Reao em Cadeia do Polimerase PCR

Trabalho no mbito da disciplina Bioqumica Experimental II, Licenciatura em Bioqumica, ano 2. Ano lectivo 2012/2013

Docente: Luka Clarke

Alunos: Ana Rita Loureno, n41885 Ana Sofia Narciso, n 41858 Maria Ins Marreiros, n 41840 Alina Maria Ardel, n 42628

Lisboa, 06 de Maio, 2013

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ndice
1. 2. Abstract ............................................................................................................................3 Procedimentos, materiais e reagentes .............................................................................4 2.1 2.2 2.3 2.4 3. 4. a) b) 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 5. 6. Extrao de DNA a partir de carne de vaca..............................................................4 Quantificao e determinao do grau de pureza do DNA extrado .......................6 Amplificao dos fragmentos de DNA por PCR ........................................................7 Electroforese em gel de agarose .............................................................................9

Apresentao de resultados ...........................................................................................11 Tratamento de Resultados .............................................................................................13 4.1 Determinao do tamanho esperado dos fragmentos aps amplificao .............13 Batata .........................................................................................................................13 Carne de bovino .........................................................................................................15 Determinao do tamanho dos fragmentos amplificados experimentalmente .....17 Comparao do tamanho dos fragmentos obtidos com os esperados ...................20 Grau de pureza .......................................................................................................21 Identificao dos tubos A e B .................................................................................21 Presena de resultados inespecficos .....................................................................22 Controlo negativo de acordo com o esperado? ......................................................22

Concluses .....................................................................................................................23 Bibliografia .....................................................................................................................24

Anexo 1 - Sequncia amplificada por PCR da espcie Solanum tuberosum (batata) .............25 Anexo 2 - Sequncia amplificada por PCR da espcie Bos Taurus (Vaca) ...............................26

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1. Abstract

Este trabalho experimental consistiu na identificao de amostras de DNA desconhecidas atravs da tcnica da reaco em cadeia do polimerase (PCR), que consiste em amplificar cpias de DNA, seguida de electroforese.

Comemos por extrair e purificar o DNA total (genmico e mitocondrial) de uma amostra de carne de vaca atravs de centrifugaes sucessivas e precipitaes diferenciais. De seguida analisamos o mesmo espectrofotometricamente, a vrios comprimentos de onda caractersticos dos cidos nucleicos e de possveis contaminantes, tendo sido possvel a sua quantificao.

Atravs da tcnica de PCR, amplificaram-se as amostras de DNA extrado da carne de vaca e o DNA extrado de batata. O DNA sujeito a elevadas temperaturas recorrendo-se ao TaqDNA polimerase termoestvel. Os 2 primers (neste caso primers especficos para o genoma da vaca e da batata) ligam-se s suas regies complementares. Por fim, o DNA polimerase catalisa a extenso da cadeia na direco 5 -3 a partir do primer, ligando os dNTPs apropriados e o DNA amplificado.

Por fim procedeu-se electroforese em gel de agarose na qual se analisaram e identificaram, com os diferentes primers , as amostras desconhecidas (A e B), com o marcador de massa molecular e respetivos controlos positivo e negativo.

Concluiu-se que a amostra A correspondia ao DNA extrado de batata e a amostra B ao DNA extrado da carne de vaca.

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2. Procedimentos, materiais e reagentes

2.1 Procedimento experimental - Extrao de DNA a partir de carne de vaca
1.Pesar 500mg de carne picada bovina 2.Reduzir a p num almofariz com azoto lquido 3.Transferir para um tubo de plstico de 50ml 4.Adicionar 20 vol. de tampo de extrao

8.Remover a fase superior (aquosa) para um tubo de 10ml e desprezar a fase orgnica

7.Centrifugar a 1600rmp durante 10min

6.Adicionar 20 vol. de mistura fenol/clorofrmio/ lcool isoamlico

5.Deixar incubar 30min temperatura ambiente

9.Extrair novamente com clorofrmio adicionando igual volume ao obtido de fase aquosa

10.Misturar, centrifugar, tirar a fase aquosa e desprezar a orgnica

11.Juntar 100g/ml de Ribonuclease A para hidrolisar o RNA presente em soluo

12.Incubar durante 30min1h a 37C

15. Centrifugar a 1600rpm durante 10 min

15. Centrifugar a 1600rpm durante 10 min

14.Adicionar igual volume de isopropanol para precipitar o DNA

13. Repetir os passos de 6 a 10 para extrair o DNA

16.Remover todo o isopropanol, lavar o pellet do DNA com 5ml de etanol (70%)

17. Centrifugar a 1600rpm durante 10 min

18. Retirar o etanol todo sem tocar no pellet e deixar secar ao ar live o pellet

19. Dissolver o DNA em 500l de TE e transferir para um tubo Eppendorf

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Reagentes e Materiais
Almofariz Micropipetas e pontas Pipetas pasteur e peras Vortex Azoto lquido Carne bovina picada Tubos de ensaio de plstico (Falcon de 50 ml e Eppendorf de 1,5 ml) Tampo de extraco de DNA (100 mM Tris-HCl pH 9.0, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA e 1% SDS) Mistura comercial de fnol/clorofrmio/alcool-isoamil (25:24:1) Clorofrmio Ribonuclease A (10mg/ml) Vortex Banho de gua com 37C Isopropanol Etanol a 70% v/v em gua Tampo TE (10 mM Tris-HCl, (pH 7.4), 0.1 mM EDTA)

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2.2 Procedimento experimental - Quantificao e determinao do grau de pureza do DNA extrado

Nesta parte do trabalho utilizado um aparelho designado por Nanodrop no qual inserida, em primeiro lugar, uma pequena quantidade de branco (gua) e de seguida a amostra contendo o DNA. Acertando o comprimento de onda desejado para a leitura, o aparelho ligado a um computador, automaticamente, descreve um grfico de Abs que ao ser analisado permite tanto verificar a presena ou no de DNA como quantificar o grau de pureza deste na soluo, recorrendo a clculos posteriores.

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2.3 Procedimento experimental - Amplificao dos fragmentos de DNA por PCR

1.Num microtubo de 1,5ml em gelo preparar a seguinte mistura de reao de PCR

Componente Tampo de PCR (c/Mg2+) x10 dNTP Mix 100 (25mM cada dNTP Primer Foward 10M Primer Reverse 10M Taq DNA Polymerase Promega (5U/l) gua ultra-pura Total (por reaco)

Quantidade/1 reao

2.Preparar as duas master mixes em 2 tubos separados

3.Homogeneizar as solues das master mixes com a micropipeta, pipetando vrias vezes suavemente

4.Preparar e marcar 3 tubos de 200l p/reco de PCR (total 6 tubos) em gelo.

Letra V A B C Exemplo

Identificao Tubo de PCR com os primers especficos para o DNA de vaca Tubo de PCR que leva o DNA do tubo A Tubo de PCR que leva o DNA do tubo B Tubo de PCR que leva H2O V1-A (tubo do grupo 1, contendo DNA do tubo desconhecido A ao qual foi adicionado o primer especfico para o DNA de vaca)
5. A marcao dos tubos dever ser feita de seguinte forma

Tubo1 V1-A

Tubo2 V1-B

Tubo3 V1-C

Tubo4 B1-A

Tubo5 B1-B

Tubo6 B1-C

6. Ligar o aparelho de PCR e programar

7. Transferir os microtubos preparados do gelo para o bloco de aquecimento do aparelho somente quando este atingir os 94C

8. Fechar a tampa e ajustla para contactar com a tampa dos microtubos

Programa: 1x 94C -5min 35x (94C-30s, 55C-30s, 72C-2min) 1x 72C 5min

Relatrio no mbito da disciplina Bioqumica Experimental II Reao em cadeia do polimerase - PCR Materiais Termociclador Micropipetas e pontas esterilizadas Microtubos Eppendorf de 1,5 ml e 200 l. Componentes do PCR Tampo de PCR (c/ Mg2+) 10x dNTP Mix 25 mM cada dNTP Primer Forward 10M* Primer Reverse 10M* Taq DNA Polymerase promega (5U/l) gua ultra-pura

*Primer Forward mtDNA COX2 batata: 5- GCGCATAAACTATGTTCGTC -3 *Primer Reverse mtDNA COX2 batata: 5- AGATCCTAATTGCCATGGTT -3 *Primer Forward mtDNA Mt11 vaca: 5- TTCTGTAGCCATAGCCGTTGTA -3 *Primer Reverse mtDNA Mt11 vaca: 5- CCCTTGCGTAGGTAATTCATTC -3

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2.4 Procedimento Experimental - Electroforese em gel de agarose

2.4.1 Preparao do suporte e do gel de agarose
2.Colocar o suporte dentro da hotte e inserir a pente 3.Preparar uma soluo de 100ml de agarose 4. Dissolver a agarose em banho de gua a ferver com agitao frequente

1.Selar ambas as extremidades do suporte com fita adesiva

8.Eliminar bolhas de ar que se tenham formado com a ajuda de uma ponta e deixar solidificar

7.Verter a agarose para um suporte de gel at a uma altura de 5mm

6.Na hotte adicionar 5l de brometo de etdio a 10mg/ml soluo de agarose

5.Deixar arrefecer para uma temperatura de cerca de 50C

9.Quando o gel se tiver polimerizado, retirar o pente com cuidado e a fita adesiva das extremidades

10.Colocar o suporte com o gel na tina de electroforese

11.Os poos devem estar do lado do eltrodo negativo

12.Adicionar tampo at cobrir o gel. Verificar que todos os poos esto preenchidos com tampo

Relatrio no mbito da disciplina Bioqumica Experimental II Reao em cadeia do polimerase - PCR 2.4.2 Preparao das amostras e deposio no gel
2. Aplicar o contedo todal de cada tubo para um poo de gel usando a respetiva ponta

1.Para cada amostra misturar, num microtubo: 2l de tampo de deposio do DNA, 10l de produto de PCR

5.Ligar os cabos eltricos a uma fonte de alimentao eltrica

4.Fechar a cmara de electroforese

3. Colocar a tampa da tina

6. Regular a voltagem para 80 volts e verificar se h bolhas nos eltrodos

7. Verificar se, passado alguns min o bromofenol migra no sentido correto

8. Aps a migrao, desligar a corrente eltrica na fonte, os cabos e retirar a tampa de electroforese

11.Registar o padro de bandas em fotografia

10.Examinar o gel com iluminao UV

9. Retirar o gel da com o suporte da cmara de electroforese

Material e Reagentes
Fonte de energia Tina de Electroforese Suporte de gel Pentes para gel Fita adesiva Balana Esptula Transiluminador de UV Micropipetas Pontas de 200 l (amarelas) e de 10 l (brancas) Erlenmeyer de 250ml Agarose Tampo TBE 10X (Soluo 1x:89.0 mM Tris, 89.0 mM Boric acid 2 mM EDTA, pH 8.4) Agente corante do DNA (Brometo de Etideo ou Gel red) Soluo de deposio do DNA (50% glicerol, 0,1% de azul de bromofenol, EDTA 100mM) Marcador de pesos

moleculares de DNA 10

3. Apresentao de resultados
De seguida apresentado o grfico que obtivemos aquando da leitura das absorvncias em funo do comprimento de onda da nossa amostra de DNA.

Imagem 1 Variao da absorvncia com comprimento de onda, da nossa amostra de DNA.

Apresentamos ainda uma imagem do gel de agarose, no qual foi aplicado a tcnica de electroforese. Este gel no foi o obtido na nossa turma prtica, mas sim noutra (PL2), visto a nossa turma no ter obtido quaisquer resultados aquando a anlise do gel radiao UV. Controlo +
V-A V-B V-C B-A B-B B-C M.M. B V

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Imagem 2 - Electroforese em gel de agarose da PL2.

Legenda:
V-A - Amostra com DNA do tubo A e primer da Vaca V-B - Amostra com DNA do tubo B e primer da Vaca V-C - Amostra do tubo C (sem DNA) e primer de vaca B-A - Amostra com DNA do tubo A e primer da Batata B-B - Amostra com DNA do tubo B e primer da Batata B-C - Amostra do tubo C (sem DNA) e primer de batata M.M - Marcadores B - Controlo Positivo de DNA da Bata V - Controlo positivo do DNA de Vaca

Note-se que para o tratamento de resultados foram utilizados os gis de cima (da direita e esquerda).

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4. Tratamento de Resultados
4.1 Determinao do tamanho esperado dos fragmentos aps amplificao a) Batata
Para obter as informaes relativas sequncia de DNA mitocondrial da batata hibridada pelos primers fornecido, acedemos base dados GenBank:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.

Na pgina do GenBank, introduziu-se o nmero de acesso relativo a esta sequncia fornecido no protocolo (DQ185064) na barra de pesquisa com a opo Nucleotide.

Obteve-se uma nova pgina com os dados relativos a Solanum tuberosum cytochrome c oxidase subunit II (COX2) gene, complete cds; mitochondrial , na qual possvel obter o nmero de pares de bases da sequncia (no topo da pgina) bem como a sequncia total do gene (no final da pgina). Para procurar a sequncia do primer na sequncia, escolheu-se a opo Find in this sequence do lado esquerdo da pgina. A sequncia dos primers introduzidos nessa opo, igual s sequncias fornecidas no protocolo, mas apenas para os Primers Forward. O primer Forward lido na cadeia sense (cadeia normalmente lida na traduo) e hibrida com a cadeia antisense (cadeia complementar cadeia sense), sendo a sua sequncia igual fornecida no protocolo.

Por outro lado, o primer reverse lido na cadeia antisense na extremidade oposta primeira, no sentido 5->3, hibridando com a cadeia sense, tal como mostra a figura 1. Deste modo, para os primers reverse, a sequncia introduzida no a fornecida no protocolo, uma vez que esta corresponde sequncia da cadeia antissense. Assim, a sequncia a introduzir tem de ser a sequncia complementar da sequncia oposta fornecida, porque o primer reverse lido na cadeia antissense, cadeia complementar da sense, e no sentido 5->3(sentido oposto de leitura da sense), obtendo-se deste modo a sequncia correspondente na cadeia sense. 13

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Cadeia sense Cadeia antissense

Figura 1 - Hibridao de primers Forward e Reverse.

Tamanho total da sequncia: 2874 bp Primers fornecidos : *Primer Forward mtDNA COX2 batata: 5- GCGCATAAACTATGTTCGTC -3 *Primer reverse mtDNACOX2 batata: 5-AGATCCTAATTGCCATGGTT -3 *Primer Reverse encontra-se na cadeia sense como (cadeia complementar da cadeia contrria, na qual A<=>T e C<=>G): AACCATGGCAATTAGGATCT

Por submisso das sequncias dos primers forward e reverse, anotou-se que o primeiro nucletido da sequncia est localizado na posio 420 e o ltimo na posio 785. Assim, o tamanho esperado da sequncia do gene dado por:

Tamanho da cadeia esperado:785-420=365 bp

A sequncia amplificada por PCR para a carne de bovino encontra-se em Anexo (Anexo 1).

Percentagem da cadeia sequenciada pelo Taq polimerase:

Espera-se que seja sequenciada e amplificada aproximadamente cerca de 13% da cadeia total do gene.

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b) Carne de bovino
Para obter as informaes relativas sequncia de DNA hibridada pelos primers Mt11 para a carne de vaca, procedeu-se da mesma forma que para a sequncia da batata, mas introduzindo o cdigo de acesso para a sequncia do gene (V00654).

Tamanho total da sequncia: 16338 bp Primers fornecidos: *Primer Forward mtDNA Mt11 vaca: 5- TTCTGTAGCCATAGCCGTTGTA -3 *Primer Reverse mtDNA Mt11 vaca: 5- CCCTTGCGTAGGTAATTCATTC - -3 *Primer Reverse lido como (cadeia complementar da cadeia oposta fornecida): GAATGAATTACCTACGCAAGGG

Por introduo da sequncia dos primers forward e reverse na opo Find in the sequence, foi possvel anotar que o primeiro nucletido da sequncia se encontra na posio 14210 e que o ltimo se encontra na posio 15960. Assim, o tamanho do fragmento amplificado esperado dado por: Tamanho da cadeia esperado:15960-14210=1750 bp

A sequncia amplificada por PCR para a carne de bovino encontra-se em Anexo (Anexo 2).

Percentagem da cadeia sequenciada pelo Taq polimerase:

Espera-se que seja sequenciada e amplificada aproximadamente cerca de 11% da cadeia total do gene.

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Relatrio no mbito da disciplina Bioqumica Experimental II Reao em cadeia do polimerase - PCR Resumindo, os resultados obtidos para o valor do tamanho esperado para os fragmentos so dados por:

Fragmento de DNA resultante da amplificao para a carne de vaca 1750 bp

Fragmento de DNA resultante da amplicao para a batata 365 bp

Sabendo que na electroforese em gel de agarose, os fragmentos lineares de DNA migram a velocidades inversamente proporcionais ao logaritmo de base 10 do nmero de pares de bases (maior tamanho do fragmento implica maior atrito entre este e a matriz do gel) de esperar uma maior migrao do fragmento proveniente da batata ( menor) do que do fragmento proveniente da carne de vaca.

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4.2 Determinao do tamanho dos fragmentos amplificados experimentalmente

Marcador: 1 Kb plus DNA ladder Caractersticas: Compreende fragmentos de 100bp a 12kb Contm no total de 20 bandas: - 12 bandas abrangem o comprimento de 1000 a 12000bp com incrementos de 1000bp - 8 bandas abrangem o comprimento de 100 a 1650bp A banda a 1650bp contm cerca de 8% da massa aplicada ao gel.

Na seguinte imagem esto representadas as bandas do marcador, obtidas numa electroforese em gel de agarose e respetivos comprimentos dos fragmentos.

Imagem 3 Marcador 1Kb plus DNA ladder

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Relatrio no mbito da disciplina Bioqumica Experimental II Reao em cadeia do polimerase - PCR De seguida apresenta-se o gel obtido:

Imagem 4 Gel obtido

Legenda: 12345V-B B-A M (marcador) B (controlo positivo) V (controlo positivo)

Se compararmos as bandas obtidas no poo identificado como poo 3, correspondente ao marcador, s bandas da imagem obtida na base de dados invitrogen temos o mesmo padro e facilmente se pode fazer corresponder as bandas obtidas s bandas da literatura.

Para determinar o tamanho dos fragmentos amplificados experimentalmente, em primeiro lugar identificou-se visualmente o tamanho de cada banda do gel obtido, correspondente ao marcador (identificado com o nmero 3 na imagem acima apresentada), a partir da imagem obtida na literatura. De seguida, estabeleceu-se uma escala de distncias de migarao, em cm. Ento, com uma rgua, determinaram-se as distncias de migrao de cada uma das bandas do marcador e, numa folha de excell, fez-se corresponder o logaritmo dessas distncias ao tamanho do respetivo fragmento, construindo-se o seguinte grfico:

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Tamanho das bandas em funo da distncia de migrao

log10(comprimento das bandas) 5 4 3 2 1 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 distncia migrada/cm y = -0,9899x + 3,9824 R = 0,9771 Tamanho das bandas em funo da distncia de migrao Linear (Tamanho das bandas em funo da distncia de migrao)

Grfico 1 logaritmo do tamanho das bandas em funo respectiva distncia de migrao

De seguida, procedeu-se ao clculo do tamanho dos fragmentos da forma descrita a seguir. Tendo em conta a equao da reta obtida por regresso linear: y=-0,9899x+3,9824 podemos calcular analiticamente o comprimento das bandas obtidas experimentalmente:

Para V-B tem-se: Distncia migrada, x=0,8cm

Ento: y= -0,9899*0,8+3,9824 = 3,19048

Como: y=log10(comprimento da banda) Comprimento da banda (V-B) = 103,19048 =1 550,53 pb Para B-A tem-se: Distncia migrada, x=1,5

Ento: y= -0,9899*1,5+3,9824 = 2,49755

Como: y=log10(comprimento da banda) Comprimento da banda (B-A) = 102,49755 =314,45 pb 19

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4.3 Comparao do tamanho dos fragmentos obtidos com os esperados

Tamanho esperado Fragmento DNA batata Fragmento DNA bovino 365pb 1750pb

Tamanho obtido 314,45pb 1550,53pb

Tabela 2 Comparao do tamanho dos fragmentos esperado e obtido para cada uma das amostras

Na tabela acima apresentada est sintetizada a relao entre o tamanho esperado e o tamanho obtido para cada um dos fragmentos de DNA. Ora se compararmos estes valores, observamos que em ambos os casos o tamanho esperado muito semelhante ao tamanho obtido. As pequenas diferenas entre estes pares de valores podem dever-se essencialmente ao facto de todas as distncias de migrao das bandas terem sido medidas visualmente, recorrendo a uma rgua e no rigorosamente, podendo haver, certamente, erros.

Clculo do rendimento: Rendimento = Para a Batata: Rendimento = Para a carne de bovino: Rendimento = x 100 = 86,60% x 100 = 86,18% x 100

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4.4 Grau de pureza

A determinao experimental do grau de pureza do DNA, faz-se normalmente atravs do mtodo espectofotomtrico, sendo possvel verificar se a amostra est contaminada com as impurezas habituais resultantes dos protocolos de extrao, tais como protenas, fenol, agarose e RNA.

de salientar que os clculos apresentados se referem ao grau de pureza obtido na nossa amostra e no amostra preparada pela turma prtica que nos forneceu os seus dados de electroforese em gel. O grau de pureza frequentemente calculado atravs da seguinte razo:

Grau de pureza =

= 1,56

Para uma amostra de DNA ser considerada pura, esta razo deve estar entre 1,8 e 2,0. Sendo que obtivemos um valor de 1,56, consideramos, sendo este um valor inferior a 1,8, que a nossa amostra pode estar contaminada com protena e fenol.

4.5 Identificao dos tubos A e B

A partir da observao das bandas formadas nos poos V2-B e B2-A, podemos inferir que a amostra A corresponde ao DNA da batata pois a distncia de migrao aproximadamente igual do primer da batata e a amostra B corresponde ento ao DNA da vaca. Estas bandas correspondem aos nicos fragmentos amplificados na presena de primers de batata e de vaca, respetivamente. No entanto, s se poder confirmar com certeza determinando as massas desses mesmos fragmentos.

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4.6 Presena de resultados inespecficos

Ao analisar as bandas correspondentes aos fragmentos de DNA extrado de carne de vaca e de batata e posteriormente amplificados pela tcnica de PCR, verifica-se que no se formaram produtos inespecficos. Isto porque se formam apenas duas bandas, uma referente ao primer da batata e outra ao da vaca.

A inexistncia de resultados inespecficos ainda confirmada por no terem surgido bandas nos controlos negativos (sem DNA logo no sofrem amplificao). Caso tivessem surgido bandas nestes poos significaria que teria ocorrido a dimerizao dos primers obtendo-se assim resultados inespecficos.

4.7 Controlo negativo de acordo com o esperado?

O controlo negativo na electroforese, correspondente s amostras V-C e B-C, no continha o produto obtido por PCR (contendo DNA).

Sabendo que na electroforese apenas se tem como objetivo a separao dos diferentes fragmentos de DNA em cada amostra, seria de esperar que no poo contendo o controlo negativo no surgisse qualquer banda.Assim, os resultados obtidos esto de acordo com o esperado. Controlo Negativo V-A V-B V-C B-A B-B B-C M.M M.M

Imagem 5 - Electroforese obtida por um dos grupos da turma PL2.

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5. Concluses
O objetivo do trabalho prtico foi em parte alcanado, pois foram cometidos alguns erros experimentais, no tendo sido obtidos quaisquer resultados aquando a anlise do gel radiao UV, pressupondo-se assim que no foi amplificado o DNA genmico e mitocondrial.

Desta forma, utilizou-se o gel de outra turma prtica, contudo pensa-se que o erro no tenha sido humano, pois analismos as vrias amostras de DNA utilizadas para a tcnica de PCR, as quais estavam razoavelmente concentradas e apresentavam um comportamento bom (grfico de variao de abs. em funo do comprimento de onda).

Utilizando o gel de outra turma, foi possvel ento identificar a composio das duas amostras desconhecidas, tubo A e tubo B. Pudemos concluir que a amostra A continha a sequncia amplificada do gene da batata, e a amostra B a da vaca.

Como esperado, observou-se que a distncia de migrao das amostras inversamente proporcional ao tamanho dos fragmentos.

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6. Bibliografia
http://www.nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-Spectrophotometers-NucleicAcid-Purity-Ratios.pdf

https://bioscibatzerlab.biology.lsu.edu/Genomics/documentation/3130_NanoDrop_tips.pdf

David L.Nelson, M. M. (2008). Lehninger - Principles of Biochemistry. New York: W.H.Freeman and Company.

Plataforma GenBank: - Sequncia do genoma mitocondrial da batata: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ185064 - Sequncia do genoma mitocondrial de bovino: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/v00654

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Anexo 1 - Sequncia amplificada por PCR da espcie Solanum tuberosum (batata)

de salientar que o produto de amplificao por PCR j inclui os dois primers (forward e reverse).

gcgcataaact atgttcgtca accaagtttg ttcagtggtc gtaagcttat taatctgacc caaattggta cacgccaatt ccatttcgcc ggattgaaag agccatcaat cactatgatc tctttcttag aaaagaaatt gcgtaaattc tgcctttttt gatcccatgc tttccgttgg tcaacaacca actaaatcta tacttcttca ctactcgtac agggaaggtg gaagaaattc agtctctctt ttttttgggg ggagcagagc agtcaaagaa tgaaccaaac caaatgattg ttctagaatg gctattcctc acaattgctc cttgtgatgc agcggaacca tggcaattag gatct

*Sequncias sublinhadas a cinzento representam os primers Forward (nicio) e Reverse (Fim).

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Relatrio no mbito da disciplina Bioqumica Experimental II Reao em cadeia do polimerase - PCR

Anexo 2 - Sequncia amplificada por PCR da espcie Bos Taurus (Vaca)

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*Sequncias sublinhadas a cinzento representam os primers Forward (nicio) e Reverse (Fim)

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