UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS E DA TERRA DEPARTAMENTO DE QUMICA BACHARELADO E LICENCIATURA EM QUMICA BIOQUIMICA APLICADA

DETERMINAO DA ENZIMTICA DA AMILASE SALIVAR

DISCENTES: MAXSUEL RIBEIRO SILVA JOSEPH

CUIAB/MT 2013

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS E DA TERRA DEPARTAMENTO DE QUMICA BACHARELADO E LICENCIATURA EM QUMICA BIOQUIMICA APLICADA

DETERMINAO DA ENZIMTICA DA AMILASE SALIVAR

Relatrio referente disciplina Bioqumica Aplicada, do curso de bacharelado e licenciatura plena em Qumica, ministrado pelo Prof. Msc. Mayara Peron Pereira, como nota parcial para concluso da disciplina.

DOCENTE: PROF. MSC. MAYARA PERON PEREIRA

CUIAB/MT 2013

Introduo

O mtodo utilizado na determino da atividade enzimatica o Somogyi Nelson, foi desenvolvido e adaptado na dcada de 40 e 50 pelos bioqumicos Michael Somogyi e Norton Nelson, inicialmente utilizado para deteco de acar no sangue, hoje um mtodo muito empregado no setor sucroalcooleiro para quantificao do teor de acar redutor, fornecendo resultados confiveis e precisos. O mtodo consiste analise quantitativa por fotometria de absoro molecular do Mo2O7, que em funo das condies impostas pelo mtodo proporcional a quantidade do acar redutor presente na amostra.

2 - Fundamentaes Tericas

O amido um polissacardeo que tem como funo biolgica primaria nos vegetais a reserva energtica, armazenado nas clulas parnquima amilfero. Formado por unidades de glicose polimerizadas por ligaes glicosdicas 1-4, podem ser encontrados na forma de dois principais grnulos; a amilose e amilopectina, a amilose no apresenta ramificaes e apresenta estrutura helicoidal, j a amilopectina, possui uma estrutura ramificada similar ao glicognio, porm com ramificaes mais espaadas, a cada 24-30 molculas de glicose, as ramificaes so realizadas por ligaes do tipo 1-6(figura 1).

Figura 1

A amilase salivar uma enzima especifica para hidrolise das ligaes glicosdicas 1-4, o tratamento do amido com a amilase salivar produz glicose ou oligmeros. Os aucares so classificados em redutores e no redutores, o grupo redutor corresponde ao grupo hemiacetal, um carbono ligado a OH e OR (no caso da glicose o carbono um, quando no estado cclico, figura 2a), os hemiacetais so caracterizados por estarem em equilbrio termodinmico com a forma ceto e Aldo (Aldo no caso da glicose). Ocorre que com a polimerizao das unidades de glicose (ligaes glicosdicas 1-4) para formao das molculas de amido, esses grupos hemiacetais so convertidos em grupos acetais (carbono ligado ao simultaneamente a

ois grupo OR) restando apenas um nico grupo redutor em uma das extremidades da cadeia

Figura 2

A estratgia utilizada nesse experimento para a determinao relativa da atividade da enzima amilase salivar foi a quantificao do acar redutor, sendo que com a hidrolise de cada ligao glicosdica 1-4 catalisada pela amilase, mais um grupo redutor formado, tendo-se assim uma proporo direta do teor de acar redutor com a atividade enzimtica. O mtodo utilizado o de Somogyi Nelson, que consiste no reativo Somogyi (soluo cupro-alcalina) fundamentado na propriedade que os aucares redutores apresentam em reduzir o Cu2+(on cprico) em Cu1+(on cuproso). Os aucares redutores reduzem o on cprico presente no reativo somogyi, a on cuproso, que convertido em oxido cuproso, que reduz o composto arsnio-molibdica, para oxido molibdnio (Mo2O7), figura 3, de colorao azul de molibdenio, cuja intensidade de cor proporcional a quantidade de acar redutor existente na amostra podendo assim ser mensurado colorimetricamente em espectrofotometria. No experimento em questo foi utilizado um espectrofotmetro para determinao da absorbncia em 510nm.

3 - Objetivo
Determinar o pH e a temperatura em que a atividade enzimtica da amilase salivar mxima.

4 - Materiais
Tubos de ensaio de 10ml; Becker de 20ml; Pera; Micro pipeta; Pipetas de 1, 5 e 10ml; Forno para banho de Maria de de 45, 60 e 100C; Refrigerador ajustado para 4 C;

5 - Reagentes
Soluo de saliva em NaCl (5mM) na proporo 1:5 (v/v); Soluo tampo fosfato 0,1M, pH 6,8; Soluo tampo acetato 0,1M, pH 4,0; Soluo tampo glicina 0,1M, pH 9,5; Soluo amido 1%; Soluo amido 5%; Soluo cupro-alcalina; Soluo arseno-molibdica.

6 - Metodologia
Os procedimento realizados podem ser divididos em duas etapas, uma para determinao do pH timo da atividade enzimtica e outra para determinao da temperatura tima da atividade enzimtica.

6.1 - Determinao do pH timo

Em um bquer de 20ml foi preparado a soluo de saliva com a adio de saliva e soluo de NaCl (5mM) na proporo de 1:5 (v/v), com as demais solues utilizados no experimento previamente preparadas por outra equipe, foram preparados uma serie de sete tubos de ensaio para determinao da atividade enzimtica em funo do pH, conforme apresentado na tabela1.

tubos 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a Tabela 1

tampo fostato 0,1M (pH 6,8) ------1mL 1mL -----

Tampo acetato 0,1M (pH 4,0) 1mL 1mL 1mL ---------

tampo glicina 0,1M (pH 9,5) ----------1mL 1mL

gua 1,5mL 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25

soluo amido 1% --0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL

soluo saliva 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml

Nos tubos 2a, 4a e 6a, imediatamente aps a adio de todos os componentes listados na tabela 1, foram adicionados 1ml de soluo cupro-alcalina e incubado a banho Maria com temperatura de 100C por 8 minutos. Os tubos 1a, 3a, 5a e 7a, foram incubados em banho Maria com temperatura de 45C por 10 minutos, imediatamente aps a adio de todos os componentes, em seguida acrescentou-se aos tubos 1ml da soluo cupro-alcalina, incubando-os em banho Maria com temperatura de 100C por mais 8minutos. Sequencialmente todos os tubos foram resfriados em gua corrente e adicionado em cada um deles 1ml da soluo arseno-molibdica e 6,5ml de gua destilada. Finalizando com a determinao de absorbncia em 510nm.

6.2 - Determinao temperatura tima

Para determinao da atividade enzimtica em funo do temperatura foram preparados uma serie de oito tubos de ensaio, conforme apresentado na tabela2.

tubos 1b 2b 3b 4b 5b 6b 7b 8b Tabela 2

tampo fostato 0,1M (pH 6,8) 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL

gua destilada 1,5mL 1,25 1,5 1,25 1,5 1,25 1,5 1,25

soluo amido 0,5% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL

Imediatamente aps de todos os componentes listados na tabela 2 serem adicionados, os tubos foram submetidos a 10 minutos de incubao em banho Maria com diferentes temperaturas; 1b e 2b a temperatura ambiente (25 C), 3b e 4b a temperatura de aproximadamente 4 C, 5b e 6b a temperatura de 45C e os tubos 7b e 8b a temperatura de 60C, aps os 10 minutos de incubao adicionou-se aos tubos 0,1ml da soluo de saliva, incubando novamente em suas respectivas temperaturas, em seguida adicionou-se aos tubos 1,0mL da soluo cupro-alcalina, agitando bem e incubando todos os tubos em banho Maria com temperatura de 100C por 8 minutos, em seguida os tubos foram resfriados em gua corrente e adicionou-se em cada tubo 1,0mL de soluo arseno-molibdica e 6,5mL de gua destilada. Finalizando com a determinao de absorbncia em 510nm.

7 - Resultados e Discusses

Os resultados podem ser divididos nos referentes a determinao do pH timo e na temperatura tima.

7.1 Determinao pH timo

As medidas de absorbncia para os tubos de ensaio preparados para determinao do pH timo da atividade da enzima amilase salivar, esto apresentadas na tabela3 e grfico 1.

Determinao pH timo Tubos Absorbncia 1a 0 2a 0,0652 3a 0,1215 4a 0,0116 5a 0,0186 6a 0,0244 7a 0,0145
Tabela 3

A incubao dos tubos a 100C tem a finalidade de cessar a atividade da amilase com a sua desnaturao, de forma que a analise da sua atividade sejam referentes unicamente s condies em que estavam submetidas antes dessa incubao.

Absorbncia X pH
0.14 0.12 absorbncia 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 1a 2a 3a 4a pH 5a 6a 7a pH6,8 pH 4 pH6,8 pH9,5 pH9,5 pH 4 pH 4

grfico 1

Os tubos 2, 4 e 6 foram incubados a 100C aps as adies dos reagentes, logo a hidrolise do amido nesses tubos, em tese nula, pois a amilase foi desnaturada de imediato. As solues desses tubos correspondem aos brancos na determinao da absorbncia para cada condio de pH (2a3a, 4a5a, 6a7a), tendo em vista que so solues que contem todos os componentes da soluo problema, menos o analito ( aucar redutor, produto da catalise enzimtica). De posse desses conceitos, constata-se a seguinte incoerncia dos dados experimentais; o tubo 6a condicionado ao pH9,5, que em tese no deveria ocorrer atividade enzimtica (enzima desnaturada de imediato), obteve-se valor de absorbncia maior que o observado tubo 7a, onde a amilase no foi desnaturada de imediato.

A inferncia da maior atividade enzimtica em funo da pH, assim com em funo da temperatura, est fundamentada (conforme descrito na fundamentao terica )na proporcionalidade da atividade enzimtica em condies controladas de temperatura de pH, com o valor da absorbncia descontando a absorbncia do respectivo branco, grfico 2.

Absorbncia X pH
0.06 0.05 0.04 Absorbncia 0.03 0.02 0.01 0 -0.01 -0.02 3a-2a 5a-4a pH 7a-6a -0.0099 0.007 0.0563

grfico 2

7.2 Determinao Temperatura tima

As medidas de absorbncia para os tubos de ensaio preparados para determinao da temperatura timo da atividade da enzima amilase salivar, esto apresentadas na tabela4 e grfico 3.

Determinao Temperatura tima Tubos Absorbncia 1b 0 2b 0,004 3b 0,0045 4b 0,0441 5b 0,0149 6b 0,0254 7b 0,027 8b -0,0059
Tabela 4

Para determinao da temperatura tima usou-se o mesmo princpio adotado para determinao do pH timo; para cada condio de temperatura tem-se dois tubos, um deles sem o produto derivado da catalise enzimtica do amido (logo o branco para essa condio de temperatura), porm a ausncia desses produtos se deu pela no adio do amido e no pela desnaturao imediata da amilase.

Absorbncia X temperatura
0.05 0.04 Absorbncia 0.03 0.02 0.01 25C 0 1b -0.01 2b 3b 4b 5b 6b 7b 8b temperatura 25C 4C 45C 45C 60 4C

60C

grfico 3

Assim como nas medidas fotomtricas dos tubos preparados para determinao do pH timo, incoerncia de valor de absorbncia maior em solues em que no devia ocorrer atividade enzimtica podem ser observadas nas medidas de absorbncia dos tubos 7b-8b (tabela4). A inferncia relativa da atividade enzimtica em funo da temperatura pode ser observado no grafico4.

Absorbncia X Temperatua
0.05 0.04 0.03 Absorbncia 0.02 0.01 0 -0.01 -0.02 -0.03 -0.04 temperatura -0.0329 2b-1b 4b-3b 6b-5b 8b-7b 0.004 0.0105 0.0396

grfico 4

8 Concluso

De acordo com os dados experimentais o pH=4 e a temperatura igual a 4C o ph e temperatura em que a enzima tem maior atividade. Porm em virtude das discrepncias observadas nas medidas de absorbncias, a confiabilidade desses resultados reduzida significativamente, a ponto de caracterizar o experimento como insatisfatrio na obteno do seu objetivo principal. A causa mais provvel para esse fato so falhas operacionais, sendo que o mtodo utilizado muito empregado e consagrado pela sua eficincia.

Referencias Bibliogrficas

SOMOGY, M. A New Reagent for Determination of Sugars. A new Sugar Reagent, May p. 61 68, 1945. Mtodos Analticos Fermentec Verso 2003 e 2012. Skoog, Douglas Fundamentos de Qumica Analitica, traduo da 8 edio norteamericana, editora Thomson.