CIENTEC Revista de Cincia, Tecnologia e Humanidades do IFPE - v. 4, n.

1 Julho de 2012

CINTICA DE CRESCIMENTO, E LIPIDEOS TOTAIS DE Bacillus licheniformis CULTIVADO COM DIFERENTES FONTES DE CARBONO E NITROGNIO
SILVA, Grayce Kelli Barbosa 1; LIMA , Jaceline Maria de Negreiros 1; THUMS, Narjara 1; SHIOSAKI, Ricardo Kenji 1; OKADA, Kaoru 1; TAKAKI, Galba Maia de Campos 1.
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Ncleo de Pesquisas em Cincias Ambientais NPCIAMB .

Resumo

Os microrganismos esto presentes nos diversos ambientes, caracterizados por sua versatilidade metablica e fisiolgica, desempenham uma funo importante na remoo de compostos do petrleo introduzidos pelo homem no ambiente. Nos reservatrios da indstria de petrleo o crescimento de microrganismos introduz uma srie de problemas de ordem tcnica, resultando conseqentemente na formao de biofilme e a corroso. Com objetivo de realizar a caracterizao bioqumica de microrganismos produtores de biosurfactantes, isolados de reas contaminadas com derivados de petrleo, neste trabalho foi analisada a cintica de crescimento de Bacillus licheniformis e o perfil de lipdeos totais, atravs da biomassa e das Unidades Formadoras de Colnias (UFC). Foi observado que no meio com suplementao 1 maior crescimento da populao microbiana foi observado aps 60 horas de cultivo e 36 horas quando cultivado com suplementao 2. E o percentual de lipdios totais foi maior quando cultivado no meio com suplementao 1 (9,17%). Palavras-chave: Bacillus licheniformis; lipdeos totais; biosurfactantes

Abstract

Microorganisms are present in different environments, characterized by their metabolic and physiological versatility, play an important role in the removal of petroleum compounds in the environment introduced by man. Reservoirs in the petroleum industry growth of microorganisms introduced a number of technical problems, consequently resulting in biofilm formation and corrosion. In order to perform biochemical characterization of microorganisms producing biosurfactants isolated from areas contaminated with petroleum derivatives, this study analyzed the growth kinetics of Bacillus licheniformis and the profile of lipids, through biomass and colony forming units (CFU ). It was observed that in the middle with a supplementation of higher growth of microbial population was observed after 60 hours and 36 hours when grown with supplemental 2. And the percentage of total lipids was higher when cultured in medium supplemented with 1 (9.17%). Keywords: Bacillus licheniformis; total lipids; biosurfactants.

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grayce_kelli@yahoo.com.br

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1. Introduo
O Bacillus licheniformis uma bactria gram-positiva, termfila, no patognica, encontrada no solo, podendo ser isolado quase em toda parte de devido os seus esporos internos altamente resistentes disseminados com a poeira (VEITH et al., 2004). O Bacillus licheniformis apresenta um grande potencial em relao produo de biosurfactantes, tem demonstrado resultados satisfatrios, degradando boa parte dos hidrocarbonetos testados em vrios experimentos (MAKKAR; CAMEOTRA, 1998). Os biosurfactantes so um grupo de compostos qumicos produzidos por diversos microrganismos como bactrias, fungos e leveduras, com aplicaes industriais, no controle da poluio ambiental, entre outras (BANAT, et al., 2000; MULLIGAN, 2005). Em bactrias so encontrados vrios tipos de cidos graxos, eles so classificados de acordo com o nmero de tomos de carbono, o nmero e a posio das duplas ligaes na cadeia de carbono e a presena de grupos funcionais. Alguns cidos graxos so utilizados pelas bactrias para sntese de fosfolipdios que so necessrios para a construo da parede celular (SUZUKI et al., 1993). Com objetivo de realizar a caracterizao bioqumica de microrganismos produtores de Biosurfactantes, isolados de reas contaminadas com derivados de petrleo, neste trabalho

foi analisada a cintica de crescimento de Bacillus licheniformis e o perfil de lipdeos totais.

2. Material e Mtodos ou Metodologia

2.1 Microrganismo
Foi utilizada amostra de Bacillus licheniformis, (UCP 1023), isolada do Porto do Recife com reas contaminadas por petrleo, pertencentes ao Banco de Culturas do Ncleo de Pesquisas em Cincias Ambientais (NPCIAMB), UNICAP/ PE, Brasil, mantido em meio Luria Bertani (SAMBROOK et al., 1989).

2.2 Produo dos lipdeos e cintica de crescimento (biomassa)

Foi utilizado o meio mineral suplementado NaCl - 5,0g ; K2HPO4 - 1,0 g ; NH4H2PO4 - 1,0g ; (NH4)2SO4 - 1,0g; MgSO4. 7H2O - 0,2g; KNO3 - 1,0g; gua destilada - 1000ml; pH - 5,6 0,2 a 25C. Com diferentes suplementaes de carbono e nitrognio, suplementao 1 - Carbono: glicose 1%, Nitrognio: asparagina 0,2 %, suplementao 2 - Carbono: milhocina 1 %, Nitrognio: cido glutmico 0,2%.
A amostra do Bacillus licheniformis foi

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inoculada em frascos de Erlenmeyer contendo meio mineral suplementado com as diferentes suplementaes de carbono e nitrognio 1 e 2. Os frascos foram incubados em cmara agitadora incubadora regulada para 150rpm em 37C, e no intervalo de 12 e 12h foram tomadas, em condies asspticas, alquotas de 2ml em duplicata da cultura com o objetivo da determinao de cintica crescimento e aumento de biomassa atravs do peso seco. Ao final do perodo de incubao dos meios suplementados com diferentes fontes de carbono 1 e 2, as clulas foram centrifugadas a 1.700x por 10mim a 4C. A massa celular foi submetida liofilizao para a extrao e anlise de lipdeos.

g da biomassa liofilizada foram submetidas a extraes sucessivas de lipdeos por trs vezes, usando vinte volumes de clorofrmio: metanol (2:1; 1:1; 1:2 v/v). O material foi agitado por 15 minutos, posteriormente homogeneizado por 24 horas, aps cada troca de solvente. Os extratos foram reunidos e combinados e evaporados ate a secura no rotoevaporador. Em seguida 1 a 2 ml de Hexano, foi utilizado para recuperar os lipdeos, que depois foram evaporados sob atmosfera de nitrognio e mantidos no dessecador at peso constante. O contedo de lipdeos totais foi estimado por gravimetria.

2.3 Cintica de crescimento mtodo de Unidades Formadoras de Colnias (UFC)

Para o estudo da cintica de crescimento foi utilizado o meio Agar nutritivo A N (peptona, 5,0 g; extrato de carne, 3,0 g; glicose, 5,0 g; gar, 15,0 g; pH 7,00,2). A determinao do crescimento foi realizada atravs da utilizao da tcnica do plaqueamento em profundidade Pour Plate (PARISI et al., 1973).

3. Resultados e discusso
A amostra do Bacillus licheniformis (UCP 1023) utilizada neste estudo apresentou todas as caractersticas morfolgicas tpicas da sua espcie. As alquotas retiradas nos intervalos de 12 e 12 horas apresentaram para o meio mineral com as suplementaes 1 e 2, os seguintes resultados de peso seco descritos na tabela 1. Dessa forma foi verificado que aps 60 horas de cultivo em meio com suplementao 1, e de 36 horas, com suplementao 2, observou-se o maior crescimento do microrganismo, como demonstrado na figura 1.

2.4 Extrao dos Lipdeos Totais

Os lipdeos foram extrados de acordo com o mtodo descrito por Manocha et al, 1980. 1,0

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Figura 1. Curva de crescimento do Bacillus licheniformis em meio mineral com as suplementaes 1 e 2, obtida atravs da biomassa.

Figura 2. Curva de crescimento do Bacillus licheniformis em meio mineral com as suplementaes 1 e 2, obtida atravs da contagem das unidades formadoras de colnias (UFC).

Tabela 1. Resultados obtidos das alquotas retiradas nos intervalos de 12 e 12 horas.

O resultado do estudo da cintica de crescimento atravs do mtodo de unidades formadoras de colnias (UFC) esto na demonstrado na tabela 2 e figura 2. Na figura 2 foi observado que durante o perodo inicial do crescimento do microrganismo

as clulas do meio com a suplementao 1, se encontram na fase de latncia entre 12 e 24 horas, no ocorrendo multiplicao das mesmas, isto por que, durante o perodo que inoculao foi feita ao meio de cultura, as mesmas passaram por um perodo de adaptao ao novo meio, no tempo 24 at 48 horas as clulas entraram na fase exponencial, fase esta que a taxa de crescimento da populao microbiana tornase constante, isto , elas sofrem diviso e o seu nmero duplica aps um determinado intervalo de tempo. E a partir do tempo 48 horas as clulas se encontram em seu desenvolvimento mximo encontrando-se na fase estacionria, ocorrendo

Tabela 2. Unidades Formadoras de Colnias (UFC) X tempo, nas suplementaes 1 e 2.

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um rpido decrscimo na taxa de diviso celular, apontando que o nmero total de clulas em diviso igual ao nmero de clulas mortas, resultando na verdadeira populao celular estacionria. O mesmo comportamento tambm foi observado no meio com a suplementao 2 no perodo entre de 12 a 24 horas o microrganismo se encontra na fase de latncia e que o mesmo s comea entrar na fase exponencial aps 24 horas chegando a seu desenvolvimento mximo em 36 horas e que a partir deste tempo as clulas comeam entrar na fase estacionaria. Os resultados obtidos para os lipdios totais esto apresentados na Tabela 2, e variaram de 9,17% para o cultivo do Bacillus licheniformis em meio com suplementao 1, a 8,54% para o cultivo em meio com a suplementao 2. Os valores de lipdeos totais obtidos para as diferentes suplementaes no foram muito significativas, pois a diferena do teor de lipdeos do meio com a suplementao 1 apresentou apenas 6,3 % acima do teor obtido no cultivo com suplementao 2.

4. Concluses
A amostra de Bacillus licheniformis apresentou crescimento mais rpido no meio suplementado com glicose e asparagina, entretanto no meio suplementado com milhocina e acido glutmico foi obtido a maior biomassa. A variao da suplementao no meio no influenciou no percentual de lipdeos totais da biomassa.

Agradecimentos
Aos rgos financiadores UNICAP; FACEP; FINEP; CNPq

Referncias
BANAT, I. M.; MAKKAR, R.S.; CAMEOTRA, S.S. Microbial production of surfactants and their commercial potencial. APPL MICROBIOL BIOTECHNOL. New York, v. 53, p.495-508, 2000. MAKKAR, R. S.; CAMEOTRA, S.S. An update on the use of unconventional substrates for biosurfactant production and their new applications. APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL. New York, v. 58, p.428-434. 2002. MANOCHA, M. S.; SAN-BLAS, G.; CENTENO, S. Lipid composition of Paracoccidioides brasiliensis: possible correlation with virulence of different strains. J. GEN. MICROBIOL. Sabouraudia, v. 117:147-154,1980.

Tabela 3. Contedos de lipdeos totais em % de (1,0g) da biomassa de Bacillus licheniformis (UCP 1023) cultivada em meio mineral com as diferentes suplementaes, obtidos por gravimetria.

MULLIGAN, C.N. Environmental applications for biosurfactants. ENVIRONMENTAL POLLUTION. Canada, v.133, p.183-198, 2005.

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PARISI, J. T.; BALDWIN, J.N.; SOTTILE M. Pour-Plate Method for the Detection of Coagulate Production by Staphylococcus aureus. APPLIED MICROBIOLOGY, USA, v.25, n.4, p. 558-561, 1973. SAMBROOK, J.; FRITSH, E. F.; MANIATIS, T. MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL. 2. Ed. New York: Cold Spring Harbor, 1989. SUZUKI, K.; GOODFELLOW, M.; ODONNELL, A. G. Cell envelopes and classication. HANDBOOK OF NEW BACTERIAL SYSTEMATIC. London, p. 195-249, 1993. VEITH, B., HERZBERG, C., STECKEL, S., FEESCHE, J., MAURER, K. H., EHRENREICH, P., BUMER, S., HENNE, A., LIESEGANG, H., MERKL, R., EHRENREICH, A., GOTTSCHALK, G. The Complete Genome Sequence Of Bacillus Licheniformis Dsm13, An Organism With Great Industrial Potential. J. MOL. MICROBIAL. BIOTECHNOLOGY. New York, p. 204-211, 2004.

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