ELETROFORESE A eletroforese uma tcnica baseada na separao de partculas, que ocorre quando as mesmas so dissolvidas ou suspensas em um eletrlito, atravs

s do qual uma corrente eltrica aplicada. tambm usada na identificao de substncias, no estudo de homogeneidade de sistemas biolgicos e na determinao de pontos isoeltricos. Esta tcnica consiste na migrao de molculas ionizadas, em soluo, de acordo com suas cargas eltricas e pesos moleculares em campo eltrico. Molculas com carga negativa migram para o plo positivo (nodo) e molculas com carga positiva migram para o plo negativo (ctodo). Arne Tiselus desenvolveu a eletroforese livre, para o estudo de protenas em soro (atravs do qual ganhou o Premio Nobel em 1948), um tipo de eletroforese em que as substncias a serem separadas esto em soluo ou suspenso, e que no emprega suporte. Este mtodo de soluo livre era bastante limitado devido a essas solues estarem sujeitas a uma srie de influncias fsicas do ambiente que lhes causam perturbaes, tais como ondas mecnicas e at mesmo movimentos de conveco do lquido pelo aquecimento da soluo causado pela aplicao da diferena de potencial. Estas perturbaes fazem com que a eletroforese, nessas condies, seja um processo muito pouco reprodutvel, com as cargas de mesma natureza no migrando juntas, mas sim, dispersas. Para contornar esses problemas, desenvolveram-se sistemas em que tais perturbaes eletroforese so minimizadas. Esses sistemas utilizam matrizes rgidas - conhecidas como suportes - com as quais a soluo interage e que diminuem as perturbaes mecnicas e os movimentos de conveco no lquido. Existem diferentes meios-suporte, tais como papel de filtro, slica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. A eletroforese que utiliza suporte tambm conhecida como eletroforese de zona, e foi iniciada por Knig em 1937 (mesmo perodo em que a eletroforese livre era descrita por Tiselius) na separao de veneno de cobra recorrendo a papel de filtro como meiosuporte, mas s mais tarde, em 1946, foi retomada por Martin e colaboradores. Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das macromolculas, podemos separ-las mais com base na carga ou mais com base em seu tamanho. Os suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as molculas com base no tamanho molar (sendo praticamente o nico tipo de suporte para eletroforese utilizado para a separao de fragmentos de cidos nuclicos). J a eletroforese em suporte de papel muito eficiente no que diz respeito a separao de partculas com grande diferenas de cargas, como por exemplo a separao de protenas que, devido variada composio de seus aminocidos, apresentam grandes diferenas na carga total.

Em razo de algumas partculas serem substncias anfteras, ou seja, capazes de adquirirem carga positiva ou negativa em funo do pH, indispensvel manter constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo uso de solues-tampo. Os principais tipos de eletroforese so: Eletroforese em gel Eletroforese capilar 1. ELETROFORESE EM GEL uma tcnica de separao de molculas onde as partculas que so carregadas negativamente por um composto denominado SDS (detergente dodecil sulfato de sdio), com exceo do DNA que j possui um carter de ction, migram em um determinado gel durante a aplicao de uma diferena de potencial em direo a um eletrodo positivo, sendo que este criado por uma corrente eltrica, e posteriormente so aplicadas sobre o gel. Para a separao das molculas nesta tcnica, temos que levar em considerao o tamanho da molcula, sendo que as de menor massa migram mais rapidamente do que as de maior, pois possuem mais agilidade de mobilidade. Em alguns casos o formato da molcula tambm influencia, pois dependendo do formato as mesmas tero mais facilidade de migrar pelo gel. importante ressaltar que a eletroforese utilizada normalmente para a separao de protenas e molculas de DNA e RNA. 1.1 SUBDIVISES DA ELETROFORESE EM GEL: 1.1.1 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE A agarose um polissacardeo composto por agar e pectina. Para preparar este gel, simplesmente faz-se a mistura entre o p de agarose e soluo tampo. Aps fundir, coloca-se brometo de etidium, que tem ampla afinidade pelo DNA, e revela sobre presena de UV(ultra violeta) os cidos nuclicos. Quando a mistura esfriar o gel estar duro. Esse endurecimento feito em um local apropriado, o mesmo local onde ser feita a corrida da amostra. Um detalhe importante a colocao do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria poos que sero utilizados para a colocao das amostras. Podemos ver este processo como uma corrida. Cada um colocado numa pista e na presena de uma corrente eltrica vai deixando o seu rasto. So estes rastos que sero comparados no mtodo. O gel de agarose e usado pois tem uma maior extenso de separao para fragmentos longos de DNA( identifica os cidos nuclicos presente neste). O tamanho e a conformao da molcula de DNA, a concentrao do gel de agarose , a corrente eltrica aplicada e tipo de tampo usado influenciam a velocidade da partcula no gel. 1.1.2 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

A poliacrilamida uma mistura de dois polmeros, acrilamida e bisacrilamida. Para preparar este gel, basta adicionar os dois polmeros nas concentraes desejadas em um suporte de vidro e na presena de um catalisador. Esta tcnica utilizada, pois o gel poliacrilamida tem a capacidade de separar fragmentos muito pequenos de DNA e que apresentam uma mnima diferena de massa, alm disso o gel pode recuperar e purificar determinada amostra. Apesar das vantagens, o gel de agarose mais utilizado pois a poliacrilamida muito txica e difcil de ser preparada. Neste tipo de gel a corrida feita em cubas verticais, e o carante utilizado o mesmo da eletroforese em gel de agarose. Existem dois tipos de gel de poliacrilamida: Desnaturante: separa e purifica fitas simples de DNA, e convenciona desnaturante pois e polimerizado pela uria. No desnaturante: separa e purifica fitas duplas de DNA. 2. ELETROFORESE CAPILAR

A eletroforese definida como o transporte, em soluo eletroltica, de compostos carregados eletricamente sob a influncia de um campo eltrico, no qual a separao entre dois solutos ocorre de acordo com diferenas entre suas mobilidades eletroforticas. Esta tcnica que foi introduzida em 1981, por Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita cada vez mais, como um importante mtodo analtico. Em sua forma mais simples a eletroforese capilar uma aproximao da tcnica original, descrita por Tiselius para o estudo de protenas em soro, porm emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletrlito, tendo como principal vantagem o uso de capilares com dimetros internos extremamente pequenos (na faixa de 15-100? m) permite uma melhor dissipao do calor e, assim, possvel obter uma alta eficincia de separao com tempo reduzido de anlise. A eletroforese capilar uma tcnica aplicvel na determinao de uma grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos aromticos, vitaminas hidrossolveis e lipossolveis, amino cidos, ons inorgnicos, cidos orgnicos, frmacos, catecolaminas, substncias quirais, protenas, peptdeos e muitos outros. Uma caracterstica que difere a eletroforese capilar das demais tcnicas a sua capacidade nica para separar macromolculas carregadas eletricamente de interesse tanto em indstrias de biotecnologia quanto em pesquisas biolgicas. Um exemplo disso o projeto Genoma Humano, que foi concludo recentemente, que teve como meta obter a seqncia completa do DNA humano e para isso foi necessrio distinguir os diversos polinucleotdeos, com massas molares, por volta de 200 a 500 Daltons que diferiam entre si por um nico nucleotdeo. Somente a eletroforese capilar tem resoluo suficiente para este tipo de separao.

Alm disso, o DNA humano contm cerca de trs bilhes de nucleotdeos e as altas velocidades de anlises, obtido pela eletroforese capilar, permitiram que milhares de nucleotdeos fossem seqenciados em um nico dia. 2.1 ELETROFORESE CAPILAR EM ZONA OU SOLUO LIVRE A separao de ons a forma mais simples de eletroforese capilar e denominada eletroforese capilar em soluo livre ou em zona. Muitos compostos podem ser separados rapidamente e facilmente por esta tcnica, pois a separao em nesta tcnica baseada nas diferenas nas mobilidades eletroforticas resultantes das diferentes velocidades de migraes de espcies inicas no tampo, contido dentro do capilar. Como Funciona est tcnica: O capilar preenchido com uma soluo tampo de composio constante, a qual est presente tanto no nodo como no ctodo. Em uma amostra tem-se uma mistura de espcies carregadas eletricamente e espcies neutras, onde os ons, apresentam tamanhos e cargas diferentes. A amostra introduzida na extremidade andica (nodo) do tubo e, ao ser aplicada uma diferena de potencial entre as extremidades da coluna, os ons migram atravs do tubo com diferentes velocidades e em diferentes sentidos. A velocidade e o sentido de migrao dependem do tamanho e da magnitude de carga de cada on. Deve ser ressaltado que as espcies neutras no sofrem influncia do campo eltrico e por isso migram conjuntamente. Na eletroforese capilar de zona, alm dos solutos, a soluo tampo, normalmente, move-se atravs do capilar sob o efeito de um campo eltrico (Este fenmeno denominado fluxo eletroosmtico ou eletro-endosmtico). Durante uma operao convencional, o fluxo eletroosmtico origina-se no nodo e dirige-se ao ctodo devido formao de uma dupla camada inica que ocorre na interface entre o capilar de slica fundida e a soluo nele contida. Os grupos silanis presentes na superfcie do capilar so cidos fracos que se ionizam a partir de pH 3-4 (estando totalmente ionizados em meio alcalino), criando uma superfcie carregada negativamente. Esta camada negativa na superfcie atrai para sua proximidade as espcies carregadas positivamente da soluo, formando uma camada positiva, a qual ser mobilizada pela presena do campo eltrico. A atrao dessa camada pelo ctodo arrasta a soluo do interior da coluna, criando assim um fluxo com perfil reto, em contraste com o perfil parablico que criado em sistemas pressurizados. O fluxo eletroosmtico proporciona duas grandes vantagens, sendo que a primeira delas que ctions e nions podem ser separados numa nica anlise, e a outra vantagem que mesmo os ons com razes carga/raio muito diferentes podem ser analisados em um tempo relativamente curto devido magnitude este fluxo. O pH da soluo tampo um dos parmetros que afeta fortemente a separao em eletroforese capilar em zona, pois este parmetro afeta tanto o fluxo eletroosmtico, quanto a mobilidade eletrofortica dos analitos. Isto, tendo em vista medida que o pH elevado tem-se um aumento do fluxo eletroosmtico, pois ocorre um aumento da

dissociao dos grupos Si-OH que se encontram nas paredes internas do capilar. O fluxo eletroosmtico tambm afetado pela concentrao do tampo e pela fora inica mas, sobretudo, pelo pH. No que se refere ao controle da seletividade da separao dos analitos, a variao do pH afeta o grau de ionizao dos analitos e, portanto, suas mobilidades eletroforticas. Normalmente, o tampo escolhido para promover a melhor separao entre os analitos e no necessariamente a velocidade eletroosmtica mais adequada. A anlise qualitativa feita atravs da comparao dos tempos de migrao dos padres com os tempos de migrao das substncias presentes na amostra e/ou atravs de espectros de UV/Vis (detector por arranjo de diodos) ou do espectro de massas (detector espectrmetro de massas). A quantificao das substncias, com concentraes desconhecidas, presentes na amostra, feita atravs do procedimento usual de calibrao: 1. Injeo de solues dos padres de concentraes conhecidas 2. Obteno das respostas do detector para cada composto, em funo da altura, rea ou rea dividida pelo tempo de migrao 3. Construo da curva analtica (resposta do detector versus concentrao) 4. Injeo das amostras 5. Obteno das respostas do detector para as amostras 6. Quantificao das substncias atravs das curvas analticas. 2.2 ELETROFORESE CAPILAR EM GEL A separao de biomolculas grandes, tais como DNA, por ECSL, s vezes muito difcil de se obter devido similaridade nas razes massa/carga. Assim ECSL muitas vezes no suficiente para separar estes tipos de substncias. Uma alternativa preencher o capilar com um gel, onde o principal mecanismo de separao est baseado nas diferenas nos tamanhos dos solutos que migram atravs dos poros do polmero. Esta tcnica denominada eletroforese capilar em gel. ons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores ficam mais tempo retidos. Alm disso, o gel serve como um meio anticonvectivo, minimizando a difuso dos solutos. Ele tambm previne a adsoro do soluto nas paredes do capilar e ajuda a eliminar a eletroosmose. A implementao da tecnologia para fabricao de capilares preenchidos com gel confrontou-se com vrios problemas. Primeiramente, ocorria o fenmeno de encolhimento do polmero durante o processo de fabricao no interior do capilar, o que gerava rupturas na estrutura final do gel. Estas rupturas estruturais formavam bolhas de ar, que eventualmente causavam interrupo da corrente eltrica durante a eletroforese. Outro aspecto relacionava-se com o uso de altas voltagens. Nestas condies, o fluxo eletroosmtico era suficientemente forte para arrastar o gel para fora do capilar. Por este motivo, o uso de agarose na fabricao de capilares foi logo descartado, porque alm do

baixo ponto de fuso, agarose contm grupos ionizveis, capazes de gerar fluxo eletroosmtico. Em 1987, B. L. Karger e A. S. Cohen apresentaram solues para ambos os problemas, descrevendo, a fabricao detalhada de capilares preenchidos com gis fisicos. O mtodo de Karger e Cohen consiste num pr-tratamento do capilar com o reagente de dupla finalidade: eliminar o fluxo eletroosmtico atravs de uma ligao covalente com os grupos da superfcie capilar e evitar a extruso do gel durante operao do sistema, atravs da ligao covalente com o gel a ser formado na etapa seguinte. O capilar ento preenchido com uma soluo tamponada e com catalisador. As extremidades do capilar so imersas em soluo tampo e a polimerizao do gel ocorre, aps algumas horas. Uma das principais vantagens de realizar separaes eletroforticas em um capilar que o seu formato possibilita a dissipao eficiente do calor gerado pelo efeito Joule. Em CGE, esta vantagem duplamente verificada, em razo da geometria do capilar e das propriedades anti-convectivas do gel. 2.2.1 ELETROFORESE DE CIDOS NUCLICOS Por meio dessa tcnica possvel separar molculas em funo da sua massa (tamanho), forma e compactao. Trata-se de uma tcnica rpida, sensvel e precisa. A molcula em questo, por exemplo o DNA, migra em suportes (gis de agarose ou acrilamida) por ao de uma corrente eltrica, com diferentes velocidades, dependendo do seu tamanho e forma. Quando submetido a um campo eltrico, as molculas de DNA migram para o plo positivo, pois so carregadas negativamente, e como fora oposta migrao existe o atrito com o suporte (gel). Quanto maior a molcula, maior o atrito e mais lenta a migrao; portanto, molculas de tamanhos diferentes tero migrado uma distncia diferente depois de algum tempo. A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. O DNA pode ser visualizado na presena de compostos intercalantes, sendo que o mais utilizado o brometo de etdio. Em presena desse composto, o DNA emite fluorescncia por exposio luz UV e, assim, molculas de um mesmo tamanho so visualizadas em um mesmo ponto do gel, formando uma faixa fluorescente. Se na amostra submetida corrente eltrica existir mais de um tamanho de molcula, estas sero separadas na migrao e, ento, sero visveis bandas em diferentes localizaes do gel. Basicamente, duas matrizes slidas so utilizadas atualmente para eletroforese: gis de agarose e gis de acrilamida. A escolha do tipo de gel depende do tamanho do fragmento e da diferena de tamanho de diferentes fragmentos de DNA que se quer visualizar. As duas substncias formam tramas de poros de tamanhos variveis, possibilitando a separao dos fragmentos, que ter sua eficincia dependente da concentrao do polmero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicadas.

Em qualquer um dos casos, estas substncias so dissolvidas numa soluo-tampo eletroltica, obrigatoriamente a mesma que recobrir o gel na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente eltrica (Tampo de Corrida). Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris- Acetato EDTA). Quanto aplicao das amostras no gel, importante ressaltar que antes disso, elas so misturadas a outra soluo (Tampo de amostra), que tem como funo aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampo de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema. Alm disso, o tampo de amostra possui um corante que possibilita a visualizao do andamento da corrida. Apesar de sua versatilidade e relativo baixo nvel de dificuldade de realizao, a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho e no quanto seqncia. CONCLUSO Ao trmino deste trabalho de pesquisa conclumos que a eletroforese um processo analtico de separao de misturas, cujo principal agente o campo eltrico. Essa tcnica passou por evolues, com a introduo de um suporte como papel de filtro, slica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. Atualmente o campo de aplicao da eletroforese tem sido amplamente difundido, devido simplificao de aparelhagem utilizada e tambm disponibilidade de meios de suporte altamente purificados, o que veio diminuir em muito o tempo gasto na separao. As principais tcnicas de eletroforese so: eletroforese em gel, eletroforese capilar e capilar em gel. A tcnica de eletroforese capilar possui uma srie de vantagens, tais como a rapidez, versatilidade, um baixo custo por anlise, alto poder se separao (resoluo) e um consumo mnimo de amostras, reagentes e solventes. Alm disso, oferece a possibilidade de automao e deteco on-line. Entretanto esta tcnica oferece algumas limitaes, pois no adequada para a determinao de compostos volteis, no-polares e de massa molar baixa, os quais so melhores determinados por cromatografia gasosa. Tambm no muito adequada para a anlise de polmeros no inicos de massa molar alta e no to sensvel quanto a cromatografia lquida de alta eficincia. A eletroforese de grande importncia para as cincias, permitindo a separao e identificao de molculas de DNA por meio da diferena de velocidade de migrao, identificao de pessoas em testes de paternidade pela comparao de DNA, na indstria farmacutica e at mesmo na agropecuria. Aline Marin Brbara Gomes Bruna Girardi

Ethiane Mezadri Fonte: w3.ufsm.br

Eletroforese

Eletroforese definida como migrao de partculas sob influncia de um campo eltrico. O princpio fsico da eletroforese bastante simples: partculas com carga eltrica so aceleradas quando colocadas em um campo eltrico; essa fora de propulso rapidamente balanceada pela fora de frico do meio, nesse momento as partculas movem-se uma velocidade constante, proporcional corrente eltrica. Quando uma molcula se move em um campo eltrico, a taxa de migrao e a direo da migrao dependem do nmero de cargas e do sinal da carga (+ ou -). Se a molcula tem carga positiva, ela vai se mover para o polo negativo e vice-versa. Em gis como o de poliacrilamida, o meio funciona como uma peneira, retardando preferencialmente as molculas grandes, fazendo com que sejam separadas pelo seu tamanho. Em gentica, a eletroforese utilizada para detectar a variabilidade em enzimas, protenas, DNA e RNA. Fonte: people.ufpr.br