Tecnica S BM

Tcnicas de Biologia Molecular
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Sntese do cDNA Enzimas de restrio (Ex: Hind III) Electroforese do DNA Hibridao de uma sonda Calculo da Tm Sonda em hibridao Southern blot Sonda especica do alelo (ASO) Polimorsmo de restrio Polimorsmo Msp I do apoA-II Mapa de restrio PCR Dideoxiadenina trifosfato Reaco da sequnciao Sequniao do DNA Gel de sequnciao
Sntese do cDNA
A manipulao e o estudo do RNA difcil por causa da sua sensibilidade aos ribonucleases que os degradam; necessrio ento recopiar a sequncia de RNA em sequncia de DNA, mais estvel ...
Cromatografia de Afinidade
Na Cromatografia de afinidade (C.A): um ligante ligado covalentemente a uma matriz; Quando uma soluo impura passada atravs da coluna, a molcula desejada liga-se ao ligante imobilizado;
Cromatografia de Afinidade
O RNAm purificado por cromatografia de afinidade em colona com Ligante = oligo-d(T)
Sntese do cDNA
O RNAm purificado por cromatografia de afinidade em colona de oligo-d(T); Os oligonucletidos poly(T) vo hibridar com a cauda poly(A).
Sntese do cDNA
A Reverse Transcriptase (RT) (=DNA polymrase) sintetiza uma fita de DNA complementar do RNAm a partir da extremidade 3' do primer poly(T)...
Sntese do cDNA
O RNA degradado utilizando uma base forte (NaOH) ou uma ribonuclease especfica; A Ext. 3 da fita de DNA sintetizada hibrida espontaneamente sobre ela mesma e forma um anel...
Sntese do cDNA
A Ext. 3' do anel vai servir de sitio de iniciao para a DNA polimerase responsvel pela sntese da fita complementar do DNA...
Sntese do cDNA
Uma Nuclease S1 especifica do DNA cadeia simples suprima o anel da extremidade.
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Enzimas de Restrio: Exemplo Hind III
Hind III uma enzima de restrio produzida por uma bactria chamada Haemophilus influenzae; O DNA da bactria metilado no hidrolizado; O DNA parasita no metilado hidrolizado.
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Enzimas de Restrio: Exemplo Hind III
Os stios de restrio so em geral palndroma (Ex: AAGCTT) O sitio de ligao ao DNA constitudo por 6 pares de Ntdos A Metilao da primeira Adenna ou da Citosina no sitio da hidrlise inibe (impede) o reconhecimento do sitio por Hind III
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Electroforese do DNA - Os fragmentos de DNA digeridos por enzimas de restrio so anies; - Os fragmentos vo migrar no sentido do polo positivo (nodo) - A velocidade da migrao depende do tamanho destes fragmentos
nodo - No primeiro poo coloca-se o Indicador do tamanho constitudo por fragmentos de DNA de tamanho conhecido
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Electroforese do DNA
Aos depsitos adiciona-se: Corante azul aninico visvel no gel BROMETO DE ETDIO, liga-se especificamente ao cidos nuclicos nodo
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Electroforese do DNA
nodo O BROMETO DE ETDIO emite uma cor uorescente lils quando esta iluminado por UV; Em presena da luz UV 254 nm os fragmentos tornam-se; visveis. O gel pode ser depois fotografado.
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Hibridao com sonda
Tm a temperatura que provoca a destruio de 50% das pontes

hidrognio das fitas de DNA; O DNA (cadeia dupla) esta parcialmente desnaturado
Hibridao com sonda
Aos
95c todas as pontes hidrognio esto rompidas e o DNA
desnaturado Com um arrefecimento rapido o DNA fica desnaturado; Com um arrefecimento lento a hlice dupla volta a se formar progressivamente
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Hibridao com sonda
A Tm de uma sonda a temperatura em qual esta sonda vai hibridar com o fragmento complementar do DNA

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Calcular a Tm
Oligonucletido < 20 Ntdos : Tm em C = (A+T)x2 + (G+C)x4 Oligonucletido > 20 Ntdos : Tm em C = [(A+T)x2 + (G+C)x4] x (1+[(N-20)/20])
A partir de N = 20, corrija-se com um multiplicador proporcional ao comprimento que ultrapassa este nmero: 1 + [(N-20)/20].
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Sonda de Hibridao
Para poder detectar especificamente uma sequncia de DNA alvo, sintetiza-se um pequeno fragmento de DNA chamado sonda cuja a sequncia corresponde a uma parte do DNA alvo
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qA hibridao de uma sonda marcada (tomos radioactivos, radicais fluorescentes ou ligante especfico) com o DNA alvo desnaturado permite detectar (marcar) especificamente todos os fragmentos de DNA tendo uma sequncia complementar esta sonda...
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Southern blot
Southern blot uma tcnica elaborada por Edward M. Southern em 1975 para procurar fragmentos de DNA de uma electroforese depois de os hibridar com uma sonda complementar....
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1. A degradao do DNA pelas Enz. Res. Resulta numa mistura de fragmentos : Fragmentos de restrio, quando submetidos uma electroforese vo migrar dentro do gel em funo dos seus tamanhos...
2. Realiza-se uma montagem que permite, com ajuda do tampo, fazer passar os fragmentos do gel uma membrana de nilon onde o DNA vai se fixar com ligaes estveis....
3. A membrana de nilon com os fragmentos de DNA incubada dentro de um saco com uma soluo da sonda radioactiva complementar ao fragmento do DNA alvo....
30 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica Temperatura de incubao ?
4. A membrana lavada e colocada com um filme radiogrfico virgem numa caixa opaca para que a sonda radioactiva ligada aos fragmentos de DNA complementar marca a sua impresso no filme...
5. O filme revelado com manchas negras que correspondem aos local onde imigraram os fragmentos do DNA alvo complementares da sonda.
Sonda especifica do alelo (ASO)
qA drepanocitose (anemia) uma doena dos glbulos vermelhos que se encontram desformados por causa da cristalizao anormal da hemoglobina; qEsta cristalizao o resultado de uma substituio do A por T no sexto codo; qEsta substituio traduz-se por uma mutao Glu por Val da cadeia da globina;
33 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica ASO = Allele Specific Oligonucleotide
Sonda especifica do alelo (ASO)
A Electroforese do DNA do gene HBB que codifica para a cadeia das globinas revelada utilizando duas sondas : qUma especifica sequncia normal (A) qOutra especifica sequncia com mutao (S)
qO DNA de um indivduo revelado unicamente pela sonda normal: qO indivduo tem os dois genes HBB normais (homozigotico normal); qO DNA de um indivduo revelado unicamente pela sonda com mutao: qO indivduo tem os dois genes HBB com mutao (homozigotico com mutao); qO DNA de um indivduo revelado pelas duas sondas : qO indivduo tem um gene normal e outro com mutao Doutor (heterozigotico). Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
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Polimorfismo Msp I do apoA-II
Alelo raro Alelo frequente
qCada sistema de restrio de alelos define um locus polimorfo; qSouthern blot permite a deteco dos polimorfismos de tamanho dos fragmentos de restrio (RFLP)
36 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica RFLPJean = Restriction Fragment Length Polymorphism
qO polimorfismo do gene apolipoproteina A-II altera a sequncia do sitio reconhecido pela Enz. Res. Msp I situado depois do gene; q19 % dos ingleses no tem stio de restrio neste local....
qA electroforese separa os fragmentos em funo do tamanho; qO southern Blot utilizando uma sonda complementar dos exes do apoA-II e a autoradiografia revela os fragmentos; qA maioria dos individuos (81 %) tm 3 stios de restrio a volta do gene, revelando assim um fragmento de 3000 pb (3,0 kb).
qIndivduos mais raros (19 %) no tm um stio de restrio e revelam um fragmento maior de 3700 pb (3,7 kb) (indivduo n3); qO indivduo n4 revela os dois fragmentos (3 e 3,7 kb)
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???
PCR
PCR (polymerase chain reaction) permite amplificar especificamente uma regio com centenas de pb do DNA fita dupla;
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qO DNA separado primeiro em fitas simples (desnaturao 95C). qAdiciona-se uma grande quantidade de primers (oligonucletidos sintetizados) complementares das duas extremidades da zona amplificar; qOs primers vo hibridar uma temperatura Tm 50-60C com as sequncias complementares;
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qA Taq polimerase (DNA polimerase) sintetiza uma temperatura de 72C a fita complementar partir do 3'OH dos primers; qOs 4 dNTP serviro de substratos da Taq poli; qO resultado a sntese de 4 fitas de DNA
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qO ciclo repetido com a desnaturao das 4 fitas de DNA, e a Taq poli sintetiza 8 fitas; partir das 8 fitas de DNA a Taq poli sintetiza 16 fitas; qDepois de 35 ciclos o resultado so 34.359.738.368 fitas de DNA; qEsta quantidade suficiente para estudar o fragmento de DNA
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica 43 amplificado.
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qO dideoxiadenosina trifosfato (ddATP) no tem a funo lcool em 3'. qAnlogo estrutural do nucletido, o ddA usado como inibidor da replicao (DNA polimerase). qA ausncia da funo lcool em 3' impede a condensao com o nucletido seguinte; qEsta inibio utilizada no sequnciao de DNA ...
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qetapas da sequnciaa: qHibridao do primer do lad 3 qSntese da cadeia complementar. qPara esta sntese adiciona-se : qOs quatro dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTP). qUma pequena quantidade de ddNTP fluorescente (ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTPP-TAMRA e ddTTP-ROX).
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qA incorporao do ddNTP fluorescente na reaco de condensao impede a continuao detsa (no h extremidade 3 -OH); qPequenos fragmentos so assim sintetizados e marcados por uma fluorescncia correspondente ao ultimo nucletido incorporado;
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qA separao por electroforese destes fragmentos permite ler as letras sucessivas que aparecem como um electroforegrama qCada electroforegrama tem a florescncia do ultimo nucletido...
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Extraco e purificao de DNA Sntese do cDNA Enzima de restrio (Hind III) Electroforese de DNA Hibridao de uma sonda Calculo da Tm Sonda em hibridao Sonda especifica do alello (ASO) Southern blot Polimorfismo de restrio Polimorfismo Msp I do apoA-II Mapa de restrio PCR Dideoxiadenina trifosfate Reaco de sequncia Sequniao do ADN Gel de squenciao
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qA separao por electroforese destes fragmentos permite ler as letras sucessivas que aparecem como um electroforegrama qCada electroforegrama tem a florescncia do ultimo nucletido...
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Sonda especifica do alelo (ASO)

Sonda especifica do alelo (ASO)

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Alelo raro Alelo frequente

Alelo raro Alelo frequente

Alelo raro Alelo frequente

Alelo raro Alelo frequente

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