Escola Secundria de Castro Verde

2011/2012

Atividade Laboratorial:

COLORAO DE GRAM
Geologia e Biologia A
11 Ano

Professor Responsvel: Rosa Faleiro

Relatrio realizado por: Lus Esprito Santo n12, 11A

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2011/2012

ndice
ndice 1

Objectivos

Introduo Terica

Materiais e Reagentes

Procedimento Experimental

Observaes

Referencias Bibliogrficas

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2011/2012

Objectivos
Desenvolver capacidades, a tcnica de preparao de esfregaos e o mtodo de colorao de Gram, sabendo classificar bactrias de acordo com a colorao. Classificar, quanto ao tipo de Gram, as bactrias presentes no iogurte natural. Aperfeioar a tcnica associada a utilizao do microscpio tico, observando as bactrias aps a colorao de Gram.

Introduo Terica
A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 por Hans Christian Joachim Gram, mdico e bacteriologista dinamarqus. Esta tcnica consiste na imerso sucessiva do esfregao bacteriano, fixado pelo calor, nos reagentes: violeta cristal (corante primrio ou corante bsico), soluo de lugol (mordente ou fixador), etanol/acetona (solvente ou agente descorante) e fucsina de Ziehl (corante secundrio ou agente contrastante). O mtodo de Gram uma das mais importantes tcnicas de colorao em microbiologia mdica e a sua principal utilidade a classificao das bactrias em dois grupos: as Gram-positivas (Gram+) e as Gram-negativas (Gram-), pois, sendo um procedimento de colorao diferencial, colora de forma diferente, diferentes tipos de clulas. Essa diferena deve-se sobretudo a desigualdades estruturais nas paredes celulares das diferentes bactrias. As bactrias Gram+ possuem uma parede mais espessa e homognea constituda principalmente por peptidoglicana. A parede celular das bactrias do tipo Gram- est estruturada em duas subcamadas: uma interna composta tambm por peptidoglicana, mais fina que a parede das bactrias Gram+, e uma outra subcamada mais externa formada principalmente por lipopolissacardeos. Peptidoglicana, tambm denominada peptideoglicana, (peptidoglicano ou peptideoglicano no singular) um heteropolissacardeo rgido e insolvel na gua, formado por dois acares aminados (cido n-acetilglucosamina e cido

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2011/2012 n-acetilmurmico) ligados entre si por ligaes glicosdicas formando cadeias lineares que se ligam entre si atravs de cadeias de quatro aminocidos. o principal constituinte da parede celular dos procariontes. As bactrias so emergidas no corante bsico, o Cristal Violeta, e seguidamente tratadas com um fixador, o lugol, que possui a funo de fixar o corante. Tanto bactrias Gram+ quanto Gram- absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma colorao violeta devido formao do complexo Cristal Violeta - Iodo (CV-I), nos seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol ou a acetona. Nas bactrias Gram-, o solvente orgnico dissolve a camada externa lipopolissacardica, deixando tambm pequenos buracos na fina camada peptidoglicnica pelos quais o complexo CV-I se escapa, descolorando as primrio, ficando, assim, incolores at serem contra coradas com o agente contrastante, a Fucsina de Ziehl.
fig.1 - Bactrias Gram-

Por outro lado, no caso das bactrias Gram+, o solvente desidrata as espessas paredes celulares e provoca a contrao dos poros, tornando, assim, a parede celular impermevel ao complexo

impedindo a remoo deste atravs da parede celular. Assim as bactrias do tipo Gram+ retm o
fig.2 - Bactrias Gram+

corante e permanecem pigmentadas de prpura.

A reao de uma bactria colorao de Gram fornece informaes importantes para o tratamento de certas doenas, uma vez que bactrias Gram+ tendem a ser mortas facilmente por antibiticos tais como as penicilinas e as cefalosporinas, enquanto que as bactrias Gram- geralmente mostram-se mais resistentes a antibiticos, pois estes no conseguem penetrar na camada de lipopolissacardeos. Em suma a reteno ou no do corante primrio depende, portanto, das propriedades das paredes celulares bacterianas. Ao microscpio, as clulas Gram+ aparecero coradas em violeta e as Gram- em rosa.

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Material e Reagentes
Material:
- Lmina (1); - Ansa de inoculao (1); - Tina de Colorao (1); - Lamparina (1); - Fsforos; - Papel de limpeza;

Reagentes:
- Soluo de violeta-de-cristal; - Soluo de lugol; - lcool a 95%; - Soluo de safranina;

Equipamento:
Microscpio tico Composto (MOC);

Nota: a soluo de violeta de cristal pode ser substituda por o azul de metileno;
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a soluo de safranina pode ser substituda por a fucsina de Ziehl; no se colocou o leo de imerso nos reagentes nem nos materiais pois a sua utilizao no obrigatria para o sucesso da experincia;

opcional,

Procedimento Experimental
Preparao e fixao do esfregao
1 Passo - Colocou-se uma gota de gua numa lmina; 2 Passo - Com uma ansa de inoculao, tornar homogneo o iogurte e retirou-se uma gota; 3 Passo - Colocou-se a gota de iogurte sobre a gota de gua e espalhou-se de maneira a formar o esfregao; 4 Passo - Secou-se o esfregao ao ar durante alguns minutos. 5 Passo - De seguida fixou-se o esfregao, inundando a lmina com lcool durante 5 minutos; 6 Passo - Secou-se a preparao ao ar mais uma vez.

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2010/2011

Colorao de Gram
1 Passo - Colocou-se a lmina na tina de colorao e inundou-se a preparao com a soluo de violeta-de-cristal, deixando atuar durante um minuto; 2 Passo - Escorreu-se e removeu-se o corante do esfregao, colocando a lmina paralelamente ao fio de gua de uma torneira pouco aberta; 3 Passo - Cobriu-se com a soluo de lugol e deixou-se atuar durante um minuto; 4 Passo - Escorreu-se o lugol; 5 Passo - Aplicou-se o lcool gota a gota e deixou-se atuar apenas trinta segundos; 6 Passo - Lavou-se cuidadosamente o esfregao uma vez mais tal como no passo 2; 7 Passo - Inundou-se com a soluo de safranina e esperou-se dois minutos; 8 Passo - Lavou-se uma ltima vez a preparao tal como nos passos 2 e 6; 9 Passo - Secou-se a preparao junto corrente ascendente da chama de uma lamparina.

Observao ao Microscpio
1 Passo - Colocou-se o microscpio numa posio que permitisse reflexo de luz solar no espelho; 2 Passo - Aps baixar a mesa (platina) do MOC colocou-se a preparao; 3 Passo - Focalizou-se usando o parafuso macromtrico e ajustou-se o foco com a ajuda do parafuso micromtrico; 4 Passo - Visualizou-se a preparao com as objetivas de menor ampliao; 5 Passo - Aplicou-se uma gota de leo de imerso sobre a preparao, mergulhou-se a lente da objetiva de 100X no leo e observou-se;

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Observaes
Um caso de "falso Gram-" pode ser causado por factores tais como o estado de vida, a condio de sade, ou a idade das clulas, ou at o tempo de exposio ao solvente. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram+" s so obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. O uso de uma amostra nova e saudvel, o controlo do tempo em que a amostra est emersa nos reagentes e o seguimento do procedimento experimental risca so medidas necessrias para garantir o sucesso da experincia e a veracidade dos resultados.

Referncias Bibliogrficas
Para este trabalho consultou-se: - MARTINS, Osrio, et al, Biologia 11, Biologia e Geologia Biologia 11Ano, Areal
Editores, pginas 212-213;

- AQUINO, Maria Luiza, et al, COLORAO DE GRAM, [citado em 12-02-11]. Disponvel em URL: http://pt.scribd.com/marigoliv/d/51493643-Relatorio-coloracao-de-gram

- CASTRO, Rui Migue; NOTA POSITIVA, Escola Sec./3 Camilo Castelo Branco, (revisto dia 20/04/2008) [citado em 12-02-11]. Disponvel em URL:
http://www.notapositiva.com/pt/trbestbs/biologia/11_observ_bacterias_vinagre.htm

- NCLEO DE ESTGIO DE BIOLOGIA E GEOLOGIA; Escola Sec./3 Arquitecto Oliveira Ferreira - Arcozelo, [citado em 12-02-11]. Disponvel em URL:
http://www.prof2000.pt/users/biologia/tcolgram.htm

- DAIHA, Michael; TABELA PERIDICA DOS ELEMENTOS, Design e Interface 1997, (revisto dia 12-02-2012) [citado em 28-09-10]. Disponvel em URL: http://www.ptable.com/

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