Variabilidade na induo de microncleos aplicado a vrias espcies de peixes

com

agentes

mutagnicos

diferentes

Abstract: Os peixes so muitas vezes utilizados para a genotoxicidade triagem de gua. Para esses programas, um conhecimento da sensibilidade clastogens, espontneo microncleo frequncia e a cintica do ciclo celular do tecido-alvo necessria. Para investigar o padro de sensibilidade interespecfica para induo de microncleos trs espcies de peixe, Tilapia rendalli, Oreochromis niloticus e Cyprinus carpio, foram expostos ao clastogens bleomicina (BLM), ciclofosfamida (CP), 5-fluorouracil (5-FU) e a mitomicina C (MMC). O binucleados / mononucleadas proporo em eritrcitos com citocalasina B tambm foi utilizado para avaliar a resposta dependente do tempo de microncleo formao durante hematopoese no rim e no pico de microncleos em eritrcitos perifricos. Freqncias de microncleos induzidos por CP foram significativamente maiores do que os seus respectivos controlos para as trs espcies de peixes em todos os perodos de tratamento. Durante o todo perodo de avaliao (30 dias) CP foi tambm o agente clastognico mais eficaz. Em geral, at o dia 14 de avaliao do perodo T.rendalii foi a espcie mais sensveis a clastogens. No h diferena nas frequncias de microncleos entre as espcies foi observado no Avaliao quarto (no dia 30). Um pico de microncleos foi observada no dia 7 aps o tratamento. Aps o dia 14 as freqncias foram estabilizados. O experimento citocalasina B foi realizada para demonstrar que microncleos de eritrcitos induzida no rim jovem as clulas foram detectados no sangue circulante de 2-4 dias mais tarde. Introduo Um crescente interesse na genotoxicidade ambiental causado por poluentes tem levado ao desenvolvimento de vrios biolgica ensaios para a deteco e identificao de genotxicos o ar, gua e solo.Os peixes fornecem um modelo adequado para genotoxicidade aqutica e monitoramento de qualidade de guas residuais, porque da sua capacidade para metabolizar a xenobiticos e acumular poluentes. Um ensaio de microncleo tem sido utilizado com sucesso em vrias espcies (De Flora et al, 1993; Al-Sabti. e Metcalfe, 1995; Minissi et al, 1996). Desenvolvimento de um programa de monitoramento de peixes requer conhecimento da cintica da vida dos eritrcitos ciclo e de induo de microncleos. A freqncia de espontnea e induzida a formao de microncleos mais tempo tem de ser determinado, a fim de confirmar a utilidade das espcies para este ensaio. Em peixes sseos, o local hematopoitico principal o rim cabea, no entanto eritrcitos, ensaios de microncleos do sangue perifrico tem foi eleito por diferentes autores como o principal desfecho (Kligerman et al, 1975;. Hooftman e De Raat, 1982). Ns investigamos as sensibilidades intra e inter-especfica de trs espcies de peixe, Tilapia rendalli, Oreochromis niloticus e Cyprinus carpio, de microncleos exposio de induo, seguindo para a bleomicina clastogens (BLM), ciclofosfamida (CP), 5-fluorouracil (5-FU) e mitomicina C (MMC). A cintica do eritrcito ciclos celulares tambm foram estudadas na presena de citocalasina-B (Cyto-B). Material e metodos Tratamentos de peixes e teste de microncleo A qualidade da gua do Lago Parano continuamente monitorado pela empresa de tratamento de gua local, e inclui medio dos nveis de oxignio, azoto, fsforo e clorofila-a, para avaliar o grau de eutrofizao. No h indstrias qumicas ou agrcola campos ao redor do lago, um eutrficos artificial reservatrio tropical. Amostras das trs espcies de peixes foram pegos nos mesmos locais e foram aclimatizadas em laboratrio durante 10 dias em 500 l-tanques de dechlorinated gua da torneira aerada continuamente, a 20 2 C e pH = 7,0. Amostras de sangue perifrico foram obtidas a partir da brnquias e imediatamente manchada. Aps a secagem durante

24 horas a temperatura ambiente, os esfregaos foram fixados em metanol durante 15 minutos e coradas com Giemsa. trs mileritrcitos foram examinadas por peixe em lminas codificadas. As amostras de sangue de controlo foram obtidos antes de cada tratamento e 2, 7, 14 e 30 dias aps uma nica intra-abdominal injeo do mutagnico. A dose mxima tolerada para cada espcie, foi determinada em experincias preliminares. Em outra srie de experimentos, amostras de sangue foram coletados do mesmo peixe a 0, 2, 5, 8, 12 e 15 dias aps uma nica injeco de citocalasina B (50 ug / kg peso do corpo, peso corporal). Para cada perodo de tratamento, cinco mil eritrcitos foram marcados para determinar a binucleado/relao mononucleada. BLM (12,5 mg / kg de peso corporal) so antibiticos glicopeptdeos isolado a partir de Streptomyces verticillus e so rotineiramente utilizado na quimioterapia do cncer. Estes compostos exercem o seu efeito genotxico, causando dano oxidativo ao DNA, que por sua vez conduz a mutaes genticas, as aberraes cromossmicas e aneuploidia (Vig e Lewis, 1978; Povirk e Austin, 1991). CP (Enduxan, 20 mg / kg de peso corporal) tem sido amplamente utilizado como um controlo positivo devido sua actividade de alquilao. CP em si no genotxica mas sofre activao metablica complexa por oxidases de funo mista que resulta em metablitos genotxicos (Colvin e Chabner, 1990). 5-FU (Roche, 2,5 mg / kg de peso corporal), uma droga antineoplsica que age como um antagonista de pirimidina, interfere com a sntese de nucletidos de pirimidina-e incorporada no ARN. 5-FU actua directamente ou indirectamente sobre as enzimas nas etapas iniciais da sntese de DNA. Em doses baixas, o 5-FU aumenta a taxa de formao de microncleos rato de medula ssea depois de 24 horas, atravs de um mecanismo envolvendo a inibio metablica (Maier e Schmid, 1976). MMC (Bristol, 1 mg / kg de peso corporal) tem o DNA de ligao cruzada e de alquilao actividade, e solvel em gua, com uma relativamente curta meia-vida biolgica em ratos (Kerpel-Fronius et al., 1988). Cito-B (Sigma, 50 ug / kg de massa corporal) inibe a clivagem citoplasmtica sem impedir a mitose, o que resulta em clulas binucleadas e multinucleadas. Todos os compostos de teste foram doseados a dose mxima tolerada (MTD), previamente determinada. Nos sinais MTD txicos foram observados, tais como alimentao lixo, as perdas de escala e alterao no comportamento de natao e motilidade. A anlise estatstica A ANOVA multivariada foi utilizado para comparar os efeitos de produtos qumicos e espcies em freqncias de microncleos mais de quatro perodos de tratamento. Microncleo freqncia em cada perodo de avaliao, as diferenas de frequncia de microncleos entre os perodos de avaliao sucessivas e diferenas entre os tratamentos freqncia de microncleos e seus controles foram submetidos anlise de varincia univariada para testar os efeitos de substncias qumicas, as espcies e as suas interaces. Estas anlises foram realizadas utilizando SAS / PROC GLM. Mltiplas comparaes entre as mdias foram obtidas empregando valores tajustados P (SAS / PROC MULTTEST). A log transformation was applied to micronucleus frequencies
before analysis, in order to stabilize the variance. Os resultados foram apresentados na escala original depois de transform-los de volta para freqncias. O valor obtido para trs transformou diferenas entre os perodos de tratamento sucessivos foi denominada "taxa de crescimento" (IR) - a taxa mdia entre a frequncia de microncleos de sucessivos perodos de avaliao. Para as diferenas entre os tratamentos e os controlos, o valor obtido para a transformao de volta para a escala original foi denominado "controlo da taxa de crescimento" (IRC), a razo mdia entre microncleo frequncia de cada tratamento e o seu controlo.

Tabela1: Aumento da taxa de freqncias de microncleos em trs especies de peixes (tratamento / controle), IRC. *IRC estatisticamente diferentes 1 (um conjunto <0,10). CP = ciclofosfamida, 5-FU= 5-fluorouracilo, BLM = bleomicina, mitomicina MMC = Tabela 2: Meios de microncleos em 2, 7, 14 e 30 dias aps o CP,5-FU, o tratamento BLM e MMC. a / Meios de espcies dentro do controle seguidos pela mesma letra no so significativamente diferentes (ajustado teste t, a - definir <0,05). b / A 2 e 7 dias: meios na mesma

coluna e perodo de tempo de tratamento seguidas pela mesma letra no so significativamente diferentes (teste t-ajustado, a - definir <0,05). Comparao entre os meios de espcies (linha) foram considerados em conjunto anterior. c / Aos 14 e 30 dias comparaes entre produtos qumicos dentro das espcies no foram feitas porque as interaes entre produtos qumicos e espcies no foram significativas. Para abreviaes, veja a legenda com o quadro I. Resultados CP induziu os maiores valores de IRC em todos os perodos de tratamento (Tabela I). Aps o dia 14 do IRC de todas as clastogens foi estabilizado para todas as espcies estudadas. Espontneas freqncias de microncleos (controles) entre as trs espcies foram significativamente diferentes (P = 0,038, Tabela II). Diferentes padres de freqncias de microncleos foram identificados para as combinaes de clastogens e espcies ao longo dos perodos de avaliao (trao Pillas de critrio, P = 0,0463). Houve diferenas significativas entre as espcies e produtos qumicos (P <0,05), exceto no dia 30, quando no houve diferena significativa entre as espcies foi detectada (Tabela II e Figura 1). As comparaes mltiplas de cada perodo de avaliao demonstraram significativamente que, em geral, CP foi mais eficaz como um agente clastognico de MMC, 5-FU e BLM. Comparando as espcies de peixes, T. rendalli foi a mais sensvel, enquanto C. carpio foi o mais resistente. No dia 7 (segunda poca de avaliao), quando houve um pico de frequncia de microncleos, T. rendalli mostrou uma sensibilidade significativamente inferior ao BLM. O pico do efeito desta droga para T. rendalli ocorreu durante o perodo de avaliao antes, no dia 2 aps o tratamento. Outra maneira de analisar o comportamento de agente clastognico para as trs espcies examinar a variao IR durante os perodos de avaliao sucessivas. O IR mdia 7-2 dias foi de 1,64 0,21. MMC tinha um IR significativamente superior a 1, durante este intervalo de tempo manteve-se estvel BLM (Tabela III). O IR geral 14-7 foi 0,58 (IC 95%: 0,42-0,80), significativamente inferior a 1 (P = 0,0005). Isso indica uma tendncia de diminuio das freqncias de microncleos entre estes dois perodos de avaliao, mais tarde, enquanto os dois anterior mostrou uma tendncia de aumento. IR no intervalo de 14-7 no se alterou significativamente com a espcie ou clastogens. O IR geral 30-14 dias foi de 0,93, o que no significativamente diferente de 1 (P = 0,6954), e isto significa que nenhuma tendncia para uma diminuio na micronucleusfrequency foi detectado durante este intervalo. O tempo necessrio para o aparecimento de eritrcitos no sangue perifrico binucleadas foi de dois dias e a proporo binucleadas / mononucleadas mxima foi observada aps 5-12 dias de tratamento com Cyto-B. Comparando cada perodo de tratamento, a maior produo de binucleadas / mononucleadas relao foi observada a partir de dois at cinco dias aps o tratamento com Cyto-B. O intervalo de tempo para a induo de microncleos e o aumento da razo binucleado / mononucleadas nos eritrcitos perifricos foram coincidentes (Figura 2). Figura 1: Comparaes de frequncia de microncleos induzidos por vrios clastogens em diferentes tempos ps-tratamento. Figura 2: Taxa de binucleados aos eritrcitos mononucleadas 0-15 dias aps o tratamento com citocalasina-B. Discusso Bahari et al. (1994) demonstraram um aumento linear dependente da dose na microncleos eritrcitos dois a quatro dias aps a irradiao g e mitomicina C-tratamento no peixe-gato de Clarias gariepinus. Da mesma forma, e Hooftman De Raat (1982) relataram um aumento da dose e dependente do tempo de microncleos em eritrcitos do mudminnow oriental Umbra pygmaea tratada com metanossulfonato de etilo. Respostas dependentes do tempo foram tambm observadas em anfbios expostos a radiaes (Siboulet et al, 1984;. Fernandez et al, 1993.). Ns demonstramos que as espcies relacionadas, tais como T. rendalli e O. niloticus, dar respostas diferentes a agentes

genotxicos. De acordo com o agente clastognico e as espcies estudadas, a frequncia de microncleos podem sofrer variaes importantes. Se o rim o principal tecido hematopoitico no peixe e, se microncleos so formados durante a hematopoiese, em seguida, o tempo necessrio para a concluso do ciclo mittico em eritrcitos devem previamente ser estimada. Ns descobrimos que a ocorrncia do pico de microncleos foi correlacionada com o ciclo de vida destas clulas no rim. Houve um perodo de latncia entre o tratamento e subsequente pico de microncleos em eritrcitos do sangue perifrico, sendo este ltimo coincidiu com a relao mxima binucleado eritrcitos (Figura 1). Al-Sabti e Metcalfe (1995), demonstrou que a induo de microncleos mxima ocorreu normalmente 1-5 dias ps-exposio, o que est de acordo com os nossos resultados. Uma anlise da taxa de aumento de microncleos indica a melhor altura para obter amostras de sangue, uma considerao importante quando se utiliza peixes para biocontrolo genotxico. ndice de proliferao celular provavelmente variar muito, dependendo das espcies de peixes, o tecido-alvo e as condies ambientais. O tratamento com Cyto-B produziu um padro semelhante de binucleado / mononucleadas proporo de eritrcitos aos observados nos microncleos induzidos pelos clastogens durante os primeiros 15 dias ps-tratamento. O experimento Cyto-B demonstrou que microncleos induzida em clulas de rim de eritrcitos jovens ser detectado no sangue circulante de 2-4 dias depois e este intervalo de tempo varia de acordo com as espcies e clastogens. A resposta dependente de tempo ocorreu com todos os clastogens nas trs espcies de peixes e deve ser determinado antes da utilizao extensiva de uma dada espcie. Tabela 3: O aumento das taxas (IR) de frequncias de microncleos 2-7 dias aps o tratamento com PB, MMC, 5-FU e BLM. *Para abreviaes, veja a legenda com o quadro I.