Cromatografia

Definies: Mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura (amostra) entre duas fases: mvel e estacionria. Mtodo fsico de separao, em que os componentes da amostra a serem separados so distribudos entre duas fases, uma estacionria e outra que se move em uma direo definida. Mtodo fsico-qumico de separao que se fundamenta na migrao diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis: fase mvel (gs, lquido ou fluido supercrtico) e fase estacionria (fixa, colocada em uma coluna ou em uma superfcie slida).

Cromatografia Lquida (CLAE) X Cromatografia Gasosa (CGAR)

CGAR Vantagens Baixo custo operacional I. Grande vida til dos equipamentos II. Gasto de 1mL/min de gs alta durabilidade da bala de gs Limitaes Restrito a analitos e derivados volteis termicamente estveis, ou seja, s capaz de analisar uma pequena frao do universo de compostos orgnicos. CLAE Vantagens Analisa cerca de 95% dos compostos orgnicos. OBS: Existem alguns compostos orgnicos que so to lbeis que mesmo com a CLAE no conseguem ser analisados. Por exemplo, existem compostos to instveis que podem se degradar no interior da coluna ou pior, atac-la de alguma maneira. Ento, para substncias muito lbeis, utilizada a CFS (Cromatografia de Fluido Supercrtico), em que utiliza-se CO2 sob presso como fase mvel em condies de temperatura de -30 a -40C. Limitaes Alto custo operacional I. Grande volume gasto de fase mvel II. Fase mvel deve ser de alta pureza, ou seja, tipo HPLC; III. Analitos devem ser solveis na fase mvel (no uma desvantagem propriamente, pois tudo solvel em algo);

IV. V.

Proibida a injeo de substncias gasosas ou volteis, pois formam-se bolhas no meio da corrida e isso prejudica a homogeneidade da fase mvel. Mais lenta que a CGAR

Pode-se dizer que a cromatografia lquida menos salubre que a gasosa devido a maior toxicidade dos solventes usados na lquida. CLAE X CL CLAE Coluna com micropartculas (m) Bombas de alta preciso e exatido Solventes ultra-puros grau HPLC Detectores seletivos e sensveis I. J que existem vrios tipos de detectores, pode haver um encarecimento das anlises, pois para anlises mais detalhadas necessrio ter vrios tipos de detectores. II. A espectrometria de massas em particular muito mais caro na CLAE do que na CGAR, pois o acoplamento do EM na CL mais complicado. OBS: Por que o EM muito mais caro na CL do que na CG? Porque transformar a amostra juntamente com a fase mvel do lquido para uma condio de alto vcuo (ambiente para o funcionamento do EM) bastante complicado.

CL (Cromatografia Lquida Clssica) Passagem da fase mvel por gravidade Uso de tubos de vidro como colunas cromatogrficas Deteco visual Anlise qumica das fraes coletadas Vantagens Menor tempo de anlise Alta resoluo Resultados quantitativos Boa sensibilidade Versatilidade Automao Limitaes Alto custo de instrumentao Alto custo de operao Pouco uso em anlise qualitativa Alto custo de detectores Necessita experincia

Separao Cromatogrfica
Migrao diferencial depende de:

Composio da FM e FE Temperatura Velocidade linear de fluxo

Alargamento da banda cromatogrfica depende de: Difuso por caminhos preferenciais Transferncia de massa da fase mvel Transferncia de massa de fase estacionria Difuso longitudinal

Equao de Van Deemter H=A + B/u + C.u u=velocidade de fluxo A=caminhos preferenciais B=difuso longitudinal C=transferncia de massa entre as fases Comparao de H entre CL e CG

Parmetros Cromatogrficos:

Componentes bsicos do Cromatgrafo Lquido

Reservatrio de FM Injetor Bomba Forno (coluna) Detector Sistema de aquisio de dados

Colunas Cromatogrficas
Analtica Baixas concentraes de amostra (at g/mL) Anlises qualitativas e quantitativas Material de recheio compacto evitando caminhos preferenciais Comprimento: 3 a 60 cm Colunas capilares: dimetro interno de 0,1 a 0,5 mm Colunas comuns: dimetro interno de 4,0 a 8,0 mm Comprimento de 10 a 15 cm, 5 a 3 m Comprimento de 25 a 60 cm, 7 a 10 m

Semi preparativa Obteno de fraes em escala analtica Injeo de amostras na ordem de mg Dimetro interno de 2 a 4 cm Comprimento de at 60 cm

Preparativa Comprimento de 1 a 4 m, 7 a 10 mm de tamanho de partcula Dimetro interno de 10 a 20 cm Bombas de maiores vazes Modo isocrtico ou gradiente, temperatura ambiente Isolamento para identificao, preparo de padres puros, purificao de composto opticamente ativo e ismero de interesse

Fase Estacionria
Slica gel (SiO2) slido poroso I. dimetro da partcula (m) II. dimetro do poro () III. compostos com baixo peso molecular (at 2000) - Dimetro do poro: 50 e 250 (maior que o dimetro da molcula) IV. compostos com alto peso molecular (acima de 2000) - Dimetro do poro: 500 a 4000 Grupos siloxana O-Si-O Grupos silanol SiOH Pouco solvel em solventes orgnicos I. metanol, acetonitrila, THF, hexano, diclorometano... cido fraco pka = 9,5 I. pH > 8 ou 9 - a slica solvel

Na cromatografia gasosa utiliza-se um gradiente de temperatura a fim de que se parta de uma condio de alta separao em direo a uma condio de baixa separao. Isto feito para acelerar a chegada ao final do cromatograma. Ento, deve-se trabalhar com uma fase mvel mais fraca no incio e uma forte no final. Coluna clssica partculas irregulares Coluna analtica partculas esfricas (evita caminhos preferenciais) Quanto menor o dimetro de partcula, maior a rea de contato com a fase mvel e a amostra e, consequentemente, maior o grau de separao. No entanto, em tais condies necessita-se de bombas de alta presso. Transferncia de Massa em Partculas Porosas

Tanto a entrada e quanto a sada de amostra da fase estacionria devem ser rpidas, caso contrrio fenmenos de transferncia de massa contribuiro para o alargamento do pico. TROCA RPIDA = PICO BEM RESOLVIDO Caso a partcula seja grande e porosa a transferncia de massa ser lenta e o pico ser alargado. A ideia de trabalhar com partculas cujo dp<2m que o tempo de residncia dentro da partcula seja menor. Quanto maior a velocidade de troca maior ser a eficincia de separao. Alm de fases estacionrias com partculas porosas pequenas tambm existem partculas grandes superficialmente porosas. A vantagem deste tipo de fase que aumenta-se a eficincia de separao (em relao uma coluna normal), pois a velocidade de troca relativamente alta e no necessrio bombas de alta presso. Apesar destas fases no serem melhores que as de partculas totalmente porosas de 2 m, so bem melhores que as de partculas grandes totalmente porosas.

Quanto menor a partcula da fase estacionria, maior a faixa de velocidade tima da fase mvel.

Cromatografia de Fase Ligada

Solvente A = Fraco (hexano) / Solvente B = Forte (ter)

I.

fora da FM: MeOH,THF > ACN >ter > diclorometano > clorofrmio > hexano, heptano, octano fora da FE: slica (mais polar) = alumina >> amino > diol > ciano

II.

Como a fase estacionria quimicamente ligada superfcie do suporte, no h mais solubilidade da fase estacionria na fase mvel. O mecanismo principal desta tcnica baseia-se na partio. Por outro lado, como esta fase estacionria tambm apresenta influncia de grupos ativos (polares) da superfcie (isto , tambm ocorre o mecanismo de adsoro), a maioria dos pesquisadores considera esta tcnica um mtodo separado.

Gradiente de Concentrao No incio da corrida cromatogrfica as molculas que interagem bem com a fase estacionria ficam aderidas na mesma e as que no interagem bem continuam sua migrao com a fase mvel. Decorrido certo tempo aps o incio h a separao dos componentes da amostra e a formao de fraes. Quando as fraes se formam, no h necessidade de continuar separando ainda mais estas fraes at o fim da corrida. Uma vez separados, podese acelerar a corrida utilizando um gradiente de concentrao. Ao acelerar a corrida as velocidades de migrao dos componentes da amostra tornam-se semelhantes, mas isso no prejudica as fraes j separadas, pois aqueles que possuam a maior velocidade de migrao continuaro a frente do restante. Ento, se a amostra j foi separada no incio da corrida, no preciso separ-la ainda mais no final. No caso de uma fase mvel H2O/MeOH, a medida que a corrida acontece aumenta-se o teor de metanol, pois ele mais apolar que a gua e consegue remover as molculas que ficaram aderidas na fase estacionria. Portanto, comea-se com um alto teor de gua para que se separe o mximo possvel logo no incio da coluna.

Cromatografia de Fase Normal

Pode-se dizer que a cromatografia de fase normal um tipo de fase ligada, s que polar. A grande vantagem da fase ligada a ampla gama de fases possveis de serem utilizadas, contanto que se saiba fazer isto quimicamente.

Na cromatografia lquida, quanto maior a diferena de polaridade entre a fase estacionria e a fase mvel, melhor ser o grau de separao. Fase Estacionria (polar) Ex: slica, alumina, amino, ciano, diol Fase Mvel (apolar) Ex: hexano, diclorometano, orgnicos Tipo de compostos separados Insolveis em gua, ismeros orgnicos

Cromatografia de Fase Reversa

Fase estacionria: apolar Ex: C18, C8, C4, Fenil Fase mvel (polar) gua e modificadores orgnicos miscveis Tipos de compostos Neutros, cidos e bases fracas e outros

Compostos Ionizados Aumento de pH I. amostras cidas perdem o prton II. reteno dos cidos diminuem III. reteno das bases aumentam Diminuio do pH I. amostras bsicas ganham o prton Reteno de compostos ionizados I. pH do tampo II. concentrao do tampo III. pka da amostra

Um fator importantssimo neste tipo de cromatografia lquida o capeamento da fase estacionria. Durante as reaes para pr substituintes na fase estacionria h a possibilidade de restar algum grupo silanol no substitudo, o que pode prejudicar a eficincia da separao. Dentre as possveis solues esto: Reagir novamente para substituir o restante; Colocar grupos de proteo que impeam o acesso ao silanol na superfcie da slica. Ex: isobutil (aumenta a cobertura da coluna) No capeamento a slica atua apenas como suporte, ela no a fase estacionria.

Porcentagem de Carbono A eficincia da fase reversa expressa com base na % de carbono. Quanto mais se regula a polaridade da coluna, maior a % de carbono e o fator de capacidade para molculas apolares. Pr-coluna uma pequena coluna posta anteriormente coluna cromatogrfica para evitar que qualquer substncia que danifique a coluna a alcance. Quando houver algum problema basta substituir por outra pr-coluna. Com esta pequena coluna h o aumento da vida til da coluna cromatogrfica. Solvente A Fraco aquele solvente que no interage bem com a fase estacionria Solvente B Forte aquele solvente que estraga a cromatografia, ou seja, ele arranca com facilidade as molculas presentes na fase estacionria. Dissolve bem Fora de eluio: THF > MeOH > ACN

Seletividade do solvente. Efeitos de variao de composio da fase mvel na separao hipottica de compostos no ionizados. Condies: 15 x 0,46 cm C18, fluxo 1,5 ml/min.

Ao injetar 100% de ACN no h separao alguma. medida que h o aumento do teor de gua a separao torna-se cada vez melhor. Como a fase reversa, quanto maior o teor de gua, mais as molculas que tem boa interao com a fase estacionria ficaro retidas. A substncia 1 possui baixa interao com a FE, ento em qualquer outra condio seu tempo de reteno ser aproximadamente o mesmo.

Nos cromatogramas a e b acima foram utilizadas eluies isocrtica e com gradiente de fase mvel, respectivamente. Percebe-se que no cromatograma b os picos so mais bem resolvidos e o tempo de anlise menor. Em termos de anlise quantitativa houve uma melhora na relao sinal/rudo, causando uma diminuio na incerteza da medida da rea. Quando um pico muito achatado fica difcil distinguir entre linha de base e pico propriamente dito. Portanto, h um aumento na certeza da medida quantitativa.

Cromatografia de Par inico Adio de um composto inico fase mvel modifica a polaridade da coluna cromatogrfica, transformando-a de fase reversa em fase normal. Este composto pode ser carregado positivamente ou negativamente, dependendo do que se quer separar. Exemplos de par inico: R-SO3- (cido alquilsulfnico) TBA (tetrabutilamnio) medida que estes compostos passam pela fase estacionria atravs da fase mvel eles, como qualquer outra substncia, passam por um equilbrio de dissoluo/sada ao longo da coluna. J que eles esto presentes na FM, tambm estaro sempre presentes na FE. Aps a adio do par inico a fase que antes era reversa torna-se polar (negativa ou positiva; depende do on utilizado) O interessante desta fase que caso deseje-se trabalhar com uma fase normal no h necessidade de trocar de coluna. Pode-se dizer que a fase reversa tem ganhado cada vez mais espao no mercado, pois com ela tambm possvel trabalhar com fase normal.

Vantagem: utilizao de uma nica coluna. Padronizao Interna A padronizao interna uma tcnica na qual um padro injetado concomitantemente amostra desconhecida, isto , ele dissolvido na prpria amostra e servir de base para os clculos quantitativos do alvo analtico a partir de uma relao de reas. Esse mtodo de quantificao ideal para procedimentos com mtodo de preparo muito complicados, pois o risco de perda de analito durante o processo grande. Quando o padro interno adicionado no incio do processo, este sofrer as mesmas perdas que o analito, mantendo a razo manalito/mPI inalterada. Na CG sempre bom utilizar padronizao interna devido aos diferentes volumes de injeo. Escolha do Padro Interno (adicionado no incio): No pode estar presente na amostra; Ter estrutura semelhante ao analito; No coeluir, ou seja, ser bem resolvido; 1. Quando se trabalha com o EM isso se torna relativo, j que pode-se observar o espectro de massas de um fragmento existente apenas no analito e no no padro interno, ou vice-versa. Pico Gaussiano A disperso das molculas um fenmeno probabilstico, ou seja, a difuso das molculas para o alargamento do pico aleatrio, pois elas podem ir para qualquer direo. A difuso s no totalmente aleatria devido a distoro causada pelo movimento da fase mvel. Se a fase mvel estivesse parada o formato seria perfeitamente gaussiano. A curva da distribuio das molculas no a curva do pico cromatogrfico (um pouco distorcido), mas igual a prpria curva gaussiana, pois ela a distribuio de probabilidade. Portanto, o fenmeno de disperso tem um formato gaussiano pelo fato deste ser um fenmeno probabilstico. A probabilidade descrita pela curva gaussiana.

2 Apresentao Slide 5 No cromatograma com 20% B v-se claramente a presena de dois grupos de compostos: carregados e neutros. Levando em considerao que todos os compostos analisados possuem carter bsico, os compostos de 1 a 4 esto protonados (pH<pKa), tendo um menor tempo de reteno, enquanto os compostos de 5 a 8 esto neutros (pH>pKa), tendo um maior tempo de reteno.

No cromatograma com 40% houve uma alterao expressiva no tempo de reteno do grupo de compostos neutros. Isso se deve ao fato Slide 8 A fase aquosa e o tampo so fundamentais para manter o equilbrio de cargas. Com a diminuio do pH h o aumento do tempo de reteno das bases, enquanto que com o aumento do pH h o aumento do tempo de reteno dos cidos, dependendo dos pks de cada composto. Slide 9 No caso da cromatografia de troca inica, por que a utilizao de tampes volteis na cromatografia preparativa? O objetivo da cromatografia preparativa fracionar a amostra e purificar a frao desejada. Quando um tampo introduzido amostra, mesmo com o processo de purificao, ainda estar presente na amostra, sendo considerado, assim, uma impureza. Desse modo, se o tampo for voltil bastar aquecer a amostra para elimin-los (este procedimento ainda mais simples quando o tampo inorgnico carbonato de amnio, nitrato de amnio). OBS: Na cromatografia preparativa no h interesse em caracterizar (anlise qualitativa) as fraes obtidas. Slide 11 Fases que no so a base de slica. Polmeros aninicos e catinicos so utilizados em troca inica. Slide 12 Quando h gases dissolvidos no solvente e este comprimido formam-se bolhas e, caso estas bolhas cheguem ao pisto da bomba, o volume de FM alterado. Os filtros evitam que partculas slidas cheguem coluna. No se pode deixar entrar bolha nem slidos na coluna em cromatografia lquida. Slide 13 O sistema de vlvula, como em sistema de injeo na cromatografia, s serve quando a amostra est na mesma fase que a fase mvel, ou seja, lquido para lquido ou gs para gs. Slide 14 Excntrico pea que gira em torno de um eixo fora do centro. O esquema acima mostra como o pisto puxa o solvente do reservatrio e envia para a coluna. Deve-se ter bastante cuidado, pois no se pode puxar da coluna e mandar para o reservatrio. De acordo com a imagem, a parte superior estaria conectada coluna e a inferior ao reservatrio.

Evita-se a entrada de partculas slidas na bomba, pois elas podem atrapalhar o movimento das esferas (passagem do lquido) e ainda arranhar o pisto. Slide 15 Com uma bomba de 2 pistes tem-se um fluxo mais suave. Em vez de trabalhar com mais de 2 pistes utiliza-se um sistema de amortecimento, como pr um tubo em espiral na sada da bomba (entre a bomba e a coluna) ou um diafragma, pois este absorvem a pulsao mecanicamente. Slide 21 Por que o EM muito mais caro na CL do que na CG? Porque transformar a amostra juntamente com a fase mvel do lquido para uma condio de alto vcuo (ambiente para o funcionamento do massas) bastante complicado. Slide 22 Maior relao sinal/rudo Toda linha de base possui rudo. Quando tem-se um pico achatado o erro introduzido no clculo da rea muito maior. Portanto, quanto mais fino for o pico, menos incerteza incorporada ao clculo da rea. Slide 26 O detector UV/Visvel pode atuar de duas maneiras: arranjo de diodos (em que apenas um comprimento de onda lido) ou varredura de comprimentos de onda (espectro) do que est saindo. A 2 opo a mais adequada quando se quer fazer uma anlise qualitativa, pois o espectro caracterstico de cada substncia. OBS: Todo volume adicional que se teria em uma tubulao simples, ou seja, que se poderia ter ao longo do percurso. O engate da clula deve ser perfeito para que o no haja a expanso nem a compresso do fluxo do gs. Toda conexo que no for bem feita gera uma zona de turbulncia no fluxo (fluxo irregular), favorecendo o alargamento do pico. Portanto, toda conexo potencialmente uma zona que ir piorar o cromatograma, sendo que, quanto menos conexes melhor. interessante utilizar um sistema de conexes cujo fabricante tenha minimizado estes efeitos. Slide 28 Rede de difrao mvel e um sistema de espelhos e fendas para selecionar o que passar pela clula de amostra e a clula de referncia (sistema de varredura). Este sistema est caindo em desuso devido ao sistema de arranjo de diodos. A ideia que a movimentao da rede alteraria o comprimento de onda que chega clula de amostra.

Slide 29 Assim como o sistema de varredura, o arranjo de diodos tambm possui uma rede de difrao, em que h a disperso da radiao. No entanto, diferentemente do sistema de varredura, ele possui um conjunto de detectores chamado de conjunto de fotodiodos, em que l-se todos os comprimentos de onda de uma vez s (como se fosse uma fotografia do espectro). Outra vantagem que o arranjo de diodos no tem partes mveis, tendo um menor desgaste mecnico. Slide 30 No to bom quanto o EM, mas tambm fornece informaes quantitativas. O detector de UV/vis timo para cromatogramas bem resolvidos, ou seja, com poucas co-eluies. Para amostras muito complexas como soro, sangue, extratos vegetais, etc, o UV/vis no adequado, pois a probabilidade da haver co-eluio alta. Slide 31 No detector de fluorescncia a fonte envia radiao em um dado comprimento de onda para amostra e, caso um dos componentes desta seja fluorescente, ser emitido um outro comprimento de onda, sendo este o comprimento registrado. Sendo assim, com esse detector no h interferncia do sinal da fonte, pois a leitura realizada no do comprimento emitido pela fonte. Portanto, pode-se dizer que este detector extremamente seletivo (ideal para), pois s haver sinal se algum componente da amostra estiver emitindo. Este detector ideal para amostras complexas, onde trabalha-se com uma rotina e quando sabe-se exatamente o que se quer analisar. Slide 33 Este detector no possui alta sensibilidade, a no ser por substncias que impe um grande desvio, tais como acares e polmeros. No permite gradiente de fase mvel, ou seja, s funciona bem em corridas isocrticas. Extremamente sensvel a variao do solvente. Slide 34 Principal Problema: achar uma fase mvel que possa trabalhar em infravermelho. Ex: CS2 e CO2. Talvez seja ideal para CFS