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Trabalho realizado por: Ana Teixeira n 52488 Joo Sousa n 52489 Marina Oliveira n 55520 Teresa Conde n 55511

ndice

1. 2.

Introduo ........................................................................................................................ 3 Materiais e mtodos ......................................................................................................... 5 2.1. Materiais e reagentes ..................................................................................................... 5 2.2. Procedimento ............................................................................................................ 5 Extraco da catalase ......................................................................................... 5 Curva de calibrao do substrato ....................................................................... 6 Concentrao de protena pelo mtodo de Bradford .......................................... 6 Determinao da actividade enzimtica ............................................................. 7 Efeito da temperatura na actividade enzimtica................................................. 7 Efeito da concentrao de substrato na actividade enzimtica ........................... 8 Efeito da concentrao da catalase na actividade enzimtica ............................. 8

2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.3. 2.2.4. 2.2.5. 2.2.6. 3. 4. 5. 6. 7.

Resultados ........................................................................................................................ 9 Discusso de resultados .................................................................................................. 12 Concluses ...................................................................................................................... 14 Bibliografia ...................................................................................................................... 15 Anexos ............................................................................................................................ 16 7.1. Mtodo de Bradford ..................................................................................................... 16 7.2. Espectrofotometria ...................................................................................................... 16 7.3. Michaelis-Menten ........................................................................................................ 17 7.4. Exemplos de clculo ..................................................................................................... 18 7.5. Curva de calibrao do substrato .................................................................................. 19 7.6. Curva de calibrao do Mtodo de Bradford................................................................. 20

Sumrio
Esta actividade experimental tem como principais objectivos a identificao da actividade enzimtica da catalase e o efeito da temperatura, pH, concentrao de substrato (perxido de hidrognio) e concentrao de catalase nesta e, ainda, a identificao da cintica de MichaelisMenten. Na determinao da actividade enzimtica recorre-se espectrofotometria e na quantificao da catalase utiliza-se o mtodo de Bradford. Os principais resultados desta actividade indicam uma concentrao de catalase prxima de 0,219g/L para a diluio de 1:2 e 0,257g/L para a diluio de 1:3; para uma temperatura de 4oC a concentrao de perxido de hidrognio varia entre 0,046 e 0,004 g/L, j para a temperatura ambiente a variao situa-se entre os 0,024 e os 0,002 g/L; no meio em que se adicionaram 4 mL de perxido de hidrognio os valores variam entre os 0,036 e os 0,003 g/L e no meio em que se adicionaram 10 mL de perxido de hidrognio obtm-se valores entre os 0,019 e os 0,005 g/L e, tanto no meio sem diluio como no meio com diluio de 1:2, os valores da concentrao de perxido de hidrognio variam entre 0,024 e 0,003 g/L. As concluses mais relevantes desta actividade so que a temperatura e a concentrao de perxido de hidrognio (substrato) afectam a actividade enzimtica. J a concentrao de catalase, desde que o substrato esteja presente em excesso, no afecta a actividade enzimtica. Verifica-se tambm que a actividade enzimtica maior temperatura ambiente, pois esta mais prxima da temperatura ptima. No caso da soluo em que so adicionados 10 mL de perxido de hidrognio obtm-se uma maior actividade enzimtica, sendo que a partir de um determinado momento diminui, pois os locais activos da catalase esto todos ocupados.

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1. Introduo
A acumulao de oxignio na atmosfera terrestre marcou um ponto de viragem na evoluo. A formao da camada de ozono na estratosfera veio a favorecer a evoluo dos seres vivos para o meio terrestre e a utilizao deste gs no metabolismo como aceitador final dos electres da cadeia respiratria mitocondrial marcou um melhoramento substancial no rendimento energtico, tornando-o imprescindvel para a maioria das espcies actuais [1]. Contudo, e apesar dos extraordinrios melhoramentos em termos de evoluo do metabolismo, viver com o oxignio perigoso, uma vez que este um gs txico, mutagnico e, por conseguinte, altamente prejudicial para os seres vivos que dele se servem [1][3]. A sua toxicidade est, actualmente, relacionada com a produo de espcies reactivas de oxignio (ROS), cuja formao ocorre maioritariamente na mitocndria [1]. O termo ROS implica uma produo intracelular de intermedirios de oxignio que ameaam a integridade de vrias biomolculas incluindo protenas, lpidos e DNA [1]. Para reagir formao de ROS, a mitocndria possui vrias defesas antioxidantes destinadas eliminao tanto do anio superxido (O2) como do perxido de hidrognio (H2O2) [1]. O perxido de hidrognio uma das formas de ROS intracelulares mais comuns e, embora no seja um radical livre, tem um papel muito importante devido sua capacidade para penetrar nas membranas biolgicas. Este intervm na formao de radicais livres funcionando como um intermedirio na formao de ROS. Assim, o perxido de hidrognio um bioproduto txico, altamente reactivo, resultante de reaces metablicas, que pode danificar as clulas se no for removido, causando a oxidao de constituintes celulares, principalmente lpidos e, em ltima instncia provocar a morte celular [1][2][3]. Para manter as concentraes de ROS dentro dos nveis fisiolgicos, o organismo produz catalase (EC 1.11.1.6) [1][2]. A catalase patrulha as clulas de forma a neutralizar a produo constante de perxido de hidrognio e mant-lo a um nvel seguro [1][2][3]. Esta est presente nos peroxissomas de praticamente todas as clulas aerbias e protege a clula dos efeitos txicos do perxido de hidrognio, catalisando a sua decomposio em oxignio molecular e gua, inofensivos ao organismo, sem a produo de radicais livres [1][2][3]. A catalase uma molcula tetramrica, constituda por quatro cadeias polipeptdicas com quatro grupos prostticos hema com Fe(III) nos locais activos da enzima que se oxida a Fe(IV) [2]. O mecanismo de catlise no est totalmente elucidado, mas a reaco geral dada pela equao 1 e ilustrada pela figura 1 [2]: 2 H2O2 2 H2O + O2 equao 1 3

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Figura 1. Mecanismo de catlise da catalase [1].

Como foi dito anteriormente, a qumica de catlise da catalase no foi completamente esclarecida mas pensa-se que esta ocorre em duas etapas, ilustradas pelas equaes 2 e 3:

H2O2 + Fe (III)-E H2O + O = Fe (IV)-E H2O2 + O = Fe (IV)-E H2O + Fe (III)-E onde Fe-E representa o centro de ferro do heme ligado ao resto da enzima (E) [2].

equao 2 equao 3

O objectivo deste trabalho experimental visa a avaliao da influncia de parmetros fsicos (temperatura) e qumicos (concentrao do substrato, concentrao da enzima e pH) na actividade enzimtica e estabilidade desta enzima de defesa anti-oxidante a catalase (figura 2). A sua actividade varia significativamente de uma fonte para outra [1] e algumas fontes desta enzima so: cebolas, cenouras, espinafres, rebentos, nabos, rabanetes, damascos, brcolos, bananas, sangue, fgado e leite cru. Os frutos tm geralmente menor actividade da catalase talvez devido sua maior acidez [1]. Neste trabalho utilizar-se- o extracto da beterraba crua como fonte de catalase que, segundo a literatura, possui cerca de 3 g de protenas por cada 100 g de beterraba [4].

Figura 2. Estrutura de tetrmero da catalase [3]. 4

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2. Materiais e mtodos
2.1. Materiais e reagentes

Bales volumtricos; Banhos termostatizados; Tubos de ensaio; Pipetas volumtricas; Varetas de vidro; Balana analtica; Faca; Suporte de tubos de ensaio; Coador; Gaze; Furador de papis; Cronmetro; Papel de alumnio; Ralador;

Gobls; Pompete; Micropipeta; Espectrofotmetro; Cuvete de quartzo; Vrtex; Beterraba; Perxido de hidrognio; gua destilada; Reagente de Bradford; Soluo de BSA; Soluo (pH=7). tampo fosfato

2.2. Procedimento

2.2.1. Extraco da catalase Descascar, cortar e pesar cerca de 100g de beterraba (anotar o valor da massa pesada); Rapidamente colocar a amostra num recipiente de plstico com 100 mL de tampo fosfato a 4oC. Colocar o recipiente num banho frio (arrefecido com gelo) e homogeneizar a amostra durante 30s a 1min; Colocar um balo de Erlenmeyer num banho frio e filtrar o extracto de beterraba com gaze. Transferir o filtrado para um balo volumtrico e acertar o volume a 200 mL com tampo fosfato a 4oC. Preservar o extracto no banho frio at ser utilizado. Este extracto ir conter a catalase e ser designado por extracto-me. 5

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2.2.2. Curva de calibrao do substrato

Num balo volumtrico de 100 mL adicionar 10 mL de perxido de hidrognio a 30% e perfazer com gua destilada de forma a obter perxido de hidrognio a 3%; Num balo volumtrico de 50 mL, preparar uma soluo contendo 0,5 mL de perxido de hidrognio (3% v/v); Perfazer a soluo com tampo fosfato (pH 7); A partir desta soluo realizar vrias diluies; Ajustar o espetroftometro para 240 nm e ler as absorvncias de todas as solues.
Nota: Realizar todas as leituras em triplicado.

2.2.3. Concentrao de protena pelo mtodo de Bradford

2.2.3.1. Curva de calibrao Preparar as solues indicadas na Tabela 1:

Tabela 1. Quantidades necessrias para a preparao das solues para a curva de calibrao de Bradford. [BSA] (mg/L) BSA (mL) Tampo fosfato (mL) 0 (branco) 400 800 1200 1600 2000 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 10,0 9,6 9,2 8,8 8,4 8,0

Em seguida, adicionam-se 3 mL de soluo de Bradford a 100 L de amostra, em tubos de ensaio; Colocar as solues no escuro e aguardar 10 minutos para que ocorra a reaco; Retirar 200 L de cada soluo para uma placa ELISA, em triplicado; Ler a absorvncia a 240 nm.

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2.2.3.2. Quantificao da catalase Preparar uma diluio de 1:2 e de 1:3 do extracto-me; Em seguida, adicionam-se 3 mL de soluo de Bradford a 100 L de amostra, em tubos de ensaio; Colocar as solues no escuro e aguardar 10 minutos para que ocorra a reaco; Retirar 200 L de cada soluo para uma placa ELISA, em triplicado; Ler a absorvncia a 240 nm.

2.2.3. Determinao da actividade enzimtica

Proceder a diluies do extracto-me de catalase de 1:2 e mant-las temperatura ambiente; Adicionam-se 6 mL de perxido de hidrognio (H2O2); Utiliza-se como branco uma soluo contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampo fosfato (pH=7); Ler absorvncia a 240 nm; Repetir a leitura de 1 em 1 minutos at a absorvncia estabilizar.

2.2.4. Efeito da temperatura na actividade enzimtica

Proceder a diluies do extracto-me de catalase de 1:2 e mant-las a duas temperaturas distintas, uma temperatura ambiente e outra em gelo; Adicionam-se 6 mL de perxido de hidrognio (H2O2); Preparar uma soluo contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampo, que foi utilizada como branco; Ler absorvncia a 240 nm; Repetir a leitura de 1 em 1 minutos at a absorvncia estabilizar.
Nota: A temperatura ptima da catalase situa-se entre 20 C e os 50 C, da as temperaturas escolhidas estarem dentro deste intervalo [5].
o o

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2.2.5. Efeito da concentrao de substrato na actividade enzimtica

Proceder a diluies do extracto-me de catalase de 1: 2 temperatura ambiente; Adicionam-se 4 mL e 10 mL de perxido de hidrognio (H2O2); Preparar uma soluo contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampo, que foi utilizada como branco; Ler absorvncia a 240 nm; Repetir a leitura de 1 em 1 minutos at a absorvncia estabilizar.

2.2.6. Efeito da concentrao da catalase na actividade enzimtica Proceder a diluies do extracto-me de catalase de 1: 2 e de 1:5, temperatura ambiente; Adicionam-se 6 mL de perxido de hidrognio (H2O2); Preparar uma soluo contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampo, que foi utilizada como branco; Ler absorvncia a 240 nm; Repetir a leitura de 1 em 1 minutos at a absorvncia estabilizar.

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3. Resultados
Na tabela 2 podem observar-se os valores obtidos de concentrao de catalase para uma diluio de 1:2 e de 1:3, que so aproximadamente iguais. Na figura 3 nota-se um decrscimo da concentrao de perxido de hidrognio (H2O2) ao longo do tempo, tanto no ensaio temperatura ambiente como no realizado a 4oC, verificando-se que temperatura ambiente a concentrao de perxido de hidrognio menor do que temperatura de 4oC. Na figura 4 verifica-se uma diminuio da concentrao de perxido de hidrognio ao longo do tempo, sendo que, at aos 5 minutos, observa-se que a curva respectiva adio de 10 mL de perxido de hidrognio tem concentraes inferiores de perxido de hidrognio, em relao curva na qual foram adicionados apenas 4 mL de perxido de hidrognio. Entre os 5 e os 7 minutos nota-se uma concentrao aproximadamente igual e a partir dos 7 minutos observa-se um aumento da concentrao de perxido de hidrognio na soluo com 10 mL de perxido de hidrognio. Na figura 5 tambm observada uma diminuio da concentrao de perxido de hidrognio ao longo do tempo, sendo que a concentrao de perxido de hidrognio prxima no meio com diluio de 1:2 e no meio com o extracto sem qualquer diluio.

Tabela 2. Valores de concentrao obtidos para a catalase.

Amostra 1 2

Diluio 1:2 1:3

[catalase] (g/L) 0,219 0,257

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0,050 0,045 0,040 0,035 [H2O2] (g.L-1) 0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 0 2 4 tempo (min) 6 8 Ambiente (25 C) Frio (4 C)

Figura 3. Representao grfica do efeito da temperatura na actividade enzimtica da catalase.

0,040 0,035 0,030 [H2O2] (g.L-1) 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 0 2 4 6 8 10 tempo (min) 4 mL de perxido de hidrognio 10 mL de perxido de hidrognio

Figura 4. Representao grfica do efeito da concentrao de perxido de hidrognio (substrato) na actividade enzimtica da catalase.

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0,025 0,020 [H2O2] (g.L-1) 0,015 0,010 0,005 0,000 0 2 4 6 8 10 tempo (min) sem diluio Diluio 1:2

Figura 5. Representao grfica do efeito da concentrao de catalase (protena) na actividade enzimtica.

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4. Discusso de resultados
Na determinao da concentrao de catalase pelo mtodo de Bradford verifica-se que a concentrao de catalase aproximadamente a mesma para as duas diluies efectuadas, isto , na diluio 1:2 obteve-se uma concentrao de 0,219 g/L e na diluio 1:3 obteve-se uma concentrao de 0,257 g/L. Tal era esperado pois as amostras foram retiradas do mesmo extracto-me, logo apresentam a mesma concentrao de catalase. Com base na anlise grfica da figura 3 pode-se concluir que a concentrao de perxido de hidrognio maior temperatura de 4oC, onde os valores variam entre 0,045 e 0,004 g/L, quando comparado com a temperatura ambiente, onde os valores variam entre 0,024 e 0,002 g/L, uma vez que, a esta temperatura a actividade da catalase vai ser menor, no convertendo tanto substrato em produto e, por conseguinte existe maior concentrao de perxido de hidrognio na amostra. Dado que a temperatura ptima encontrada na literatura se situa entre os 20oC e os 50oC, era de esperar que temperatura ambiente se obtivesse maior actividade enzimtica, dado o facto de a catalase estar num meio a uma temperatura mais prxima da sua temperatura ptima [5][6]. Analisando a figura 4 verifica-se que para o meio onde foram adicionados 4 mL de perxido de hidrognio os valores situam-se entre os 0,036 e os 0,003 g/L, enquanto no meio onde se adicionaram 10 mL de perxido de hidrognio os valores variam entre 0,019 e 0,005 g/L, regista-se inicialmente uma menor concentrao de perxido de hidrognio na soluo qual foram adicionados 10 mL de perxido de hidrognio at aos 5 minutos de reaco. Seguidamente, entre os 5 e os 7 minutos de reaco, ambas as curvas se encontram, sendo que a partir dos 7 minutos, a curva ilustrativa da amostra qual foram adicionados 4 mL de perxido de hidrognio apresenta menor concentrao de perxido de hidrognio. Assim, a actividade enzimtica foi maior primeiramente para a amostra onde existia maior concentrao de substrato e, a partir dos 7 minutos, para a amostra contendo menor concentrao de substrato. Tal pode ser explicado pelo facto de a velocidade da reaco aumentar mais rapidamente quando a concentrao de substrato maior, mas somente at um valor mximo, em que todas as enzimas disponveis esto saturadas, isto , recrutadas para a formao do complexo enzima-substrato [7]. Pela anlise da figura 5 verifica-se que no h grande variao entre as duas curvas correspondentes no diluio e diluio de 1:2 do extracto de catalase. Assim, tanto na curva do meio sem diluio como na curva do meio com diluio de 1:2 os valores de concentrao de perxido de hidrognio variam entre os 0,024 e os 0,003 g/L. Ora, tal facto 12

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indica que a concentrao de catalase no influencia a sua actividade enzimtica, isto , variando a concentrao de catalase, desde de que exista uma concentrao de substrato suficiente, este liga-se enzima formando o complexo enzima-substrato indiscriminadamente [7]. Devido ao atraso da actividade prtica e ao esgotar do tampo no foi possvel realizar a actividade prtica referente ao efeito do pH na actividade enzimtica e o estudo da cintica de Michaelis-Menten. Contudo, esperava-se que a actividade enzimtica fosse maior a um pH prximo do pH ptimo da catalase que se situava entre o 7,0 e os 9,0 [5]. Quanto cintica de Michaelis-Menten a literatura refere um Km da catalase igual a 1,1 M, pelo que se esperava encontrar uma constante cintica de Michaelis-Menten prxima deste valor [8].

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5. Concluses
As concluses mais relevantes que podem ser retiradas deste trabalho so que a actividade enzimtica afectada pela temperatura e pela concentrao de perxido de hidrognio (substrato), mas no pela concentrao de catalase desde que o substrato esteja presente na soluo em excesso. A actividade enzimtica foi maior para uma temperatura mais prxima da temperatura ptima, ou seja, foi mais alta temperatura ambiente. Para uma concentrao de substrato mais elevada foi obtida uma maior actividade enzimtica, sendo que a partir de um determinado momento diminui, uma vez que os locais activos da catalase estavam todos ocupados a formar o complexo enzima-substrato.

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6. Bibliografia
[1] DOURADO, F.; ABRUNHOSA, L.; 2010/2011, Laboratrios de Tecnologias Alimentares, Trabalhos Prticos; [2]http://www.callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/catalase/cat 1.htm, consultado em 30/09/11; [3] BRITO, A.; 2006; O Oxignio no Mundo Vivo: dos melhoramentos extraordinrios aos efeitos deletrios, Adequao de protocolos para aplicao aos Ensinos Bsico e Secundrio; [4] http://www.vidadequalidade.com.br/saude/beneficios-da-beterraba.html; [5] Medeiros, I.;Bainy, A.; 2000, Otimizao da metodologia de anlise da enzimas catalase e glutationa s-transferase para a glndula digestiva do mexilho Perna perna; [6] BARTOSZEK, M.; KCIUCZYK, M.; 2005, Study of the temperature influence on catalase using spin labelling method, Journal of Molecular Structure, pp. 733-736; [7] Schuller, D.; Bjrn, J.; 2009/2010, Laboratrios Integrados de Biologia, Guia de Laboratrio; [8] QUINTAS, A.; FREIRE, A.; HALPERN, M.; Bioqumica, Organizao Molecular da Vida, 2008, 1 edio, LIDEL, pgs. 257, 274; [9] SOUSA, D.; 2009/2010; Protocolos de Laboratrios de Bioprocessos; [10]http://pt.scribd.com/doc/19825031/Analise-pelo-espectrofotometro-e-curva-

padrao, consultado em 7/10/11;

[11] http://c2o.pro.br/automacao/x1669.html, consultado em 7/10/11; [12] http://cheirosdaterra.hd1.com.br/controle_qualidade_03.htm, consultado em 7/10/11 [13] http://gmein.uib.es/otros/enzimas/Jmoldesarrollo/textos/enzima5.html, consultado em 30/09/11; [capa] http://csmres.jmu.edu/biology/bio380/web12/discussion%20proj2.htm, consultado em 20/10/11.

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7. Anexos

7.1. Mtodo de Bradford A quantificao da protena solvel presente nos extractos celulares foi efectuada pelo mtodo desenvolvido por Bradford (1976). Este mtodo baseia-se na propriedade que o corante azul de Coomassie tem em estabelecer ligaes a protenas pela sua parte cromfora. Ao ligar-se protena, o corante muda de vermelho para azul. Assim, as solues deste corante apresentam um mximo de absorvncia a 465 nm e 595 nm, na ausncia e na presena, respectivamente, de protena em soluo [9].

7.2. Espectrofotometria Neste trabalho experimental recorre-se a uma tcnica analtica que avalia a capacidade que os solutos tm de absorver a luz em comprimentos de onda especficos a espectrofotometria. A medida da luz absorvida, isto , a absorvncia, possibilita a deduo da concentrao do soluto nas solues [10]. Deste modo, pelo uso da espectrofotometria possvel determinar a quantidade de luz absorvida por uma substncia em soluo, permitindo assim calcular a sua concentrao. Quando a luz com um determinado comprimento de onda incide numa soluo uma parte dessa luz absorvida pelas molculas em soluo. Esta absorvncia segue a Lei de Beer-Lambert e directamente proporcional : Concentrao do soluto Capacidade que a substncia dissolvida tem de absorver a luz de um determinado comprimento de onda A distncia percorrida pela luz atravs da soluo (geralmente 1 cm)

Aps a passagem pela soluo, a energia luminosa detectada pelo fotodetector expressa em absorvncia (A), calculada pela equao 4 e ilustrada pela Figura 2:

A (absorvncia) = log(I0/It)

equao 4

Onde I0 representa a intensidade da luz na fonte, antes de passar pela amostra (substncia dissolvida) e It representa a luz que passa atravs da amostra (substncia dissolvida) [7].

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Figura 6. Esquema ilustrativo do funcionamento do espetroftometro [11].

Pela medio da absorvncia possvel determinar a concentrao de molcula em soluo que absorve luz de um determinado comprimento de onda. Todavia, as leituras das absorvncias apenas indicam concentraes relativas uma absorvncia mais elevada resulta de uma concentrao mais elevada. Nestes casos, a concentrao pode ser estimada recorrendo a uma curva de calibrao. A espectrofotometria possui como vantagem principal uma grande sensibilidade, uma vez que, ao contrrio dos mtodos volumtricos onde necessrio uma concentrao mnima de 0,1mg/ml da substncia a ser analisada, enquanto na espectrofotometria, se pode analisar solues com concentraes at 0,001mg/ml, ou seja, o mtodo cerca de 100 vezes mais sensvel. As anlises espectrofotomtricas so ainda seguras, de fcil execuo, rpidas e de baixo custo. Contudo, esta tcnica possui algumas desvantagens como: a falta de especificidade, por ser baseado na quantidade de energia absorvida por uma substncia num comprimento de onda especfico, tornando difcil a distino da substncia a ser analisada; algumas substncias no seguem a Lei de Beer-Lambert, no sendo possvel determinar a sua concentrao em determinadas solues [12].

7.3. Michaelis-Menten [13]

A cintica enzimtica o estudo do caminho mais provvel para a definio da equao da taxa da reaco de um sistema reaccional catalisado por enzimas. Medindo-se a concentrao do substrato com o decorrer do tempo, estas medies permitem a construo da curva da

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Figura 2, a qual traduz a variao da velocidade de reaco com o consumo de substrato (formao do produto) com o tempo. Um dos objectivos deste trabalho experimental prende-se com a utilizao da cintica de Michaelis-Menten para a determinao das constantes cinticas Vmx, Km e K2 da catalase:

V0

Vmx [ S 0 ] Km [ S 0 ]

equao 5

Vmx K 2 [ E0 ]

equao 6

Onde, V0 a velocidade inicial da reaco, [S0] a concentrao de substrato, [E0] a concentrao de enzima inicial e Vmx, Km e K2 so as constantes cinticas. Recorrendo ao ajuste no linear da representao grfica da equao acima possvel determinar as constantes cinticas como mostra a figura 2:

Figura 7. Grfico ilustrativo da cintica de Michaelis-Menten [13].

7.4. Exemplos de clculo

Concentrao de Perxido de Hidrognio:

H 2O2 mdiaabs 0,0198 2

38,503

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0,421 0,445 0,0198 2 [H 2O 2 ] 2 0,024 g l 38,503

Concentrao de Protena:

Proteina mdiaabs 0,755 2

0,437

0,763 0,812 0,755 2 Proteina 2 0,219 g l 0,437

7.5. Curva de calibrao do substrato

1,2 1,0 Absorvncia 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,000

y = 38,503 10,031 x - 0,0198 0,170 R = 0,9803

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

Concentrao (g.L-1)

Figura 8. Curva de calibrao do substrato (perxido de hidrognio H2O2).

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7.6. Curva de calibrao do Mtodo de Bradford

1,8 1,6 1,4 Absorvncia 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Concentrao (g.L-1) y = 0,437 0,125 x + 0,7555 0,151 R = 0,9637

Figura 9. Curva de calibrao do mtodo de Bradford.

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