*Histrico

1495 uso de mercrio para tratamento da sfilis Curso de Ps-Graduao em Microbiologia BMM 5753 Bacteriologia de Anaerbios 1905 Paul Ehrlich (Alemanha) bala mgica quimioterapia 1928 Alexander Fleming substncia com ao inibitria contra Staphylococcus aureus, produzida pelo fungo:
Penicillium notatum

Antimicrobianos Teste de Susceptibilidade

Dra. Viviane Nakano

Penicilina

*Conceitos
ANTIMICROBIANOS Produzidas por microrganismos ou sintetizado em laboratrio, capazes de matar ou inibir microrganismos (antibiticos e quimioterpicos).

*Conceitos

TOXICIDADE

SELETIVA

Capacidade

de

lesar

microrganismo, sem ser txica para o hospedeiro. SINERGISMO Quando a combinao de duas drogas aumenta a atividade de ambas. ANTAGONISMO Quando um antimicrobiano diminui a ao de outro.

*Conceitos

*Conceitos

CONCENTRAO INIBITRIA MNIMA (CIM) menor concentrao da droga capaz de inibir o crescimento bacteriano. CONCENTRAO BACTERICIDA MNIMA (CBM) menor concentrao da droga que inibe pelo menos 99,9% do inculo bacteriano. PONTO CRTICO OU BREAKPOINT a concentrao de uma droga que alcana no soro, urina ou lquido

cefaloraquidiano, aps a administrao do agente, com fins teraputicos.

Propriedades ideais dos antibiticos

1. Toxicidade seletiva; 2. Amplo espectro de ao; 3. No agir contra microbiota residente; 4. Solubilidade em lquidos corporais; 5. Alcanar altas concentraes nos tecidos e sangue; 6. No ser afetado pela acidez estomacal ou protenas do sangue; 7. No produzir efeitos colaterais; 8. Disponibilidade e baixo custo.

Relao Microbiota-Hospedeiro-Antibitico
Hospedeiro Antimicrobiano Microbiota

Desequilbrio

Microbiota exgena

Processo infeccioso Sistema imune comprometido Morte Cepas resistentes Terapia: insucesso

Mecanismos de ao dos antimicrobianos

7 Inibio da sntese de parede celular; 7 Inibio da sntese de protenas; 7 Alterao da membrana citoplasmtica; 7 Inibidores da sntese dos cidos nuclicos (DNA/RNA); 7 Alterao do metabolismo do cido flico (PABA).

Mecanismos de ao dos antimicrobianos

Madigan et al., 2010.

Inibidores da Sntese de Parede Celular

Mecanismo de ao Ligam-se as protenas de ligao de penicilina (PBPs) e enzimas responsveis pela sntese de peptideoglicano.

Composio do peptidoglicano

Madigan et al., 2010.

Madigan et al., 2010.

Inibidores da Sntese de Parede Celular

Transpeptidases/ Carboxipeptidases/Endopeptidases Protenas de ligao penicilina (PBPs)

Inibidores da Sntese de Parede Celular

Principais Antimicrobianos: Beta-lactmicos Glicopeptdeos

PBPs + antibitico

Penicilinas Cefalosporinas Carbapenmicos Monobactmicos Cefamicinas Inibidores de beta-lactamases

Vancomicina Teicoplanina Fosfomicina Bacitracina Cicloserina

Inibem a montagem das cadeias de peptideoglicano

Outros

Ativao das autolisinas

Lise e morte celular

Madigan et al., 2010.

Inibidores da Sntese de Parede Celular

Penicilinas (Beta-lactmico) Penicilinas Naturais Penicilina G, Penicilina V. Penicilinas Semi-Sintticas Oxacilina, Ampicilina, Amoxicilina, Piperacilina. Outras Penicilinas Meticilina, Pirazocilina, Propicilina, Azidocilina, Cloxacilina

Inibidores da Sntese de Parede Celular

Cefalosporinas (Beta-lactmico)

1. Gerao Cefazolina Cefalotina Cefalexina

2. Gerao Cefamandol Cefonicida Cefuroxima Cefaclor

3. Gerao Cefoperazona Cefotaxima Ceftazidima Ceftriaxona Cefoperazona

4. Gerao

Cefpiroma Cefixima Cefepima

Inibidores da Sntese de Parede Celular

Beta-lactmicos

Inibidores da Sntese de Parede Celular

Inibidores de Beta-lactamases Inibidores beta-lactamase

Carbapenmicos

Monobactmico

Cefamicinas Ampicilina+Sulbactam Piperacilina+Tazobactam Ticarcilina+c. clavulnico Amoxicilina + c. clavulnico

Imipenem, Meropenem Ertapenem, Panipenem Biapenem

Aztreonam Tigemonam

Cefotetan, Cefoxitina

Inibidores da Sntese de Parede Celular

Glicopeptdeos

Composio do Ribossomo Bacteriano

Vancomicina Teicoplanina Bacitracina Fosfomicina Cicloserina

Tortora et al., 2012.

16S RNA

5S RNA

23S RNA

Funo: Sntese de Protenas

Tortora et al., 2012.

Inibio da Sntese de Protenas

Mecanismo de ao Alvos so as subunidades 50S e 30S do ribossomo
9

Inibio da Sntese de Protenas

Inibidores da subunidade 50S Macroldeos Claritromicina, Roxitromicina, Diritromicina,

Eritromicina,

Azitromicina, Telitromicina.
9

Cloranfenicol (ativo contra anaerbios)

Cloranfenicol, Tianfenicol.
9

Lincosamidas (ativo contra anaerbios)

Lincomicina, Clindamicina.
Tortora et al., 2012.

Inibio da Sntese de Protenas

Inibidores da subunidade 30S
6

Membrana citoplasmtica

Aminoglicosdeos (dependente de O2)

Estreptomicina, Gentamicina, Amicacina, Neomicina, Canamicina.

6

Tetraciclina (inibe colagenase, quimiotaxia e aderncia bacteriana)

Tetraciclina, Minociclina, Doxiciclina, Clorotetraciclina, Oxitetraciclina.

6

Nitrofurano

Nitrofurazona, Furazolidona, Nitrofurantona, Nifurtimox. 6 Glicilciclinas (nova opo contra anaerbios) Tigeciclina
Madigan et al., 2010.

Inibidores da Sntese de DNA/RNA

Permeabilidade Seletiva Mecanismo de ao

Interferem na replicao do DNA (DNA girase e DNA polimerase) e na transcrio Alterao (RNA polimerase - sntese de RNA).

Madigan et al., 2010.

Inibidores da Sntese de DNA/RNA

Principais Antimicrobianos:

Inibidores da Sntese de DNA/RNA

Rifamicina (Inibe a sntese de RNA) D Rifamicina D Nitroimidazol D Quinolonas Nitroimidazol (Anaerobiose Hidroxialamina dano ao DNA) Metronidazol, Tinidazol Rifamicina, Rifampicina

Inibidores da Sntese de DNA/RNA

Quinolonas (Atuam na replicao do DNA) 1. Gerao cido nalidxico cido pipemdico Rosoxacino 2. Gerao Norfloxacina Ciprofloxacina Ofloxacina Difloxacina Pefloxacina Levofloxacina 3. Gerao

Alterao do Metabolismo do cido Flico

Mecanismo de ao Inibidor metablitos (cido flico). Principal Antimicrobiano Sulfonamidas competitivo essenciais

que atua na sntese de Moxifloxacina Gatifloxacina Gemifloxacina Clinafloxacina Trovafloxacina

Fluoroquinolonas

Sulfametoxazol + Trimetoprim
Tortora et al., 2012.

cido paraminobenzico

cido didroflico

Resistncia aos Antimicrobianos

cido tetraidroflico (cido flico)
Tortora et al., 2012.

Definio
9Capacidade de um microrganismo para resistir aos efeitos de uma droga a que normalmente, sensvel.

Por que?

Origem
1950 Primeiras observaes de Staphylococcus sp. resistente a penicilina.

Uso abusivo e indiscriminado de antibiticos, o que seleciona bactria geneticamente resistente.

*Produo industrial e consumo mundial de antimicrobianos

Tipos de resistncia
Natural ou intrnseca Decorrente de caractersticas inerentes clula bacteriana e que j existe antes da exposio a um determinado antibitico.
Exemplos: Anaerbios aminoglicosdeos; Aerbios metronidazol; gram positivos polimixina; gram negativos antimicrobianos hidrofbicos (rifampicina e cido fusdico).

Madigan et al., 2010.

Tipos de resistncia
Resistncia adquirida Surge quando cepas resistentes emergem de populaes bacterianas originalmente sensveis em geral, aps exposio.

Tipos de resistncia
Resistncia adquirida Cromossmica
Aquisio de genes Mutao Modifica a permeabilidade da membrana

Plasmidial
Plasmdios de resistncia (Plasmdio R) Produo de enzimas (betalactamases, fosfotransferase)

Resulta de uma alterao gentica que se expressa bioquimicamente em resposta a ao dos antibiticos.

Mecanismos de aquisio da resistncia

Resistncia transfervel Resistncia por mutao

Transformao Transduo Conjugao

Mecanismos de resistncia

Mecanismos de resistncia
Inativao enzimtica da droga

Inativao enzimtica da droga

9 Produo (penicilinas,

de

beta-lactamases e

cefalosporinas

Alterao do stio alvo

carbapenmicos); 9 Genes (cromossomo, plasmidial e

Impedir o acesso do antibitico ao stio alvo

transposons).

Mecanismos de resistncia
Alterao do stio alvo
9 Alterao das PBP (protenas ligadoras de penicilina); 9Alterao da DNA girase e

Mecanismos de resistncia
Impedir o acesso do antibitico ao stio alvo
9 Mutaes que causam alterao na permeabilidade da membrana; 9 Efluxo da droga pelo sistema de bombas.

topoisomerase.

Mecanismos de resistncia

Transmissibilidade da resistncia aos antimicrobianos

Reservatrios comensais (humanos e animais); Reservatrio ambiental (solo, gua, entre outros); Disseminao por pessoas da rea de sade:
* Lavagem das mos de forma inadequada; * Uso inadequado de equipamento de proteo.

Efeito da presso seletiva em bactrias

Para refletir...
7 Uso racional de antibiticos; 7 Auto medicao; 7 Boas prticas de controle de infeces (diagnstico e tratamento efetivo); 7 Novos antimicrobianos???

Quais as indicaes para o teste de susceptibilidade?

Infeces especficas (endocardites, osteomielites, infeces que no respondem ao tratamento emprico, infeces do sistema nervoso central);

Testes de Susceptibilidade de Bactrias Anaerbias Estritas

Avaliao de novas drogas; Determinar o padro de susceptibilidade de

determinada rea geogrfica.

Preconizado pela CLSI

(Clinical and Laboratory Standards Institute)

Outras tcnicas

1. Mtodo de diluio em caldo: macrodiluio e microdiluio;

Mtodo Kirby-Bauer Mtodo Epsilomtrico E-Test

2. Mtodo de diluio em gar;

Sistemas miniaturizados:

3. SGE (Spiral Gradient Endpoint).

MicroScan Micro Media Systems Sceptor Anaerobe MIC Eluio de disco em caldo

Inculo Bacteriano

Inculo Bacteriano Meios de cultura utilizados

0,5 McFarland (1,5 x 108 cl./mL)

0,5 McFarland (1,5 x 108 cl./mL) Em Caldo: BHI (Brain

Heart Infusion); Incubao

Escala McFarland

Em gar: gar Wilkins & Chalgren, gar Sangue, gar Brucella.

35-37C por 46-48 horas.

Agentes a serem testados

Variavelmente ativo

Para todos os mtodos

Preparao da soluo estoque (droga) (10 mg/mL);

Ativos

Cefalosporinas, penicilinas e clindamicina.

Pouca atividade

Diluio da droga (0,25 a 512 g/mL); Controles de viabilidade: Inicial, Final e Aerobiose; Controle do teste: ATCC.

Metronidazol, imipenem, cloranfenicol, beta-lactmico/inibidor de beta-lactamase.

Norfloxacina, ofloxacina, ciprofloxacina, e novas fluoroquinolonas (levofloxacina, gatifloxacina, moxifloxacina).

Diluio em gar
1. Preparao das placas com as concentraes da droga; 2. Secagem das placas; 3. Preparao do inculo (0,5 McFarland); 4. Aplicao do inculo no replicador de Steers; 5. Carimbar nas placas; 6. Esperar secar. Incubao em anaerobiose.

Diluio em gar

Replicador de Steers (32 poos)

Diluio em gar
Vantagens
Vrias cepas

Diluio em gar
Desvantagens
ser No conveniente para apenas um isolado; os CBM no pode ser

podem

testadas ao mesmo tempo; Vivel exigentes. para todos

anaerbios, mesmo os mais

determinado; Teste dispendioso e incmodo.

gar Brucella

gar Wilkins & Chalgren

Macrodiluio em caldo
1. Preparao dos tubos com as concentraes da droga; 2. Preparao do inculo (0,5 McFarland); 3. Aplicao do inculo nos tubos; 4. Incubao em anaerobiose.

Macrodiluio em caldo

Caldo BHI (Brain Heart Infusion)

Macrodiluio em caldo
Vantagens
Custo mais efetivo; Fcil de ser executado; So teis para isolados nico. Pode ser determinada a CBM. Utilizado para microrganismos

Microdiluio
1. Preparao da placa com as concentraes da droga; 2. Preparao do inculo (0,5 McFarland); 3. Aplicao do inculo com carimbador; 4. Incubao em anaerobiose.

Desvantagens
Dificuldade na determinao da CIM em microrganismo que no apresentam turbidez aps crescimento (Dialister). No vivel para muitos isolados.

como Clostridium spp. (swarming).

Microdiluio

Microdiluio

Caldo BHI (Brain Heart Infusion)

Microdiluio
Vantagens
Placas podem ser preparadas antecipadamente e congeladas ou serem compradas prontas; Vivel para um nico isolado ou vrios. No

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

Desvantagens
favorvel para

crescimento de muitos anaerbios

(Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella);

Dificuldade na determinao da CIM.

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

1. Preparao das placas com as concentraes da droga;

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

Aplicao da droga em espiral
Mais concentrado

H2O

H2O

Hipoclorito

Aplicao de droga

Lavagem do dispositivo
Menos concentrado

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

1. Preparao das placas com as concentraes da droga; 2. Secagem das placas; 3. Preparao do inculo (0,5 McFarland); 4. Aplicao do inculo no replicador radial; 5. Carimbar nas placas; 6. Esperar secar. Incubao em anaerobiose.

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

Replicador radial: 15 cepas

Bactrias

Placa

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

Crescimento bacteriano

Como interpretar os resultados do SGE?

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

Diagrama para clculo da CIM

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

Distncia em mm

SGE (Spiral Gradient Endpoint)

Vantagens
Crescimento de microrganismos exigentes; Sistema rpido e prtico; Diminuio placas. no nmero de

Qual mtodo utilizar?

9 Variao dos testes permitir confuso no padro de resistncia; 9 A CIM de algumas drogas para anaerbios so mtodo dependentes; 9 As tcnicas de macro e microdiluio apresentam a CIM uma concentrao menor do que a diluio em gar.

Desvantagens
Equipamento requerido tem custo elevado.

200 cepas testadas e comparadas SGE e SAD (Standard Agar Dilution) 8 drogas testadas (clindamicina,
ampicilina/sulbactam, mezlocilina, penicilina) metronidazol, imipenem, cefoxitina, ampicilina,

2 cepas ATCC testadas e comparadas SGE e SAD (Standard Agar Dilution) em 5 laboratrios diferentes; Resultados discrepantes, mas devido a tcnica.

SGE apresentou CIM menor em comparao com SAD.

Controle de Qualidade dos Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos

9 Validade das drogas e preparao das solues estoques; 9 Filtrao das drogas e evitar a inativao pela luz; 9 Escolha do meio de cultura (suplementos, pH, espessura); 9 Tamanho do inculo (104-106 cls./mL); 9 Pureza do inculo (gram, teste respiratrio); 9 Viabilidade do organismo-teste (incio e fim); 9 Controle de esterilidade de aerobiose do teste; 9 Cepas de referncia (ATCC, NCTC). Nitrocefin

Teste de Beta-lactamase
Cefinase

Teste de Beta-lactamase
Mtodo Biolgico Resistente

Sensvel

Resistncia aos antimicrobianos em anaerbios

Resistncia aos antimicrobianos em anaerbios

Resistncia aumentando = rea geogrfica, conduta teraputica e auto-medicao Resistncia intrnseca e adquirida (plasmdios e transposons) Produo de enzimas beta-lactamases- estrutura primria (classe A a D); caractersticas funcionais e bioqumicas (grupo I a IV).

Genes relacionados com resistncia aos antibiticos

cepA classe A (IS21)
(Cefalosporina) (Penicilina) Metais pesados

cfiA classe B (IS4351, IS942, IS1186)

(Carbapenmicos)

tetQ
(Tetraciclina)

Bacteroides fragilis

ermF (IS4351) (Clindamicina)

(Macroldeos)

nim
(IS1168, IS1169, IS1170) (Metronidazol)

cfxA
(Cefoxitina)

Transferncia horizontal de genes com dois tipos de elementos conjugativos Transposons tetQ ermF* ermB** ermG**

Transferncia de genes entre organismos gram positivos e negativos no clon e outros ambientes intestinais
gram-positivos Genes gram-negativos
Campylobacter spp. Haemophilus spp.

Plasmdeos

Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Streptococcus spp. Actinomyces spp. Bifidobacterium spp. Clostridium spp.

tetM

ermF

Veillonella spp. Neisseria spp. Fusobacterium nucleatum

*genes ermF inicialmente descritos em gram-positivos e foram transferidos para gram-negativos. **genes ermB e ermG parecem ser transferidos s entre Bacteroides spp.
Salyers et al. (2004)

Eubacterium spp.

tetQ ermF

Bacteroides spp. Prevotella spp. Porphyromonas spp.

Salyers et al. (2004)

Resistncia aos antimicrobianos

Porcentagens de resistncia para antimicrobianos de 114 espcies dos gneros Bacteroides e Parabacteroides
Bactrias-Origem (n) Faixa de Resistncia (%)

Antibiticos: Amx, Amp, Cfx, Cli, Er, PenG, Tet

Pacientes (64) Sadios (50) 13,7 100 22 100

24 crianas sem diarria 50 cepas Bacteroides/Parabacteroides spp. 15 crianas com diarria 64 cepas Bacteroides/Parabacteroides spp. Teste de susceptibilidade: 11 antibiticos 6 metais pesados

ons Metlicos: Hg, Ag, Cu, Cd, Pb, Ni

Pacientes (64) Sadios (50) 57 100 80 100
Nakano et al. (2004)

90 crianas sem diarria 35 cepas Clostridium spp.

Cura: Resistncia para Penicilina G, Ampicilina, Clindamicina e Amoxicilina/cido clavulnico

91 crianas com diarria 56 cepas Clostridium spp. Teste de susceptibilidade: 10 antibiticos

30 paciente com implantes: - Prevotella intermedia 19 cepas - Porphyromonas gingivalis 7 cepas Teste de susceptibilidade: 8 metais pesados
Ferreira et al. (2004)

Alteraes morfolgicas produzidas por antibiticos em B. fragilis

Clindamicina

Cefoxitina
Pfau & Avila-Campos (2005) Silvestro et al. (2006)

Alteraes morfolgicas produzidas por antibiticos em B. fragilis

54 bezerros sem diarria 92 cepas Bacteroides/Parabacteroides spp. 54 bezerros com diarria 124 cepas Bacteroides/Parabacteroides spp.
Clindamicina Cefoxitina

Teste de susceptibilidade: 12 antibiticos 6 metais pesados

Controle
Silvestro et al. (2006)

Almeida et al. (2007)

5225 cepas amostras clnicas Bacteroides/Parabacteroides spp.

Snydman et al. (2007)

466 cepas amostras clnicas Bacteroides/Parabacteroides spp.

Roh et al. (2009)

114 cepas Bacteroides/Parabacteroides spp. Teste de susceptibilidade: 8 antibiticos Genes de resistncia: cfiA, cepA, tetQ, nim, ermF

Genes de resistncia: cfiA: Carbapenmicos cepA: Cefalosporinas/Penicilina tetQ: Tetraciclina nim: Nitroimidazol (metronidazol) ermF: Clindamicina/Macroldeos
Nakano et al. (2011) Nakano et al. (2011)