Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri Disciplina: Biologia Celular CTD150 Bacharelado em Cincias e Tecnologia

Manual de Aulas Prticas de Biologia Celular / Histologia

Profa. MSc. Vivian Machado Benassi

Diamantina /MG

SUMRIO
Pgina

INTRODUO .............................................................................................................. Aula Prtica no1- Preparao de Lminas para Observao em Microscpios....... Aula Prtica no2- Estrutura Geral das Clulas e Mtodos de Estudo...................... Aula Prtica no 3- Mitocndrias, Retculo Endoplasmtico e Complexo de Golgi Aula Prtica no4- Microvilosidades e Diviso Celular (Mitose)................................

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INTRODUO:

Este manual tem a finalidade de orientar os discentes da disciplina de Biologia Celular/Histologia CTD 150, na iniciao e manuseio do microscpio ptico bem como na preparao, identificao e anlise de diferentes tecidos vegetais e animais e, principalmente, ao estudo dos componentes celulares.

A publicao constituda por itens, distribudos em atividades prticas correlacionadas e complementares s aulas tericas expositivas, sendo um guia indispensvel para os procedimentos necessrios s prticas. Para cada tem foi elaborada uma srie de exerccios complementares de fundamental importncia para a correlao e fixao dos conhecimentos tericos obtidos.

Dedico um agradecimento especial Dra. Maria de Lourdes T. Moraes Polizeli, Professora do Departamento de Biologia, da Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo, pela orientao e ensinamentos a mim dados nesses anos de convivncia e amizade.

AULA PRTICA NO 1

MANUSEIO DO MICROSCPIO PTICO E EXAME DE CLULAS

A palavra microscpio de origem grega (micros = pequeno; scopein = observar com ateno). Sabe-se que o sculo XVII foi um perodo de grande interesse pelos microscpios, sendo essa palavra oficializada na poca, pelos membros da Academia dei Lincei, uma importante sociedade cientfica. Em 1590, os irmos holandeses, Francis e Zacharias Janssen construram o primeiro microscpio ptico composto. Contudo, havia ainda, dvidas sobre a importncia do instrumento para a cincia, uma vez que, o microscpio at ento inventado, possua um pequeno aumento, dessa forma, no permitindo observar coisas realmente novas. Posteriormente, Hooke fabricou um microscpio ptico composto mais aperfeioado ao de Janssen, o qual utilizou para a visualizao da cortia (Figura 1). Apesar de composto (com uma lente ocular e uma objetiva), esse microscpio possua apenas um poder ampliador de 30 vezes.

Figura 1. Esquema representativo do microscpio ptico composto desenvolvido por Hooke.

Por sua vez, o bilogo Anton van Leeuwenhoek, foi considerado o pai ou progenitor da microscopia e, provavelmente, tambm da Bacteriologia. Aps algumas experincias com microscpios compostos, Leeuwenhoek abandonou o seu uso, uma vez que, no era exeqvel uma ampliao superior a 20 ou 30 vezes. Entretanto, a sua percia no polimento de lentes permitiu-lhe construir um microscpio ptico simples (apenas com uma lente de boa qualidade) que ampliava mais de 200 vezes (Figura 2). Foi assim que se tornou um pioneiro na observao de diferentes espcies microscpicas: protistas, algas e bactrias, desenhando-as e posteriormente enviando-as Royal Society de Londres.

Os seus microscpios eram feitos individualmente para cada amostra, e alguns dos seus infinitamente pequenos proporcionavam uma ampliao de cerca de 300 vezes, uma faanha considervel mesmo em comparao com alguns instrumentos modernos.

Figura 2. Esquema representativo do microscpio de Leeuwenhoek.

Um microscpio ptico pode ser simples ou composto: o microscpio simples possui uma nica lente e s fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se est estudando; o microscpio composto consiste de duas ou mais lentes e fornece um aumento muito maior. Observam-se variaes nas formas externas, na capacidade de ampliao e resoluo entre distintos microscpios, contudo os componentes fundamentais so sempre os mesmos. Os Microscpios compostos constituem o tipo mais comum de microscpios e so utilizados para as mais diversas finalidades. Distinguem-se pelas seguintes caractersticas: Ampliaes na faixa de 25x at 1800x. Imagem reversa e invertida. Campo visual pequeno (entre 8,0 a 0,15 mm). Distncia de trabalho na faixa de 10 a 0,3 mm. Iluminao incidente ou transmitida.

PARTES INTEGRANTES DE UM MICROSCPIO COMPOSTO: Um microscpio em sua constituio simples formado por trs elementos: (1) um sistema ptico de ampliao; (2) uma fonte de luz; e (3) um estgio de visualizao. A complexidade total do sistema aumentada dramaticamente quando se tenta aumentar a capacidade de ampliao e a qualidade de imagem. Resumindo: O microscpio composto consiste de partes mecnicas e pticas.

a) Mecnicas: - base ou p: serve para estabilizar o microscpio - coluna ou canho: que se estende da base para cima - platina ou mesa: local onde colocado o objeto a ser examinado. Apresenta o formato redondo ou retangular, fixa, mvel ou giratria no plano horizontal ou com uma parte inferior fixa e outra superior, deslizante. - charriot

b) pticas: prendem-se coluna acima e abaixo da platina - oculares: encaixadas na parte superior do canho formada por lentes convergentes, a qual funciona como uma lupa fornecendo uma imagem virtual e aumentada da imagem real. - objetivas: um conjunto de lentes que apresenta pequena distncia focal e que fornece uma imagem real e aumentada do objeto que observado, em sua maioria trata-se de 2 ou 3 lentes denominadas de pequeno, mdio e grande aumento e uma imerso, com aumento de 90 a 100 vezes, usada com leo de cedro, cujo ndice de refrao maior que o ar e permite um maior aproveitamento dos raios luminosos que incidem sobre o objeto. - condensador - espelho: em muitos microscpios o espelho e a lmpada esto alojados, com segurana, na base do instrumento (Figura 3).

Figura 3. Representao de um microscpio ptico composto.

COMO USAR O MICROSCPIO: 1. Ajuste o charriot de modo a centrar o orifcio da platina (mesa); 2. Coloque a lmina sobre a platina (com a lamnula voltada para cima); 3. Ajuste o charriot de modo a centrar o orifcio da platina; 4. Comece as observaes utilizando a objetiva de menor aumento (panormica); 5. Olhe pela ocular ao mesmo tempo em que a platina lentamente elevada, girando o macromtrico at que a preparao aparea, este parafuso deve ser movido lentamente, a fim de se evitar que a objetiva atinja a lmina e a quebre, ou danifique o equipamento; 6. Melhore o foco girando lentamente o micromtrico. 7. Utilizando o charriot desloque a lmina sobre a platina, a fim de efetuar observaes em toda sua extenso; 8. Gire o revlver e mude para uma objetiva de maior aumento. Proceda com cuidado, para que a objetiva no atinja a lmina. As objetivas secas so perifocais, isto , se o objeto estiver focalizado com uma objetiva estar muito perto de ser focalizado com as outras; 9. Se for necessrio, abaixe ou levante o condensador, abra ou feche o diafragma para obteno de uma melhor imagem possvel. Estas manobras devero ser realizadas com cuidado; 10. Para retirar a lmina do microscpio, gire o revlver de modo a deixar a objetiva panormica em posio de observao. Abaixe a platina, girando o parafuso macromtrico. Remova a lmina com cuidado para que os dedos ou a lmina no toquem nas objetivas do microscpio.

CUIDADOS COM O MICROSCPIO: 1. No arraste o microscpio pela bancada; 2. Verifique se a objetiva de menor aumento est voltada para baixo. Nunca inicie o foco com as objetivas de maior aumento voltadas para baixo, a fim de evitar a quebra da lmina e danificar as lentes; 3. Nunca tente fazer consertos no equipamento, isso exige mo-de-obra qualificada. 4. Nunca desmonte as oculares e/ou objetivas. 5. Aps o uso coloque a capa de proteo no equipamento 6. Nunca saia da sala sem guardar as lminas e o microscpio nos lugares adequados. 7. Voc ser responsvel pelo microscpio que est utilizando, bem como as lminas. 8. Qualquer ocorrncia comunique imediatamente ao professor.

AO FINAL DE CADA AULA PRTICA: 1. Encaixe a objetiva de menor aumento (nunca movimente a platina com a objetiva de maior aumento encaixada). 2. Desa a platina. 3. Desligue a luz; 4. Retire a lmina e guarde-a na caixa. 5. Cubra o microscpio. 6. Deixe seu local limpo e organizado.

LIMITE DE RESOLUO Refere-se menor distncia que pode existir entre dois pontos para que apaream individualizadas na imagem formada pelo sistema ptico utilizado. O limite de resoluo (LR) depende do comprimento de luz utilizado () e da abertura numrica da objetiva (AN). Vale citar que, o olho humano possui um poder de resoluo de, aproximadamente 0,2 mm, enquanto que os microscpios comuns, em geral, tm um limite de resoluo de at 0,25 m. Dessa forma, o limite de resoluo pode ser calculado pela frmula: sendo: k = constante com valor de 0,61; = comprimento de onda da luz empregada (luz branca = 0,55 m); AN = abertura numrica da lente em uso.

LR = k

AN

O Poder de Resoluo (PR) de um aparelho inversamente proporcional ao limite de resoluo (LR), assim PR = 1/LR. A abertura numrica proporcional ao ngulo mximo dos raios que atingem a lente e ao ndice de refrao do meio entre o objeto e a lente. Essa relao pode ser representada como: AN = n . sen sendo: n = ndice de refrao do meio; = ngulo que forma o raio externo captado pela lente.

As lentes objetivas trazem inscries que especificam suas caractersticas. Por exemplo: sendo: 10 = aumento de 10x; 0,22 = valor da abertura numrica; 160 = comprimento mecnico do tubo em mm (distncia da rosca da objetiva at a ocular); 0,17 ( 0,1 mm) = espessura da lmina que ser formada a imagem ntida.
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10/0,22 160/0,17

OBJETIVAS DE IMERSO Denomina-se imerso a tcnica na qual se coloca um fludo (leo especfico) entre a objetiva e o preparado (lmina/lamnula). Este procedimento proporciona um grande aumento na amplitude numrica da objetiva com a melhoria do poder de resoluo do microscpio e da qualidade de imagem. As objetivas de 100x so sempre de imerso. Os fludos de imerso so: leo (n = 1,515), glicerina (n = 1,455) e gua (n = 1,333). Ressaltando que n o ndice de refrao do meio, cujo ar sempre igual a 1,0. Para focalizar com a objetiva de 100x, coloque o revlver na posio intermediria entre a objetiva de 40 e de 100, posteriormente, ponha uma gotcula do leo de imerso sobre a estrutura a ser observada, abaixe a objetiva de 100x e focalize mexendo somente o micromtrico. Ressaltando que ao final da observao, dever limpar com um leno de papel a preparao e a objetiva de 100x, cuidadosamente. No utilize outro tipo de papel, como folha de caderno, papel ofcio, jornal, etc.

Aumento Final proporcionado pelo Microscpio O aumento final oferecido pelo microscpio obtido multiplicando-se o aumento da objetiva pelo da ocular. Vejamos um exemplo: com uma objetiva de 10x e uma ocular de 12,5x, teremos um aumento final de 125x.

Exerccios 1. Como distinguir a objetiva utilizada para a imerso em leo, das demais objetivas? 2. Qual o procedimento utilizado para a focalizao correta de uma preparao com a objetiva de imerso em leo? 3. Por que utilizar leo de imerso? 4. Verifique e identifique as partes do microscpio.

Colorao: O uso de substncias coloridas com capacidade de ligao permite a identificao de componentes qumicos especficos da clula, dando-lhes cor e permitindo sua localizao. Para ser utilizada como corante, uma substncia deve possuir cor prpria e capacidade de ligao com grupos qumicos especficos das clulas ou de seus produtos. A cor apresentada pela molcula atribuda pela presena de grupos cromforos na mesma. Observam-se distintos tipos de colorao: (1) colorao vital, caracterizada por ser feita quando o organismo ainda est vivo, sendo que estes corantes no alteram as estruturas e fisiologia da clula, so exemplos de corantes vitais: ltio carmim, tinta nanquin, azul de Nilo; (2) colorao supra-vital, denominada quando a colorao realizada logo aps a retirada da estrutura a ser analisada, so exemplos de corantes supra-vitais: vermelho neutro, verde janus, azul de tripan e azul de metileno. Em geral, os corantes interagem com os componentes celulares atravs de seus radicais ionizveis, por interao eletrosttica. Quando o radical ionizvel do corante aninico (cargas negativas livres), chamado de Corante cido. Quando o radical ionizvel do corante catinico (cargas positivas livres), chamado de Corante bsico. Colorao dos cortes Alguns reagentes so empregados para a definio do tipo de substncia encontrada em alguns tipos de clulas. Alguns corantes e reagentes: - Azul de Toluidina: corante metacromtico, reage com paredes lignificadas corando-as de azul esverdeado e com paredes celulsicas corando-as em roxo. - Azul de Metileno: um corante vital, ou seja, no mata a clula, por isso recomendado para observao de material vivo, tambm utilizado para corar mucilagem. - Sudan III: reagente para substncias apolares, oleosas ou cerosas (compostos graxos de cadeia longa), que impregnam a parede celular, como a suberina e a cutina. Tambm cora leos armazenados no interior da clula; sua colorao vai do amarelo-alaranjado ao vermelho. - Lugol: proporciona a reao do iodo com os amilos, resultando em uma colorao azul-negra ou marrom escuro.

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PREPARAO DAS LMINAS Inicialmente, a preparao de lminas permanentes decorrncia da extrao do material a ser analisado, o qual passa por procedimentos de desidratao e fixao em suportes, principalmente, parafina. Para que a luz possa atravessar a amostra a ser estudada, os cortes feitos devem ser suficientemente finos e transparentes, para isso, utiliza-se regularmente de um aparelho denominado de micrtomo. Contudo, vale citar que podem ser realizados, tambm, cortes mo livre com o auxilio de uma lmina de barbear ou bisturi e um suporte (isopor, pecolo de embaba, medula do caule de sabugueiro). Os cortes realizados devem ser os mais finos possveis, possibilitando a observao das estruturas. Tipos de seces: para uma boa anise do material a ser estudo, faz-se necessria a observao de vrios planos de corte. Os planos utilizados para seco so: Transversal - perpendicular ao maior eixo do rgo.

Longitudinal radial - paralelo ao maior eixo do rgo partindo do centro do rgo.

Longitudinal tangencial - paralelo ao maior eixo do rgo partindo de um plano paralelo superfcie do mesmo.

Paradrmico - principalmente utilizado para o estudo de folhas, sendo paralelo superfcie.

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Aula Prtica n 1 O desenho permite que voc relembre as suas observaes com mais facilidade. Alm disso, desenhando, voc estar identificando e interpretando as caractersticas que compem uma estrutura complexa, formada por diferentes clulas e estruturas. Inclua os detalhes das clulas individuais, como forma, contedo, etc., assim como, identifique sempre as estruturas e faa uma breve descrio do material. No faa desenhos minsculos, cujos detalhes sero difceis de serem observados - desenhe um nmero menor de clulas, mas com maior riqueza de detalhes. No esquea de identificar o material, indicar o aumento e o corante (quando possvel) utilizados. Estas informaes so necessrias para a correta interpretao do material estudado. No h necessidade de voc desenhar todo o campo observado, e sim um detalhe que represente adequadamente o que est sendo estudado.

1.1 Material a ser observado: Jornal Preparao das lminas: 1. Corte um pedao de jornal, com cerca de 3 mm x 3 mm, que inclua pelo menos uma letra. Se possvel use um pedao que esteja impresso em um lado apenas. Ponha o papel no centro da lmina, com as letras voltadas para cima e sobre ele acrescente uma gota de gua e a lamnula. A lamnula deve encostar-se gota de gua por apenas uma das bordas (45 graus) e ento ser acomodada de forma gradual sobre a gota de gua; 2. Coloque a preparao de maneira que a letra fique no centro da abertura da platina; 3. Olhando lateralmente, abaixe o tubo, at que a lente frontal da objetiva de menor aumento esteja cerca de 0,5 cm distante da lmina. S ento olhe pela ocular e levante vagarosamente o tubo, pelo mecanismo macromtrico, at que a imagem esteja no campo visual. Observao do resultado: a) Compare a posio da imagem da letra quando vista pela ocular e quando vista diretamente. Como ela aparece? b) Olhando pela ocular, mova a lmina da direita para a esquerda vagarosamente. Em que sentido a imagem se move? c) Afaste a lmina de voc. Em que sentido a imagem se move?

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1.2 Preparao e Observao de Clulas Descamadas da Mucosa Oral 1. Coloque uma gota de gua sobre a lmina e com uma esptula de madeira faa uma suave raspagem da mucosa bucal colocando o material colhido sobre gota de gua; 2. Cubra com lamnula e observe ao microscpio, aproximando-se, primeiramente, em um ngulo de 45oC, depois a tombe delicadamente sobre o lquido, evitando a formao de bolhas; 3. Coloque uma gota de Azul de Toluidina em uma das extremidades da lamnula. O corante Azul de Toluidina caracteriza-se por ser um bom corante bsico e generalista, assim como, artificial e heterocromtico (pode corar diferentes componentes celulares de cores diversas, por exemplo, os cromossomas coram de azul, mas alguns polissacardeos podem corar de vermelho). 4. Aguarde alguns minutos e observe ao microscpio; 5. Esquematize uma clula, observando o material com a objetiva de 40x, e indique: o ncleo, citoplasma e o limite celular.

Sem colorao

Com colorao

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1.3 Preparao e Observao de Clulas Vegetais

1.3.1: Fruto de Pimento Vermelho e Verde (Capsicum sp.) Procedimento: 1. Fazer cortes finos do material; 2. Coloque uma gota de gua sobre a lmina e coloque o material colhido sobre gota de gua; 3. Cubra com lamnula e observe ao microscpio, aproximando-se, primeiramente, em um ngulo de 45oC, depois a tombe delicadamente sobre o lquido, evitando a formao de bolhas; 4. Esquematize o que est sendo visualizado utilizando a objetiva de 40x: cromoplastos (vermelhos) e cloroplastos (verdes) em clulas do parnquima.

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1.3.2 Corte de Folha de Epiderme abaxial (dorsal) em vista frontal da folha de Tradescantia pallida 1. Coloque uma gotcula de gua sobre a lmina; 2. Com uma lmina faa um corte superficial na folha vegetal e coloque acima da gota de gua; 3. Cubra com lamnula e observe ao microscpio; 4. Esquematize o que est sendo visualizado utilizando a objetiva de 40x.

Exerccios acerca da Primeira aula Prtica a) Quais foram as dificuldades encontradas na observao das clulas da mucosa antes da colorao? b) Qual o efeito do corante sobre a visualizao das clulas? c) O corante utilizado caracterizado como corante vital ou supra-vital? Explique. d) Quais as principais diferenas entre a clula vegetal e da mucosa?

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