior da nadadeira anal; 14. Base posterior da nadadeira anal; 15. Base inferior da nadadeira caudal; 16. Base superior da

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3. Resultados

Do total de indivduos fixados (N=215), foram selecionadas, de acordo com as condies de fixao, 142 amostras (Santa Isabel N=22 3 P. scalare + 19 P. altum; Barcelos N=18 P. scalare; Boa Vista N=16 4 P. scalare + 12 P. altum; Purus N=20 P. scalare; Iranduba N=9 P. scalare; Janauaca N=20 P. scalare; Santarm N=20 P. scalare; Careiro do Castanho N=17 P. scalare), que ao serem fotografadas e analisadas, pela Supersobreposio dos Quadrados Mnimos de Procrustes, geraram, para cada configurao, 17 variveis morfomtricas (1 componente de deformao uniforme e 16 componentes de deformao parciais, projetadas nos eixos X e Y). No entanto, somente os 16 componentes de deformao parciais foram usados, porque representam variaes de deformao entre determinadas regies da forma corporal, enquanto que os componentes de deformao uniformes, embora informativos, refletem variaes morfomtricas na sua totalidade, num nico sentido e em eixos ortogonais, o que impossibilita a identificao de variaes morfolgicas regionais e dilu variaes morfomtricas localizadas. Esses componentes de deformao parciais, ao serem reduzidos de

dimensionalidade, resultaram em trinta e dois componentes principais, dos quais somente os cinco primeiros (CP1 = 22,97%; CP2 = 14,79%; CP3 = 10,12%; CP4 = 7,72%; CP5 = 5,34%) foram utilizados como variveis dependentes, porque explicaram maior parte da variao observada, num total de 60,9%. Alm disso, os eigenvalues resultantes em cada componente foram > 1,5 e possuem maior parte da explicao para a distribuio da variao morfomtrica encontrada, segundo o scree plot obtido neste modelo de ordenao em componentes principais. Algumas das variveis, nos quatro primeiros componentes, obtiveram maiores escores (valores de loadings > 0,600) do que outras, indicando que algumas das variveis morfomtricas tiveram maior contribuio na distribuio da variao morfolgica em cada componente (principalmente nos dois primeiros componentes), o que pode ser visto nos valores de loadings marcados de azul na tabela 7.

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No teste estatstico de MANOVA, com os cinco primeiros componentes principais como variveis dependentes, observou-se significncia entre a variao morfolgica e as diferentes localidades (Wilks' Lambda = 0,040; p < 0,001; 35 g.l., onde PC1, PC2, PC4 e PC5 com p < 0,001). Tambm foi encontrado resultado significativo com relao ao grupo haplotpico de cada indivduo, sua caracterizao taxonmica e a variao morfolgica encontrada (Wilks' Lambda = 0,194; p < 0,001; 10 g.l., onde PC1 com p < 0,001 e PC2 e PC4<0,05). A separao da distribuio morfomtrica dos indivduos em relao aos grupos de hapltipos, espcies e as diferentes localidades tambm foi evidenciada na representao grfica dos componentes 1 e 2, sendo marcante ao longo do componente principal 1 (CP1) a separao em relao espcie (P. scalare e P. altum) e ao grupo haplotpico (Ptero2 e Ptero3), concordando com a identificao taxonmica morfolgica e estrutura filogentica (do captulo 1) das espcies P. altum e P. scalare (Grfico 3). Alm disso, foi observado que a separao entre estas espcies e o grupo haplotpico est mais relacionada s variveis de maior peso neste componente: PW11_X; PW12_X; PW15_X; PW15_Y; PW16_X e PW16_Y, o que reflete diferenas pontuais entre o formato corporal dessas duas espcies (P. altum e P. scalare), resultando na significncia observada (Tabela 7). Ainda foi visto que 4 das 6 variveis morfomtricas com os maiores escores estiveram relacionadas variao da forma no eixo longitudinal (no eixo X) dos pontos, refletindo uma deformao maior nesse sentido entre os peixes analisados dos diferentes hapltipos e espcies (Tabela 7). J no componente principal 2 (CP2) ficou mais evidente a distino dos morfotipos organizada de acordo com as localidades (Grfico 4), sendo que a variao morfomtrica significativa observada entre as localidades teve maior contribuio das variveis PW5_X; PW5_Y e PW9_Y, possuindo os maiores loadings neste componente (Tabela 7), indicando maior variao latitudinal (no eixo Y) entre os peixes de localidades distintas. Ainda neste componente, foi observado que os espcimes de P. altum das localidades de Boa Vista e Santa Isabel mostraram pouca sobreposio na distribuio grfica deste componente, o mesmo ocorreu para P. scalare provenientes do rio Negro que mostraram uma separao grfica em comparao as demais localidades coletadas desta espcie (Grfico 3), o que ser discutido mais adiante. 58

Atravs da determinao morfomtrica foi possvel sugerir o grupo haplotpico dos seis indivduos, que no foram determinados no captulo 1 sendo, cinco indivduos da espcie P. altum (Ptero2) e um P. scalare (Ptero3), corroborando com a identificao taxonmica desses espcimes (Grfico 3). No foi possvel testar a separao morfomtrica de P. leopoldi dentro do grupo porque no se obteve espcimes coletados e fixados desta espcie para as anlises.
Tabela 7: Pesos das variveis morfomtricas sobre os cinco primeiros componentes da anlise de componentes principais. Os valores marcados de azul indicam os maiores loadings (>0,600) obtidos.
Varivel Morfomtrica PW1_X PW1_Y PW2_X PW2_Y PW3_X PW3_Y PW4_X PW4_Y PW5_X PW5_Y PW6_X PW6_Y PW7_X PW7_Y PW8_X PW8_Y PW9_X PW9_Y PW10_X PW10_Y PW11_X PW11_Y PW12_X PW12_Y PW13_X PW13_Y PW14_X PW14_Y PW15_X PW15_Y PW16_X PW16_Y Eigenvalues % da variao explicada CP1 0,316 0,386 0,290 0,414 0,105 0,542 -0,506 0,046 0,058 0,208 0,026 -0,535 0,353 -0,564 -0,105 0,095 -0,008 -0,270 -0,103 -0,412 0,645 0,355 -0,821 -0,553 0,561 -0,452 0,331 -0,673 -0,798 -0,847 -0,772 -0,826 7,353 22,97 CP2 -0,167 -0,320 0,596 0,402 0,010 0,344 0,210 0,495 -0,665 0,740 0,286 -0,070 -0,469 0,039 0,587 -0,356 0,238 -0,624 0,555 -0,204 -0,381 0,332 -0,153 -0,225 -0,172 -0,215 0,586 0,433 0,084 0,061 0,401 -0,081 4,735 14,79 CP3 0,763 0,547 -0,426 -0,295 -0,184 0,042 0,220 0,198 -0,556 -0,493 0,143 -0,117 -0,162 0,162 0,535 0,672 0,321 0,103 0,037 -0,014 0,179 0,448 -0,125 -0,315 0,102 0,186 0,037 0,152 0,062 0,187 0,135 -0,010 3,239 10,12 CP4 0,301 -0,008 -0,164 -0,142 0,411 0,378 0,354 0,202 0,139 -0,128 0,473 -0,538 0,083 -0,219 -0,299 0,159 -0,604 -0,238 0,317 0,315 -0,137 -0,505 -0,141 0,106 0,211 -0,174 0,106 0,191 -0,074 0,194 0,128 0,170 2,471 7,72 CP5 0,118 0,099 -0,02 -0,296 0,108 -0,228 -0,102 0,015 0,166 -0,018 0,538 0,181 0,057 0,084 0,107 -0,319 0,255 0,424 -0,108 0,182 -0,333 0,076 -0,092 0,152 0,225 -0,537 0,398 -0,083 0,210 0,025 -0,099 -0,233 1,711 5,3

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Grfico 3: Distribuio dos hapltipos ao longo dos dois primeiros componentes principais construdos com as variveis morfomtricas.

Grfico 4: Distribuio das localidades amostradas ao longo dos dois primeiros componentes principais construdos com as variveis morfomtricas.

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Considerando o padro de distribuio da variao morfomtrica encontrado ao longo da distribuio geogrfica do grupo P. scalare (Ptero3) (Grfico 3), foi aplicado, novamente, uma Anlise de Componentes Principias (ACP/PCA), para a reduo de dimensionalidade das variveis correlacionadas em um nmero menor de variveis independentes, utilizando somente as variveis morfomtricas dos indivduos do grupo P. scalare (Ptero3), considerando, tambm, o indivduo molecularmente no determinado, mas taxonomicamente P. scalare e agrupado morfometricamente neste grupo (Grfico 3). Como resultado observou-se que os cinco primeiros componentes principais explicaram 54,58% da variao morfolgica do grupo P. scalare (Ptero3) (CP1=19,56%; CP2=13,29%; CP3=9,05%; CP4=6,49%; CP5=6,16%) com eigenvalues > 1,9. No entanto, somente os quatro primeiros componentes foram responsveis pela maior parte da explicao para a distribuio da variao morfomtrica encontrada, enquanto que o quinto componente principal possuiu grande parte da variao observada relativa ao rudo do tratamento adotado, de acordo com o scree plot obtido neste modelo de ordenao em componentes principais. Por isso, s sero utilizados os quatro primeiros componentes principais para as anlises estatsticas multivariadas. Os quatro primeiros componentes principais (CP1, CP2, CP3 e CP4) apresentaram algumas variveis com valores de loadings maiores em relao aos demais (p > 0,600) (Tabela 8), o que est relacionado maior contribuio destas variveis morfomtricas para a distribuio morfomtrica em cada componente. Na organizao espacial morfomtrica do componente principal 1, foi notado que os indivduos da espcie P. scalare estavam distribudos graficamente em dois grandes grupos o quais foram chamados de negro: Barcelos (todos indivduos/N=18) + Santa Isabel (todos indivduos/N=3) + Boa Vista (N=3) + Careiro do Castanho (N=1), maioria do rio negro, e o outro branco: Santarm (todos indivduos/N=20) + Janauaca (todos indivduos/N=20) + Iranduba (todos indivduos/N=9) + Purus (todos indivduos/N=20) + Careiro do Castanho (N=16) + Boa Vista (N=1), grande parte relacionada calha dos rios Solimes-Amazonas (Grfico 5). Com estes grupos, separados seguindo a distribuio espacial no primeiro componente principal do grfico 5, como variveis independentes e os quatro primeiros componentes principais obtidos como variveis dependentes foi desenvolvido uma 61

MANOVA para testar a significncia da variao morfomtrica em relao distribuio das localidades de P. scalare nestes dois grupos (Ptero3). O resultado foi um F significativo (Wilks' Lambda = 0,262; p < 0,001; 4 g.l., onde PC1 com p < 0,001). Na representao grfica da distribuio morfolgica de P. scalare (Ptero3) nestes dois grupos, notou-se uma separao ao longo do eixo PC1, tendo como variveis de maior peso: PW5_X; PW10_X; PW11_X; PW14_Y; PW15_Y; PW16_X (Grfico 6), estando a variao morfomtrica mais relacionada ao eixo X (longitudinal) entre os peixes desses dois conjuntos geogrficos, contribuindo para a significncia observada na MANOVA.

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Tabela 8: Pesos das variveis morfomtricas sobre os cinco primeiros componentes da anlise de componentes principais na espcie P. scalare (grupo Ptero 3). Os valores marcados de azul indicam os maiores loadings (>0,600) obtidos.
Varivel Morfomtrica PW1_X PW1_Y PW2_X PW2_Y PW3_X PW3_Y PW4_X PW4_Y PW5_X PW5_Y PW6_X PW6_Y PW7_X PW7_Y PW8_X PW8_Y PW9_X PW9_Y PW10_X PW10_Y PW11_X PW11_Y PW12_X PW12_Y PW13_X PW13_Y PW14_X PW14_Y PW15_X PW15_Y PW16_X PW16_Y Eigenvalues % da variao explicada CP1 0,028 -0,383 0,348 0,118 0,09 0,209 0,564 0,549 -0,695 0,566 0,349 -0,043 -0,518 0,228 0,582 -0,158 -0,019 -0,556 0,659 0,114 -0,644 0,078 0,006 0,051 -0,296 -0,064 0,527 0,773 0,437 0,674 0,832 0,462 6,261 19,565 CP2 0,803 0,658 -0,428 -0,274 -0,202 0,141 0,070 0,159 -0,489 -0,603 0,159 -0,178 -0,119 0,192 0,552 0,723 0,512 0,086 -0,062 -0,156 0,195 0,674 -0,236 -0,498 0,230 0,200 0,086 0,056 0,214 0,109 0,027 -0,180 4,254 13,293 CP3 -0,096 -0,036 -0,240 -0,122 -0,337 -0,441 0,248 0,003 -0,254 -0,073 -0,499 0,385 0,051 -0,059 0,009 0,096 0,005 0,131 0,014 0,223 0,436 0,076 0,572 -0,107 -0,721 0,549 -0,425 0,044 -0,083 0,239 0,162 0,517 2,899 9,059 CP4 0,196 -0,045 -0,329 -0,151 -0,010 -0,383 0,131 0,134 0,127 -0,062 0,189 0,293 0,397 -0,201 -0,067 -0,166 0,257 0,464 -0,062 0,605 -0,290 0,016 -0,192 0,297 -0,092 -0,257 0,333 -0,116 0,511 0,161 -0,078 0,032 2,080 6,499 CP5 -0,097 -0,455 0,112 0,637 -0,216 -0,276 -0,101 0,03 -0,016 -0,139 -0,246 0,225 0,047 0,375 0,168 0,266 0,236 0,184 0,068 -0,366 -0,003 0,251 -0,320 0,541 0,175 0,162 -0,032 -0,011 0,157 -0,225 0,090 0,064 1,972 6,162

63

Grfico 5: Distribuio das localidades amostradas da espcie P. scalare (grupo Ptero 3) ao longo dos dois primeiros componentes principais construdos com as variveis morfomtricas.

Grfico 6: Distribuio das populaes amostradas da espcie P. scalare (grupo Ptero 3) ao longo dos dois primeiros componentes principais construdos com as variveis morfomtricas.

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4. Discusso e Concluso
Neste estudo observaram-se variaes morfomtricas significativas

relacionadas s espcies vlidas, ao grupo haplotpico e distribuio geogrfica, sugerindo que fatores taxonmicos, filogenticos, genticos e ambientais esto influenciando o perfil morfomtrico destes peixes. Klingenberg e colaboradores (2003) ao estudarem trs espcies de cicldeos do gnero Amphilophus em lagos prximos da Nicargua encontraram variao morfomtrica significativa entre as trs espcies estudadas, corroborando descries taxonmicas pr-existentes para o grupo. No entanto, Ready e colaboradores (2006) encontraram certa dificuladade para separar morfologicamente duas espcies descritas para o gnero Symphysodon (S. discus e S. aequifasciatus), conseguindo identificar morfologicamente somente a espcie S. tarzoo neste genro. Considerando a distribuio morfomtrica ao longo dos componentes principais foi possvel constatar que a maior parte da variao morfomtrica encontrada foi explicada por divergncia gentica entre as linhagens de P. scalare e P. altum, representando 22,97% da variao observada no componente principal 1, seguido pela variao morfolgica de acordo com a distribuio geogrfica coletada, explicando 14,5% da variao observada no componente principal 2 (Grficos 3 e 4), sendo que algumas das vriveis morfomtricas obtidas tiveram maior peso em relao s demais variveis, indicando que algumas regies do formato corporal entre os grupos analisados (de espcies e de locadidades amostradas) foram mais responsveis pela separao morfomtrica significativa observada (Tabela 7), mostrando que a variao morfolgica na direo do eixo X contribuiu mais para as varies entre as espcies e grupo haplotpico e as variaes no eixo Y tiveram maior peso para as diferenas significativas observadas entre os pontos coletados. Olhando separadamente a variao morfolgica resultante entre as localidades amostradas nas espcies de P. altum (Ptero2) (Grfico 4) e P. scalare (Ptero3) (Grficos 4 e 5), possvel sugerir a atuao de fatores ecolgicos locais mostrando um exemplo da capacidade adaptativa da famlia Cichlidae e da tribo Heroini (LoweMcConnell, 1969b; 1999; Kocher, 2004; Concheiro-Prez et al., 2007). 65

Outro fato, relacionado distribuio morfomtrica entre as localidades amostradas, est no comportamento de ocupao espacial ao longo do componente principal 2 das duas espcies (P. altum e P. scalare), que em simpatria (Santa Isabel e Boa Vista) esto dispostas espacialmente, neste componente, com pouca sobreposio entre os indivduos, quando comparado ao padro de distribuio espacial da espcie P. scalare nas demais regies, onde ocorre isoladamente. Alm disso, grande parte dos indivduos na espcie P. scalare das localidades coletadas na calha SolimesAmazonas estiveram graficamente dispostos mais prximos dos indivduos de P. altum, quando comparados com amostras simptricas de P. scalare coletados no rio negro (Grfico 4), indicando maior similaridade morfomtrica entre indivduos de espcies diferentes do que dentro de uma mesma espcie. Este padro de distribuio morfomtrica nas duas espcies pode ser decorrente da existencia de plasticidade fenotpica, uma vez que em simptria indivduos que apresentam nichos ecolgicos similares podem apresentar maior divergncia fenotpica quando comparadas em alopatria por conseqncia da competitividade entre si por recursos (Schluter, 2000; Adams et al., 2007). Nas populaes amostradas P. scalare foi observado maior variao morfomtrica intralocal do que entre localidades distintas, principalmente entre as regies do eixo Solimes Amazonas (Grfico 4 e 5). Ready et al (2006) observaram um padro parecido de variao morfolgica similar ao analisarem populaes de Symphysodon ao longo da bacia amaznica (principalmente entre o eixo SolimesAmazonas), sugerindo uma distribuio morfolgica populacional pouco relacionada s localidades amostradas, encontrando maior variao morfolgica dentro das

populaes consideradas no estudo. Dessa forma, a pequena variao morfolgica encontrada entre as localidades coletadas de Pterophyllum scalare, pode ser conseqncia da ampla distribuio geogrfica deste grupo, ao longo de grandes tributrios e canais principais que, juntamente com as florestas de inundao, podem estar garantindo um certo nvel de fluxo gnico entre regies (Tabela 4 do Captulo 1), mantendo a similaridade gentica (Tabela 6 do Captulo 1) e a menor variao morfolgica ao longo da rea estudada. Cantanhede e colaboradores (2005), estudando populaes de peixe boi da espcie Trichechus inunguis, mamfero com 66

distribuio ampla na bacia amaznica, encontraram relativo fluxo gnico e semelhana fenotpica entre as diferentes populaes do grupo, considerando-o como uma populao panmtica mantida pela disperso relacionada dinmica das plancies de inundao, o que tambm foi visto por Hrbek et al. (2005) em populaes de pirarucu (Araipama gigas). Outra hiptese, aqui sugerida, de nvel ecolgico e comportamental em que a ampla distribuio geogrfica e a menor sobreposio dos indivduos e das espcies, associadas abundante disponibilidade de recursos pode estar gerando uma distribuio morfolgica mais homogenia entre as localidades. No entanto, maiores esforos devem ser aplicados no desenvolvimento e na validao desta ltima hiptese. Um outro padro de distribuio morfomtrica pode ser sugerido ao olharmos para o grfico 5 e 6 com relao aos indivduos da espcie P. scalare (Ptero3) das localidades de Barcelos, Boa Vista e Santa Izabel, resultando em uma significativa separao morfolgica destes pontos em relao aos demais morfotipos das outras regies, ao longo do componente principal 1. Uma possvel explicao pode estar nas diferenas de origem e de composio qumica e fsica das guas dos principais afluentes (rios Negro, Solimes e Amazonas), onde estas localidades esto situadas, influenciando a diferenciao morfolgica, o reduzido fluxo gnico e a estrutura gentica populacional observados entre estas regies em relao as outras localidades (Grfico 5 e Tabela 4 do Captulo 1) (Sioli, 1984; Lowe-McConnell, 1991). Um fenmeno similar foi constatado na diferenciao gentica (Vasconcelos et al., 2006; Willis et al., 2007) e morfolgica (Willis et al., 2007) em outros grupos de animais distribudos ao longo dos principais tributrios da bacia amaznica, sendo considerado como um fator geolgico limitante para distribuio geogrfica das espcies e para o fluxo gnico populacional, promovendo oportunidades de diversificao (Willis et al., 2007). Por outro lado, a diferenciao morfolgica encontrada em P. scalare situado nesses dois tipos de gua pode estar relacionado ao reduzido fluxo gnico entre estas duas drenagens, originando um padro morfolgico distinto apenas pelo acumulo de diferenas morfomtricas por deriva gentica. Para verificar a existncia de relaes entre a variao morfolgica e as diferenas ambientais preciso localizar e definir a importncia ecolgica das diferenas morfolgicas encontradas, o que est previsto futuramente neste trabalho. 67

Numa viso conjunta de todo o contexto de distribuio morfolgica entre as localidades nota-se uma separao morfomtrica entre os indivduos da regio de Barcelos (Grficos 4 e 5) e as localidades restantes, apresentando um perfil de distribuio haplotpica semelhante quando comparada a rvore e a rede de hapltipos (Figura 7; Figura 9), gerados no captulo 1. Mesmo com o conhecimento da influncia de eventos geolgicos (como os arcos geolgicos Purus e Vaups) na modelagem do rio Negro (Lundberg, 1998), pouco se conhece sobre a existncia de alguma barreira geolgica significativa e especifica nesta regio. Alm disso, registros cientficos que descrevam padres morfolgicos e biogeogrficos semelhantes em outros grupos de animais so inexistentes. Porm no pode descartar a existncia de uma diferenciao morfolgica e gentica e que fatores ambientais histricos e/ou atuais estejam relacionados separao morfolgica e gentica observada, assumindo o papel de causa (primrio) ou de manuteno (secundrio) do resultado observado, levando-se em considerao a complexidade em se distinguir eventos ecolgicos primrios de secundrios (Coyne; Orr, 2004). Provavelmene essa diferenciao morfolgica pode ser resultante da maior influncia do rio Branco na regio de Barcelos e da diferenciao qumica na qualidade da gua antes e depois da confluncia do rio Branco com o Negro, como j foi sugerido no captulo 1, levando tanto a diferencio morfolgica, como gentica dos peixes nessa regio. Num contexto geral, a utilizao em conjunto de ferramentas moleculares e de morfometria geomtrica pode ser de grande valia em estudos evolutivos, principalmente em organismos que apresentam alta variabilidade morfolgica e difierentes morfotipos, como o caso dos peixes do gnero Pterophyllum. Apesar da existncia de diferentes morfotipos em P. scalare, foi possvel separar morfometricamente duas espcies de Pterophyllum (P. altum e P. scalare), concordando com a identificao taxonmica e a estrutura filogentica molecular de P. scalare (Ptero3) e P. altum (Ptero2) observada no primeiro captulo. Alm disso, o perfil de variao e determinao morfolgica encontrados nos nas duas espcies de Pterophyllum estudadas composto por fatores tanto ambientais (extrnsecos) quanto genticos (intrnsecos), existindo variao morfolgica

intraespecfica, condicionadas pelo fluxo gnico (migrao), pela dinmica das plancies 68

de inundao, pela composio das guas, por adaptaes morfolgicas ambientais e pela existncia de plasticidade fenotpica nestes peixes, refletindo variaes morfomtricas em determidadas regies da forma destes peixes. No entanto, para verificar a existncia de relaes entre a variao morfolgica e as diferenas ambientais preciso localizar e definir a importncia ecolgica das diferenas morfolgicas encontradas.

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II. Concluso Geral

Mesmo existindo na literatura evidncias de diferentes mortipos e sobreposio de alguns caracteres mersticos no gnero Pterophyllum, neste trabalho foi possvel delimitar de maneira molecular e morfolgica as espcies existentes no gnero Pterophyllum (P. scalare, P. altum e P. leopoldi) e a estrutura taxonmica observada no primeiro captulo tambm pode ser vista nos resultados morfomtricos do captulo dois, exceto para a determinao morfomtrica de P. leopoldi. Particularmente na espcie Pterophyllum scalare, observou-se uma complexa histria filogeogrfica, modelada por processos antigos e incertos de fragmentao, seguidos por episdios de expanso geogrfica, juntamente com eventos de fluxo gnico e isolamento influenciados pela ampla distribuio da espcie. No entanto, no foi encontrado alguma relao entre a distncia geogrfica e a diferenciao gentica e morfolgica ao longo da rea amostrada, mesmo sendo um grupo muito distribudo pela bacia amaznica, possuir comportamento territorialista e baixa mobilidade associada aos ambientes lenticos. Os ndices de fluxo gnico e a homogeniedade morfolgica observados nas comparaoes das reas coletadas, principalmente, no eixo Solimes-Amazonas, esto possivelmente relacionados ao sistema das plancies de inundao, que durante a cheia, oferecem intercomunio entre populaes, mesmo distantes entre si, acarretando numa maior variabilidade gentica e morfolgica intrapopulacional do que entre populaes. A homogeineidade morfolgica na espcie P. scalare observada em toda exteno coletada da drenagem Solimes-Amazonas, tambm, pode ter explicaes ecolgicas decorrentes da disponibilidade de recursos e inexistncia de espcies simptricas, ao contrrio do que visto nas regies de simpatria entre P. scalare e P. altum, sugerindo a existncia de plasticidade fenotpica em P. scalare e que o padro morfomtrico encontrado nas regies coletadas de P. altum pode estar sendo influenciado pela existncia de P. scalare nas regies de Sante Isabel e Boa Vista. As diferenas qumicas e fsicas das guas se caracterizaram como um fator limitante para migrao entre as localidades estudadas de Pterophyllum scalare, resultando numa estrutura populacional entre essas guas, que, tambm, modelaram uma diferenciao morfolgica entre os distintos tipos de guas, sendo considerado, 70

por outros trabalhos, como um fator geolgico limitante para distribuio geogrfica das espcies e para o fluxo gnico, promovendo oportunidades de diversificao. O padro diferenciado molecular e morfolgico de Pterophyllum scalare da regio de Barcelos em relao as demais localidades pode ser decorrente da influncia da drenagem do rio Branco nesta regio e pelas diferenas qumicas existentes antes e depois da confluncia deste rio com o Negro, porm maiores esforos devem ser aplicados para a validao desta hiptese. No entanto, embora se tenha observado morfometricamente diferenciao significativa relacionada variao geogrfica que foram associadas s propriedades qumicas e fsicas das guas e mesmo encontrando maior contribuio de algumas regies morfolgicas nos padres morfomtricos resultantes, preciso associar as diferenas morfomtricas obtidas importncia ecolgica entre as diferentes localidades e ambientes para que se tenha entendimento do valor adaptativo e evolutivo, uma vez que as diferenas morfomtricas encontradas podem ser meramente resultado de acmulo por deriva gentica. Neste trabalho o marcador molecular do citocromo b mostrou-se um bom marcador molecular, sendo eficaz em estudos filogenticos e de taxonomia molecular, concordando com identificao taxonmica efetuada e o perfil morfomtrico obtido dos espcimes coletados. A anlise combinada entre morfometria geomtrica e gentica molecular pode ser de grande valia na determinao de eventos evolutivos, dando maior suporte as inferncias evolutivas aqui trabalhadas.

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ANEXOS
ANEXO I DISTNCIA GEOGRFICA ENTRE LOCALIDADE
Indica-se, neste anexo, a distncias (em Km) entre as localidades amostradas, de acordo com o curso do rio, por meio do programa GoogleEarth.
Localidades 1. Campina 2. Catalo 3. Purus 4. Novo Airo 5. Aman 6. Janauac 7. Santa Isabel 8. Boa Vista 9. Mamirau 10. Santarm 11. Careiro do Castanho 12. Iranduba 13. Barcelos 14. Careiro da Vrzea 1 **** 622 244 742 112 557 1.357 1.382 39 1.342 675 573 1.060 628 2 **** 377 200 734 64 741 759 660 743 114 61 438 38 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

**** 497 689 347 1.111 1.134 622 1.097 430 326 811 384

**** 854 185 621 639 781 863 249 181 318 157

**** 692 1.467 1.490 96 1.454 787 669 1.167 740

**** 797 820 630 784 75 36 521 71

**** 30 1.394 1.479 864 797 303 773

**** 1.417 1.503 888 818 321 797

**** 1.381 713 610 1.094 667

**** 786 781 1.181 716

**** 111 567 121

**** 494 68

**** 476

****

89

ANEXO II
Indica-se, neste anexo, as distribuio haplotpica das espcies P.altum e P.scalare no network do NCA (Nested Clade Analysis) (Figuras 8 e 9) .

Network : Pterophyllum altum

Campina Catalo Purus Novo Aman Janauac Santa Airo Isabel Hapltipos N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL 1 5 1 1 2 4 3 1 5 0 0 0 0 0 0 1 14 10 0 0 0 0 0 Boa Mamirau Santarm Careiro do Castanho Iranduba Barcelos Vista

90

Network : Pterophyllum scalare

Campina Hapltipos N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Catalo Purus Novo Airo Aman Janauac Santa Boa Vista Mamirau Santarm Careiro do Iranduba Barcelos Isabel Castanho

3 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 4 2 4 1 1 1 14 2 28 10 4 2 4 1

1 1

91

Continuao
Campina Catalo Purus Novo Airo Aman Janauac Santa Boa Vista Mamirau Santarm Careiro do Iranduba Barcelos Isabel Castanho

Hapltipo N 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

3 1 1

1 1

1 1 1 1 4 2 1 1 2 1 4 4 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 4 1 2 1 2

1 1 1 1 1 1 6

92

Continuao
Campina Hapltipo N 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 TOTAL Catalo Purus Novo Airo Aman Janauac Santa Boa Vista Mamirau Santarm Careiro do Iranduba Barcelos Isabel Castanho 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 2 1 1 1 12 3 1 2 25 22 4 8 18 13 3 1 30 42 19 12 17 2

93

94

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